SK286115B6

SK286115B6 - Nukleová kyselina kódujúca ligand c-Ret, polypeptid ligand c-Ret, spôsob jeho prípravy a použitie na stimuláciu rastu tkanív

Info

Publication number: SK286115B6
Application number: SK1524-98A
Authority: SK
Inventors: Michele Sanicola-Nadel; Catherine Hession; Richard L. Cate
Original assignee: Biogen Idec Ma Inc.
Priority date: 1996-05-08
Filing date: 1997-05-07
Publication date: 2008-03-05
Also published as: BG64907B1; SK152498A3; CN1624126A; NZ332706A; NO324957B1; WO1997044356A2; CN1232469A; RO120343B1; BG102973A; IL126918A0; NO20065528L; KR100587556B1; ES2270465T3; TR199802252T2; DE69736428T2; IS4884A; EA002544B1; EA199800990A1; ATE335003T1; NO985231L

Abstract

Opisuje sa izolovaná nukleotidová sekvencia kódujúca polypeptid aspoň s 80 % sekvenčnou identitou saminokyselinovou sekvenciou vybranou zo skupiny pozostávajúcej zo SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 21, pričom uvedený polypeptid interaguje s receptorovým proteínom Ret, spúšťa dimerizáciu receptorového proteínu Ret alebo autofosfotyláciu tyrozínkinázovejdomény receptorového proteínu Ret. Ďalej je opísaný vektor obsahujúci uvedenú nukleovú kyselinu, hostiteľská bunka zahrnujúca vektor, polypeptid kódovaný uvedenou nukleovou kyselinou, spôsob prípravypolypeptidu a izolovaná monoklonálna protilátka.

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka nukleotidových sekvencií, ktoré kódujú ligand Ret (RetL) a tiež spôsobov stimulácie rastu nervových a obličkových tkanív ošetrením buniek a cicavčích subjektov s DNA alebo proteínom RetL.

Doterajší stav techniky

Jedným z cieľov súčasného výskumu bunkovej signalizácie a receptorovej aktivácie je umožniť liečebnú moduláciu procesov zapojených do bunkového rastu a prežívania. Tieto procesy určujú výsledok rôznych zdravotných stavov, vrátane zlyhania orgánov, vývoja plodu, nádorového rastu a ďalších. Každý z týchto stavov je celosvetovo klinicky významný a možnosti účinného liečenia sú obmedzené. Cieľom vynálezu je poskytnúť prípravky a spôsoby na podporovanie regenerácie alebo prežívanie poškodeného tkaniva a tiež na liečenie porúch zahrnujúcich odchylný rast a vývoj tkanív.

Strata tkaniva a konečné štádium zlyhania orgánu zasahujú každý rok milióny ľudí na celom svete a podstatne prispievajú na výdaje na zdravotnícku starostlivosť. Strata tkaniva alebo orgánu sa zvyčajne lieči transplantáciou orgánov od darcov, chirurgickou rekonštrukciou alebo mechanickými zariadeniami. Každý z týchto liečebných postupov má nedostatky. Transplantácia je obmedzená nedostatkom darcov, chirurgická rekonštrukcia môže vytvoriť ďalšie dlhodobé problémy a mechanické zariadenia nemôžu uskutočňovať všetky funkcie jedného orgánu a preto nemôžu zabrániť postupnej degenerácii. Preto existuje reálna zdravotná potreba pre nové riešenia týchto problémov.

Proteínové faktory, ktoré ovplyvňujú rast, diferenciáciu alebo prežívanie buniek, sa môžu použiť na liečenie porúch orgánov obsahujúcich responzívne bunky. Faktory alebo ligandy, ktoré interagujú s receptormi rodiny proteínového receptora tyrozínkinázy (RPTK) sú z tohto hľadiska mimoriadne zaujímavé. Tieto receptory sú zapojené v mnohých bunkových programoch vrátane bunkového rastu a diferenciácie vrátane genézy mnohých novotvarov. Tak sa môžu faktory alebo ligandy, ktoré interagujú s týmito receptormi, dokázať ako použiteľné na liečenie porúch určitých orgánov, ktorých tkanivo sa poškodilo. Ako alternatíva, aby sa blokoval rast nádorov, môžu sa použiť na blokovanie interakcie týchto faktorov so svojimi receptormi.

Protoonkogén Ret kóduje receptor tyrozínkinázy, ktorý je exprimovaný počas vývoja v rôznych tkanivách, vrátane periférneho a centrálneho nervového systému a obličiek. Abnormality prítomné v myšiach, ktoré neobsahujú Ret („ret null mice“), sú dôkazom toho, že Ret je kritický pre migráciu a inerváciu črevných neurónov do zadného čreva a pre proliferáciu a vetvenie epitelu močovodového pupeňa počas vývoja obličiek (Náture 367, 380 - 383, 1994). Hľadania kľúčovej zložky signálnej dráhy Ret, ligandu Ret je oblasťou intenzívneho výskumu.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje purifikovanú a izolovanú molekulu DNA kódujúcu RetL, ktorá má nukleotidovú sekvenciu akéhokoľvek RetL, ale špecificky zahrnuje cDNA potkanieho retLl (sekvencia SEQ ID NO: 1), čiastočnú cDNA ľudského retLl (SEQ ID NO: 8), neskrátenú cDNA ľudského retLl (SEQ ID NO: 10), cDNA ľudského retL2 (SEQ 1D NO: 12), cDNA myšacieho retL3 (SEQ ID NO: 16), čiastočnú cDNA ľudského retL3 (SEQ ID NO: 18) alebo cDNA ľudského retL3 (SEQ ID NO: 20). Vynález ďalej poskytuje proteín RetL a aminokyselinovú sekvenciu zahrnujúcu sekvenciu potkanieho RetL (SEQ ID NO: 2), čiastočnú sekvenciu ľudského RetLl (SEQ ID NO: 9), neskrátenú sekvenciu ľudského RetLl (SEQ ID NO: 11). Ľudského RetL2 (SEQ ID NO: 13), myšacieho RetL3 (SEQ ID NO: 17), čiastočnú sekvenciu ľudského RetL3 (SEQ ID NO: 19) alebo ľudského RetL3 (SEQ ID NO: 21).

V ďalšom uskutočnení vynález zahrnuje sekvenciu DNA, ktorá obsahuje sekvenciu (čiastočnú cDNA ľudského retLl (SEQ ID NO: 8) inzertu DNA klonu HRL20, ktorý má ATCC č. 97604, alebo sekvenciu inzertu DNA klonu č. 230-5A-86-17 (cDNA potkanieho retLl (SEQ ID NO: 1), ktorý má ATCC č. 98047.

V ďalšom uskutočnení vynálezu má purifikovaná a izolovaná molekula DNA na použitie v bezpečnej expresii polypeptidového produktu v prokaryotickej alebo eukaryotickej hostiteľskej bunke minimálne časť primárnej štrukturálnej konformácie a biologickej aktivity RetL, DNA môže byť a) molekula DNA, ktorá obsahuje cDNA potkanieho retLl, čiastočnú cDNA ľudského retLl, neskrátenú cDNA ľudského retLl, cDNA ľudského retL2, cDNA myšacieho retL3 alebo cDNA ľudského retL3, alebo komplementárne vlákno cDNA potkanieho retLl, čiastočnú cDNA ľudského retLl, neskrátenú cDNA ľudského retLl, cDNA ľudského retLl, cDNA myšacieho retL3 alebo cDNA ľudského retL3, b) molekuly DNA, ktoré by sa vďaka degenerácii genetického kódu hybridizovali s molekulami DNA definovanými v a) alebo b). Predmetom vynálezu je

SK 286115 Β6 tiež purifikovaná a izolovaná molekula DNA kódujúca polypeptidový fragment alebo variant ľudského RetL majúci biologickú aktivitu RetL.

Každá rekombinantná molekula DNA vynálezu môže byť operatívne spojená s expresnou kontrolnou sekvenciou.

Do vynálezu tiež patria vektory a systémy na podávanie, ktoré obsahujú molekuly DNA alebo konštrukcie definované na inom mieste tohto opisu. Vektor môže obsahovať molekulu DNA kódujúcu RetL alebo jeho variant.

Vynález zahŕňa prokaryotické alebo eukaryotické hostiteľské bunky trvalé transformované alebo transfekované s vektorom obsahujúcim molekulu DNA kódujúcu natívny RetL alebo jeho variant.

Purifikovaný a izolovaný ľudský RetL v podstate bez ďalších ľudských proteínov je špecifický pre vynález a tiež spôsob prípravy polypeptidového produktu, ktorý má čiastočnú alebo úplnú primárnu štruktúrnu konformáciu a biologickú aktivitu RetL. Takýto spôsob môže zahrnovať kroky kultivácie pri vhodných podmienkach, prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských buniek transformovaných alebo transfekovaných akoukoľvek molekulou DNA podľa vynálezu spôsobom umožňujúcim expresiu tohto polypeptidového produktu a opätovné získame RetL. Vynález tiež zahrnuje polypeptidový produkt expresie DNA v prokaryotickej alebo eukaryotickej hostiteľskej bunke.

Vynález poskytuje tiež proteíny a proteínové fragmenty, varianty a deriváty, buď rozpustné, alebo viazané na membráne. Vo vybraných uskutočneniach má proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá zahrnuje potkaní RetLl, čiastočnú sekvenciu ľudského REtLl, neskrátený ľudský RetLl, ľudský RetL2, myšací RetL3 alebo ľudský RetL3, alebo variant jednej z týchto sekvencií. V ďalších uskutočneniach je proteín fuzny proteín obsahujúci Ret alebo RetL, fúzovaný k ďalšej molekule alebo fragmentu molekuly, ako je imunoglobulín, toxín, zobrazovacia zlúčenina (na detekciu zobrazovacími technikami) alebo rádionuklid. Patria sem tiež chiméme molekuly RetL.

Ďalšie uskutočnenia vynálezu zahrnujú špecifické monoklonálne protilátky proti RetL podľa vynálezu. Táto protilátka môže byť spojená s toxínom, zobrazovacou zlúčeninou alebo rádionuklidom. Vynález tiež zahrnuje hybridómové bunkové línie, ktoré produkujú špecifické protilátky proti Ret, vrátane AA.FF9, AA.HE3, AF.E9, BA.B1, BB.B6, AA.GE7, CD.F11, AH.E3, CD.G4, AG.E6, BD.G6 a BH.G8 a tiež subklony týchto hybridómov a protilátky tvorené týmito hybridómami alebo subklony týchto hybridómov.

Vynález ďalej zahrnuje spôsob podporovania rastu nového tkaniva alebo podporovanie prežívania poškodeného tkaniva pacienta, vrátane podávania pacientovi liečebne účinného množstva zlúčeniny, ktorá interaguje s bunkovým Ret a tým indukuje autofosforyláciu Ret. Zlúčenina môže byť RetL, RetL2 alebo RetL3, fragment neskráteného RetL alebo protilátka, ktorá sa viaže na Ret. Zlúčenina sa môže podávať súčasne s liečebne účinným množstvom druhej zlúčeniny, ako je GNDF, neurturin alebo molekula príbuzná s GNDF. Zatiaľ čo cieľové tkanivá pre tieto spôsoby liečenia zahrnujú akékoľvek tkanivo, preferované tkanivá zahrnujú obličkové tkanivo, nervové tkanivo, srdce, žalúdok, tenké črevo, miechu alebo pľúca. V jednom uskutočnení je RetL rozpustný RetL. Subjektom spôsobu liečenia môže byť človek.

V ďalšom spôsobe podľa vynálezu je inhibovaná signálna transdukcia (prenos signálu) Ret medzi prvou bunkou exprimujúcou RetL a druhou bunkou kontaktom prvej bunky s rozpustným proteínom Ret alebo s protilátkou proti RetL. Rozpustný proteín Ret môže byť fuzny proteín.

Vynález tiež zahrnuje spôsob delenia toxínu, zobrazovanej zlúčeniny alebo rádionuklidu na bunku exprimujúcu Ret, spôsob zahrnuje kontakt bunky s fúznym proteínom RetL, alebo protilátkou anti-Ret konjugovanou s toxínom, zobrazovacou zlúčeninou alebo rádionuklidom. RetL môže byť RetLl, RetL2 alebo RetL3. V ďalšom spôsobe podľa vynálezu je potlačený rast nádorovej bunky, ktorá exprimuje Ret, krokom spôsobuje kontakt bunky s fuznym proteínom RetL s toxínom alebo rádionuklidom, alebo s protilátkou anti-Ret konjugovanou s toxínom alebo rádionuklidom. Bunka môže byť pritom v tele pacienta a proteín alebo konjugovaná protilátka sa podáva pacientovi. Vo vynáleze je tiež zahrnutý spôsob cielenia toxínu, zobrazovacej zlúčeniny alebo rádionuklidu na bunku exprimujúcu RetL, zahrnujúcu kontakt bunky s fúznym proteínom obsahujúcim Ret a toxín, zobrazovaciu zlúčeninu alebo rádionuklid, alebo protilátku anti-RetL konjugovanú s toxínom, zobrazovacou zlúčeninou alebo rádionuklidom. Ďalšie uskutočnenie zahrnuje spôsob potlačenia rastu nádorovej bunky, ktorá exprimuje RetL. Spôsob obsahuje kontakt bunky s fúznym proteínom Ret s toxínom alebo rádionuklidom, alebo s protilátkou anti-RetL konjugovanou s toxínom alebo rádionuklidom, pritom bunka môže byť v tele pacienta a proteín alebo konjugovaná protilátka sa podáva pacientovi. RetL pre ktorýkoľvek zo spôsobov vynálezu môže byť RetLl, RetL2 alebo RetL3, alebo variant, či fragment RetLl, RetL2 alebo RetL3.

Vynález ďalej poskytuje spôsoby génovej terapie. Jedno uskutočnenie je spôsob liečenia pacienta s poruchou metabolizmu Ret, zahrnujúce podávanie pacientovi vektor obsahujúci molekulu DNA kódujúcu RetL a tiež spôsob podporovania rastu nového tkaniva v tele pacienta, zahrnujúce podávanie takéhoto vektora pacientovi. Ďalšie uskutočnenie zahrnuje spôsob podporovania prežívania poškodeného tkaniva v tele pacienta, jedným krokom spôsobuje podávanie terapeuticky účinného množstva vektora kódujúceho RetL pacientovi.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 je sekvencia cDNA (SEQ ID NO: 1) a z nej odvodená aminokyselinová sekvencia (SEQ ID NO: 2) potkanieho RetLl. Nukleotidová sekvencia zasahuje od 201. bázového páru po bázu 1700 zo sekvencie SEQ ID NO: 1 a obsahuje celý otvorený čítací rámec.

Obrázok 2A je čiastočná sekvencia cDNA (SEQ ID NO: 8) a z nej odvodená aminokyselinová sekvencia (SEQ ID NO: 9) ľudského RetLl. Táto sekvencia je tá, ktorá je vložená do klonu HRL20, uloženého ako ATCC č. 97604.

Obrázok 2B je zložená úplná sekvencia DNA (SEQ ID NO: 10) a odvodená aminokyselinová sekvencia (SEQ ID NO: 11) ľudského RetLl.

Obrázok 3A je porovnanie nukleotidovej sekvencie ľudského RetLl (horný riadok sekvencie) s potkaňou sekvenciou RetLl (spodný riadok sekvencie). Vertikálne riadky medzi nukleotidmi ukazujú identitu v danej pozícii, zatiaľ čo bodka vyznačuje v tej istej pozícii medzeru.

Obrázok 3B je porovnanie aminokyselinovej sekvencie ľudského RetLl (horný riadok sekvencie) s potkaňou sekvenciou RetLl (spodný riadok sekvencie). Vertikálne riadky medzi zodpovedajúcimi aminokyselinami ukazujú identitu vo zvyškoch, zatiaľ čo bodka vyznačuje v tomto zvyšku konzervatívnu substitúciu.

Obrázok 4A je schematické zobrazenie možnej úlohy pre Ret a RetL v interakcii medzi metanefrogénnou mezenchýmovou bunkou a bunkou močovodového pupeňa.

Obrázok 4B je schematické zobrazenie spôsobu testovania transfektantov z cDNA knižnice na prítomnosť klonov, ktoré exprimujú RetL. Prítomnosť exprimovaného RetL v transfektantoch je detegovaná stanovením väzby týchto transfektantov buď na fúzny proteín Ret/Ig, alebo fiízny proteín Ret/alkalická fosfatáza.

Obrázok 5 je schematické zobrazenie ukazujúce konštrukciu plazmidov použitých na expresiu ľudského fuzneho proteínu Ret/IgG.

Obrázok 6 je schematické zobrazenie ukazujúce konštrukciu plazmidov použitých na expresiu ľudského fuzneho proteínu Ret/IgG.

Obrázok 7 je sekvencia cDNA (SEQ ID NO: 12) a odvodená aminokyselinová sekvencia (SEQ ID NO: 13) ľudského RetL2 v klone DSW240. Proteínový čítací rámec sa nachádza medzi nukleotidmi 25 až 1416.

Obrázok 8 je porovnanie aminokyselinovej sekvencie ľudského RetL2 (horný riadok sekvencie) so sekvenciou ľudského RetLl (spodný riadok sekvencie). Vertikálne riadky medzi aminokyselinami ukazujú identitu v danej pozícii, zatiaľ čo bodka vyznačuje medzeru v tejto pozícii.

Obrázok 9 je sekvencia cDNA (SEQ ID NO: 16) a z nej odvodená aminokyselinová sekvencia (SEQ ID NO: 17) myšacieho RetL3.

Obrázok 10 je sekvencia cDNA (SEQ ID NO: 20) a z nej odvodená aminokyselinová sekvencia(SEQ ID NO: 21) ľudského RetL3.

Podrobný opis vynálezu Identifikačné čísla sekvencií

- cDNA potkanieho retLl,

- aminokyselinová sekvencia potkanieho retLl,

- oligomér kid-13,

- oligomér kid-14,

- oligomér kid-15,

- cDNA extracelulámeho potkanieho ret,

- aminokyselinová sekvencia potkanieho Ret,

- čiastočná cDNA ľudského retLl,

- čiastočná aminokyselinová sekvencia ľudského RetLl,

Nukleotidovým a aminokyselinovým sekvenciám uvedeným v špecifikácii sa pridelili nasledovné identifikačné čísla (SEQ ID NO) sekvencií:

SEQ ID NO: SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO cDNA ľudského retLl, aminokyselinová sekvencia ľudského RetLl, cDNA ľudského retL2, aminokyselinová sekvencia ľudského RetL2, čiastočná cDNA myšacieho retL3 (EST AA 50083), čiastočná aminokyselinová sekvencia myšacieho RetL3, cDNA myšacieho retL3, aminokyselinová sekvencia myšacieho RetL3, čiastočná cDNA ľudského retL3, čiastočná aminokyselinová sekvencia ľudského RetL3, cDNA ľudského retL3, aminokyselinová sekvencia ľudského RetL3.

SEQID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID

NO	10
NO	11
NO	12
NO	13
NO	14
NO	15
NO	16
NO	17
NO	18
NO	19
NO	20
NO	21

SK 286115 Β6

Definícia termínov

V opise vynálezu termín „RetL“ znamená každý proteín, ktorý špecificky interaguje s receptorovým proteínom Ret, a ktorý ak reaguje s Ret, spúšťa dimerizáciu Ret alebo autofosforyláciu tyrozínkinázovej domény Ret. Sekvencie DNA, ktoré kódujú RetL a Ret, sú nazývané „retL“ a „ret“ v uvedenom poradí. Ligand môže byť rozpustný alebo prítomný ako molekula naviazaná na membránu a na tej istej alebo inej bunke ako je molekula Ret, pre ktorú spúšťa autofosforyláciu. Pri určitých použitiach alebo interakciách s Ret môže ligand vyžadovať na spustenie autofosforylácie ďalšie molekuly. Ligandy vynálezu zahrnujú spoločné receptory alebo prídavné kofaktory ligandu. Ligandy vynálezu ďalej zahrnujú monoklonálne protilátky (mAbs) antiRet, ktoré pôsobia ako antagonisty Ret spúšťajúci dimerizáciu a autofosforyláciu Ret. Ligand sa môže rôznymi spôsobmi modifikovať, napríklad s toxínom alebo rádionuklidom.

„Porovnaním sekvencií“ sa rozumie porovnanie pozícií jednej sekvencie, buď nukleotidovej, alebo aminokyselinovej, s ďalšou sekvenciou, aby sa umožnilo porovnanie sekvencie relevantných častí jednej s tou istou časťou druhej. Príklad tejto metódy opísal Needleman a kol. (J. Mol. Biol., 48, 443 - 453, 1970). Na metódu sa môžu použiť pohodlne počítačové programy, ako je napríklad program Align (DNAstar, Inc.). Odborníkom je známe, že homologické alebo funkčne ekvivalentné sekvencie zahrnujú funkčne ekvivalentné usporiadanie cysteínových zvyškov v konzervovanom cysteínovom skelete, vrátane aminokyselinových inzercií alebo delécií, ktoré pozmeňujú lineárne tieto cysteíny, ale podstatne nemenia svoj vzťah v zloženej (usporiadanej) štruktúre proteínu. Preto vnútorné medzery a aminokyselinové inzercie v uvažovanej sekvencii sú ignorované, aby sa vyrátal stupeň sekvenčnej homológie aminokyselinovej sekvencie alebo identity medzi uvažovanou a referenčnou sekvenciou. Jedna charakteristika často používaná pri stanoveniach homológie proteínov je podobnosť počtu a lokalizácie cysteínových zvyškov medzi jedným a druhým proteínom.

„Klonovaním“ sa rozumie použitie in vitro rekombinantných techník na zloženie konkrétneho génu alebo inej sekvencie DNA do molekuly vektora. Aby sa požadovaný gén mohol úspešne klonovať, je nevyhnutné použiť metódy na vznik fragmentov DNA, na spájanie fragmentov s molekulami vektora, na vnesenie zloženej molekuly DNA do hostiteľskej bunky, v ktorej sa môže replikovať a na výber klonu, ktorý obsahuje cielový gén z príjemcových hostiteľských buniek.

„cDNA“ sa rozumie komplementárna DNA alebo kópia DNA tvorená z templátu RNA prostredníctvom DNA polymerázy závislej od RNA (reverznej transkriptázy). Teda „kloň cDNA“ znamená dvojitú sekvenciu DNA komplementárnej ku skúmanej molekule RNA nesenej v klonovacom vektore.

„cDNA knižnica“ sa rozumie súbor rekombinantných molekúl DNA obsahujúcich inzerty DNA, ktoré spolu reprezentujú úplný súbor molekúl RNA prítomných v celom organizme alebo tkanive, v závislosti od zdroja templátov RNA. Takáto cDNA knižnica sa môže pripraviť spôsobmi odborníkom známymi, ako sú opísané napr. v Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Všeobecne sa RNA najskôr izoluje z buniek organizmu, z jeho genómu je žiaduce klonovať konkrétny gén. Na tento účel sú podľa predkladaného vynálezu výhodne používané cicavčie a osobitne ľudské bunkové línie. Alternatívne sa RNA môže izolovať z nádorovej bunky, pochádzajúcej zo zvieracieho nádoru výhodne z ľudského nádoru. Tak sa môže pripraviť knižnica z ľudského nádoru nadobličiek, ale môže sa použiť akýkoľvek nádor.

Termín „polymorfizmus DNA“ sa týka stavu, keď môžu existovať dve alebo viac odlišných nukleotidových sekvencií v konkrétnom mieste v DNA.

„Expresný vektor“ opisuje vektory, ktoré sú schopné exprimovať sekvencie DNA v nich klonované, t. j. kódujúce sekvencie sú operatívne spojené s ďalšími sekvenciami schopnými uskutočniť ich expresiu. Je jasné, aj keď nie vždy vyjadrené explicitne, že tieto expresné vektory musia byť replikovateľné v hostiteľskom organizme buď ako epizómy, alebo ako integrálna časť chromozómovej DNA. Užitočný, aj keď nie nevyhnutný prvok účinnej expresie vektora je sekvencia kódujúca marker - značku, čo je sekvencia kódujúca proteín, ktorého následkom je určitá fenotypová vlastnosť (napr. tetracyklínová rezistencia) buniek, ktoré obsahujú proteín, čo umožňuje, že tieto bunky sú ľahko identifikovateľné. Teda termín „expresný vektor“ je daný funkčnou definíciou a akákoľvek sekvencia DNA, ktorá je schopná uskutočniť expresiu prítomného špecifického DNA kóduje v tomto termíne zahrnutá, ako je to aplikované na sekvencie v tomto opise. Tieto vektory sú často vo forme plazmidov, takže „plazmid“ a „expresný vektor“ sú často používané synonymne. Ale vynález zahrnuje aj ďalšie formy expresných vektorov, vrátane fága, ktoré majú ekvivalentnú funkciu a ktoré sú v odbore známe.

Podobne „funkčný derivát“ génu ktoréhokoľvek z proteínov podľa predkladaného vynálezu zahrnuje „fragmenty“, „varianty“ a „analógy“ génu, ktoré môžu byť „podstatne podobné“ v nukleotidovej sekvencií a ktoré kódujú molekulu, ktorá má podobnú aktivitu.

„Molekula príbuzná GDNF“ znamená každú molekulu, ktorá je aspoň na 40 % homologická buď s GDNF, alebo neurturínom a je schopná špecificky viazať RetL.

Termín „gén“ znamená polynukleotidovú sekvenciu kódujúcu polypeptid.

„Homogénnym“ sa rozumie pri odkaze na peptidovú alebo DNA sekvenciu, že primárna molekulová štruktúra (t. j. sekvencia aminokyselín alebo nukleotidov) všetkých molekúl prítomných v danom prípravku je v podstate totožná.

Termín „oligonukleotid“, ako sa tu používa pre molekulové DNA sondy, oligomérové fragmenty, ktoré sa majú detegovať, oligomérové kontroly, neznačené blokujúce oligoméry a primery na amplifikáciu DNA sekvencií, je definovaný ako molekula zložená z viac ako troch deoxyribonukleotidov alebo ribonukleotidov. Presná veľkosť oligonukleotidov závisí od mnohých faktorov, ktoré zase závisia od konečnej funkcie alebo použitia oligonukleotidu.

Termín „sonda“ všeobecne označuje ligand známych kvalít schopný selektívnej väzby na cieľový antiligand. Pri aplikácii na nukleové kyseliny sa termín „sonda“ týka vlákna nukleovej kyseliny, ktorá má sekvenciu báz komplementárnu k cieľovému vláknu.

Termín „rekombinantné hostiteľské bunky“ sa týka buniek, ktoré sa transformovali vektormi skonštruovanými s použitím techník rekombinantnej DNA. Ako sa m definovalo, protilátka alebo jej modifikácia tvorená rekombinantnou hostiteľskou bunkou je výsledkom tejto transformácie, pretože natransformovaný hostiteľ by skôr tvoril malé množstvá, menšie ako detegovateľné.

Termíny „reštrikčná endonukleáza“ a „reštrikčný enzým“ sa týkajú bakteriálnych enzýmov, každý z nich štiepi dvoj vláknovú DNA v špecifickej nukleotidovej sekvencií alebo blízko nej.

Termín „polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov“ („FRLP“) sa týka odlišnosti medzi jednotlivcami v dĺžke konkrétneho reštrikčného fragmentu.

O molekule sa hovorí, že je „podstatne podobná“ inej molekule, ak je sekvencia aminokyselín v obidvoch molekulách v podstate rovnaká a ak obidve molekuly majú podobnú biologickú aktivitu. Tak pri predpoklade, že dve molekuly majú podobnú aktivitu, sa považujú varianty, ako je tento termín tu používaný, dokonca aj keď jedna z molekúl obsahuje ďalšie aminokyselinové zvyšky, ktoré sa nenachádzajú v druhej, alebo keď sekvencia aminokyselinových zvyškov nie je totožná. O molekule sa hovorí, že je „chemický derivát“ inej molekuly, keď obsahuje ďalšie chemické skupiny, ktoré normálne nie sú časťou molekuly. Takéto skupiny môžu zlepšiť molekulovú rozpustnosť, absorpciu, biologický polčas atď. Skupiny môžu alternatívne znižovať toxicitu molekuly atď. Skupiny schopné sprostredkovať takéto účinky sú opísané napríklad v Remington's Sciences, 16, vyd., Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1980.

„Vektorom“ sa rozumie molekula DNA, odvodená z plazmidu alebo bakteriofága, do ktorého sa môžu vložiť alebo klonovať fragmenty DNA. Vektor obsahuje dve alebo viac jedinečných reštrikčných miest a je schopný autonómne sa replikovať v definovanom hostiteľovi alebo nosičskom organizme tak, že klonovaná sekvencia je reprodukovateľná.

Termínom „v podstate čistý“ sa rozumie každý proteín podľa predkladaného vynálezu alebo každý gén kódujúci taký proteín, ktorý je v podstate bez ďalších proteínov alebo génov, alebo bez iných kontaminujúcich zlúčenín, s ktorými môže byť normálne prirodzene nájdený a sám osebe existuje vo forme prirodzene sa nevyskytujúci.

Zlúčeniny podľa vynálezu

Vynález zahrnuje cDNA kódujúcu RetL, ako je nukleotidová sekvencia cDNA potkanieho retLl, čiastočná cDNA ľudského retLl, neskrátená cDNA ľudského retLl, cDNA ľudského retL2, cDNA myšacieho retL3 alebo cDNA ľudského retL3. Okrem toho zlúčeniny vynálezu zahrnujú sekvencie, ktoré obsahujú uvedené sekvencie alebo sú deriváty jednej z týchto sekvencií. Vynález tiež zahrnuje vektory, lipozómy a ďalšie vehikuly (nosiče) vhodné na prenos, ktoré obsahujú jednu z týchto sekvencií alebo derivát jednej z týchto sekvencií. Vynález tiež zahrnuje proteíny transkribované a translatované z cDNA potkanieho retLl, čiastočne cDNA ľudského retLl, úplnej cDNA ľudského retLl, cDNA ľudského retL2, cDNA myšacieho retL3 alebo cDNA ľudského retL3, čo zahrnuje alebo nie obmedzené na potkaní RetLl, čiastočnú sekvenciu ľudského RetLl, úplný ľudský RetLl, ľudský RetL2, myšací RetL3 alebo ľudský RetL3 a ich deriváty a varianty.

Jedno uskutočnenie vynálezu sa týka rozpustného variantu RetL. Rozpustné varianty neobsahujú minimálne úsek intramembránovej časti natívneho RetL. V niektorých príkladoch rozpustný variant neobsahuje fosfatidylinozitolglykánovú väzbu natívneho RetL. Rozpustné varianty zahrnujú fuzne proteíny, ktoré obsahujú deriváty RetL, ktoré neobsahujú fosfatidyl-inozitolový motív.

