CZ361598A3

CZ361598A3 - Nukleová kyselina kódující ligand c-Ret, polypeptid ligand c-Ret, způsob jeho přípravy a použití pro stimulaci růstu tkání

Info

Publication number: CZ361598A3
Application number: CZ983615A
Authority: CZ
Inventors: Michele Sanicola-Nadel; Catherine Hession; Richard L. Cate
Original assignee: Biogen, Inc.
Priority date: 1996-05-08
Filing date: 1997-05-07
Publication date: 1999-03-17
Also published as: KR20060024843A; NO985231L; CN1232469A; DE69736428T2; CA2253871C; EP1757617A1; JP2002515743A; CA2253871A1; ES2270465T3; NO324957B1; ATE335003T1; PT914339E; EP0914339B1; WO1997044356A2; BG109433A; BR9710665A; NO323612B1; BG102973A; NZ332706A; IL126918A0

Description

Oblast techniky

Tento 'vynález se týká 'nuk'1'eóťidb'yýčh sekvenOlý 'které kódují ligand Ret (KetL), a také způsobů ^ťštimulace rustu nervových a ledvinných tkání ošetřením buněk* *^!a savčích subjektů DNA nebo proteinem RetL,‘ .r ··

Dosavadní stav techniky ' 1 - 1,- ¹ — Jedním—z—cílů—současného výzkumu—buněčné--signallzacea receptorové aktivace je umožnit léčebnou modulaci procesů zapojených do buněčného růstu a přežívání. Tyto procesy určují výsledek různých zdravotních stavů, včetně orgánového : - í ·· Ý ·' ·* Γ * selhání, vývoje plodu, a nádorového růstu, a' dalších. Každý ^1,1 I .·, _ . * C ' z těchto stavů je celosvětově klinicky . významný a možnosti účinného léčení jsou omezené. Cílem vynálezu je poskytnout

TT přípravky a způsoby pro podporování regenerace nebo přežívání * -i μ J ' poškozené tkáně, a také pro léčení ¹ poruch zahrnujících odchylný růst a vývoj tkání.

Ztráta tkáně a konečné stádium orgánového selhání zasahují každý rok miliony lidí na celém světě a podstatně ¹ ! ' přispívají k výdajům na zdravotní péči. Ztráta tkáně nebo orgánu se obvykle léčí transplantací orgánů od dárců, chirurgickou rekonstrukcí nebo mechanickými zařízeními. Každý z těchto léčebných postupů má nedostatky. Transplantace je omezena nedostatkem dárců, chirurgická rekonstrukce může vytvořit další dlouhodobé problémy a mechanická zařízení nemohou provádět všechny funkce jednoho orgánu a proto

«» «· • · * · • · · * « · · · « « * · • ·· ·♦ nemohou zabránit postupné degeneraci. Proto existuje reálná zdravotní potřeba pro nová řešení těchto problémů.

Proteinové faktory, které ovlivňují růst, diferenciaci a/nebo přežívání buněk, mohou být použitelné při léčeni poruch orgánů obsahujících responzivní buňky. Faktory nebo ligandy, které interagují s receptory rodiny proteinového receptoru tyrozinkinázy (RPTK) jsou v tomto ohledu hodné obzvláštního zájmu. Tyto receptory jsou zapojeny v mnoha , buněčných programech včetně buněčného růstu a diferenciace včetně geneze mnoha novotvarů. Tak se mohou faktory nebo ligandy, které interagují s těmito receptory, prokázat jako použitelné pro léčení poruch určitých orgánů, při kterých byla poškozená tkáň. Jako alternativa, aby se blokoval růst nádorů, mohou být použitelné pro blokádu interakce těchto faktorů se svými receptory.

Protoonkogen Ret kóduje receptor tyrozinkinázy, který je exprimován během vývoje v různých tkáních, včetně periferního a centrálního nervového systému a ledvin. Abnormality přítomné u myší, které Ret postrádají (ret null mice), svědčí pro to, že Ret je kritický pro migraci a inervaci střevních neuronů do zadního střeva, a pro proliferaci a větvení epitelu ureterového pupenu během vývoje ledvin (Nátuře 367, 3.80-383, 1994). Hledání klíčové složky signální dráhy Ret, ligandu Ret, je oblast intenzivního výzkumu.

μ ť

Podstata vvnálezu '·. —. — — - —Vynález poskytuje purifikovanou a izolovanou molekulu DNA kódující RetL, která má nukleotidovou sekvenci jakéhokoliv RetL, ale specificky zahrnuje cDNA krysího retLl (sekvence s identifikačním číslem (id. č.) 1), částečnou cDNA lidského retLl (sekvence id. č. 8), nezkrácenou. cDNA lidského f, flC o c

f. ft’ r Γ4 «· Í tr Λ c c ^f t Γ Γ C ·“ i { k L fc ‘

f. C C í

Λ C Γ· Γ, ff

G C f G <ř

RétLl (sekvence ,id. (sekvence id. mvšího RetL3 retLl (sekvence id. č. 10), cDNA lidského retL2 (sekvence id. č. 12), cDNA myšího retL3 (sekvence id. č. 16), částečnou cDNA lidského' retL3 (sekvence id. č. 18) nebo cDNA lidského retL3 (sekvence id. č. 20.). Vynález dále poskytuje protein RetL, s „aminokyselinovou sekvencí zahrnující sekvenci krysího sekvence'id. č. 2), částečnou sekvenci lidského RetLl č. -9), nezkrácenou sekvenci .lidského RetLl č. 11), lidského RetL2 (sekvence id. č. 13), (sekvence- id. č. .17), částečnou sekvenci lidského RetL3 (sekvence id:.: č. 19) nebo. lidského RetL3 (sekvence.id. č. 21) . ·

- V dalším provedení vynález zahrnuje sekvenci DNA,' která obsahuje . sekvenci (částečnou cDNA lidského retLl (sekvence id. č. 8)) inzertu DNA klonu HRL20, který má „ATCC ,č„.._9.76.0.4.,. nebo sekvenci inzertu DNA klonu č. 230-5A-86-17 (cDNA krysího retLl (sekvence id. č. 1)),· který má ATCC č. 98047.

V dalším provedení vynálezu má purifikovaná a izolovaná molekula DNA pro použití v bezpečné expresi polypeptidového produktu v prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňce přinejmenším část primární strukturální konformace a biologické aktivity RetL, DNA' může být a) molekula DNA, která obsahuje cDNA krysího.. retLl, částečnou cDNA lidského retLl, nezkrácenou cDNA lidského; retLl, cDNA lidského retL2, cDNA myšího retL3 nebo cDNA lidského retL3, nebo komplementární vlákno cDNA- krysího retLl, částečné cDNA lidského retLl, nezkrácené cDNA lidského retLl, cDNA lidského retL2, cDNA myšího retL3 nebo cDNA lidského retL3, b) molekuly DNA, které hybridizuj-í za stringentních (přísných) podmínek s molekulami DNA definovanými v a) nebo jejich fragmenty, nebo c) molekuly DNA, které by díky degeneraci genetického kódu hybridizovaly s molekulami DNA definovanými v a) nebo b). Předmětem vynálezu je také purifikovaná « «· ·· · · · · · · · · · • »· · · · ······ * • · * · · · *«« *« *« ··· *· ·· a izolovaná molekula DNA kódující polypeptidový fragment nebo variantu lidského RetL mající biologickou aktivitu RetL.

Každá rekombinantní molekula DNA vynálezu může být operativně spojena s expresní kontrolní sekvencí.

Do vynálezu také patří vektory a systémy pro podávání, které obsahují molekuly DNA nebo konstrukty definované na jiném místě tohoto popisu. Vektor může obsahovat molekulu DNA kódující RetL nebo jeho variantu.

Vynález zahrnuje prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky trvale transformované nebo transfekované vektorem obsahujícím molekulu DNA kódující nativní RetL nebo jeho variantu.

Purifikovaný a izolovaný lidský RetL v podstatě bez dalších lidských proteinů je specifický pro vynález, a také způsob přípravy polypeptidového produktu, který má částečnou nebo úplnou primární strukturní konformaci a biologickou aktivitu RetL; Takový způsob může zahrnovat kroky pěstování, za vhodných kultivačních podmínek, prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk transformovaných nebo. transfekovaných jakoukoliv molekulou DNA podle vynálezu způsobem umožňujícím expresi tohoto polypeptidového produktu, a opětovné získání RetL. Vynález také zahrnuje polypeptidový produkt exprese DNA v prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňce.

Vynález poskytuje také proteiny a proteinové fragmenty, varianty a deriváty, buď rozpustné nebo vázané na membráně. Ve vybraných provedeních má protein aminokyselinovou sekvenci, která zahrnuje krysí RetLl, částečnou sekvenci lidského RetLl, nezkrácený lidský RetLl, lidský RetL2, myší RetL3 nebo lidský RetL3 nebo je variantou jedné z těchto sekvencí. V dalších provedeních je protein fúzní protein obsahující Ret nebo RetL, fúzovaný k další molekule nebo ·« • « • ·

molekulovému fragmentu, jako je imunoglobulin, toxln, zobrazovací sloučenina (pro detekci zobrazovacími technikami) nebo radionuklid. Patří sem také chimérické molekuly RetL.

zahrnují specifické podle vynálezu. Tato toxinem, zobrazovací sloučeninou hybridomové

Další provedení vynálezu monoklonální protilátky k RetL protilátka může být spojena s nebo radionuklidem. Vynález také zahrnuje buněčné linie, které produkují specifické protilátky k Ret,' včetně AA.FF9, AA.HE3, AF.E9, BA.B1, BB.B6.

AA.GE7, CD.F11, AH.E3, CD.G4, AG.E7, BD.G6 a BH.G8, a také subklony těchto hybridomů, a protilátky tvořené těmito hybridomy nebo subklony těchto hybridomů.

Vynález dále zahrnuje způsob podporování růstu nové tkáně _ nebo .. ppdpprp_yání„.„přežívání .. po.ško.zené_...tkáně_.pa.cien.ta.,______ včetně podávání pacientovi léčebně -účinné množství sloučeniny, která interaguje s buněčným Ret, a tím indukuje autofosforylaci Ret. Sloučenina může být RetLl, RetL2, nebo RetL3, fragment nezkráceného RetL nebo protilátka, která se váže na Ret.. Sloučenina může být podávána současně s léčebně účinným množstvím druhé sloučeniny, jako je GDNF, neurturin nebo molekula příbuzná s GDNF. Zatímco cílové tkáně pro tyto způsoby léčení mohou zahrnovat jakoukoliv tkáň, preferované tkáně zahrnují tkáň ledvin, nervovou tkáň, srdce, žaludek, tenké střevo, míchu nebo plíce. V jednom provedení je RetL rozpustný RetL. Subjektem způsobů léčení může být člověk.

V dalším způsobu podle vynálezu je inhibována signální transdukce (přenos signálu) Ret mezi první buňkou exprimující RetL a druhou buňkou kontaktem první buňky s rozpustným proteinem Ret nebo s protilátkou k RetL. Rozpustný protein Ret může být fúzní protein.

Vynález také zahrnuje způsob cílení toxinu, zobrazovací sloučeniny nebo radionuklidu na buňku exprimující Ret, způsob

♦ o

zahrnuje kontakt buňky s fúzním proteinem RetL nebo protilátkou anti-Ret konjugovanou s toxinem, zobrazovací sloučeninou nebo radionuklidem. RetL může být RetLl, RetL2 nebo RetL3. V dalším způsobu podle vynálezu je potlačen růst nádorové buňky, která exprimuje Ret, krokem způsobu je kontakt buňky s fúzním proteinem RetL s toxinem nebo radionuklidem, nebo s protilátkou anti-Ret konjugovanou s toxinem nebo radionuklidem. Buňka může přitom být v těle pacienta a protein nebo konjugovaná protilátka se podává pacientovi. Ve vynálezu je také zahrnut způsob, cílení toxinu, zobrazovací sloučeniny nebo radionuklidu na buňku exprimující RetL, zahrnující kontakt buňky s fúzním proteinem obsahujícím Ret a toxin, zobrazovací sloučeninu nebo radionuklid, nebo . . .

__ protilátku_ _anti-RetL .. konjugovanou. ..s. toxinem,.. zobrazovací·--- -sloučeninou nebo radionuklidem. Další provedení zahrnuje způsob potlačení růstu nádorové buňky, která exprimuje RetL, způsob obsahuje . kontakt buňky s fúzním proteinem Ret s toxinem nebo radionuklidem, nebo s protilátkou anti-RetL konjugovanou s toxinem nebo radionuklidem, přitom buňka může být v. těle pacienta a protein nebo konjugovaná protilátka se podává pacientovi. RetL pro kterýkoliv ze způsobů vynálezu může být RetLl, .RetL2 nebo RetL3, nebo varianta či fragment

RetLl, RetL2 nebo RetL3.

ř _h Vynález déle poskytuje způsoby genové terapie. Jedno b provedení je způsob léčení pacienta s poruchou metabolismu ' Ret, zahrnující podávání pacientovi vektor obsahující molekulu DNA kódující RetL, a také způsob podporování růstu nové tkáně v těle pacienta, zahrnující podávání takového vektoru pacientovi. Další provedení zahrnuje způsob podporování přežívání poškozené tkáně v těle pacienta, jedním krokem způsobu je podávání terapeuticky účinného množství vektoru kódujícího RetL pacientovi.

·«« *·

Popis obrázků

Obrázek 1 je sekvence cDNA (sekvence id. č. 1) a z ní odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 2) krysího RetLl. Nukleotidové sekvence zasahuje od páru baží 201 po pár baží 1700 ze sekvence id. č. 1 a obsahuje celý otevřený čtecí rámec.

Obrázek 2A je částečná sekvence cDNA (sekvence id. č. 8) a z ní odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 9) lidského RetLl. Tato sekvence je ta, která je vložena do klonu HRL2Q, deponovaného jako ATCC č. 97604.

Obrázek 2B je složená úplná sekvence DNA (sekvence id. č. 10) a odvozené aminokyselinové sekvence (sekvence id. č. 11) lidského RetLl.

Obrázek 3A je srovnání nukleotidové sekvence lidského RetLl (horní řádek sekvence) s krysí sekvencí RetLl (spodní řádek sekvence). Vertikální řádky mezi nukleotidy ukazují identitu v dané pozici, zatímco tečka vyznačuje v téže pozici mezeru.

Obrázek 3B je srovnání aminokyselinové sekvence lidského RetLl (horní řádek sekvence) s krysí sekvencí RetLl (spodní řádek sekvence). Vertikální řádky mezi odpovídajícími aminokyselinami ukazují ve zbytku identitu, zatímco tečka vyznačuje v tomto zbytku konzervativní substituci.

Obrázek 4A je schematické zobrazení možné role pro Ret a RetL v interakci mezi metanefrogenní raezenchymovou buňkou a buňkou ureterového pupenu.

Obrázek 4B je schematické zobrazení způsobu testování transfektant z knihovny cDNA na přítomnost klonů, které exprimují RetL. Přítomnost exprimovaného RetL u transfektant je detekována stanovením vazby těchto transfektant buď na

fúzní protein Ret/ígG nebo fúzní protein Ret/alkalická fosfatáza.

Obrázek 5 je schematické zobrazení ukazující konstrukci plazmidú použitých k expresi lidského- fúzního proteinu Ret/ígG.

Obrázek 6 je schematické zobrazeni ukazující konstrukci plazmidú použitých k expresi lidského fúzního

Ret/ígG.

Obrázek 7 je sekvence cDNA (sekvence id.

proteinu

č. 12) a odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 13) lidského RetL2 v klonu DSW240. Proteinový čtecí rámec je obsažen mezi nukleotidy .25 až 1416.

Obrázek 8 je .srovnání aminokyselinové sekvence lidského'

RetL2 (horní řádek sekvence) se sekvencí lidského RetLl ......._ (.

(spodní řádek sekvence). Vertikální řádky, mezi' aminokyselinami ukazují identitu v dané pozici, zatímco tečka vyznačuje v téže pozici mezeru.

v Obrázek 9 je sekvence cDNA (sekvence _id.· č. 46) a 2 ní. . J odvozená^aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 17) myšího )

RetL3.

Obrázek 10 je sekvence cDNA. (sekvence id. č. 20) .a zní odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 21) lidského RetL3.

&

4» 3»

O 3

3 *·

I*

Λ

Podrobný popis vynálezu

Identifikační čísla sekvencí

Nukleotidovým a aminokyselinovým sekvencím zmiňovaným ve specifikaci byla dána následující identifikační čísla (id. č.) sekvencí;

sekvence	id.	č.	1	- cDNA krysího retLl
sekvence	id.	č.	2	- aminokyselinová sekvence krysího retLl
sekvence	id.	č.	3	- oligomer kid-13
sekvence	id.	č.	4	- oligomer kid-14
sekvence	id.	č.	5	- oligomer kid-15
sekvence	id.	č.	6	- cDNA extracelulárního krysího ret
sekvence	id.	č.	7	- aminokyselinová sekvence krysího Ret
sekvence	id.	č.	8	- částečná cDNA lidského retLl
sekvence	id	č	•	9 . - částečná, aminokyselinová sekvence
lidského	RetLl
sekvence	id.	č.	10	- cDNA lidského retLl
sekvence	id.	č.	11	- aminokyselinová sekvence lidského RetLl
sekvence	id.	č.	12	- cDNA lidského retL2
sekvence	id.	č.	13	- aminokyselinová sekvence lidského RetL2
sekvence	id.	č.		14 - částečná cDNA. myšího retL3 (EST
AA 50083)
sekvence	id.	č.		15 - částečná aminokyselinová sekvence

myšího RetL3

sekvence	id.	č.	16	- cDNA myšího retL3
sekvence	id.	č.	17	- aminokyselinová sekvence myšího RetL3
sekvence	id.	č.	18	- částečná cDNA lidského retL3
sekvence	id.	č.		19 - částečná aminokyselinová sekvence
1idského	RetL3
sekvence	id.	č.	20	- cDNA lidského retL3
sekvence	id.	č.	21	- aminokyselinová sekvence lidského RetL3

• * ·»· *·«·** · ·· «· ·« ··· ·* ··

Definice termínů

V popisu vynálezu termín RetL znamená každý protein, který specificky interaguje s receptorovým proteinem Ret, a který, když interaguje s Ret, spouští dimerizaci Ret a/nebo autofosforylaci tyrozinkinázové domény Ret. Sekvence DNA, které kódují RetL a Ret, jsou nazývány retL a ret, v uvedeném pořadí. 'Ligand může být rozpustný, nebo přítomný jako molekula navázaná na membránu a na téže nebo jiné buňce, jako je molekula Ret, pro kterou spouští autofosforylaci. Při určitých použitích nebo interakcích s Ret, může ligand vyžadovat ke spuštění autofosforylace další molekuly. Ligandy vynálezu zahrnují společné receptory nebo přídatné kofaktory ligandu. Ligandy vynálezu dále zahrnují monokionální protilátky (mAbs) anti-Ret, které působí, .jako .antagonisté-Ret spouštějící dimerizaci^ a autofosforylaci Ret.. Ligandumúže, být také různými způsoby modifikován, například inkorporován jako část fúzního proteinu, například s toxinem nebo radionuklidem.

Porovnáním sekvencí se míní srovnání pozic jedné sekvence, buď nukleotidové nebo aminokyselinové, s další sekvencí, aby se umožnilo srovnání sekvence relevantních částí jedné s toutéž částí druhé. Příklad této metody popsal Needleman et al. (J. Mol. Biol., 48, 443-453, 1970). Metoda může být použita pohodlně počítačovými programy jako je program Align (DNAstar, lne.). Odborníkům je známo, že homologní nebo funkčně ekvivalentní sekvence zahrnují funkčně ekvivalentní uspořádání cysteinových zbytků v konzervovaném cysteinovém skeletu, včetně aminokyselinových inzercí nebo delecí, které pozměňují lineární uspořádání těchto cysteinů, ale .podstatně nemění svůj vztah ve složené (uspořádané) struktuře proteinu. Proto vnitřní mezery a aminokyselinové inzerce v uvažované sekvenci jsou ignorovány za účelem

9 9 9 9 99

99 «99

9 * 9 9 · ·

9 9 9 9 9

999 99 99 9*9 • · 9 *

9 9 9

9 9« 9 9 9

9

9 9 9 kalkulace stupně sekvenční homologie aminokyselinové sekvence nebo identity mezi uvažovanou a referenční sekvencí. Jedna charakteristika často používaná při stanovení homologie proteinů je podobnost počtu a lokalizace cysteinových zbytků mezi jedním a druhým proteinem.

Klonováním se míní použití in vitro rekombinantních technik pro vložení konkrétního genu nebo jiné sekvence DNA do molekuly vektoru. Aby se požadovaný gen mohl úspěšně klonovat, je nezbytné použít metody pro vznik fragmentů DNA, pro spojování fragmentů s molekulami vektoru, pro zavedení složené molekuly DNA do hostitelské buňky, ve které se může replikovat, a pro výběr klonu, který obsahuje cílový gen, z příjemcových hostitelských buněk..

.c.DNA se .míní komplementární. DNA nebo · kopie -DNA tvořenáz templátu RNA činnosti DNA polymerázy 'závislé na RNA. (reverzní transkriptázy) . Tedy klon cDNA znamená dvojitou sekvenci DNA komplementární ke zkoumané molekule RNA nesenou v klonovacím vektoru.

Knihovou cDNA se míní soubor rekombinantních molekul DNA obsahujících inzerty DNA, které dohromady reprezentují úplný soubor molekul RNA přítomných v celém organismu nebo tkáni, v závislosti na zdroji templátu RNA. Taková knihovna cDNA může být připravena způsoby odborníkům známými, jak jsou popsány např. v Maniatis et al., Molecular Cloning:

A Laboratory Manual, výše. Obecně se RNA nejdříve izoluje z buněk organismu, z jehož genomu je žádoucí klonovat konkrétní gen. Pro tento účel jsou. podle předkládaného vynálezu výhodné savčí, a obzvláště lidské, buněčné linie. Jako alternativa může být RNA izolována z .nádorové buňky, pocházející ze zvířecího nádoru, a výhodně z. lidského nádoru. Tak může být připravena knihovna například z lidského nádoru nadledvinek, ale může být použit jakýkoliv nádor.

»

• 4 4 4 • 4 4 4 ««4 4*4

4

44

Termín polymorfismus DNA se týká stavu, kdy mohou existovat dvě nebo více odlišných nukleotidových sekvencí v konkrétním místě v DNA.

Expresní vektor popisuje vektory, které jsou schopné exprese sekvencí DNA v nich obsažených, tj . kódující sekvence jsou operativně spojeny s dalšími sekvencemi schopnými uskutečnit jejich expresi. Je jasné, ačkoliv ne vždy vyjádřeno explicitně, že tyto expresní vektory musí být replikovatelné v hostitelském organismu buď jako episomy nebo jako integrální část chromozomové DNA. Užitečný, i když ne nezbytný, prvek účinné exprese vektoru je sekvence kódující markér - značku, což je sekvence kódující protein, který má za . následek určitou fenotypovou vlastnost (např. ..t.etracyklinovou rezistenci), buněk protein, „obsahujících, ..což umožňuje, . že tyto buňky jsou snadno identifikovatelné. Tedy termín expresní vektor je dán funkční definicí a jakákoliv sekvence DNA, která je schopná uskutečnit expresi specifického obsaženého DNA kódu je v tomto termínu zahrnuta, jak je to aplikováno na sekvence v tomto popisu. Tyto vektory jsou často ve formě plazmidů, takže plazmid a expresní vektor jsou často používány zaměnitelně. Avšak vynález zahrnuje i další formy expresních vektorů, včetně fága, které mají ekvivalentní funkci a které jsou v oboru známé.

Podobně funkční derivát genu kteréhokoliv z proteinů podle předkládaného vynálezu zahrnuje fragmenty, varianty a analogy genu, které mohou být podstatně podobné v nukleotidové sekvenci, a které kódují molekulu mající podobnou aktivitu.

Molekula příbuzná GDNF znamená každou molekulu, která je alespoň ze 40 % homologní s buď GDNF nebo neurturinem, a je také schopna specificky vázat RetL.

4 4 4 · ·

44 4 · * · 4 4 ♦

4*4 4 4 ··· 44 44 4 • 4 44

4 4 4 * 444 44>

Termín gen znamená polynukleotidovou sekvenci kódující peptid.

Homogenním se míní při odkazu na peptidovou nebo DNA sekvenci, že primární molekulární struktura (tj. sekvence x aminokyselin nebo nukleotidů) v podstatě všech molekul přítomných v daném přípravku je totožná.

Termín oligonukleotid, jak se zde .používá pro molekulové sondy DNA, oligomerové fragmenty, které mají být detekovány, oligomerové kontroly, neznačené blokující oligomery a primery pro amplifikaci sekvencí DNA, je definován jako molekula složená z více než tří deoxvribonukleotidů nebo ribonukleotidů. Přesná velikost oligonukleotidu závisí na mnoha faktorech, které zase závisí na konečné funkci nebo použití oligonukleotidu.

Termín sonda obecně obecně označuje ligand známých.

kvalit schopný selektivní vazby na cílový antiligand. Při aplikaci na nukleové kyseliny se termín sonda týká vlákna nukleové kyseliny, která má sekvenci baží komplementární k cílovému vláknu.

Termín rekombinantní hostitelské buňky se týká buněk, které byly transformovány vektory konstruovanými za použití technik rekombinantní DNA. Jak je zde definováno, protilátka nebo její modifikace tvořená rekombinantní hostitelskou buňkou je výsledkem této transformace, neboť netransformovaný hostitel by tvořil spíše malá množství, menší než detekovatelná.

Termíny restrikční endonukleáza a restrikční enzym se týkají bakteriálních enzymů, . každý z nich štěpí dvoj vláknovou DNA ve specifické nukieotidové sekvenci nebo blízko ní.

• · * φ « · • β φφ · φ · φ ·♦· ·φ · φ φ φ» «·

Termín polymorfismus délky restrikčních fragmentů” (RFLP) se týká odlišností mezi jednotlivci v délce konkrétního restrikčního fragmentu.

molekule se říká, že je podstatně podobná jiné molekule, jestliže je sekvence aminokyselin v obou molekulách v podstatě stejná, a jestliže Obě molekuly mají podobnou biologickou aktivitu. Tak za předpokladu, že dvě molekuly mají podobnou aktivitu, se považují za varianty, jak je tento termín používaný zde dokonce i když jedna z molekul obsahuje další aminokyselinové zbytky nenalezené v druhé, nebo když sekvence aminokyselinových zbytků není totožná. O molekule se říká, že je chemický derivát jiné molekuly, když obsahuje další chemické skupiny, které normálně nejsou částí molekuly. Takové skupiny mohou zlepšit molekulovou ' rozpustnost, absorpci, biologický poločas atd. Skupiny ...mohou alternativně snižovat toxicitu molekuly, eliminovat nebo zeslabovat každý nežádoucí vedlejší účinek molekuly atd. Skupiny schopné zprostředkovat takové“' účinky jsou popsány například v Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. vyd., Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1980.

Vektorem se míní molekula DNA, odvozená z plazmidu nebo bakteriofága, do které mohou být vloženy nebo klonovány fragmenty DNA. Vektor obsahuje dvě nebo více jedinečných restrikčních míst, a je schopen autonomní replikace v definovaném hostiteli nebo nosičském organismu tak, že klonovaná sekvence je reprodukovatelná.

Termínem v podstatě čistý se míní každý protein podle předkládaného vynálezu nebo každý gen kódující takový protein, který je v podstatě bez dalších proteinů nebo genů, nebo bez jiných kontaminujících sloučenin, se kterými může být normálně nalezen v přírodě, a jako takový existuje ve formě v přírodě nenalezené.

	• 44 «0 * • 4 4 4 * 4 ·· • 44 4 * 4 4 4 4 *4 · · 4 4 4 · · » 44· ·« «4 444 15	4« 4* • «4 4 4 «4 4 44 44 4 4 44 «4
Sloučeniny podle vynálezu
Vynález	zahrnuje cDNA	kódující RetL, jako	je
nukleotidové	sekvence cDNA	krysího retLl, částečná	cDNA

lidského retLl, nezkrácená cDNA lidského retLl, cDNA lidského retL2, cDNA myšího retL3 nebo cDNA. lidského retL3. Kromě toho sloučeniny vynálezu zahrnují sekvence, které obsahují výše uvedené sekvence nebo jsou deriváty jedné z 'těchto sekvencí. Vynález také zahrnuje vektory, lipozomy a další vehikula vhodná pro přenos, která obsahují jednu z těchto sekvencí nebo derivát jedné z těchto .sekvencí. Vynález také zahrnuje proteiny transkribované a translatované z cDNA krysího retLl, částečné cDNA lidského retLl, úplné cDNA lidského retLl, cDNA lidského retL2, cDNA myšího retL3 nebo cDNA lidského· retL3, což zahrnuje, ale není .omezeno na, krysí RetLl, částečnou' sekvenci lidského RetLl, úplný lidský- RetLl,· lidský RetL2, myší RetL3· nebo lidský RetL3, a jejich deriváty a varianty.

Jedno provedení vynálezu se týká rozpustné varianty RetL. , Rozpustné varianty postrádají přinejmenším úsek intramembránové části nativního RetL. V některých příkladech rozpustná varianta postrádá fosfatidylinozitolglykanovou vazbu' nativního RetL. Rozpustné varianty zahrnují fúžní' proteiny, které obsahují deriváty RetL, které postrádají fosfatidylinozitolový motiv.

Varianty se mohou lišit od přirozeně se vyskytujícího RetL v aminokyselinové sekvenci nebo způsobem, který nepostihuje sekvenci, nebo oběma možnostmi. Varianty v aminokyselinové sekvenci se tvoří,., když je jedna nebo více aminokyselin v přirozeně se vyskytujícím RetL substituována odlišnou přirozenou aminokyselinou, derivátem aminokyseliny nebo jinou než nativní aminokyselinou. Obzvláště výhodné varianty zahrnují přirozeně se vyskytující RetL nebo biologicky aktivní ,fragmenty přirozeně se vyskytujícího RetL, • e ► « *· ► · ’ » ♦ · ι « · ·· »·♦ «· ·· • · * · • · · · ··« ··· • ♦ • · · · jejichž sekvence se liší od sekvence divokého typu substitucemi jedné nebo více konzervativní aminokyseliny, které mají typicky minimální vliv na sekundární strukturu a hydrofobní povahu proteinu nebo peptidu. Varianty mohou také mít sekvence, které seliší substitucemi, delecemi nebo inzercemi jedné nebo více nekonzervativní aminokyseliny, které neruší biologickou aktivitu RetL. Konzervativní substituce typicky zahrnují substituce jedné aminokyseliny druhou s podobnými vlastnostmi uvnitř následujících skupin: valin, glycin; glycin, alanin; valin, isoleucin; kyselina aspartová, kyselina glutamová; asparagin, glutamin; serin, threonin; lysin, arginin; a fenylalanin, týrosin. Nepolární (hydrofobní) aminokyseliny zahrnují alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin.Polární neutrální, aminokyseliny zahrnuji - glycin, serin,' threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin. Pozitivně nabité (bazické) aminokyseliny zahrnují arginin, lysin a histidin. Negativně nabité (kyselé) aminokyseliny zahrnují . kyselinu aspartovou a kyselinu glutamovou.

Další konzervativní substituce mohou být vybrány z následující tabulky, a ještě další popsal .Dayhoff v Atlas of Protein Sequence and Structure (1988) .

Tabulka 1: Náhrady konzervativních aminokyselin

Aminokyselinu	Kód	Nahraď jakoukoliv z:
Alanin	A	D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginin	R	D-Arg, Lys, homo-Arg, Dhomo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Om, D-Om
Asparagin	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, DGlu, Gin, D-Gln
Kyselina aspartová	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu,DGlu, Gin, D-Gln

• ·· «··

9

Tabulka 1 (pokračování): Náhrady konzervativních aminokyselin

Cystein	C	D-Cys, S-Me-Cys,MekDMekThr, D-Thr
Glutamin	Q	D-Gln,Asn, D-Asn,Glu,DGlu, Asp, D-Asp
Kyselina glutamová	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, DAsn, Gin, DrGln
Glycin	G	Ala, D-AIa,Pro, D-Pro, BetaAla, Acp
Isoieucin	I	D-IIe, Val, D-Val, Leu, DLeu, Met, D-Met
Leucin	L	D-Leu, Val, D-Val, Met, DMet
Lysin	K	D-Lys, Arg, D-Arg, homoArg, D-homo-Arg, Met, DMet, Ile, D-Ile.Om, D-Om
Methionín	M	D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val, Norleu
Fenylalanin	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans 3,4 oř 5-fenylprolin cis 3,4 oř 5-fenylprolin
Prolin	P	D-Pro, kyselina L-I-thioazo lidin-4-karboxylová kyselina 'D- nebo L-l-oxazolidin4-karboxylová
Senn	s'	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Μεζ D-Mek Met(O), DMet(O), Val, D-Val
Threonin	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Mek D-Mek Met)O, DMet(O), Val, D-Val
Tyrosin	Y	D-Tyr,Phe, D-Phe, L-Dopa, His,D-His
Valin	V	D-Val, Leu,D-Leu,Ile,D-ne, Mek D-Met

• 09 90

9» 9 9 9 · » »9 9 ·

9 9 9 · ·

9 9 *9

9·9 ·* 9« lv«

0« 9»

0 9 ·

909 999

9

9· 99

Další varianty vynálezu jsou takové modifikace, které zvyšují peptidovou stabilitu. Tyto varianty mohou obsahovat například jednu nebo více nepeptidových vazeb (které nahrazují peptidové vazby) v sekvenci peptidu. Patří sem také varianty, které obsahují zbytky jiných než přirozeně se vyskytujících L-aminokyselin, jako jsou D-aminokyseliny nebo aminokyseliny nevyskytující se přirozeně či syntetické aminokyseliny, jako jsou beta nebo gamma aminokyseliny a cyklické varianty. Inkorporace D- místo L- aminokyselin do polypeptidu může zvýšit jeho rezistenci k proteázám. Viz např. Patent USA č. 5 219 990.

Peptidy podle vynálezu mohou být také modifikovány různými změnami, jako jsou inzerce, delece a substituce, a to buď konzervativní nebo nekonzervatívní, pokud takové změny mohou poskytnout určité výhody při jejich- použití. Vé vynálezu jsou specificky zahrnuty také sestřihové (splíce) varianty.

Kromě peptidů v podstatě nezkrácených poskytuje předkládaný vynález biologicky aktivní fragmenty polypeptidu. Polypeptid RetL nebo fragment je biologicky aktivní, jestliže projevuje biologickou aktivitu přirozeně se vyskytujícího RetL. Tyto biologické aktivity zahrnují schopnost specificky vázat extracelulární část Ret s afinitou, která je alespoň 50%, a výhodně je alespoň stejná, jako afinita přirozeně se vyskytujícího RetL, pro extracelulární část Ret. Další biologická aktivita je schopnost vázat se na protilátku, která je namířená proti epitopu, který je přítomný na přirozeně se vyskytujícím RetL.

V dalších provedeních také varianty se substitucemi aminokyselin, které jsou méně konzervativní, mohou poskytnout požadované deriváty, např. způsobením změn v náboji, konformaci a dalších biologických „vlastnostech. Tyto • 4 » 4 4 • 4 h 44 *

· »

4

4	• 4	• 4
44	4 4	4 4
4	4 4	4 4
4	4 444	«44
4	4	>
• 44	44	44

substituce by zahrnovaly například substituci hydrofilního zbytku hydrofobním, substituci cysteinu nebo prolinu jiným zbytkem, substituci zbytku, který má malý postranní řetězec zbytkem s rozsáhlým postranním řetězcem, nebo substituci zbytku, který má čistý pozitivní náboj zbytkem s čistým negativním nábojem. Když nemůže být výsledek dané substituce s jistotou předpovězen, mohou být deriváty snadno otestovány způsoby zde popsanými pro určení výskytu nebo chybění požadovaných vlastností.

Obecně substituce, u kterých se očekává, že vyvolají změny ve funkčních vlastnostech polypeptidů Ret, jsou ty, ve kterých:

I) hydrofilní zbytek, např, serin nebo threonin, je nahrazen hydrofobním . zbytkem, např. leucinem,

- isoleucinem, fenylaianinem nebo alaninem,

II) cysteinový zbytek je nahrazen jakýmkoliv jiným zbytkem nebo nahradí jakýkoliv zbytek,

III) zbytek, který má elektropozítivní postranní řetězec, např. lysin, arginin nebo histidin, nahradí zbytek{nebo je nahrazen zbytkem), který má elektronegativní náboj, např. kyselina glutamová nebo kyselina aspartamová, nebo

IV) zbytek, který má rozsáhlý postranní řetězec, např. fenylalanin, nahradí zbytek (nebo je nahrazen zbytkem), který takový postranní řetězec nemá, např. glycín.

Varianty podle vynálezu zahrnují proteiny a peptidy s aminokyselinovými sekvencemi, které mají přinejmenším šedesát procent homologie se sekvencí krysího RetLl (sekvence id. č. 2), částečnou sekvenci lidského RetLl (sekvence id. č. 9), nezkrácenou sekvenci lidského RetLl (sekvence id. č. 11), lidského RetL2 (sekvence id. č. 13), myšího RetL3 (sekvence id. č. 17), částečnou sekvenci lidského RetL3 (sekvence id. č. 19) nebo lidského RetL3 (sekvence id. č. 21). Výhodněji je ϊ

• · * »· ··· sekvenční homologie alespoň osmdesát, alespoň devadesát nebo alespoň devadesát pět procent. Pro účely určování homologie je obecně délka srovnávaných sekvencí alespoň 8 aminokyselinových zbytků, obvykle alespoň. 20 aminokyselinových zbytků. Varianty sloučenin vynálezu také zahrnují každý protein, který

1) má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze čtyřiceti procent homologní k proteinu RetL vynálezu, a také která

2) při optimální shodě se sekvencí RetL (jak je zobrazeno pro RetLl a RetL2 na obrázku 8), -má alespoň 80 % svých cysteinových zbytků ve shodě s cysteiny v proteinu RetL vynálezu.

Právě tak, jak je možné nahradit substituenty kostru, je také -možné substituovat funkční skupiny, které jsóu navázány na kostře, skupinami charakterizovanými podobnými vlastnostmi. Takové modifikace nemění primární sekvenci. Tyto budou zpočátku konzervativní, tj. skupina, která nahrazuje, bude mít přibližně stejnou velikost, tvar, hydrofobnost a náboj' jako původní skupina. Nesekvenční modifikace mohou zahrnovat například in vivo nebo in vitro chemickou derivatizaci Částí 'přirozené se vyskytujícího RetL, a také změny v acetylaci, metylaci, fosforylaci, karboxylaci nebo glykosylaci.

Vynález se také týká látek, které se specificky vážou na protein vynálezu nebo fragment takového proteinu. Tyto látky zahrnují fúzní proteiny Ig a protilátek (včetně jednoduchého řetězce, dvojitého řetězce, fragmentů Fab, a jiných protilátek, ať už nativních, humanizovaných, primatizovaných nebo chimérických). Další popisy těchto skupin látek lze nakít v přihlášce PCT 95/16709, na jejíž pois se zde odkazujeme.

e co : ; r £ fit® e o o <

Λ «?, C^:h C cm c c c c C r r. A c t o u, c cm c c fc

Příklady provedení vynálezu

Experimentální postupy

Přehled strategie _ - <ú · Všeobecná strategie použitá . ke klonování RetLl .je ukázána na obrázcích,4A a 4B. Naše strategie. byla.,,,.založena na předpokladu,. »₇. že ·. RetL. . je· ;,přinejmenším _ř exprimován v metanefrogenním mesenchymu vyvíjející se .ledviny jako membránový protein (ačkoliv je -možné, že . ligand je .také exprimován v, rozpustné fo.rmě, obrázek 4A)>. RetL řnteraguje s receptorem Ret na buňce..ureterového, pupenu, aktivuje její cýtoplazmatickou doménu tyrozinkinázy a posílá jádru signál,, který následně aktivuje geny .zapojené do růstu a větveni ureterového pupenu. Proto proteiny obsahující extracelulární doménu Ret fúzovanou buď k části Fc lidského imunoglobulinu G1 (IgGl) nebo alkalické fosfatázy (AP) mohou být použity jako: část strategie ke klonování. RetL,. jak je ukázáno na obrázku*· 4B. Fúzní proteiny,v expresní knihovny a další reagencie použité ,při klonování RetLl jsou popsány níže.

Nejdříve jsme izolovali. .cDNA krysího· RetLl, a -poté ji použili jako sondu pro izolaci cDNA lidského RetLl. Následně byla izolována cDNA pro RetL2-a RetL3. ,

Příprava reagencií požadovaných.pro přímé expresní klonování ligandů Ret . . ,

1...Izolace cDNA kódující extracelulární doménu krysího Ret

Pro identifikaci RetLl byly vytvořeny fúzní proteiny, které se skládaly z extracelulárních domén buď krysího nebo > · lidského Ret fúzovaných k proteinu, .a sice části Fc lidského IgGl v jednom příkladu, a alkalické fosfatáze. v jiném • 4 ·

• · · * b · · * • « · · · · * 4 4 «4 ·♦ příkladu. Obě fúzní partnerské molekuly mohou být snadno testovány na detekci buněk, které exprimují ligand, jak je vyznačeno na obrázku 4B.

Protože cDNA kódující krysí Ret nebyla nikdy objevena, izolovali jsme cDNA kódující extracelulární doménu krysího receptoru Ret za použití metody užívající reverzní transkriptázu s následnou polymerázovou řetězovou reakcí (RT-PCR). Srovnali jsme nukieotidové sekvence pro lidský (přístupová čísla v Genbank M57464 a X15262) a myší (přístupové číslo Genbank x67812) ret a navrhli oligonukleotidové primery pro oblasti s vysokou identitou mezi těmito dvěma sekvencemi. Sense oligomer (souhlasný se směrem transkripce), nazvaný kid-013 (sekvence id. č. 3, obsahuje nukleotidy 150-169 ze sekvence z Genbank č. X15262) je vybrán z 5'-konce lidské sekvence cDNA ret, která překrývá iniciační kodon ATG. Na svém 5'-konci zahrnuje nukleotidy kódující restrikční místo Notl pro účel klonování. Dva antisense oligomery (orientované proti směru transkripce), nazvané kid-014 (sekvence id. č. 4, obsahuje komplementární sekvenci nukleotidů 1819 až 1839 ze sekvence Genbank č. M57464) a kid-015 (sekvence id. č. 5, obsahuje komplementární sekevnci nukleotidů 1894 až 1914 ze sekvence Genbank č. X67912) jsou vybrány, v uvedeném pořadí, z lidské a myší sekvence cDNA bezprostředně sousedící s 5'-koncem sekvencí, které kódují transmembránové domény. Oligomery kid014 a kid-015 obsahují přídatné nukleotidy na svých 5'koncích, které kódují restrikční místo Sáli pro účely klonování.

Celková RNA se izolovala z krysí ledviny 14 denního embrya a mRNA se purifikovala za použití oligo-dT chromatografie. mRNA se přeměnila na cDNA za použití reverzní transkriptázy AMV a cDNA se přeměnila na dvojvláknovou cDNA ♦ · ♦ ···*· · r·· 9* ·· *·♦ 9· · a amplifikovala se za použití polymerázy Taq ve standardní polymerázové řetězové reakci s oligomery kid-013 a kid-015. Syntéza fragmentu PCR o velikosti 1942 bp byla potvrzena analýzou alikvotu z reakce PCR na 1% agarózovém gelu. Zbytek PCR fragmentu se štěpil Notl a Sáli a klonoval se do pSAS132 předem naštěpeného Notl a Sáli. Výsledný plazmid byl nazván pJCOll. Celý inzert plazmidu pJCOll obsažený mezi místy Notl a Sáli se sekvencoval a je zde uveden jako extracelulární cDNA krysího ret, sekvence s id. č. 6. Translace této sekvence poskytla peptidovou sekvenci (sekvence id. č. Ί) pro extracelulární krysí Ret. Protože oligomery pro PCR byly vybrány z lidské a myší sekvence ret, je možné, že nukleotidová sekvence uvedená jako sekvence extracelulární cDNA krysího ret a peptidová sekvence uvedená jako sekvence extracelulárního krysího Ret, se mohou lišit od přirozené nukleotidové sekvence krysího ret a peptidové sekvence Ret v oblastech sekvencí kid-013 a kid-015. Následně byly izolovány klony krysí cDNA ret z knihovny cDNA z 18 denních, krysích ledvin a bylo pozorováno několik nukleotidových změn v oblastech primerů, které mají za následek dvě změny aminokyselin. Jedna změna je v signální sekvenci (arginin v pozicí 5 na threonin) a jedna změna je blízko konce extracelulární domény (kyselina glutamová v pozici 633 na alanin). Obě tyto změny by neměly ovlivnit vazbu ligandu.

2. Fúzní proteiny Ret/IgG

Byly vytvořeny fúzní proteiny, které se skládaly z extracelulární domény krysího (aminokyselinové zbytky 1 až 637) a lidského (aminokyselinové zbytky 1 až 636) receptoru Ret fúzovaného k části Fc lidského IgGl.

Konstrukce plazmidů používaných k expresi krysího fuzního proteinu Ret/IgG je ukázána schematicky na obrázku 5. „ »'

» ·

1*· Φ· φ * « φ φ · · · φ · » b · φφφφφφ ·> Φ φ * φφφ φ* ·φ

Pro konstrukci genu kódujícího krysí fúzní protein Ret/IaG, jsme štěpili pJCOll (popsaný výše), obsahující extracelulární doménu krysího Ret, se Sáli, a ligovali jsme ho k fragmentu Sáli o velikosti 700 bp z plazmidu 2-4, a vytvořili jsme plazmid pJCQ12. Tento fragment Sáli obsahuje část domény Fc lidského IgGl pocházejícího původně z plazmidu pSAB144. Plazmid 2-4 byl vytvořen předem třístupňovou ligací: fragment Notl-Sall vzniklý metodou PCR obsahující .· extracelulární doménu králičího receptoru TGF-beta typu II; Notl-Sall fragment o velikosti 693 bp z pSAB144 obsahující část domény Fc lidského IgGl; a pSAB132 štěpený Notl. Jak je ukázáno na obrázku 5, fragment obsahující doménu Fc může být uvolněn z plazmidu 2-4 jako fragment Sáli o velikosti 700 bp. pJC012 byl transfekován do buněk COS a krysí fúzní protein Ret/IgG byl purifikován ze živného média 48 hodin později za použití chromatografie na' Sepharose Protein-A. Aby se vytvořila stabilní buněčná linie produkující protein Ret/IgG, byl izolován fragment Notl o velikosti 2612 bp z pJC012 obsahující celý krysí fúzní protein Ret/IgG a byl klonován do místa Notl expresního vektoru pMDR901. Výsledný plazmid byl nazván pJC022. Plazmid pJC022 pak byl transfekován do buněk CHO, aby vznikly stabilní buněčné linie. Nejvíce produkující buněčná linie byla upravena na suspenzni kulturu. Typické zisky pro linii CHO krysího Ret/IgG jsou 75 mg/1.

Konstrukce plazmidu užitých k expresi lidského fúzního proteinu Ret/IgG je schematicky ukázána na obrázku 6. Aby se vytvořil gen kódující lidský fúzní protein Ret/IgG, získali jsme plazmid obsahující cDNA kódující lidský receptor Ret od Ďr. M. Takahashiho (Department of Pathoiogy, Nagoya University, School of Medicine, Nagoya, Japonsko) . 2 tohoto plazmidu vznikl fragment PCR za použití oligomerů kid-013 a kid-014. PCR fragment byl ošetřep enzymem Klenowovým \ .1 b

9 fragmentem, pak následovala digesce s Notl za vzniku PCR fragmentu s lepivým koncem Notl a jedním tupým koncem. Tento fragment byl klonován do vektoru pGEMllzf(+) předem naštěpeného EcoRI, a naštěpeného Notl, ošetřeného Klenowovým fragmentem aby se vytvořil lepivým konec Notl a jeden tupý konec. Výsledný plazmid byl nazván pJC013. Fragment Notl-Sall o velikosti 1916 bp z pJC013 byl izolován po kompletním štěpení s Notl a částečném štěpení se Sáli a ligován k^: fragmentu Sall-Notl o velikosti 693 bp z pSAB144 obsahujícím část domény Fc lidského IgGl a k expresnímu vektoru pSAB132 naštěpenému Notl. Výsledný plazmid byl nazván pJC015. Inzert v plazmidu pJC013 byl sekvencován a zjistilo se, že obsahuje jednu nukleotidovou odchylku, která mění jednu aminokyselinu v extracelulární doméně lidského Ret (sekvence z Genbank M57464 má C v pozici 812, zatímco pJC013 má T v odpovídající pozicí, to má za následek změnu aminokyselin z alaninu na valin v pozici 294 proteinové, sekvence lidského Ret). Tento nukleotid byl zpětně opraven na zbytek C specifikovaný sekvencí z Genbank č. M57464 místně: cílenou mutagenezí plazmidu pJC013, čímž byl vytvořen plazmid pJC023. Byl izolován fragment BstE2 o velikosti 585 bp z pJC023 obsahující opravenou nukleotidovou sekvenci a zaklonován do plazmidu pJC015, ze kterého byl odstraněn fragment BstE2 o velikosti 585 bp obsahující variantní nukleotid. Nový plazmid byl nazván pJC024. Byl izolován fragment Notl o velikosti 2609 bp z pJC024 obsahující celý lidský fúzní protein Ret/IgG a byl zaklonován do místa Notl - expresního vektoru pMDR901. Výsledný plazmid byl nazván pJC025. Plazmid pJC025 byl transfekóván do buněk CHO, aby vznikly stabilní buněčné linie. Nejvíce produkující buněčná linie byla upravena na suspenzní kulturu. Typické zisky pro linii CHO lidského Ret/IgG jsou 6 mg/1.

Další detaily vytváření vektorů použitých ve způsobech podle vynálezu jsou uvedeny v přihlášce PCT 94/01456 a 92/02050, na jejichž popis se zde odkazujeme.

3. Biologické aktivita fúzních proteinů Ret/IgG . Aby se určilo, jestli fúzní proteiny Ret/IgG, které jsme vytvořili, jsou biologicky aktivní, a tudíž by byly dobré «. testovací reagencie pro klonování RetL, provedli jsme několik orgánových kultivačních testů na biologickou aktivitu.

.í Orgánový kultivační test se skládal z pěstování krysích ledvin 13-14 dnů starého embrya v orgánové kultuře po 3-5 dnů v přítomnosti fúzního proteinu Ret/Ig v koncentraci 50 ug/ml. Ledviny se také pěstovaly v přítomnosti LFA-3TIP/IgG nebo nosičového pufru. Po kultivačním období, jsou některé ledviny obarveny fluorescenčním lektinem Dolichos Biflorus Agglutinin (DB lektin) , který obarvi tkáně sběracího kanálku, což jsou epitelové buňky pocházející z ureterového pupenu. Tyto DB pozitivní buňky označují Ret-pozitivní buňky, protože Ret je exprimován v buňkách ureterového pupenu a jeho epitelových derivátech. To poskytuje hrubé vyhodnocení vlivu fúzního proteinu Ret/IgG na růst a vývoj embryonálních ledvin. Je zde jasná odlišnost v morfologii a růstu sběracího kanálku mezi ledvinami, které byly pěstovány s LFA-3TIP a těmi, které byly pěstovány s krysím fúzním proteinem Ret/IgG. Ledviny ošetřované Ret/IgG mají sběrací kanálky, které vykazují * významně menší větvení a jsou typicky celkově menší.

Z dalších ledvin byly připraveny parafinové řezy pro

O histologické vyšetření. Embryonální ledviny byly ošetřeny kontrolním pufrem nebo s Ret/IgG, a poté obarveny hematoxylinem a eosinem. Embryonální ledviny ošetřené Ret/Ig projevovaly menší větvení sběracích kanálků, než kontrolní embryonální ledviny ošetřené pufrem. Kromě toho ledviny i

• * «4 *

» « *« « ··· v · t «·>

ošetřované Ret/IgG měly méně kanálků. Tento účinek jsme také pozorovali u ošetření lidským fúznim proteinem Ret/IgG. Tato pozorování jsou v souladu s fúzními proteiny blokujícími induktivní signál mezi mezenchymem a ureterovým pupenem. Proto uzavíráme, že fúzní protein je vhodný pro klonování RetL.

4. Fúzní protein Ret/alkalická fosfatáza

Fúzní proteiny receptor/alkalická fosfatáza (AP) byly úspěšně použity pro identifikaci a klonování ligandů pro c-kit (Cell, 63, 185, 1990), ligandů pro členy rodiny eph receptorů (Cell, 79, 157, 1994) a nedávno ke klonování receptoru pro leptin, produkt genu ob (Cell, 83, 1263, 1995). Plazmidy kódující krysí fúzní protein Ret/AP byly zkonstruovány a krysí protein Ret/AP byl tvořen v buňkách COS7 v buněčných fermentorech. Následně byla vytvořena stabilní buněčná linie NIH3T3 exprimující průměrně 10mg/l fúzního proteinu. Analýza krysího proteinu Ret/AP metodou SDS-PAGE naznačuje, že jeho velikost je konzistentní s předpověděnou molekulovou hmotností a filtrací indikuje, že se tvoří jako purifikace je dosaženo afinitní chromatograií na koloně anti-AP.

analýza gelovou dimer. Částečné

Protilátky anti-Ret

Byla připravena králičí polyklonální protilátka proti krysímu fúznímu proteinu Ret/IgG. Protilátka je funkční při westernovém přenosu, analýze buněčných linií Ret-pozitivních pomocí FACS a při imunohistochemickém vyšetření řezů embryonálních ledvin.

Byl vytvořen panel křečcích monoklonálních anti-krysích protilátek Ret. K imunizaci arménských křečků je použit krysí * « · · *β· aa* i · · · * ««· ·> ♦* fúzní protein Ret/lgG připojený k sefaróze s proteinem A (Protein-A Sepharose) . Po fúzi se získalo 316 klonů a testovalo se na schopnost vázat krysí fúzní proteiny Ret a/nebo lidské IgG v tesu ELISA. 11 klonů tvořilo protilátky, které se vázaly pouze na krysí' Ret/lgG (a krysí Ret/AP), ale ne na lidský IgG. Zkřížená reaktivita k lidskému Ret se testovala pomocí FACS, čtyři klony tvořily protilátky, které se mohly vázat na Ret-pozitivní lidskou buněčnou linii THP-1. Následující tabulka shrnuje vazebné vlastnosti k Ret dvanácti mcnoklonálních protilátek.

Klon	ELISA Krysí Reí/Ig	FACS lidský THP-1
AA.FF9.5	+	-
AA.HE3.7	+	+
AF.E9.5	+	-
BA.Bl.16	+	-
BB.B6	+	-
AA.GE7.3	+	-
CD.F1I.2	+	-
AH.E3.il	+	+
CD.G4.2		+
AG.E7.9		-
BD.G6	+	+
BH.G8	-	-

.1 v Μ < * * > 44 ♦

·.' · • · 4 4 4

4 4'·

I 4 4 ^J » »4 ¹

4« 4 4 4 1

1 »·» * *

6. Expresní knihovny cDNA

Připravili jsme knihovny cDNA z krysích embryonálních ledvin, jednu ve vektoru CDM9, který používá pro amplifikaci replikační počátek SV40, a jednu v modifikovaném vektoru InVitrogen pCEP4, který pro amplifikacei používá replikační počátek EBV. Modifikovaný vektor CH269 má odstraněnou genovou sekvenci EBNA-1. Protein EBNA-1 ínteraguje s replikačním počátkem EBV, ale tento gen není ve vektoru potřebný, když jsou použity buňky, které trvale exprimují protein EBNA. Knihovna ve vektoru CDM8 obsahuje l,5xl0⁶ klonů s průměrnou velikostí inzertu 1,18 kb, zatímco knihovna ve vektoru CH269 obsahuje přibližně lxlO⁵ klonů s průměrnou velikostí inzertu 1,5 kb.

Expresní klonování RetLl, ligandu Ret

A. Klonování krysího RetLl, Ret ligandu

1. Počáteční pokusy expresního klonování Ret ligandu RetLl

Pro klonování retLl bylo vyzkoušeno několik metod přímé exprese. Všechny tyto metody jsou založeny na myšlence ilustrované na obr. 4B. CDNA z knihovny cDNA jsou vloženy do savčích buněk, bunňky obsahující RetLl je pak možné identifikovat pomocí fúzních proteinů Ret. Ačkoliv tři dále popsané metody nebyly úspěšné, pomohly k získání zkušeností a důležitých znalostí, které vedly k úspěchu při použití další metody.

A) Metoda „rýžování pomocí Ret/IgG

Krysí fúzní protein Ret/IgG byl použit v pokusu o izolaci RetLl pomocí přímého expresního klonování metodou „rýžování (Aruffo a Seed, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:

8753-8757, 1987). Pro tento pokus byla užita CDM8 knihovna cDNA z krysích 18denních embryonálních jater. Soubory (tzv. pool) cDNA z této knihovny (5000 až 10 000 cDNA- v jednom souboru) byly vneseny do COS buněk DEAE-dextranovou metodou. Po 48 hodinách se buňky odstranily z misek s EDTA, inkubovaly se s fúzním proteinem a pak se rozetřely na misky pokryté anti-lidskou protilátkou IgGl. Z buněk, které se .přichytily, _t se izolovala DNA, zpětně se transformovala do E. coli a pak « se znovu izolovala ve druhém kole „rýžováni. Po třetím kole „rýžování nebyly vidět už žádné buňky a po transformaci ‘ Hirtovy frakce DNA zpět do E. coli lze pozorovat jen několik málo klonů. VCAM cDNA, konjugovaná s monoklonální protilátkou anti-VCAM, použitá jako pozitivní kontrola, se mohla ředit až

1:100 a stále se dala detekovat, což ukazuje, že použité soubory byly asi moc velké. Analýza několika klonů získaných po druhém kole „rýžování ukazuje, že v klonech dochází k reorganizaci a delecím.

B) Preparativní použití FACS s Ret/IgG i 80 000 klonů z knihovny cDNA z krysích 18denních embryonálních jater (vektor CDM8) bylo vneseno do buněk COS7 a pak analyzováno prparativně pomocí FACS s využitím proteinu t

Ret/IgG z krysy následováného druhou protilátkou označenou fluorescenční značkou. Vrcholy 0,5 % a 0,9 % fluoreskujících buněk byly odebrány a DNA z nich byla izolována Hirtovou * lyží. Elektroporací pak byla DNA vnesena zpět do E. coli, čímž bylo získáno 228 klonů pro 0,5 % soubor a 752 klonů pro ’ 0,9¾ soubor. Z klonů byla získána DNA a pak podrobena druhému kolu preparativní analýzy FACS. Plazmidy získané z bakteriálních klonů na konci druhého kola byly analyzovány, ale bylo zjištěno, že obsahují velké genové reorganizace a delece.

· »· • · ♦ 4 • · * « ·« · ·♦·

C) Kolorimetrická detekční metoda s Ret/AP

Buňky COS byly transfekovány 400 soubory cDNA klonů (1000 klonů v každém souboru) z knihovny cDNA z krysích 18denních embryonálních jater (vektor CDM8) a pak byly buňky obarveny pomocí proteinu Ret/AP a kolorimetrickým substrátem pro alkalickou fosfatázu. Transfekované buňky se pak vyšetřovaly pod mikroskopem na pozitivní signál. V jednom pokusu bylo nalezeno 5 potenciálně pozitivních buněk, ale při opakované analýze byly negativní.

Jako kontrola k proteinu Ret/AP byl připraven protein VCAM/AP fúzí prvních dvou domén lidské VCAM k N-konci AP z placenty (VCAM se váže k integrinu VLA4, který je složen ze dvou řetězců, a sice alfa-4 a beta-1) . Přechodná transfekce COS buněk poskytla dostatek proteinu VCAM/AP pro kontrolní pokusy. Protein VCAM/AP se porovnal s VCAM/IgG přímo navázaným na AP, a také s VCAM/IgG se sekundární protilátkou s navázanou AP, aby se vyhodnotila jejich schopnost detekovat VLA4 na COS buňkách transfekovaných alfa-4 řetězcem cDNA (COS' již exprimují řetězec beta-1). Výsledky ukazují, že zatímco protein VCAM/AP může detekovat VLA4 na transfekovaných buňkách, nej lepší detekci umožňuje protein VCAM/IgG v kombinaci se sekundární protilátkou s navázanou AP.

D) Metodologické závěry.

Hlavní závěry vyplývající z těchto úvodních klonovacích pokusů jsou následující:

1) Metody, které vyžadují, aby se plazmidy znovu izolovaly pro následující kolo („rýžování nebo preparativní FACS) nejsou vhodné pokud je hledané cDNA málo, protože během těchto metod se objevují genové reorganizace a delece. Vzhledem k nízké úrovni exprese Ret je opodstatněné se * »»· · · ♦ * a · · · · »« ··· ··· »»·*«* · ·

,., ,, ,. ... .« ·» domnívat, že exprese RetLl je také nízká. Výhodný způsob je transfekovat pomocí souborů a pak užít takovou metodu, která dovoluje detekovat pozitivní soubor. Původní soubor pak může být rozdělen, aniž by se izolovala přechodně exprimovaná DNA z transfekovaných buněk.

2) Protein Ret/ígG má, pokud je navázán na sekundární reagens, lepší detekční schopnost než protein Ret/AP.

3) Kontrolní pokusy s kontrolním proteinem VCAM/IgG (a sekundární protilátkou s navázanou AP) a cDNA pro integrin alfa-4 (vloženou do vektoru CDM8 a transfekovanou do buněk COS) ukazují, že detekční možnosti jsou asi jedna ku tisíci (tzn. Že velikost souboru nemůže přesahovat 1000 klonů). Abychom dosáhli zlepšené úrovně citlivosti, změnili jsme vektor založený na SV40 (exprimovaný v COS buňkách) na vektor založený na EBV (exprimovaný v buněčných liniích pozitivních, na EBNA) . Vektroy založené na EBV se udržují jako epizomy a nejsou pro buňky tak toxické jako vektory založené na SV40 po namnožení. Existují významné důkazy, že geny mohou být těmito vektory exprimovány ve vyšší hladině a že cDNA může mnohem víc ředěna (tj. až 1:80 000) a je stále možné ji detekovat.

2. Screening souborů z knihovny cDNA založené na EBV

Soubory klonů z cDNA knihovny z krysích 18denních embryonálních ledvin (vektor CH269 odvozený z EBV) byly podrobeny screeningu s fúzním proteinem Ret/ígG. V jednom pokusu vzniklo 256 souborů, z nichž každý obsahoval 5000 klonů z knihovny. Stručně řečeno, alikvotní díl z knihovny cDNA se titroval, 5000 buněk se vyselo (256x) a nechaly se narůst přes noc. Kolonie pak byly setřeny do média, část kultury byly použita k vytvoření glycerolového zásobního •ίΐ * • * a

Itt · · • 4 · •44 ·»· roztoku každého souboru (byly uloženy v -70 °C) a část byla použita k izolaci plazmidu. DNA z 256 souborů se jednotlivě transfekovalo do buněk EBNA293 (8xl0⁵ buněk na 60mm misce) lipofectinovou metodou. Po 48 hodinách se buňky opláchly dvakrát pufrem HBHA (0,5 mg/ml BSA, 0,1% NaN₃, 20mM HEPES, pH 7,0) a inkubovaly se s 20 pg/ml krysího proteinu Ret/lgG v pufrovaném solném roztoku s lmM MgCl₂ a .CaCl₂ asi 60 až 90 minut při teplotě místnosti. Po této inkubaci byly buňky 4x opláchnuty v HBHA pufru a pak 30 sekund fixovány roztokem 60% aceton/3% formaldehyd/20mM HEPES (pH 7,0). Po dvou promytích v pufru HBS (150mM NaCl, 20mM HEPES, pH 7,0, byly buňky inkubovány se sekundární protilátkou s navázanou AP (kozí anti-lidský IgG F(ab')2 specifický pro Fc-gama · (Jackson Immuno Research Laboratories, katalog. Č. 109-056-098, ředění 1:5000 v solném roztoku pufrovaném fosfátem s lmM MgCl? a CaCl₂) po 60 minut při teplotě místnosti. Buňky pak byly promytv dvakrát v HBS pufru a dvakrát substrátovým pufrem pro AP (100mM Tris-HCl, pH 9,5, lOOmM NaCl, 5mM MgCl₂) obsahujícím 2x supresor fosfatázy Immuno Pure© (Pierce,' katalog, č. 35002), Poslední lázeň byly ponechána 15 minut. Substráty AP NBT (0,33 mg/ml) a BCIP (0,17 mg/ml) byly přidány v AP substrátovém pufru obsahujícím AP inhibitor (Pierce) a byly inkubovány s buňkami po 5 až 20 minut. Destičky pak byly opláchnuty dvakrát vodou. Pak byly destičky vyšetřovány pod mikroskopem na přítomnost purpurově zbarvených buněk.

Analýzou 256 souborů bylo nalezeno 17 pozitivních souborů v průběhu primárního screeningu. DNA z každého pozitivního souboru byla znovu transfekována do buněk celý postup se znovu opakoval

293/EBNA a dodatečnými kontrolními pokusy pro potvrzení s dalšími toho, že pozorované., obarvení je specifické pro Ret/igG, 10 ze 17 * · * « ··· ··· *···* · ·. · * «· ·»·, ·» »· pozitivních souborů vykazovalo barvení pouze s fúzním proteinem Ret/IgG, ale nikoliv s jinými fúzními proteiny IgG.

3. Rozdělení souboru č. 230

Jako příklad byl jeden z výše popsaných pozitivních souborů, označený č. 230, rozdělen na menší podsoubory, aby bylo možné v rámci souboru identifikovat cDNA, která zodpovídá za vazbu k fúznímu proteinu Rett/IgG. 600 buněk z glycerolového zásobního roztoku souboru č. 230 bylo vyseto (lOx) a pěstováno přes noc. Kolonie z těchto misek byly setřeny do média: jedna desetina kultury byly použita k přípravě glycerolového zásobního roztoku a zbylá část byla použita pro izolaci DNA. Těchto 10 podsouborů- bylo označeno 230-1A až 230-5A a 230-1B až 230-5B. DNA z těchto podsouborů byla transfekována do buněk 293/EBNA a byl .opakován celý postup barvení pomocí fúzního proteinu Ret/IgG popsaný dříve. Jeden podsoubor č. 230-5A byl pozitivní při barvení na protein Ret/IgG.

Podsoubor č. 230-5A byl ještě dále rozdělen, aby bylo možné ještě v rámci podsouborů identifikovat cDNA, která zodpovídá za vazbu k fúznímu proteinu Ret/IgG. Buňky z glycerolového zásobního roztoku souboru č. / 230-5A byly vysety a pěstovány přes noc. Kolonie byly sebrány do jamek sedmi 96jamkových destiček zařízení Bioblock® a pěstovány přes noc. Z každých 96 jamek v zařízení Bioblock® byly vytvořeny 4 soubory po 20 klonech a jeden soubor s 16 klony. Takže ze sedmi zařízení Bioblock® bylo vytvořeno celkem 35 souborů označených 230-5A-71 až 230-5A-105. Z každého souboru byly izolována DNA a transfekována do buněk 293/EBNA a znovu testována s fúzním porteinem Ret/IgG, jak již byio dříve popsáno. Soubor č. 230-5A-86 byl pozitivní.