Varianty sa môžu odlišovať od prirodzene sa vyskytujúceho RetL a aminokyselinovej sekvencie alebo spôsobom, ktorý nepostihuje sekvenciu alebo i oboma možnosťami. Varianty v aminokyselinovej sekvencií sa tvoria, ak je jedna alebo viac aminokyselín v prirodzene sa vyskytujúcom RetL substituovaná odlišnou prirodzenou aminokyselinou. Mimoriadne výhodné varianty zahrnujú prirodzene sa vyskytujúci RetL alebo biologicky aktívne fragmenty prirodzene sa vyskytujúceho RetL, ktorých sekvencie sa líšia od sekvencie divého typu substitúciami jednej alebo viacerých konzervatívnych aminokyselín, ktoré majú typicky minimálny vplyv na sekundárnu štruktúru alebo hydrofóbnu povahu proteínu alebo peptidu. Varianty môžu mať tiež sekvencie, ktoré sa líšia substitúciami, deléciami alebo inzerciami jednej alebo viacerých nekonzervatívnych aminokyselín, ktoré nerušia biologickú aktivitu RetL. Konzervatívne substitúcie typicky zahrnujú substitúcie jednej aminokyseliny druhou s podobnými vlastnosťami vnútri nasledovných skupín: valín, glycín; glycín, alanín; valín, izoleucín; kyselina asparágová, kyselina glutámová; asparagín, glutamín; serín, treonín; lyzín, arginín a fenylalanín, tyrozín. Nepoláme (hydrofóbne) aminokyseliny zahrnujú alanín, leucín, izoleucín, va lín, prolín, fenylalanín, tryptofán a metionín. Poláme neutrálne aminokyseliny zahrnujú glycín, šerm, treonín, cysteín, tyrozín, asparagín a glutamín. Pozitívne nabité (bázické) aminokyseliny zahrnujú arginín, lyzín a histidín. Negatívne nabité (kyslé) aminokyseliny zahrnujú kyselinu asparágovú a kyselinu glutámovú.

Ďalšie konzervatívne substitúcie sa môžu vybrať z nasledovnej tabuľky a ešte ďalšie opísal Dayhoff v At5 las of Proteín Sequence and Structure (1988).

Tabuľka 1: Náhrady konzervatívnych aminokyselín

Aminokyselinu	kód	možno nahradiť s:
Alanín	A	D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginín	R	D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, íle, D-Ile, Om, D-Om
Asparagín	A	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Kyselina asparágová	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cysteín	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamín	Q	D-Gln, AsnD-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Kyselina glutámová	E	D-Glu, D-Asp, Asp. Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glycín	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Beta-Ala, Acp
Izoleucín	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucín	L	D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met
Lyzín	K	D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, íle, D-Ile, Om, D-Om
Metionín	M	D-Met, S-Me-Cys, íle, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val, Norleu
Fenylalanín	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans 3,4 alebo 5-fenylprolín, Cis 3, 4 alebo 5-fenylprolín
Prolín	P	D-Pro, L-I-tioazolidín-4-karboxylová kyselina, D- alebo L-1 -Oxazolidin-4-karboxylová kyselina
Serín	S	D-Ser, Thr, D-Thr. Allo-Thr, Met, D-Met. Met(O), D-Met(0), Val, D-Val
Treonín	T	D-Thr, Ser, D-Ser, Allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(0), Val, D-Val
Tyrozín	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valín	v	D-Val, Leu, D-Leu, íle, D-Ile, Met, D-Met

Ďalšie varianty sú také modifikácie, ktoré zvyšujú peptidovú stabilitu. Tieto varianty môžu obsahovať 10 napríklad jednu alebo viac nepeptidových väzieb (ktoré nahradzujú peptidové väzby) v sekvencii peptidu. Patria sem tiež varianty, ktoré obsahujú zvyšky iných ako prirodzene sa vyskytujúcich sa L-aminokyselín, ako sú D-aminokyseliny alebo aminokyseliny nevyskytujúce sa prirodzene či syntetické aminokyseliny, ako sú beta alebo gama aminokyseliny a cyklické varianty. Inkorporácia D- namiesto L-aminokyselín do polypeptidu môže zvýšiť jeho rezistenciu proti proteázam. Pozri Patent USA č. 5 219 990.

Peptidy podľa vynálezu sa môžu tiež modifikovať rôznymi zmenami, ako sú inzercie, delécie a substitúcie a to buď konzervatívne, alebo nekonzervatívne, pokiaľ takéto zmeny môžu poskytnúť určité výhody pri ich použití. Vo vynáleze sú špecificky zahrnuté tiež zostrihové („splice“) varianty.

Okrem peptidov v podstate neskrátených poskytuje predkladaný vynález biologicky aktívne fragmenty polypeptidov. Polypeptid RetL alebo fragment je biologicky aktívny, ak prejavuje biologickú aktivitu priro20 dzene sa vyskytujúceho RetL. Tieto biologické aktivity zahrnujú schopnosť špecificky viazať extracelulámu časť Ret s afinitou, ktorá je aspoň 50 %, a výhodne aspoň rovnaká, ako je afinita prirodzene sa vyskytujúceho RetL, pre extracelulámu časť Ret. Ďalšia biologická aktivita je schopnosť viazať sa na protilátku, ktorá je namierená proti epitopu, ktorý je prítomný na prirodzene sa vyskytujúcom RetL.

V ďalších uskutočneniach môžu tiež varianty so substitúciami aminokyselín, ktoré sú menej konzervatív25 ne poskytovať požadované deriváty, napr. spôsobením zmien v náboji, konformácii a ďalších biologických vlastnostiach. Tieto substitúcie by zahrnovali napríklad substitúciu hydrofilného zvyšku hydrofóbnym, substitúciu cysteínu alebo prolínu iným zvyškom, substitúciou zvyšku, ktorý má malý bočný reťazec zvyškom s rozsiahlym bočným reťazcom alebo substitúciou zvyšku, ktorý má čistý pozitívny náboj zvyškom s čistým negatívnym nábojom. Keď sa nemôže s istotou predpovedať výsledok danej substitúcie, môžu sa deriváty 30 jednoducho otestovať spôsobmi tu opísanými na určenie výskytu alebo chýbania požadovaných vlastností.

Všeobecne substitúcie, pri ktorých sa očakáva, že vyvolajú zmeny vo funkčných vlastnostiach polypeptidov Ret, sú tie, v ktorých:

SK 286115 Β6

I. hydrofilný zvyšok, napr. serín alebo treonín, je nahradený hydrofóbnym zvyškom, napr. leucínom, izoleucinom, fenylalanínom alebo alanínom,

II. cysteínový zvyšok je nahradený akýmkoľvek iným zvyškom alebo nahradí akýkoľvek zvyšok,

III. zvyšok, ktorý má elektropozitívny bočný reťazec, napr. lyzín, arginín alebo histidín, nahradí zvyšok (alebo je nahradený zvyškom), ktorý má elektronegatívny náboj, napr. kyselina glutámová alebo kyselina asparágová, alebo

IV. zvyšok, ktorý má rozsiahly bočný reťazec, napr. fenylalanín, nahradí zvyšok (alebo je nahradený zvyškom), ktorý takýto bočný reťazec nemá, napr. glycín.

Varianty podľa vynálezu zahrnujú proteíny a peptidy s aminokyselinovými sekvenciami, ktoré majú minimálne 60 % homológie so sekvenciami potkanieho RetLl (SEQ ID NO: 2), čiastočnú sekvenciu ľudského RetLl (SEQ ID NO:: 9), neskrátená sekvencia ľudského RetLl (SEQ ID NO: 11), ľudského RetL2 (SEQ ID NO: 13), myšacieho RetL3 (SEQ ID NO: 17), čiastočnú sekvenciu ľudského RetL3 (SEQ ID NO: 19) alebo ľudského RetL3 (SEQ ID NO: 21). Výhodnejšie je sekvenčná homológia minimálne 80, 90 alebo 95 %. Na určenie homológie je všeobecne dĺžka porovnávaných sekvencií aspoň 8 aminokyselinových zvyškov, obyčajne aspoň 20 aminokyselinových zvyškov. Varianty zlúčenín vynálezu tiež zahrnujú každý protein, ktorý

1. má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 40 % homologická k proteínu RetL vynálezu a tiež ktorá

2. pri optimálnej zhode so sekvenciou RetL (ako je zobrazené pre RetLl a RetL2 na obrázku 8), má aspoň 80 % svojich cysteínových zvyškov v zhode s cysteínmi v proteíne RetL vynálezu.

Práve tak, ako je možné nahradiť substituenty kostru, je tiež možné substituovať funkčné skupiny, ktoré sú naviazané na kostre, skupinami charakterizovanými podobnými vlastnosťami. Takéto modifikácie nemenia primárnu sekvenciu. Tieto budú spočiatku konzervatívne, t. j. skupina, ktorá nahradzuje, bude mať približne rovnakú veľkosť, tvar, hydrofóbnosť a náboj ako pôvodná skupina. Nesekvenčné modifikácie môžu zahrnovať napríklad in vivo alebo in vitro chemické derivovanie časťou prirodzene sa vyskytujúceho RetL a tiež zmeny v acetylácii, metylácii, fosforylácii, karboxylácii alebo glykozylácii.

Vynález sa tiež týka látok, ktoré sa špecificky viažu na protein vynálezu alebo fragment takéhoto proteínu. Tieto látky zahrnujú fúzne proteíny Ig a protilátok (vrátane jednoduchého reťazca, dvojitého reťazca, fragmentov Fab a iných protilátok, či už natívnych, humanizovaných, primatizovaných alebo chimémych). Ďalšie opisy týchto skupín látok možno nájsť v prihláške PCT 95/16709, na ktorého opis sa tu odkazujeme.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Experimentálne postupy

Prehľad stratégie

Všeobecná stratégia použitá na klonovanie RetLl je uvedená na obrázkoch 4A a 4B. Naša stratégia bola založená na predpoklade, že RetL je minimálne exprimovaný v metanefrogénnom mezenchýme vyvíjajúcej sa obličky ako membránový protein (aj keď je možné, že ligand je tiež exprimovaný v rozpustnej forme, obrázok 4A). RetL interaguje s receptorom Ret na bunke močovodového pupeňu, aktivuje jej cytoplazmatickú doménu tyrozínkinázy a posiela jadru signál, ktorý následne aktivuje gény zapojené do rastu a vetvenie močovodového pupeňu. Preto proteíny obsahujúce extracelulámu doménu Ret fúzovanú buď k časti Fc ľudského imunoglobulínu G1 (IgGl), alebo alkalickej fosfatázy (AP) sa môžu použiť ako časť stratégie na klonovanie RetL, ako je uvedené na obrázku 4B. Fúzne proteíny, expresné knižnice a ďalšie reagencie použité na klonovanie RetLl sú opísané.

Najskôr sa izolovala cDNA potkanieho RetLl a potom ju použili ako sondu na izoláciu cDNA ľudského RetLl. Následne sa izolovala cDNA pre RetL2 a RetL3.

Príprava reagencií požadovaných na priame expresné klonovanie ligandov Ret

1. Izolácia cDNA kódujúca extracelulámu doménu potkanieho Ret

Na identifikáciu RetLl sa vytvorili fúzne proteíny, ktoré sa skladali z extracelulámych domén buď potkanieho, alebo ľudského Ret fúzovaných k proteínu, konkrétne časti Fc ľudského IgGl v jednom príklade a k alkalickej fosfatáze v inom príklade. Obidve fúzne partnerské molekuly sa môžu ľahko testovať na detekciu buniek, ktoré exprimujú ligand, ako je uvedené na obrázku 4B.

Pretože cDNA kódujúca potkaní RetL nebola nikdy objavená, izolovali sme cDNA kódujúcu extracelulámu doménu potkanieho receptora Ret s použitím metódy využívajúcej reverznú transkriptázu s následnou polymerázovou reťazovou reakciou (RT-PCR). Porovnali sme nukleotidové sekvencie pre ľudský (prístupové čísla v Genbank M57464 a X15262) a myšací (prístupové číslo v Genbank x67812) ret a navrhli oligonukleotidové primery pre oblasti s vysokou identitou medzi týmito dvoma sekvenciami. „Sense“ oligomér (súhlasný so smerom transkripcie), nazvaný kid-013 (SEQ ID NO: 3) obsahuje nukleotidy 150-169 zo sekvencie z Genbank č. X15262) je vybraný z 5'-konca ľudskej sekvencie cDNA ret, ktorá prekrýva iniciačný kodón

SK 286115 Β6

ATG. Na svojom 5'-konci zahrnuje nukleotidy reštrikčné miesto Nôti na klonovanie. Dva „antisense“ oligoméry (orientované proti smeru transkripcie) nazvané kid-014 (SEQ ID NO: 4, obsahuje komplementárnu sekvenciu nukleotidov 1819 až 1839 zo sekvencie Genbank č. X67912) sú vybrané v uvedenom poradí, z ľudskej a myšacej sekvencie cDNA bezprostredne susediace s 5'-koncom sekvencií, ktoré kódujú transmembránové domény. Oligoméry kid-014 a kid-015 obsahujú prídavné nukleotidy na svojich 5'-koncoch, ktoré kódujú reštrikčné miesto Sali na klonovanie.

Celková RNA sa izolovala z potkanej obličky 14 denného embrya a mRNA sa purifikovala s použitím oligo-dT chromatografie. mRNA sa premenila na cDNA z použitím reverznej transkriptázy AMV a c DNA sa premenila na dvojvláknovú cDNA a amplifikovala sa s použitím polymerázy Taq v štandardnej polymerázovej reťazovej reakcii s oligomérmi kid-013 a kid-015. Syntéza fragmentu PCR s veľkosťou 1942 bp sa potvrdila analýzou alikvoty z reakcie PCR v 1 % agarózovom géli. Zvyšok PCR fragmentu sa štiepil s Nôti a Sali a klonoval sa do pSAB 132 dopredu štiepaného s Nôti a Sali. Výsledný plazmid sa nazval pJCOl 1. Celý inzert plazmidu pJCOl 1 nachádzajúci sa medzi miestami Nôti a Sali sa sekvenoval a je tu uvedený ako extracelulámy cDNA potkaní ret, SEQ ID NO: 6. Translácia tejto sekvencie poskytla peptidovú sekvenciu (SEQ ID NO: 7) pre extracelulámy potkaní Ret. Pretože oligoméry pre PCR sa vybrali z ľudskej a myšacej sekvencie ret, je možné, že nukleotidová sekvencia uvedená ako sekvencia extracelulámej cDNA potkanieho ret a peptidová sekvencia uvedená ako sekvencia extracelulámeho potkanieho Ret, sa môžu líšiť od prirodzenej nukleotidovej sekvencie potkanieho ret a peptidovej sekvencie Ret v oblastiach sekvencií kid-013 a kid-015. Následne sa izolovali klony potkanej cDNA ret z cDNA knižnice z 18 denných potkaních obličiek a pozorovalo sa niekoľko nukleotidových zmien v oblastiach primeru, ktorých následkom sú dve zmeny aminokyselín. Jedna zmena je v signálnej sekvencií (arginín v pozícii 5 na treonín) a jedna zmena je blízko konca extracelulámej domény (kyselina glutámová v pozícii 633 na alanín). Obidve tieto zmeny by nemali ovplyvniť väzbu ligandu.

2. Fúzne proteíny Ret/IgG

Vytvorili sa fúzne proteíny, ktoré sa skladali z extracelulámej domény potkanieho (aminokyselinové zvyšky 1 až 637) a ľudského (aminokyselinové zvyšky 1 až 636) receptora Ret fuzovaného k časti Fc ľudského IgGl.

Konštrukcia plazmidov používaných na expresiu potkanieho fuzneho proteínu Ret/IgG je uvedená schematicky na obrázku 5. Na konštrukciu génu kódujúceho potkaní fúzny proteín Ret/IgG sme štiepili pJCOll (opísaný) obsahujúci extracelulámu doménu potkanieho Ret, so Sali a ligovali sme ho k fragmentu Sali s veľkosťou 700 bp z plazmidu 2 - 4 a vytvorili sme plazmid pJC012. Tento fragment Sali obsahuje časť domény Fc ľudského IgGl pochádzajúceho pôvodne z plazmidu pSAB144. Plazmid 2 - 4 sa vytvoril dopredu trojstupňovou ligáciou: fragment Notl-Sall vzniknutý metódou PCR obsahujúci extracelulámu doménu králičieho receptora TGF-beta typu II; Notl-Sall fragment s veľkosťou 693 bp z pSAB144 obsahujúci časť domény Fc ľudského IgGl; a pSAB132 štiepený s Nôti. Ako sa ukázalo na obrázku 5, fragment obsahujúci doménu Fc sa môže uvoľniť z plazmidu 2-4 ako fragment Sali s veľkosťou 700 bp. PJC012 sa transfekoval do buniek COS a potkaní fúzny proteín Ret/IgG sa purifikoval zo živného média 48 hodín neskôr s použitím chromatografie na Sepharose Protein-A. Aby sa vytvorila stabilná bunková línia produkujúca proteín Ret/IgG, izoloval sa fragment Nôti s veľkosťou 2612 bp z pJC012 obsahujúci celý potkaní fúzny proteín Ret/IgG a klonoval sa miesto Nôti expresného vektora pMDR901. Výsledný plazmid sa nazval pJC022. Plazmid pJC022 sa potom transfekoval do buniek CHO, aby vznikli stabilné bunkové línie. Najviac produkujúca bunková línia sa upravila na suspenznú kultúru. Typické zisky pre líniu CHO potkanieho Ret/IgG sú 75 mg/1.

Konštrukcia plazmidov použitých na expresiu ľudského fúzneho proteínu Ret/IgG je schematicky uvedená na obrázku 6. Aby sa vytvoril gén kódujúci ľudský fúzny proteín Ret/IgG, získali sme plazmid obsahujúci cDNA kódujúcu ľudský receptor Ret od Dr. M. Takahashiho (Department of Pathology, Nagoya University, School of Medicíne, Nagoya, Japonsko). Z tohto plazmidu vznikol fragment PCR s použitím oligomérov kid-013 a kid-014. PCR fragment sa opracoval s enzýmom Klenowovým fragmentom, potom nasledovalo štiepenie s Nôti za vzniku PCR fragmentu s lepivým koncom Nôti a jedným tupým koncom. Tento fragment sa klonoval do vektora pGEMl lzf(+) dopredu štiepaného s EcoRI, opracovaného s Klenowovým fragmentom a štiepeného s Nôti, aby sa vytvoril lepivý koniec Nôti a jeden tupý koniec. Výsledný plazmid sa nazval pJC013. Fragment Notl-Sall s veľkosťou 1916 bp z pJC013 sa izoloval po kompletnom štiepení s Nôti a čiastočnom štiepení so Sali a ligoval k fragmentu Sall-NotI s veľkosťou 693 bp z pSAB144 obsahujúcom časť domény Fc ľudského IgGl a k expresnému vektoru pSAB132 štiepeného s Nôti. Výsledný plazmid sa nazval pJCO15. Inzert v plazmide pJC013 sa sekvenoval a zistilo sa, že obsahuje jednu nukleotidovú odchýlku, ktorá mení jednu aminokyselinu v extracelulámej doméne ľudského Ret (sekvencia Genbank M57464 má C v pozícii 812, zatiaľ čo pJC013 má T v zodpovedajúcej pozícii, čoho následkom je zámena aminokyseliny alanín za valín v pozícii 294 proteínovej sekvencie ľudského Ret). Tento nukleotid sa spätne opravil na C zvyšok špecifikovaný z Genbank č. M57464 miestne cielenou mutagenézou plazmidu pJC013, čím sa vytvo

SK 286115 Β6 ril plazmid pJC023. Izoloval sa fragment BstE2 s veľkosťou 585 bp z pJC023 obsahujúci opravenú nukleotidovú sekvenciu a klonoval sa do plazmidu pJC015, z ktorého sa odstránil fragment BStE2 s veľkosťou 585 bp obsahujúci variantný nukleotid. Nový plazmid sa nazval pJC024. Izoloval sa fragment Nôti s veľkosťou 2609 bp z pJC024 obsahujúci celý ľudský fúzny proteín Ret/IgG a klonoval sa do miesta Nôti expresného vektora pMDR901. Výsledný plazmid sa nazval pJC025. Plazmid pJC025 sa transfekoval do buniek CHO, aby vznikli stabilné bunkové línie. Najviac produkujúca bunková línia sa upravila na suspenznú kultúru. Typické zisky pre líniu CHO ľudského Ret/IgG sú 6 mg/1.

Ďalšie detaily vytvárania vektorov použitých v spôsoboch podľa vynálezu sú uvedené z prihláške PCT 94/01456 a 92/02050, na ktorých opis sa tu odkazujeme.

3. Biologická aktivita fuznych proteínov Ret/IgG

Aby sa určilo, či fúzne proteíny Ret/IgG, ktoré sme vytvorili, sú biologicky aktívne a teda by boli dobré testovacie reagencie na klonovanie RetL, uskutočnili sme niekoľko orgánových kultivačných testov na biologickú aktivitu. Orgánový kultivačný test sa skladal z pestovania potkaních obličiek 13 - 14 dní starého embrya v orgánovej kultúre počas 3 - 5 dní v prítomnosti fúzneho proteínu Ret/IgG s koncentráciou 50 ug/ml. Obličky sa tiež pestovali v prítomnosti LFA-3TIP/IgG alebo nosičového pufra. Po kultivačnom čase sú niektoré obličky zafarbené s fluorescenčným lektínom Dolichos Biflorus Agglutinin (DB lektín), ktorý zafarbí tkanivá zberného kanálika, čo sú epitelové bunky pochádzajúce z močovodového pupeňu. Tieto „DB“ pozitívne bunky označujú Ret-pozitívne bunky, pretože Ret je exprimovaný v bunkách močovodového pupeňu a jeho epitelových derivátoch. To poskytuje hrubé vyhodnotenie vplyvu fúzneho proteínu Ret/IgG na rast a vývoj embryonálnych obličiek. Je tu jasná odlišnosť v morfológii a raste zberného kanálika medzi obličkami, ktoré sa pestovali s LFA-3TIP a tými, ktoré sa pestovali s potkaním fuznym proteínom Ret/IgG. Obličky opracované s Ret/IgG majú zberné kanáliky, ktoré majú významne menšie vetvenie a sú typicky celkovo menšie.

Z ďalších obličiek sa pripravili parafínové rezy na histologické vyšetrenie. Embryonálne obličky sa ošetrili s kontrolným pufrom alebo s Ret/IgG a potom sa zafarbili hematoxylínom a eozinom. Embryonálne obličky opracované Ret/IgG mali menšie vetvenie zberných kanálikov, ako kontrolné embryonálne obličky opracované pufrom. Okrem toho obličky opracované s Ret/IgG mali menej kanálikov. Tento účinok sme tiež pozorovali pri opracovaní ľudským fúznym proteínom Ret/IgG. Tieto pozorovania sú v súlade s fúznymi proteínmi blokujúcimi induktívny signál medzi mezenchýmom a močovodovým pupeňom. Preto uzatvárame, že fúzny proteín je vhodný na klonovanie RetL.

4. Fúzny proteín Ret/alkalická fosfatáza

Fúzne proteíny receptor/alkalická fosfatáza (AP) sa úspešne použili na identifikáciu a klonovanie ligandov pre c-kit (Celí, 63, 185, 1990), ligandov pre členov rodiny eph receptorov (Celí, 79, 157, 1994) a nedávno na klonovanie receptorov pre leptín, produkt génu ob (Celí, 83, 1263, 1995). Plazmidy kódujúce potkaní fúzny proteín Ret/AP sa vytvorili v bunkách COS7 v bunkových fermentoroch. Následne sa vytvorila stabilná bunková línia NIH3T3 exprimujúca priemerne 10 mg/1 fúzneho proteínu. Analýza potkanieho proteínu Ret/AP metódou SDA-PAGE naznačuje, že jeho veľkosť je konzistentná s predpovedanou molekulovou hmotnosťou a analýza gólovou filtráciou indikuje, že sa tvorí ako dimér. Čiastočná purifikácia sa dosiahla afinitnou chromatografiou na kolóne anti-AP.

Protilátky anti-Ret

Pripravila sa králičia polyklonálna protilátka proti potkaniemu fúznemu proteínu Ret/IgG. Protilátka je funkčná pri Western prenose, analýze bunkových línií Ret-pozitívnych pomocou FACS a pri imunohistochemickom vyšetrení rezov embryonálnych obličiek.

Vytvoril sa panel škrečích monoklonálnych anti-potkaních protilátok Ret. Na imunizáciu arménskych škrečkov sa použil potkaní fúzny proteín Ret/IgG pripojený k sefaróze s proteínom A (Protein-A Sepharose). Po fúzii sa získalo 316 klonov a testovalo sa na schopnosť viazať potkanie fúzne proteíny Ret alebo ľudské IgG v teste ELISA. 11 klonov tvorilo protilátky, ktoré sa viazali iba na potkaní Ret/IgG (a potkaní Ret/AP), ale nie na ľudský IgG. Skrížená reaktivita k ľudskému Ret sa testovala pomocou FACS, štyri klony tvorili protilátky, ktoré sa mohli viazať na Ret-pozitívnu ľudskú bunkovú líniu THP-1. Nasledovná tabuľka zhrňuje väzbové vlastnosti 12 monoklonálnych protilátok k Ret.

Kloň	ELISA potkaní Ret/Ig	FACS ľudský THP-1
AA.FF9.5	+	-
AA.HE3.7		+
AF.E9.5	4-	-
BA.BI. 16	+	-

SK 286115 Β6

Kloň	ELISA potkaní Ret/Ig	FACS ľudský THP-1
BB.B6	+	-
AA.GE7.3	+	-
CD.F11.2	+	-
AH.E3.il	+	+
CD.G4.2	+	+
AG.E7.9	+	-
BD.G6	+	+
BH.G8	-	-

6. Expresná cDNA knižnica

Pripravila sa cDNA knižnica z potkaních embryonálnych obličiek, jedna vo vektore CDM8, ktorý používa na amplifikáciu replikačný počiatok SV40 a jedna v modifikovanom vektore InVitrogen pCEP4, ktorý na amplifikáciu používa replikačný počiatok EBV. Modifikovaný vektor CH269 má odstránenú génovú sekvenciu EBNA-1. Proteín EBNA-1 interaguje s replikačným počiatkom RBV, ale tento gén nie je vo vektore potrebný, ak sa použili bunky, ktoré trvalo exprimujú proteín EBNA. Knižnica vo vektore CDM8 obsahuje 1,5 x 10^Λ klonov s priemernou veľkosťou inzertu asi 1,18 kb, zatiaľ čo knižnica vo vektore CH269 obsahuje asi 1 x 10^Λ klonov s priemernou veľkosťou inzertu 1,5 kb.

Expresné klono vanie RetLl, Ugandu Ret.

A. Klonovanie potkanieho RetLl, Ret ligandu

L Počiatočné pokusy expresného klonovanie Ret ligandu RetLl

Na klonovanie retLl sa vyskúšalo niekoľko metód priamej expresie. Všetky tieto metódy sú založené na myšlienke ilustrovanej na obr. 4B. cDNA z knižnice sa vložili do cicavčích buniek, bunky obsahujúce RetLl sa potom môžu identifikovať pomocou fúznych proteínov Ret. Aj keď tri ďalej opísané metódy neboli úspešné, pomohli získať skúsenosti a dôležité poznatky, ktoré viedli k úspechu pri použití ďalšej metódy.

A. Metóda „ryžovania“ pomocou Ret'IgG

Potkaní fúzny proteín Ret/IgG sa použil v pokuse o izoláciu RetLl pomocou priameho expresného klonovania metódou „ryžovania“ (Aruffo a Seed, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 8753 - 8757, 1987). Na tento pokus sa použila CDM8 knižnica cDNA z potkaních 18 denných embryonálnych obličiek. Súbory (tzv. „pool“) cDNA z tejto knižnice (5 000 až 10 000 cDNA v jednom súbore) sa vniesli do COS buniek DEAE-dextránovou metódou. Po 48 hodinách sa bunky odstránili z misiek s EDTA, inkubovali sa s fuznym proteínom a potom rozotreli na misky pokryté antiľudskou protilátkou IgGl. Z buniek, ktoré sa prichytili, sa izolovala DNA, spätne transformovala do E. coli a potom sa znova izolovala v druhom kole „ryžovania“. Po treťom kole „ryžovania“ neboli vidieť už žiadne bunky a po transformácii Hirtovej frakcie DNA späť do E. coli možno pozorovať iba niekoľko málo klonov. VCAM cDNA, konjugovaná s monoklonálnou protilátkou anti-VCAM, použitá ako pozitívna kontrola, sa mohla riediť až 1 : 100 a stále sa dala detegovať, čo ukazuje, že použité súbory boli asi veľmi veľké. Analýza niekoľkých klonov získaných po druhom kole „ryžovania“ ukazuje, že v klonoch dochádza k reorganizáciám a deléciám.

B. Preparatívne použitie FACS s Ret/IgG

000 klonov z cDNA knižnice z potkaních 18 denných embryonálnych obličiek (vektor CDM8) sa vnieslo do buniek COS7 a potom sa analyzovalo preparatívne pomocou FACS s využitím proteínu Ret/IgG z potkana nasledované druhou protilátkou označenou fluorescenčnou značkou. Vrcholy 0,5 % a 0,9 % fluoreskujúcich buniek sa odobrali a DNA z nich sa izolovala Hirtovou lýzou. Elektroporáciou sa potom DNA vniesla späť do E. coli, čím sa získalo 228 klonov pre 0,5 % súbor a 752 klonov pre 0,9 % súbor. Z klonov sa získala DNA a potom sa použila v druhom kole preparatívnej analýzy FACS. Plazmidy získané z bakteriálnych klonov na konci druhého kola sa analyzovali, ale zistilo sa, že obsahujú veľké génové reorganizácie a delécie.

C. Kolorimetrická detekčná metóda s Ret/AP

Bunky COS sa transfekovali so 400 súbormi cDNA klonov (1 000 klonov v každom súbore) z knižnice cDNA z potkaních 18 denných embryonálnych pečení (vektor CDM8) a potom sa bunky zafarbili pomocou proteínu Ret/AP a kolorimetrickým substrátom pre alkalickú fosfatázu. Transfekované bunky sa potom skúmali pod mikroskopom na pozitívny signál. V jednom pokuse sa našlo 5 potenciálne pozitívnych buniek, ale pri opakovanej analýze boli negatívne.

Ako kontrola k proteínu Ret/AP sa pripravil proteín VCAM/AP fúziou prvých dvoch domén ľudskej VCAM k N-koncu AP z placenty (VCAM sa viaže k integrínu VLA4, ktorý je zložený z dvoch reťazcov, a to

SK 286115 Β6 alfa-4 a beta-1). Prechodná transfekcia COS buniek poskytla dostatok proteínu VCAM/AP na kontrolné pokusy. Proteín VCAM/AP sa porovnal VCAM/IgG priamo naviazaným na AP, aby sa vyhodnotila ich schopnosť detegovať VLA4 na COS bunkách transfekovaných alfa-4 reťazcom cDNA (COS už exprimuje reťazec beta-1). Výsledky ukazujú, že zatiaľ čo proteín VCAM/AP môže detegovať VLA4 na transfekovaných bunkách, najlepšiu detekciu umožňuje proteín VCAM/IgG v kombinácii so sekundárnou protilátkou z naviazanou AP.