• · * ·»« ··* • ♦ ·« ·*

Soubor č. 230-5A-86 byl rozdělen a bylo identifikováno všech 20 klonů, které byly při vytváření tohoto souboru smíchány. Z každého z těchto dvaceti klonů byla izolována DNA a jednotlivě transfekována do buněk 293/EBNA a znovu testována s fúzním proteinem Ret/IgG, jak již bylo dříve popsáno. Soubor č. 230-5A-86-17 byl pozitivní.

4. Charakterizace klonu č. 230-5A-36-17

Klon č. 230-5A-86-17 (zvaný též retL-1'7 nebo klon 17, deponovaný jako č. ATCC 98047) byl dále analyzován sekvencováním DNA. Celá nukleotidová sekvence inzertu tohoto klonu je zde uvedena jako sekvence id. č. 1 (krysí cDNA retLl), a část nukleotidové sekvence je také ukázána na obr. 1. V této sekvenci byl nalezen čtecí rámec kódující protein složený z 468 aminokyselin (krysí RetLl). Předpovězený protein má signální sekvenci s předvídaným štěpným místem po 24. aminokyselině (Von Heijne et al., Nucl. Acid. Res. 14: 14583, 1986) . Hydrofobní C-konec ukazuje, že protein by mohl být navázán na buňku prostřednictvím fosfatidylinositolglykanové vazby. Jsou zde předpovězena tři N-glykosylační místa. Tyto vlastnosti odpovídají tomu, co se dá pro ligand proteinu Ret očekávat.

Rozpustné formy krysího proteinu RetLl je možné exprimovat tak, že se gen zkrátí před hydrofobním C-koncem. Např. by se to mohlo udělat zkrácením za lysinem 435 (v krysím RetLl). Zkrácení proti směru transkripce od této aminokyseliny může vést k expresi rozpustné formy krysího proteinu RetLl. Rozpustný krysí protein může být exprimován buď sám nebo jako část fúzního proteinu s lidským imunoglobulínem, histidinovou značkou nebo malým epitopem, který je rozpoznáván protilátkou.

·» . » · ·« t · ·

1' * · • · ·

»· β · » ♦ » · ♦ ··· »· «

tet • »

B. Klonování lidského RetLl, ligandu Ret

Knihovna cDNA z lidských embryonálních ledvin ve vektoru lambda gtlO byla získána od firmy Clontech (katalog. Č. HL5004A). Jeden milion jednotek tvořících plaky ze zásobního roztoku byl vyset na misky 10 Nunc™. Byly vytvořeny otisky plaků v duplikátu na filtry Opitran™ firmy Schleicher and Shuell. Sonda byla vytvořena nastěpením piazmidu nesoucího krysí retLl restrikčním enzymem PvuII, po kterém následovala izolace fragmentu velikosti 1,34 kb z agarózového gelu, a tento fragmnet odpovídal nukleotidům 242 až 1582 sekvence krysího RetL (krysí cDNA retLl) . Tato sonda z kódujícího úseku byla označena pomocí ³²P za pomoci náhodných primerů (Feinberg a Vogelstein, Anal. Biochem. 137: 266-267, 1984}. Filtry byly hybridizovány přes noc při 55 °C ve 300-ml pufru pro screening plaků PSB (50mM Tris pH 7,5, 1M NaCl, 0,1% pyrofosforečnan sodný, 0,2% PVP a 0,2% Ficoll) obsahujícím 10% dextransulfát, 100 pg/ml tRNA a 6,7xl0⁷ cpm krysí sondy. Pak byly filtry dvakrát opláchnuty v pufru PSB a dvakrát ve 2xSSC/l%SDS při 55 °C a film byl exponován při. teplotě -70 °C s intenzifikačním stínítkem.

Duplikáty pozitivních plaků byly přeneseny do média SM (100 mM NaCl, lOmM SO<, 50mM Tris pH 7,5) se želatinou. 24 z těchto pozitivních plaků bylo purifikováno. Lambda DNA získaná minipreparací z těchto vybraných plaků byla štěpena Notl, rozdělena elektroforézou na 1% agaróze a pak analyzována Southernovým přenosem. V Southernově hybridizaci byla použita sonda kódujícího úseku krysího RetLl. Klon HRL20 měl nejdelší inzert (4,4 kb), který hybridizoval intenzivně s krysí sondou. Sekvence DNA (částečná cDNA lidského retLl, sekvence id. č. 8, obr, 2A) a dedukovaná sekvence peptidu (částečná sekvence lidského RetLl, sekvence id. č. 9, obr. 2A) byly získány z tohoto klonu, což potvrzuje, že se * ·♦ «·' « · * *· «I « · · • » · *·· *« ·· » * • · « · • · *« »· • » * · * · · ·«· ··♦' • · «♦ 9 9 jedná o lidský homolog. Tento klon obsahuje většinu kódujícího úseku včetně 3'-konce kódujícího úseku.

Pro přípravu 5'-konce lidské cDNA byla získána souprava cDNA z lidských fetálních ledvin Marathon-Ready™ (Clontech, katalog, č. 7423-1). Antisense nukleotidy (tj . nukleotidy s orientací proti smyslu normální transkripce) Kid-155, odpovídající komplemetární sekvenci k nukleotidům 62 až 81 sekvence id. č. 8 (částečná cDNA lidského retLl), a Kid-154, odpovídající nukleotidů 17 až 43 sekvence id. č. 8 (částečná cDNA lidského retLl) byly syntetizovány. PCR byla provedena pomocí soupravy Advantage™ cDNA PCR (Clontech katalog, č. 8417-1) kombinované s některými činidly ze soupravy Marathon™ cDNA a pomocí oligonukleotídů Kid-155 a Kid-154. První reakce PCR byla sestavena následovně: 35,5 μΐ H₂0, 5,0 μΐ lOx pufr pro enzym Klen Taq, 1,0 μΐ směsi lOmM dNTP, 1,0 μΐ 50x směs polymeráz Klen Taq Advantage¹”. Tyto reagencie byly smíchány a směs promíchána. Pak bylo přidáno 5,0 μΐ cDNA z fetálních jater Marathon-Ready™, 1,0 μΐ 10 μΜ primeru API a 1,5 μΐ 6,4 μΜ Kid-155 (celkový objem reakce 50 μΐ). PCR byla provedena v cyklovacím termostatu Perkin-Elmer Cetus DNA Cycler 480 s následujícím nastavením cyklů: 1 cyklus 94 °C po 1 minutu, 30 cyklů 94 °C po 30 sekund, 55 °C 30 sekund, 68 °C po 4 minuty. S produktem první PCR byla následně provedena „hnízdová PCR (nested PCR). Nejdříve bylo 5 μΐ produktu z první reakce naředěno 50 x v TE (celkový objem 250 μΐ). Hnízdová PCR obsahovala 35,5 μΐ H₂O, 5,0 μΐ 10x pufr pro enzym Klen Taq, 1,0' μΐ směsi IQrrM dNTP, 1,0 μΐ 50x směs polymeráz Klen Taq Advantage™. Reagencie byly smíchány stejně jak bylo popsáno pro předchozí reakci, pak bylo přidáno 5 μΐ naředěného produktu první reakce, 1,0 μΐ 10 μΜ primeru AP2 a 1,5 μΐ 6,9 μΜ primeru Kid-154. Podmínky cyklování byly stejné jak bylo již popsáno v předchozí reakci. Výsledný

Ví » I • ·♦ ♦·

9 9 9 «

9 9 · 9 •l 9 999 999 9 9 9 ·· 99 99 produkt přibližně velikosti 700 bp byl purifikován v 1% agaróze s nízkým bodem tání a extrahován fenolem. Purifikovaná DNA byla klonována do místa EcoRV plazmidu pZErO™ (Invitrogen, katalog, č. K2510-01). Z opakovaných izolací, obsahujícíh klony HRL7G6 a HRL7G3, byla získána informace o sekvenci.

Sekvence získaná z klonu HRL7G8 se částečně překrývá se sekvencí z klonu HRL20 (částečná cDNA lidského retLl) a byla proto použita k vytvoření úplného lidského RetLl (cDNA plné délky lidského RetLl), jak je ukázáno na obr. 2B. Nukleotidová sekvence získaná z klonu HRL7G8 představuje nukleotidy 1 až 520 z úplné cDNA RetLl, zatímco sekvence klonu HRL20 představuje nukleotidy 460 až 1682 z úplné lidské cDNA RetLl. Sekvence získaná z klonu HRL7G8 byla ještě potvrzena sekvencováním jiného, klonu cDNA (GJ102) izolovaného z knihovny cDNA z lidských embryonálních ledvin ve 'vektoru lambda gtlO, která již byla popsána výše, pomocí sondy odvozené z klonu HRL7G6. Nukleotidy 118 až 1497 obsahují proteinový čtecí rámec úplné cDNA pro lidský RetLl.

Úplná sekvence aminokyselin lidského RetLl je ukázána na obr. 2B. Jak ukázala analýza BESTFIT uvedená na obr. 3A, lidská cDNA retLl je z 88,2 % identická s krysí cDNA retLl. Srovnání peptidů (obr. 3B) ukazuje, že předpokládaná lidská proteinová sekvence je z 93,3 % identická a z 97,2 % podobná, s krysí sekvencí.

Klonování ligandu RetL2

A. Klonování lidského RetL2

Peptidová sekvence krysího RetLl byla použita k prohledávání databáze GenBank pomocí programu BLAST, aby se identifikovaly příbuzné proteiny (tj. isology). Program BLAST ♦ 4 • 44 • · 9 Ο • · · *ή ♦ · * 4 4 • · 4 49 ··

4 · 4 ♦ 4 4 4 *4« 4·'*^: ·

4 4 (Basic Local Alignment Search Tool) používá metodu, kterou publikovali Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990), k vyhledávání podobnosti mezi požadovanou sekvencí a všemi sekvencemi v databázi. Požadovaná sekvence a sekvence v prohledávané databázi mohou být buď peptidové nebo nukleotidové sekvence v libovolné kombinaci. Když byla peptidové sekvence krysího RetLl porovnávána s nukleotidovou databází klonů EST, byly nalezeny dvě významné shody. Jeden klon byl klon vedený v GenBank pod číslem R02249, což je EST klon velikosti 229 bp z kombinované knihovny cDNA z lidských fetálních jater a sleziny, a druhý byl klon GenBank č. H12981, což byl EST klon velikosti 521 bp ž knihovny cDNA z lidského dětského mozku. Oba EST klony sdílejí 99% identitu v překrývající se oblasti, což ukazuje, že jsou ze stejné cDNA. 2 EST klonu H12981 byly vytvořeny oligonuleotidy KID-228 (GAA TGA CAA CTG CAA GAA GAA GCT GCG CTC CTC, odpovídající nukleotidům 38 až 67, a také nukleotidům 534 až 563 sekvence id. č. 12) a antisense nukleotid KID-229 (GTG TAC TCG CTG GGC ACC CG, odpovídající komplementární sekvenci k nukleotidům 156 až 175, a také komplemetární sekvenci k nukleotidům 652 až 671 sekvence id. č. 12}.

lxlO⁶ jednotek tvořících plaky z knihovny cDNA z lidských fetálních jater 5'-Stretch Plus Lambda GT10 (Clontech,katalog, č. HL5003a) bylo podrobeno screeningu na duplikátech na filtrech Optitran™. Filtry byly hybridizovány přes noc při 65 °C s oligonukleotidy KID-229 a KID-228 značenými ³²P ve 400 ml pufru pro screening plaků (50mM Tris pH 7,5, IM NaCl, 0,1% pyrofosforečnan sodný, 0,2% PVP a 0,2% Ficoll) obsahujícím 10% dextransulfát, 100 pg/ml tRNA 80 pmol každého značeného oligonuleoitidu. Pak byly filtry dvakrát opláchnuty 2xSSC/l%SDS a dvakrát v lxSSC/l%SDS a film byl exponován. 11 duplikátů· pozitivních plaků bylo-purifikováno.

« » » », · » · • ·Φ φ · » φ φ φ ♦ • I · · »J φ · - »·· · ··♦ ··· • •••»· φ · • φ' φ «· φφ φφφ. φφ φ*

DNA z každého z těchto klonů byla analyzována tak, že byla naštěpena restrikčním. enzymem; pak rozdělena elektroforézou a pak podrobena Southernovu přenosu. Filtry pak byly hybridizovány s KID-228 a KID-229 pro potvzení toho, že inzerty hybridizují se sondou. Inzert klonu DSW240 byl úplně sekvencován (lidský retL2, sekvence id. č..12) a je ukázán na obr. 7.

Nukleotidy 25 až 1416 obsahují proteinový čtecí rámec pro lidskou cDNA retL2, který kóduje protein z 464 aminokyselin (lidský RetL2, sekvence id. č. .13) a je ukázán na obr. 7. Jak ukázala analýza BESTFIT uvedená na obr. 8, lidský protein RetL2 je z 49,1 % identický a z 63 % podobný lidskému proteinu RetLl. Sdílí společně s RetLl hydrofóbní N-konec, což ukazuje na signální sekvenci, a také hydrofóbní C-konec, což ukazuje na fosfatidylinositolglykanový vazebný motiv. Kromě toho je konzervováno 30 cysteinových zbytků z 31 přítomných v každém proteinu.

B. Důkaz toho, že RetL2 je ligandem Ret

Ukázali jsme, že RetL2 je ligandem Ret tak, že buňky 293/EBNA byly transfekovány expresním plazmidem obsahujícím inzert klonu DSW240 a pak bylo ukázáno, že tyto buňky vážou rozpustný fúzní protein Ret/IgG.

Inzert DSW240 byl vyjmut pomocí Notl a klonován do expresního vektoru CH269 obsahujícího počátek EBV, který umožňuje expresi v EBNA pozitivních buněčných liniích. Bylo provedeno restrikční štěpení pro identifikaci klonů se správnou orientací. Z plazmidu se správnou orientací byla připravena DNA.

Plazmidové DNA (expresního plazmidu retL2, expresního plazmidu retLl jako pozitivní kontroly a expresního plazmidu obsahujícího nepříbuznou sekvenci jako negativní kontroly) » ·« #4 * » ·· • 4« 4 4 «·· * 4 4 ·

4·· 4 ♦ · 4 4 4 4

4 · ·ι 4 · · 4 ·*» ♦··

4 4 ··· 4 ·

444 44 ·· ··· ·· ♦· byly transfekovány do buněk 293/EBNA (8xl0⁵ buněk na 60mm misce) metodou s Lipofectinem. Po 48 hodinách byly buňky opláchnuty dvakrát v HBHA pufru (0,5 mg/ml BSA, 0,1% NaN₃, 20mM HEPES pH 7,0) a inkubovány s 20 pg/ml Ret/lgG v solném roztoku pufrovaném Tris s 1 mM MgCl2 a CaCl₂ po 60 až 90 minut při teplotě místnosti. Po této inkubaci byly buňky opláchnuty dvakrát v pufru HBHA a pak fixovány roztokem 60% aceton/3% formaidehyd/20mM HEPES (pH 7,0) po 30 sekund.· Po dvou opláchnutích HBS (150mM NaCl, 20 mM HEPES, pří 7,0) byly buňky inkubovány se sekundární protilátkou s navázanou AP (kozí protlidiský IgG F(ab)2 specifický pro Fc-gamma, Jackson Immuno Research Laboratories, katalog, č. 109-056-098, ředění 1:5000 v solném roztoku pufrovaném fosfátem s ImM MgCl₂a CaCl₂) po 60 minut při teplotě místnosti. Buňky pak byly dvakrát opláchnuty pufrem HBS a dvakrát substrátovým pufrem pro AP (lOOmM Tris-HCl, pH 9,5, lOOmM NaCl, 5mM MgCl₂) obsahujícím 2x supresor fosfatázy Immuno Pure® (Pierce, katalog, č. 35002). Poslední lázeň byla ponechána 15 minut. Substráty AP NBT (0,33 mg/ml) a BCIP (0,17 mg/ml) byly přidány v AP substrátovém pufru obsahujícím AP inhibitor (Pierce) a byly inkubovány s buňkami po 5 až 20 minut. Destičky pak byly opláchnuty dvakrát vodou. Pak byly destičky vyšetřovány pod mikroskopem na přítomnost purpurově zbarvených buněk. Přítomnost purpurově zbarvených buněk ukazuje na to, že fúzní protein Ret se navázal na buňky a že protein RetL2 je ligandem Ret. Purpurově zbarvené buňky byly pozorovány po transfekci expresním vektorem retLl, ale nikoliv po transfekci vektorem negativní kontroly.

t «4

« · ·· 44

Klonování ligandů RetL3

A. Myší RetL3

Prohledávání databáze EST pomocí aminokyselinové sekvence krysího RetLl vedlo k objevení dvou klonů EST .homologních s ligandy Ret. Jedná se o EST klony AA049894 a AA050083 (což je částečná myší cDNA „retL3, sekvence id. č. 14). Plazmidy obsahující tyto ESTT klony byly získány od firmy Genome Systems lne. (katalog, č. 475791 a 475497) jako bakteriální kultury očkované jehlou. Plazmidová DNA byla připravena z jednotlivých kolonií získaných po naočkování misek s médiem LB Amp. Celé inzerty z těchto plazmidú byly sekvencovány. Porovnání dvou sekvencí ukázalo, že AA049894, který obsahuje inzert velikosti 1,4 kb, je .obsažen v AA050083, který obsahuje inzert velikosti 1,9 kb. Translacesekvence DNA z AA050083 ukázala, že je zde souvislý otevřený čtecí rámec (ORF) od nukleotidu 205 po nukleotid 1412 (částečná myší RetL3, sekvence id. č. 15). Tento ORF měl 37,5¾ identitu s ORF krysího retrLl a 40,2% identitu s krysím retL2. Avšak tento otevřený čtecí rámec nekóduje Met nebo signální' sekvenci na 5'-konci. 'Byly prozkoumány čtecí 'rámce proti směru transkripce v tomto úseku a byl nalezen Met v kontextu Kozákovy konsensuální sekvence pro iniciaci translace a potenciální signální sekvence pro povrchovou expresi/sekreci. Tento ORF nesouvisí s rámcem ORF ležícím po směru transkripce, což ukazuje, ze klon EST AA050083 obsahuje na svém 5'-konci potenciální mutaci, jako např. inzerci, deleci, intron nebo artefakt vzniklý při klonování.

Aby se získal správná sekvence 5'-konce, bylo. použito soupravy Marathon RACE. Myší embryonální cDNA Marathon-Ready™ (katalog. č. 7458-1) a souprava Advantage™ (katalog, č. 8417-1) byly získány od firmy Clontech. Byly syntetizovány

«.Í*í»í!> -CiC '

C -Či

- Ě

C / , t$r C <

řjC.

antisense⁴^nukleotidy * Kid-366, 'odpovídající komplementární

reakce'¹ PCR byla sestavena’-^;následdvně :· 35/5 μΐ H20,' 5,0 μΐ í’Óx pufr pro enzym KlenTaq/ ^:1,Ό ²μ1-¹ směs i' lÓmM dNTP, 1,0 μΐ

50x směs polymeráz Klen Ťáq Advantagé™.- Tyto reagencie byly smíchány a směs' promíchána?'Pak bylo ‘.přidáno -5/0 μΐ cDNA

Marathon-Ready™ ' z' lldenního myšího embrya, 1,0 μΐ

ΙΟμΜ primeru API a 1,7 μΐ 5,88 ’μΜ ^rKid-366 (celkový.' objem reakce 50 μΐ) . PCR byla provedena-. v' cyklovacím termostatu PerkinEÍmer Cetus DNA Cycler 480 s následujícím nastavením cyklů: lcyklus 94 °C po 1 minutu, 5 cyklů 94 °C po 30 sekund, 72 °C po 4 minuty, 5 cyklů 94 °C po 30 sekund, 70 °C po 4 minuty, 25-cyklů 94 °C po 30 sekund, 68 °C po 4.-minutý. S produktem prvníPCR byla následně provedena „hnízdová'’' PCR. Nejdříve bylo 5 μΐ-produktu z první reákce naředěno 50’χ'v TE (celkový

--obj'em^-2-3θ’“μ1·)^ιί·?**Ηη^,ί zdová^PCR^obšáhovala **'*3575' '(ΙΓ^ΗοΟ, 5,0 ' μΐ 10x’ pufr pro ·ěnzym Klen- Tág',' Γ, 0 μΐ směsi’ 10mM' dNTP, 1,0 μΐ 50x’' směs- polymeráz Klen- Taq Advantagé™'.¹ Reagencie' byly ‘ 4·· 1 1 · . i ¹ »smíchaný stejne jak bylo ^popsáno pro předchozí reakci, pak bylo^J přidáno < 5 μΐ naředěného produktu první reakce, 1,0 μΐ ΙΟ^μΜ příměru'¹ AP2 a 3, 6 μΓ' 2,8 μΜ primeru Kid-365. Podmínky ’ * ř .·. .

cyklování- bylý stejné jak bylo již popsáno v předchozí reakci, výsledný produkt přibližně velikosti 665 bp byl purifikován v 1% agaróze s nízkým bodem tání a extrahován pomocí Qiaex II (Qiagen, katalog, č·. 20021). Purifikovaná DNA byla 'klonována' - do plazmidu * pNoTA/T7™ pomocí klonóvací soupravy PRIME PCR/- CLONĚR™’-¹ ‘(5p'ri'me-3Prime,· 'katalog'.' φ« ·· * · « · φφ φ « « φφφ «

Φ · I »» Φ ·

ΦΦ ** * · · * • · · ·

Φ«Φ *ΦΦ Φ Φ • « ·Φ

č. 1-725029). Z opakovaných izolací, obsahujících klony DSW252 a DSW253, byla zíkána informace o sekvenci.

Bylo zjištěno, že sekvence DSW252 se částečně překrývá se sekvencí id. č. 14 kromě dodatečného T přítomného v poloze mezi nukleotidy 252 a 253 sekvence id. č. 14. Tento T je přítomen v ostatních izolátech DSW251 a DSW253. Vložení této dodatečné baze upravuje otevřený čtecí rámec tak, že dostáváme jediný čtecí rámec velikosti 1191 bp (počítáno od prvního Met) kódující 397 aminokyselin. Tento ORF kóduje Met v kontextu s kanonickou konsensuální sekvencí (Kozák) iniciace translace a zahrnuje také signální sekvenci pro povrchovou expresi/sekrecí.

Pro získání myšího klonu plné délky, který by mohl být exprimován, byly purifikovány fragmentty Notl-BamHI velikosti 630 bp z DSW252 a BamHl-Notl velikosti 1308 bp z AA050083 a vloženy do expresního vektoru CH269 naštěpeného Notl. Ligační směs byla transformována do E. coli XLl-Blue (Stratgene, katalog. č. 200236). Pak byla provedena minipreparace plazmidové DNA z transformovaných bakterií pomocí Qiawell Ultra Minipreps. DNA pak byly analyzovány restrikčním štěpením a gelovou elektroforézou, aby se ověřila správná velikost a orientace inzertu. Konstrukt byl nazván DSW254. Inzert DSW254 byl úplně sekvenccván (myší retL3, sekvence id. č. 16) a byl potvrzen ORF, kódující protein z 397 aminokyselin (myší RetL3, sekvence id. č. 17) . Tyto sekvence jsou ukázány také na obr. 9. C-konec RetL3 je hydrofobní zdá se, že jde o fosfatidylinositolglykanový vazebný motiv.

B. Lidský RetL3

Aby byla nalezena vhodná tkáň jako zdroj pro klonování lidského RetL3, byl užit northernový přenos vzorků myších

Ci CC íC, ůcJ n r c čí co c; í cl C. C. O O Í í: C* O f.·’ f ( c» st í c..

O, c

ci c* (TCO¹

Cl c c c Cj í C. C cl c o c

o. ci c o í: g < <r,· c ϋ C ňc tkání pro stanovení expresního vzorce myšího RetL3. Ze všech zkoumaných tkání ^nejvyšší expresi RetL3 vykazovala srdeční

J . . i ·* >

tkáň. Knihovna cDNA z lidského dospělého srdce ve vektoru lambda gtlO byla získána ' od firmy Cldntech ' ‘(katalog.

* ¥' ” Ϊ *

č. HL3026a). Jeden milion jednotek tvořících plaky ze zásobního roztoku byl vyset ha misky 10 Nunc™. Byly vytvořeny otisky plaků v duplikátu na 'filtry’ Opitran™ fřrmy Schřeicher !,*· and Shuell.

Pomocí PCR' byla připřavěna sonda ^ls ^uprimery Kid-336 a Kid-367, odpovídající nukleotidům' 397 áž 420 sekvence AA050083. PCR byla sestavena tak, :že bylo 'smícháno následující: ΪΌ,Ο μΐ 10x 'pufr 'PFU, 2/0 μΓ směsi' IQmM dNTP, 72,1 μΐ H2O,' 3,1 μΐ 13; 2 pM'pr'imeřu Kid-367 a '6/8 μ15,88 μΜ 'Kid-366, 5 μΐ DNA AA050083 koncentrace Ό,ípg/pl a .2,0 μΐ PFU polymerázy koncentrace 2,5' ‘U/μΙ (Stratagene, katalog, č. 6Ό0154). * PCR byla provedena v cýklovacím 'termostatu Perkin^-Elmer Cetus DNA Cycleř 480 s “'následujíčím nastavením cyklů: ‘25 cyklů 94 °C po 1 minutu, 53 °c’po 1 minutu, 72 °C pó '4 minuty. Produkt PČR byl ‘£>ůrif ikován' extrakcí fenolem;, chloroformem'a' isoamylalkoholem v-^ť poměru“'‘50 : 49:1 a pak rozdělen- eléktroforé'zou há^gelů¹· z^ágaróžý^s^ňížkým**'Bodem tání, vyříznutý fragment byl následně’ puřifikován ' pomocí Qiaexír.' Tato’sonda pro kódující úsek byla značena ³²P metodou náhodných primerů (Feinberg a Vogelstein).

Filtry byly hybridizovány přes noc při 65°C ve 200 ml pufru pro screening plaků obsahujícím 10% dextransulfát, 100 pg/rnl tRNA a l,xl0^e cpm myší sondy. Pak byly filtry dvakrát opláchnuty 2xSSC/l%SDS á' dvakrát v lxSSC/l%SDS a film byl exponován při -70 °C s ' intenzifikačním stínítkem. DNA z duplikátů pozitivních plaků byla purifikována, Lambda DNA připravená minipreparací z každého z těchto plaků byla analyzována tak, že byla naštěpena restrikčnim enzymem EcoRI,

pak rozdělena elektroforézou na 1% agarózovém gelu a pak podrobena Southernovu přenosu. Filtry se Southernovým přenosem pak byly hybridizovány s myší. sondou. Klon GJ128, který obsahoval inzert velikosti 1,3 kb, hybridizoval intenzivně s myší sondou pro. kódující úsek. Sekvence DNA (částečná cDNA lidského retL3, sekvence id. č. 13) a dedukovaná peptidová sekvence, (částečná sekvence lidského RetL3, sekvence id. č. 19) byly získány z tohoto klonu a potvrdilo se tak, že se jedná o lidský homolog. Tento klon obsahuje většinu kódujícího úseku včetně 3'-konce kódujícího úseku.

Inzert velikosti 1,3 kb z GJ128 byl purifikován, označen ³²P a použit pro screeniong knihovny cDNA z lidského dospělého srdce (Clontech) pro získání klonu obsahujícího 5'-konec. Screeningem 2xl0⁶ plaků z této knihovny nebyly získány žádné klony obsahující 5'-konec. Northernové' analýzy' membrán s northernovým přenosem mRNA z lidských dospělých tkání (Clontech, katalog. č. 7760-1, 7759-1 a 7767-1) hybridizovaných se stejnou sondou podle protokolu dodaného výrobcem, ukázaly, že lidský RetL3 je nej silněji exprimovánve tkáni dospělé míchy, žaludku, srdce, pankreatu, tenkého střeva, tlustého střeva, prostaty a varlat. Knihovna cDNA z dospělé lidské míchy (Clontech, atalog. č. 5001a) byla podrobena screeningu s inzertem GJ128. 3 nezávislé klony byly purifikovány a nejdelší z nich, GJ135, byl sekvencován. Sekvence inzertu GJ135 se částečně překrývá s inzertem GJ128, což umožnilo vytvořit složenou sekvenci cDNA plné délky lidského retL3 (sekvence id. č. 20) a stanovit tak úplnou sekvenci lidského RetL3 (sekvence id. č. 21). Tyto sekvence jsou také ukázány na obr. 10. Lidský RetL3 je z 34,3 % identický s lidským RetLl a. z 34,9 % identický s lidským RetL2. Je také ze 76,8 % identický s myším RetL3.

• • 4 · * ·♦

Použití sloučenin podle vynálezu pro léčení

Nativní proteiny RetL a jejich varianty, protilátky anti-RetL, protilátky anti-Ret a fúzní proteiny s Ret a RetL se mohou použít pro léčení v situaci, kdy je třeba blokovat nebo aktivovat signální dráhu Ret, stimulovat růst ledvinných buněk neb neuronů nebo jejich přežívání v případě nemoci, při které jsou tyto buňky poškozeny anebo odumírají, nebo kde je třeba potlačit růst nebo usmrtit nežádoucí buňky jako jsou např. nádorové buňky exprimující Ret nebo RetL.

Obecně jsou sloučeniny podle vynálezu, které se váží na Ret a indukují dimerizaci a/nebo autofosforylaci Ret, užitečné pro stimulaci růstu nebo omezení poškození tkáně exprimující Ret. Sloučeniny podle vynálezu jsou užitečné pro stimulaci růstu ledvinové tkáně a/nebo přežívání, podporu funkce ledvin a minimalizaci poškození ledvinné tkáně po různých zraněních. Sloučeniny podle vynálezu jsou zvláště' výhodné pro léčení stavů, které zahrnují akutní selhání ledvin, akutní nefritidu, chronické selhání ledvin,’ nefrotický syndrom, poruchy ledvinných kanálků, transplantaci ledvin, toxické poškození, poškození hypoxií a úrazy. Nemoci ledvinných kanálků zahrnují jak dědičné, tak získané poruchy, jako je např. polycystická ledvina, cystické onemocnění dřeně a cystická (houbovitá) ledvina. Možný výčet však není takto omezen a může obsahovat i mnoho dalších poruch ledvin (viz. Harrisons Principles of Internal Medicine, 13. vydání, .1994, na kteroužto publikaci se tímto plně odkazuje).

Při jiných aplikacích lze geny a proteiny podle vynálezu použít při léčení stavů, kdy je třeba, aby neurony rostly nebo regenerovaly. Sem patří nervová degenerativní onemocnění jako je Alzheimerova nemoc, Parkinsonova nemoc, Huntingtonova choroba., Tourettův syndrom, amyotrofní • 4 4 4 4 4 · « » 4 « · » 444 ·44 • 4 4 4 4 4

4« 444 44 44 lateráiní skleróza a onemocnění motorických neuronů, a také demyelinizačni onemocnění je scierosis muitipiex, také bakteriální nemoci jako je meningitida, absces nebo empyem, virové choroby jako je myelopatie spojená s HIV, nebo prionová onemocnění včetně Creutzfeldt-Jakobovy nemoci. Patří sem také poruchy v důsledku poškození nervové tkáně, ať už neoplastickým působením nebo úrazem, a také cerebrovaskulární příhody, jako krvácení nebo embolie. Zejména sem také patří nemoci kraniálních nervů a míchy, včetně vrozených poruch a poruch v důsledku úrazu nebo zánětu a poruch cévní etiologie, jako jsou např. poruchy ovlivňující autonomní nervový systém. Také sem patří vývojové nervové poruchy jako je mentální retardace, autismus, fetální alkoholový syndrom,: Downův syndrom a cerebrální paresa. Sloučeniny podle vynálezu se také mohou použít pro léčení syndromů zahrnujících periferní nervový systém.’ K 'takovým poruchám patří poruch způsobené kterýmkoliv faktorem z dříve vyjmenovaných, a zejména Lymská nemoc, neuropathie spojená s HIV, polymyositís, svalová distrofie a myasthenia gravis.

Protilátky anti-RetL a fúzní proteiny Ret podle vynálezu, které se specificky váží na krysí protein RetLl, částečný lidský protein RetLl, úplný lidský protein RetLl, lidský RetL2, myší RetL3 nebo lidský RetL3, nebo fragmenty těchto proteinů, se mohou využít v mnoha metodách. Sloučeniny se mohou terapeuticky použít k blokování nebo inhibici signální dráhy receptoru Ret, např. pro blokování růstu nádorů, jejichž růst je závislý na signální dráze Ret. Tato agens Se také mohou fúzovat s detekovatelnými značkami, jako jsou např. látky zobrazitelné fluoroskopicky nebo radiograficky, a podávat subjektu, což umožní zobrazit tkáně, které exprimují RetL. Tato agens lze také navázat na látky, jako je např. křenová peroxidáza, kterou lze užít jako β β ·

imunohistochemické barvivo, které umožňuje vizualizaci buněk pozitivních na RettL v histologických preparátech. Specifické protilátky pro tento účel se mohou použít samotné, a místa kam se váží lze pak vizualizivat v sendvičovém testu použitím anti-imunoglobulinové protilátky s navázaným detekovatelným markérem. Specifické protilátky proti kterémukoliv RetL jsou užitečné v imunotestech pro kvantifikaci látky, pro kterou má daná protilátka specifičnost. Specifické protilátky proti RetL se také mohou navázat na pevnou fázi, jako např. mikroperly nebo misky, a pak využít k. odstranění ligandu z roztoku, buď s cílem vyčistit protein nebo ho odstranit z roztoku. Všechny tyto způsoby jsou v podstatě rutinou pro odborníka v imunologii. Další metody podle vynálezu zahrnují modulaci signální dráhy Ret-RetL tím, .že se na Ret naváže monoklonální protilátka anti-Ret. Efekt takového kontaktu mAb-Ret může být buď blokující nebo stimulující pro aktivaci signální dráhy Ret, v závislosti na vlastnostech interakce konkrétní monoklonální protilátky mAB s Ret. Některé mAb reagují s Ret jako agonisté, takové agonistické navázání vede ke spuštění dimerizace a autofosforylace Ret,.Jiné mAB působí jako antagonisté. Interakce Ret s antagonistickou mAb zabraňuje aktivaci signální dráhy Ret jinými RetL nebo kompiey obsahujícími Ret, které by jinak signální dráhu Ret aktivovaly.

se mohou použít ke zobrazení tkání, které exprimují Ret, nebo pro imunohistologické nebo preparativní metody popsané v předchozím textu pro protilátky RetL.

Fúzní proteiny obsahující RetL a/nebo protilátky antiRet se mohou použít ke speciálnímu . cílení protinádorové terapie proti nádorům exprimujícím Ret. takové nádory mohou zahrnovat několik nádorových fenotypů, které jsou spojeny ί;

s mutacemi v Ret (N. Engl. J. Med. 335: 943-951, 1966, Nátuře 367, 319-320, 1996, Trends in Genetics 12: 138-144, 1996). Terapeutická . intervence proti nádorům exprímujícim RetL využívá fúzní proteiny obsahující Ret a/nebo protilátku antiRet. Protilátka anti-Ret nebo anti-RetL může být sama účinná vzhledem k cytolýze závislé' na komplementu a protilátce zprostředkované doménou Fc. Takové hybridní ligandy a protilátky se mohou stát terapeuticky ještě účinnějšími pokud se použijí jako nosiče protinádorových léků, toxinů nebo cytocidních radionuklidů, jako je yttrium90. Cytotoxické efektorové buňky se mohou zacílit na nádorové buňky pomocí heterokonjugátů protilátek, kde protilátka specifická buď pro Ret nebo RetL exprimovaná nádorem je kovalentně navázána na protilátku namířenou proti povrchovému proteinu cytotoxické efektorové buňky jako jsou buňky NK nebo CTL.

Jedním příkladem protilátky anti-Ret nebo terapie pomocí Ret je konjugace toxického řetězce A ricinu nebo modifikované úplné formy ricinu (který se již nemůže vázat ne buňky) s RetL nebo protilátkou namířenou proti polypeptidu Ret, které jsou exprimovány na povrchu maligní buňky. V jiném provedení je toxin konjugovaný s Ret nebo protilátkou anti-RetL, aby selektivně zacílil a usmrtil RetL-pozitivní buňky, jako jsou např. nádorové buňky exprimující RetL. Takový přístup se osvědčil s blokovaným ricinem konjugovaným s monoklonální protilátkou proti antigenu CD19, který exprimuje většina nádorových buněk (Grossbard et al., Blood 79: 576, 1992). Ostatní toxiny jsou zrovna tak užitečné, jak je odborníkům známo. K takovým toxinům patří např. exotoxin pseudomonád, difterický toxin a saporin, přičemž možnosti nejsou omezeny pouze na tyto toxiny. Tento přístup by měl být dokonce mnohem účinnější při použití RetL nebo protilátky anti-RetL ve srovnání se 2námým využitím antigenu CD19, • a · · · * · · · • · 4 · « · » ··· *·· • · « r · · · protože Ret je exprimován pouze . ve velmi omezeném počtu tkání.

Výše uvedené přístupy využívající fúzi ricinu nebo jiného toxinu, jsou zrovna tak využitelné pro toxinové konjugéty RetL nebo protilátek anti-RetL, které jsou užitečné pro selektivní cílení a usmrcení Ret-pozitivních buněk, jako jsou nádorové buňky exprimujicí Ret.

Jiným přístupem v terapii je použití RetL nebo protilátek označených radioizotopem. Takové radioaktivně značené sloučeniny mohou výhodně směrovat radioaktivitu do míst nádorů exprimujících Ret, přičemž ušetří normální tkáň. V závislosti na použitém izotopu radiace emitovaná ze značené protilátky navázané na nádorovou buňku může usmrtit také sousední nádorové maligní buňky, které neexprimují Ret. Mohou být využity různé radionuklidy. .Izotopy, emitující β-částice (např. ^ljlI) byly úspěšně použity ve spojení s monoklonálními protilátkami proti CD20, který je přítomen na B-buňkách lymfomu (Kaminski et al., N. Engl. J. Med. 329: 459, 1993, Press et al·., N. Engl. J. Med. 329: 1219, 1993). Radionuklidy emitující částice β vytvářejí tumoricidní radioaktivitu na vzdálenost přesahující průměr několika buněk, což dovoluje zahubit i buňky, které nenesou antigen a eliminovat tak následky nehomogenního uložení protilátky nebo ligandu v nádoru.

Je také možné využít radionuklidů emitujících a-záření. Nízká dávka ozáření způsobená RetL nebo protilátkou anti-RetL značenou takovým radionuklidem může být terapeuticky účinnější než okamžité externí ozáření při konvenční radiační terapii. Nízké dávky ozáření mohou způsobovat apoptózu (tj. programovanou buněčnou smrt) v určitých buněčných liniích (Macklis et al., Radiat. Res. 130: 220, 1992, Macklis et al., Radipharm. 5: 339, 1992).

Sloučeniny podle vynálezu se podávají v terapeuticky účinném množství, což znamená takové množství sloučeniny, které vede k medicínsky žádoucímu výsledku nebo ovlivní zvláštní situaci, která má být ošetřena.

Termín „subjekt zde použitý znamená jakéhokoliv savce, kterému lze podat ligand Ret nebo gen Ret. Zvláště výhodnými subjekty pro použití vynálezu jsou lidé, ale také ostatní primáti, ovce, koně, dobytek, kozy, prasata, psi, kočky, králíci, morčata, křečci, piskomilové, krysy a myši, a také orgány, nádory a buňky pocházející z výše uvedených hostitelů.

Použití sloučenin podle vynálezu pro. genovou terapii

Geny RetL podle vynálezu se mohou zavést do poškozené tkáně, aby stimulovaly produkci RetL transfekovaných buněk, a k tomu, aby podporovaly růst a přežívání buněk, které exprimují Ret.

Ve' zvláštním provedení způsobu genové terapie se gen RetL zavede do vybrané cílové nervové tkáně nebo tkáně ledvin. RetL se pak stabilně exprimuje a stimuluje buňky pozitivní na receptory Ret k růstu, dělení a diferenciaci a/nebo podporuje přežíváni těchto buněk. Geny retL se mohou vložit do cílových buněk pomocí mnoha známých metod založených na použití buď virových nebo nevirových strategií.

Nevirové metody zahrnují elektroporaci, fúzi membrány s liposomy, bombardování mikroprojektily pokrytými DNA, inkubaci s precipitátem kalciumfosfát-DNA, transfekci zprostředkovanou DEAE-dextranem a také přímé mikroinjekce do jednotlivých buněk. Např. gen retL může být vnesen do buňky koprecipitací s kalciumfosfátem (Pillicer et al., Science 209: 1414-1422, 1980), mechanickou mikroinjekcí a/nebo bombardováním mikročásticemi (Anderson et al., Proč. Nati.

• 4

4β > « • 4

Acad. Sci. USA 77: 5399-5403, 1980), přenosem DNA. pomocí liposomů (např. transfekcí zprostředkovanou LIPOFECTINEM, Fefgner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 84: 471-477, 1987, GAo a Huang, Biochim, Biophys. Res. Comm. 179: 230-235,

1991) ,. transfekcí zprostředkovanou DEAE-dextranem, * elektroporací (Patent USA 4 956 288) nebo metodou užívající polyiysin, kde je DNA konjugována tak, že je přednostně * transportována do hepatocytů jater (Wolf et al., Science 247: 465-468, 1990, Curiel et al·., Human Gene Therapy 3: 147-154,

1992) .

ti

Cílové buňky mohou být transfekovány geny podle vynálezu přímým přenosem genů (viz např. Wolff et al·., Direct gene Transfer Into Moose Muscle In Vivo, Science 247, .1465-68, 1990. V mnoha případech však bude žádoucí přenos , ..^..zprostředkovaný vektorem,. , Kterákoliv vhodná metoda pro, vložení polynukleotidové sekvence do vektoru v oboru známá se může použít (viz. např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY, 1992, na obě publikace se tímto plně odkazujeme).

Aktivace promotoru může být tkáňově specifické nebo indukovatelná metabolickým produktem nebo podanou látkou.

.ií

K takovým promotorům/enhancerům (zesilovačům) patří např. nativní promotor RetL, časný promotor/enhancer cytomegaloviru (Karasuyama et al., J. Exp. Med. 169: 13, 1989), lidský » promotor beta-aktinu (Cunning et al., Proč. Nati. Acad. Sci.

USA 84; 4831, .1987, promotor indukovatelný glukokortikoidy přítomný dlouhých terminálních repeticích (LTR) myšího viru MMTV (Klessig et al., Mol. Cell. Biol. 4: 1354, 1984), sekvence dlouhých terminálních repetic viru Moloneyho myší leukémie (MuLV LTR) (Weiss et al., RNA Tumor Viruses, Cold • 4 - 4 · • 4 · 4 • · · 4 4 • 4 4 4 « · 4 4 · ·4 · 4 »

Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1985), promotor časného úseku SV40 (Bernoist a Chambon, Nátuře 290: 304, 1981, promotor viru Rousova sarkomu (RSV)(Yamamoto et al., Cell 22:

787, 19.80).., promotor thymidinkiná-zy z- viru· herpes simplex (HSV)(Wagner et al., Proč. Nati, Acad. Sci. USA 78: 1441, 1981) a promotor adenoviru (Yamada et al.,

Proč. Nati. Acad,. Sci. USA 82: 3567, 1985)přičemž možnosti nejsou omezeny pouze na tyto příklady.

Geny retL mohou být vneseny do buněk také specifickými virovými vektory určenými pro použití v systémech přenosu genů, které jsou již dobře zavedeny. Takové systémy popsali např. Madzak et al., J. Gen. Virol. 73: 1533-36, 1992 (papovav.irus SV40), Berkner et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 39-61, 1992 (adenovirus), Hofmann etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 10099-10103,,1.995 (bakulovi.ry)Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 25-38, 1992 (virus vaccinia), Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 97-123, 1992 (viry asociované s adenovirem), Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 67-93, 1992 (herpes simplex virus (HSV) a virus Epstein-Barrové (HBV)), Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24, 1992 (retrovirus), Mol. Cell. Biol. 4: 749-754, 1984

Miller ét al., Nátuře 357: 450-455, 1992

Anderson, Science 256: 808-813, 1992

Ausubel et al., Current Protocols in Moleculař

Biology, Greene Publishing Asociates, 1989, kapitoly 9.10 až 9.14, všechny tyto citace jsou součástí referencí).

Výhodné vektory jsou DNA viry, kam patří adenoviry (výhodně vektory založené na Ad-2 a Ad-5), bakuloviry, herpetické viry (výhodně vektory založené na herpes simplex viru) a parvoviry (výhodně vektory založené na defektních nebo neautoftomních parvovirech, výhodněji vektory založené na

Brandýopadhyay et al (retrovirus), (retrovirus), (retrovirus),

O ·«« · · · · · · «·«««* · * ··* *»· «·«*· · ·»« ·· ·· ··· *· ·· virech asociovaných s adenoviry, nejvýhodněji vektory založené na AAV-2). Pro další informace k této oblasti viz např. Ali et al., Gene Therapy 1: 367-384, 1994, patenty USA č. 4 797 368, 5 399 346 a také následující diskuse.

Výběr konkrétního vektorového systému pro přenos např. sekvence RetL, je závislý na řadě faktorů. Jedním důležitým faktorem je povaha populace cílových .buněk. Ačkoliv retrovirové vektory byly intenzivně zkoumány a jsou používány v mnoha aplikacích genové terapie, obecně nejsou vhodné pro infekci nedělících se buněk, a tak mohou být užitečné pro léčení nádorů, neboť se integrují a exprimují své geny pouze v replikujících se buňkách. Jsou také užitečné pro využití ex vivo, kde jsou velmi -atraktivní vzhledem k jejich stabilní integraci do· genomu hostitele. - * - '' *

Adenoviry ..jsou.·, DNA . viry eukaryot, které je ‘možně modifikovat tak, že účinně přenášejí terapeutické nebo reportérové transgeny do buněk mnoha různých typů. Adenoviry obecných typů 2 a 5 {Ad2 a Ad5), které způsobují respirační onemocnění lidí, byly nyní upraveny pro genovou terapii Duchennovy svalové dystrofie (DMD) a cystické fibrózy (CF) . Jak Ad2 tak Ad5 patří do podtřídy adenovirů, které nejsou spojeny s malignitami u lidí. Adenovirové vektory jsou schopné poskytnout extrémně vysokou úroveň přenosu genů prakticky do buněk všech typů, bez ohledu na jejich mitotické stadium. Vysoký titr viru (10ⁿ jednotek tvořících plak/ml) lze snadno získat v buňkách 293” (komplementační linie buněk lidských embryonálních ledvin transformovaných adenovirem,, ATCC CRL1573) a uchovávat v kryoprezervovaném stavu po dlouhou dobu bez znatelných ztrát. Účinnost tohoto systému v přenosu terapeutických transgenů in vivo pro komplementaci stavu genové neovnováhy byly demonstrovány pro různé nemoci na zvířecích modelech, viz např. Watanabe,Y., Atherosclerosos ·« »*

« · * • · · · ·· · *·· « ·

36. 261- 263, 1986, Tanzawa, K. et al., FEBS Letters 118 (1): 81-84, 1980, Golasten, J.L. et al., New Engl. J. Med. 309 (11983): 288-296, 1983, Ishibashi, S. et al., J. Clin. Invest. 92: 883-893, 1993 a Ishibashi, S. et al., J. Clin. Invest,93: 1889-1893, 1994, přičemž všechny uvedené citace jsou zahrnuty v referencích. Rekombinantní replikačně defektní adenovirus kódující cDNA pro transmembránový regulátor .cystické fibrózy (CTFR) byl skutečně schválen pro použití alespoň ve dvou klinických pokusech na lidské CF (Wilson, J., Nátuře 365: 691-692 (21. říjen 1993). Extenzivní zkušenost s živými adenovirovými vakcínamí užívanými v lidské populaci je dalším faktorem svědčícím o bezpečnosti rekombinantních adenovirů pro genovou terapii.

. Lidské, adenoviry obsahují genom- tvořený lineární dvouřetězcovou DNA . dlouhou . přibližně.... 36 .kb, která je rozdělena do 100 mapových jednotek (m.u.), každá o délce 360 bp. DNA obsahuje krátké terminální invertované repetice (ITR) na každém konci genomu, které jsou nezbytné pro replikaci virové DNA. Genové produkty jsou organizovány do časného (El až E4) a pozdního (LI až L5) úseku, v závislosti na tom, zda jsou geny exprimovány před nebo po iniciaci syntézy virové DNA (viz Horwitz, Virology, 2nd Ed., Fields, B.N. (ed), Raven Press Ltd., New York, 1990.

Rekombinantní replikačně defektní adenoviry první generace, které byly připraveny pro genovou terapii DMD a dalších dědičných onemocnění mají odstraněný celý úsek Ela a část úseku Elb. Replikačně defektní virus se množí v buňkách 293 obsahujících funkční adenovirový gen Ela, který poskytuje trans-púsobící produkt Ela. Viry s delecí El jsou schopny replikace a produkce infekčních částic v buňkách 293, které poskytují v trans genové produkty úsekú Ela a Elb. Výsledný virus je schopen infikovat buňky mnoha typů

I · ·

I · * «·· « a exprimovat vložený gen (za předpokladu že má svůj vlastní promotor), ale není schopem replikace v buňkách, které nemají DNA pro úsek El, pokud buňky nejsou infikovány obrovským nadbytkem infekčního viru. Adenoviry mají výhodu, že mají široké hostitelské spektrum, mohou infikovat klidové nebo diferencované buňky jako jsou např. neurony, a jsou v zásadě neonkogenní. Adenoviry se neintegrují do genomu hostitele, jelikož existují v buňce extrachromozomálně, je podstatně sníženo riziko inzerční mutageneze (Ali et al., supra, 373). Rekombinantní adenoviry (rAdV) tvoří velmi vysoké titry, virové částice jsou přiměřeně stabilní, úroveň exprese je vysoká a mohou infikovat široké spektrum buněk. Jejich přirozeným hostitelem jsou buňky epitelu dýchacích cest, takže jsou vhodné pro terapii plicní rakoviny.

Přenos genů zprostředkovaný bakuloviry má některé výhody. Přenos genů bakuloviry se může uskutečnit jak do replikující se tak i do nereplikuj ící se buňky, také do ledvinné buňky, a stejně tak do hepatocytů, nervových buněk, a buněk sleziny, kůže, a svalu. Bakulovirus se nereplikuje v savčích buňkách a není pro ně patogenní. Člověk postrádá protilátkay proti rekombiantním bakulovirům, které by mohly zabránit infekci. Navíc jsou bakuloviry schopny inkorporovat a přenášet velmi velké inzerty DNA.

Viry asociované s adenoviry (AAV) byly také využity jako vektory pro somatickou genovou terapii. AAV je malý virus s jednořetězcovou DNA (ssDNA) s jedoduše upořádaným genomem (4,7 kb), což z něho činí ideální substrát pro genové inženýrství. Dva otevřené čtecí rámce kódují série polypeptidů rep a cap. Polypeptidy rep (rep78,^> rep68, rep62 a rep40) se účastní replikace, uvolnění a integrace genomu AAV.

t noc

r. U Ci C t, c ti. € í:

ti c o c ť<ú <·<;-.. Ců C C f.

¢1 cfo c *-> -ct-Cj c*oř; c c oc: t*e ¹ Životní ' cyklus ‘ AAv -je' .'dvoufázový, '^skládá se z fáze latentní*'a lytické-V průběhu latentníi infekce' viriony AAV vstupují do’buňky -j akó . enka-psidovaná ssDNA*a -krátce nato’sě dostanou·· -'k¹'jádru,“ kde· ’s^re·-· s’sDNA•Jjstabilňě ¹ integruje do hostitelského chromozomu, aniž by k tomu bylo třeba dělení hostitelské'buňky. ·Bez přítomnosti pomocného viru integrovaný virus·¹ AÁV'-·'·-zůstává* laténtňí, i aléje’.^-schopen aktivace a uvolnění. iLytická' fázé životního cyklu *žačí'há^!,1 ^:· když· / buňka nesoucí próvirus.) ^;-AAV je· aktivována ' sekundární infekcí heřpeťickým'·’ virem-' nebo- ádenovirem, íkteré „.kódují pomocnou funkci, která· je využita' ?AAV jako pomoc pro . vytřízení • z.'hostitelského- chromozomu''(Garter, B;J., supra). Původní infikuj ící ,ssDNA' se rozvine -do dvoušroubovicové réplikační .formy (RF).^.DNA.. způsobem,.—který -je závislý..,na-rep.. -Uvolněnégenomv AAV’· jsou zabaleny do proteinové kapsidy (která má 'ikosahedrickóú symetrii a průměr asi 20 nm) a po buněčné lýze sé 'uvolňují- jako' infekční viriony, které obsahují genom buď '-ssDNA? nebo -ssDNA'.

AAV viry mají významný •potenciál pro genovou terapii. -Virové‘částice jsou. velmi stabilní a rekombi-nantní AAV ŮrAAV) mají -‘.vlastnosti· podobné /léčivům, jako to, že- se dají purifikovať- peletováním nebo⁷ pomoci pásů v gradientu ČsCl. Dále¹-jsou“¹ teplotně stabilní a mohou se lyofilizovat na prášek a- pak'·^vrehýdřátoVat, čímž' získají opět plnou aktivitu. Jejich DNA ' še Xštábilně integruje- do chromozomu hostitele, takže exprese jé dlouhodobá. Hostitelské spektrum je velmi široké a přitom - AAV'·' nezpůsobuje žádnou známou nemoc, takže rekombinanthívektory jsou zcela netoxické.

Po vložení 'do cílové buňky-může být daná sekvence identifikována konvenčními metodami^ jako je napřhybridizače nukíeových.-kýselin pomocí sond, které obsahují sekvence homologní-/kómpleiftentářní * k sekvencím genů· - vložených · do ·*···» ·· ··· ··· Φ Φ · Φ Φ · * · φφφ φφ «φ ΦΦ· ·· ·· vektoru. Jiným způsobem se může sekvence identifikovat tím, že je přítomna nebo nepřítomna funkce markerového genu (např. aktivita thymidinkinázy, rezistence k antibiotiku apod.) způsobená zavedením expresního vektoru do cílové buňky.

Formulace a podávání

Sloučeniny podle vynálezu se mohou podávat jakýmkoliv způsobem, který je z lékařského hlediska přijatelný. To zahrnuje např. injekce, např. intravenózní, intarvaskulární, intraarteriální, subkutánní, intramuskulární, do nádoru, intraperitoneálni, intraventrikulární nebo intraepidurální, nebo podávání perorální, nazáiní, oftalmické, rektální nebo topické. Systém pro kontinuální podávání je také specificky zahrnut v předkládaném vynálezu např. v podobě depotních injekcí nebo erodovatelných implantátů. Lokalizované podávání je zvláště vhodné, jako např. prostřednictvím katétru do jedné nebo více arterií, jako je např. renální arterie nebo céva zásobující lokalizovaný nádor.

Termín farmaceuticky přijatelný nosič znamená jednu nebo více organických nebo -anorganických látek, přírodních nebo syntetických, se kterými je mutovaný protoonkogen nebo mutovaný onkoprotein kombinován pro usnadnění aplikace. Vhodným nosičem je např, sterilní fyziologický roztok, ačkoliv odborníkovi je známa celá řada vodných i. nevodných izotonických sterilních roztoků a sterilních suspenzí farmaceuticky přijatelných. Termín nosič v tomto případě zahrnuje i liposomy a protein tat z HIV-1 (viz Chen et al., Anal. Biochem. 227: 168-175, 1995) a také jakýkoliv plazmidový nebo virový expresní vektor. Účinné množství znamená takové množství, které je schopné odstranit nebo zpomalit progresi nemoci nebo degenerativní stav či poškození. Účinné množství je možně stanovit individuálně • ** 4» * «· 44

4 4 · 4 44 4··· ·· 4 4 · 4444

4» 444 4 4 4 444444

444444 4 4

444 44 4· 4·4 44 44 a je zčásti založeno na zvážení symptomů, které je třeba léčit, a vyžadovaných výsledků. Účinné množství může odborník se znalostí těchto faktorů stanovit rutinním způsobem bez nepřiměřeného experimentování.

Liposomový systém může být jakýkoliv systém jednovrstevných váčků, mnohavrstevných váčků nebo stabilních několikavrstevných váčků, které se mohou připravit a podávat způsoby, které jsou odborníkovi dobře známy, např. jak se popisuje v patentech USA č. 5 169,637, 4 762 915, 5 000 958 nebo 5 185 154. Kromě toho se může ukázat potřeba exprimovat nové polypeptidy podle vynálezu a jiné vybrané polypeptidy jako lipoproteiny, aby se zvýšila jejich schopnost vázat se na liposomy. Tak například akutní lédvinné selhání člověka lze léčit in vivo RetL zabaleným v liposomů tak, že se tento RetL zavede do potřebných buněk pomocí liposomů. Liposomy se pak mohou podat renálním katétrem do renální arterie. Rekombinantní protein RetL se purifikuje, např. z buněk CHO imunoafinitní chromatografíí nebo jinou obvyklou metodou, pak se smíchá s liposomy a inkorporuje se .. do nich ^.s velkou ™— účinností. Obalený ' protein je možné testovat in vitro libovolným testem na stimulaci buněčného růstu.

Nový polypetid podle předkládaného vynálezu je možné také podat zvířeti pomocí liposomového systému, čímž se zvýší jeho stabilita a imunogeničnost. Podání nových polypetidů prostřednictvím liposomů je zvláště výhodné, protože liposomy jsou internalizovány fagocytujícími buňkami v ošetřovaném zvířeti. Takové buňky poté, co rozloží membránu liposomů presentují polypeptid imunitnímu systému ve spojení s dalšími molekulami, které jsou nutné k vyvolání silné imunitní odpovědi.

Kterýkoliv z nových polypeptidů podle předkládaného vynálezu může být použit ve formě farmaceuticky přijatelné v » • φ * φφφ φ φ φφ φφφ φφφ φφφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ • φ φφ φ

φ φ » φ φ I Φ Φ Φ b « φ ·

Φ·Φ ΦΦΦ Φ Φ

ΦΦ ·Φ soli. Vhodné kyseliny a zásady, které jsou schopné vytvářet soli s polypeptidy podle vynálezu jsou odborníkovi dobře známy a patří k nim jak organické tak i anorganické kyseliny a zásady.

Ačkoliv předkládaný vynález byl z důvodu jasnosti a lepšího pochopení podrobně popsán pomocí ilustrací a příkladů, odborníkovi je zřejmé, že v rámci vynálezecké myšlenky je možno provést jisté modifikace, předmět vynálezu je tudíž omezen pouze následujícími nároky.

1·* ď

·4 44 • 4 4 > » ♦

44 ♦ ·

4 4 » 4 ·

4 4 «4

444 >4 44 • 4 4 4 4 «

4 4 4 4

4 444 444 « 4 4

4*4 >4 4*

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1;

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3616 párů baží.

- - £B) TYP: nukleová kyselina , (C) TYP VLÁKNA: dvojité ...

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 257...1660 «4 *44 ·· » 4 4 · ·4 ··· (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1;

GCGGCCGCAG GTTGGGTCC-G AACTGAACCC CTGAAAGCGG GTCCGCCTCC CGCCCTCGCG ⁶⁰

CCCGCCCGGA TCTGAGTCGC TGGCGGCGGT GGGCGGCAGA GCGACGGGGA GTCTGCTCTC

120

ACCCTGGATG gagctgaact ttgagtgccc agaggagcgc agtcgcccgg ggatcgctgc 160 acgctgagct ctctccccga gaccgggcgg cggctttgga ttttgggggg gcggggacca

240

GCTGCGCGGC GGCACC ATG TTC CTA GCC ACT CTG TAC TTC GCG CTG CCA 269

Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro

1

5

10

'4.T -

337

CTC

CTG

GAT

TTG

CTG

ATG

TCC

GCC

GAG

GTG

AGT

GGT

GGA

GAC

CGT

CTG

Leu

Asp

Leu

Met

Ser

Ala

Glu

Val

Ser

Gly

Asp

Arg

Leu

15

20

25

GAC

TG?

GTG

AAA

GCC

AGC

GAT

CAG

TGC

CTG

AA.G

GAA

CAG

AGC

TGC

AGC

. '.3 65

Asp

Cys

Val

Lys

Ala

Ser

Asp

Gin

Cys

Leu

Lys

Glu'

Gin

Ser

Cys

Ser

30

35

40

ACC

AAG

TAC

CC-C

ACA

CTA

AGG

CA.G

TGC

GTG

C-CG

GGC

AAG

GAA

ACC

AAC

433

Thr

Lys

Tyr

Arg

Thr

Leu

Arg

Gin

Cys

Val

Ala

Gly

Lys

Glu

Thr

Asn

45

50

55

TTC

AGC

CTG

ACA

TCC

C-GC

CTT

GAG

C-CC

AAG

GAT

GAG

TGC

CGT

A.GC

C-CC

0

461

Phe

Ser

Leu

Thr

Ser

Gly

Leu

Glu

Ala

Lys

Asp

Glu

Cys

Arg

Ser

Ala

60

65

70

75

ATG

GAG

C-CC

TTG

A »

CAG

AAG

TGT

CTG

TAC-

AAC-

-TGC

CGC.

TGC.

AAG.

CC-S

,7'

529

»1

Met

Glu

Ala

Leu

Lvs

Gin

Lys

Ser-

Leu

Tyr

Asn

Cvs

Arg

Cys·

Lys

Arg

60

65

90

•

577

GGC

ATG

AAG

AAA

GAG

AAG

AAT

TGT

CTG

CGT

ATG

TAC

TGG

AGC

AŤG

TAC

Gly

Ker

Lys

Glu

Lys

Asn

Cys

Leu

Arg

Ile

Tyr

Trp

Ser

Met

Tyr

95

100

105

CAG

AGC

CTG

CAG

GGA

AAT

GAC

CTC

CTG

GAA

GAT

TCC

CCG

TAT

GAG

CCG

4 Ji

625

•

Gin

Ser

Leu

Gin

Gly

Asn

Asp

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro

110

115

120

GTT

AAC

AGC

AGG

TTG

TCA

GAT

ATA

TTC

CGG

GCA

GTC

CCG

TTC

ATA

TCA

-

673

Val

Asn

' Ser

Arg

Leu

Ser

Asp

Ile

Phe

Arg

Ala

Val

Pro

Phe

Ile

Ser

125

130

135

GAT

GTT

TTC

CAG

CAA

GTG

GAA

CAC

ATT

TCC

AAA

GGG

AAC

TGC

CTG

721

Asp

Val

Phe

Gin

Val

Glu

His

Ile

Ser

Lys

Gly

Asn

Cys

Leu

140

145

150

155

GAC

769

Asp

817

TCG

Ser

865

AAC

Asn

913

CCG

Pro

961

GCC

Ala

220

GAA

1009

Glu

ACC

1057

Thr

CAG 1105--------Gin

GAC

1153

Asp

AAC

1201

Asn

300

AGC

1249

Ser

GCA

GCC

AAG

GCC

TGC

AAC

CTG

GAC

ACC

TGT

AAG

TAC

AGG

Ala

Lys

Ala

Cys

A 5

Leu

Asp

Thr

cys

Lys

Tyr

Arg

160

165

170

GCC

TAC

ATC

ACC

CCC

TGC

ACC

AGC

ATG

TCC

AAC

GAG

GTC

TGC

Ala

Tyr

Ile

Thr

Pro

Cys

Thr

Ser

Ket

Ser

Asn

Glu

Val

Cys

175

180

185

CGC

CGT

AAG

TGC

CAC

AAG

GCC

CTC

AGG

CAG

TTC

GAC

AAG

GTT

Arg

Lys

cys

His

Lys

Ala

Leu

Arg

Gin

Phe

Asp

Lys

Val

ISO

195

200

GCC

AAG

CAC

AGC

TAC

GGG

ATG

CTC

TTC

TGC

TCC

TGC

CGG

GAC

ATC

Ala

Lys

His

Ser

Tyr

Gly

Ket

Leu

Phe

Cys

Ser

Cys

Arg

Asp

Ile

205

210

215

TGC

ACC

GAG

CGG

CGA

CAG

ACT

ATC

GTC

CCC

GTG

ŤGC

TCC

TAT

Cys

Thr

Glu

Arg

Gin

Thr

Ile

Val

Pro

Val

cys

Ser

Tyr

225

230

235

GAA

CGA

GAG

AGG

CCC

AAC

TGC

CTG

AGT

CTG

CAA

GAC

TCC

TGC

AAG

Glu

Arg

Glu

Are

Pro

Asn

cys

Leu

Ser

Leu

Gin

Asp

Ser

Cys

Lys

24 0

245

250

AAT

TAC

ATC

TGC

AGA

TCT

CGC

CTT

GCA

GAT

TTT

ACC.

AAC

TC-C

Asn

Tyr

Ile

cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Ala

Asp

Phe

Thr

Asn

Cys

2 55

2Ě0

265

CCA

GAG

TCA

AGG

TCT

GTC

AC-C

AAC

TGT

CTT

AAG

GAG

AAC

TAC

GCA

Pro

Glu

Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Asn

Cys

Leu

Lys

Glu

Asn

cyr

Ala

270

275

280

TGC

CTC

CTG

C-CC

TAC

TCG

C-GA

CTG

ATT

GGC

ACA

GTC

ATG

ACT

CCC

Cys

Leu

Ala

Tyr

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr

Val

Ket

Thr

Pro

2 S5

290

295

TAC

GTA

GAC

TGC

AGC

CTC

AGC

GTG

GCA

CCA

TGG

TGT

GAC

TC-C

Tyr

Val

Asp

Ser

Leu

Ser

Val

Ala

Pro

Trp

Cys

Asp

Cys

305

310

315

AAC

AGC

GGC

AAT

GAC

CTG

GAA

GAC

TGC

TTG

AAA

TTT

CTG

AAT

TTT

Asn

Ser

Gly

Asn

Asp

Leu

Glu

Asp

cys

Leu

Lys

Phe

Leu

Asn

Phe

320

325

330

TTT

AAG

GAC

AAT

ACT

TGT

CTC

AAA

AAT

GCA

ATT

CAA

GCC

TTT

GGC

AAT

Phe

Lys

Asp

Asn

Thr

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

Ile

Gin

Ala

Phe

Gly

Asn

335

340

345

GGC

TCA

GAT

GTG

ACC

ATG

TGG

CAG

CCA

GCC

CCT

CCA

GTC

CAG

ACC

Gly

Ser

Asp

Val

Thr

Ket

Trp

Gin

Pro

Ala

Pro

Val

Gin

Thr

350

355

350

• 4 · · * • * · · • ·· · ·

«4 ··

J

ACT 1393 Thr

GCC Ala 365

ACC Thr

AC? Thr

ACC Thr

ACT Thr

GCC TTC CGG GTC AAG AAC AAG

CCT CTG

GGg Gly

Ala 370

Phe Arg

Val

Lys.