D. Metodologické závery

Hlavné závery vyplývajúce z týchto úvodných klonovacích pokusov sú nasledovné:

1. Metódy, ktoré vyžadujú, aby sa plazmidy znovu izolovali pre nasledujúce kolo („ryžovanie“ alebo preparatívna FACS) nie sú vhodné, pokiaľ je hľadanej cDNA málo, pretože počas týchto metód sa objavujú génové reorganizácie a delécie. Vzhľadom na nízku úroveň expresie Ret je opodstatnené sa domnievať, že expresia RetLl je tiež nízka. Výhodný spôsob je transfekovať pomocou súborov a potom použiť takú metódu, ktorá dovoľuje detegovať pozitívny súbor. Pôvodný súbor sa potom môže rozdeliť, pričom sa prechodne exprimovaná DNA nemusí izolovať z transfekovaných buniek.

2. Proteín Ret/IgG má, ak je naviazaný na sekundárne činidlo, lepšiu detekčnú schopnosť ako proteín Ret/AP.

3. Kontrolné pokusy s kontrolným proteínom VCAM/IgG (a sekundárnou protilátkou s naviazanou AP) a cDNA pre integrín alfa-4 (vložená do vektora CDM8 a transfekovaná do buniek COS) ukazujú, že detekčné možnosti sú asi jedna k tisíc (to znamená, že veľkosť súboru nemôže presahovať 1 000 klonov). Aby sme dosiahli zlepšenú úroveň citlivosti, vymenili sme vektor založený na SV40 (exprimovaný v COS bunkách) za vektor založený na EBV (exprimovaný v bunkových líniách pozitívnych na EBNA). Vektory založené na EBV sa udržujú ako epizómu a nie sú pre bunky tak toxické ako vektory založené na SV40 po namnožení. Existujú významné dôkazy, že gény môžu byť týmito vektormi exprimované vo vyššej hladine a že cDNA sa môže omnoho viac riediť (t. j. až 1 : 80 000) a je možné ju stále detegovať.

2. Skríning súborov z cDNA knižnice založenej na EBV.

Súbory klonov z cDNA knižnice z potkaních 18 denných embryonálnych obličiek (vektor CH269 odvodený z EBV) sa podrobili skríningu s fúznym proteínom Ret/IgG. V jednom pokuse vzniklo 256 súborov, z ktorých každý obsahoval 5 000 klonov z knižnice. Stručne povedané, alikvotný diel z knižnice cDNA sa titroval, 5 000 buniek sa vyslalo (256x) a nechali sa narásť cez noc. Kolónie sa potom zotreli do média, časť kultúry sa použila na vytvorení glycerolového zásobného roztoku každého súboru (uložili sa pri -70 °C) a časť sa použila na izoláciu plazmidu. DNA z 256 súborov sa jednotlivo transfekovala EBNA293 (8xl0⁵ buniek na 60 mm miske) lipofektínovou metódou. Po 48 hodinách sa bunky opláchli dvakrát s pufrom HBHA (0,5 mg/ml BSA, 0,1 % NaN₃, 20 mM HEPES, pH 7,0) a inkubovali sa s 20 gg/ml potkanieho proteínu Ret/IgG v pufrovanom soľnom roztoku s lmM MgCl₂ a CaCl₂ asi 60 až 90 minút pri teplote miestnosti. Po tejto inkubácii sa bunky 4x opláchli v HBHA pufri a 30 sekúnd fixovali roztokom 60 % acetón/3 % formaldehyd/20mM HEPES (pH 7,0). Po dvoch premytiach v pufri HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,0), sa bunky inkubovali so sekundárnou protilátkou s naviazanou AP (kozí anti-ľudský IgG F(ab')2 špecifický pre Fc-gama (Jackson Immuno Research Laboratories, katalóg, č. 109-056-098, riedenie 1 : 5 000 v soľnom roztoku pufrovaného fosfátom s 1 mM MgCl₂ a CaCl₂) počas 60 minút pri teplote miestnosti. Bunky sa potom premyli dvakrát v HBS pufri a dvakrát substrátovým pufrom pre AP (100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) obsahujúcim 2x supresor fosfatázy Immuno Pure® (Pierce, katalóg, č. 35002). Posledný kúpeľ sa ponechal 15 minút. Substráty AP NBT (0,33 mg/ml) a BCIP (0,17 mg/ml) sa pridali v AP substrátovom pufri obsahujúcom AP inhibítor (Pierce) a inkubovali sa s bunkami 5 až 20 minút. Doštičky sa potom opláchli dvakrát vodou. Potom sa doštičky vyšetrovali pod mikroskopom na prítomnosť purpurovo zafarbených buniek.

Analýzou 256 súborov sa našlo 17 pozitívnych súborov v priebehu primárneho skríningu. DNA z každého pozitívneho súboru sa znova transfekovala do buniek 293/EBNA a celý postup sa znova opakoval s ďalšími dodatočnými kontrolnými pokusmi na potvrdenie toho, že pozorované zafarbenie je špecifické pre Ret/IgG 10 zo 17 pozitívnych súborov malo farbenie iba s fuznym proteínom Ret/IgG, ale vôbec s inými fuznymi proteínmi IgG.

3. Rozdelenie súboru č. 230

Ako príklad bol jeden z opísaných pozitívnych súborov, označený č. 230, rozdelený na menšie podsúbory, aby bolo možné v rámci súboru identifikovať cDNA, ktorá zodpovedá za väzbu k fúznemu proteínu RetL/IgG. 600 buniek z glycerolového zásobného roztoku súboru č. 230 sa vyslalo (10 x) a pestovalo cez noc. Kolónie z týchto misiek sa zotreli do média: jedna desatina kultúry sa použila na prípravu glycerolového zásobného roztoku a zostávajúca časť sa použila na izoláciu DNA. Týchto 10 podsúborov sa označilo 230-1A až 230-5A a 230-1B až 230-5B. DNA z týchto podsúborov sa transfekovala do buniek 293/EBNA a opa

SK 286115 Β6 koval sa celý opísaný postup zafarbenia pomocou fuzneho proteínu Ret/IgG. Jeden podsúbor č. 230.5A bol pozitívny pri farbení na proteín Ret/IgG.

Podsúbor č. 230-5A sa ešte ďalej rozdelí, aby sa mohla ešte v rámci podsúboru identifikovať cDNA, ktorá zodpovedá za väzbu k fúznemu proteínu Ret/IgG. Bunky z glycerolového zásobného roztoku súboru č. 230-5A sa vyslali a pestovali cez noc. Kolónie sa zozbierali do jamiek siedmich 96 jamkových doštičiek zariadenia Bioblock® a pestovali cez noc. Z každých 96 jamiek z zariadení Bioblock® sa vytvorili 4 súbory po 20 klonov a jeden súbor so 16 klonmi. Takže zo siedmich zariadení Bioblock® sa vytvorilo celkovo 35 súborov označených 230-5A-71 až 230-5A-105. Z každého súboru sa izolovala DNA a transfekovala do buniek 293/EBNA a znova sa testovala s fúznym proteínom Ret/IgG, ako sa už skôr opísalo. Súbor č. 230-5A-86 bol pozitívny.

Súbor č. 230-5A-86 sa rozdelil a identifikovalo sa všetkých 20 klonov, ktoré sa pri vytvorení tohto súboru zmiešali. Z každého z týchto dvadsiatich klonov sa izolovala DNA a jednotlivo sa transfekovala do buniek 293/EBNA a znova s testovala s fúznym proteínom Ret/IgG, ako už bol skôr opísané. Súbor č. 230-5A-86-17 bol pozitívny.

4. Charakterizácia klonu č. 23O-5A-86-17

Kloň č. 230-5A-86-17 (pomenovaný tiež retL-17 alebo kloň 17, uložený ako ATCC č. 98047) sa ďalej analyzoval DNA sekvenovaním. Celá nukleotidová sekvencia inzertu tohto klonu je tu uvedená ako SEQ ID NO: 1 (potkania cDNA retLl) a časť nukleotidovej sekvencie je tiež uvedená na obr. 1. V tejto sekvencii sa našiel čítací rámec kódujúci proteín zložený z 468 aminokyselín (potkaní RetLl). Predpovedaný proteín má signálnu sekvenciu s predvídavým štiepnym miestom po 24. aminokyseline (Von Heijne a kol., Nucl. Acid. Res. 14: 14683, 1986). Hydrofóbny C-koniec ukazuje, že proteín by mohol byť naviazaný na bunku prostredníctvom fosfatidylinozitolglykánovej väzby. Sú tu predpovedané tri N-glykozylačné miesta. Tieto vlastnosti zodpovedajú tomu, čo sa dá pre ligand proteínu Ret očakávať.

Rozpustné formy potkanieho proteínu RetLl je možné exprimovať tak, že sa gén skráti pred hydrofóbnym C-koncom. Napr. by sa to mohlo urobiť skrátením za lyzínom 435 (v potkanom RetLl). Skrátenie proti smeru transkripcie od tejto aminokyseliny môže spôsobiť expresiu rozpustnej formy potkanieho proteínu RetLl. Rozpustný potkaní proteín sa môže exprimovať buď sám, alebo ako časť fúzneho proteínu s ľudským imunoglobulínom, histidínovou značkou alebo malým epitopom, ktorý je rozpoznávaný protilátkou.

B. Klonovanie ľudského RetLl, ligandu Ret cDNA knižnica z ľudských embryonálnych obličiek vo vektore lambda gtlO sa získala z firmy Clontech (katalóg, č. HL5004A). Jeden milión jednotiek tvoriacich plaky zo zásobného roztoku sa vyslal na misky Nunc™. Vytvorili sa duplikatívne odtlačky plakov na filtre Opitran™ firmy Schleicher and Schuell. Sonda sa vytvorila štiepením plazmidu nesúceho potkaní retLl s reštrikčným enzýmom PvuII, po ktorom nasledovala izolácia fragmentu s veľkosťou 1,34 kb z agarózového gélu a tento fragment zodpovedal nukleotidom 242 až 1 582 sekvencie potkanieho RetL (potkania cDNA retLl). Táto sonda z kódujúceho úseku sa ³²P pomocou náhodných primerov (Feinberg a Vogelstein, Anál. Biochem. 137: 266 - 267, 1984). Filtre sa hybridizovali cez noc pri 55 °C v 300 ml pufru pre skríning plakov PSB (50 mM Tris HC1 pH 7,5, IM NaCl, 0,1 % pyrofosforečnan sodný, 0,2 % PVP a 0,2 % Ficoll) obsahujúceho 10 % dextránsulfát, 100 /zg/ml tRNA a 6,7 x 10⁷ cpm potkanej sondy. Potom sa filtre opláchli v pufri PSB a dvakrát v 2xSSC/l %SDS pri 55 °C a film sa exponoval pri teplote -70 °C s intenzifikačným tienidlom.

Duplikáty pozitívnych plakov sa preniesli do média SM (100 mM NaCl, 10 mM SO₄, 50m M Tris pH 7,5) so želatínou. 24 z týchto pozitívnych plakov sa purifikovalo. Lambda DNA získaná minipreparáciou z týchto vybraných plakov sa štiepila s Nôti, rozdelila elektroforézou v 1 % agaróze a potom sa analyzovala Southem prenosom. V Southem hybridizácii sa použila sonda kódujúca úsek potkanieho RetLl. Kloň HRL20 mal najdlhší inzert (4,4 kb), ktorý hybridizoval intenzívne s potkaňou sondou. Sekvencie DNA (čiastočná cDNA ľudského retLl, SEQ ID NO: 8, obr. 2A) a odvodená sekvencia peptidu (čiastočná sekvencia ľudského RetLl, SEQ ID NO: 9, obr. 2A) sa získali z tohto klonu, čo potvrdzuje, že ide o ľudský homológ. Tento kloň obsahuje väčšinu kódujúceho úseku, vrátane 3'-konca kódujúceho úseku.

Na prípravu 5'-konca ľudskej cDNA sa získala súprava cDNA z ľudských obličiek Marathon-Ready™ (Clontech, katalóg, č. 7423-1). Syntetizovali sa antiscnse nukleotidy (t. j. nukleotidy s orientáciou proti zmyslu normálnej transkripcie) Kid-155, zodpovedajúci komplementárnej sekvencii k nukleotidom 62 až 81 SEQ ID NO: 8 (čiastočná cDNA ľudského retLl) a Kid-154, zodpovedajúci nukleotidu 17 až 43 SEQ ID NO: 8 (čiastočná cDNA ľudského retLl). PCR sa uskutočnila pomocou súpravy Advantage™ cDNA PCR (Clontech katalóg, č. 8417-1) kombinovanej s niektorými činidlami zo súpravy Marathon™ cDNA a pomocou oligonukleotidov Kid-155 a Kid-154. Prvá reakcia PCR sa zostavila nasledovne: 35,5 μΐ H₂O, 5,0 μΐ 10 x x pufor pre enzým Klen Taq, 1,0 μΐ zmesi 10 mM dNTP, 1,0 μΐ 50 x zmes polymeráz Klen Taq Advantage™. Tieto reagencie sa zmiešali a zmes sa premiešala. Potom sa pridalo 5,0 μΐ cDNA z fatálnej pečene Marathon-Ready™, 1,0 μΐ 10 μΜ primeru AP1 a 1,5 μΐ 6,4 μΜ Kid-155 (celkový objem reakcie 50 μΐ). PCR sa

SK 286115 Β6 uskutočnila v cyklovacom termostate Perkin-Elmer Cetus DNA Cycler 480 s nasledujúcim nastavením cyklov: 1 cyklus 94 °C 1 minútu, 30 cyklov 94 °C 30 sekúnd, 55 °C 30 sekúnd, 68 °C 4 minúty. S produktom prvej PCR sa následne uskutočnila „hniezdová“ PCR („nested“ PCR). Najskôr sa 5 μΐ produktu z prvej reakcie nariedilo 50 x v TE (celkový objem 250 μΐ). Hniezdová PCR obsahovala 35,5 μΐ H₂O, 5,0 μΐ 10 x pufor pre enzým Klen Taq, 1,0 μΐ zmesi 10 mM dNTP, 1,0 μΐ 50 x zmes polymeráz Klen Taq Advantage™. Reagencie sa zmiešali rovnako, ako sa opísalo pri predchádzajúcej reakcii, potom sa pridalo 5 μΐ nariedeného produktu prvej reakcie, 1,0 μΐ 10 μΜ primeru AP2 a 1,5 μΐ 6,9 μΜ primeru Kid-154. Podmienky cyklovania boli rovnaké, ako sa už opísalo v predchádzajúcej reakcii. Podmienky cyklovania boli rovnaké, ako sa už opísalo v predchádzajúcej reakcii. Výsledný produkt s približnou veľkosťou 700 bp sa purifikoval v 1 % agaróze s nízkym bodom tuhnutia a extrahoval fenolom. Purifikovaná DNA sa klonovala do miesta EcoRV plazmidu pZero™ (Invitrogen, katalóg, č. K2510-01). Zo zopakovaných izolácií obsahujúcich klony HRL7G6 a HRLG8 sa získala informácia o sekvencii.

Sekvencia získaná z klonu HRL7G8 sa čiastočne prekrýva so sekvenciou z klonu HRL20 (čiastočný cDNA ľudského retLl) a použila sa preto na vytvorenie úplného ľudského RetLl (cDNA s plnou dĺžkou ľudského RetLl) ako je uvedené na obr. 2B. Nukleotidová sekvencia získaná z klonu HRL7G8 predstavuje nukleotidy 1 až 250 z úplnej cDNA RetLl, zatiaľ čo sekvencia klonu HRL20 predstavuje nukleotidy 460 až 1682 z úplnej ľudskej cDNA RetLl. Sekvencia získaná z klonu HRL7G8 sa ešte potvrdila sekvenovaním iného klonu cDNA (GJ102) izolovaného z cDNA knižnice z ľudských embryonálnych obličiek vo vektore lambda gtlO, ktorá už bola opísaná vyššie, pomocou sondy odvodenej z klonu HRL7G6. Nukleotidy 118 až 1497 obsahujú proteínový čítací rámec úplnej cDNA pre ľudský RetLl.

Úplná sekvencia aminokyselín ľudského Retl 1 je uvedená na obr. 2B. Ako ukázala analýza BESTFIT uvedená na obr. 3A, ľudská cDNA retLl je na 88,2 % identická s potkaňou cDNA retLl. Porovnanie peptidov (obr. 3B) ukazuje, že predpokladaná ľudská proteínová sekvencia je na 93,3 % identická a na 97,2 % podobná s potkaňou sekvenciou.

Klonovanie ligandu RetL2

A. Klonovanie ľudského RetL2

Peptidová sekvencia potkanieho RetLl sa použila na prehľadanie databázy GenBank pomocou programu BLAST, aby sa identifikovali príbuzné proteíny (t. j. izológy). Program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) používa metódu, ktorú publikovali Altschul a kol. (J. Mol. Biol. 215: 403 - 410, 1990) na vyhľadávanie podobnosti medzi požadovanou sekvenciou a všetkými sekvenciami v databáze. Požadovaná sekvencia a sekvencie v prehľadávanej databáze môžu byť buď peptidová, alebo nukleotidová sekvencie v ľubovoľnej kombinácii. Keď sa peptidová sekvencia potkanieho RetLl porovnala s nukleotidovou databázou klonov EST, našli sa dve významné zhody. Jeden kloň bol uvedený v GenBank pod číslom R02249, čo je EST kloň s veľkosťou 229 bp z kombinovanej cDNA knižnice z ľudskej pečene a sleziny a druhý kloň GenBank č. H12981, čo bol EST kloň s veľkosťou 521 bp z cDNA knižnice z ľudského detského mozgu. Obidva EST klony majú 99 % identitu v prekrývajúcej sa oblasti, čo ukazuje, že sú z rovnakej cDNA. Z EST klonu H12981 sa vytvorili oligonukleotidy KID-228 (GAA TGA CAA CTG CAA GAA GAA GCT GCG CTC CTC, zodpovedajúce nukleotidom 38 až 67 a tiež nukleotidom 534 až 563 sekvencie SEQ ID NO: 12) a antisense nukleotid KID-229 (GTG TAC TCG CTG GGC ACC CG, zodpovedajúci komplementárnej sekvencii k nukleotidom 156 až 175 a tiež komplementárnej sekvencii k nukleotidom 652 až 671 sekvencie SEQ ID NO: 12).

lxlO⁶ jednotiek tvoriacich plaky z cDNA knižnice z ľudskej fetálnej pečene 5'-Stretch Plus Lambda GT10 (Clontech, katalóg, č. HL5OO3a) sa podrobilo skríningu na duplikátoch na filtroch Optitran™. Filtre sa hybridizovali cez noc pri 65 °C s oligonukleotidmi KID-229 a KID-228 značenými ³²P v 400 ml pufra na skríning plakov, 50 mM Tris pH 7,5, IM NaCl, 0,1 % dextránsulfát, 100 μg/ml tRNA, 80 pmol každého značeného oligonukleotidu. Potom sa filtre dvakrát opláchli s 2xSSC/l % SDS a dvakrát v lxSSC/1 % SDS a film sa exponoval. 11 duplikátov pozitívnych plakov sa purifikovalo. DNA z každého z týchto klonov sa analyzovala tak, že bola štiepená s reštrikčným enzýmom, potom sa rozdelila elektroforézou a potom prenesená Southem prenosom Filtre sa potom hybridizovali s KID-228 a KID-229 na potvrdenie toho, že inzerty hybridizujú so sondou. Inzert klonu DSW240 sa úplne sekvenoval (ľudský retL2, SEQ ID NO: 12) a je uvedený na obr. 7.

Nukleotidy 25 až 1 416 obsahujú proteínový čítací rámec pre ľudskú cDNA retl2, ktorá kóduje proteín z 464 aminokyselín (ľudský RetL2, SEQ ID NO: 13) a je uvedený na obr. 8, ľudský proteín RetL2 je na 49,1 % identický a na 63 % podobný ľudskému proteínu RetLl. Má spoločne s RetLl hydrofóbny N-koniec, čo ukazuje na fosfatidylinozitolglykánový väzbový motív. Okrem toho je konzervovaných 30 cysteínových zvyškov z 31 prítomných v každom proteíne.

SK 286115 Β6

B. Dôkaz toho, že Retl2 je ligandom Ret

Ukázali sme, že RetL2 je ligandom Ret tak, že bunky 293/EBNA sa transfekovali expresným plazmidom obsahujúcim inzert klonu DSW240 a potom sa ukázalo, že tieto bunky viažu rozpustný fúzny protein Ret/IgG.

Inzert DSW240 sa vybral pomocou Nôti a klonoval z expresného vektora CH269 obsahujúceho počiatok EBV, ktorý umožňuje expresiu v EBNA pozitívnych bunkových líniách. Uskutočnilo sa reštrikčné štiepenie na identifikáciu klonov so správnou orientáciou. Z plazmidov so správnou orientáciou sa pripravila DNA.

Plazmidové DNA (expresného plazmidu retL2, expresného plazmidu retLl ako pozitívne kontroly a expresného plazmidu obsahujúceho nepríbuznú sekvenciu ako negatívna kontrola) sa transfekovali do buniek 293/EBNA (8x105 buniek na 60 mm miske) metódou s Lipofectinom. Po 48 hodinách sa bunky opláchli dvakrát v HBHA pufri (0,5 mg/ml BSA, 0,1 % NaN₃, 20 mM HEPES pH 7,0) a inkubovali s 20 pg/ml Ret/IgG v soľnom roztoku pufrovanom s Tris s 1 mM MgCl₂ a CaCl₂ 60 až 90 minút pri teplote miestnosti. Po tejto inkubácii sa bunky opláchli dvakrát v pufri HBHA a potom sa fixovali roztokom 60 % acetón/3 % formaldehyd/20 mM HEPES (pH 7,0) 30 sekúnd. Po dvoch opláchnutiach HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,0) sa bunky inkubovali so sekundárnou protilátkou s naviazanou AP (kozí protiľudský IgG F(ab)2 špecifický pre Fc-gamma, Jackson Immuno Research Laboratories, katalóg, č. 109-056-098, riedenie 1 : 5 000 v soľnom roztoku pufrovanom fosfátom s lmM MgCl₂ a CaCl₂) 60 minút pri teplote miestnosti. Bunky sa potom dvakrát opláchli pufrom HBS a dvakrát substrátovým pufrom pre AP (100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) obsahujúcom 2x supresor fosfatázy Immuno Pure® (Pierce, katalóg, č. 35002). Posledný kúpeľ sa ponechal 15 minút. Substráty AP NBT (0,33 mg/ml) a BCIP (0,17 mg/ml) sa pridali v AP substrátovom pufri obsahujúcom AP inhibítor (Pierce) a inkubovali sa s bunkami 5 až 20 minút. Doštičky sa potom opláchli dvakrát vodou. Potom sa doštičky skúmali pod mikroskopom na prítomnosť purpurovo sfarbených buniek. Prítomnosť purpurovo sfarbených buniek ukazuje na to, že fúzny protein Ret sa naviazal na bunky a že protein RetL2 je ligandom Ret. Purpurovo sfarbené bunky sa pozorovali po transfekcii expresným vektorom retLl, ale nie po transfekcii s vektorom negatívnej kontroly.

Klonovanie ligandu RetL3

A. Myšací RetL3

Prehľadávanie databázy EST pomocou aminokyselinovej sekvencie potkanieho RetLl viedlo k objaveniu dvoch klonov EST homologických s ligandmi Ret. Ide o EST klony AA049894 a AA050083 (čo je čiastočná myšacia cDNA retL3, SEQ ID NO: 14). Plazmidy obsahujúce tieto ESTT klony sa získali z firmy Genome Systems Inc. (katalóg, č. 475791 a 475497) ako bakteriálne kultúry očkované ihlou. Plazmidová DNA sa pripravila z jednotlivých kolónií získaných po naočkovani misiek s médiom LB Amp. Celé inzerty z týchto plazmidov sa sekvenovali. Porovnanie dvoch sekvencií ukázalo, že AA049894, ktorý obsahuje inzert s veľkosťou 1,9 kb. Translácia sekvencie DNA z AAO5OO83 ukázala, že je tu súvislý otvorený čítací rámec (ORF) od nukleotidu 205 po nukleotid 1412 (čiastočná myšacia RetL3, SEQ ID NO: 15). Tento ORF mal 37,5 % identitu s ORF potkanieho retLl a 40,2 % identitu s potkaním retL2. Ale tento tvorený čítací rámec nekóduje Met alebo signálnu sekvenciu na 5’-konci. Preskúmali sa čítacie rámce proti smeru transkripcie v tomto úseku a našiel sa Met v kontexte Kozákovej consensus sekvencie pre iniciáciu translácie a potenciálne signálne sekvencie pre povrchovú expresiu/sekréciu. Tento ORF nesúvisí s rámcom ORF ležiacim v smere transkripcie, čo ukazuje, že kloň EST AAO5OO83 obsahuje na svojom 5'-konci potenciálnu mutáciu, ako je napr. inzercia, delécia, intrón alebo artefakt vzniknutý pri klonovaní.

Aby sa získala správna sekvencia 5'-konca, použila sa súprava Marathon RAČE. Myšacia embryonálna cDNA Marathon-Ready™ (katalóg, č. 7458-1) a súprava Advantage™ (katalóg, č. 8417-1) sa získali z firmy Clontech. Syntetizovali sa antisense nukleotidy Kid-366, zodpovedajúce komplementárnej sekvencii k nukleotidom 847 až 866 sekvencie SEQ ID NO: 14 a Kid-365, zodpovedajúci komplementárnej sekvencii k nukleotidom 589 až 615 sekvencie SEQ ID NO: 14.

PCR sa uskutočnila pomocou súpravy Advantage™ cDNA PCR (Clontech katalóg, č. 8417-1) kombinovanej s niektorými činidlami zo súpravy Marathon™ cDNA a oligonukleotidom Kid-366. Prvá reakcia PCR sa zostavila následne: 35,5 pl H₂O, 5,0 pl 10 x pufor pre enzým Klen Taq, 1,0 pl zmesi 10 mM dNTP, 1,0 pl 50 x zmes polymeráz Klen Taq Advantage™. Tieto reagencie sa zmiešali a zmes premiešala. Potom sa pridalo 5,0 pl cDNA Marathon-Ready™ z 11 denného myšacieho embrya, 1,0 pl 10 pM primeru AP1 a 1,7 pl 5,88 pM Kid-366 (celkový objem reakcie 50 pl). PCR sa uskutočnila v cyklovacom termostate Perkin-Elmer Cetus DNA Cycler 480 s nasledujúcim nastavením cyklov: 1 cyklus 94 °C 1 minútu, 5 cyklov 94 °C 30 sekúnd, 72 °C 4 minúty, 25 cyklov 94 °C 30 sekúnd, 68 °C 4 minúty. S produktom prvej PCR sa následne uskutočnila „hniezdová“ PCR. Najskôr sa 5 pl produktu z prvej reakcie nariedilo 50 x v TE (celkový objem 250 pl). Hniezdová PCR obsahovala 35,5 pl H₂0, 5,0 pl 10 x pufor pre enzým Klen Taq, 1,0 pl zmesi 10 mM dNTP, 1,0 pl 10 pM primeru AP2 a 3,6 pl 2,8 pM primeru Kid-365. Podmienky cyklovania boli rovnaké ako sa už opísalo pre predchádzajúcu reakciu, 1,0 pl 10 pM primeru AP2 a 3,6 pl 2,8 pM primeru Kid-365. Podmienky cyklovania boli rovnaké, ako sa už opísalo v predchádzajúcej reakcii. Výsledný produkt približne s veľkosťou 665 bp sa purifikoval v 1 % agaróze s nízkym bodom topenia a extrahoval sa pomocou Qiaex II (Qiagen, katalóg, č. 20021). Purifikovaná DNA sa klonovala do plazmidov pNoTA/T7™ pomocou klonovacej súpravy PRIME PCR CLONER™ (5prime-3Prime, katalóg, č. 1-725029). Z opakovaných izolácií obsahujúcich klony DSW252 a DSW253 sa získala informácia o sekvencii.

Zistilo sa, že sekvencia DSW252 sa čiastočne prekrýva so sekvenciou SEQ ID NO: 14 okrem dodatočného T prítomného v polohe medzi nukleotidmi 252 a 253 sekvencie SEQ ID NO: 14. Tento T je prítomný v ostatných izolátoch DSW251 a DSW253. Vloženie tejto dodatočnej bázy upravuje otvorený čítací reťazec tak, že dostávame jediný čítací reťazec s veľkosťou 1191 bp (rátané od prvého Met) kódujúci 397 aminokyselín. Tento ORF kóduje Met v kontexte s kanonickou consensus sekvenciou (Kozák) iniciácie translácie a zahrnuje tiež signálnu sekvenciu pre povrchovú expresiu/sekréciu.

Na získanie myšacieho klonu s plnou dĺžkou, ktorý by mohol byť exprimovaný, sa purifikovali fragmenty Notl-BamHI s veľkosťou 630 bp z DSW252 a BamHI-Notl s veľkosťou 1 308 bp z AA050083 a vložili sa do expresného vektora CH269 štiepeného s Nôti. Ligačná zmes sa transformovala do E. coli XLl-Blue (Stratagene, katalóg, č. 200236). Potom sa uskutočnila minipreparácia plazmidovej DNA z transformovaných baktérií pomocou Qiawell Ultra Minipreps. DNA sa potom analyzovalo reštrikčným štiepením s gélovou elektroforézou, aby sa overila správna veľkosť a orientácia inzertu. Konštrukcia sa nazvala DSW254. Inzert DSW254 sa úplne sekvenoval (myšací retL3, SEQ ID NO: 16) a potvrdil sa ORF, kódujúci proteín z 397 aminokyselín (myšací RetL3, SEQ ID NO: 17). Tieto sekvencie sú uvedené tiež na obr. 9. C-koniec RetL3 je hydrofóbny a zdá sa, že ide o fosfatidylinozitolglykánový väzbový motív.

B. Ľudský RetL3

Aby sa našlo vhodné tkanivo ako zdroj na klonovanie ľudského RetL3, použil sa northern prenos vzoriek myšacích tkanív na stanovenie expresného vzorca myšacieho RetL3. Zo všetkých skúmaných tkanív najvyššiu expresiu RetL3 malo srdcové tkanivo. cDNA knižnica z ľudského dospelého srdca vo vektore lambda gtlO sa získala z firmy Clontech (katalóg, č. HL3026a). Jedine milión jednotiek tvoriacich plaky zo zásobného roztoku sa vysial na misky 10 Nunc™. Vytvorili sa odtlačky plakov v duplikátoch na filtre Opitran™ firmy Schleicher and Schuell.

Pomocou PCR sa pripravila sonda s primermi Kid-336 a Kid-337, zodpovedajúca nukleotidom 397 až 420 sekvencie AA050083. PCR sa zostavila tak, že sa zmiešalo nasledovné: 10,0 μΐ 10 x pufor PFU, 2,0 μΐ zmesi 10 mM dNTP, 72,1 μΐ H₂O, 3,1 μΐ 13,2 μΜ printeru Kid-367 a 6,8 μΐ 5,88 μΜ Kid-366, 5 μΐ DNA AA050083 s koncentráciou 0,1 Fg/μΐ a 2,0 μΐ PFU polymerázy s koncentráciou 2,5 U/μΙ (Stratagene, katalóg, č. 600154). PCR sa uskutočnila v cyklovacom termostate Perkin-Elmer Cetus DNA Cycler 480 s nasledovným nastavením cyklov: 25 cyklov 94 °C 1 minútu, 53 °C 1 minútu, 72 °C 4 minúty. Produkt PCR sa purifíkoval extrakciou fenolom, chloroformom a izoamylalkoholom v pomere 50 : 49 : la potom rozdelil elektroforézou na géli z agarózy s nízkym bodom topenia, vyrezaný fragment sa nasledovne purifikoval pomocou QiaexII. Táto sonda pre kódujúci úsek sa značila s ³²P metódou náhodných printerov (Feinberg a Vogelstein).

Filtre sa hybridizovali cez noc pri 65 °C v 200 ml pufra pre skríning plakov obsahujúcom 10 % dextránsulfát, 100 μg/ml tRNA a 1 x 10⁸ cpm myšacej sondy. Potom sa filtre dvakrát opláchli s 2 x SSC/1 % SDS a dvakrát v 1 x SSC/1 % SDS a film sa exponoval pri -70 °C s intenzifikančným tienidlom. DNA z duplikátov pozitívnych plakov sa purifíkovala. Lambda DNA pripravená minipreparáciou z každého z týchto plakov sa analyzovala tak, že sa štiepila s reštrikčným enzýmom EcoRI, potom rozdelila elektroforézou v 1 % agarózovom géli a potom sa preniesla pomocou Southern prenosu. Filtre so Southem prenosom sa potom hybridizovali s myšacou sondou. Kloň GJ128, ktorý obsahoval inzert s veľkosťou 1,3 kb, hybridizoval intenzívne s myšacou sondou pre kódujúci úsek. Sekvencia DNA (čiastočná cDNA ľudského retL3, SEQ ID NO: 18) a odvodená peptidová sekvencia (čiastočná sekvencia ľudského RetL3, SEQ ID NO: 19) sa získali z tohto klonu a potvrdilo sa, že ide o ľudský homológ. Tento kloň obsahuje väčšinu kódujúceho úseku vrátane 3'-konca kódujúceho úseku.

Inzert s veľkosťou 1,3 kb z GJ128 sa purifikoval, označil s ^j2P a použil na skríning cDNA knižnice z ľudského dospelého srdca (Clontech) na získanie klonu obsahujúceho 5'-koniec. Skríningom 2 x 10⁶ plakov z tejto cDNA knižnice sa nezískali žiadne klony obsahujúce 5'-koniec. Northern analýzy membrán s northern prenosom mRNA z ľudských dospelých tkanív (Clontech, katalóg, č. 7760-1, 7759-1 a 7767-1) hybridizovaných s rovnakou sondou podľa protokolu dodaného výrobcom, ukázali, že ľudský RetL3 je najsilnejšie exprimovaný v tkanivách dospelej miechy, žalúdka, srdca, pankreasu, tenkého čreva, hrubého čreva, prostaty a semenníkov. cDNA knižnica z dospelej ľudskej miechy (Clontech, katalóg, č. 5001a) sa podrobila skríningu s inzertom GJ128. 3 nezávislé klony sa purifikovali a najdlhší z nich, GJ 135, sa sekvenoval. Sekvencia inzertu GJ135 sa čiastočne prekrýva s inzertom GJ128, čo umožnilo vytvoriť zloženú sekvenciu cDNA s plnou dĺžkou ľudského retL3 (SEQ ID NO: 20) a stanoviť tak úplnú sekvenciu ľudského RetL3 (SEQ ID NO: 21). Tieto sekvencie sú uvedené na obr. 10. Ľudský Retl3 je na 34,3 % identický s ľudským RetLl a na 34,9 % identický s ľudským RetL2. Je tiež na 76,8 % identický s myšacím RetL3.

Použitie zlúčenín podľa vynálezu na liečenie

Natívne proteíny RetL a ich varianty, protilátky anti-RetL, protilátky anti-Ret a fuzne proteíny s Ret a RetL sa môžu použiť na liečenie v situácii, keď je treba blokovať alebo inaktivovať signálnu dráhu Ret, stimulovať rast obličkových buniek alebo neurónov, alebo ich prežívanie, či odumieranie, alebo keď je treba potlačiť rast alebo usmrtiť nežiaduce bunky, ako sú napr. nádorové bunky exprimujúce Ret alebo RetL.

Všeobecne sú zlúčeniny podľa vynálezu, ktoré sa viažu na Ret a indukujú dimerizáciu alebo autofosforyláciu Ret, užitočné na stimuláciu rastu alebo obmedzenie poškodenia tkaniva exprimujúceho Ret. Zlúčeniny podľa vynálezu sú užitočné na stimuláciu rastu obličkového tkaniva alebo prežívanie, podporu funkcie obličiek a minimalizáciu poškodení obličkového tkaniva po rôznych poraneniach. Zlúčeniny podľa vynálezu sú osobitne výhodné na liečenie stavov, ktoré zahrnujú akútne zlyhanie obličiek, akútnu nefritídu, chronické zlyhanie obličiek, nefrotický syndróm, poruchy obličkových kanálikov, transplantáciu obličiek, toxické poškodenie, poškodenie hypoxiou a úrazmi. Choroby obličkových kanálikov zahrnujú tak dedičné, ako aj získané poruchy, ako je napr. polycystická oblička, cystické ochorenie drene a cystická (hubovitá) oblička. Možný zoznam však nie je týmto obmedzený a môže obsahovať aj mnoho ďalších porúch obličiek (pozri Harrisons Principles of Intemal Medicíne, 13. vydanie, 1994, na ktorú sa týmto plne odkazujeme).

Pri iných aplikáciách sa môžu gény a proteíny podľa vynálezu použiť pri liečení stavov, keď je treba, aby neuróny rástli alebo regenerovali. Patria sem nervové neurodegeneratívne ochorenia, ako je Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba, Tourettov syndróm, amyotrofná laterálna skleróza a ochorenie motorických neurónov a tiež demyelizačné ochorenie je sclerosis multiplex, tiež bakteriálne choroby ako je meningitída, absces alebo empyém, vírusové choroby, ako je myelopatia spojená s HIV alebo priónové ochorenie vrátane Creutzfeld-Jacobovej choroby. Patria sem tiež poruchy v dôsledku poškodenia nervového tkaniva, či už neoplastickým pôsobením alebo úrazom a tiež cerebrovaskuláme príhody, ako je krvácanie alebo embólia. Konkrétne sem tiež patria choroby kraniálnych nervov a miechy, vrátane vrodených porúch a porúch v dôsledku úrazu alebo zápalu a porúch cievnej etiológie, ako sú napr. poruchy ovplyvňujúce autonómny nervový systém. Tiež sem patria vývojové nervové poruchy, ako je mentálna retardácia, autizmus, fetálny alkoholový syndróm, Downov syndróm cerebrálna paresa. Zlúčeniny podľa vynálezu sa tiež môžu použiť na liečenie syndrómov zahrnujúcich periférny nervový systém. K takýmto poruchám patria poruchy spôsobené ktorýmkoľvek faktorom už skôr uvedeným a konkrétne Lymská choroba, neuropatia spojená s HIV, polyomyozitída, svalová dystrofia a ťažká myasténia.

Protilátky anti-RetL a fuzne proteíny Ret podľa vynálezu, ktoré sa špecificky viažu na potkaní proteín RetLl, čiastočný ľudský proteínRetLl, úplný ľudskýproteín RetLl, ľudský RetL2, myšací RetL3 alebo ľudský RetL3, alebo fragmenty týchto proteínov, sa môžu využiť v mnohých metódach. Zlúčeniny sa môžu terapeuticky použiť na blokovanie alebo inhibíciu signálnej dráhy receptora Ret, napr. na blokovanie alebo inhibíciu rastu nádorov, ktorých rast je závislý od signálnej dráhy Ret. Tieto agens sa tiež môžu fúzovať s detegovateľnými značkami, ako sú napr. látky zobraziteľné fluoroskopicky alebo rádiograficky a podávať subjektu, čo umožní zobraziť tkanivá, ktoré exprimujú RetL. Tieto agens sa môžu tiež naviazať na látky, ako je napr. chrenová peroxidáza, ktorá sa môže použiť ako imunohistochemické farbivo, ktoré umožňuje vizualizáciu buniek pozitívnych na RetL v histologických preparátoch. Špecifické protilátky na tento účel sa môžu použiť samotné a miesta, kde sa viažu, sa môžu vizualizovať potom v sendvičovom teste použitím antiimunoglobulínovej protilátky s naviazaným detegovateľným markerom. Špecifické protilátky proti ktorémukoľvek RetL sú užitočné v imunotestoch na kvantifikáciu látky, pre ktorú má daná protilátka špecificitu. Špecifické protilátky proti RetL sa môžu tiež viazať na pevnú fázu, ako sú napr. mikroperly alebo misky a potom využiť na odstránenie ligandu z roztoku, buď s cieľom vyčistiť proteín alebo ho odstrániť z roztoku. Všetky tieto spôsoby sú v podstate rutinou pre odborníka v imunológii. Ďalšie metódy podľa vynálezu zahrnujú moduláciu signálnej dráhy Ret-RetL tým, že sa na Ret naviaže monoklonálna protilátka anti-Ret. Efekt takéhoto kontaktu mAb-Ret môže byť buď blokujúci, alebo stimulujúci na aktiváciu signálnej dráhy Ret, v závislosti od vlastností interakcie konkrétnej monoklonálnej protilátky mAb s Ret. Niektoré mAb reagujú s Ret ako agonisty, takéto agonistické naviazanie spôsobuje dimerizáciu a autofosforyláciu Ret. Iné mAb pôsobia ako antagonisty. Interakcia Ret s antagonistickou mAb zabraňuje aktivácii signálnej dráhy Ret inými RetL alebo komplexmi obsahujúcimi Ret, ktoré by inak signálny dráhu Ret aktivovali.

RetL alebo protilátky proti Ret, alebo fuznym proteínom Ret sa môžu použiť na zobrazenie tkanív, ktoré exprimujú Ret alebo na imunohistologické, alebo preparatívne metódy opísané v predchádzajúcom texte pre protilátky RetL.

Fúzne proteíny obsahujúce RetL alebo protilátky anti-Ret sa môžu použiť na špeciálne delenie protinádorovej terapie proti nádorom exprimujúcim Ret. Takéto nádory môžu zahrnovať niekoľko nádorových fenotypov, ktoré sú spojené s mutáciami v Ret (N. Engl. J. Med. 335: 943 - 951, 1966, Náture 367, 319 - 320, 1996, Trends in Genetics 12: 138 - 144, 1996). Terapeutická intervencia proti nádorom exprimujúcim RetL využíva fuzne proteíny obsahujúce Ret alebo protilátku anti-Ret. Protilátka anti-Ret alebo anti-RetL môže byť sama účinná vzhľadom na cytolýzu závislú od komplementu a protilátku sprostredkovanú doménou Fc. Takéto hybridné ligandy a protilátky sa môžu stať terapeuticky ešte účinnejšie, pokiaľ sa použijú ako nosiče protiná dorových liekov, toxínov alebo cytocídnych rádionuklidov, ako je ytrium 90. Cytotoxické efektorové bunky sa môžu zacieliť na nádorové bunky pomocou heterokonjugátov protilátok, kde protilátka špecifická buď pre Ret, alebo RetL exprimované nádorom je kovalentne naviazaná na protilátku namierenú proti povrchovému proteínu cytotoxickej efektorovej bunky, ako sú bunky NK alebo CTL.

Jedným príkladom protilátky anti-Ret alebo terapie pomocou Ret je konjugácia toxického reťazca A ricínu alebo modifikovanej úplnej formy ricínu (ktorý sa už nemôže viazať na bunky) a s RetL alebo protilátkou namierenou proti polypeptidu Ret, ktoré sú exprimované na povrchu malígnej bunky. V inom uskutočnení je toxín konjugovaný s Ret alebo protilátkou bunky, ako sú napr. nádorové bunky exprimujúce RetL. Takýto prístup sa osvedčil s blokovaným ricínom konjugovaným s monoklonálnou protilátkou proti antigénu CD 19, ktorý exprimuje väčšina nádorových buniek (Grossbard a kol., Blood 79: 576,1992). Ďalšie toxíny sú takisto užitočné, ako je odborníkom známe. K takýmto toxínom patria napr. exotoxín pseudomonád, difterický toxín a saporín, pričom možnosti nie sú obmedzené iba na tieto toxíny. Tento prístup by mal byť dokonca omnoho účinnejší s použitím RetL alebo protilátky anti-RetL v porovnaní so známym využitím antigénu CD 19, pretože je exprimovaný iba vo veľmi obmedzenom počte tkanív.

Uvedené prístupy využívajúce fúziu ricínu alebo iného toxínu sú takisto využiteľné pre toxínové konjugáty RetL alebo protilátok anti-RetL, ktoré sú užitočné na selektívne cielenie a usmrtenie Ret-pozitívnych buniek, ako sú nádorové bunky exprimujúce Ret.

Iným prístupom v terapii je použitie RetL alebo protilátok označených rádioizotopom. Takéto rádioaktívne značené zlúčeniny môžu výhodne smerovať rádioaktivitu do miest nádorov exprimujúcich Ret, pričom ušetrí normálne tkanivo. V závislosti od použitého izotopu radiácia emitovaná zo značenej protilátky naviazanej na nádorovú bunku môže usmrtiť tiež susedné nádorové malígne bunky, ktoré neexprimujú Ret. Môžu sa využiť rôzne rádionuklidy. Izotopy emitujúce β-častice vytvárajú tumoricídnu rádioaktivitu na vzdialenosť presahujúcu priemer niekoľkých buniek, čo umožňuje zahubiť aj bunky, ktoré nenesú antigén a eliminovať tak následky nehomogénneho uloženia protilátky alebo ligandu v nádore.

Je tiež možné využiť rádionuklid emitujúcich α-žiarenie. Nízka dávka ožiarenia spôsobená RetL alebo protilátkou anti-RetT značenou takýmto rádionuklidom môže byť terapeuticky účinnejšie ako okamžité externé ožiarenie pri konvenčnej radiačnej terapii. Nízke dávky ožiarenia môžu spôsobovať apoptózu (t. j. programovanú bunkovú smrť) v určitých bunkových líniách (Macklis a kol., Radiat. Res. 130: 220, 1992, Macklis a kol., Radipharm. 5, 339, 1992).

Zlúčeniny podľa vynálezu sa podávajú v terapeuticky účinnom množstve, čo znamená takéto množstvo zlúčeniny, ktoré vedie k medicínsky žiaducemu výsledku alebo ovplyvní osobitnú situáciu, ktorá sa má opracovať.

Termín „subjekt“ tu použitý znamená akéhokoľvek cicavca, ktorému sa môže podať ligand Ret alebo gén Ret. Osobitne výhodnými subjektmi na použitie vynálezu sú ľudia, ale tiež primáty, ovce, kone, dobytok, kozy, prasce, psy, mačky, králiky, morčatá, škrečky, pieskomily, potkany a myši a tiež orgány, nádory a bunky pochádzajúce z uvedených hostiteľov.

Použitie zlúčenín podľa vynálezu na génovú terapiu

Gény RetL podľa vynálezu sa môžu zaviesť do poškodeného tkaniva, aby stimulovali produkciu RetL transfekovaných buniek a na to, aby podporovali rast a prežívanie buniek, ktoré exprimujú Ret.

V zvláštnom uskutočnení spôsobu génovej terapie sa gén RetL zavedie do vybraného cieľového nervového tkaniva alebo tkaniva obličiek. RetL sa potom stabilne exprimuje a stimuluje bunky pozitívne na receptory Ret k rastu, deleniu a diferenciácii alebo podporuje prežívanie týchto buniek. Gény retL sa môžu vložiť do cieľových buniek pomocou mnohých známych metód založených na použitie buď vírusových, alebo nevírusových stratégií.

Nevírusové metódy zahrnujú elektroporáciu, fúziu membrány s lipozómami, bombardovanie mikroprojektilmi pokrytými DNA, inkubáciu s precipitátom kalciumfosfát-DNA, transfekciu sprostredkovanou DEAE-dextránom a tiež priame mikroinjekcie do jednotlivých buniek. Napr. gén retL sa môže vniesť do bunky koprecipitáciou s kalciumfosfátom (Pillicer a kol., Science 209: 1414 - 1422, 1980), mechanickou mikroinjekciou alebo bombardovaním mikročasticami (Anderson a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5399 až 5403, 1980), prenosom DNA pomocou lipozómov (napr. transfekciou sprostredkovanou LIPOEECTINOM, Fefgner a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 471 - 477, 1987, Gao a Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm. 179. 280 - 285, 1991), transfekciou sprostredkovanou DEAE-dextránom, elektroporáciou (USA patent 4,956,288) alebo metódou využívajúcou polylyzín, kde je DNA konjugovaná tak, že je prednostne transportovaná do hepatocytov pečene (Wolf a kol., Science 247: 465 - 468, 1990, Curiel a kol., Human Gene Therapy3: 147 - 154, 1992).

Cieľové bunky môžu byť transfekované gény podľa vynálezu priamym prenosom génov (pozri napr. Wolff a kol., „Direct gene Transfer Into Moose Muscle In Vivo“, Science 247, 1465 - 68, 1990). V mnohých prípadoch však bude žiaduci prenos sprostredkovaný vektorom. Ktorákoľvek vhodná metóda v odbore známa na vloženie polynukleotidovej sekvencie do vektora sa môže použiť (pozri napr. Sambrook a kol., Molecular

SK 286115 Β6

Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, Ausubel a kol., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY, 1992, na obidve publikácie sa týmto odkazujeme).

Aktivácia promótora môže byť tkanivovo špecifická alebo indukovateľná metabolickým produktom alebo podanou látkou. K takýmto promótorom/enhancerom (zosilňovačom) patria napr. natívny promótor RetL, skorý promótor/enhancer cytomegalovírusu (Karasuyama a kol., J. Exp. Med. 169: 13, 1989), ľudský promótor beta-aktínu (Cunning a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4831, 1987, promótor indukovateľný glukokortikoidmi prítomný na dlhých terminálnych repetíciách (LTR) myšacieho vírusu MMTV (Klessig a kol., Mol. Celí. Biol. 4: 1354, 1984), sekvencia dlhých terminálnych repetícií vírusu Moloneyho myší leukémie (MuLV LTR) (Weiss a kol., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1985), promótor skorého úseku SV40 (Bemoist a Chambon, Náture 290: 304, 1981, promótor vírusu Rousovho sarkómu (RSV) (Yamamoto a kol., Celí 22: 787, 1980), promótor tymidínkinázy z vírusu herpes simplex (HSV) (Wagner a kol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441, 1981) a promótor adenovírus (Yamada a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3567, 1985), pričom možnosti nie sú obmedzené iba na tieto príklady.

Gény retL sa môžu vniesť do buniek tiež špecifickými vírusovými vektormi určenými na použitie v systémoch prenosu génov, ktoré sú už dobre zavedené. Takéto systémy opísali napr. Madzak a kol., J. Gen. Virol. 73: 1533 - 36, 1992 (papovavírus SV40), Berkner a koľ, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 39 - 61, 1992 (adenovírus), Hofmann a kol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10099-10103, 1995 (bakulovírusy), Moss a kol., Curr. Top. Microbiol. Immunol 159: 25 - 38, 1992 (vírus vaccinia), Muzyczka, Curr. Top. Microbiol Immunol 158: 97 - 123, 1992 (adenoasociované vírusy), Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol 158: 67 až 93, 1992 (herpes simplex vírus (HSV) a vírus Epstein-Barrovej (EBV)), Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1 - 24, 1992 (retrovírus), Brandyopadhyay a kol., Mol. Celí. Biol. 4: 749 - 754, 1984 (retrovírus), Miller a kol., Náture 357: 450 - 455, 1992 (retrovírus), Anderson, Science 256: 808 - 813,1992 (retrovírus), Ausubel a kol., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989, kapitoly 9.10 až 9.14 (všetky citácie sú súčasťou referencií).

Výhodné vektory sú DNA vírusy, ku ktorým patria adenovírusy (výhodne vektory založené na Ad-2 a Ad-5), bakulovírusy, herpetické vírusy (výhodne vektory založené na herpes simplex víruse) a parvovírusy (výhodne vírusy založené na defektných alebo neautonómnych parvovírusoch, výhodnejšie vektory založené na adeno-asociovaných vírusoch, najvýhodnejšie vektory založené na AAV-2). Ďalšie informácie k tejto oblasti pozri napr. Ali a kol., Gene Therapy 1: 367 - 384, 1994, patenty USA č. 4 797 368 a 5 399 346 a tiež nasledujúcu diskusiu.

Výber konkrétneho vektorového systému na prenos napr. RetL sekvencie je závislý od radu faktorov. Jedným dôležitým faktorom je povaha populácie cieľových buniek. Aj keď retrovírusové vektory sa intenzívne skúmali a sú používané v mnohých aplikáciách génovej terapie, všeobecne nie sú vhodné na infekciu nedeliacich sa buniek a tak môžu byť užitočné na liečenie nádorov, lebo sa integrujú a exprimujú svoje gény iba v replikujúcich sa bunkách. Sú tiež užitočné na využitie ex vivo, kde sú veľmi atraktívne vzhľadom na ich stabilnú integráciu do genómu hostiteľa.

Adenovírusy sú DNA vírusy eukaryotov, ktoré sa môžu modifikovať tak, že účinne prenášajú terapeutické alebo reportérové transgény do buniek mnohých rôznych typov. Adenovírusy všeobecných typov 2 a 5 (Ad2 a Ad5), ktoré spôsobujú respiračné ochorenie ľudí, sa teraz upravili na génovú terapiu Duchennovej svalovej dystrofie (DMD) a cystickej fibrózy (CF). Tak Ad2, ako aj Ad5 patria do podtriedy adenovírusov, ktoré nie sú spojené s malignitami u ľudí. Adenovírusové vektory sú schopné poskytnúť extrémne vysokú úroveň prenosu génov prakticky do buniek všetkých typov, bez ohľadu na ich mitotické štádium. Vysoký titer vírusu (10¹³ jednotiek tvoriacich plak/ml) sa môže ľahko získať v bunkách „293“ (komplementačná línia buniek ľudských embryonálnych obličiek transformovaných adenovírusom, ATCC CRL1573) a uchovávať v kryoprezervovanom stave dlhý čas bez znateľných strát. Účinnosť tohto systému v prenose terapeutických transgénov in vivo na komplementáciu stavu génovej nerovnováhy sa demonštrovali pre rôzne choroby na zvieracích modeloch, pozri napr. Watanabe, Y., Atherosclerosis 36: 261 - 268, 1986, Tanzawa, K. a kol., FEBS Letters 118 (1): 81 - 84, 1980, Golasten, J. L. a kol., New Engl. J. Med. 309 (11983): 288 - 296, 1983, Ishibashi, S. a kol., J, Clin. Invest. 92: 883 - 893, 1993 a Ishibashi, S. a kol., J. Clin. Invest. 93: 1889 - 1893, 1994, pričom všetky uvedené citácie sú zahrnuté v referenciách. Rekombinantný replikačne defektný adenovírus kódujúci cDNA pre transmembránový regulátor cystickej fibrózy (CFTR) bol skutočne schválený na použitie aspoň v dvoch klinických pokusoch na ľudskej CF (Wilson, J., Náture 365: 691 - 692 (21. október 1993). Extenzívna skúsenosť so živými adenovirusovými vakcínami používanými v ľudskej populácii je ďalším faktorom svedčiacim o bezpečnosti rekombinantných adenovírusov pre génovú terapiu.

Ľudské adenovírusy obsahujú genóm tvorený lineárnou dvojvláknovou DNA dlhou približne 36 kb, ktorá je rozdelená do 100 mapových jednotiek (m. u.), každá s dĺžkou 360 bp. DNA obsahuje krátke terminálne invertované repetície (ITR) na každom konci genómu, ktoré sú nevyhnutné na replikáciu vírusovej DNA. Génové produkty sú organizované do včasného (E1 až E4) a neskorého (L1 až L5) úseku, v závislosti od toho,

SK 286115 Β6 či sú gény exprimované pred alebo po iniciácii syntézy vírusovej DNA (pozri Horwitz, Virology, 2^nd. Ed., Fields, B. N. (ed), Raven Press Ltd., New York, 1990).

Rekombinantné replikačné defektne adenovírusy prvej generácie, ktoré sa pripravili na génovú terapiu DMD a ďalších dedičných ochorení majú odstránený celý úsek Ela a časť úseku Elb. Replikačne defektný vírus sa množí v bunkách „293“ obsahujúcich funkčný adenovírusový gén Ela, ktorý poskytuje transpôsobiaci produkt Ela. Vírusy s deléciou E1 sú schopné replikovať sa a produkovať infekčné častice v bunkách „293“, ktoré poskytujú v trans génové produkty úsekov Ela a Elb. Výsledný vírus je schopný infikovať bunky mnohých typov a exprimovať vložený gén (za predpokladu, že má svoj vlastný promótor), ale nie je schopný replikovať sa v bunkách, ktoré nemajú DNA pre úsek El, pokiaľ bunky nie sú infikované obrovským nadbytkom infekčného vírusu. Adenovírusy majú výhodu, že majú široké hostiteľské spektrum, môžu infikovať pokojové alebo diferencované bunky ako sú napr. neuróny, a sú v zásade neonkogénne. Adenovírusy sa neintegrujú do genómu hostiteľa, keďže existuje v bunke extrachromozomálne, je podstatne znížené riziko inzerčnej mutagenézy (Ali a kol., supra, 373). Rekombinantné adenovírusy (rAdV) tvoria veľmi vysoké titre, vírusové častice sú primerane stabilné, úroveň expresie je vysoká a môžu infikovať široké spektrum buniek. Ich prirodzeným hostiteľom sú bunky epitelu dýchacích ciest, takže sú vhodné na terapiu pľúcnej rakoviny.

Prenos génov sprostredkovaný bakulovírusmi má niektoré výhody. Prenos génov bakulovírusmi sa môže uskutočniť tak do replikujúcej sa, ako aj nereplikujúcej sa bunky, tiež do obličkovej bunky a rovnako tiež do hepatocytov, nervových buniek a buniek sleziny, kože a svalu. Bakulovírus sa nereplikuje v cicavčích bunkách a nie je pre tieto bunky patogénny. Človek nemá protilátky proti rekombinantným bakulovírusom, ktoré by mohli zabrániť infekcii. Navyše sú bakulovírusy schopné inkorporovať a prenášať veľmi veľké inzerty DNA.

Adenoasociované vírusy (AAV) sa využili ako vektory na somatickú génovú terapiu. AAV je malý vírus s jedno vláknovou DNA (ssDNA) s jednoducho usporiadaným genómom (4,7 kb), čo z neho robí ideálny substrát na génové inžinierstvo. Dva otvorené čítacie rámce kódujú série polypeptidov rep a cap. Polypeptidy rep (rep78, repz68, rep62 a rep40) sa zúčastňujú replikácie, uvoľnenia a integrácie genómu AAV.

Životný cyklus AAV je dvojfázový, skladá sa z fázy latentnej a lytickej. V priebehu latentnej infekcie virióny AAV vstupujú do bunky ako enkapsidovaná ssDNA a krátko nato sa dostanú k jadru, kde sa ssDNA stabilne integruje do hostiteľského chromozómu bez toho, aby na to bolo potrebné delenie hostiteľskej bunky. Bez prítomnosti pomocného vírusu zostáva integrovaný vírus AAV latentný, ale je schopný aktivácie a uvoľnenia. Lytická fáza životného cyklu začína, keď bunka nesúca provírus AAV je aktivovaná sekundárnou infekciou herpetickým vírusom alebo adenovirusom, ktoré kódujú pomocnú funkciu, ktorá je využitá s AAV ako pomoc na vystrihnutie z hostiteľského chromozómu (Carter, B. J., supra). Pôvodná infikujúca ssDNA sa rozvinie do dvojzávitnicovej replikačnej formy (RF) DNA spôsobom, ktorý je závislý od rep. Uvoľnené genómy AAV sú zabalené do proteínového kapsidu (ktorý má ikosahedrickú symetriu a priemer asi 20 nm) a po lýze bunky sa uvoľňujú ako infekčné virióny, ktoré obsahujú buď +ssDNA, alebo -ssDNA.

AAV vírusy majú významný potenciál pre génovú terapiu. Vírusové častice sú veľmi stabilné a rekombinantné AAV (rAAV), majú vlastnosti podobné liečivám, a to, že sa dajú purifikovať peletovaním alebo pomocou pásov v gradiente CsCl. Ďalej sú teplotné stabilné a môžu sa lyofilizovať na prášok a potom rehydratovať, čím získajú opäť úplnú aktivitu. Ich DNA sa stabilne integruje do chromozómu hostiteľa, takže expresia je dlhodobá. Hostiteľské spektrum je veľmi široké a pritom AAV nespôsobuje žiadnu známu chorobu, takže rekombinantné vektory sú úplne netoxické.

Po vložení do cieľovej bunky sa môže daná sekvencia identifikovať konvenčnými metódami, ako je napr. hybridizácia nukleových kyselín pomocou sond, ktoré obsahujú sekvencie homologické/komplementáme k sekvenciám génov vložených do vektora. Iným spôsobom sa môže sekvencia identifikovať tým, že je prítomná alebo neprítomná funkcia markerového génu (napr. aktivita tymidínkinázy, rezistencia proti antibiotiku a pod.) spôsobená zavedením expresného vektora do cieľovej bunky.

Formulácia a podávanie

Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu podávať akýmkoľvek spôsobom, ktorý je z lekárskeho hľadiska prijateľný. To zahŕňa napr. injekcie, napr. intravenózne, intravaskulárne, intraarteriálne, subkutánne, intramuskuláme, do nádoru, intraperitoneálne, intraventrikuláme alebo intraepidurálne, alebo podávanie perorálne, nazálne, oftalmické, rektálne alebo topické. Systém na kontinuálne podávanie je tiež špecificky zahrnutý v predkladanom vynáleze napr. v podobe depotných injekcií alebo erodovaných implantátov. Lokalizované podávanie je obzvlášť vhodné, ako ja napr. renálna artéria alebo cieva zásobujúca lokalizovaný nádor.