Asn 375

Lys

Pro

Leu

CCA

GCA

GGG

GAG

» » fT, *

GAG

ATC

ccc

ACA

CAC

GTT

TTA

CCA

CCC

TGT

1441

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu

Asn

Glu

Ile

Pro

Thr

His

Val

Leu

Pro

Cys

380

385

390

395

GCG

AAT

TTG

CAG

GCT

CAG

AAG

CTG

»

TCC

AAT

GTG

TCG

GGT

AGC

ACA

14S9

Ala

Asn

Leu

Gin

Al a

Gin

Lys

Leu

Lys

Ser

Asn

Val

Ser

Gly

Ser

Thr

400

405

410

CAC

CTC

TGT

CTT

TCT

GAT

AGT

GAT

TTC

GGA

AAG

GAT

GGT

CTC

GCT

GGT

1537

His

Leu

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Asp

Phe

Gly

Lys

Asp

Gly

Leu

Ala

Gly

415

v

420

425

GCC

TCC

AGC

CAC

ATA

ACC

ACA

AAA

TCA

ATG

GCT

CCT

CCC

AGC

TGC

15S5

Ala

Ser

His

Tle

Thx

Thr

Lys

Ser

Met

Ala

Pro

Ser

Cys

430

435

440

AGT

CTG

AGC

TCA

CTG

CCG

GTG

CTG

ATG

CTC

ACC

GCC

CTT

GCT

GCC

CTG

1633

Ser

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Kec

Leu

Thr

Ala

Leu

Ala

Leu

445

450

455

TTA

TCT

GTA

TCG

TTG

C-CA

GAA

ACG

TCG

TAGCTGCATC CGGGAAAACA

1680

Leu

Ser

Val

Ser

Leu

Ala

Glu

Thr

Ser

460

465

' -

G TATG AAAAG 1740	ACAAA.AGAGA	ACC AA. GT A TT	CTGTCCCTGT	CCTCTTGTAT	ATCTGAAAAT
CCAGTTTTAA 1800	AAC-CTCCGTT	GAGAAGCAGT	TTCACCCAAC	TC-GAACTCTT	TCCTTGTTTT
TAAGAAAGCT 1860	TGTC-GCCCTC	AGGGGCTTCT	GTTGAAGAAC	TGCTACAGGG	CTAATTCCAA
AČCCATAAGG 1920 ‘	CTCTGGGGCG	TGGTGCGGCT	TAAGGGGACC	ATTTGCACCA	TGTAAAC-CAA
GCTGGGCT7A 1980	TCATGTGTT?	GATC-GTGAGG	ATGGTAGTGG	TGATGATC-AT	GGTAATTTTA
ACAGCTTGAA 2040	CCCTGTTCTC	TCTACTGGTT	AGGAACAGGA	GATACTATTG	ATAAAGATTC
TTCCATGTCT 2100	TACTCAGCAG	CATTGCCTTC	TGAAGACAGG	CCCGCAGCCT	AGTGTGAATG
ACAAGTGGAG 2160	GTTGGCCTCA	AGAGTGGACT	TGGCAGACTC	TACCTTGTAG	TAATGTTCAC
CTTTCCGTGT 2220	ATGGTCTCCA	CAGAGTGTTT	ATGTATTTAC	AGACTGTTCT	GTGATCCCCC
AACAACAACA	ACCACAAATT	CCTTGGTCAC	CTCCAAATGT	AACCGGTCCT	TTAGCCCAGT

2280

· »

i r r ···*·»·

DO ♦ h » * * * ·«· *· ·· ·** ·*

AGAGGAGGGT 2340	GGG7GTGGCC	CTGGCACAGC	TCCCGGATTG	TTGATGGGCA	CTCTCCTGAG
CTTTGCTTGA 2400	GTGAGAAGCT	GAATGTAGCT	GAAAATCAAC	TCTTCTTACA	CTTCT7ACTG
CTTCGTTCAC 2460	TTACGAGGTC	AC λ í r. i AC AA	CAAACATCAC	CAAC7ATTAG	CTTACCGTTA
GCTTCCCAAC 2520	TATTAGC77T	CTATGTTTTG	AAAGCAGTGT	TGCTGACCCC	ATG7TTTAAT
GATGGTTTAA 2580	TACATGCAGC	CCTTTCCTCT	CA7CGGTAAC	ACTAGCTCCA	ACATCAACTT
CATGCATGTG 2640	gctctcaaaa	GCAGGCCCCA	AGAAGCCCAG	TTCTTTAGGA	GAAAGCTGCG
TCCTGTTTCT 2700	GTGGACAGGC	AGGAGGAAAC	AGAGCAGCCT	GCCCGTGGTG	TCTTTATCTG
TTTTGAAATC 2760	AAGGCTGCCT	GTGTGTAAGG	AATGGTTCAA	TTCTTATAAA	GGGTGCCACT
GTTGATGCCA 2820	CAACTGGCAG	TTGGTCTAGC	TCCAGGACAC	CGGTTTCCAT	GTTGCCTGGC
AGAGACAGCT 2880	TTGATTC-GGA	CTC-GCTGGCC	ACAAGGGATG	GGATGAAGAT	GTGCTGCCCT
CŤCTTTCAAA 2940	GTTGAGCCCT	GCCAGGGCAC	ATAGAAGCAT	CTTTGCTCCT	GACCACAA.CG
TAGAACAGCT 3000	TGGATTCAAG	GTCATCAAGC	GTCTCCTGTA	CATTGCTCTG	TGACCTTCA7
AACAGACTGT 3 060·	CCCGCACAAA	AGG.AACGGCA	C-TTTATGGAT	CTAC-AGTGGG	AGCACAGGGT
. CTGGAAAGGT 3120	GAACCGATTG	GCAAAATACA	CAC-AACAC-GA	GGGAGAG7CT	CAAGCCGAGA
CATCTTGCTT 3180	ACTAGCCACA	CACCA7C7CC	TGGAGCCCTC	CTCCTGACCT	GGGCAGACCC
TTAGGTGTAT 3240	ATCTA.AAGAC	CTCTTCAATG	TTCAGGTTCA	GAATCTGTAA	ATGGTTGCGT
CCTGGCACCC 3300	ATTCCTGAAA	ACTGAACAAA	GGAGAGGATA	TCTTTCCTCC	ATTGAGCCCT
GAAAGTATGA 3360	CTGGCTTCTC	ACCCTCCCAC	AGAGCAGGGA	GCCCTGGTGC	ACACAGTGTC
CTGATATCCT 3420	CCCTGCTCTT	TGAGGTTTGC	CTTGGGAGAA	AATGATTCAC	CTCGGGAGGG
GACGCTTTGG 3480	TGTCTGAAGT	ACGTTTATAT	CGAAATGTTA	ATGAATACCC	ATGTAAAATA
CTCAATAGCC	ACCTTTCTTC	CCTTCACAAT	GTTTTCGAGG	GGAATGCATC	CAACATCCAA

GTGTACCTGG TCAGTGGGAA GTTCCATGAA GACTCATACA TTGAATAAAC ATATTCGATG

3540

3600 ···

TGCCGAAAGC GGCCGC

3616 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 468 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

•

Met Phe Leu 1

Ala

Thr 5

Leu

Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu

10

¹⁵

Met

Ser

Ala

Glu

Val

Ser

Gly

Asp

Arg

Leu

Asp

Cys

Val

Lys

Ala

20

25

30

•

Ser

Asp

Gin

Cys

Leu

Lys

Glu

Gin

Ser

Cys

Ser

Thr

Lys

Tyr

Arg

Thr

35

40

45

i

Leu

Arg

Gin

cys

Val

Ala

Gly

Lys

Glu

Thr

Asn

Phe

Ser

Leu

Thr

Ser

50

55

60

Gly

Leu

Glu

Ala

Lys

Asp

Glu

Cys

Arg

Ser

Ala

Met

Glu

Ala

Leu

Lys

65

70

75

60

Gin

Lys

Ser

Leu

Tyr

Asn

Cys

Arg

Cys

Lvs

Arg

Gly

Met

Lys

Lvs

Glu

65

90

Šs

Lys

Asn

Cys

Leu

Arg

Ile

Tyr

Trp

Ser

Met

Tyr

Gin

Ser

Leu

Gin

Gly

100

105

110

· w-

Asn

Asp

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro

Val

Asn

Ser

Arg

Leu

115

120

125

i^jl

Ser

Asp

Ile

Phe

Ar c

Ala

Val

Pro

Phe

Ile

Ser

A.sp

Val

Phe

Gin

130

135·

140

Val

Glu

His

Ile

Ser

Lys

Gly

Asn

Cys

Leu

Asp

Ala

Lys

Al 3.

.til'

145

ISO

155

160

Cys

Asn

Leu

Asp

Thr

Cys

Lys

Tyr

Arg

Ser

Ala

Tyr

Ile

Thr

165

170

175

Pro

cys

Thr

Ser

Met

Ser

Asn

Glu

Val

Cys

Asn

Arg

Lys

Cys

ISO

165

190

His

Lys

Ala

Leu

Arg

Gin

Phe

Asp

Lys

Val

Pro

Al a

Lys

His

Ser

195

200

205

Tyr

Gly

Met

Leu

Phe

Cys

Ser

Cys

Arg

Asp

Ile

Ala

Cys

Thr

Glu

Arg

210

215

220

Arg

Gin

Thr

Ile

Val

Pro

Val

Cys

Ser

Tyr

Glu

Arg

Glu

Arg

·>

225

230

235

240

•

Pro

Asn

Cys

Leu

Ser

Leu

Gin

Asp

Ser

Cys

Lys

Thr

Asn

Tyr

Ile

Cys

245

250

255

Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gin Pro Glu Ser Arg

260

68

265

• * • 9 i

·· • · • · 1 ·*

* • · « 270

• 9 •

• * · 9 »9 ·

Ser

Val

Ser

Asn

Cys

Leu

Lys

Glu

Asn

Tyr

Ala

Asp

Cys

Leu

Ala

275

2S0

285

Tyr

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr

Vel

Kec

Thr

Pro

Asn

Tyr

Val

Asp

Ser

290

295

300

Ser

Leu

Ser

Val

Ala

Pro

Trp

Cys

Asp

Cys

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

305

310

315

320

Asp

Leu

Glu

Asp

Cys

Leu

Lys

Phe

Leu

Asn

Phe

Lys

Asp

Asn

Thr

325

330

335

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

Ile

Gin

Ala

Phe

Gly

Asn

Gly

Ser

Asp

Val

Thr

340

345

350

Kec

Trp

Gin

Pro

Ala

Pro

Val

Gin

Thr

Ala

Thr

355

360

365

Thr

Ala

Phe

Arg

Val

Lys

Asn

Lys

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu

370

375

380

Asn

Glu

Ile

Pro

Thr

KÍS

Val

Leu

Pro

Cys

Ala

Asn

Leu

Gin

Ala

385

390

395

400

Gin

Lys

Leu

Lys

Ser

Asn

Val

Ser

Gly

Ser

Thr

His

Leu

Cys

Leu

Ser

405

410

415

Asp

Ser

Asp

Phe

Gly

Lys

Asp

Gly

Leu

Ala

Gly

Ala

Ser

Eis

íle

420

425

430

Thr

Lys

Ser

Kec

Ala

Pro

Ser

Cys

Ser

Leu

Ser

Leu

435

440

445

Pro

Val

Leu

Kec

Leu

Τί'Ίΐ'

Ala

Leu

Ala

Leu

Ser

Val

Ser

Leu

450

455

460

Ala

Glu

Thr

Ser

465 • 99

• · » · 9 • 9 9« 9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární ííi) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGCGAAGGC GACGTCCGG 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIElineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCTCGTC GCA 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5: ' (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE;

(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5;

AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCGCATC ACA

4·· » » · ♦ «· · ··· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1926 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché ' ' (D) TOPOLOGIE: lineární' (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: ODS (B) POZICE: 10...192.0 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

GCGGCCGCC ATG GCG AAG GCG ACG TCC GGC GCC GCA GGG CTG GGG CTG

Met Ala Lys Ala Thr Ser Glv Ala Ala Gly Leu Gly Leu <70 475 480

¹

96

AAG

CTG

TTT

TTG

CTG

CTG CCG

CTA

CTG

GGA

GAA

GCC

CCG

CTG

GGT

CTC

Lys

Leu

Phe

Leu

Leu Pro

Leu

Gly

Glu

Ala

Pro

Leu

Gly

Leu

^J Λ

465

490

495

144

TAC

TTC

TCA

AGG

GAT

GCT TAC

TGG

GAG

AGG

CTG

TAT

GTG

GAC

CAG

CCA

-

Tyr

Phe

Ser

Ařg

Asp

Ala Tyr

Trp

Glu

Arg

Leu

Tyr

Val

Asp

Gin

Pro

-500

505

510

GCT

GGC

ACA

CCT

CTG

CTC-TAT

GTC

CAT

GCC

CTA

CGG

GAT

GCC

CCT

GGA

192 • 4 k

4« «44 4» ··

4 ·

4 *

4*4 ♦·· * “ ··

Ala Gly Thr Pro Le; 515

Leu Tyr Val 520

His Ala

Leu Arg Asp Ala 525

Pro Gly

384 •*1

768

240

83

336

432

480

528

576

624

672

720

GAA

GTG

CCC

AGC

TTC

CGC

CTG

GGC

CAG

TAT

CTC

TAT

GGC

GTC

TAC

CGC

Glu

Val

Pro

Ser

Phe

Arg

Leu

Gly

Gin

Tyr

Leu

Tyr

Gly

Val

Tyr

Arg

530

535

540

545

ACG

CGT

CTG

CA?

GAG

AAT

GAC

TGG

ATC

CAC

ATC

GAT

GCG

GGC

ACT

GGC

Thr

Arg

Leu

His

Glu

Asn

Asp

Trp

Ile

His

Ile

Asp

Ala

Gly

Thr

Gly

550

555

560

CTC

TAC

CTC

AAT

CAG

AGC

CTG

GAC

CAT

AGT

TCC

TGG

GAG

CAG

CTC

Leu

Tyr

Leu

Asn

Gin

Ser

Leu

Asp

His

Ser

Trp

Glu.

Gin

Leu

565

570

575

AGC

ATC

CGA

AAT

GGC

TTC

CCC

TTG

CTC

ACC

GTC

TTC

CTC

CAG

GTC

Ser

Ile

Arg

Asn

Gly

Phe

Pro

Leu

Thr

Val

Phe

Leu

Gin

Val

580

565

590

TTC

CTG

GGG

TCC

ACA

GCC

CAG

AGA

GAG

GGA

GAG

TGT

CAT

TGG

CCA

GGC

Phe

Leu

Gly

Ser

Thr

Ala

Gin

Arg

Glu

Gly

Glu

Cys

His

Trp

Pro

Gly

5S5

600

605

TGT

GCC

CGT

GTG

TAC

TTC

TCC

TTC

ATC

AAC

GAC

ACC

TTC

CCA

AAT

TGT

Cys

Ala

Arg

Val

Tyr

Phe

Ser

Phe

Ile

Asn

Asp

Thr

Phe

Pro

Asn

Cys

610

615

620

625

AGC

tcc

TTC-

•AAA

C-CC

CGG

GAT

CTC

TGC

ACC

CCA

GAG

ACG

GGT

GTG

TCC

Ser.

Ser

Phe.

Lvs

Ala-

Arg

Asp

Leu

Cys

Thr

Pro

Glu

Thr

Gly

Val

Ser

630

635

640

TTC

CGC

ATC

AGG

GAG

AAC

AGG

CCC

CCT

GGC

ACC

TTC

TAC

CAG

TTC

CGC

Phe

Arg

Ile

A—g

Glu

Asn

Arg

Pro

Gly

Thr

Phe

Tyr

Gin

Phe

Arg

645

650

655

ATG

CTA

CCT

GTG

CAG

TTC

CTT

TGT

CCT

AAC

ATC

AGT

GTG

AAG

TAC

A_-_\

Het

Leu

Pro

Val

Gin

Phe

Leu

Cys

Pro

Asn

Ile

Ser

Val

Lys

Tyr

Lys

660

665

670

CTC

TTA

GAA

GGG

GAC

C-GT

CTG

CCC

TTC

CGT

TGT

GAC

CCC

GAC

TGT

CTG

Leu

Glu

Gly

Asp

Gly

Leu

Pro

Phe

Arg

Cys

Asp

Pro

Asp

Cys

Leu

675

680

685

GAG

GTG

AGC

ACG

CGG

TGG

GCA

CTG

GAT

CGG

GAG

CTT

GAG

AAG

TAT

Glu

Val

Ser

Thr

Arg

Trp

Ala

Leu

Asp

Arg

Glu

Leu

Gin

Glu

Lys

Tyr

690

695

700

705

GTG

CTG

GAG

GGT

GAG

TGC

GCA

GTG

GCA

GGC

CCT

GGA

GCC

AAC

AAG

GAG

Val

Leu

Glu

Ala

Glu

Cys

Ala

Val

'Ala

Gly

Pro

Gly

Ala

Asn

Lys

Glu

710

715

720

AAG

GTG

GCC

GTG

TCC

TTC

CCG

GTG

ACG

GTG

TAT

GAT

GAA

GAC

TCC

'ř—816 *♦ ·· • · · ' ·» » · * · * · · • * · « • · · · · ·· ·· > * · · » · · · >.· *·· • ·· ·*

960

864

912

1008

1056

1104

1152

Lys

Val

Ala

Val 725

Ser

Phe

Pro

Val

Thr 730

Val

Tyr

Asp

Glu

Asp 735

Asp

Ser

CCG

CCC

ACC

TTC

TCC

GGA

GGT

GTG

C-GC

ACC

GCC

AGT

GCT

GTG

GAG

Pro

Thr

Phe

Ser

Gly

Val

Gly

Thr

Ala

Ser

Ala

Val

Glu

740

745

750

TTT

AAG

CGG

AAG

GAG

GGG

ACT

GTG

GTA

GCC

ACT

CTG

CAG

GTG

TTT

GAT

Phe

Lys

Arg

Lys

Glu

Gly

Thr

Val

Ala

Thr.

Leu

Gin

Val

Phe

Asp

755

760

765

GCA

GAT

GTG

CCA

GCA

TCT

GGG

GAG

CTG

GTG

AGG

CGG

TAC

ACA

AGC

Ala

Asp

Val

Pro

Ala

Ser

Gly

Glu

Leu

Val

Arg

TVr

Thr

Ser

770

775

7S0

785

ACA

CTA

CTC

TCA

GGG

GAT

TCC

TGG

GCC

CAG

ACC

TTC

CGG

GTG

GAG

s Thr

Leu

Ser

Gly

Asp

Ser

Trp

Ala

Gin'

Gin

Thr

Phe

Arg

Val

Glu

790

795

800

CAC

ACA

CCC

AAC

GAG

ACC

TTG

GTC

CAG

TCC

AAC

TCC

GTG

CGG

Ϊ His

Thr

Pro

Asn

Glu

Thr

Leu

Val

Gin

Ser

Asn

Ser

Val

Arg

805

810

815

GCA 1

ACC

ATG

CAC

AAT

TAC

A_'.G

CTG

GTT

CTC

AAC

AGG

AGC

CTG

TCC

ATC

Ala

Thr

Ket

His

Asn

Tyr

Lys

Leu

Val

Leu

Asn

Arg

Ser

Leu

Ser

Tle

820

825

830

TCA

GAG

AGC

CGA

GTC

CTG

CAG

CTA

GTA

íGTC

CTG

GTC

AAT

GAC

TCA

. GAC

Ser

Glu.

Ser

rZ 9

Val

Leu

Gin

Leu

Val

.Val

Leu

Va 1

Asn.

Asp

Ser

Asp

835

840

S45

1200

1248

1296

CAG

C-GG

CCT

GGG

TCA

GGT

GTT

CTC

TTC

CTC

CAT

TTC

AAC

GTG

TCT

Phe

Gin

Gly

Pro

Gly

Ser

Gly

Val

Leu

Pne

Leu

His

Phe

Asn

Val

Ser

850

£55

eso

865

GTG

CTG

CCT

GTC

ACC

CTG

AAC

CTA

CCC

ATG

GCC

TAC

TCC

TTC

CCA

GTG

Val

Leu

Pro

Val

Thr

Leu

Asn

Leu

Pro

Ket

Ala

Tyr

Ser

Phe

Pro

Val

670

875

880

AAT

AGG

AGA

GCC

CGG

CGT

TAT

GCC

CAG

ATT

GGG

AAA

GTT

TGC

GTG

GAG

Asn

Arg

Ala

Arg

Tyr

Ala

Gin

Ile

Gly

Lys

Val

Cys

Val

Glu

885

890

895

AAC

TGC

CAG

GAG

TTC

AGC

GGT

GTC

TCC

ATC

CAG

TAC

AAG

CTG

CAG

CCC

1 Asn

Cys

Gin

Glu

Phe

Ser

Gly

Val

Ser

Ile

Gin

Tyr

Lys

Leu

Gin

Pro

900

905

910

TCC 1

AGC

ACC

AA.C

TGC

AGT

GCC

CTA

GGT

GTG

GTC

ACC

TCA

ACA

GAA

GAC

Ser

Thr

Asn

Cys

Ser

Ala

Leu

Gly

Val

Thr

Ser

Thr

Glu

Asp

915

920

925

ACC

TCA

GGG

ACC

CTA

TAT

GTA

AAT

GAC

ACG

GAG

GCC

CTG

CGG

CGA

CCT

1344

1392

1440 ··

Thr 930

Ser

Gly

Thr

Leu

Tyr 935

Val Asn Asp

Thr

Glu 940

Ala

Leu Arg

Arg

Pro 945

GAG

TGT

ACC

GAG

CT7

CAG

TAC ACA

GTG

GTA

GCC

ACT

GAC

GGG

CAG

ACC

1433

Glu

Cys

Thr

Glu

Leu

Gin

Tyr Thr

Val

Ala

Thr

Asp

Arg

Gin

Thr

950

955

960

CGC

AGG

CAG

ACC

CAA

GCT

TGG TTA

GTC

ACA

GTG

GAG

C-GG

ACA

TAC

1536

Arg

Gin

Thr

Gin

Ala

Ser Leu

Val

Thr

Val

Glu

Gly

Thr

Tyr

965

970

975

ATT

GCA

GAA

GTG

GGC

TGC CCC

AAG

TCC

TGT

GCA

GTA

AAC

AAG

AGG

15S4

Ile

Ala

Glu

Val

Gly

Cys Pro

Lys

Ser

Cys

Ala

Val

Asn

Lys

Arg

980

985

990

CGA

CCT

GAG

TGT

GAC-

GAG

TGT GGT

GGC

CTG

GGT

TCT

CCA

ACT

GGC

AGA

1632

Arg

Pro

Glu

Cys

Glu

Cys Gly

Gly

Leu

Gly

Ser

Pro

Thr

Gly

Arg

995

1000

1005

TGT

GAG

TGG

CGT

CAC-

GGA

GAT GGT

AAA

GGG

ATC

ACC

AGG

AAC

TTC

TCC

1680

Cys

Glu

Trp

Arg

Gin

Gly

Asp Gly

Lys

Gly

Ile

Thr

Arg

Asn

Phe

Ser

1010

1015

1020

102:

ACC

TGT

TCT

CCT

AGC

ACC

AC-G ACC

TGT

CCT

GAT

GGC

CAC

TGT

GAT

GCT

1728

Thr

Cys

Ser

Pro

Ser

Thr

Arg Thr

cys

Pro

Asp

Gly

His

Cys

Asp

Ala

lO-i

0

1035

1040

CTG' 1776

GAG

AGC

CC-G

GAT

ATC

AAČ ATT

TGC

CCC

CAG

GAC

TGT

CŤC

CGT

C-GC

Leu

Glu

Ser

Arc

As?

Ile

Asn Ile

cys

Pro

Gin

Asp

Cys

Leu

Arg

Gly

1045

1050

1055

CCC

ATT

GTT

GGC

C-GG

CAT

C-AG CGA

GGG

GAG

CGC

CAG

GGG

ATT

AAA

GCC

1824

Pro

Ile

Val

Gly

His

Glu Are

Gly

Glu

Arg

Gin

Gly

Ile

Lys

Ais.

1060

1065

107 0'

GGC

TAT

GGC

ATC

TGC

A.AC

TGT TTC

CCT

GAT

GAG

A-AG

AAG

TGC

TTC

TGC

1872

Gly

lýr

Gly

ile

Cys

Asn

Cys Phe

Pro

Asp

Glu

Lys

Cys

Phe

Cys

1075 1080 1085

GAG CCA GAG GAC AGC CAG C-GC CCA TTG TGT GAT GCG CTG TGC CGC ACG

1920

Glu Pro Glu Asp Ser	Gin Gly	Pro Leu Cys Asp Ala Leu Cys Arg
1090	1095	1100
GTCGAC

1926 ’ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

i> (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

• (A) DÉLKA: 637 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

74

•

e * 9«

0

> ♦ ·«

0 • 00

Met

Ala

Lys

Ala

Thr

Ser

Gly

Ala

Gly

Leu

Gly

Leu

Lys

Leu

Phe

1

5

10

15

Leu

Pro

Leu

Gly

Glu

Ala

Pro

Leu

Gly

Leu

Tyr

Phe

Ser

20

25

30

Arg

As?

Ala

Tyr

Trp

Glu

Arg

Leu

Tyr

Val

Asp

Gin

Pro

Ala

Gly

Thr

35

40

45

Pro

Leu

Tyr

Val

His

Ala

Leu

Arg

Asp

Ala

Pro

Gly

Glu

Val

Pro

50

55

60

Ser

Phe

Arg

Leu

Gly

Gin

Tyr

Leu

Tyr

Gly

Val

Tyr

Arg

Thr

Arg

Leu

65

70

75

60

His

Glu

Asn

Asp

Trp

Ile

His

Ile

Asp

Ala

Gly

Thr

Gly

Leu

Tyr

65

90

95

Leu

Asn

Gin

Ser

Leu

Asp

His

Ser

Trp

Glu

Gin

Leu

Ser

Ile

Arg

.100

105

110

Asn

Gly

Phe

Pro

Leu

Thr

Val

Phe

Leu

Gin

Val

Phe

Leu

Gly

115

120

125

Ser

Thr

Ala

Gin

Arg

Glu

Gly

Glu

Cys

His

Trp

Pro

Gly

Cys

Ala

Arg

130

135

140

Val

Tyr

Phe

Ser

Phe

Ile

Asn

Asp

Thr

Phe

Pro

Asn

Cys

Ser

Phe

145

150

155

160

Lys

Ala

Arg

As?

Leu

Cys

Thr

Pro

Glu

Thr

Gly

Val

Ser

Phe

Auro

Ile

165

170

175

Arg

Glu

Asn

Arg

Pro

Gly

Thr

Pne

Tyr

Gin

Phe

Arg

Met

Leu

Pro

160

165

190

Val

Gin

Phe

Leu

Cys

Pro

Asn

Ile

Ser

Val

Lys

Ty-

Lys

Leu

Glu

195

200

20S

Gly As?

Gly

Leu

Pro

Phe

Arg

Cys

Asp

Pro

Asp

Cvs

Leu

Glu

Val

Ser

210

215

220

Thr

Arg

Trp

Ala

Leu

Asp

Arg

Glu

Leu

Gin

Glu

Lys

Tyr

Val

Leu

Glu

225

230

235

240

Ala

Glu

Cys

Ala

Val

Ala

Gly

Pro

Gly

Ala

Asn

Lys

Glu

Lys

Val

Ala

24 5

250

255

Val

Ser

Phe

Pro

Val

Thr

Val

Tyr

Asp

Glu

As?

Asp

Ser

Pro

Thr

260

265

270

Phe

Ser

Gly

Val

Gly

Thr

Ala

Ser

Ala

Val

Glu

Phe

Lys

Arg

275

280

285

Lys

Glu

Gly

Thr

Val

Ala

Thr

Leu

Gin

Val

Phe

Asp

Ala

Asp

Val

290

295

300

Val

Pro

Ala

Ser

Gly

Glu

Leu

Val

Arg

Tyr

Thr

Ser

Thr

Leu

305

310

315

320

Ser

Gly

Asp

Ser

Trp

Ala

Gin

Thr

Phe

Arg

Val

Glu

His

Thr

Pro

325

330

335

** ·\ » 4 · * » · 4

44· • 4 • ·4 • 4

Asn

Glu

Thr

Leu 340

Val Gin

Ser

Asn

Asn Asn Ser Val Arg Ala Thr

Met

345

350

His

Asn

Tyr

Lys

Leu

Val

Leu

Asn

Arg

Ser

Leu

Ser

Zle

Ser

Glu

Ser

355

360

365

Arg

Val

Leu

Gin

Leu

Val

Leu

Val

Asn

Asp

Ser

Asp

Phe

Gin

Gly

370

375

350

Pro

Gly

Ser

Gly

Val

Leu

Phe

Leu

His

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Leu

Pro

355

390

395

400

Val

Thr

Leu

Asn

Leu

Pro

Met

Ala

Tyr

Ser

Phe

Pro

Val

Asn

Arg

405

410

415

Ala

Arg

Tyr

Ala

Gin

Ile

Gly

Lys

Val

Cys

Val

Glu

Asn

Cys

Gin

420

425

430

Glu

Phe

Ser

Gly

Val

Ser

Zle

Gin

Tyr

Lys

Leu

Gin

Pro

Ser

Thr

435

440

445

Asn

Cys

Ser

Ala

Leu

Gly

Val

Thr

Ser

Thr

Glu

Asp

Thr

Ser

Gly

450

455

460

Thr

Leu

Tyr

Val

Asn

Asp

Thr

Glu

Ala

Leu

Arg

Pro

Glu

Cys

Thr

465

470

475

450

Glu

Leu

Gin

Tyr

4 ii2f

Val

Ala

Thr

Asp

Arg

Gin

Thr

Arg

Gin

465

490

495

Thr

Gin

Ala

Ser

Leu

Val

Thr

Val

Glu

Gly

Thr

Tyr

Ile

Ala

Glu

500

505

510

Glu

Val

Gly

Cys

Pro

Lys

Ser

Cys

Ala

Val

Asn

Lys

Arg

Pro

Glu

515

520

525

Cys

C-lu

Glu

Cys

Gly

Leu

Gly

Ser

Pro

Thr

Gly

Arg

cys

Glu

Trp

530

535

54 0

Arg

Gin

Gly

Asp

cly

Lys

Gly

Zle

Thr

Arg

Asn

Phe

Ser

Thr

Cys

Ser

545

550

555

560

Pro

Ser

Thr

Arg

Thr

cys

Pro

Asp

Gly

His

Cys

Asp

Ala

Leu

Glu

Ser

Ji,

565

570

575

Arg

Asp

Ile

Asn

Zle

Cys

Pro

Gin

Asp

Cys

Leu

Arg

Gly

Pro

Zle

Val

560

555

590

Gly

His

Glu

r·- 5

Gly

Glu

Arg

Gin

Gly

Zle

Lys

Ala

Gly

Tyr

Gly

4

595

600

605

Zle

Cys

Asn

Cys

Phe

Pro

Asp

Glu

Lys

Cys

Phe

Cys

Glu

Pro

Glu

41'

610

615

620

Asp

Ser

Gin

Gly

Pro

Leu

Cys

Asp

Ala

Leu

Cys

Arg

Thr

625

630

635

* 4 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1223 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

I »9

I 9 9 · ••9 ··· ·

9« ·· (ÍX) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE : 1. ..1038 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

48

CTG Leu

GAG Glu 640

GAT Asp

TCC Ser

CCA Pro

TAT Tvr

GAA Glu 645

CCA Pro

GTT Val

AAC Asn

AGG Ser

AGA Arg 650

TTG Leu

TCA Ser

GAT Asp

«

Q £

ATA

TTC

CGG

GTG

GTC

CCA

TTC

ATA

TCA

GTG

GAG

CAC

ATT

CCC

AAA

GGG

Ile

Phe

Arg

Val

Pro

Phe

Ile

Ser

Val

Glu

His

Ile

Pro

Lys

Gly

«

655

660

665

b

AAC

TGC

CTG

GAT

CCA

GCG

AAG

GCC

.TGC

AAC

CTC

GAC

ATT

TGC

144

Asn

Cys

Leu

Asp

Ala

Lys

Ala

cys

Asn

Leu

Asp

Ile

cys

670

675

680

6S5

AAG

TAC

AGG

TCG

GCG

TAC

ATC

ACC

CCG

TGC

ACC

AGC

GTG

TCC

192

Lys

Tyr

Arg

Ser

Ala

Tyr

Ile

Thr

Pro

cys

Thr

Ser

Val

Ser

690 695 700

AAC GAT GTC TGC AAC CGC CC-C AAG TGC CAC AAG GCC CTC CGG CAG TTC

^! 240		-
Asn Asn Val Cys Asr.	Arg Auro Lys Cys His	Lys Ala Leu A.rg Gin Phe
705	710	715—

TTT GAC AAG GTC CCG GCC AAG CAC AC-C TAC GGA ATG CTC TTC TGC TCC

288

Phe

Asp

Lys 720

Val

Pro Ala Lys

His 725

Ser

Tyr

Gly

Men

Leu 730

Phe

Cys

Ser

336

TGC

CGG

GAC

ATC

C-CC

TGC

ACA

GAG

CC-G

AGG

CGA

CAG

ACC

ATC

GTG

CCT

Cys

Arg

Asp

Ile

Ala

Cys

Thr

Glu

Arg

Gin

Thr

Ile

Val

Pro

•7

735

740

745

384

GTG

TGC

TCC

TAT

GAA

GAG

AC-G

GAG

AAG

CCC

AAC

TGT

TTG

AAT

TTG

CAG

Val

Cys

Ser

cyr

Glu

Arg

Glu

Lys

Pro

Asn

cys

Leu

Asn

Leu

Gin

·>

750

755

760

765

GAC

TCC

TGC

AAG

ACG

AAT

TAC

ATC

TGC

AGA

TCT

CGC

CTT

GCG

GAT

TTT

ů.