Termín „farmaceutický prijateľný nosič“ znamená jednu alebo viac organických alebo anorganických látok, prírodných alebo syntetických, s ktorými je mutovaný protoonkogén alebo mutovaný onkoproteín kombinovaný na uľahčenie aplikácie. Vhodným nosičom je napr. sterilný fyziologický roztok, aj keď odborníkovi je známy celý rad vodných i nevodných izotoníckých sterilných roztokov a sterilných suspenzií farmaceutický prijateľných. Termín „nosič“ v tomto prípade zahŕňa aj lipozómy a proteín tat z HIV-1 (pozri Chen a kol.,

SK 286115 Β6

Anál. Biochem. 227: 168 - 175, 1995) a tiež akýkoľvek plazmidový alebo vírusový expresný vektor. „Účinné množstvo“ znamená také množstvo, ktoré je schopné odstrániť alebo spomaliť progresiu choroby alebo degeneratívny stav či poškodenie. Účinné množstvo sa môže stanoviť individuálne a je sčasti založené na zvážení symptómov, ktoré je treba liečiť a vyžadovaných výsledkov. Účinné množstvo môže odborník so znalosťou týchto faktorov stanoviť rutinným spôsobom bez neprimeraného experimentovania.

Lipozómový systém môže byť akýkoľvek systém jednovrstvových vačkov, ktoré sa môžu pripraviť a podávať spôsobmi, ktoré sú odborníkovi dobre známe, napr. ako sa opisuje v patentoch USA č. 5 169 637, 4 762 915, 5 000 958 alebo 5 185 154. Okrem toho sa môže ukázať potreba exprimovať nové polypeptidy podľa vynálezu a iné vybrané polypeptidy ako lipoproteíny, aby sa zvýšila ich schopnosť viazať sa na lipozómy. Tak napríklad akútne obličkové zlyhanie človeka sa môže liečiť in vivo s RetL zabaleným v lipozóme tak, že sa tento RetL zavedie do potrebných buniek pomocou lipozómu. Lipozómy sa potom môžu podať renálnym katétrom do renálnej artérie. Rekombinantný proteín RetL sa purifikuje, napr. z buniek CHO imunoafmitnou chromatografiou alebo inou zvyčajnou metódou, potom sa zmieša s lipozómami a inkorporuje sa do nich s veľkou účinnosťou. Obalený proteín sa môže testovať in vitro ľubovoľným testom na stimuláciu bunkového rastu.

Nový polypeptid podľa predkladaného vynálezu sa môže tiež podať zvieraťu pomocou lipozómového systému, čím sa zvýši jeho stabilita a imunogenicita. Podanie nových polypeptidov prostredníctvom lipozómov je mimoriadne výhodné, pretože lipozómy sú intemalizované fagocytujúcimi bunkami v ošetrovanom zvierati. Takéto bunky potom, čo rozložia membránu lipozómu, prezentujú polypeptid imunitného systému v spojení s ďalšími molekulami, ktoré sú nutné na vyvolanie silnej imunitnej odpovede.

Ktorýkoľvek z nových polypeptidov podľa predkladaného vynálezu sa môže použiť vo forme farmaceutický prijateľne soli.

Vhodné kyseliny a zásady, ktoré sú schopné vytvárať soli s polypeptidmi podľa vynálezu, sú odborníkovi dobre známe a patria k nim tak organické, ako aj anorganické kyseliny a zásady.

Aj keď predkladaný vynález bol z dôvodu jasnosti a lepšieho pochopenia podrobne opísaný pomocou ilustrácií a príkladov, odborníkovi je zrejmé, že v rámci myšlienky vynálezu sa môže uskutočniť isté modifikácie, predmet vynálezu je teda obmedzený iba nasledujúcimi nárokmi.

Zoznam sekvencií (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 3 616 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: dvojité (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: nie (iv) opačná orientácia: nie (ix) znaky:

(A) meno/označenie: CDS (B) pozícia: 257...1660 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1

GCGGCCGCAG GTTGGGTCGG AACTGAACCC CTGAAAGCGG GTCCGCCTCC CGCCCTCGCG 60

CCCGCCCGGA TCTGAGTCGC TGGCGGCGGT GGGCGGCAGA GCGACGGGGA GTCTGCTCTC 120

ACCCTGGATG GAGCTGAACT TTGAGTGGCC AGÄGGAGCGC AGTCGCCCGG GGATCGCTGC 180

ACGCTGAGCT CTCTCCCCGÄ GACCGGGCGG CGGCTTTGGA TTTTGGGGGG GCGGGGACCA 240

GCTGCGCGGC GGCACC ATG TTC CTA GCC ACT CTG TACTTC GCG CTG CCA

282

Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr phe Ala Leu Pro 15 10

SK 286115 Β6

CTC

CTG

GAT

TTG

CTG

ATG

TCC

GCC

GAG

GTG

AGT

GGT

GGA

GAC

CGT

CTG

337

Leu

Asp

Leu

Met

Ser

Ala

Glu

Val

Ser

Gly

Asp

Arg

Leu

15

20

25

GAC

TGT

GTG

AAA

GCC

AGC

GAT

CAG

TGC

CTG

AAG

GAA

CAG

AGC

TGC

AGC

385

Asp

Cys

Val

Lys

Ala

Ser

Asp

Gin

Cys

Leu

Lys

Glu

Gin

Ser

Cys

Ser

30

35

40

ACC

AAG

TAC

CGC

ACA

CTA

AGG

CAG

TGC

GTG

GCG

GGC

AAG

GAA

ACC AAC

Thr

Lvs

Tyr

Arg

Thr

Leu

Are

Gin

Cys

Val

Ala

Gly

Lys

Glu

Thr Asn

45

5Ô

55

TTC

AGC

CTG

ACA

TCC

GGC

CTT

GAG

GCC

AAG

GAT

GAG

TGC

CGT

AGC GCC

Phe

Ser

Leu

Thr

Ser

Gly

Leu

Glu

Ala

Lys

Asp

Glu

Cys

Arg

Ser Ala

60

65

70

75

ATG

GAG

GCC

TTG

AAG

CAG

AAG

TCT

CTG

TAC

AAC

TGC

CGC

TGC

AAG CGG

Met

Glu

Ala

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Leu

Tyr

Asn

Cys

Arg

Cys

Lvs Arg

80

85

90

GGC

ATG

AAG

AAA

GAG

AAG

AAT

TGT

CTG

CGT

ATC

TAC

TGG

AGC

ATG TAC

Gly

Met

Lys

Glu

Lys

Asn

Cys

Leu

Arg

íle

Tyr

Trp

Ser

Het Tyr

95

100

105

CAG

AGC

CTG

CAG

GGA

AAT

GAC

CTC

CTG

GAA

GAT

TCC

CCG

TAT

GAG CCG

Gin

Ser

Leu

Gin

Gly

Asn

Asp

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro

Tyr

Glu Pro

110

115

120

GTT

AAC

AGC

AGG

TTG

TCA

GAT

ATA

TTC

CGG

GCA

GTC

CCG

TTC

ATA TCA

Val

Asn

Ser

Arg

Leu

Ser

Asp

íle

Phe

Arg

Ala

Val

Pro

Phe

íle Ser

125

130

135

GAT

GTT

TTC

CAG

CAA

GTG

GAA

CAC

ATT

TCC

AAA

GGG

AAC

TGC CTG

Asn

Val

Phe

Gin

Val

Glu

His

íle

Ser

Lys

Gly

Asn

Cys Leu

140

145

150

155

GAC

GCA

GCC

AAG

GCC

TGC

AAC

CTG

GAC

ACC

TGT

AAG

TAC AGG

Asp

Ala

Lys

Ala

Cys

Asn

Leu

Asp

Thr

Cys

Lys

Tyr Arg

160

165

170

TCG

GCC

TAC

ATC

ACC

CCC

TGC

ACC

AGC

ATG

TCC

AAC

GAG

GTC TGC

Ser

Ala

Tyr

íle

Thr

Pro

cys

Thr

Ser

Met

Ser

Asn

Glu

Val Cys

175

180

185

AAC

CGC

CGT

AAG

TGC

CAC

AAG

GCC

CTC

AGG

CAG

TTC

GAC

AAG GTT

Asn

Arg

Lys

Cys

His

Lys

Ala

Leu

Arg

Gin

Phe

Asp

Lys Val

190

200

195

CCG

GCC

AAG

CAC

AGC

TAC

GGG

ATG

CTC

TTC

TGC

TCC

TGC

CGG

GAC

ATC

913

Pro

Ala

Lys

His

Ser

Tyr

Gly

Met

Leu

Phe

Cys

Ser

Cys

Arg

Asp

íle

205

210

215

GCC

TCC

AGC

CAC

ATA

ACC

ACA

AAA

TCA ATG

GCT

CCT

CCC AGC

TGC

1S3S

Ala

Ser

Hl s

tie

Thr

Lys

Ser Met

Ala

Pro

Pro Ser

Cys

430

435

440

AGT

CTG

AGC

TCA

CTG

CCG

GTG

CTG

ATG CTC

ACC

GCC

GCT GCC

CTG

1633

Ser

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Met Leu

Ala

Leu

Ala Ala

Leu

445

450

455

TTA

GTA

TCG

TTG

GCA

GAA

ACG

TCG TAGCTGC

ATC

CGGSAäääCA

1680

Leu

Ser

Val

Ser

Leu

Ala

Glu

Thr

Ser

460

465

GTATGAAAAG 1740	ACAAAAGAGÄ ACCÄAGTATT	CTGTCCCTGT	CCTCTTGTAT	ÄTCTGAAAAT
CCAGTTTTÄA	AAGCTCCGTT	GäGäAGCäGT	TTCACCCAAC	TGGÄACTCTT
1800
TAAGArtAGCT	TGTGGCCCTC	AGGC-GCTTCT	GTTGAAGAAC	TGCTACAGGG	CTAATTCCAA
1060 ACCCATÄAGG	CTCTGGGGCG	TGGTGCGGCT		ATTTGCACCA	-w · x 43 x ΛηΛν\..%η

1920

GCTGGGCTTA 1980	TCATGTGTTT GATGGTGAGG	ATGGTAGTGG	TGATGÄTGAT	GGTÄATTTTA
ACAGCTTGAA 2040	CCCTGTTCTC	TCTACTGGTT	AGGAACAGGA	GATACTATTG	ATAÄAGATTC
TTCCATGTCT 2100	TACTCAGCAG	CATTGCCTTC	TGAAGACAGG	CCCGCAGCCT	AGTGTGÄÄTG
ACÄAGTGGAG 2160	GTTGGCCTCA	AGAGTGGACT	TGGCAGACTC	TACCTTGTAG	TAATGTTCAC
CTTTCCGTGT 2220	ATGGTCTCCA	CAGAGTGTTT	ATGTATTTAC	AGACTGTTCT	GTGATCCCCC
AACAACAACA 2280	ACCACAAATT	CCTTGGTCAC	CTCCAAATGT	AACCGGTCCT	TTAGCCCAGT
AGAGGAGGGT 2340	GGGTGTGGCC	CTGGCACAGC	TCCCGGATTG	TTGATGGGCA	CTCTCCTGAG

CTTTGCTTGA GTGAGAAGCT GAATGTAGCT GAAXATCAAC TCTTCTTACA cttcttactg 2400

CTTCGTTCAC TTACGAGGTC ACÄTATAGAA CAAÄCATCAC CAACTATTAG CTTACCGTTA 2460

GCTTCCCAAC TATTAGCTTT CTATGTTTTG ÄAAGCAGTGT TGCTGACCCC ATGTTTTAAT 2520

GATGGTTTÄA TACATGCAGC CCTTTCCTCT CATCGGTAAC ACTAGCTCCA ACATC-ACTľ 2580

CATGCATGTG GCTCTCAäää GCAGGCCCCA AGAAGCCCÄG TTCTTTAGGA GAAAGCTGCG 2640

SK 286115 Β6

TCCTGTT2C? C5CGACÄGGC AGGAGGAAAC AGÄGCÄGCCT GCZCGTGGľG TCTTľATCTG 2700 b ΓΛαλα á V· äaw\- · %Λ- _ _Λ íjTG * sj x ruxGvi λλ*\74Τ7-λλ uXí’í a^wia

2760

GTTGATGCCA CAACTGGCAG TCGGTCTAGC TCCAGGACAC CGGTTXCA? GTTGCCľGGC 2320

AGAGaCAGC? ttgattggga ctggctggcc acaac-ggatg ggatgaaga? G7GCTGCCC? 2880

CTGTTTCÄAA GTTGÄGCCC7 GCCAGGGCAC ATAGAAGCAT CľT?C-CTG-7 GÄCCACAACG 2940

TAGAACAGCľ TGGATTCAAG GTCATGAAGC GTCTCCTGTA CATTGCTCľG TGACCTTCAT 3000

AACAGACTGT 3060	CCCGCACAAA	AGGAACGGCA	gtttämsät	CTAGAGTGGG	AGCACAGGGT
CTGGAAAGGT 3120	GÄACCGAGTG	GCAäAATACA	CAGAACAGGA	GGGAGAGTCľ	CAAGCCGAGA
CÄTCTTGCTT 3180	ACTAGCCACA	CÄCCÄTCTCC	TGGAGCGCTC	CľCCTGACCT	GGGGAGACCC
TTAGGTGTAT 3240	A A	crerTCAATG	TTCÄGGTTCA	GAMXľTGTÄA	ATGGTTGCG7
CCTGGCACCG 3300	ATTCCTGAAÄ	ACTGAACAAA	GGAGAGGATA	TCTGTCCTCC	ATTGAGCCC”
GAAAGTATGA 3360	CTGGCTTCTC	ACCCTCCCAC	agagcaggga	GCCCTGGTGC	ACACAGTCTC
CTGATATCCT 3420	CCCTGCTCTT	TCAGGTTTGC	CTTGGGAGÄA	AATGA7TCAC	CTCGGGAGGG
GACGCTTTGG 3480	TGTCTGAAG?	ACGTTTATAT	CGÄAATGTTA	ATGÄATACCC	ÄTGTAAAATÄ
CTCÄATAGCC 3540	AccTTrcrrc	CCTTCACAAT	GTTTTCGAGG	GGAATGCATC	CAACATCCÄA
GTGTACCTGG	TCAGTGGGAA	GTTCCATGAA	GACTCATACA	TTGAATAAAC	ATATTCGATG

600

TGCCGAAAGC GGCCGC 3616 (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 2:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 468 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 2:

SK 286115 Β6

Met phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu 15 1015

Met Ser Ala Glu Val Set Gly Gly Asp Arg Leu Asp cys Val Lys Ala 20 2530

Ser Asp Glr. cys Leu Lys Glu G Ír. Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr 35 4045

Leu Arg Gin Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Thr Ser 50 5560

Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lvs 65 70 7580

Gin Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lvs Glu 85 9055

Lys Asn Cys Leu Arg íle Tyr Tro Ser Met Tyr Gin Ser Leu Gin Gly 100 10S110

Asn

ASP

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro

val

Asn

Ser

Arg

Leu

115

120

125

Ser

Asp

íle

Phe

Ala

val

Pro

Phe

íle

Ser

Aso

val

Phe

Gin

13 0

135

140

Val

Glu

His

íle

Ser

Lvs

Gly

Asn

Cys

Leu

Asp

Ala

Lys

Ala

145

150

155

160

Cys

Asn

Leu

Asp

Thr

Cys

Lys

Tyr

Arg

Ser

Ala

Tyr

íle

Thr

165

170

175

Pro

Cys

Thr

Ser

Met

Ser

Asn

Glu

Val

Cys

Asn

Arg

Lys

Cys

180

185

190

His

Lys

Ala

Leu

Arg

Gin

Phe

Asp

Lys

Val

Pro

Ala

Lys

Mís

Ser

195

200

205

Tyr

Gly

Met

Leu

Phe

Cys

Ser

Cys

Arg

Asp

íle

Ala

Cys

Thr

Glu

Arg

210

21S

220

Arg

Gin

Thr

íle

Val

Pro

Val

Cys

Ser

Tyr

Glu

Arg

Glu

Arg

225

230

235

240

Pro

Asn

Cys

Leu

Ser

Leu

Gin

Asp

Ser

Cys

Lys

Thr

Asn

Tyr

íle

Cys

245

250

255

Arg

Ser

Arg

Leu

Ala

Asp

Phe

Thr

Asn

Cys

Gin

; Pro

Glu

Ser

Arg

260

265

270

Ser

Val

Ser

ÄSľl

Cys Leu Lys

Glu

Asn Tyr

Ala

Asp

Cys

Leu

Ala

275

230

285

Tyr

Ser

Gly

Íle Gly Thr

Val

Mec Thr

Pro

Asn

Tyr

Val

Asp

ser

290

295

300

Ser

Leu

Ser

Val Ala Pro

Trp

Cys ASp

Cys

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

305

310

315

320

Asp

Leu

Glu

Asp

C/S Leu Lys

Phe

Leu Asn

Phe

Lys

Asp

Asn

Thr

325

330

335

Cys

Leu

Lys

Asr,

Ala íle Gin

Ala

Phe Gly

Asn

Gly

Ser

Asp

Val

Thr

340

345

350

Met

'T’rt

Gin

Frc

Ala Pro Pro

Val

Gin Thr

Thr

Ala

Thr

je:

36G

365

Ala

Phe

Ατς

Val Lys Asn

Lys

Pro Leu

Gly

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu

370

375

360

Asn

Glu

íle

?ro

Thr His VaL

Leu

Pro Pro

Cys

Ala

Asn

Leu

Gin

Ala

385

390

395

400

Gin

Lys

Leu

Lys

Ser Asn Val

Ser

Gly Ser

Thr

His

Leu

C/s

Leu

Ser

405 410 415

SK 286115 Β6

Asp

Ser Asp

?h.5 420

Gl·/

Lys

Asp

Gly

Leu 425

Ala

Gly

Aiä

Ser

Ser 430

Hl s

íle

Thr

Thr Lys

Ser

Ai.a

Ala.

Pre

Pro

Ser

Cys

Ser

Leu

Ser

Leu

435

440

445

Pzo

Val Leu

Het

Läu

Thr

Alä

Leu

Ala

Leu

Ser

Val

Ser

Leu

450 455 460

Ala Glu Tr.r Ser

465 (2) Informácia o sekvencii SEQID NO: 3:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 39 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:

AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGCGAAGGC GACGTCCGG (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 4:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 33 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:

AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCTCGTC GCA (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 5:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 33 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:

AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCGCATC ACA (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 6:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 1 926 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) znaky:

(A) meno/označenie: CDS (B) pozícia: 10...1920 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 6:

GCGGCCGCC ATG GCG AÄG GCG ACG TCC GGC GCC GCA GGG CTG GC-G CTG 4S

Met Ala Lys Ala Thr Ser GIv Ala Ala Gly Leu Gly Leu 470 475 480

AAG CTG TTT TTG CTG CTG CCG CTA CTG GGA GAA GCC CCG CTG GGT CTC 96

Lys Leu Phe Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Glu Ala Pre Leu Gly Leu 485 490 495

144

192

384

240

288

336

TAC

TTC

TCA

AGG

GAT

GCT

TAC

TGC

GAG

AGG

CTG

TAT

GTG

GAC

CAG

CCA

Tyr

Phe

Ser soo

Arg

ÄSp

Ala

Tyr

Trp 505

Glu

Arg

Leu

Tyr

Val 510

Asp

Gin

Pro

GCT

GGC

ACA

CCT

CTG

CTC

TAT

GTC

CAT

GCC

CTA

CGG

GAT

GCC

CCT

GGÄ

Ala

Gly S15

Thr

Pro

Leu

Tyr 520

Val

His

Ala

Leu

Arg 525

Asp

Ale

Pro

Gly

GAA

GTG

CCC

AGC

TTC

CGC

CTG

GGC

CAG

TAT

CTC

TAT

GGC

GTC

TAC

CGC

Glu 53 Q

Val

Pro

Ser

Phe

Arg S3S

Leu

Gly

Gin

Tyr

Leu S40

Tyr

Gly

Val

Tyr

Arg 54$

ACG

CGT

CTG

CAT

GAG

AAT

GAC

TGG

ATC

CAC

ATC

GAT

GCG

GGC

ACT

GGC

Thr

Arg

Leu

HÍS

Glu 550

Asn

Asp

Trp

íle

His 555

íle

Asp

Ala

Gly

Thr 560

Gly

CTC

TAC

CTC

ÄAT

CAG

AGC

CTG

GAC

CAT

AGT

TCC

TGG

GAG

CAG

CTC

Leu

Tyr

Leu 565

Asn

Gin

Ser

Leu

Asp 570

His

S«r

Ser

Trp

Glu 575

Gin

Leu

AGC

ATC

CGA

ΛΑΤ

GGC

ttc

CCC

TTG

CTC

ACC

GTC

ttc

CTC

CAG

GTC

S«:

11«

Arg Asn

580

Gly Gly Pha

Pro ses

Leu

L«u

Tlur

Val

Phe

590

Val

432

TTC

CTG

GGG TCC

ACA GCC CAG

AGA

GAG

GGA

GAG

TGT

CAT

TGG CCA

GGC

480

528

Phe

TGT

Cys

610

AGC

Ser

768

Leu

595

GCC

Ala

TCC

Ser

Gly Se:

CGT

GTG

Thr· Ala Gin

600

TCC

Glu

Gly

Glu

TÄC ttc

TTC

ATC

AAC

GAC

Cys

605

ACC

His ttc

Arg

TTC

Phe

Val

AAA

Lys

Tyr

GCC

Ala

630

Trp Pro

CCA

AAT

Gly

TGT

Ph«

615

CGG

Arg

Ser

GAT

Asp

Phe

11«

As~

Asp

620

Thr

Phe

Pro

A«n cys

625

CTC

Leu

TGC

Cys

ACC

Thx

635

CCA

GAG

ACG

GGT

GTG

TCC

Pro

Glu

Thr

Gly val Ser

640

576

624

672

720

816

864

912

TTC CGC ATC AGG GAG

AAC

AGG

CCC CCT GGC ACC TTC TAC CAG TTC CGC

Phe Arg

íle

Arg 645

Glu

Asn

Arg

Pro

Pro 650

Gly

Thr

Phe

Tyr

Gin 655

Phe

Arg

ATG CTA

CCT

GTG

CAG

TTC

CTT

TGT

CCT

AAC

ATC

AGT

GTG

AAG

TAC

XAA

Met Leu

Pro 660

val

Gin

Phe

Leu

Cvs 665

Pro

Asn

íle

Ser

Val 670

Lys

Tyr

Lys

CTC TTA

GAA

GGG

GAC

GGT

CTG

CCC

TTC

CGT

TGT

GAC

CCC

GAC

TGT

CTG

Leu Leu €7 5

Glu

Gly

Asp

Gly

Leu 680

Pro

Phe

Arg

Cys

Asp 685

Pro

Asp

cys

Leu

GAG GTG

AGC

ACG

CGG

TGG

GCA

CTG

GAT

CGG

GAG

CTT

CAG

GAG

AAG

TAT

Glu Val 690

Ser

Thr

Trp 695

Ala

Leu

Asp

Arg

Glu 700

Leu

Gin

Glu

Lys

Tyr 705

GTG CTG

GAG

GCT

GAG

TGC

GCA

GTG

GCA

GGC

CCT

GGA

GCC

AAC

AAG

GAG

Val Leu

Glu

Ala

Glu 710

Cys

Ala

Val

Ala

Gly 715

Pro

Gly

Ala

Asn

Lys 720

Glu

AAG GTG

GCC

GTG

TCC

TTC

CCG

GTG

ACG

GTG

TAT

GAT

GAA

GAC

TCC

Lys Val

Ala

Val 725

Ser

Phe

Pro

Val

Thr 730

Val

Tyr

Asp

Glu

Asp 735

ASp

Ser

CCG CCC

ACC

TTC

TCC

GGA

GGT

GTG

GGC

ACC

GCC

AGT

GCT

GTG

GAG

Pro Pro

Thr 740

Phe

Ser

Gly

Val 745

Gly

Thr

Ala

Ser

Ala 750

Val

Glu

TTT AAG

CGG

AAG

GAG

GGC

ACT

GTG

GTX

GCC

ACT

CTG

CAG

GTG

TTT

GAT

Phe Lys 755

Arg

Lys

Glu

Gly

Thr 760

Val

Ala

Thr

Leu 765

Gin.

Val

Phe

Asp

GCA GAT i

GTG

: GTG

CCA

GCA

TCT

GGG

GAG

CTG

GTG

AGG

CGG

TAC

ACA

AGC

Ala Asp 77 0

Val

Pro

Ala 775

Ser

Gly

Glu

Leu

Val 780

Arg

Tyr

Thr

Ser 785

GTG

CTX

CTC TCA GGG GAT TCC TGC GO

CAG CAG

ACC

TTC

GAG

CGG

ACA 1008

Thr

Leu

Leu Ser Gly Asp Ser Trp Ala Gin G1

790 795

Phe

Arg

Val Glu

800

CAC

ACA

ccc

ÄAC

GAG

ACC

TTG

GTC

CAG

TCC

ÄAC

AAC

AAC TCC

GTG

CC-G

Eis

Thr

Pro

Asn

Gltt

Thr

Leu

Val

Gin

Ser

Asn

Asn Ser

Val

Arg

aos

910

81S

GCA

ACC

ATG

CÄC

AAT

TAC

AAG

CTG

GTT

CTC

AAC

AGG

AGC CTG

TCC

ÄTC

ÄXÄ

Thr

Mer

Hl S

Asn

Tyr

Lvs

Leu

Val

Leu

Asn

Arg

Ser Leu

Ser

Zle

820

825

830

TCA )

GAG

AGC

CGA

GTC

CTG

CAG

CTA

GTA

GTC

CTG

GTC

AAT GAC

TCA

GAC

Ser

Glu

Ser

Ar g

Val

Leu

Gin

Leu

Val

Leu

Val

Asn Asp

Ser

Äsp

935

840

845

TTC

CAG

GGG

CCT

GGG

TCA

GGT

GTT

CTC

TTC

CTC

CÄT

TTC ÄAC

GTG

1200

P b. e 850

Gin

Gly Pro

Gly

Ser 85«

Gly Val

Leu

?he

Leu 980

Hl s

Phe Asn

Val

Ser 86«

GTG

CTG

CCT

GTC

ACC

CTG

AAC

CTA

CCC

Λ a\J

GCC

TAC

TCC

TTC

CCA

GTG

1248

Val

Leu

Pro

Val

Thr 910

Leu

Asn.

Leu

Pro

Met 875

Ala

Ty«r

Ser

Phe

Pro 680

Val

AAT

AGC

AGA

GCC

CGC

CGT

TAT

GCC

CAG

ATT

GGG

AÄÄ

GTT

TGC

GTG

gag

1296

Asn

Arg

Ala 885

Arg

Tyr

Ala

Gin 890

íle

Gly

Lys

Val

Cvs 895

Val

Glu

AAC

TGC

CAG

GAG

TTC

AGC

GGT

GTC

TCC

ÄTC

CAG

TAC

AAG

CTG

CAG

CCC

1344

Asn

Cys

Gin 900

Glu

Phe

Ser

Gly

Val 905

Ser

íle

Gin

Lys 910

Leu

Gin

Pro

TCC

AGC

ACC

AAC

TGC

AGT

GCC

CTA

GGT

GTG

GTC

ACC

TCA

ACA

GAA

GAC

1392

Ser

Ser 915

Thr

Asn

Cys

Ser

Ala 920

Leu

Gly

Val

Thr 925

Ser

Thr

Glu

Asp

ACC

TCA

GGG

ACC

CTA

TAT

GTA

AAT

GAC

ACG

GAG

GCC

CTG

CGG

CGA

CCT

1440

Thr 930

Ser

Gly

TI.—

Leu Tyr 935

Val Asn Asp

Thr

Glu 940

Ala

Leu

Arg Arg

Pro 945

GAG

TGT

ACC

GAG

CAG

TAC

ACA

GTG

GTA

GCC

ACT

GAC

CGG

CAG

ACC

1498

Glu

Cys

Thr

Glu

Leu

Gin

Tyr

Thr

Val

Ala

Thr

Asp

Arg

Gin

Thr

950

955

960

CGC

AGG

CAG

ACC

CÄA

GCT

TCG

TTA

GTC

ACA

GTG

GAG

GGG

ACA

TAC

1536

Arg

Gin

Thr

Gin.