432

Asp

Ser

Cys

Lys

Thr

Asn

Tyr

Ile

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Ala

Asp

Phe

770

775

780

TTT

ACC

AAC

TGC

CAG

CCA

GAG

TCA

AGG

TCT

GTC

AGC

TGT

CTA

AAG

480

Phe

Thr

Asn

Cys

Gin

Pro

Glu

Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Cys

Leu

Lys

d·

785

790

795

•

GAA

AAC

TAC

GCT

GAC

TGC

CTC

ctc

GCC

TAC

TCG

GGG

CTT

ATT

GCC

ACA

Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr 800 805 810

528

191

9 * 9 · ·

999 ·· ·· ·»· 94

GTC 576 Val

ATG Ket 815

ACC CCC AAC TAC

ATA GAC

TGC AGT AGC CTC AGT GTG

GCC Ala

CCA Pro

Thr

Pro

Asn

Tyr

Ser

Leu 825

Ser

Val

I le 820

Asp

TGG

TGT

GAC

TGC

AGC

AAC

AGT

GGG

AAC

GAC

CTA

GAA

GAG

TGC

TTG

AAA

624

Trp

Cys

Asp

Cys

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

Asp

Leu

Glu

Cys

Leu

Lys

830

835

840

845

TTT

TTG

AAT

TTC

AAG

GAC

AAT

ACA

TGT

CTT

AAA

AAT

GCA

ATT

CAA

672

Phe

Leu

Asn

Phe

Lys

Asp

Asn

Thr

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

Ile

Gin

650

855

860

720

GCC

TTT

GGC

AAT

GGC

TCC

GAT

GTG

ACC

GTG

TGG

CAG

CCA

GCC

TTC

CCA

Ala

Phe

Gly

Asn

Gly

Ser

Asp

Val

Thr

Val

Trp

Gin

Pro

Ala

Phe

Pro

865

870

875

«

768

GTA

CAG

ACC

ACT

GCC

ACT

ACC

ACT

GCC

CTC

CGG

GTT

AAG

AAC

v

Val

Gin

Thr

Ala

Thr

Ala

Leu

Arg

Val

Lys

Asn

880

885

890

AAG

CCC

CTG

C-GG

CCA

GCA

C-GG

TCT

GAG

AAT

GAA

ATT

CCC

ACT

CAT

GTT

816

Lys

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu

Asn

Glu

Ile

Pro

Thr

His

Val

895

,900

905

TTG

CCA

CCG

TGT

GCA

AAT

TTA

CAG

GCA

CAG

AAG

CTG

AAA

TCC

AAT

GTG

864

Leu

Pro

C-ys

Ala

Asn

Leu

Gin

Ala

Gin

Lvs

Leu

Lys

Ser

Asn

Val

910

915

920

925

TGG

C-GC

AAT

ACA

CAC

CTG

ATT

TCC

AAT

GGT

AAT >

«.TÁT

, GAA

AA-A

GAA

... -

Ser

Gly

Asn

Thr

His

Leu

Cys

Ile

Ser

Asn

Gly

Asn

Tyr

Glu

Lys

Glu

930

935

940

GGT

CTC

GGT

GCT

TGC

AC-C

CAC

ATA

ACC

ACA

AAA

TCA

ATG

GCT

CGT

960

Gly

Leu

Gly

Ala

Ser

His

Ile

Thr

Lys

Ser

Met

Ala

Pro

945

950

955

ji

CCA

AGC

TGT

1

CTG

AGC

CCA

CTG

GTC

CTG

GTG

GTA

ACC

GCT

CTG

100S

Pro	Ser	Cys 960	Gly	Leu	Ser	Pro	Leu 965	Leu	Val	Leu Val Val Thr Ala Leu 970
TCC 1058	ACC	CTA	TTA	TCT	TTA	ACA	GAA	ACA	TCA	TAGCTGCATT AAAAAAATAC
Ser	Thr 975	Leu	Leu	Ser	Leu	Thr 980	Glu	Thr	Ser

AATATGGACA TGTAAAAAGA CAAAAACCAA GTTATCTGTT· TCCTGTTCTC TTGTATAGCT

1118

GAAATTCCAG TTTAGGAGCT CAGTTGAGAA ACAGTTCCAT TCAACTGGAA CATTTTTTTT

1178

TTTTCCTTTT AAGAAAGCTT CTTGTGATCC TTCGGGGCTT CTGTG'

1223 •·· ·♦· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 346 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

	(xi) POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE	S IDENTIFIKAČNÍM	ČÍSLEM	9:
	Leu Leu 1	Glu Asp Ser 5	Pro Tyr Glu	Pro Val Asn Ser Arg 10	Leu Ser 15	Asp
	Ile Phe	Arg Val Val 20	Pro Phe Ile	Ser Val Glu His Ile 25	Pro Lys 30	Gly
	Asn Asn	Cys Leu Asp 35	Ala Ala Lys 40	Ala Cys Asn Leu Asp 45	Asp Ile	Cys
*	Lys Lys 50	Tyr Arg Ser	Ala Tyr Ile 55	Thr Pro Cys Thr Thr 60	Ser Val	Ser
	Asn Asp 65	Val Cys Asn	Arg Arg Lys 70	Cys His Lys Ala Leu 75	Arg Gin	Phe 60
	Phe Asp	Lys Val Pro 65	Ala Lys His	Ser Tyr Gly Het Leu 90	Phe Cys 95	Ser
	Cys Arg	Asp Ile Ala 100	Cys Thr Glu	Arg Arg Arg Gin Thr 105	Ile Val 110	Pro
	Val Cys	Ser Tyr Glu 115	Glu Arg Glu 120	Lvs Pro Asn Cvs Leu 125	Asn Leu	Gin
	Asp. Ser 130	Cys Lys Thr	Asn Tyr Ile 135	Cys Arg 'Ser Arg Leu 140	Ala -Asp	Phs
	Phe Thr 145	Asn Cys Gin	Pro Glu Ser 150	Arg Ser Val Ser Ser155	Cys Leu	LvS 160
»	Glu Asn	Tyr Ala Asp 165	Cys Leu Leu	Ala Tyr Ser Gly Leu 170	Ile Gly ' 175	Thr
	Val Het	Thr Pro Asn 160	Tyr Ile Asp	Ser Ser Ser Leu Ser 165	Val Ala 150	Pro
	Trp Cys	Asp Cys Ser 195	Asn Ser Gly 200	Asn Asp Leu Glu Glu 205	Cys Leu	Lys
	Phe Leu 210	Asn Phe Phe	Lys Asp Asn 215	Thr Cys Leu Lys Asn ²²⁰	Ala Ile	Gin
A	Ala Phe 225	Gly Asn Gly	Ser Asp Val 230	Thr Val Trp Gin Pro 235	Ala Phe	Pro 240
ř	Val Gin	Thr Thr Thr 245	Ala Thr Thr	Thr Thr Ala Leu Arg 250	Val Lys 255	Asn
£	Lys Pro	Leu Gly Pro 260	Ala Gly Ser	Glu Asn Glu Ile Pro 265	Thr His 270	Vál
•	Leu Pro	Pro Cys Ala 275	Asn Leu Gin 280	Ala Gin Lys Leu Lys 285	Ser Asn	Val

Ser

Gly 290

Asn.

Tr.r

His

Leu

Cys 295

Ile

Ser

Asn

Gly

Asn 300

Tyr

Glu

Lys

Glu

Gly

Leu

Gly

Ala

Ser

His

Ile

Thr

Lys

Ser

Met

Ala

Pro

305

310

315

320

Pro

Ser

Cys

Gly

Leu

Ser

Pro

Leu

Val

Leu

Val

Thr

Ala

Leu

325

330

335

Ser

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr

Ser

340 345 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI Ξ IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1682 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ÍL) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 118. . .1497 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

GGGCGGCCAG AC-CAGCACAG CTGTCCGGGG ATCGCTGCAT GCTGAGCTCC CTCC-GCAAC-A

CCCAGCGGCG GCTCGGGATT TTTTTGGGGG GGCGGC-GACC AGCCCCGCGC CGGCACC

ATG 165 Met

TTC CTG GCG

ACC CTG

TAC Tyr

TTC Phe

GCG CTG CCG CTC TTG GAC TTG CTC

Phe Leu

Ala 350

Thr

Leu

Ala 355

Leu

Pro

Leu

Asp 360

Leu

213

CTG

TCG

GCC

GAA

GTG

AGC

GGC

GGA

GAC

CGC

CTG

GAT

TGC

GTG

ΑΑ»,

GCC

Leu

Ser

Ala

Glu

Val

Ser

Gly

Asp

Arg

Leu

Asp

Cys

Val

Lys

Ala

365

37 0

375

261

AGT

GAT

CAG

TGC

CTG

AAG

GAG

CAG

AGC

TGC

AGC

ACC

AAG

TAC

CGC

ACG

Ser

Asp

Gin

Cys

Leu

Lys

Glu

Gin

Ser

Cys

Ser

Thr

Lys

Tyr

Arg

Thr

360

365

390

CTA

AGG

CAG

TGC

GTG

GCG

GGC

AAG

GAG

ACC

AAC

TTC

AGC

CTG

GCA

TCC

309

Leu

Arg

Gin

Cys

Val

Ala

Gly

Lys

Glu

Thr

Asn

Phe

Ser

Leu

Ala

Ser

395

400

405

410

GGC

CTG

GAG

GCC

AAG

GAT

GAG

TGC

CGC

AGC

GCC

ATG

GAG

GCC

CTG

AAG

Wl

357

Gly

Leu

Glu

Ala

Lys

Asp

Glu

Cys

Arg

Ser

Ala

Met

Glu

Ala

Leu

Lys

415

420

425

Ϊ «

CAG

AAG'

'TCG’

CTC

TAC

AAG

TGC

CGC

TGC

AAG

CGG

GGT

ATG

AAG

GAG

405

Gin Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu

430 435

453	AAG AAC Lys Asn	TGC Cys 445	CTG CGC	ATT Ile	TAC Tyr	TGG Trp 450	AGC Ser
Leu	Arg
	AAT	GAT	CTG	CTG	GAG	GAT	TCC	CCA	TAT
501	Asn	Asp	Leu	Leu	Glu	Asp	Ser	Pro	Tyr
		460					465
	TCA	GAT	ATA	TTC	CGG	GTG	GTC	CCA	TTC
549	Ser	Asp	Ile	Phe	Arg	Val	Val	Pro	Phe
	475					480
	AAA	GGG	AAC	AAC	TGC	CTG	GAT	GCA	GCG
597	Lys	Gly	Asn	Asn	Cys	Leu	Asp	Ala	Ala
					4.95
	ATT'	TGC	AAG	AAG	TAC	AGG	TCG	GCG	TAC
645	Ile	Cys	Lys	Lys	Tyr	Arg	Ser	Ala	Tyr
				510					515
	GTG	TCC	AA.C	GAT	GTC	TGC	AAC	CGC	CC-C
693'	Val	Ser	Asn	Asp	Val	Cys	Asn	Arg	Arg
			525					530·
	CAG	TTC	TTT	GAC	AAG	GTC	CCG	GCC	AAG
741	Gin	Phe	Phe	Asp	Lys	Val	Pro	Ala	Lys
		540					54 5
	TGC	TCC	TGC	CGG	GAC	ATG	GCC	TGC	ACA
7S9	Cys	Ser	Cys	Arg	Asp	Ile	Ala	Cys	Thr
	555					560
	GTG	CCT	GTG	TGC	TCC	i A i	CAG,	GA.G	AGG
837	Val	Pro	Val	Cys	Ser	Tyr	Glu	Glu	Arg
					575
	TTG	CAG	GAC	TCC	TGC	AAG	ACG	AAT	TAC
885	Leu	Gin	Asp	Ser	Cys	Lys	Thr	Asn	Tyr
				590					595
	GAT	TTT	TTT	ACC	AAC	TGC	CAG	CCA	GAG
933	Asp	Phe	Phe	Thr	Asn	Cys	Gin	Pro	Glu
			605				610
	CTA	A.AG	GAA	AAC	TAC	GCT	GAC	TGC	CTC
981	Leu	Lys	Glu	Asn	Tyr	Ala	Asp	Cys	Leu
		620					625
	GGC	ACA	GTC	ATG	ACC	CCC	AAC	TAC	ATA

• ι· ·* · ·· ·'

		»· · · • ·· • ♦ · · • · · IBB ··	« · « · • * * · ·*	·· • * • ···
				440
ATG	TAC	CAG	AGC	CTG	CAG	GGA
Met	Tyr	Gin	Ser 455	Leu	Gin	Gly
GAA	CCA	GTT	AAC	AGC	AGA	TTG
Glu	Pro	Val 470	Asn	Ser	Arg	Leu
ATA	TCA	GTG	GAG	CAC	ATT	CCC
Ile	Ser 485	Val	Glu	His	Ile	Pro 490
AAG	GCC	TGC	AAC	CTC	GAC	GAC
Lys 500	Ala	Cys	Asn	Leu	Asp 505	Asp
ATC	ACC	CCG	TGC	ACC	ACC	AGC
Ile	Thr	Pro	Cys	Thr 520	Thr	Ser
AAG	TGC	CAC	AAG	GCC	CTC	CGG
Lys	Cys	His	Lys 535	Ala	Leu	Arg
CAC	AGC	TAC	GGA	ATG	CTC	TTC
His	Ser	Tyr 550	Gly	Met	Leu	Phe
GAG	CGG	AGG	CGA	CAG	ACC	ATC
Glu	Arg 565	Arg	Arg	Gin	Thr	Ile 570
GAG	AAG	CCC	AAC	TGT	TTG	AAT
Glu 580	Lys	Pro	Asn	Cys	Leu 585	Asn
ATC	TGC	AGA	TCT	CGC	CTT	GCG
Ile	Cys	Arg	Ser	Arg 600	Leu	μ 1 a
TCA	AGG	TCT	GTC	AGC	AGC	TGT
Ser	Arg	Ser	Val 615	Ser	Ser	cys
CTC	GCC	TAC	TCG	GGG	CTT	ATT
Leu	Ala	Tyr 630	Ser	Gly	Leu	Ile
GAC	TCC	AGT	AGC	CTC	AGT	GTG

1029

Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val «·· ··* «····· · .* .,............

635

640

645

650

GCC

CCA

TGG

TGT

GAC

TGC

AGC

AAC

AGT

GGG

AAC

GAC

CTA

GAA

GAG

TGC

1077

Ala

Pro

Trp

Cys

Asp

Cys

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

Asp

Leu

Glu

Cys

655

660

665

TTG

AAA

TTT

TTG

AAT

TTC

AAG

GAC

AAT

ACA

TGT

CTT

AAA

AAT

GCA

1125

Leu

Lys

Phe

Leu

Asn

Phe

Lys

Asp

Asn

Thr

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

670

675

680

ATT

CAA

GCC

TTT

GGC

AAT

GGC

TCC

GAT

GTG

ACC

GTG

TGG

CAG

CCA

GCC

1173

Ile

Gin

Ala

Phe

Gly

Asn

Giy

Ser

Asp

Val

Thr

Val

Trp

Gin

Pro

Ala

685

690

695

TTC

CCA

GTA

CAG

ACC

ACT

GCC

ACT

ACC

ACT

GCC

CTC

CGG

GTT

1221

Phe

Pro

Val

Gin

Thr

Ala

Thr

Ala

Leu

A—g

Val

700

705

710

AAG

AAC

AAG

CCC

CTG

GGG

CCA

GCA

GGG

TCT

GAG

AAT

GAA

ATT

CCC

ACT

1269

Lys

Asn

Lys

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu

Asn

Glu

Ile

Pro

Thr

715

720

725

730

CAT

GTT

TTG

CCA

CCG

TGT

GCA

AAT

TTA

CAG

GCA

CAG

AAG

CTG

AAA

TCC

1317

His

Val

Leu

Pro

Cys

Ala

Asn

Leu

Gin

Ala

Gin

Lys

Leu

Lys

Ser

735

740

745

AAT

gtg

TCG

GGC

AAT

ACA

CA.C

CTC

TGT

ATT

TCC

AAT

GGT

AAT

TAT

GAA

1365

A.sn

Val

Ser

Glv

Asn

Thr

His

Leu

cys

Ile

Ser

Asn

Gly

Asn

Tyr

Glu

750

755

760

AAA

GAA

GCT

CTC

GGT

GCT

TCC

AGC

CA.C

ATA

ACC

ACA

AAA

TCA

A TG

GCT

1413

Lys

Glu

Gly

Leu

Gly

Ala

Ser

His

Ile

Thr

Lys

Ser

Met

Ala

765

770

775

GCT

CCT

CCA

AGC

TGT

C-GT

CTG

AGC

CCA

CTG

GTC

CTG

GTG

GTA

ACC

1461

Ala

Pro

Ser

Cys

Gly

Leu

Ser

Pro

Leu

Val

Leu

Val

Thr

780

785

790

GCT

CTG

TCC

ACC

CTA

TTA

TCT

TTA

ACA

GAA

ACA

TCA

TAGCTGCATT

1507

Ala

Leu

Ser

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr

Ser

795

800

805

AAAAAAATAC AATATGGACA TGTAAAAAG.A CAAAAACCAA GTTATCTGTT TCCTGTTCTC

1567

TTGTATAGCT GAAATTCCAG TTTAGGAGCT CAGTTGAGAA ACAGTTCCAT TCAACTGGAA

1627

CATTTTTTTT TTTTCCTTTT AAGAAAGCTT CTTGTGATCC TTCGGGGCTT CTGTG

1682 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 460 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární «*· ♦ ·

-?

(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

Met 1

Phe

Leu

Ala

Thr 5

Leu

Tyr

Phe

Ala

Leu 10

Pro

Leu

Asp

Leu 15

Leu

Ser

Ala

Glu 20

Val

Ser

Gly

Asp 25

Arg

Leu

Asp

cys

Val 30

Lys

Ala

Ser

Asp

Gin 35

Cys

Leu

Lys

Glu

Gin 40

Ser

Cys

Ser

Thr

Lys 45

Tyr

Arg

Thr

•

Leu

Arg 50

Gin

Cys

Val

Ala

Gly 55

Lys

Glu

Thr

Asn

Phe 60

Ser

Leu

Ala

Ser

Gly 65

Leu

Glu

Ala

Lys

Asp 70

Glu

Cys

Arg

Ser

Ala 75

Met

Glu

Ala

Leu

Lys 80

Gin

Lys

Ser

Leu

Tyr 65

Asn

Cys

Arg

Cys

Lys 90

Arg

Gly

Met

Lys

Lys 95

Glu

Lys

Asn

Cys

Leu 100

Arg

Ile

Tyr

Trp

Ser 105

Met

Tyr

Gin

Ser

Leu 110

Gin

cly

Asn

Asp

Leu 115

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro 120

Tyr

Glu

Pro

Val

Asn 125

Ser

Arg

Leu

Ser

Asp 130

Ile

Phe

Α2Γ C

Val

Val 135

Fro

Phe

Ile

Ser

Val 140

Glu

Kis

Ile

Pro

Lys 145

Gly

Asn

cys

Leu 150

Asp

Ala

Lys

Ala 155

Cys

Asn

Leu

Asp

Aso 160

Ile

cys

Lys

Tyr 165

Arg

Ser

Ala

Tyr

Ile 170

Thr

Pro

Cys

Thr

Thr 175

Ser

Val

Ser

Asn

Aso 160

Val

Cys

Asn

Arg

Arg 165

Lys

Cys

Kis

Lys

Ala 190

Leu

Arg

Gin

Phe

Phe 195

Asp

Lys

Val

Pro

Ala 200

Lys

Kis

Ser

Tyr

Giv 2 05

Met

Leu

Phe

♦'

Cys

Ser 210

cys

Arg

As?

Ile

Aid 215

Cys

Thr

Glu

Arg

Arg 220

Arg

Gin

Thr

Ile

Val 225

Pro

Val

Cys

Ser

Tyr 230

Glu

Arg

Glu

Lys 235

Pro

Asn

Cys

Leu

Asn 240

w

Leu

Gin

Asp

Ser

Cys 245

Lys

Thr

Asn

Tyr

Ile 250

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu 255

Ala

Asp

Phe

Thr 260

Asn

Cys

Gin

Pro

Glu . 265

Ser

Arg

Ser

Val

Ser 270

Ser

Cys

j ..

Leu

Lys

Glu

Asn

Ala

Asp

Cys

Leu

Ala

Tyr

Ser

Gly

Leu

Ile

275 260 265

Gly Thr Va.l Ker Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val 290 295 300

Ala 305

Pro

Trp

Cys Asp Cys 310

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn Asp Leu Glu Glu Cys

315

320

Leu

Lys

Phe

Leu

Asn

Phe

Lys

Asp

Asn

Thr

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

325

330

335

Ile

Gin

Ala

Phe

Gly

Asn

Gly

Ser

Asp

Val

Thr

Val

Trp

Gin

Pro

Ala

340

345

350

Phe

Pro

Val

Gin

Thr

Ala

Thr

Ala

Leu

Arg

Val

355

360

365

tys

Asn

Lys

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu

Asn

Glu

Ile

Pro

Thr

370

375

3S0

His

Val

Leu

Pro

cys

Ala

Asn

.Leu

Gin

Ala

Gin

Lys

Leu

Lys

Ser

385

390

395

400

Asn

Val

Ser

Gly

Asn

Thr

His

Leu

Cys

Ile

Ser

Asn

Gly

Asn

Tyr

Glu

405

410

415

.Lys

Glu

Gly

Leu

Gly

Ala

Ser

His

Ile

Thr

Lys

Ser

Ket

Ala

420

-

425

430

Ala

Pro

Ser

cys

Gly

Leu

Ser

Pro

Leu

Val

Leu

Val

Thr

435

440

445

Ala

Leu

Ser

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr

Ser

450

455

460

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1888 párů baží

- — - - - (-B-)· -T-Y-P-: -nu-ki-eová·-kyselina , (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (íx) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 25. . . 1416 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

AAAAAACGGT GGGATTTATT TAAC ATG ATC TTG GCA AAC GTC TTC TGC CTC

Ket Ile Leu Ala Asn Val Phe Cys Leu 465

TTC

TTT

CTA

GAC

GAG

ACC

CTC

CGC

TCT

TTG

GCC

AGC

CCT

TCC

Phe

Leu

Asp

Glu

Thr

Leu

Arg

Ser

Leu

Ala

Ser

Pro

Ser

470

475

480

485

CTG

CAG

GGC

CCC

GAG

CTC

CAC

GGC

TGG

CGC

CCC

CCA

GTG

GAC

TGT

GTC

Leu

Gin

Gly

Pro

Glu

Leu

His

Gly

Trp

Arg

Pro

Val

Asp

Cys

Val

490

495

500

CGG

GCC

AAT

.GAG

CTG

TGT

GCC

GAA

TCC

AAC

TGC

AGC

TCT

CGC

TAC

195 * ·

3B7

627

243

291

339

435

483 .53.1.

579

675

723

771

Arg

Ala

Asn

Glu 505

Leu

Cys

Aid

Ala

Glu 510

Ser

Asn

Cys

Ser

Ser 515

Arg

Tyr

CGC

ACT

CTG

CGG

CAG

TGC

CTG

GCA

GGC

CGC

GAC

CGC

AAC

ACC

ATG

CTG

Arg

Thr

Leu 520

Arg

Gin

cys

Leu

Ala 525

Gly

Arg

Asp

Arg

Asn 530

Thr

Met

Leu

GCC

AJ\C

AAG

GAG

TGC

CAG

GCG

GCC

TTG

GAG

GTC

TTG

CAG

GAG

AGC

CCG

Ala

Asn 535

Lys

Glu

Cys

Gin

Ala 540

Ala

Leu

Glu

Val

Leu 545

Gin

Glu

Ser

Pro

CTG

TAC

GAC

TGC

CGC

TGC

AAG

CC-G

GGC

ATG

AAG

GAG

CTG

CAG

TGT

Leu 550

Tyr

Asp

Cys

Arg

Cys 555

Lys

Arg

Gly

Met

Lys 560

Lys

Glu

Leu

Gin

cys 565

CTG

CAG

ATC

TAC

TC-G

AGC

ATC

CAC

CTG

GGG

CTG

ACC

GAG

GGT

GAG

Leu

Gin

Ile

Tyr

Trp 570

Ser

Ile

His

Leu

Gly 575

Leu

Thr

Glu

Gly

Glu 560

Glu

TTC

TAC

GAA

GCC

TCC

CCC

TAT

GAG

CCG

GTG

ACC

TCC

CGC

CTC

TCG

GAC

Phe

Tyr

Glu

Ala 565

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro 590

Val

Thr

Ser

Arg

Leu 595

Ser

Asp

ATC

TTC

AC-G

CTT

GCT

TCA

ATC

TTC

TCA

GGG

ACA

GGG

GCA

GAC

CCG

GTG

Ile

Phe

Arg 600

Leu

Ala

Ser

Ile

?he 605

Ser

Gly

Thr

Gly

Ala 610

Asp

Pro

Val

GTC

AGC

GCC

AAG

AC-C

AAC

CAT

TGC

CTG

GAT

GCT

GCC

A-AG

GCC

TGC

A-AC

Val

Ser 615

Ala

Lys

Ser

Asn

His 620

cys

Leu

Asp

Ala

Ala 625

Lys

Ala

Cys

Asn

CTG

PAT

GAC

AAC

TCP

AAG

CTG

CGC

TCC

TAC

ATC

TCC

ATC

TGC

Leu 630

Asn

Asp

Asn

Cys

Lvs 635

Lys

Leu

Arg

Ser

Ser 640

Tyr

Ile

Ser

Ile

Cvs 645

AAC

CGC

GAG

ATC

TCG

CCC

A.CC

GAG

CGC

TGC

AAC

CGC

AAG:'

TGC

CAC

Asn

Arg

C-lu

Ile

Se r 650

Pro

Thr

Glu

Arg

cys 655

Asn

Arg

Lys

Cys 660

His

AAG

GCC

CTG

CGC

CAG

TTC

GAC

CGG

GTG

CCC

AGC

GAG

TAC

ACC

TAC

Lys

Ala

Leu

Arg 665

Gin

Phe

Fhe

Asp

Arg 670

Val

Pro

Ser

Glu

Tyr 675

Thr

Tyr

CGC

ATG

CTC

TTC

TGC

TCC

TGC

CAA

GAC

CAG

GCG

TGC

GCT

GAG

CGC

Arg

Met

Leu 660

Phe

cys

Ser

cys

Gin 665

Asp

Gin

Ala

Cys

Ala 690

Glu

Arg

CGG

CAA

ACC

ATC

CTG

CCC

AGC

TGC

TCC

TAT

GAG

GAC

AAG

GAG

AAG

CCC

Arg

Gin 695

Thr

Ile

Leu

Pro

Ser 700

Cys

Ser

Tyr

Glu

Asp 705

Lys

Glu

Lys

Pro

AAC

TGC

CTG

GAC

CTG

CGT

GGC

GTG

TGC

CGG

ACT

GAC

CAC

CTG

TGT

CGG

619 tf.e c i?

í c c ti r- c

G 6 c

Γ. C f c C

Λ f r: c c t r C C

G ά c c fe cc **»· «;<ij ς C < ?

i* t c' c <·. o σ c C O o f. q C C ««.« QC ^oe

Asn

Cys

Leu

Asp

Leu’

Arg

Gly

Val

Cys

Arg

Thr

Asp

His

Leu

Cys

Arg

710

715

720

725

TGC

CGG

CTG

GCC

GAC

TTC

CAT

GCC

AAT

'tgt

CGA

GCC

TCC

TAC

CAG

ACG

667

Ser

Arg

Leu

Ala

Asp

Phe

Hi s

Ala

Asn

cys

Arg

Ala

Ser

Tyr

Gin

Thr

73 0^l

735

740

GTC

ACC

AGC

TGC

CCT

GCG

GAC

AAT

TAC

CAG

GCG'

.TGT

CTG

GGC

TCT

TAT

915

, J

-

ΐ

L- ' *i

Val

Thr

Ser

Cys

Pro

Ala

Asp

Asn

Tyr

Gin

Ala

Cys

Leu

Gly

Ser

Tyr

745

-

N,

750

755

GCT

GGC

ATG

ATT

GGG

TTT

GAC

ATG

ACA

CCT

AAC

TAT

GTG

GAC

TCC

AGC

963 .. -. .. . - . . , _Λ .. ...

Ala Gly Met Ile Gly Phe Asp'Met Thr Pro Asn'Tyr‘VaT Ásp^SeR Ser 760 765 770 , CCC ACT GGC atc gTg ’gtg'Tc'c čcč tgg 'tgc agc' TGT'CG? GGČ'AGC'GGG '1011

Pro	Thr^Gly.	Ile Val,Val Ser '· , :( > ,_7ÍO	Pro·	Trp	cys	Ser	cys	Arg, Gly	Ser	Gly
	775·					765'		-•._ý Λ·	..i..’:, n.; ·
AAC	ATG GAG	GAG GAG TGT GAG	AA.G	TTC	CTC	AGG	GAC	TTC	ACC	GAG	AAC
1059’·
Asn	Met Glu	Glu Glu Cys Glu	Lys·	Phe	Leu	Arg	Asp	Phe	Thr	Glu	Asn
790		' -795				800					805
	.. , f	. 3 -»¹ ’** ¹ i 5 'í.'*\|		;í	. í ’	. '	'Ί ,
CCA	TGC CTC	CC-G AAC , C-CC ATC	CAG	GCC	TTT	GGC	AAC	GGC	ACG	GAC	GTG
1107	V ._x . _t ·	, ý .
Pro i	Cys .'Leu	ArgjAsn'Ala· Ile	Gin	Ala	Phe	Gly	Asn	Gly	Thr	Aso	Val
’’	, h, <Hb, τ	^ · -·* * ' K-			615			,		820
AAC	GTG TCC	CCA AAA C-GC CCČ	TCG	TTC	CAG	GCC	ACC	CAG	GCC	CCT	CGG

; 1155 ......... Asn ’ · ‘ / r

Val'Ser + π .JÍ.

1' 'H A ¹¹ ~ Pro Lys Gly Pro Ser

Phe 830;

Gin ·.'»·< »

Ala, κ *

Thr '· f

C-ln

Ala '835:

Fro

Arg

82-5

• > r

GTG

GAG AAG

ACG CCT

TCT, TTG CCA

GAT

GAC

CTC AGT

GAC

AGT

ACC

AGC

1203

4

·**

''

Val

Glu Lys

Thr Pro

Ser Leu Pro

Asp

Leu

Ser

Asp

Ser

Thr

Ser

. 840

845

850

4

J

. ,, . ·.- rf X

hp *

•‘f·.' Ť*

X. A

*

TTG

GC-G ACC

AGT'GTC

ATC ACC ACC

TGC

ACG

TCT

GTC

CAG

GAG'

CAG

GGG

1251

4

Leu

Gly Thr

Sér Val

ile-Thr Thr

Cy.s^t

Thr

Ser

Val

Gin

Glu

Gin^J

^!lGly

855 -

860 ’

865

4

' ... *

< . ...

i M

*

·

·*ι·. -Γ-) '

' CTG ’

AAG^fGCC'

AAC AAC·

TCC' AAA GAG

TTA-

AGC

ATG

TGC

TTC

ACA

GAG

CTC

1299

*

Γ

Leu

Lys. Ala

Asn Asn

Ser.Lys Glu

Leu

Ser

Met

. Cys

Phe.

Thr

Glu

Leu

870

875

í

880

885

ACG

ACA AAT

ATC ATC

CCA GGG AGT

AAC

AAG

GTG

ATC

AAA

CCT

AAC

TCA

t

1347 ’

'•J

1 , ' >

'5

>· *·

Thr

Thr Asn

Ile Ile

Pro Gly Ser

Asn

Lys

Val

Ile

Lys

Pro

Asn

Ser

890

895

900

** 4 f·

GGC

CCC AGC

AGA C-CC

AGA CCG TCG*

GCT

GCC

TTG

ACC

GTG

CTG

TCT

GTC

1395

Gly

Pro Ser

Arg Ala

Arg Pro Ser

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Ser

Val

4

905

910

915

CTG ATG CTG AAA CTG GCC TTG TAGGCTGŤGG GAACCGAGTC AGAAGAŤTTT

1446 • · * * · ♦ · ·· · « · « · * ft« »· · * * · • · · · * • · ·«· ··*

Leu Met Leu Lys Leu Ala Leu 920

TGAAAGCTAC 1505	GCAGACAAGA	ACAGCCGCCT	GACGAAATGG
ACACCTTGCA 1566	AAAAAAAAA T	TGTTTTTCCC	ACCTTGTCGC
TTTCTTCTCT 1626	GGAGAAGTTT	TTGTAAACCA	AACAGACAAG
TGGCCCAGGG 1666	GTCCCCTGGC	A GGGG AAA C T	CTGGTGCCGG
AATGCCCTTC 1746	ACTTTCTCCT	GGTGTTTTTC	TCTCTGGACC
CAAGAGCCTG 1806	CAGCGGAAGG	GACTCTGGGC	TGTGCCTGAG
CACAGCTGCT 1666	TCCCCAGGCT	GCCCACTCTG	GGGACCCGCT
GGTCAGGGGG 1668	GCAGCGGGGC	TG

AAACACACAC AGACACACAC

TGAACCTGTC TCCTCCCAGG

CAGGCAGGCA GCCTGAGAGC

GGAGGGCACG AGGCTCTAGA

CTTCTGAAGC AGAGACCGGA

GCTGGCTGGG GC-CAGGACAA

GGGGGCTGGC AGAGGGCATC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 464 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

.............(D)- TOPOLOG-IE :· lineární .....- - - .........— (ii) TYP MOLEKULY: protein'

(xi) POPIS

SEKVENCE:

SEKVENCE Ξ

IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM

13:

Met

Ile

Leu

Ala

Asn

Val

Phe

Cys

Leu

Phe

Leu

Asp

Glu

Thr

1

ς

10

15

Leu

Arg

Ser

Leu

Ala

Ser

Pro

Ser

Leu

Gin

Gly

Pro

Glu

Leu

His

20

25

30

Gly

Trp

Arg 35

Pro

Val

Asp

Cys 40

Val

Arg

Ala

Asn

Glu 45

Leu

Cys

Ala

• 4

Ala

Glu

Ser

Asn

Cys

Ser

Arg

Tyr

Arg

Thr

Leu

Arg

Gin

Cys

Leu

50

55

60

Ala

Gly

Arg

Asp

Arg

Asn

Thr

Met

Leu

Ala

Asn

Lys

Glu

Cys

Gin

Ala

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Leu

Gin

Glu

Ser

Pro

Leu

Tyr

Asp

Cys

Arg

Cys

Lys

65

90

95

Arg

Gly

Met

Lvs

Lys

Glu

Leu

Gin

Cys

Leu

Gin

Ile

Tyr

Trp

Ser

Ile

*' *

100

105

110

His

Leu

Gly

Leu

Thr

Glu

Gly

Glu

Phe

Tyr

Glu

Ala

Ser

Pro

Tyr

i ύ

115

120

125

*

Glu

Pro

Val

Thr

Ser

Arg

Leu

Ser

Asp

Ile

Phe

Arg

Leu

Ala

Ser

Ile

130

135

14 0

Phe 145

Ser

Gly

Thr Gly

Ala As? 150

Pro Val

Val

Ser 155

Ala

Lys

Ser

Asn

His 160

Cys

Leu

Asp

Ala Ala 155

Lys Ala

Cys Asn

Leu 170

Asn

Asp

Asn

Cys

Lys 175

Lys

Leu

Arg

Ser

Ser Tyr 160

Ile Ser

Ile Cys 165

Asn

Arg

Glu

Ile

Ser 190

Pro

Thr

Glu

Arg

cys 195

Asn Arg

Arg Lys

Cys His 200

Lys

Ala

Leu

Arg 205

Gin

Phe

Asp

Arg 210

Val

Pro Ser

Glu Tyr 215

Thr Tyr

Arg

Kec

Leu 220

Phe

Cys

Ser

cys

Gin 225

Asp

Gin

Ala Cys

Ala Glu 230

Arg Arg

Arg

Gin 235

Thr

Ile

Leu

Pro

Ser 240

cys

Ser

Tyr

Glu Asp 245

Lys Glu

Lys Pro

Asn 250

Cys

Leu

Asp

Leu

Arg 255

Gly

Val

Cys

Arg

Thr Asp 260

His Leu

Cys Arg 265

Ser

Arg

Leu

Ala

Asp 270

Phe

His

Ala

Asn

Cys 275

Arg Ala

Ser Tyr

Gin Thr 280

Val

Thr

Ser

Cys 285

Pro

Ala.

Asp

Asn

Tyr 290

Gin

Ala Cys

Leu Glv 2S5

Ser Tyr

Ala

Gly

Ket 300

Ile

Gly

Phe

Asp

Ket 305

Thr

Pro

Asn Tyr

Val Asp 310

Ser Ser

Pro

Thr 315

Gly

Ile

Val

Sgt 320

O -.0.

* - h*

Ser Cys 325

Arg 'Gly'

' Sér’ Gly

Ash 330

Ket .. v ^l·

Glu

Cys 335

Glu

Lys

Phe

Leu

Arg As o 340

Phe Thr

Glu Asn 345

Pro

Cys

Leu

Arg

Asn 350

Ala

Ile

Gin

Ala

Phe 355

Gly Asn

Gly Thr

Asp Val 3 60

Asn

Val

Ser

Pro 365

Lys

Gly

Pro

Ser

Phe 370

Gin

Ala Thr

Gin Ala 37 5

Pro Arg

Val

Glu

Lys 380

Thr

Pro

Ser

Leu

Pro 365

Asp

Leu Ser

Asp Ser 390

Thr Ser

Leu

Gly 395

Thr

Ser

Val

Ile

Thr 400

Thr

Cys

Thr

Ser Val 405

C-ln Glu

Gin Gly

Leu 410

Lys

Ala

Asn

Ser 415

Lys

Glu

Leu

Ser

Ket Cys 420

Phe Thr

Glu Leu 425

Thr

Asn

Ile

Ile 430

Pro

Gly

Ser

Asn

Lys 435

Val Ile

Lys Pro

Asn Ser 440

Gly

Pro

Ser

Arg 445

Ala

Arg

Pro

Ser

Ala 450

Ala

Leu Thr

Val Leu 455

Ser Val

Leu

Met

Leu 460

Lys

Leu

Ala

Leu

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1878 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární • »

4 ♦ 4 i

• 44 • 4 4 4 4

4 4 4 4 4

4* 44 *· ·44

444 444 β

44 (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZŇAČENÍ: CDS (B) POZICE: 205...1242 (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

CGCGGCGCCC AGCGCAGGCA GAGCGCTGTC GCATCCCGGG CGTCCACCCG CCATGGGGCT

CTCCTGGAGC CCGCGACCTC CACTGCTGAT GATCCTGCTA CTGGTGCTGT CGTTGTGGCT

120

GCCACTTGGA GCAGGAAACT CCCTTGCCAC AGAGAACAGG TTTGTGAACA GCTGTACCCA

180

GGCCAGAAAG AAATGCGAGG CTAA TCC CGC TTG GAA GGC TGC CTA CCA GCA

231

Ser Arg Leu Gin Gly Cys Leu Pro Ala

465

470

CCT

GGG

CTC

CTG

CAC

CTC

CAG

TTA

AGC

AGG

CCG

CTG

CCC

TTA

GAG

GA.G

279

Pro

Gly

Leu

His

Leu

C-ln

Leu

Ser

Arg

Pro

Leu

Pro

Leu

Glu

475

4E0

485

TCT

GCC

ATG

TCT

GCA

GAC.

TGC

CTA

GAG-

•GCA

SC-A

. /“'Λ.*. c.-„n

CTC

AGG

AAC

327

Ser

Ala

Ket

Ser

Ala

A.so

Cys

Leu

Glu

Ala

Ala'

Glu

Gin

Leu

Arg

Asn

490

495

500

505

AGC

TCT

CTG

A7A

GAC

TGC

AGG

TGC

CAT

CGG

CC-C

ATG

AAG

CAC

CAA

GCT

375

Ser

Leu

Ile

AS?

Cys

Arc

cys

His

Arg

Kec

Lys

His

Gin

Ala

.li

510

515

520

ACC

TGT

CTG

C-AC

ATT

TAT

TGG

ACC

C-TT

CAC

CCT

GCC

CGA

AGC

CTT

GGT

423

Thr

Cys

Leu

Asp

Ile

Tyr

Trp

Thr

Val

His

Pro

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

525

530

535

GAC

TAC

GAG

TTG

GAT

GTC

TCA

CCC

TAT

GAA

GAC

ACA

GTG

ACC

AGC

' AAA

471

Asp

Tyr

Glu

Leu

Asp

Val

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

540

545

550

519

CCC

TGG

AAA

ATG

AAT

CTT

AGC

AAG

TTG

AAC

ATG

CTC

AAA

CCA

GAC

TCG

Pro

Trp

Lys

Ket

Asn

Leu

Ser

Lys

Leu

Asn

Ket

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

«i¹

555

560

565

567

GAC

CTC

TGC

CTC

AAA

TTT

GCT

ATG

CTG

TGT

ACT

CTT

CAC

GAC

AAG

TGT

i

Asp

Leu

Cys

Leu

Lys

Phe

Al a

Kec

Leu

Cys

Thr

Leu

His

Asp

Lys

Cys

b

570

575

580

565

•J *· ·· ·· » <

► · · <

··· ··<

* I

GAC

615

Asp

CAG

663

Gin

GCA

711

Ala

GAT

759

Asp

GCC

S07

Ala

650

CGT

855

Arg

TGT

903

Cys

TGT

951

Cys

TTC

999

Phe

GGC

1047

Gly

730

TCC

1095

Ser

CAC

1143

His * · «·

CGC

CTG

CGC

AAG

GCC

TAC

GGG

GAG

GCA

TGC

TCA

GGG

ATG

CGC

TGG

Arg

Leu

Arg

Lys

Ala

Tyr

Gly

Glu

Ala

Cys

Ser

Gly

Ile

Arg

Cys

590

595

600

CGC

CAC

CTC

TGC

CTA

GCC

CAG

CTG

CGC

TCC

TTC

TTT

GAG

AAG

GCA

Arg

His

Leu

cys

Leu

Ala

Gin

Leu

Arg

Ser

Phe

Glu

Lys

Ala

605

610

615

GAG

TCC

CAC

GCT

CAG

GGT

CTG

TGT

CCC

4 Vi

GCA

CCA

GAA

Glu

Ser

His

Ala

Gin

Gly

Leu

cys

Pro

Cys

Ala

Pro

Glu

620

625

630

GCG

GGC

TGT

GGG

GAG

CGG

CGT

AAC

ACC

ATC

GCC

CCC

AGT

TGC

Ala

Gly

Cys

Gly

Glu

Arg

Asn

Thr

Ile

Ala

Pro

Ser

Cys

635

640

645

CTG

CCT

TCT

GTA

ACC

CCC

AAT

TGC

CTG

GAT

CTG

CGG

AGC

TTC

TGC

Leu

Pro

Ser

Val

Thr

Pro

Asn

Cys

Leu

Asp

Leu

Arg

Ser

Phe

Cys

655

660

665

GCG

GAC

CCT

TTG

TGC

AGA

TCA

CGC

CTG

ATG

GAC

TTC

CAG

ACC

CAC

Ala

Asp

Pro

Leu

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Met

Asp

Phe

Gin

Thr

Kis

670

675

660

CAT

CCT

ATG

C-AC

* -V/% i

CTT

GGG

ACT

TGT

GCA

ACT

C-AG

CAG

TCC

AGÁ

His

Pro

Met

Asp

Ile

Leu

Gly

Thr

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin

Ser

Arg

685

690

69 5

CTG

CGG

GCA

TAC

CTG

GGG

CTG

ATT

GGG

ACT

GCC

ATC

ACC

CCA

AAC

Leu

Arg

Ala

iyr

Leu

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

Pro

Asn

700

705

710

ATC

AGC

A-AG

GTC

AAC

ACT

GTT

GCC

TTA

AGC

TGC

ACC

TGC

CGA

Ile

Ser

Lys

Val

Asn

Thr

val

Ala

Leu

Ser

Cys

Thr

Cys

Arg

715

720

725

AGC

GGC

AAC

CTA

CAG

GAC

GAG

TGT

GAA

CAG

CTG

C-A-A

AGG

TCC

TTC

Ser

Gly

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Cys

Glu

Gin

Leu

Glu

Arg

Ser

Phe

735

740

745

CAG

AAC

CCC

TGC

CTC

GTG

GAG

GCC

ATT

GCA

GCT

AAG

ATG

CGT

TTC

Gin

Asn

Pro

cys

Leu

Val

Glu

Ala

Ile

Ala

Lys

Met

Arg

Phe

750

755

760

AGA

CAG

CTC

TTC

tcc

CAG

GAC

TGG

GCA

GAC

TCT

ACT

TTT

TCA

GTG

Arg

Gin

Leu

Phe

Ser

Gin

Asp

Trp

Ala

Asp

Ser

Thr

Phe

Ser

Val

76S

770

775

CAG

AAC

AGC

AAC

CCT

GCT

CTG

AGA

CTG

CAG

CCC

AGG

CTA

Gin

Asn

Ser

Asn

Pro

Ala

Leu

Arg

Leu

Gin

Pro

Arg

Leu

780

785

790

GTG

1191

Val • 44

44

4« 4 4 • ·· * · * • · ·

444 44 *· ·4

4 4 · • 4 4 4

CCC ATT CTT TCT TTC TCC ATC CTT CCC TTG ATT CTG CTG CAG ACC CTC

1239

Pro Ile Leu Ser Phe Ser Ile Leu Pro Leu Ile Leu Leu Gin Thr Leu 795 600 SOS

TGG TAGCTGGGCT TCCTCAGGGT CCTTTGTCCT CTCCACCACA CCCAGACTGA

1292

Trp

810

TTTGCAGCCT 1352	GTGGTGGGAG	AGAViCTCGCC	AGCCTGTGGA	AGAAGACGCA	GCGTGCTACA
CAGCAACCCG 1412	GAACCAACCA	GGCATTCCGC	AGCACATCCC	GTCTGCTCCA	GAAGAGGTCT
TAGAAGTGAG 1472	GGCTGTGACC	CTTCCGATCC	TGAGCGGCTA.	gttttcaaac	CTCCCTTGCC
CCTGCTTCCT 1532	TCTGGCTCAG	GCTGCTCCTC	CTTAGGACTT	'tgtgggtcca	GTTTTGCCTT
CTGTTCTGAT 1592	GGTGATTAGC	GGCTGACCTC	CAGCGCTTCT	tcctgtttcc	CAGGACCACC
CAGAC-GCTAA 1652	GGAATCAGTC	ATTCCCTGTT	GCCTTCTCCA	GGAAGGCAGG	CTAAGGGTTC
TGAGGTGACT 1712	GAG AAAAA TG	TTTCCTTTGT	GTGGAAGGCT	GGTGCTCCAG	CCTCCACGTC
CCTCTGAATG 1772	GAAGATAAAA	ACCTGCTGGT	GTCTTGACTG	CTCTGCCAGG	CAATCCTGAA
X1 1' i 'cKÁJV. Λ 1832	* i Λ-r·, v a g c ta	AAGTCTTTGG	GŤCTTGTŤŤA	ACŤCČŤATŤA	CTGŤCCCCAA
ATTCCCCTAG	TCCCTTGGG7	C λ TG λ T T A.-A	CATTTTGACT	TAAAAA

1878 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI Ξ IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 346 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

Ser 1

Arg

Leu

Gin

Gly 5

Cys

Leu

Pro

Ala

Pro 10

Gly

Leu

His

Leu 15

Gin

Leu

Ser

Arg

Pro 20

Leu

Pro

Leu

Glu

Glu 25

Ser

Ala

Met

Ser

Ala 30

Asp

Cys

l.

Leu

Glu

Ala 35

Ala

Glu

Gin

Leu

Arg 40

Asn

Ser

Leu

Ile 45

Asp

Cys

Arg

Cys

His 50

Arg

Met

Lys

His 55

Gin

Ala

Thr

Cys

Leu 60

Asp

Ile

Tyr

Trp

Thr Val His Pro Ala Arg Ser Leu Gly Asp Tyr Glu Leu Asp Val Ser • ♦

*

65

70

75

80

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

Lys

Met

Asn

Leu

Ser

£5

90

95

Lys

Leu

Asn

Met

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

Cys

Leu

Lys

Phe

Ala

100

105

110

Met

Leu

Cys

Thr

Leu

Kis

Asp

Lys

cys

Asp

Arg

Leu

Arg

Lys

Ala

Tyr

115

120

125

Gly

Glu

Ala

Cys

Ser

Gly

Ile

Arg

cys

Gin

Arg

His

Leu

Cys

Leu

Ala

130

135

140

Gin

Leu

Arg

Ser

Phe

Glu

Lys

Ala

Glu

Ser

Kis

Ala

Gin

Gly

145

150

155

160

v

Leu

Cys

Pro

Cys

Ala

Pro

Glu

Asp

Ala

Gly

Cys

Gly

Glu

Arg

165

170

175

Arg

Asn

Thr

Ile

Ala

Pro

Ser

Cys

Ala

Leu

Pro

Ser

Val

Thr

Pro

c

ISO

185

190

Asn

Cys

Leu

Asp

Leu

Arg

Ser

Phe

Cys

Arg

Ala

Asp

Pro

Leu

Cys

Arg

195

200

205

Ser

Aro

Leu

Met

Asp

Phe

Gin

Thr

Kis

Cys

Kis

Pro

Met

Asp

Ile

Leu

210

215

220

Glv

Thr

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin

Ser

Arg

Cys

Leu

Arg

Ala

Tyr

Leu

Gly

225

230

235

240

Leu

Ile

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

Pro

Asn

Phe

Ile

Ser

Lys

Val

Asn

Thr

245

250

255

Th**

Val

Ala

Leu

Ser

Cys

Thr

cys

Arg

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Gin

Asp

-

260

2 65

.....

27 0··

Glu

Cys

Glu

Gin

Leu

Glu

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

Pro

Cys

Leu

Val

275

2 S 0

285

Glu

Ala

Ile

Ala

Lvs

Met

Arg

Phe

Kis

Arg

Gin

Leu

Phe

Ser

Gin

290

295

300

Asp

Trp

Ala

As?

Ser

Thr

Phe

Ser

Val

Gin

Asn

Ser

Asn

305

310

315

320

Pro

A1&

Leu

Arg

Leu

Gin

Pro

Arg

Leu

Pro

Ile

Leu

Ser

Phe

Ser

Ile

325

330

335

Leu

Pro

Leu

Ile

Leu

Gin

Thr

Leu

Trp

*

340

345

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1889 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 41...1231 • v íxi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

CGCAGGCAGA GCGCTGTCGC ATCCCGGGCG TCCACCCGCC

ATG GGG CTC TCC TGC

Met Gly Leu Ser Trp 350

151

535

103

199

247

295

343

391

439

487

AGC

CCG

CGA

CCT

CCA

CTG

CTG ATG

ATC

CTG

CTA

CTG

GTG

CTG

TCG

TTG

Ser

Pro

Arg

Pro

Leu

Leu Met

Ile

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

355

360

365

TGG

CTG

CCA

CTT

GGA

C-CA

GGA AAC

TCC

CTT

GCC

ACA

GAG

AAC

AGG

TTT

Trp

Leu

Pro

Leu

Gly

Ala

Gly Asn

Ser

Leu

Ala

Thr

Glu

Asn

Arg

Phe

370

375

380

GTG

AAC

AGC

TGT

ACC

CAG

GCC AGA

AAG

AAA

TGC

GAG

GCT

AAT

CCC

GCT

Val

Asn

Ser

Cys

Thr

Gin

Ala Arg

Lys

cys

Glu

Ala

Asn

Pro

Ala

385

390

395

TGC

AAG

GCT

GCC

TAC

CAG

CAC CTG

GGC

TCC

TGČ

ACC

TCC

AGT

TTA

AGC

Cys

Lys

Ala

Tyr

Gin

His Leu

Gly

Ser

Cys

Thr

Ser

Leu

Ser

400

405

410

415

AGG

CCG

CTG

CCC

TTA

GAG

GAG TCT

GCC

ATG

TCT

GCA

GAC

TGC

CTA

GAG

Arg

Pro

Leu

Pro

Leu

Glu

Glu Ser

Ala

Met

Ser

Ala

Asp

cys

Leu

Glu

Í70

425

430

GCA

•GCA

GAA

CAA

CTC-

AGG-

AAC-AGC

TCT'

CTG

ATA

GAC

TGC

AGG

TGC

CAT

Ala

Glu

Gin

Leu

Arg

Asn Ser

Ser

Leu

Ile

Asp

Cys

Arg

Cys

His

435

440

445

CGG

CGC

H i

Aj-.G

CAC

CAA

GCT ACC

TGT

CTG

GAC

ATT

TAT

TGG

ACC

GTT

Arg

Met

Lys

His

Gin

Ala Thr

Cys

Leu

Asp

Ile

Tyr

Trp

Thr

Val

450

455

460

CAC

CCT

GCC

CGA

AGC

CTT

GGT GAC

TAC

GAG

TTG

GAT

GTC

TCA

CCC

TAT

His

Pro

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly Asp

Tyr

Glu

Leu

Asp

Val

Ser

Pro

Tyr

465

470

475

GAA

GAC

ACA

GTG

ACC

AGC

AAA CCC

TGG

AAA

ATG

AAT

CTT

AGC

AAG

TTG

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys Pro

Trp

Lys

Met

Asn

Leu

Ser

Lys

Leu

4.80

485

490

495

AAC

ATG

CTC

AAA

CCA

GAC

TCG GAC

CTC

TGC

CTC

AAA

TTT

GCT

ATG

CTG

Asn

Met

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser Asp

Leu

Cys

Leu

Lys

Phe

Ala

Met

Leu

500

505

510

TGT

ACT

CTT

CAC

GAC

AAG

TGT GAC

CGC

CTG

CGC

AAG

GCOTAC

GGG

GAG

Cys

Thr

Leu

His

Asp

Lys

Cys Asp

Arg

Leu

Arg

Lys

Ala

Tyr

Gly

Glu

515

520

525

·♦ ♦ · · · • · 9 ·

99« ·9·

9

99

583

f *

⁹³

» « β • • • Μ Λ

·· • · ·· • · • · ··

• v

• 4 ·» • ♦ · · • · « · * Mt • · • «· ··

* • · • «

• » a a a

GCA

TGC

TCA

GGG

ATC

CGC

TGC

CAG

CGC

CAC

CTC

TGC

CTA

GCC

CAG

CTG

631

Ala

Cys

Ser

Gly

Ile

Arg

Cys

Gin

Arg

Kis

Leu

Cys

Leu

Ala

Gin

Leu

530

535

540

CGC

TCC

TTC

TTT

GAG

AAG

GCA

GAG

TCC

CAC

GCT

CAG

GGT

CTG

679

Arg

Ser

Phe

Glu

Lys

Ala

Glu

Ser

His

Ala

Gin

Gly

Leu

S45

550

555

CTG

TGT

CCC

TGT

GCA

CCA

GAA

GAT

GCG

GGC

TGT

GGG

GAG

CGG

CGT

727

Leu

Cys

Pro

cys

Ala

Pro

Glu

Asp

Ala

Gly

Cys

Gly

Glu

Arg

560

565

570

575

AAC

ACC

ATC

GCC

CCC

AGT

TGC

GCC

CTG

CCT

TCT

GTA

ACC

CCC

AAT

TGC

775

Asn

Thr

Ile

Ala

Pro

Ser

Cys

Ala

Leu

Pro

Ser

Val

Thr

Pro

Asn

Cys

580

585

590

CTG

GAT

CTG

CGG

AGC

TTC

TGC

CGT

GCG

GAC

CCT

TTG

TGC

AGA

TCA

CGC

823

Leu

Asp

Leu

Arg

Ser

Phe

Cys

Arg

Ala

Asp

.Pro

Leu

Cys

Arg

Ser

Arg

595

600

605

CTG

ATG

GAC

TTC

CAG

ACC

CAC

TGT

CAT

CCT

ATG

GAC

ATC

CTT

GGG

ACT

871

Leu

Met

Asp

Phe

Gin

Thr

Kis

Cys

His

Pro

Met

Asp

Ile

Leu

Gly

Thr

610

615

620

TGT

GCA

ACT

GAG

CAG

TCC

AGA

TGT

CTG

CGG

GCA

TAC

CTG

GGG

CTG

ATT

919

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin

Ser

Aro

cys

Leu

Arg

Ala

Tyr

Leu

Gly

Leu

Ile

6 2 5

•6-3 Ó-

□ 3-5

GGG

* /'T 1

GCC

ATG

ACC

CCA

AAC

TTC

ATG

AGC

AAG

GTC

* ·»

ACT

GTT

, , .....

967

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

Pro

Asn

Phe

Ile

Ser

Lys

Val

Asn

Thr

Val

640

645

650

655

' GCC

1 1Λ

AGC

TGC

ACC

TGC

CGA

GGC

AGC

GGC

AAC

CTA

CAG

GAC

GAG

TGT

1015

Ala

Leu

Ser

cys

Thr

Cys

Arg

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Cys

650

665

670

GAA

CAG

CTG

GAA

AC-G

TCC

TTC

TCC

CAG

AAC

CCC

TGC

CTC

GTG

GAG

GCC

1063

Glu

Gin

Leu

Glu

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

Pro

Cys

Leu

Val

Glu

Ala

675

680

685

ATT

GCA

GCT

AAG

ATG

CGT-

TTC

CAC

AGA

CAG

CTC

TTC

TCC

CAG

GAC

TGG

1111

Ile

Ala

Lys

Met

Arg

Phe

Kis

Arg

Gin

Leu

Phe

Ser

Gin

Asp

Trp

690

695

700

GCA

GAC

TCT

ACT

TTT

TCA

GTG

CAG

AAC

AGC

AAC

CCŤ

GCT

1159

Ala

Asp

Ser

Thr

Phe

Ser

Val

Gin

Asn

Ser

Asn

Pro

Ala

705

710

715

CTG

AGA

CTG

CAG

CCC

AGG

CTA

CCC

ATT

CTT

TCT

TTC

TCC

ATC

CTT

CCC

1207

i

Leu

Arg

Leu

Gin

Pro

Arg

Leu

Pro

Ile

Leu

Ser

Phe

Ser

Ile

Leu'

Pro

720

725

730

735

··

9· » · « ♦· • · · ·

9*

999 «9

9« • · · i * · · 9

9* 9··

9· 99 · · * • 9 9 * • ·9· ··· • · • 9 99

TTG ATT CTG CTG CAG ACC CTC TCG TAGCTGGGCT TCCTCAGGGT CCTTTGTCCT

1261

Leu Ile Leu Leu Gin Thr Leu Trp 740

CTCCACCACA 1321	CCCAGACTGA	TTTGCAGCCT	G7GG7GGGAG	AGAACTCGCC	AGCCTGTGGA
AGAAGACGCA 1361	GCGTC-CTACA	CAGCAACCCG	GAACCAACCA	GGCATTCCGC	AGCACATCCC
GTCTGCTCCA 1441	GAAGAGGTCT	TAGAAGTGAG	GGCTGTGACC	CTTCCGATCC	TGAGCGGCTA
GTTTTCAAAC 1501	CTCCCTTGCC	CCTGCTTCCT	TCTGGCTCAG	GCTGCTCCTC	CTTAGGACTT
TGTGGGTCCA 1561	GTTTTGCCTT	CTGTTCTGAT	GGTGATTAGC	GGCTCACCTC	CAGCGCTTCT
TCCTGTTTCC 1621	CAGGACCACC	cagaggctaa	GGAATCAGTC	ATTCCCTGTT	GCCTTCTCCA
GGAAGGCAGG 1681	CTAAGGGTTC	TGAGGTGACT	GAGAAAAATG	TTTCCTTTGT	GTGGAAGGCT
GGTGCTCCAG 1741	CCTCCACGTC	CCTCTGAATG	GAAGATAAAA	ACCTGCTGGT	GTCTTGACTG
CTCTGCCAGG 1801	CAATCCTGAA	CATTTGGGCA	TGAAGAGCTA	AAGTCTTTGG	GTCTTGTTTA
ACTGCTATTA 1£-6T	CTGTCCCCAA	ATTCCCCTAG	TCCCTTGGGT	CATC-ATTAAA	CA.TTTTGACT
1	ΑΑΑΑΛΑΑΛΑΛ	AAAAAAAA

18,89 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

' ¥ (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 397 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

ď

Met 1 Leu

Gly Val

Leu Leu

Ser Ser 20

Trp Ser 5

Pro Arg

Pro Leu 25

Pro Leu Leu Met 10

Ile Ser 30

Leu 15 Leu

Leu Ala

Leu

Trp

Leu

Pro

Gly

Ala

Gly

Asn

·' w¹

Thr

Glu

Asn

Arg

Phe

Val

Asn

Ser

Cys

Thr

Gin

Ala

Arg

Lys

Cys

*

35

40

45

Glu

Ala

Asn

Pro

Ala

Cys

Lys

Ala

Tyr

Gin

His

Leu

Gly

Ser

Cys

•i·.

50

55

60

Thr

Ser

Leu

Ser

Arg

Pro

Leu

Pro

Leu

Glu

Ser

Ala

Met

Ser

65

70

75

80

»4 *»

4* 4 4 · *

95

« • • « 4

• • ·

4 · 4 4 ·

• 4 •

4 9

Ala

Asp

Cys

Leu

Glu

Ala

Glu

Gin Leu

Arg

Asn

Ser

Leu

Ile

85

90

95

Asp

Cys

Arg

Cys

His

Arg

Met

Lys His

Gin

Ala

Thr

Cys

Leu

Asp

ICO

105

110

Ile

Tyr

Trp

Thr

Val

His

Pro

Ala

Arg Ser

Leu

Gly

Asp

Tyr

Glu

Leu

115

120

125

Asp

val

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

Lys

Met

130

135

140

Asn

Leu

Ser

Lys

Leu

Asn

Met

Leu

Lys Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

Cys

Leu

145

150

155

160

Lys

Phe

Ala

Ker

Leu

cys

Thr

Leu

His Asp

Lys

Cys

Asp

Arg

Leu

Arg

165

170

175

Lys

Ala

Tyr

Gly

Glu

Ala

Cys.

Ser

Gly Ile

Arg

Cys

Gin

Arg

His

Leu

180

185

190

Cys

Leu

Ala

Gin

Leu

Arg

Ser

Phe

Phe Glu

Lys

Ala

Glu

Sér

His

195

200

205

Ala

Gin

Gly

Leu

Cys

Pro

Cys Ala

Pro

Glu

Asp

Ala

Gly

Cys

210

215

220

Gly

Glu

Arg

A-rg

Asn

Thr

Ile

Ala Pro

Ser

Cys

Ala

Leu

Pro

Ser

225

230

235

240

Val

Thr

Pro

Asn

Cys

Leu

Asp

Leu

Arg Ser

Phe

Cys

A-g

Ala

Asp

Pro

245

250

255

Ley

Cys

Are

Ser

Leu

her

rt S p'

?he' 'Gin

ΤΓίΣ“

H‘iš

cys

His

Pro

Met

260

265

270

Asp

Ile

Leu

Gly

Thr

Cys

Ala

Thr

Glu Gin

Ser

Arg

Cys

Leu

Arg

Ala

275

280

285

Tyr

Leu

Gly

Leu

Ile

c-ly

Thr

Ala

Met Thr

Pro

Asn

Phe

Ile

Ser

Lys

250

295

300

Val

Asn

Thr

Val

Ala

Leu

Ser

Cys Thr

Cys

Arg

Gly

Ser

Gly

Asn

305

310

315

320

Leu

Gin

Asp

Glu

Cys

Glu

Gin

Leu

Glu Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

Pro

325

330

335

Cys

Leu

Val

Glu

Ala

Ile

Ala

Lys Met

Arg

Phe

His

Arg

Gin

Leu

340

345

350

Phe

Ser

Gin

Asp

Trp

Ala

Asp

Ser

Thr Phe

Ser

Val

Gin

355

360

365

Asn

Ser

Asn

Pro

Ala

Leu

Arg

Leu

Gin Pro

Arg

Leu

Pro

Ile

Leu

Ser

370

375

380

Phe

Ser

Ile

Leu

Pro

Leu

Ile

Leu

Leu Gin

Thr

Leu

Trp

385

390

395

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1271 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP 'VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární « 4 * · »· ·»· (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (3) POZICE: 2...946 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

C GGC TAC TGT GA_A ACA CCT CAA CTC AGG AAC AGC TCT CTG ATA GGC 46

Gly Tyr Cys Glu Thr Pro Gin Leu Arg Asn Ser Ser Leu Ile Gly ‘ 400 405 410

v

94

TGC ATG

TGC CAC CGG CGC ATG AAG AAC CAG GTT GCC TGC TTG GAC ATC

Cys

Ket

Cys 415

His

Arg

Arg Ket

Lys 420

Asn

Gin

Val Ala

cys 425

Leu

Asp

Ile

TAT

TGG

ACC

GTT

CAC

CGT

GCC

CGC

AGC

CTT

GGT

AAC

TAT

GAG

CTG

GAT

142

Tyr

Trp

Thr

Val

His

Arg

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

Asn

Tyr

Glu

Leu

Asp

430

43 5

440

GTC

TCC

CCC

TAT

GAA

GAC

ACA

GTG

ACC

AGC

AAA

CCC

TGG

AAA

ATG

AAT

190

Val

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

Lys

Ket

Asn

445

450

455

460

Γ'ίΤν*

’ΛΛΛ

CTG'

AAC

ATG

CTC

ΑΛΛ

CCA

GAC

TCA

GAC

CTC

TGC

CTC

AAG

238

Leu

Ser

Lys

Leu

Asn

Ket

Leu

bys

Pro

Asn

Ser

Asp

Leu

Cys

Leu

Lys

465

470

475

GCC

ATG

CTG

TGT

ACT

CTC

AAT

GAC

AAG.