Ala

Ser

Leu

Val

Thr

Val

Glu

Gly

Thr

Tyr

965

970

975

ATT

GCA

GAA

GTG

GGC

TGC

CCC

AAG

TCC

TGT

GCA

GTA

AAC

AAG

AGG

1584

Íle

Ala

Glu

Val

Gly

Cys

Pro

Lys

Ser

cys

Ala

Val

Asn

Lys

Arg

980

9BS

990

CGÄ	CCT GAG TGT GAG GAG TGT	GGT GGC CTG GGT TCT CCA ACT GGC AGA
1632
	Pro	Glu	Cys Glu Glu Cys	Gly	Gly	Leu Gly	Ser Pro	Thr Gly Arg
	995		1000			100S
TGT	GAG	TGG	CGT CAG GGA GAT	GGT	AAÄ	GGG ATC	ACC AGG	AAC TTC TCC
1630
Cys	Glu	Trp	Arg Gin Gly Asp	Gly	Lys	Gly íle	Thr Arg	Asn Phe Ser
101C	1		1015			1020	1025
ACC	TGT	*rv—r	CCT AC-C ACC AC-G	ACC	TGT	CCT GAT	GGC CAC	TGT GAT GCT
1723
Thr	Cys	Ser	?»o S—z* Tb.z äjtc	Thr	Cys	Pro Asp	Gly His	Cvs Asn Ala
			1020		1035	1040
CTG	GAG		CGG GAT ATC AAC	ATT	TGC	CCC CAG	GAC TGT	CTC CGT C-GC
1776
Leu	Glu	Ser	Arg Asp íle Asn	íle	Cys	Pro Gin	Asp Cys	Leu Arg Gly
			1045		1050		1055
CGC	ATT	GTT	GGC GGG CAT GAG	CGÄ	GGG	GAG CGC	CAG GGG	ATT AAA GCC
1824
Pro	íle	Val	Gly Gly His Glu		Gly	Glu Arg	Gin Gly	íle Lys Ala
		1060	106:			1070
GGC	m Lr> -	GGC	ATC TGC AAC TGT	TTC	CCT	GAT GAG	AäG aag	TGC TTC TGC
1872
Gly	Tvr	Gly	íle Cys Asr. cys	Phe	Pro	Asp Glu	Lvs Lys	Cys Phe Cys
	107		1080			1085
GAG	CCA	GAG	GAC AGC CAG C-C-C	CCA	TTG	TGT GAT	GCG CTG	TGC CGC ACG
1920
Glu	Pro	Glu	Asp Ser Gin Gly	Pro	Lev	Cys Asp	Ala Leu	Cys Arg Thr

1090 1095 1100 1105

GTCGAC

1926 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 7:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 637 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 7:

Μβΐ	Ala Lys Ala Thr Ser	Gly	Ala	Ala	Gly	Leu Gly	Leu	Lys	Leu	Phe
	e				10				15
Letí	Leu Leu Pro Leu Leu	Gly	Glu	Ala	Pro	Leu Gly	Leu	Tyr	Phe	Ser
	20			25				30
Arg	Asp Ala Tyr Trp Glu	Arg	Leu	Tyr	Val	Asp Gin	Pro	Ala	Gly	Thr
	35		40				4S
Pro	Leu Leu Tyr Val His	Ala	Leu	Arg	Asp	Ala Pro	Gly	Glu	Val	Pro
	50	55				60
Ser	Phe Arg Leu Gly Glr.	Tyr	Leu	Tyr	Gly	Val Tyr	Arg	Thr	Arg	Leu
65	70					7«				80
His	Glu Asn Asn Trs íle	His	íle	Asp	Ala	Gly Thr	Gly	Leu	Leu	Tyr
	85			90				95
Leu	Asr. Gin Ser Leu Asp	His	ser	Ser	Trp	Glu Glr.	Leu	Ser	íle	Arg
	100			105				110
Asr.	Gly Gly Phe Pro Leu	Leu	Thr	Val	Phe	Leu Gin	Val	Phe	Leu	Gly
	llš		120				125
Ser	Thr Ala Glr. Arg Glu	Glv	Glu	Cys	His	Trp Pro	Gly	Cys	Ala	Arg
	130	13 5				140

SK 286115 Β6

Val 145

Typ

Phe Ser

Phe

íle 150

Asn

Asp

Thr Phe

Pro Asr. Cys 155

Ser

Phe 160

Lys

Ala

Arg

Asp

Leu

Cys

Thr

Pro

Glu Thr

Gly

Val

Ser

Phe

Arg

Zle

165

170

175

Arg

Glu

Asti

Arg

Pro

Gly

Thr

Phe Tyr

Gin

Phe

Arg

Met

Leu

Pro

180

185

190

Val

Gin

Phe

Leu

Cys

Pro

Asn

íle

Ser Val

Lys

Tvr

Lys

Leu

Glu

195

200

205

Gly

Asp

Gly

Leu

Pro

Phe

Arg

Cys

Asp Pro

Asp

Cys

Leu

Glu

Val

Ser

210

21S

220

Thr

Arg

Trp

Ala

Leu

Asp

Arg

Glu

Leu Gin

Glu

Lys

Tyr

Val

Leu

Glu

225

230

23 5

240

Ala

Glu

Cys

Ala

Val

Ala

Gly

Pro

Gly Ala

Asn

Lys

Glu

Lys

Val

Ala

24S 250 25S

Val Ser Phe Pro Val Thr Val Tyr Asp Glu Asp Asp Ser Pro Pro Thr 260 265 270

Phe Ser

Gly Gly 27 5

Val

Gly Thr Ala 280

Ser

Ala Val

Val

Glu 285

Phe

Lys

Arg

Lys Glu

Gly

Thr

Val

val

Ala

Thr

Leu

Gin

val

Phe

Asp

Ala

Asp

VA1

290

295

3 00

Val Pro

Ala

Ser

Gly

Glu

L au

VaL

Arg

Tyť

Thr

Ser

Thr

Leu

305

310

31S

320

Ser Gly

Asp

Ser

Trp

Ala

Gin

Thr

Phe

Arg

Val

Glu

His

Thr

Pro

325

330

335

Asn Glu

Thr

Leu

Val

Gin

Ser

Asn

Ser

Val

Arg

Ala

Thr

Met;

340

345

350

His Asr.

Tyr

Lys

Leu

val

Leu

Asn

Arg

Ser

Leu

Ser

íle

Ser

Glu

Ser

355

360

365

Arg Val

Leu

Gin

Leu

Val

Leu

Val

Asn

Asp

Ser

Asp

Phe

Gin

Gly

370

375

380

Pro Gly

Ser

Gly

Val

Leu

Phe

Leu

His

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Leu

Pro

365

390

395

400

Val Thr

Leu

Asn

Leu

Pro

tí e c.

Ala

Tyr

Ser

Phe

Pro

Val

Asn

Arg

405

410

415

Ala Arg

Arg

Tyr

Ala

Gin

Zle

Gly

Lys

Val

Cys

Val

Glu

Asn

Cys

Gin

420

425

430

Glu Phe

Ser

Gly

Val

Ser

íle

Gin

Tyr

Lys

Leu

Gin

Pro

Ser

Thr

43 5

440

445

Asn Cys

Ser

Ala

Leu

Gly

Val

Thr

Ser

Thr

Glu

Asp

Thr

Ser

Gly

4S0 455 460

Thr Leu 465

Tyr

Val

Asn

Asp Thr 470

Glu Ala Leu Arg 475

Arg Pro Glu Cys

Thr 480

Glu Leu

Gin

Tyr

Thr

Val

Ala

Thr

ASp

Arg

Gin

Thr

Arg

Gin

485

490

495

Thr Gin

Ala

Ser

Leu

Val

Thr

val

Glu

Gly

Thr

Tyr

íle

Ala

Glu

500

505

S10

Glu Val

Gly

Cys

Pro

Lys

Ser

Cys

Ala

Val

Asn

Lys

Arg

Pro

Glu

S15

520

525

Cys Glu

Glu

cys

Gly

Leu

Gly

Ser

Pro

Thr

Gly

Arg

Cys

Glu

Trp

530

535

540

Arg Gin

Gly

Asp

Gly

Lvs

Gly

íle

Thr

Arg

Asn

Phe

Ser

Thr

Cys

Ser

545

550

555

560

Pro Ser

Thr

Arg

Thr

Cys

Pro

Asp

Gly

His

Cys

Asp

Ala

Leu

Glu

Ser

S65

570

575

Arg Asp

íle

Asn

íle

cys

Pro

Gin

Asp

Cys

Leu

Arg

Gly

Pro

íle

Val

580

585

530

Gly Gly

His

Glu

Arg

Gly

Glu

Arg

Gin

Gly

íle

Lys

Ala

Gly

Tyr

Gly

S95

600

6 OS

íle Cys

Asn

Cys

Phe

Pro

Asp

Glu

Lys

Cys

Phe

Cys

Glu

Pro

Glu

610

615

620

Asp Ser

Gin

Gly

Pro

Leu

cys

Asp

Ala

Leu

Cys

Arg

Thr

625

630

635

SK 286115 Β6 (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 8:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 1 223 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) znaky:

(A) meno/označenie: CDS (B) pozícia: 1...1038 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 8:

288

CTG

GAG

GAT

TCC

CCA

TAT

GAA

CCA

GTT AAC

AGC

AGA

TTG

TCA

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro

Val Asn

Ser

Arg

Leu

Ser

640

645

650

ATA

TTC

CGG

GTG

GTC

CCA

TTC

ATA

TCA

GTG GAG

CAC

ATT

CCC

AAA

íle

Phe

Arg

Val

Pro

Phe

íle

Ser

Val Glu

His

íle

Pro

Lys

655

660

665

AAC

*> Xf aaL·

TGC

CTG

GAT

GCA

GCG

AAG

GCC

TGC AAC

CTC

GAC

ATT

Asn

cys

Leu

Asp

Ala

Lys

Ala

Cys Asn

Leu

Asp Asp

íle

670

675

680

AAG

TAC

AGG

TCG

GCG

TAC

ATC

ACC

CCG TGC

ACC

AGC

GTG

LyS

Lys

Tyr

Arg

Ser

Ala

Tyr

íle

Thr

Pro Cys

Thr

Ser

Val

690

695

700

AAC

GAT

GTC

TC-C

AAC

CGC

AAG

TGC

CAC AAG

GCC

CTC

CGG

CAG

Asn

Asp

Val

Cys

Asn

Arg

Lys

Cys

His Lys

Ala

Leu

Arg

Gin

705

710

715

TTT

C-ÄC

AAG

GTC

CCG

GCC

AAG

CAC

AGC

TAC GGA

ATG

CTC

TTC

TGC

GAT

Asp

Cys

685

TCC

Phe

480

228

Phe

Asp

Lys 720

Val

Pro

Ala

Lys

His 725

Ser

Tyr

Gly

Met

Leu 730

Phe

TGC

CGG

GAC

ATC

GCC

TGC

ACA

GAG

CGG

AGG

CGA

CAG

ACC

ATC

cys

λϊβ 735

Asp

íle

Ala

Cvs

Thr 740

Glu

Arg

Gin 745

Thr

íle

GTG

TGC

TCC

TAT

GAA

GAG

AGG

GAG

AAG

CCC

AAC

TGT

TTG

AAT

Val 750

cys

Ser

Tyr

Glu

Glu 755

Arg

Glu

Lys

Pro

Asn 760

cys

Leu

Asn

GAC

TCC

TGC

AAG

ACG

AAT

TAC

ATC

TGC

AGA

TCT

CGC

CTT

GCG

Asp

Ser

cys

Lys

Thr 770

Asn

Tyr

íle

Cys

Arg 775

Ser

Arg

Leu

Ala

TTT

ACC

AAC

TGC

CAG

CCA

GAG

TCA

AGG

TCT

GTC

AGC

TGT

Phe

Thr

Asn

Cys 785

Gin

Pro

GlU

Ser

Arg 790

Ser

Val

Ser

Cys 795

GAA

AAC

TAC

GCT

GAC

TGC

CTC

GCC

TAC

TCG

GGG

CTT

ATT

Glu

Asn

Tyr

Ala

Asp

Cys

Leu

Ala

Tyr

Ser

Gly

Leu

Zle

CTA

Leu

GGC

Gly

800

805

810

Asp

780

GTG

CAG

TTG

TTT

GAT

Phe

AAG

Lys

ACA

Thr

SK 286115 Β6

GTC 576 Val

ATG ACC

CCC AAC TAC

ATA GAC TCC AGT

AGC CTC AGT GTG GCC CCA

Ser

Leu Ser Val Ala Pro 825

Met 815

Thr

Pro

Asn Tyr

íle 820

Asp Ser

Ser

TCG

TGT

GAC

TGC

AGC

AAC

AGT

GGG

AAC

GAC

CTA

GAA

GAG

TGC TTG AAA

624

Trp

Cys

Asp

Cys

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

Asp

Leu

Glu

Cys Leu Lvs

830

a3S

840

845

TTT

TTG

AAT

TTC

AAG

GAC

AAT

ACA

TGT

CTT

AAA

AAT

GCA ATT CAA

672

Phe

Leu

Asn

Phe

Lys

Asp

Asn

Thr

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala I_e G_.~.

650

855

860

GCC

TTT

GGC

AAT

GGC

TCC

GAT

GTG

ACC

GTG

TGG

CAG

CCA

GCC TTC CCA

720

Ala

Phe

Gly

Asn

Gly

Ser

Asp

Val

Thr

Val

Trp

Gin

Pro

Ala Phe Pro

865

870

875

GTA

CAG

ACC

ACT

GCC

ACT

ACC

ACT

GCC

CTC

CGG

GTT AAG AAC

768

Val

G Ír.

Thr

Ala

Thr

Ala

Leu

Arg

Val Lys Asn

880

685

890

AAG

CCC

CTG

GGG

CCA

GCA

GGG

TCT

GAG

AAT

GAA

ATT

CCC

ACT CAT GTT

816

Lys

Pro

Leu

Gly

Pro

Ά1&

Gly

Ser

Glu

Asn.

Glu

íle

Pro

Thr His Val

895

900

90S

TTG

CCA

CCG

TGT

GCA

AAT

TTA

CAG

GCA

CAG

AAG

CTG

AAA

. TCC AAT GTG

864

Leu

Pro

cys

Ala

Asn

Leu

Gin

Ala

Gin

Lys

Leu

Lvs

Ser Asn Vai.

910 915 920 925

TCG GGC AAT ACA CAC CTC TGT ATT TCC AAT GGT AAT TAT GAA AAA GAA 912

Ser Gly Asn Thr His Leu Cys íle Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu 930 935940

GGT CTC GGT GCT TCC AGC CAC ATA ACC ACA AAA TCA ATG GCT C-CT CCT 960

Glv Leu Gly Ala Ser Ser His íle Thr Thr Lys Ser Meč Ale Ale Pro 945 950955

CCA AGC TGT GGT CTG AGC CCA CTG CTG GTC CTG GTG GTA ACC GCT CTG 1008

Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu 960 965970

TCC ACC CTA TTA TCT TTA ACA GAA ACA TCA TAGCTGCATT AAAAAAATAC 1058

Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr Ser

975		980
AATATGGACA 1118	TGTAAAAAGA	CAÄAAACCAA	GTTATCTCTT	TCCTGTTCTC	TTGTATAGCT
GAAATTCCAG 1178	TTTAGGAGCT	CAGTTGAGAA	ACAGTTCCAT	TCAACTGGAA	CATTTTTTTT
TTTTCCTTTT 1223	AAGAAAGCTT	CTTGTGATCC	TTCGGGGCTT	CTGTG

(2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 9:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 346 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 9:

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro

val

Asn Ser

Arg

Leu Ser .

Asp

1

5

10

15

íle

Phe

Arg

Val

Pro

Phe

íle

Ser

Val

Glu His

íle

Pro Lys

Gly

20

25

30

Asn

Cys

Leu

Asp

Ala

Lys

Ala

Cys

Asn Leu

Asp

Asp íle

Cys

35

40

45

Lys

Tyr

Arg

Ser

Ala

Tyr

íle

Thr

Pro

Cvs Thr

Tixx

Ser Val

Ser

50

55

60

Asn

Asp

Val

Cys

Asn

Arg

Lys

Cys

His

Lvs Ala

Leu

Arg Gin

phe

65

70

75

80

Phe

Asp

Lys

Val

Pro

Ala

Lys

Hl s

Ser

Tyr

Gly Met

Leu

Phe Cvs

Ser

85

90

95

Cys

Asp

íle

Ala

Cys

Thr

Glu

Arg

Arg Gin

Thr

íle Val

Pro

100

105

110

Val

Cys

Ser

Tyr

Glu

Arg

Glu

Lys

Pro

Asn Cys

Leu

Asn Leu

Gin

115

120

125

Asp

Ser

Cys

Lys

Thr

Asn

Tyr

íle

Cys

Arg

Ser Arg

Leu

Ala Asp

Phe

130

135

140

Phe

Thr

Asn

Cys

Gin

Pro

Glu

Ser

Arg

Ser

Val Ser

Ser

Cys Leu

Lvs

14S

150

155

160

Glu

Asn

Tyr

Ala

Asp

Cys

Leu

Ala

Tyr

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Thr

165

170

175

Val

Met

Thr

Pro

Asn

Tyr

íle

Asp

Ser

Leu

Ser

Val

Ala

Pro

180

135

190

Trp

Cys

Asp

Cys

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

Asp

Leu

Glu

Cys

Leu

Lys

195

200

205

Phe

Leu

Asn

Phe

Lys

Asp

Asn

Thr

cys

Leu

Lys

Asn

Ala

íle

Gin

210

215

220

Ala

Phe

Gly

Asn

Gly

Ser

Asp

Val

Thr

val

Trp

Gin

Pro

Ala

Phe

Pro

225

230

235

240

Val

Gin

Thr

Ala

Thr

Ala

Leu

Arg

Val

Lys

Asn

245

250

255

Lys

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu

Asn

Glu

íle

Pro

Thr

His

Val

260

265

270

Leu

Pro

cys

Ala

Asn

Leu

Gin

Ala

Gin

Lys

Leu Lys

Ser

Asn

Val

275

280

285

Ser

Gly

Asn

Thr

His

Leu

cys

íle

Ser

Asn

Gly

Asn

Tyr

Glu

Lys

Glu

290

295

300

Gly

Leu

Gly

Ala

Ser

His

íle

Lys

Ser

Met

Ala

Pro

305

310

315

320

Pro

Ser

Cys

Gly

Leu

Ser

Pro

Leu

Val

Leu

Val

Thr

Ala

Leu

325

330

335

Ser

Thr

Leu

Ser

Leu

Th“

Glu

Thr

Ser

340

345

(2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 10:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 1 682 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) znaky:

(A) meno/označenie: CDS (B) pozícia: 118... 1 497 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 10:

GGGCGGCCAG AGCAGCACAC

CTGTCCGGGG ATCGCTGCÄT GCTGAGCTCC CTCGGCÄAGA

CCCAGCGGCG GCTCGGGATT TTTTTG 117

ATG TTC CTG GCG ACC CTG TAC

165

Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr

250

CTG TCG GCC G?A GTG AGC GGC 2’3

Leu Ser Ala Glu Val Ser C-ly

365

ÄGT GAT CAG TGC CTG AAG GAG 261

Ser Asp G Ír. Cys Leu Lys Glu

380 385

CTA AGG CAG TGC GTG GCG GGC 309

Leu Arg Gin Cys Val Ala Gly

395 400

GGC CTG GAG GCC AAG GAT GAG 357

Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu

415

CAG AAG TCG CTC TAC AÄC TGC 405

Gin Lys Ser Leu Tyr Asn Cys

430

AAG ÄAC TGC CTG CGC ATT TAC 453

Lys Asr. Cys Leu Are íle Tyr

445

AAT GAT CTG CTG GAG GAT TCG 501

Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser 460 465

TCA GAT ATA TTC CGG GTG GTC 549

Ser Asp íle Phe Arg Val Val

475 480

AAA GGG AAC AAC TGC CTG GAT 597

Lys Gly Asn Asr. Cys Leu Asn

495

ATT TGC AAG AAG TAC AGG TCG 645 íle Cys Lys Lvs Tvr Are Ser

510

693	GTG TCC AAC GAT	GTC TGC	AÄC Asn
Val Ser	Asn Asp 525	Val	Cys
	CAG	TTC	<r»T>r	GAC	AAG	GTC	CCG
741
	Gin	Phe	Phe	Asp	Lys	Val	Pro
		540					545

GGGG GGCGGGGACC AGCCCCGCGC CGGCÄCC

TTC GCG CTG CCG CTC TTG GAC TTCCTC

Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp LeuLeu

355360

GGA GAC CGC CTG GAT TGC GTG AAAGCC

Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val LysAla

370375

CAG AGC TGC AGC ACC AAG TAC CGCACG

Gin Ser Cys Ser Thr Lys Tyr ArgThr

390

AAG GAG ACC AAC TTC AGC CTG GCATCC

Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu AlaSer

405410

TGC CGC AGC GCC ATG GAG GCC CTGAAG

Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala LeuLvs

420425

CGC TGC AAG CGG GGT ATG AAG AAGGAG

Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys LysGlu

435440

TCG AGC ATG TAC CAG AGC CTG CAGGGA

Trp Ser Met Tyr Glr. Ser Leu GinGly

450455

CCA TAT GAA CCA GTT AAC AGC AGATTG

Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser ArgLeu

470

CCA TTC ATA TCA GTG GAG CAC ATTCCC

Pro Phe íle Ser Val Glu His ílePro

485490

GCA GCG AAG GCC TGC AAC CTC GACGAC

Ala Ala Lvs Ala Cys Asn Leu AspAsp

500505

GCG TAC ATC ACC CCG TGC ACC ACCAGC

Ala Tyr íle Thr Pro Cys Thr ThrSer

515520

CGC CGC AAG TGC CAC AAG GCC CTCCGG

Arg Arg Lys Cys His Lys Ala LeuArg

530535

GCC AAG CAC AGC TAC GGA ATG CTC TTC

Ala Lys His Ser Tyr Gly Het Leu Phe

550

SK 286115 Β6

789

933

835

TGC

TCC

TGC

CGG GAC

ATC

GCC

TGC

ACA

GAG

CGG

AGG

CGA

CAG

ACC

ATC

Cys

Ser

Cys

Arg Asp

Tie

n i a

cys

Thr

Glu

Arg

Gin

Thr

íle

555

560

565

570

GTO

CCT

GTG

TGC TCC

TAT

GAA

GAG

AGG

GAG

AAG

CCC

AAC

TGT

TTG

AAT

Val

Pro

Val

Cys Ser

Tyr

Glu

Ary

Glu

Lys

Pro

Asn

Cys

Leu

Asn

575

580

535

TTG

CAG

GAC

TCC TGC

AAG

ACG

AAT

TAC

ATC

TGC

AGA

TCT

CGC

CTT

GCG

Leu

Gin

Asp

Ser Cys

Lys

Tg;

Asn

Tyr

íle

cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Ala

590

595

600

GAT

TTT

ACC AAC

TGC

CAG

CCA

GAG

TCA

AGG

TCT

GTC

AGC

TGT

Asp

Phe

Thr Asn

Cys

Gin

Pro

Glu

Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Cys

60S

610

615

CTA

AAG

GAÄ

AAC TAC

GCT

GAC

TGC

CTC

GCC

TAC

TCG

GGG

CTT

ATT

Leu

Lys

Glu

Asn Tyr

Ala

Asp

Cys

Leu

Ala

Tyr

Sex

Gly

Leu

íle

620

ACC

CCC

TAC

ATA

AGT

1029

Gly

635

Thr

Val

Met

Asn

AGT

Ser

Val

Th:

Pro

640

Tyr íle

Asp

Sex 645

Ser

Leu

Ser

650

GCC CCA TGC TGT GAC TGC

1077

Ala Pro Trp Cys Asp Cys

655

AGC	AAC	AGT	GGG	AAC	GAC	CTA	GAA	GAC	TGC
Ser	Asn	Ser	Gly	Asn	Asp	Leu	Glu	Glu	Cys
			660					665

TTG c

AAA

TTT

TTG

AAT

TTC

AAG

GAC

AAT

ACA

TGT

CTT

AAA

AAT

GCA

Leu

Lys

Phe

Leu 670

Asn

Phe

Lys

Asp 67 5

Asn

Thr

Cys

Leu

Lys 680

Asn

Ala

ATT r 3

CAA

GCC

TTT

ggc

AAT

GGC

TCC

GAT

GTG

ACC

GTG

TGG

CAG

CCA

GCC

íle

G Ír.

Ala 68 5

Phe

Gly

Asn

Gly

Ser 690

Asp

Val

Thr

Val

Trp 695

Gin

Pro

Ala

TTC

CCA

GTA

CAG

ACC

ACT

GCC

ACT

ACC

ACT

GCC

CTC

CGG

GTT

Phe

Pro 700

Val

Gin

Thr

Thr 705

Ala

Thr

Thr 710

Ala

Leu

Arg

Val

AAG í Q

AAC

AAG

CCC

CTG

GGG

CCA

GCA

GGG

TCT

GAG

AAT

GAA

ATT

CCC

ACT

3 5 Lys 715

Asn

Lys

Pro

Leu

Gly 720

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu 725

Asn

Glu

íle

Pro

Thr 730

CAT 1317 His

GTT Val

TTG Leu

CCA CCG

TGT GCA

AAT TTA

CAG GCA

CAG AAG CTG AAA TCC

cys

Ala

Äsr.

Leu

Gin

Lys

Leu

Lys 745

Ser

Pro

Pro 735

Gin 740

Ala

.-77

GTG

TCG

GGC

AAT

AGA

CAC

CTC

TGT

ATT

TCC

GGT

AAT

TAT

1365

Asn

Val

Ser

Gly

Asn

Thr

His

Leu

Cys

íle

Ser

Asn

Gly

Asn

Tyr

Glu

750

755

760

AAA

GAA

GGT

CTC

GGT

GCT

TCC

AGC

CAC

ATA

ACC

ACA

AAA

TCA

ATG

GCT

1413

Lys

Glu

Gly

Leu

Gly

Ala

Ser

His

íle

Thr

Lys

Ser

Met

Ala

765

770

775

GCT

CCT

CCA

AGC

TGT

GGT

CTG

AGC

CCA

CTG

GTC

CTG

GTG

GTA

ACC

1461

Ala

Pro

Ser

cys

Gly

Leu

Ser

Pro

Leu

Val

Leu

Val

Thr

780

785

790

GCT

CTG

TCC

ACC

CTA

TTA

TCT

TTA

ACA

GAA

ACA

TCA

TAGCTGCATT

1507

Ala

Leu

Ser

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr

Ser

795

800

805

AAAAAAATAC 1567	AATATGGACA	TGTAAAAAGA	CAAAAACCAA	GTTATCTGTT	TCCTGTTCTC
TTGTATAGCT 1627	GAAATTCCAG	TTTAGGAGCT	CAGTTGAGAA	ACAGTTCCAT	TCAACTGGAA
CATTTTTTTT 1682	TTTTCCTTTT	AAGAAAGCTT	CTTGTGATCC	TTCGGGGCTT	CTGTG

SK 286115 Β6 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 11:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 460 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: protein (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 11:

Met L

Phe

Leu Ala. Thr 5

Leu

Tyr

Phe

Ala

Leu 10

PCQ

Leu

Asp Leu Leu 15

Leu

Ser

Ala

Glu

Val

Ser

Gly

Asp

Arg

Leu

Asp

Cys

Val

Lys Ala

20

25

30

Sex

Asp

Gin Cys 35

Leu

Lys

Glu Gin 40

Ser Cys

Ser Thr Lys 4S

Tyr Arg Thr

Leu

Arg

Gin

Cys

Val

Ala

Glv

Lys

Glu

Thr

Asn

Phe

Ser

Leu

Ala Ser

SO

55

60

Gly

Leu

Glu

Ala

Lys

Asp

Glu

Cys

Arg

Ser

Ala

Met

Glu

Ala

Leu Lys

65

70

75

80

Glr.

Lys

Ser

Leu

Tyr

Asn

Cys

Arg

Cys

Lys

Arg

Gly

Met

Lys

Lys Glu

85

50

95

Lys

Asn

Cys

Leu

Arg

íle

Tvx

Trp

Ser

Met

Tyr

Gin

Ser

Leu

Gin Gly

100

105

110

Asn

Asp

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro

Val

Asn

Ser

Arg Leu

115

120

12 S

Ser

Asp

Tie

Phe

Arg

Val

Pro

Phe

íle

Ser

Val

Glu

Hl s

Zle Pre

130

13 5

140

Lys

Gly

Asn

Cys

Leu

Asp

Ala

Lys

Ala

cys

Asn

Leu

Asp ASp

145

150

155

160

íle

cys

Lys

Tyr

Arg

Ser

Ala

Tyr

íle

Thr

Pro

Cys

Thr

Thr Ser

165 ΠΟ 175

Val Ser

Asn

ÄSO

Val

Cys .

Asn Arg

Arg

Lys

cys

His

Lys

Ala

Leu

Arg

ieo

195

190

Gin Phe

Phe

Asp

Lys

val

Pro Ala

Lys

His

Ser

Tyr

Gly

Met

Leu

Phe

195

200

205

Cys Ser

Cys

Arg

Asp

íle

Ala Cvs

Thr

Glu

Arg

Gin

Thr

íle

210

215

220

Val Pro

Val

Cys

Ser

Tyr

Glu Glu

Arg

Glu

Lys

Pro

Asn

Cys

Leu

Asr.