TGT

GAC

CGG

CTG

CGC

AA.G

*5

286

Phe

Ala

Ket

Leu

cys

Thr

Leu

Asn

Asp

Lys

Cys

Asp

Arg

Leu

Arg

Lys

480

485

490

GCC

TAC

C-GG

GAG

C-CG

TGC

TCC

GGG

CCC

CAC

TGC

CAG

CGC

CAC

GTC

TGC

334

Ala

Tyr

Gly

Glu

Ala

Cys

Ser

Gly

Pro

His

Cys

Gin

Arg

His

Val

cys

495

500

505

CTC

AGG

CAG

CTG

CTC

ACT

TTC

GAG

AAG

GCC

GAG

CCC

CAC

GCG

382

Leu

Arg

Gin

Leu

Thr

Phe

Glu

Lys

Ala

Glu

Pro

His

Ala

510

515

520

CAG

GGC

CTG

CTA

CTG

TGC

CCA

TGT

GCC

CCC

AAC

GAC

CGG

GGC

TGC

GGG

430

Gin

Gly

Leu

Cys

Pro

Cys

Ala

Pro

Asn

Asp

Arg Gly

Cys

Gly

525

530

535

540

GAG

CGC

CGG

CGC

AAC

ACC

ATC

GCC

CCC

AAC

TGC

GCG

CTG CCG

CCT

GTG

Glu

Arg

Asn

Thr

Ile

Ala

Pro

Asn

Cys

Ala

Leuf/Pro

Pro

Val

545 550 555

478 ¢1

Ií

766 li •1' i

• ·· ·· «* * · · · • ·· * · * · · » · · * * · · · ··* *· ·· «·»

526

574

622

670

71S

814

862

910

956

GGC

CCC

AA.C

TGC

CTG

GAG

CTG

CGG

CGC

CTC

TGC

TTC

TCC

GAC

CCG

CTT

Ala

Pro

Asn

Cys

Leu

Glu

Leu

Arg

Leu

Cys

Phe

Ser

Asp

Pro

Leu

560

565

570

TGC

AGA

TCA

CGC

CTG

GTG

GAT

TTC

CAG

ACC

CAC

TGC

CAT

CCC

ATG

GAC

cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Val

Asp

Fhe

Gin

Thr

His

cys

His

Pro

Met

As?

575

5S0

585

ATC

CTA

GGA

ACT

TGT

GCA

ACA

GAG

CAG

TCC

AGA

TGT

CTA

CGA

GCA

TAC

ile

Leu

Gly

Thr

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin

Ser

Arg

Cys

Leu

Arg

Ala

Tyr

590

595

600

CTG

GGG

CTG

ATT

GGG

ACT

GCC

ATG

ACC

CCC

AAC

TTT

GTC

AC-C

AAT

GTC

Leu

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

Pro

Asn

Phe

Val

Ser

Asn

Val

605

610

615

620

AAC

ACC

AGT

GTT

GCC

TTA

AGC

TGC

ACC

TGC

CGA

GGC

AGT

GGC

AAC

CTG

Asn

Thr

Ser

Val

Ala

Leu

Ser

Cys

Thr

Cys

Arg'

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

625

630

63 5

CAG

GAG

TGT

GAA

ATG

CTG

GAA

GGG

TTC

TCC

CAC

AAC

CCC

TGC

Gin

Glu

Cys

Glu

Met

Leu

Glu

Gly

Phe

Ser

His

Asn

Pro

cys

640

645

650

CTC

ACG

GAG

GCC

ATT

GCA

GCT

AAG

ATG

CGT

TTT

CAC

AGC

CAA

CTC

TTC·

Leu

Thr

Glu

Ala

Ile

Ala

Lys

Met

Arg

Fhe

His

Ser

Gin

Leu

Phe

655

660

6-6-5

TCC

CAG

GAC

TGG

CCA

CAC

CCT

ACC

TTT

C-CT

GTG

ATG

GCA

CAC

CAG

AAT

Ser

Gin

Asp

Trp

Pro

His

Pro

Thr

Phe

Ala

Val

Met

Ala

His

Gin

Asn

670

67 5

680

GAA

AA.C

CCT

GCT

GTG

AGG

CCA

CAG

CCC

TGG

GTG

CCC

TCT

CTT

TTC

TCC

Glu

Asn

Pro

Ala

Val

Arg

Pro

Gin

Pro

Trp

Val

Pro

Ser

Leu

Phe

Ser

635

690

695

700

TGC

ACG

CTT

CCC

TTG

ATT

CTG

CTC

CTG

AGC

CTA

TGG

tagctgg;

ACT

Cys

Thr

Leu

Pro

Leu

Ile

Leu

Ser

Leu

Trp

705

TCCCCAGGGC 1016	CCTCTTCCCC
GGAAAGGACA 1076	GCAGCAGC-AA
GGTTATGACC 1136	TCCAGATCCT
CTGATTCATG 1196	CTGCCCCTCC
GCCTTGCTTT 12S6	ATTCCTATTA

710

TCCACCACAC CCAGGTGGAC

GGAGGTGCAG TGCGCAGATG

TACTGGTCCA GTCCTCATTC

TTGGTGGCCA CAATTTAGCC

TTGTCCTAAA GTCTCTCTGG • 4 «· I • · · I * · * • · * · · · * · ·» ··

TTGGAGCCCA CAAGGGGTGA

AGGGCACAGG AGAAGCTAAG

CCTCCACCCC ATCTCCACTT

ATGTCATCTG GTGCCTGTGG

GCTCTTGGAT CATGATTAAA

CCTTTGACTT ΑΛΑΛΑ

1271 * ·· «· · ·· »· • * « · · »f* · «· « ··« · · · · · · #· «·ν · * · ··*·· »**«·* · ·♦» ·« K ··♦ ·» ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 315 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

Gly

Tyr

cys

Glu

Thr

Pro

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Leu

Ile

Gly

Cys

1.

1

5

10

15

Ket

Cys

His

Arg

Ket

Lys

Asn

Gin

Val

Ala

Cys

Leu

Asp

Ile

Tyr

20

25

30

Trp

Thr

Val

His

Arg

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

Asn

Tyr

Glu

Leu

Asp

Val

Ť

35

40

45

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

Lys

Ket

Asn

Leu·

, A i

50

55

60

Ser

Lys

Leu

Asn

Ket

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

cys

Leu

Lys

Phe

65

70

75

60

Ala

Ket

Leu

Cys

Thr

Leu

Asn

Asp

Lys

Cys

Asp

Arg

Leu

Arg

Lys

Ala

65

90

95

Tyr

Gly

Glu

Ala

Cys

Ser

Gly

Pro

His

Cys

Gin

Auro

Hi.s

Val

Cys

Leu-

-

100

105

110

Arg

C-ln

Leu

Thr

Phe

Glu

Lys

Ala

Glu

Pro

His

Ala

Gin

115

120

125

Gly

Leu

Cys

Pro

Cys

Ala

Pro

Asn

Asp

Arg

Gly

cys

Gly

Glu

130

135

140

Arg

Asn

Thr

Ile

Ala

Pro

Asn

Cys

Ala

Leu

Pro

Val

Ala

145

150

155

160

Pro

Asn

cys

Leu

Glu

Leu

Arg

Leu

Cys

Phe

Ser

Asp

Pro

Leu

cys

165

170

175

Arg

Ser

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Gin

Thr

His

Cys

His

Pro

Ket

Asp

Ile

ISO

155

190

4Íi

Leu

Gly

Thr

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin

Ser

Arg

Cys

Leu

Arg

Ala

Tyr

Leu

155

200

205

1'

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr

Ala

Ket

Thr

Pro

Asn

Phe

Val

Ser

Asn

Val

Asn

210

215

220

• *

Thr

Ser

Val

Ala

Leu

Ser

Cys

Thr

Cys

Arg

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Gin

*

225

230

235

240

Glu

Cys

Glu

Ket

Leu

Glu

Gly

Phe

Ser

His

Asn

Pro

Cys

Leu

i

245

250

255

Thr

Glu

Ala

Ile

Ala

Lys

Ket

Arg

Phe

His

Ser

Gin

Leu

Phe

Ser

260 265 270

-i ,f— ^Ί 17* o u n < h o

f. o'6/ i:

o c. o’ o «:·(,· iji i, <6 *7 ftf

jíl ’i

1-

Gin

Asp

Trp 275

Pro

Kis

Pro

Thr

260

Ala

Val

Met

Ala

Mís 2SS

Gin

Asn

Glu

i

Asn

Pro 290

Ala

Val

Arg

Pro

Gin 295'

Pro

Trp

Val

Pro

Ser 300

Leu

Phe

Ser

Cys

í - ι,·Ι

Thr 305

Leu

Pro

Leu

Ile

Leu 310

Leu

Ser

Leu

Tťp 315

-

' (2) INFORMACE PRO SEKVENCI ŠIDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM '20:

' . (i) CHARAKTERISTIKA'SEKVENCE: ' ' .(A) DÉLKA: 1699 párů'bázi ' (B).-TYP:* nukleováíkyselina + , j, ' (C) TYP VLÁKNA: jednoduché jl ř (D)' TOPOLOGIE: lineární ·) ' „' > .

í' ^: ’ N ( . (ii) _; TYP MOLEKULY:. cDNA '{! ISi· I Y i y J. ' í* _t (ix) ZNAKY:. , .

* (A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS | (B) POZICE: 175...1374 _t (XX) POPIŠ.SEKVEŇČÉ.:' SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM:-ČÍSLEM 2Ó:

TGTGGACGCG CGCTTCGGAG TTC-C-AGGGCG GCGCCCAGGA CCCTGGTGGG AC-AGTGTGTG ⁶⁰

CGTCGCGCTG GAGGGCGGGA. GGCC-GGGGCG GGAGGTGCCG GTCGAC-GGAG CCCCC-CTCTC

120

AGAGCTCCAG GGGAGGAGCG AC-GGGAGCGC C-C-AGCCCGGC GCC7ACAGCT CGCC A7G

177

Met

GTG CGC CCC

CTG

AAC CCG

CGA

CCG

CTG

CCG. CCC GTA

GTC CTG

ATG

TTG

£. Λ J

Val

Arg Pro

Leu

Asn

Pro

Arg

Pro

Leu

Pro

Val

Leu

Met

Leu

£ .

. ·*

32 0

325

3 30

CTG

CTG CTG

CTG

CCG

TCG

CCG

CTG

CCT

CTC

GCA

GCC

GGA

GAC

CCC

273 -

. ^Λ.

t

Leu

Leu Len

Leu

Pro

Ser

Pro

Leu

Pro

Leu

Ala

Gly

Asp

Pro

-J .

*<'· ₃₃5

κ

**

340

'“f*. ’

.....1

345

CTT

CCC ACA

GAA

AC-C

CGA

CTC

ATG

AAC

AGC

TGT

CTC

CAG

GCC

AGG

321

’ -

V

i

Leu

Pro Thr

Glu

Ser

Arg

Leu

Met

Asn

Ser

Cys

Leu

Gin

Ala

Arg

’ ·?

-'350

355

. r ?

( .

360

AAG

TGC CAG

GCT

GAT

CCC

ACC

TGC

AGT

GCT

GCC

TAC

CAC

CTG

GAT

369 -

< ,

1Ί

' Lys

Cys Gin

Ala

Asp

Pro

Thr

Cys

Ser

Ala

Tyr

His

Leu

Asp

'365

370

1

375

360

TCC

TGC ACC

TCT

AGC

ATA

AGC

ACC

CCA

CTG

CCC

TCA

GAG

CCT

TCG

417

•t

Ser

Cys Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Pro

Leu

Pro

Ser

Glu

Pro

Ser

365

»

/ J 41

3 90

Ί

395

£ <65

513

561

609

657

705

753

S49

Pro

525

S97

945

93 « » · » ) · 4 · • 4 · « b * * * « b 4 4 « «4 · ·· ·

4

I b 4 ··*

445

CCT

GCT

GAC TGC CTG

GAG

GCA

CAG

CAA

CTC

AGG

AAC

AGC

TCT

Pro

Ala

Asp Cys Leu

Glu

Ala

Ais

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

400

405

410

ATA

GGC

TGC ATG TGC

CAC

CGG

CGC

ATG

AAG

AAC

CAG

GTT

GCC

TGC

Ile

Gly

Cys Ket Cys

His

Arg.

Arg

Ket

Lys

Asn

Gin

Val

Ala

cys

415

420

425

GAC

ATC

TAT TGG ACC

GTT

CAC

CGT

GCC

CGC

AGC

CTT

GGT

AAC

TAT

Asp

Ile

Tyr Trp Thr

Val

His

Arg

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

Asn

Tyr

430

435

440

CTG

GAT

GTC TCC CCC

TAT

GAA

GAC

AGA

GTG

ACC

AGC

AAA

CCC

TGG

Leu

Asp

Val Ser Pro·

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

450

455

460

ATG

AAT

CTC AGC AAA

CTG

AAC

ATG

CTC

AAA.

CCA

GAC

TCA

GAC

CTC

Hec

Asn

Leu Ser Lys

Leu

Asn

Ket

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

465

470

475

CTC

AAG

TTT GCC ATG

CTG

TGT

ACT

CTC

AAT

GAC

AAG

TGT

GAC

CGG

Leu

Lys

Phe Ala Ket

Leu

Cys

Thr

Leu

Asn

Asp

Lys

cys

Asp

Arg

4S0

405

490

CGC

AAG

GCC TAC GGG

GAG

GCG

TC-C

TCC

GC-G

CCC

CAC

TGC

CAG

CGC

Arg-

-Lys·

Ala-Tyr Gly

Glu

Ala

Cys

Ser

Έϊ/

Pro

His

Cys

Gin

Arg

495

500

505

GTC

TC-C

CTC AC-G CAG

CTG

CTC

ACT

TTC

GAG

AAG

GCC

GAG

Val

Cys

Leu Are c-ln

Leu

Thr

Phe

Glu

Lys

Ala

Glu

510

515

520

•

CAC

GCG

CAG GGC CTG

CTA

CT\j

TGC

CCA

TGT

GCC

CCC

AAC

GAC

CGG

His

Ala

Gin Glv Leu

Leu

Cys

Pro

cys

Ala

Pro

Asn

Asp

Arg

530

535

540

X“ Ajr-jkp

CGu CGG

ČGC

AAC

ACC

.ATC

GCC

CCC

AAC

TGC

GCG

CTG

Cys

Gly

Glu Arg, Arg

Arg,

Asn

Thr

Ile

Ala

Pro

Asn

Cys

Al d

Leu

545

550

555

CCT

GTG

GCC CCC AAC

TGC

CTG

GAG

CTG

CGG

CGC

CTC.

TGC

TTC

TCC

Pro

Val

Ala Pro Asn

Cys

Leu

Glu

Leu

Arg

Leu

Cys

Phe

Ser

560

565

570

CCG

GTT

TGC AGA TCA

CGC

CTG

GTG

GAT

TTC

CAG

ACC

CAC

TGC

CAT

Pro

Leu

Cys Arg Ser

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Gin

Thr

His

Cys

His

575

505

5S0

CCC ATG

GAC

ATC

CTri GG/á

ACT

TGT

GCA

ACA

GAG

CAG

TCC

AGA

TGT

CTA

1041

Pro Ket

Asp

Ile

Leu Gly

Thr

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin

Ser

Arg

Cys

Leu

590

595

600

101

• · • « • Φ ·

• * « v » · B « • ·

• • • B •

« · B • • B

• b

CGA

GCA

TAC

CTG

GGG

CTG

ATT

GGG

ACT

GCC

ATG

ACC

CCC

AAC

TTT

GTG

i oe 9

Arg

Ala

Tyr

Leu

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

Pro

Asn

Phe

Val

605

610

615

620

AGC

AAT

GTC

AAC

ACC

AGT

GTT

GCC

TTA

AGC

TGC

ACC

TGC

CGA

GGC

AGT

1137

Ser

Asn

Val

Asn

Thr

Ser

Val

Ala

Leu

Ser

cys

Thr

Cys

Arg

Gly

Ser

625

630

635

GGC

AAC

CTG

CAG

GAG

TGT

GAA

ATG

CTG

GAA

GGG

ttc

TTC

TCC

CAC

1165

Gly

Asn

Leu

Gin

Glu

Cys

Glu

Ket

Leu

Glu

Gly

Phe

Ser

His

640

645

650

AAC

CCC

TGC

CTC

ACG

GAG

GCC

ATT

GCA

GCT

AAG

ATG

CGT

TTT

CAC

AC-G

1233

Asn

Pro

cys

Leu

Thr

Glu

Ala

Ile

Ala

tys

Met

Arg

Phe

His

Ser

655

660

665

CAA

CTC

TTC

TCC

CAG

GAC

TGG

CCA

CAC

CCT

ACC

TTT

GCT

GTG

ATG

GCA

12Θ1

Gin

Leu

Phe

Ser

Gin

Asp

Trp

Pro

His

Pro

Thr

Phe

Ala

Val

Met

Ala

670

675

680

CAC

CAG

AAT

GAA

AAC

CCT

GCT

GTG

/\GG

CCA

CAG

CCC

TGG

GTG

CCC

TCT

1329

His

Gin

Asn

Glu

Asn

Pro

Ala

Val

Arg

Pro

Gin

Pro

Trp

Val

Pro

Ser

685

690

695

700

CTT

TTC

TCC

TGC

ACG

CTT

CCC

TTG

ATT

CTG

CTC

CTG

AGC

CTA

TGG

1374

Leu

Phe

Ser

Cys

Thr

Leu

Pro

Leu

Ile

Leu

Ser

Leu

Trp

705

710

7Γ5

	TAGCTGGACT 1434	TCCCCAGC-GC	CCTCTTCCCC	TCCACCACAC	CCAGGTGC-AC	TTGCAuCCCA
	CAAGGGGTGA 1494	GGAAAGGACA	G CAG C A GG AA	GG AC-G TGG AG	TGCGCAGATG	AGGGCACAGG
·!	AGAAGCTAAG 1554	GGTTATGACC	TCCAGATCCT	TACTGGTCCA	G.TCCTCATTC	CCTCCACCCC
»1-	ATCTCCACTT 1614	CTGATTCATG	CTGCCCCTCC	TTGGTGGCCA	CAATTTAGGC	ATGTCATG TG
	GTGGCTGTGG 1674	GCC7TGCTTT	ATTCCTATTA	TTGTCCTAAA	GTCTCTCTGG	GCTCTTGGAT
all	CATGATTAAA 1699	CCTTTGACTT	AAAAA
	(2) INFORMACE PRO	SEKVENCI	S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 400 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE 5'IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

«ιι *ι· «4 ·· • · * «4

i 0 2	• · 4 • 1 • < ♦ »·	1 4 44 ► 4 » · 4 4	• 4 · 4 44	* ·· · * · • * ··	• 4 • 4
Ker Val Arg Pro Leu Asn Pro	Arg Pro	Leu	Pro Pro	Val	Val	Leu	Ker
1 5		10				15
Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro	Ser Pro	Leu	Pro Leu	Ala	Ala	Gly	Asp
20	25				30
Pro Leu Pro Thr Glu Ser Arg	Leu Ker	Asn	Ser Cys	Leu	Gin	Ala	Arg
35	40			45
Arg Lys Cys Gin Ala Asp Pro	Thr Cys	Ser	Ala Ala	Tyr	His	His	Leu
50 55			60
Asp Ser Cys Thr Ser Ser Ile	Ser Thr	Pro	Leu Pro	Ser	Glu	Glu	Pro
65 70			75				80
Ser Val Pro Ala Asp Cys Leu	Glu Ala	Ala	Gin Gin	Leu	Arg	Asn	Ser
85		90				95
Ser Leu Ile Gly Cys Ker Cys	His Arg	Arg·	Kec,.Lys	Asn	Gin	Val	Ala
100	105				110
Cys Leu Asp Ile Tyr Trp Thr	Val His	Arg	Ala Arg	Ser	Leu	Gly	Asn
115	120			125
Tyr Glu Leu Asp Val Ser Pro	Tyr Glu	Asp·	Thr Val	Thr	Ser	Lys	Pro
130 ' 135			140
Trp Lys Ker Asn Leu Ser Lys	Leu Asn	Ker	Leu Lys	Pro	Asp	Ser	Asp
145 150			155				160
Leu Cys Leu Lys Phe Ala Ker	Leu Cys	Thr	Leu Asn	Asp	Lys	Cys	Asp
165		170				175
Arg Leu Arg Lys Ara Tyr Gly	Glu Ala	Cys	Ser Gly	Pro	His	Cys	Gin
ISO	155				190
Arg His Val Cys Leu Ara Gin.	Leu Leu	Thr	Phe Phe	Glu	Lys	Al &	Ala
195	200			205
Glu Pro His Ala Gin Gly Leu	Leu Leu	Cys	Pro Cvs	Ala	Pro	Asn	Ke- * —f
210 215			220
Arg Gly Cys Gly Glu Are Arg	Arg Asn	Thr	Ile Ala	Pro	Asn	cys	Ala
225 230			235				240
Leu Pro Pro Val Ala Pro Asn	Cys Leu	Glu	Leu Arg	Arg	Leu	Cys	Phe
24 5		250				255
Ser Asp Pro Leu Cys Arg Ser	Arg Leu	Val	Asp Phe	C-ln	Thr	His	Cys
260	265				270
His Pro Ker Asp Ile Leu Gly	Thr Cys	Ala	Thr Glu	Gin	Ser	Arg	Cys
275	280			285
Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Leu	Ile Gly	Thr	Ala Ket	Thr	Pro	Asn	Phe
290 295			300
Val Ser Asn Val Asn Thr Ser	Val Ala	Leu.	Ser Cys	Thr	Cys	Arg	Gly
305 310			.315				320
Ser Gly Asn Leu Gin Glu Glu	Cys Glu	Ket	Leu Glu	Gly⁵	’ Phe	Phe	Ser
325		330				335
His Asn Pro Cys Leu Thr Glu	Ala Ile	Ala	Ala Lys	Ket	Arg	Phe	His
340	345				350

.i

103

Kl •ř· fr • 44 »· · ·· ·· •· 4 4 · «4« O · 4 * • 44 4 · · 4444 * 4*4 4 * 4 ··· 444

4 · · · · * · ··· ·· ·· ··· ·· ··

Ser	Gin	Leu 355	Phe	Ser	Gin	Asp	Trp 380	Pro
Ala	Kis	Gin	Asn	Glu	Asn	Pro	Ala	Val
	370					375
Ser	Leu	Phe	Ser	Cys	Thr	Leu	Pro	Leu

385 390

Kis	Pro	Thr	Phe 365	Ala	Val	Eet
Arg	Pro	Gin 380	Pro	Trp	Val	Pro
Ile	Leu 395	Leu	Leu	Ser	Leu	Trp 400

104 *1 ·· • ·

9 9 · 9 · 9

9 9 9

9 9 9 9 . ’::^:::^:

N-koncovou hydrofobní

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Nukleová kyselina kódující ligand c-Ret, který obsahuje polypeptid složený z alespoň 400 aminokyselin, který má hydrofobní signální sekvenci a C-koncovou sekvenci obsahující fosfatidylinositolglykanový vazebný motiv.

Nukleová kyselina podle nároku 1 kódující ligand c-Ret vybraný ze skupiny obsahující krysí RetLl (sekvence id. č.
2), lidský RetLl (sekvence id. č. 11), lidský RetL2 (sekvence id. č. 13), myší RetL
3 (sekvence id. č. 17) a lidský RetL3 (sekvence id. č. 21) .

Nukleová kyselina podle nároku 1 kódující aminokyselinovou substituční variantu ligandu c-Ret vybraného ze skupiny obsahující krysí RetLl (sekvence id. č. 2), lidský RetLl (sekvence id. č. 11), lidský RetL2 (sekvence id. č. 13), myší RetL3 (sekvence id. č. 17) a lidský RetL3 (sekvence id. č. 21) .
4. Nukleová kyselina podle nároku 3, kde substituční varianta, pokud je srovnána s ligandem c-Ret vybraným ze skupiny obsahující krysí RetLl (sekvence id. č. 2), lidský RetLl (sekvence id. č. 11), lidský RetL2 (sekvence id. č. 13), myší RetL3 (sekvence id. č. 17) a lidský RetL3 (sekvence id. č. 21), sdílí s ním alespoň 40% podobnost sekvence, a dále kde substituční varianty sdílí alespoň 80 % porovnávaných cysteinových zbytků s uvedeným ligandem c-Ret.

105 • · > · * · » · · · ·« · *· ·

Nukleová kyselina podle nároku 3, kde substituční varianta, pokud je srovnána s ligandem c-Ret vybraným ze skupiny obsahující krysí RetLl (sekvence id. č. 2), lidský

RetLl (sekvence id. id. č. 13), myší RetL3 (sekvence id. č. 21), podobnost.

č. 11) , lidský RetL2 (sekvence (sekvence id. č. 17) a lidský RetL3 sdílí s ním alespoň 80% sekvenční

Nukleová kyselina podle nároku 1 kódující zkrácenou variantu ligandu c-Ret vybraného ze skupiny obsahující krysí RetLl (sekvence- id, č. 2), lidský RetLl (sekvence id. č. 11), lidský RetL2 (sekvence id. č. 13), myší RetL3 (sekvence id. č. 17) a lidský RetL3 (sekvence id. č. 21).

7. Nukleová kyselina podle nároku 4, kde zkrácená varianta postrádá fosfatidylinositolglykanový vazebný motiv.

ť?· n A Sfe..·

8. Nukleová kyselina, která má sekvenci nukleotidů obsahující

a) sekvenci vybranou ze skupiny obsahující krysí cDNA retLl (sekvence id. č. 1), částečnou lidskou cDNA retLl (sekvence id. č. 8), lidskou cDNA retLl (sekvence id. č. 10), lidskou retL2 (sekvence id. č. 12), myší retL3 (sekvence id. č. 16), částečnou lidskou retL3 . (sekvence ,id. č. 18) a lidskou retL3 (sekvence id. č. 20), nebo

b) degenerovanou variantu sekvence vybrané ze skupiny obsahující krysí cDNA retLl (sekvence' id. č. 1), částečnou lidskou cDNA retLl (sekvence id. č. 8), lidskou cDNA retLl (sekvence id. č. 10) , lidskou retL2 (sekvence id. č. 12), myší retL3 (sekvence id. č. 16), částečnou lidskou retL3 (sekvence id. č. 18) a lidskou retL3 (sekvence id. č. 20), nebo * ·· ·» · ·· · · · · »·

- 9 v » * ♦ • · · · · · · • » · · · · ««· ·· »· *··

105

c) polymorfní variantu sekvence vybrané ze skupiny obsahující krysí cDNA retLl (sekvence id. č. 1), částečnou lidskou cDNA retLl (sekvence id. č. 8), lidskou cDNA retLl (sekvence id. č. 10), lidskou retL2 (sekvence id. č. 12), myší retL3 (sekvence id. č. 16), částečnou lidskou retL3 (sekvence id. č. 18) a lidskou retL3 (sekvence id. č. 20).

9. Vektor obsahující nukleovou· kyselinu podle nároku 1, 2, 3,
6,
7 nebo
8, přítomnou v něm jako inzert, přičemž vektor volitelně obsahuje sekvenci kontrolující expresi operativně spojenou s uvedeným inzertem.

10. Hostitelská buňka, .která obsahuje vektor podle nároku 9.

11. Způsob přípravy polypeptidu vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se pěstují hostitelské buňky podle nároku 10 v médiu pro buněčné kultury, a kdy se získá polypeptid ligand c-Ret exprimovaný inzertem vektorů uvnitř uvedených hostitelských buněk.

12. Polypeptid ligand c-Ret obsahující alespoň 400 aminokyselin, který má N-koncovou hydrofobní signální sekvenci a C-koncovou hydrofobní sekvenci obsahující fosfatidylino5itolglykanový vazebný motiv.

13. Polypeptid ligand c-Ret obsahující alespoň 400 aminokyselin, který má C-koncovou hydrofobní sekvenci obsahující fosfatidylinositolglykanový vazebný motiv, a který byl upraven tak, že byla odstraněna hydrofobní N-koncová signální sekvence.

107

99 9« * 9 » ·
9 9 · *· 9 9 9 9 » ·

99 99
14. Polypeptid ligand c-Ret podle nároku 13, který, když se naváže na c-Ret, spouští jeho dimerizaci nebo autofosforylaci.
15. Ligand c-Ret vybraný

a) ze skupiny obsahující krysí RetLl (sekvence id. č. 2), částečný lidský RetLl (sekvence id. č. 9), lidský RetLl (sekvence id. č. 11), lidský RetL2 (sekvence id. č. 13), částečný myší RetL3 (sekvence id. č. 15), myší RetL3 (sekvence id. č. .17), částečný lidský RetL3 (sekvence id. č. 19) a lidský RetL3 (sekvence id. č. 21), nebo

b) ze skupiny obsahující aminokyselinové substituční varianty krysího RetLl (sekvence id. č. 2), částečného lidského RetLl (sekvence id. č. 9), lidského RetLl (sekvence id. č. 11), id. č. 13), částečného id. č. 15), myšího RetL3 lidského RetL2 myšího . RetL3 (sekvence id.

částečného lidského RetL3 (sekvence a lidského RetL3 (sekvence id. č. 21).

id, (sekvence (sekvence č. 17), č. 19)
16. Rozpustný zkrácený polypeptid ligand c-Ret obsahující alespoň 400 aminokyselin, který má na C-koncovou hydrofobní sekvenci obsahující fosfatidylinositolglykanový vazebný motiv, a který byl upraven tak, ze byla odstraněna hydrofobní N-koncová signální sekvence a byl odstraněn uvedený fosfatidylinositolglykanový vazebný motiv.
17. Fúzní protein obsahující polypeptid ligand c-Ret podle nároku 12, 13, 14, 15, nebo 16, který je fúzován s imunoglobulinovým polypeptidem nebo toxinovým polypeptidem.

108 ·*«»·» · * • 9 · 9 « 9

999 «9 9« ··· • · 4 »99
18. Fúzní protein obsahující polypeptid c-Ret, který je fúzován s imunoglobulinovým polypeptidem nebo toxinovým polypeptidem.
19. Protilátka, která se specificky váže na polypeptid ligand c-Ret podle nároku 12, 13, 14, 1.5 nebo 16.
20. Protilátka, které specificky blokuje vazbu polypeptidu ligandu c-Ret na polypeptid c-Ret.
21. Protilátka podle nároku 20, která se specificky váže na polypeptid c-Ret.

22 Použití polypeptidu ligandu 14, 15 nebo 16 pro léčení. c-Ret podle nároku 12, 13/ 23 Použití pro léčení fúzního proteinu podle nároku 17 nebo 18 24 Použití pro léčení protilátky podle nároků 19, 20 nebo 21
25. Způsob stimulace růstu nebo omezení poškození tkáně subjektu, která exprimuje c-Ret, vyznačuj ící setím, že způsob obsahuje krok, kdy se subjektu podá terapeuticky účinné množství polypeptidu ligandu c-Ret podle nároku 12, 13, 14, 15 nebo 16, nebo imunoglobulinový fúzní protein podle nároku 17 nebo 18, nebo protilátka podle nároku 20 nebo 21.

109 • 4fc • fc · >%>

• 4* fc·

44 · • 4 44 »44 4 · ·

4·4

44 444 • fc • 4 4 4 • 4 « 4 •*4 444

4 4

44 44
26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že polypeptid ligand c-Ret se podá současně s polypeptídem příbuzným s GDNF.

27. Způsob podle nároku 25 vyz.načuj ící s e tím, že tkáň, která exprimuje c-Ret, je tkáň ledviny nebo nervová tkáň
28. Způsob potlačení růstu nádorové buňky, která exprimuje c-Ret, vyznačující se tím, že způsob obsahuje krok, kdy se nádorová buňka uvede do kontaktu s účinným množstvím polypeptidu ligandů c-Ret podle nároku 16, fúzního proteinu podle nároku 17 nebo' protilátky podle nároku 20 nebo 21.
29. Způsob potlačení růstu nádorové buňky, která exprimuje polypeptid ligand c-Ret, vyznačující se tím, že způsob obsahuje krok, kdy se nádorová buňka uvede do kontaktu s účinným množstvím polypeptidu ligandů c-Ret podle nároku 16, fúzního proteinu podle nároku 18 nebo protilátky podle nároku 19 nebo 20.
30. Způsob modulace přenosu signálu transdukce) zahrnujícího buňky, které polypetid c-Ret nebo polypeptid vyznačující se krok, kdy se tato buňka uvede c-Ret (signální exprimují buďto ligand c-Ret, tím, že způsob obsahuje kontaktu s účinným do množstvím polypeptidu ligandů c-Ret podle' nároku 16, fúzního proteinu podle nároku 17 nebo 18, nebo protilátky podle nároku 20.

110 • 9 • *9 • ♦ a ·· 9 • 9

9 9 9 9«

99 9
31. Způsob zacílení toxinu, zobrazovací sloučeniny nebo radionuklidu do buňky, která exprimuje buďto polypetid c-Ret nebo polypeptid ligand c-Ret, vyznačuj ící se t i m, že způsob obsahuje krok, kdy se tato buňka uvede do. kontaktu s: polypetidem ligandem c-Ret podle nároku 16 konjugovaným s uvedeným toxinem, .zobrazovací sloučeninou nebo radionuklidem, fúzním proteinem podle nároku 17 nebo 18, nebo protilátkou podle nároku 20 konjugovanou s uvedeným toxinem, zobrazovací sloučeninou nebo radionuklidem.
32, Způsob potlačení růstu nádorové buňky, která exprimuje buďto polypeptid c-Ret nebo polypeptid ligand c-Ret,

v y z n a č u j í c í se t í m, že způsob obsahuj e krok, kdy se nádorová buňka uvede do kontaktu s: polvpeptídem ligandem c-Ret podle nároku 16 konjugovaným s toxinem nebo radionuklidem, • fúzním

proteinem podle nároku 17 nebo 18, nebo protilátkou podle nároku 20 konjugovanou s toxinem nebo radionuklidem.
33. Použití vektoru podle nároku 9 pro léčení.
34. Způsob ošetřování subjektu s poruchou metabolismu c-Ret, vyznačující se tím, že způsob obsahuje krok, kdy se subjektu podá vektor podle nároku 9.
35. Způsob stimulace růstu nebo omezení poškození tkáně subjektu, která exprimuje c-Ret, v y z n'á č u j ící se t i m, že způsob obsahuje krok, kdy se subjektu podá vektor podle nároku 9.

111

44 4 4 4 ¢ - · » «

4 4 *44

4 4 · 4 ♦♦♦ 44 44

44 »4

4 4 4 4

4 4 4 4 * *44 444

4 4

4 44 ·4
36. Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že tkáň/ která exprimuje c-Ret, je tkáň ledviny nebo nervová tkáň.