225

230

235

240

Leu Gin

ASp

Ser

Cys

Lys

Thr Asn

Tyr

íle

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Ala

24 S

250

255

Asp Phe

Phe

Thr

Asn

Cys

Gin Pro

Glu

Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Cys

260

265

270

Leu Lys

Glu

Asn

Tyr

Ala

Asp Cys

Leu

Ala

Tyr

Ser

Gly

Leu

íle

275

280

285

Cly Thr

Val

Met

Thr

Pro

Asn Tyr

íle

Asp

Ser

Leu

Ser

Val

290

29 S

30Q

Ala Pre

> Trp Cys

i Asp Cys

Ser Asn

l Ser

Gly

Asn

Asp

Leu

Glu

cys

305

310

315

320

Leu	Lys	Phe	Leu Asn Phe 325	Phe	Lys	Asp Asn Thr 330	Cys Leu Lys	Asn Ala
íle	Gin	Ala	Phe	Gly	Asn	Gly	Ser	Asp	Val Thr	Val Trp Gin	Pro Ala
			340					345		350
Phe	Pro	Val	Gin	Thr	Thr	Thr	Ala	Thr	τ'** Thr	Thr Ala Leu	Arg val
		355					360			365
Lys	Asn.	Lys	Pro	Leu	Gly	Pro	Ala	Gly	Ser Glu	Asn Glu íle	Pro Thr
	3T0					375				3S0
His	Val	Leu	Pro	Pro	Cys	Ala	Asn	Leu	Gin Ala	Gin Lys Leu	Lys Ser
38'					390				395		400
Asn	Val	Ser	Gly	Asn	Thr	His	Leu	Cys	11« Ser	Asn Gly Asn	τντ Glu
				405					410		4ÍS
Lys	Glu	Gly	Leu	Gly	Ala	Ser	Ser	HÍS	11« Thr	Thr Lys Ser	Met Ala
			420					425		430
Ala	Pro	Pro	Ser	Cys	Gly	Leu	Ser	Pro	Leu Leu	Val Leu Val	Val Thr
		435					440			445
Ala	Leu	Ser	Thr	Leu	Leu	Ser	Leu	Thr	Glu Thr	Ser
	450					455				460

(2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 12:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 1 888 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) znaky:

(A) meno/označenie: CDS (B) pozícia: 25...1 416 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 12:

SI

AAAAÄACGGT GGGATTTATT TÄAC ATG ATC TTG GCA AAC GTC TTC TGC CTC

Met íle Leu Ale Asn Val Phe Cys Leu

465

TTC

TTT

CTA

GAC

GAG

ACC

CTC

CGC

TCT

TTG

GCC

AGC

CCT

TCC

99

Phe

Leu

ASP

Glu

Thr

Leu

Arg

Ser

Leu

Ala

Ser

Pro

Ser

470

475

480

485

CTG

CAG

GGC

CCC

GAG

CTC

CAC

GGC

TGG

CGC

CCC

CCA

GTG

GAC

TGT

GTC

147

Leu

Gin

Gly

Pro

Glu

Leu

His

Gly

Trp

Arg

Pro

Val

Asp

Cys

Val

490

495

500

CGG

GCC

AAT

GAG

CTG

TGT

GCC

GAA

TCC

AAC

TGC

AGC

TCT

CGC

TAC

195

Arg

Ala

Asn

Glu

Leu

Cys

Ala

Glu

Ser

Asn

Cys

Ser

Arg

Tyr

505

510

515

CGC

ACT

CTG

CGG

CAG

TGC

CTG

GCA

GGC

CGC

GAC

CGC

AAC

ACC

ATG

CTG

243

Arg

Thr

Leu

Arg

Gin

Cys

Leu

Ala

Gly

Arg

Asp

Arg

Asn

Thr

Met

Leu

520

525

530

GCC

AAC

AAG

GAG

TGC

CAG

GCG

GCC

TTG

GAG

GTC

TTG

CAG

GAG

AGC

CCG

291

Ala

Asn

Lys

Glu

Cys

Gin

Ala

Leu

Glu

Val

Leu

Gin

Glu

Ser

Pro

S3S

540

545

CTG

TAC

GAC

TGC

CGC

TGC

AAG

CGG

GGC

ATG

AAG

GAG

CTG

CAG

TGT

339

Leu

Tyr

Asp

Cys

Arg

Cys

Lys

Arg

Gly

Met

Lys

Glu

Leu

Gin

Cys

550

555

560

5S5

CTG

CAG

ATC

TAC

TGG

AGC

ATC

CAC

CTG

GGG

CTG

ACC

GAG

GGT

GAG

387

Leu

Gin

íle

Tyr

Trp

Ser

íle

His

Leu

Gly

Leu

Tbz

Glu

Gly

Glu

570 575 580

435

483

531

579

TTC TAC

GAA GCC TCC CCC TAC

GAC- CCG GTG ACC

TCC CGC CTC TCG GAC

Phe

Tyr

Glu

Ala 585

Ser

Pro

Tyr

Glu Pro 590

Val

Thr

Ser

Arg Leu 595

Ser

Asp

ATC

TTC

AC-G

CTT

GCT

TCA

ATC

TTC TCA

GGG

ACA

GGG

GCA GAC

CCG

GTG

íle

Phe

Arg 600

Leu

Ala

Ser

T' A

Phe Ser 605

Gly

»T>·— _va

Gly

Ala Asp 610

Pro

Val

GTC

AGC

GCC

AAG

AGC

AAC

CAC

TGC CTG

GAT

GCT

GCC

AAG GCC

TGC

AAC

Val

Ser 615

Ala

Lys

Ser

Asn

His 620

Cys Leu

Asp

Ala

Ala 625

Lys Ala

cys

Asn

CTG

AAT

GAC

AAC

TGC

AAG

CTG CGC

TCC

TAC

ATC TCC

ATC

TGC

Leu 630

Asn

Asp

Asn

cys

Lvs 635

Lys

Leu Arg

Ser

Ser 640

Tyr

íle Ser

íle

Cys 645

AAC

CGC

GAG

ATC

TCG

CCC

ACC

GAG CGC

TGC

AAC

CGC

CGC AAG

TGC

CAC

Asn

Arg

Glu

íle

Ser 650

Pro

Thr

Glu Arg

cys 655

Asn

Arg

Arg Lvs

Cys 660

His

627

SK 286115 Β6

723

771

819

Lys

Kla

CGC

Met

Arg

CTG

CGC

CAG

TTC

GAC

CGG

GTG

CCC

AGC GAG

TAC

ACC

TAC

Leu

Arg

Gin

Phe

Asp

Arg

Val

Pre

Ser Glu

Tyr

Thr

Tyr

665

670

675

CTC

TTC

TGC

TCC

TGC

CAA

GAC

CAG

GCG

TGC GCT

GAG

CGC

Leu

Phe

Cys

Ser

Cys

Gin

Asp

Gin

Ala

Cys Ala

Glu

Arg

680

585

690

ACC

ATC

CTG

ccc

AGC

TGC

tcc

TAT

GAG

GAC AAG

GAG

AAG

CCC

Thr

íle

Leu

Pro

Ser

Cys

Ser

Tyr

Glu

Asp Lys

Glu

Lys

Pro

700

705

CTG

GAC

CTG

CGT

GGC

GTG

TGC

CGG

ACT

GAC CAC

CTG

TGT

CGG

Leu

Asp

Leu

Arg

Gly

Val

cys

Arg

Thr

Asp His

Leu

cys

Arg

715

720

725

CTG

GCC

GAC

TTC

CAT

GCC

AAT

TGT

CGA

GCC TCC

TAC

CAG

ACG

GTC ACC AGC TGC CCT GCG GAC AAT TAC CAG GCG TGT CTG GGC TCT TAT
915
Val	Thr	Ser Cys	Pre Ala	Asp	Asn	Tvr	Gin Ala	Cys Leu ¹	Gly Ser	Tyr
		745				750			755
GCT		S ΦΓ * ftVJ ΛΑ. 4	GGG TTT	GAC	ATG	ACA	CCT AAC	TAT GTG	GAC TCC	AGC
963
Ala	Gly	Met íle	Gly Phe	ASp	Met	Thr	Pro Asn	Tyr val	Asp Ser	Ser
		760			765			770
CCC	ACT	GGC ATC	GTG GTG	TCC	CCC	TGG	TGC AGC	TGT CGT	GGC AGC	GGG
1011
Pro	Thr	Gly íle	Val Val	Ser	Pro	Trp	Cys Ser	Cys Arg	Gly Ser	Gly
	775			780				785
AAC	ATG	GAG GAG	GAG TGT	GAG	AAG	TTC	CTC AGG	GAC TTC	ACC GAG	AAC
1059
Asn	Met.	Glu Glu	Glu Cys	Glu	Lys	Phe	Leu Arg	Asp Phe	Thr Glu	Asn
790			795				800			805
CCA	TGC	CTC CGG	AAC GCC	ATC	CAG	GCC	TTT GGC	AAC GGC	ACG GAC	GTG
1107
Pro	Cys	Leu Arg	Asn Ala	íle	Gin	Ala	Phe Gly	Asn Gly	Thr Asn	Val
			810				815		820
AAC	GTG	TCC CCA	ΛΛΛ	CCC	TCG	TTC	CAG GCC	ACC CAG	GCC CC?	CGG
1155
Asn	Val	Ser Pro	Lys Gly	Pro	Ser	Phe	Glr. Ala	Thr Gin	Ala Pro	Arg
		825				830			835
GTG	GAG	AAG ACG	CCT TCľ	TTG	CCA	GAT	GAC CTC	AGT GAC	AGT ACC	AGC
1203
Val	Glu	Lys Thr	Pro Ser	Leu	Pro	Asp	Asp Leu	Ser Asp	Ser Thr	Ser
		840			845			850
TTG	GGG	ACC ÄGT	GTC ATC	ACC	ACC	TGC	ACG TCT	GTC CAG	GAG CAG	GGG
1251
Leu	Glv	Thr Ser	Val íle	Thr	Thr	Cys	Thr Ser	Val Gin	, Glu Gin	. Gly
	855			860				865

SK 286115 Β6

CTG

AAG

GCC

AAC

TCC

AAA

GAG

TTA

AGC

ATG

TGC

TTC

ACA

GAG

CTC

1299

Leu

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Glu

Leu

Ser

Met

Cys

Phe

Thr

Glu

Leu

370

87S

880

885

ACG

ACA

AAT

ATC

CCA

GGG

AGT

AAC

AAG

GTG

ATC

AAA

CCT

AAC

TCA

1347

Thr

Asn

íle

Pro

Gly

Ser

Asn

Lys

Val

íle

Lys

Pro

Asn

Ser

890

895

900

GGC

CCC

AGC

AGA

GCC

AGA

CCG

TCG

GCT

GCC

TTG

ACC

GTG

CTG

TCT

GTC

1395

Gly

Pro

Ser

Arg

Ala

Arg

Pro

Ser

Ala

Leu

Val

Leu

Ser

Val

905

910

915

CTG

ATG

CTG

AAA

CTG

GCC

TTG

TAGGCTGTGG i

GAÄC

CGAG

TC A

GAAGATTT'

J.

1446

Leu Met Leu	Lys Leu Ala Leu
920
TGääAGCTAC	GCAGACÄAGA ACAGCCGCCT GACGAAATGG AÄACACACAC AGACACACAC
1506
TTVk-A	ÄAAAÄAAAAT TGTTTTTCCC ACCTTGTCGC TGAACCTGTC TCCTCCCAGG
15éc
TTTCTTCTCT	GGAGAAGTTT TTGTÄAACCA ÄACAGACAAG CAGGCAGGCA GCCTGAGAGC
1626
TGGCCCAGGG	GTCCCCTGGC AGGGGAAACT CTGGTGCCGG GGAGGGCACG AGGCTCTAGA
1686
AATGCCCTTC	ACTTTCTCCT GGTGTTTTTC TCTCTGGACC CTTCTGÄAGC AGAGACCGGA
1746
CAÄGAGCCTG	CAGCGGAAGG GACTCTGGGC TGTGCCTGAG GCTGGCTGGG GGCAGGACAA
1806
CACAGCTGCT	TCCCCAGGCT GCCCACTCTG GGGACCCGCT GGGGGCTGGC AGAGGGCÄTC

186 ó

GGTCJM3CGGG GCÄGCC-GGGC TG

138S (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 13:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 464 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: protein (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 13:

Met

íle

Leu

Ala

Asn

Val

Phe

Cys

Leu

Phe

Leu

Asp

Glu

Thr

-

10

1S

Leu

Arg

Ser

Leu

Ala

Ser

Pro

Ser

Leu

Gin

Gly

Pro

Glu

Leu

Hl s

20

25

30

Gly

Trp

Arg

Pro

Val

Asp

Cys

Val

Arg

Ala

Asn

Glu

Leu

Cys

Ala

35

40

45

Ala

Glu

Ser

Asn

Cys

Ser

Arg

Tyr

Arg

Thr

Leu

Arg

Gin

Cys

Leu

50

S5

60

Ala

Gly

Arg

Asp

Arg

Asn

Thr

Met

Leu

Ala

Asn

Lys

Glu

cys

Gin

Ala

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Leu

Gin

Glu

Ser

Pro

Leu

Tyr

Asp

cys

Arg

Cys

Lys

85

90

95

Arg

Glv

Met

Lys

Glu

Leu

Gin

Cvs

Leu

Gin

íle

Tyr

Trp

Ser

íle

100

105

110

His

Leu

Gly

Leu

Glu

Gly

Glu

Phe

Tyr

Glu

Ala

Ser

Pro

Tyr

115

120

125

Glu

Pro

Val

Thr

Ser

Arg

Leu

Sex

Asp

Zle

Phe

Arg

Leu

Ala

Ser

Zle

130

13 5

140

Phe

Ser

Gly

Thr

Gly

Ala

Asp

Pro

Val

Ser

Ala

Lys

Ser

Asn

His

145

150

155

160

Cys

Leu

Asp

Ala

Lys

Ala

Cys

Asn

Leu

Asn

Asp

Asn

Cys

Lys

165

170

175

Leu

Arg

Sex

Tyr

Zle

Sex

Zle

Cys

Asn

Arg

Glu

Zle

Ser

Pro

Thr

180

1B5

190

Glu

Arg

Cys

Asn

Arg

Lys

Cys

His

Lys

Ala

Leu

Arg

Gin

Phe

19$ 200 205

Asp

Arg

Val

Pro

Ser

Glu

Tyr

Thr

Tyr

Arg

het

Leu

Phe

Cys

ser

Cys

210

215

220

Gin

Asp

Gin

Ala

Cys

Ala

Glu

Arg

Gin

Thr

Zle

Leu

Pro

Ser

225

230

235

240

cys

ser

Tyr

Glu

Asp

Lys

Glu

Lys

Pro

Asn

Cys

Leu

Asp

Leu

Arg

Gly

245

250

255

Val

cys

Arg

Thr

Asp

His

Leu

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Ala

Asp

Phe

His

260

265

270

Ala

Asn

Cvs

Arg

Ala

Ser

Tyr

Gin

Thr

Val

Thr

Ser

Cys

Pro

Ala

Asp

275

280

285

Asn

Tyr

Gin

Ala

Cys

Leu

Gly

Ser

Tyr

Ala

Gly

Het

Zle

Gly

Phe

Asp

290

295

300

Met Thr 305

Pro Asn

Tyr Val 310

Asp

Ser

Pro Thr 315

Gly Zle Val

Val

Ser 320

Pro

Tsrp

Cys

Sex

Cys 325

Arg

Gly

Ser

Gly

Asn 330

Met

Glu

Cys 335

Glu

Lys

Phe

Leu

Arg 340

Asp

Phe

Thr

Glu

Asn 345

Pro

Cys

Leu

Arg

Asn 350

Ala

Zle

C-ln

Ala

Phe 355

Gly

Asn

Gly

Thr

Asp 360

Val

Asn

Val

Ser

Pro 365

Lys

Gly

Pro

Ser

Phe 370

Gin

Ala

Thr

Gin

Ala 375

Pro

Arg

Val

Glu

Lys 380

Thr

Pro

Ser

Leu

Pro 3BS

Asp

Leu

Ser

Asp 390

Ser

Thr

ser

Leu

Gly 395

Thr

Ser

Val

Zle

Thr 400

Thr

Cys

Thr

Ser

Val 405

Gin

Glu

Gin

Gly

Leu 410

Lys

Ala

Asn

Ser 415

Lys

Glu

Leu

Ser

Met 420

Cys

Phe

Thr

Glu

Leu 425

Thr

Asn

Zle

Zle 430

Pro

Gly

Ser

Asn

Lys 435

Val

íle

Lys

Pro

Asn 440

Ser

Gly

Pro

Ser

Arg 445

Ala

Arg

Pro

Ser

Ala 450

Ala

Leu

Thr

Val

Leu 4S5

Ser

Val

Leu

Met

Leu 460

Lys

Leu

Ala

Leu

(2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 14:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 1 878 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina

SK 286115 Β6 (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) znaky:

(A) meno/označenie: CDS (B) pozícia: 205...1 242 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 14:

CGCGGCGCCC AGCGCAGGCA GAGCGCTGTC GCATCCCGGG CGTCCACCCG CCATGGGGCT 60

CTCCTGGAGC CCGCGACCTC CACTGCTGAT GATCCTGCTA CTGGTGCTGT CGTTGTGGCT 120

GCCACTTGGA GCAGGAAACT CCCTTGCCAC AGAGÄACAGG TTTGTGAACA GCTGTACCCA

130

231

GGCCAGAAAG AAATGCGAGG CTAA TCC CGC TTG CAA GGC TGC CTA CCA GCA

Ser Arg Leu Gin Gly Cys Leu Pro Ala 465 470

279

327

375

423

471

519

567

CCT

GGG

CTC

CTG

CAC

CTC

CAG

TTA

AGC

AGG

CCG

CTG

CCC

TTA GAG

GAG

Pro

Gly

Leu

His

Leu

Gin

Leu

Ser

Arg

Pro

Leu

Pro

Leu Glu

Glu

475

4 80

485

TCT

GCC

ATG

TCT

GCA

GAC

TGC

CTA

GAG

GCA

GAA

CAA

CTC AGG

AAC

Ser

Ala

Met

Ser

Ala

Asp

Cys

Leu

Glu

Ala

Glu

Gin

Leu Arg

Asr.

490

495

500

50S

AGC

TCT

CTG

ATA

GAC

TGC

AGG

TGC

CAT

CGG

CGC

ATG

AAG

CAC CAA

GCT

Ser

Leu

íle

Asp

Cys

Arg

Cys

His

Arg

Met

Lys

His Gin

Ala

510

515

520

ACC

TGT

CTG

GAC

ATT

TAT

TGG

ACC

GTT

CAC

CCT

GCC

CGA

AGC CTT

GGT

Thr

Cys

Leu

Asp

Xle

Tyr

Trp

Thr

Val

His

Pro

Ala

Arg

Ser Leu

Gly

525

530

S35

GAC

TAC

GAG

TTG

GAT

GTC

TCA

CCC

TAT

GAA

GAC

ACA

GTG

ACC AGC

AAA

Asp

Tyr

Glu

Leu

Asp

Val

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

val

Thr Ser

Lys

540

545

550

CCC

TGG

AAA

ATG

AAT

CTT

AGC

AAG

TTG

AAC

ATG

CTC

AAA

CCA GAC

TCG

Pro

Trp

Lys

Met

Asn

Leu

Ser

Lys

Leu

Asn

Het

Leu

Lys

Pro Asp

Ser

555

560

565

GAC

CTC

TGC

CTC

AAA

TTT

GCT

ATG

CTG

TGT

ACT

CTT

CAC

GAC AAG

TGT

Asp

Leu

Cys

Leu

Lys

Phe

Ala

Met

Leu

Cys

Thr

Leu

His

Asp Lys

Cvs

570

575

580

585

GAC

CGC

CTG

CGC

AAG

GCC

TAC

GGG

GAG

GCA

TGC

TCA

GGG

ATC

CGC

TGC

615

ASp

Arg

Leu

Arg

Lys

Ala

Tyr

Gly

Glu

Ala

Cys

Ser

Gly

íle

Arg

cys

590

595

600

CAG

CGC

CAC

CTC

TGC

CTA

GCC

CAG

CTG

CGC

TCC

TTC

TTT

GAG

AAG

GCA

663

Gin

Arg

His

Leu

Cys

Leu

Ala

Gin

Leu

Arg

Ser

Phe

Glu

Lys

Ala

605

610

615

GCA

GAG

TCC

CAC

GCT

CAG

GGT

CTG

TGT CCC

TGT

GCA

CCA

GAA

711

Ala

Glu

Ser

His

Ala

Gin

Gly

Leu

Cys Pro

cys

Ala

Pro

Glu

620

62S

630

GAT

GCG

GGC

TGT

GGG

GAG

CGG

CGT

AAC

ACC ATC

GCC

CCC

AGT

TGC

759

ASp

Ala

Gly

cys

Gly

Glu

Arg

Asn

Thr íle

Ala

Pro

Ser

Cys

635

640

645

GCC

CTG

CCT TCT GTA ACC CCC AAT

TGC CTG GAT

CTG CGG AGC TTC TGC

807

Ala

Leu

Pro

Ser

val

Thr

Pro

Asn

Cys

Leu Asp

Leu

Arg

Ser

Phe Cys

650

655

660

665

CGT

GCG

GAC

CCT

TTG

TGC

AGA

TCA

CGC

CTG ATG

GAC

TTC

CAG

ACC CAC

8S5

Arg

Ala

Asp

Pro

Leu

Cys

^A*g

Ser

Arg

Leu Met

Asp

Phe

Gin

Thr Hŕs

670

675

680

TGT

CAT

CCT

ATG

GAC

ATC

CTT

GGG

ACT

TGT GCA

ACT

GAG

CAG

TCC AGA

903

cys

Eis

Pro

Met

Asp

íle

Leu

Gly

'T'U —

Cys Ala

Thr

Glu

Gin

Ser Arg

685

6*90

695

TGT

CTG

CGG

GCA

TAC

CTG

GGG

CTG

ATT

GGG ACT

GCC

ATG

ACC

CCA AAC

951

Cys

Leu

Arg

Ala

Tyr

Leu

Gly

Leu

íle

Gly Thr

Ala

Me-

Thr

Pro Asn

700

705

710

TTC

ATC

AGC

AAG

GTC

AAC

ACT

GTT

GCC TTA

AGC

TGC

ACC

TGC CGA,

999

Phe

íle

Ser

Lys

Val

Äsn

Thr

Val

Ala Leu

Ser

Cys

Thr

Cys Arg

715

720

725

GGC

AGC

GGC

AAC

CTA

CAG

GAC

GAG

TGT

GAA CAG

CTG

GAA

AGG

TCC

1047

Gly Ser 730

Gly

Asn

Leu Gin 735

Asp Glu Cvs

Glu Gin 740

Leu

Glu

Arg

Ser

Phe 745

TCC

CAG

AAC

CCC

TGC

CTC

GTG

GAG

GCC

ATT

GCA

GCT

ÄAG

ATG

CGT

TI**’

1095

Ser

Gin

Asn

Pro

Cys

Leu

Val

Glu

Ala

íle

Ala

Lys

Met

Arg

Phe

750

755

760

CAC

AGA

CAG

CTC

TTC

TCC

CAG

GAC

TGG

GCA

GAC

TGT

ACT

TTT

TCA

GTG

1143

His

Arg

Gin

Leu

Phe

Sex

Gin

ASP

Trp

kla

Asp

Sex

Thr

Phe

Ser

Val

76S

770

775

GTG

CAG

AAC

AGC

AAC

CCT

GCT

CTG

AGA

CTG

CAG

CCC

AGG

CTA

1191

Val

Gin

Asn

Ser

Asn

Pro

Ala

Leu

Arg

Leu

Gin

Pro

Arg

Leu

780

785

790

CCC ATT CTľ TCT TTC TCC ATC CTT CCC TTG ATT CTG CTG CAG ACC CTC 1239

Pro 11« Leu Ser Phe Ser 11« Leu Pro Leu íle Leu Leu Gin Thr Leu 795 800 805

TGG TAGCTGGGCT TCCTCAGGGT CCTTTGTCCT CTCCACCACA CCCAGACTGA 1292

Trp

810

TTTGCAGCCT 1352	GTGGTGGGAG	AGAACTCGC C	AGC CTGTGGA	AGAAGACGCA	GCGTGCTACA
CAGCAACCCG 1412	GAACCAACCA	GGCATTCCGC	AGCACATCCC	GTCTGCTCCA	GÄAGAGG'T’CT
T AGAAGTGag 1472	GGCTGTGACC	CTTCCGATCC	TGAGCC-GCTA	GTTTTCAÄAC	CTCCCTTGCC
CCTGCTTCCT 1532	TCTGGCTCAG	GCTGCTCCTC	CTTAGGACTT	TGTGGGTCCA	GTTTTGCCTT
CTGTTCTGAT	GGTGATTAGC	GC-CTCACCTC	CAGCGCTTCT	TCCTGTTTCC	CAGGACCACC

1592

CAGAGGCTAA GGAATCAGTC ATTCCCTGTT GCCTTCTCCA GGAAGGCAGG CTAAGC-GTTC 1652

TGAGC-TGACT GAGAAÄÄATG TTTCCTTTGT GTGGÄAGGCT GGTGCTCCAG CCTCCACGTC 1712

CCTCTGAÁTG GAAGATAAÄA ACCTGCTGGT GTCTTGACTG CTCTGCCAGG CAATCCTGAA 1772

CA.TTTGGGCA TGAAGAGCTA AAGTCTTTGG GTCTTGTTTA ACTCCTATTA CTGTCCCCÄA 1832

ATTCCCCTAG TCCCTTQGGT CATGATTAAA CATTTTGACT TAÄAAA

1878

SK 286115 Β6 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 15:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 346 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: protein (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 15:

Ser

Arg

Leu

Gin

Glv

Cys

Leu

Pro

Ala

Pro

Gly

Leu

His

Leu

Gin

1

5

10

15

Leu

Ser

Arg

Pro

Leu

Pro

Leu

Glu

Ser

Ala

Met

Ser

Ala

Asp

Cy s

20

25

30

Leu

Glu

Ala

Glu

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Leu

íle

Asp

Cys

Arg

35

40

45

Cys

His

Arg

Met

Lys

His

Gin

Ala

Thr

Cys

Leu

Asp

íle

Tyr

Trp

50

S5

60

Thr

Val

His

Pro

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

Asp

Tyr

Glu

Leu

Asp

Val

Ser

7Q 75 80

Pre Tyr Glu Asp Thr Vsi Thr Ser Lvs Pro Trp Lys Met Asn Leu Ser 85 * 9095

Lys Leu Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp Leu Cys Leu Lys Phe Ala 100 105110

Met Leu Cys Thr Leu His Asp Lys Cvs Asp Arg Leu Arg Lys Ala Tyr 115 120125

Gly Glu Ala Cys Ser Gly íle Arg Cvs Gin Arg His Leu Cys Leu Ala 130 135140

Gin Leu Arg Ser Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu Ser His Ala Gin Gly 145 150 155160

Leu

Leu Leu

Cys

Pro Cys

Ala

Pro

Glu

Asp

Ala Gly i

Cys

Gly

Glu

Arg

165

170

175

Arg

Arg Asn

Thr

íle Ala

Pro

Ser

Cys

Ala

Leu Pro

Ser

Val

Thr

Pro

180

ías

190

Asn

Cys Leu

Asp

Leu Arg

Ser

Phe

Cys

Arg

Ala Asp

Pro

Leu

Cys

Arg

195

200

205

Ser

Arg Leu

Met

Asp Phe

Gin

Thr

His

Cys

His Pro

Met

Asp

íle

Leu

210

215

220

Gly

Thr Cys

Ala

Thr Glu

Gin

Ser

Arg

Cys

Leu Arg

Ala

Tyr

Leu

Gly

225

230

235

240

Ijôu

íle Gly

Thr

Ala Het

T^ur

Pro

Asn

Phe

íle Ser

Lys

Val

Asn

Thr

245

2S0

255

Thr

Val Ala

Leu

Ser Cys

Thr

cys

Arg

Gly

Ser Gly

Asn

Leu

Gin

Asp

260

265

270

Glu

Cys Glu

Gin

Leu Glu

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin Asn

Pro

Cys

Leu

Val

275

280

285

Glu

Ala íle

Ala

Ala Lys

Met

Arg

Phe

His

Arg Gin

Leu

Phe

Ser

Gin

290

295

300

Asp

Trp Ala

Asp

Ser Thr

Phe

Ser

Val

Gin Gin

Gin

Asn

Ser

Asn

305

310

315

320

Pro

Ala Leu

Arg

Leu Gin

Pro

Arg

Leu

Pro

íle Leu

Ser

Phe

Ser

íle

325

330

335

Leu

Pro Leu

íle

Leu Leu

Gin

Thr

Leu

Trp

340

345

(2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 16:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 1 889 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: j ednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) znaky:

(A) meno/označenie: CDS (B) pozícia: 41...1 231 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 16:

CGCAGGCAGA gcgctgtcgc atcccgggcg tccacccgcc atg ggg ctc tcc tgg 55

Met Gly Leu Ser Trp

350

AGC

CCG

CGA

CCT CCA

CTG

ATG

ATC

CTG

CTA

CTG

GTG

CTG

TCG

TTG

103

Ser

Pro

Arg

Pro Pro

Leu

Met

Íle

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

355

360

365

TGG

CTG

CCA

CTT GGA

GCA

GGA

AAC

TCC

CTT

GCC

ACA

GAG

AAC

AGG

TTT

x

Trp

Leu

Pro

Leu Gly

Ala

Gly

Asn

Ser

Leu

Ala

Thr

Glu

Asn

Arg

Phe

370

375

380

GTG

AAC

AGC

TGT ACC

CAG

GCC

AGA

AAG

AAÄ

TGC

GAG

GCT

AAT

CCC

GCT

199

Val

Asn

Ser

Cys Thr

Gin

Ala

Arg

Lys

Cys

Glu

Ala

Asn

Pro

Ala

385

390

395

TGC

AAG

GCT

GCC TAC

CAG

CAC

CTG

GGC

TCC

TGC

ACC

TCC

AGT

TTÄ

AGC

247

cys

Lys

Ala

Ala Tyr

Gin

His

Leu

Gly

Ser

cys

Thr

Ser

Leu

Ser

400

403

410

415

AGG

CCG

CCC TTÄ

GAG

TCT

GCC

ATG

TCT

GCA

GAC

TGC

CTA

GAG

295

Arg

Pro

Leu

Pro Leu

Glu

Ser

Ala

Met

Ser

Ala

Asp

Cys

Leu

Glu

420

425

430

GCA

GAA

CAA CTC

AGG

AAC

AGC

TCT

CTG

ATA

GAC

TGC

AGG

TGC

CAT

343

Ala

Glu

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Leu

íle

Asp

Cys

Arg

Cys

His

435

440

445

CGG

CGC

ATG

AAG

CAC

CAA

GCT

ACC

TGT

CTG

GAC

ATT

TAT

TGG

ACC

GTT

j - « Arg

Arg

Met

Lys

His

Gin

Ala

Thr

Cys

Leu

Asp

íle

Tyr

Trp

Thr

Val

450 455 460

CAC

CCT

GCC

CGA

AGC

CTT

GGT

GAC

TAC

GAG

TTG

GAT

GTC

TCA

CCC

TAT

His

Pro

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

Asp

Tyr

Glu

Leu

Asp

Val

Ser

Pro

Tyr

465

470

475

GAA

GAC

ACA

GTG

ACC

AGC

AAA

CCC

TGG

AAA

ATG

AAT

CTT

AGC

AAG

TTG

Glu

Asp

Thr

val

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

Lys

Met

Asn

Leu

Ser

Lys

Leu

480

485

490

495

AAC

ATG

CTC

AAA

CCA

GAC

TCG

GAC

CTC

TGC

CTC

AAA

TTT

GCT

ATG

CTG

Asn

Met

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

Cys

Leu

Lys

Phe

Ala

Met

Leu

500

SOS

510

TGT

ACT

CTT

CAC

GAC

AAG

TGT

GAC

CGC

CTG

CGC

AAG

GCC

TAC

GGG

GAG

Cys

Thr

Leu

His

Asp

Lys

Cys

Asp

Arg

Leu

Arg

Lys

Ala

Tyr

Gly

Glu

515

520

525

SK 286115 Β6

631

GCA

TGC

TCA

GGG

ATC

CGC

TGC

CAG

CGC

CAC

CTC

TGC

CTA

GCC

CAG

CTG

Ala

Cys

Ser

Gly

íle Arg Cys

Gin

Arg

His

Leu

cys

Leu

Ala

Gin

Leu

530

535

540

CGC

TCC

TTC

TTT

GAG

AAG

GCA

GAG

TCC

CAC

GCT

CAG

GGT

CTG

679

Arg

Ser

Phe

Glu

Lys

Ala

Glu

Ser

His

Ala

Gin

Gly

Leu

545

550

555

CTG

TGT

CCC

TGT

GCA

CCA

GAA

GAT

GCG

GGC

TGT

GGG

GAG

CGG

CGT

727

Leu

Cys

Pro

cys

Ala

Pro

Glu

Asp

Ala

Gly

Cys

Gly

Glu

Arg

560

565

570

575

AAC

ACC

ATC

GCC

CCC

AGT

TGC

GCC

CTG

CCT

TCT

GTA

ACC

CCC

λλΤ

TGC

775

Asn

Thr

íle

Ala

Pro

Ser

Cys

Ala

Leu

Pro

Ser

Val

Thr

Pro

Asn

cys

580

585

590

CTG

GAT

CTG

CGG

AGC

TTC

TGC

cct

GCG

GAC

CCT

TTG

TGC

AGA

TCA

CGC

823

Leu

Asp

Leu

Arg

Ser

Phe

Cys

Arg

Ala

Asp

Pro

Leu

Cys

Arg

Ser

Arg

595

600

605

CTG

ATG

GAC

TTC

CAG

ACC

CAC

TGT

CAT

CCT

ATG

GAC

ATC

CTT

GGG

ACT

871

Leu

Met

Asp

Phe

Gin

Thr

His

Cys

His

Pro

Met

Asp

íle

Leu

Gly

Thr

610

615

620

TGT

GCA

ACT

GAG

CAG

TCC

AGA

TGT

CTG

CGG

GCA

TAC

CTG

GGG

CTG

A.'CT

919

Cys

Ala Thr Glu Gin Ser Arg Cys

Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Leu 635

íle

625

630

GGG

ACT

GCC

ATG .

ACC CCA AAC

TTC

ATC

AGC

AAG

GTC

AAC ACT

ACT

GTT

967

Gly

Thr

Ala

Met

Thr :

Pro Asn

Phe

íle

Ser

Lys

Val

Asn Thr

Thr

Val

640

645

650

655

GCC

TTA

AGC

TGC

ACC ¹

TGC CGA

GGC

AGC

GGC

AAC

CTA

CAG GAC

GAG

TGT

1015

Ala

Leu

Ser

Cys

Thr .

Cys Arg

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Gin Asp

Glu

Cys

660

665

670

GAA

CAG

CTG

GAA

AGG

TCC TTC

TCC

CAG

AAC

CCC

TGC

CTC GTG

GAG

GCC

1063

Glu

Gin

Leu

Glu

Arg

Ser Phe

Ser

Gin

Asn

Pro

Cys

Leu Val

Glu

Ala

675

680

685

ATT

GCA

GCT

AAG

ATG

CGT TTC

CAC

AGA

CAG

CTC

TTC

TCC CAG

GAC

TGG

1111

íle

Ala

Lys

Met

Arg Phe

His

Arg

Gin

Leu

Phe

Ser Gin

Asp

Trp

690

695

70Q

GCA

GAC

TCT

ACT

TTT

TCA GTG

GTG

CAG

AAC

AGC AAC

CCT

GCT

1159

Ala

Asp

Ser

Thr

Phe

Ser Val

Val

Gin

Asn

Ser Asn

Pro

Ala

705

710

715

CTG

AGA

CTG

CAG

CCC

AGG CTA

CCC

ATT

CTT

' TCT

¹ TTC

TCC ATC

CTT

CCC

1207

Leu

Arg

Leu

Gin

Pro

Arg Leu

Pro

íle

Leu

Ser

- Phe

- Ser íle

Leu

Pro

720

725

730

735

TTG

ATT

CTG

CAG

ACC CTC

TGG

TAGí

CTGGGCT

TCCTCAGGG7 CCTTTGTCC?

1261

Leu

íle

Leu

Gin

Thr Leu

Trp

740

CTCCACCACA CCCAGACTGA TTTGCAGCCT GTGGTGGGAG AGAACTCGCC AGCCTGTGGA 1321

AGAAGACGCA GCGTGCTACA CAGCAACCCG GAACCAACCA GGCATTCCGC AGCACÄTCCC

1381

SK 286115 Β6

GTCTGCTCCÄ 1441	GAÄGAGGTCT TAGAAGTGAG	GGCTGTGACC	CTTCCGATCC	TGAGCGGCTA
GTTTTCAAAC 1S01	CTCCCTTGCC	CCTGCTTCCT	TCTGGCľCAG	GCTGCTCCTC	CTTAGGACTľ
TGTGGGTCCA 1561	GTTTTGCCTT	CTGTTCTGAT	GGTGATTAGC	GGCTCACCTC	CAGCGCTTCT
TCCTGTTTCC 1621	CAGGACCACC	CAGAGGCTAA	GGÄATCAGTC	ATTCCCTGTT	6CCTTCTCCA
GGAAGGCAGG 1681	CTAAGGGTTC	TGAGGTGACT	GAGAAAÄATC	TTTCCTTTGT
GGTGCTCCAG 1741	CCTCCACGTC	CCTCTGAATG	GÄAGATAAAA	ACCTGCTGGT	GTCľTCÄCTG
CTCTGCCAGG 1801	CAATCCTGAA	Wi i áXajuvä	TGAÄGÄGCTA	AAGTCTTTGG
ACTCCTATTA 1861	CTGTCCCCAÄ	ATTCCCCTAG	TCCCTTGGGT	CATGATTAÄÄ	CÄTTTTGACT
TAAÄAAAAAA	AAAAÄAAAAA	AAAAAAAA

1889 (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 17:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 397 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 17:

Met 1

Gly

Leu

Ser

Trp 5

Ser

°ro

Arg

Pro

Pro 10

Leu

Met

íle

Leu 15

Leu

Val

Leu

Ser 20

Leu

Trp

Leu

Pro

Leu 25

Gly

Ala

Gly

Asn

Ser 30

Leu

Ala

Thr

Glu

Asn 35

Arg

Phe

Val

Asn

Ser 40

Cys

Thr

Gin

Ala

Arg 45

Lys

Cys

Glu

Ala 50

Asn

Pro

Ala

Cys

Lys 55

Ala

Tyr

Gin

His 60

Leu

Gly

Ser

Cys

Thr 65

Ser

Leu

Ser

Arg 70

Pro

Leu

Pro

Leu

Glu 75

Glu

Ser

Ala

Met

Ser ao

Ala

Asp

Cys

Leu

Glu as

Ala

Glu

Gin

Leu 90

Arg

Asn

Ser

Leu 95

íle

Asp

Cys

Arg

Cys 100

His

Arg

Mec

Lys 105

His

Gin

Ala

Thr

Cys 110

Leu

Asp

íle

Tyr

Trp 115

Thr

Val

His

Pro

Ala 120

Arg

Ser

Leu

Gly

Asp 125

Tyr

Glu

Leu

Asp

Val 130

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp 13$

Thr

Val

Thr

Ser

Lys 140

Pro

Trp

Lys

Met

Asn 14S

Leu

Ser

Lys

Leu

Asn 150

Met

Leu

Lys

Pro

Asp 155

Ser

Asp

Leu

Cys

Leu 160

Lys

Phe

Ala

Met

Leu 165

Cys

Thr

Leu

His

Asp 170

Lys

cys

Asp

Arg

Leu 175

Arg

Lys

Ala

Tyr

Gly 180

Glu

Ala

Cys

Ser

Gly ías

íle

Arg

Cys

Gin

Arg 190

His

Leu

Cys

Leu.

Ala 195

Gin

Leu

Arg

Ser

Phe 200

Phe

Glu

Lys

Ala

Ala 205

Glu

Ser

His

Ale

Gin 210

Gly

Leu

Cys 215

Pro

Cys

Ala

Pro

Glu 220

Asp

Ala

Gly

Cys

Gly 225

Glu

Arg

Asn 230

Thr

íle

Ala

Pro

Ser 23 5

Cys

Ala

Leu

Pro

Ser 240

Val

Thr

Pro Asn

Cvs Leu Asp 245

Leu

Arg

Ser 250

Phe Cys Arg Ala

Aso 255

Pro

Leu

Cys

A. r g

Ser

i

Leu

Met

Asp

Phe

Gin

Thr His

Cys

HiS

Pro

Met

260

26í

270

Asp

íle

Lom

Gly

Thr

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin

Ser Arg

Cys

Leu

Arg

Ala

250

265

Tyr

Leu

Gly

Leu

íle

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

Pro Asn

Phe

íle

Ser

Lys

290

295

300

Val

Asn

'pu. —

Thr

Val

Ala

Leu

Ser

Cys

Thr

Cys Arg

Gly

Ser

Gly

A s r.

305

310

315

320

Leu

Gl.n

Asp

Glu

Cys

Glu

Gin

Leu

Glu

Arg

Ser Phe

Ser

Gin

Asn

Pro

325

330

335

Cys

Leu

Val

Glu

Ala

íle

Ala

Lys

Met

Arg Phe

His

Arg

Gin

Le’-

340

345

3S0

Phe

Ser

Gin

Asp

Trp

Ala

Asp

Ser

Thr

Phe

Ser Val

Val

Gin

355

360

365

Asn

Ser

Asn

Pro

Ala

Leu

Arg

Leu

Gin

Pro

Arg Leu

Pro

íle

Leu

Ser

370

375

380

Phe

Ser

íle

Leu

Pro

Leu

íle

Leu

Gin

Thr Leu

Trp

385

390

395

(2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 18:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 1 271 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) znaky:

(A) meno/označenie: CDS (B) pozícia: 2...946 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 18:

C GGC TAC TGT GAA ACA CCT CAA CTC AGG AAC AGC TCT CTG ATA GGC 46

Gly Tyr Cys Glu Thr Pro Gin Leu Arg Asn Ser Ser Leu íle Gly 400 40S 410

TGC ATG TGC CAC CGG CGC ATG AAG ÄAC CAG GTT GCC TGC TTG GAC ATC 94

Cys Met Cys His Arg Arg Met Lys Asn Gin Val Ala Cys Leu Asp íle 415 420 42S

TAT TGG ACC GTT CÄC CGT GCC CGC AGC CTT GGT AAC TAT GAG CTG GAT 142

Tyr

Trp

r

Val

His

Arg

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

Asn

Tyr

Glu

Leu

Asp

430

425

440

GTC

TCC

ccc

TAT

GAA

GAC

ACA

GTG

ACC

AGC

AAA

CCC

TGG

AAA

ATG

* * *n

Val

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

Lys

Met

Asn

445

450

455

460

CTC

AGC

AAA

CTG

ÄAC

ATG

CTC

AAA

CCA

GAC

TCA

GAC

CTC

TGC

CTC

AAG

Leu

Ser

Lys

Leu

Asn

Met

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

cys

Leu

Lys

465

470

475

GCC

ATG

CTG

TGT

ACT

CTC

AAT

GAC

AAG

TGT

GAC

CGG

CTG

CGC

AAG

Phe

Ala

Mét

Leu

Cvs

Leu

Asn

Asp

Lys

Cys

Asp

Arg

Leu

Arg

Lys

480

485

490

334

430

478

GCC

Λ A*»

GGG

GAG

GCG

TGC

TCC

GGG

ccc

CAC

TGC

CAG

CGC

CAC

GTC

TGC

Ala

Tyr

Gly

Glu

Ala

Cys

Ser

Gly

Pro

His

Cys

Gin

Arg

His

Val

cys

495

500

505

CTC

AGG

CAG

CTG

CTC

ACT

TTC

GAG

AAG

GCC

GAG

CCC

CAC

GCG

Leu

Arg

Gin

Leu

Thr

Phe

Glu

Lys

Ala

Glu

Pro

His

Ala

510

515

520

CAG

GGC

CTG

CTA

CTG

TGC

CCA

TGT

GCC

CCC

AAC

GAC

CGG

GGC

TGC

GGG

Gin

Gly

Leu

cys

Pro

Cys

Ala

Pro

Asn

Asp

Arg

Gly

Cys

Gly

525

530

535

540

GAG

CGC

CGG

CGC

AAC

ACC

ATC

GCC

CCC

AAC

TGC

GCG

CTG

CCG

CCT

GTG

Glu

Arg

Asn

Thr

íle

Ala

Pro

Asn

Cys

Ala

Leu

Pro

Val

555

545

550

526

574

GCC

CCC

AAC

TGC

CTG

GAG

CTG

CGG

CGC

CTC

TGC

TTC

TCC

GAC

CCG

CTT

Ala

Pro

Asn

cys 560

Leu

Glu

Leu

Arg

Arg 565

Leu

Cys

Phe

Ser

Asp 570

Pro

Leu

TGC

AGA

TCA

CGC

CTG

GTG

GAT

TTC

CAG

ACC

CAC

TGC

CAT

CCC

ATG

GAC

cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Gin

Thr

His

Cys

His

Pro

Met

Asp

575

580

595

ATC CTA GGA ACT TGT GCA ACA GAG CAG TCC AGA TGT CTA CGA GCA TAC 622

íle

Leu 590

Gly

Thr

Cys

Ala

Thr S9S

Glu

Gin

Ser

Arg

Cys 600

Leu Arg

Ala

Tyr

CTG

GGG

CTG

ATT

GGG

ACT

GCC

ATG

ACC

CCC

AAC

TTT

GTC AGC

ÄÄT

GTC

670

Leu

Gly

Leu

íle

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

Pro

Asn

Phe

Val Ser

Asn

Val

605

610

615

620

715

AAC

ACC

AGT

GTT

GCC

TTA

AGC

TGC

ACC

TGC

CGA

GGC

AGT GGC

AAC

CTG

Asn

Thr

Ser

Val

Ala

Leu

Ser

Cys

Thr

Cys

Arg

Gly

Ser Gly

Asn

Leu

625

630

635

CAG

GAG

TGT

GAÄ

ATG

CTG

GAA

GGG

TTC

TCC

CAC AAC

CCC

TGC

766

Glr.

Glu

Cvs

Glu

Met

Leu

GlU

Gly

Phe

Ser

His Asn

Pxo

Cys

640

645

650

CTC

Acq

GAG

GCC

ATT

GCA

GCT

AAG

ATG

CGT

TTT

CAC

AGC CAA

CTC

r*irr*Q

814

Leu

Thr

Glu

Ala

íle

Ala

Lvs

Met

Arg

Phe

His

Ser Glr.

Leu

Pne

655

660

665

TCC

CAG

GAC

TGG

CCA

CAC

CCT

ACC

TTT

GCT

GTG

ATG

GCA CAC

CAG

» * m ΛΤ,ί

862

Ser

Gin

Asp

Trp

Pro

His

Pro

Thr

Phe

Ala

Val

Met

Ala His

Gin

Asn

670

675

680

GAA

AAC

CCT

GCT

GTG

AGG

CCA

CAG

ccc

TGG

GTG

CCC

TCT CTT

fT'T'Q

TCC

910

Glu

Asn

Pro

Ala

Val

Arg

Pro

Gin

Pro

Trp

Val

Pro

Ser Leu

Phe

Ser

695

690

695

700

TGC

ACG

CTT

CCC

TTG

ATT

CTG

CTC

CTG

AGC

CTA

TGG

TAGCTGGACT

956

Cys

Thr

Leu

Pro

Leu

íle

Leu

Ser

Leu

Trp

705

710

TCCCCAGGGC 1016	CCTCTTCCCC	TCCACCACAC	CCAGGTGGAC	TTGCAGCCCA
GGAAAGGACA 1076	GCAGCAGGAA	GGAGGTGCAG	TGCGCAGATG	AGGGCACÄGG	AGAAGCTÄAG
GGTTATGACC 1136	TCCAGATCCT	TACTGGTCCA	GTCCTCATTC	CCTCCÄCCCC	ATCTCCACTT
CTGATTCATG 1196	CTGCCCCTCC	TTGGTGGCCA	CAATTTAGCC	ÄTGTCATCTG	GTGCCTGTGG
GCCTTGCTTT	ATTCCTATTA	TTGTCCTAAA	GTCTCTCTGG	GCTCTTGGÄT	CATGATTAA

1256

SK 286115 Β6 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 19:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 315 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 19:

Gly

Tyr

Cys

Glu

Thr

Pro Gin

Leu .

Arg

Asn

Ser

Leu

íle

Gly

Cys

1

5

10

15

Met

cys

His

Arg

Met Lys

Asn

Gin

val

Ala

cys

Leu

Asp

íle

Tyr

20

25

30

Trp

Thr

Val

His

Arg

Ala Arg

Ser

Leu

Gly

Asn

Tyr

Glu

Leu

Asp

Val

35

40

4S

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr Val

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

Lys

Het

Asn

Leu

50

55

60

Ser

Lys

Leu

Asn

Met

Leu Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

Cys

Leu

Lys

Phe

65

70

75

80

Ala

Met

Leu

Cys

Thr

Leu Asn

Asp

Lys

Cys

Asp

Arg

Leu

Arg

Lys

ÄJ.&

85

90

95

Tyr

Gly

Glu

Ala

Cys

Ser Gly

Pro

His

Cys

Gin

Arg

His

Val

Cys

Leu

100

105

110

Arg

Gin

Leu

Tb*x

Phe Phe

Glu

Lys

Ala

Glu

Pro

His

Ala

Gin

115

120

125

Gly

Leu

Cys

Pro Cys

Ala

Pro

Asn

Asp

Arg

Gly

Cys

Gly

Glu

130

135

140

Arg

ASn

a»·*

íle Ala

Pro

Asn

Cys

Ala

Leu

Pro

Val

Ala

145

150

155

160

Pro

Asn

Cys

Leu

Glu

Leu Arg

Arg

Leu

Cys

Phe

Ser

Asp

Pro

Leu

Cvs

165

170

175

Arg

Ser

Arg

Leu

Val

Asp Phe

Gin

Thr

His

Cys

His

Pro

Met

Asp

íle

180 185 190

Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gin Ser Arg Cys Leu Arg Ala Tyr Leu 195 200205

Gly Leu Íle Gly Thr Ala Mec Thr Pro Asn Phe Val Ser Asn Val Asn 210 215220

Thr Ser Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn LeuGin

225 230 235240

Glu Glu Cys Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe Ser His Asn Pro CysLeu

245 250255

Thr Glu Ala íle Ala Ala Lys Met Arg Phe His Ser Gin Leu Phe Ser 260 265270

Gin Asp Trp Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met Ala His Gin Asn Glu 275 280285

Asn Pro Ala Val Arg Pro Gin Pro Trp Val Pro Ser Leu Phe Ser Cys 290 295300

Thr Leu Pro Leu íle Leu Leu Leu Ser Leu Trp

305 310315 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 20:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 1 699 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna

SK 286115 Β6 (ii) typ molekuly: cDNA (ix) znaky:

(A) meno/označenie: CDS (B) pozícia: 175...1 374 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 20:

TGTGGACGCG CGCTTCGGAG TTGGAGGGCG GCGCCCAGGA CCCTGGTGGG AGAGTGTC-TG

CGTCGCGCTG GAGGGCGGGA GGCGGC-GGCG GGAGGTGCCG GTCGAGGGAG CCCCC-CTCTC 120

AGAGCTCCAG GGGAGGAGCG AGGGGAGCGC GGAGCCCGGC GCCTACAGCT CGCC ATG

177

Met

225

GTG CGC CCC CTG AAC

CCG Pro

CGA CCG CTG

CCG Pro

CCC Pro

GTA GTC CTG ATG

TTG La&la

Val

Arg

Pro

Leu 320

Asn

Arg

Pro

Lôu 325

Val val

Leu 330

Met

ctg

CTG

CCG

TCG

CCG

CTG

CCT

CTC

GCA

GCC

GGA

GAC

CCC

273

Leu

Pro

Ser

Pro

Leu

Pro

Leu

Ala

Gly

Asp

Pra

335

340

345

CTT

CCC

ACA

GAA

AGC

CGA

CTC

ATG

AAC

AGC

TGT

CTC

CAG

GCC

AGG

321

Leu

Pro

Thr

Glu

Ser

Arg

Leu

Met

Asn

Ser

Cys

Leu

Gin

Ala

Arg

350

3SÓ

360

AAG

TGC

CAG GCT

GAT

CCC

ACC

TGC

AGT

GCT

GCC

TÄC

CAC

CTG

GAT

Lys

Cys

Gin Ala

Asp

Pro

Thr

Cys

Ser

Ala

Tyr

His

Leu

Asn

363

370

375

380

TCC

TGC

ACC TCT

AGC

ATA

AGC

ACC

CCA

CTG

CCC

TCA

GAG

CCT

TCG

Ser

Cys

Thr Ser

Ser

íle

Ser

Thr

Pro

Leu

Pro

Ser

Glu

Pro

Ser

323

290

395

GTC

CCT

GCT GAC

TGC

CTG

GAG

GCA

CAG

CÄÄ

CTC

AGG

AAC

AGC

TCT

Val

Pro

Ala Asp

cys

Leu

Glu

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

400

405

410

CTG

AT»X

GGC TGC

ATG

TGC

CAC

CGG

CGC

ATG

AAG

AAC

CAG

GTT

GCC

TGC

Leu íle Gly Cys Met Cys His Arg Arg Met Lys Asn Gin Val Ala Cys

512

415

420

425

TTG

GAC

ATC TAT

TGG

ACC GTT

CAC CGT

GCC

CGC AGC

CTT

GGT

AAC

TAT

Sól

Leu

Asp

íle Tyr

Trp

Thr Val

His Arg

Ala

Arg Ser

Leu

Gly

Asn

Tyr

430

435

440

GAG

CTG

GAT GTC

TCC

CCC TAT

GAA GAC

ACA

GTG ACC

AGC

AAA

CCC

TGG

609

Glu

Leu

Asp Val

Ser

Pro Tyr

Glu Asp

Thr

Val Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

445

450

455

460

AAA

ATG

AAT CTC

AGC

AAA CTG

AAC ATG

CTC

AAA CCA

GAC

TCA

GAC

CTC

657

Lys

Met

Asn Leu

Ser

Lys Leu

Asn Het

Leu

Lys Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

465

470

47S

TGC

CTC

AAG TTT

GCC

ATG CTG

TGT ACT

CTC

AAT GAC

AAG

TGT

GAC

CGG

70S

Cys

Leu

Lys Phe

Ala

Met Leu

Cvs Thr

Leu

Asn Asp

Lys

Cvs

Asp

Arg

480

485

490

CTG

CGC

AAG GCC

TAC

GGG GAG

GCC TC-C

TCC

GGG CCC

CAC

TGC

CAG

CGC

753

Leu Arg Lys

495

Ala Tyr Gly

Glu Ala Cys

500

Ser Gly Pro His Cys Gin Arg 505

CAC GTC

TGC

CTC

AGG

CAG

CTG

CTC

ACT

TTC

GAG

AAG

GCC

GAG

801

His Val

Cys

Leu

Arg

Gin

Leu

Thr

Phe

Glu

Lys

Ala

A1.&

Glu

510

515

520

CGG

GGC

CCC

049 cx

897

945

993

GCG

CAG

GCC

CCC

AAC

GAC

CAC

CTA

CTG

TGC

CCA

TGT

GGC

CCG

Pro

GAC

Asp

Gly

CGA 1089

Arg

605

AGC 1137

Ser

Pro

525

CCC 1041

Pro

GGC 1185

Gly

His

Ala Gin Gly Leu 530

Leu Leu Cys

Pro

Cys Ala Pro Asn Asp Arg

535

540

TGC

GGG

GAG

CGC

CGG

CGC

AAC

ACC

ATC

GCC

CCC

AAC

TGC

GCG CTG

Cys

Gly

Glu

Arg 545

Arg

Asn

Thr

íle 550

Ala

Pro

Asn

cys

Ala Leu 555

CCT

GTG

GCC

CCC

AAC

TGC

CTG

GAG

CTG

CGG

CGC

CTC

TGC

TTC TCC

Pro

Val

Ala 560

Psa

Asn

cys

Leu

Glu 555

Leu

Arg

Leu

cys 570

Phe ser

CCG

CTT

TGC

AGA

TCA

CGC

CTG

GTG

GAT

TTC

CAG

ACC

CAC

TGC CAT

Pro

Leu 575

cys

Arg

Ser

Arg

Leu 500

Val

Asp

Phe

Gin

Thr 505

His

Cys His

ATG

GAC

ATC

CTA

GGA

ACT

TGT

GCA

ACA

GAG

CAG

TCC

AGA

TGT CTA

Met S90

Asp

11·

Lau

Gly

Thr 595

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin 600

Ser

Arg

Cys Leu

GCA

TAC

CTG

GGG

CTG

ATT

GGG

ACT

GCC

ATG

ACC

CCC

AAC

TTT GTC

Ala

Tyr

Leu

Gly

Leu 610

íle

Gly

Thr

Ale

Het 61S

Thr

Pro

Asn

Phe Val 620

Arx«.

GTC

AAC

ACC

AGT

GTT

GCC

TTA

AGC

TCC

ACC

TGC

CGA

GGC AGT

Asn

Val

Asn

Thr 625

Ser

Val

Ala

Leu

Ser 630

Cys

Thr

Cys

Arg

Gly Ser 63 5

AAC

CTG

CAG

GAG

TGT

GAA

ATG

CTG

GAA

GGG

TTC

TCC CAC

Asn

Leu

Gin

Glu

Cys

Glu

Met

Leu

Glu

Gly

Phe

Ser His

840

645

850

1233

132

AAC

CCC

TGC

CTC

ACG

GAG

GCC

ATT

GCA

GCT

AAG

ATG

CGT

TTT

CAC

AGC

Asn

Pro

cys

Leu

Thr

Glu

Ala

íle

Ala

Lys

Met

Arg

Phe

His

Ser

655

660

665

CAA

CTC

TTC

TCC

CAG

GAC

TGG

CCA

CAC

CCT

ACC

TTT

GCT

GTG

ATG

GCA

Gin

Leu

Phe

Ser

Gin

ASP

Trp

Pro

His

Pro

Thr

Phe

Ala

Val

Met

Ala

670

675

600

CAC j

CAG

AAT

GAA

AAC

CCT

GCT

GTG

AGG

CCA

CAG

CCC

TGG

GTG

CCC

TCT

His

Gin

Asn

Glu

Asn

Pro

Ala

val

Arg

pro

Gin

Pro

Trp

Val

Pro

Ser

685

690

695

70G

CTT ς

TTC

TCC

TGC

ACG

CTT

CCC

TTG

ATT

CTG

CTC

CTG

AGC

CTA

TGG

Leu

Phe

Ser

cys

Thr

Leu

Pro

Leu

íle

Leu

Ser

Leu

Trp

705

710

715

TAGCTGGACT TCCCCAGGGC CCTCTTCCCC TCCACCACAC CCAGGTGGÄC TTGCAGCCCA 1434

CAAGGGGTGA GGAAAGGACA GCAGCAGGAA GGAGGTGCAG tgcgcagatg agggcxcagg 1494 agaagctaag ggttatgacc tccagatcct tactggtcca gtcctcattc cctccacccc

1554

ÄTCTCCACTT CTGATTCATG CTGCCCCTCC TTGGTGGCCA CÄATTTAGCC ATC-TCATCTG 1614

GTGCCTGTGG GCCTTGCTTT ATTCCTATTA TTGTCCTÄÄÄ GTCTCTCTGG GCTCTTGGAT 1574

CATGATTAAA CCTTTGACTT AAAAA

1699 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 21:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 400 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 21:

Mec 1	val	Arg	Pro Leu Asn Pro Arg Pro Leu Pro Pro Val Val Leu Met
S	10	1«
Leu	Leu	Leu	Leu	Leu	Pro Pro Ser Pro	Leu	Pro	Leu	Ala	Ala Gly Aso
			20		25					20
Pro	Leu	?ro	Thr	Glu	Ser Arg Leu Met	Asn	Ser	Cys	Leu	Gin. Ara Arg
		35			40				45
Arg	Lys	Cys	Gin	Ala	Aso Pro Thr Cys	Ser	Ala	Ala	Tyr	Kis His Leu
	50				55			60
Asp	Ser	Cys	Thr	Ser	Ser íle Ser Thr	Pro	Leu	Pro	Ser	Glu Glu Pro
65					70		7S			80
Ser	Val	Pro	Ala	Asp	Cys Leu Glu Ala	Ala	Gin	Gin	Leu	Arg Asn Ser
				85		50				95
Ser	Leu	íle	Gly	Cys	Met Cys His Arg	Arg	Met	Lys	Asn	Gin Val Ala
			100		10S					110
Cys	Leu	Asp	íle	Tyr	Trp Thr Val His	Arg	Ala	Arg	Ser	Leu Gly Asn
		115			120				125
-Tyr	Glu	Leu	Asp	Val	Ser Pro Tyr Glu	Asp	Thr	Val	Thr	Ser Lys Pro

130 135 140

Trp Lys Met Asn Leu Ser Lys Leu Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp

145	150	155	160
Leu Cys	Leu Lvs Phe Ala Met Leu Cvs Thr Leu Asn Asp	Lys Cys Asn
	165	170	175

Arg

Leu

Arg

Lvs

Ala

'T-

Gly

Glu

Ala

cys

Ser

Gly

Pra

His

Cys

Gin

100

105

190

Arg

His

Val

Cys

Leu

Arg

Gin

Leu

Phe

Glu

Lys

» h aaA

Ala

195

200

205

Glu

Pro

His

Ala

Gin

Gly

Leu

Cys

Pra

cys

Ala

Pro

Asn

Asp

210

215

220

Arg

Gly

Cys

Gly

Glu

Arg

Asn

Thr

íle

Ala

Pro

Asn

Cys

Ala

225

230

235

240

Leu

Pro

Val

Als

Pro

Asn

Cys

Leu

Glu

Leu

Arg

Leu

Cvs

Phe

245

250

253

Ser

Asp

Pro

Leu

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Gin

Thr

His

Cys

260

265

270

His

Pro

Met

Asp

íle

Leu

Gly

Thr

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin

Ser

Arg

Cys

275

280

285

Leu

Arg

Ala

Tyr

Leu

Gly

Leu

íle

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

Pro

Asn

Phe

290

295

300

Val

Ser

Asn

Val

Asn

Thr

Ser

Val

Ala

Leu

Ser

cys

Thr

Cys

Arg

Gly

305

310

315

320

Ser

Gly

Asn

Leu

Gin

Glu

Cys

Glu

Met

Leu

Glu

Gly

Phe

Ser

325

330

335

His

Asn

Pro

Cys

Leu

Thr

Glu

Ala

íle

Ala

Lys

Met

Arg

Phe

His

340 345 350

Ser

GLn

Leu 355

Phe

Ser

Gin

Asp Trp 360

Pro

His

Pro

Thr Phe 365

Ala

Val

Ker

Ala

His

Gin

Asn

Glu

Asn

Pro

Ala.

Val

Arg

Pre

Gin Pro

i.rp

Val

Pro

270

375

380

Ser

Leu

Phe

Ser

cys

Leu

Pro

Leu

íle

Leu

Leu Leu

Ser

Leu

Trp

3S5

39C

335

400

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná nukleová kyselina kódujúca polypeptid s aspoň 80 % sekvenčnou identitou s aminokyselinovou sekvenciou vybranou zo skupiny pozostávajúcej zo SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 21, pričom uvedený polypeptid interaguje s receptorovým proteínom Ret, pričom spúšťa dimerizáciu receptorového proteínu Ret alebo autofosforyláciu tyrozinkinázovej domény receptorového proteínu Ret.
2. Nukleová kyselina podľa nároku 1, pričom aminokyselinová sekvencia kódovaného polypeptidu zachováva aspoň 80 % cysteínových zvyškov v porovnaní so SEQ ID NO: 17 alebo SEQ ID NO: 21.
3. Nukleová kyselina podľa nároku 1, pričom kódovaný polypeptid má aspoň 90 % sekvenčnú identitu s aminokyselinovou sekvenciou vybranou zo skupiny pozostávajúcej zo SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 21.
4. Nukleová kyselina podľa nároku 3, pričom kódovaným polypeptidomje SEQ ID NO: 17 alebo SEQ ID NO: 21.
5. Izolovaná nukleová kyselina zahrnujúca nukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny pozostávajúcej zo SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 20.
6. Vektor zahrnujúci inzert obsahujúci nukleovú kyselinu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.
7. Hostiteľská bunka zahrnujúca vektor podľa nároku 6.
8. Spôsob prípravy polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky, keď sa: kultivujú bunky podľa nároku 7 a izoluje sa polypeptid exprimovaný z inzertu v hostiteľských bunkách.
9. Polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.
10. Izolovaná monoklonálna protilátka, ktorá sa viaže na polypeptid vybraný zo skupiny pozostávajúcej zo SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 21.
11. Protilátka podľa nároku 10, ktorá sa viaže na polypeptid SEQ ID NO: 19 alebo SEQ ID NO: 21.
12. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje a) protilátku podľa nárokov 10 alebo 11, ktorá je asociovaná s b) toxínom, zobraziteľnou zlúčeninou alebo rádionuklidom.
13. Fúzny proteín zahrnujúci polypeptid podľa nároku 9, ktorý je fuzovaný s imunoglobulínom, toxínom, zobraziteľnou zlúčeninou alebo rádionuklidom.
14. Nukleová kyselina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, polypeptid podľa nároku 9, vektor podľa nároku 6, protilátka podľa nárokov 10 alebo 11, kompozícia podľa nároku 12 alebo fúzny proteín podľa nároku 13 na použitie v terapii alebo diagnostike.