JP2002515743A

JP2002515743A - 神経増殖および腎臓増殖を刺激するためのＲｅｔリガンド（ＲｅｔＬ）

Info

Publication number: JP2002515743A
Application number: JP54243197A
Authority: JP
Inventors: サニコラ―ナデル，ミシェル; ヘション，キャサリン; エル．ケイト，リチャード
Original assignee: バイオジェン，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-05-08
Filing date: 1997-05-07
Publication date: 2002-05-28
Also published as: KR20060024843A; NO985231L; CN1232469A; DE69736428T2; CA2253871C; EP1757617A1; CA2253871A1; ES2270465T3; NO324957B1; ATE335003T1; PT914339E; EP0914339B1; WO1997044356A2; BG109433A; BR9710665A; NO323612B1; BG102973A; NZ332706A; IL126918A0; AU732392B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、Retリガンド（RetL）をコードするヌクレオチド配列、ならびに、細胞および哺乳動物被験体を、RetL DNAまたはタンパク質で処置することによって神経および腎臓の増殖を刺激する方法に関する。本発明は、RetLをコードする精製および単離されたDNA分子を提供する。これは、任意のretLだが、特にラットretL1 cDNA（配列番号１）、部分的ヒトRetL1 cDNA（配列番号８）、完全長ヒトretL1 cDNA（配列番号10）、ヒトretL2 cDNA（配列番号12）、マウスretL3 cDNA（配列番号12）、またはヒトretL3 cDNA（配列番号16）、部分ヒトretL3 cDNA（配列番号18）、もしくはヒトretL3 cDNA（配列番号20）を含むヌクレオチド配列を有する。本発明はさらに、RetLタンパク質を提供する。これは、ラットRetL1（配列番号２）、部分的ヒトRetL（配列番号９）、完全長ヒトRetL1（配列番号11）、ヒトRetL2（配列番号13）、マウスRetL3（配列番号17）、部分的ヒトRetL3（配列番号19）、またはヒトRetL3（配列番号21）のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する。

Description

【発明の詳細な説明】神経増殖および腎臓増殖を刺激するためのRetリガンド(RetL) 発明の分野本発明は、Retリガンド(RetL)をコードするヌクレオチド配列、ならびにRetL DNAまたはタンパク質で細胞および哺乳動物被験体を処理することにより神経増殖および腎臓増殖を刺激する方法に関する。発明の背景細胞シグナル伝達およびレセプター活性化に関する現行の研究の１つの目的は、細胞増殖および生存に関与するプロセスの治療的調節を可能にすることである。このようなプロセスは、とりわけ、器官不全、胎児発生、および腫瘍増殖を含む、多様な医学的状態の結果を決定する。これらの状態の各々は、世界的に臨床的に重要であり、そして有効な処置オプションが限られている。損傷組織の再生または生存を促進するための、ならびに組織の異常増殖および発生を含む障害を処置するための組成物および方法を提供することが本発明の目的である。組織損失または末期器官不全は、毎年、世界中で数百万の人々に影響し、そして保健医療コストを実質的に付加している。器官または組織損失は、通常、ドナーから器官を移植することにより、外科的再構築により、または機械的デバイスを用いて処置される。これらの療法の各々は欠点を有する。移植は、ドナー不足による制限され、外科的再構築は、その他の長期間の問題を生じ得、そして機械的デバイスは、単一の器官のすべての機能を実施できる訳ではなく、それゆえ、進行性の悪化を予防し得ない。従って、これらの問題に対する新たな解決法に対する本当の医療の必要性が存在している。細胞の増殖、分化および/または生存に影響するタンパク質因子は、応答性細胞を含む器官の障害の処置に有用であり得る。レセプタータンパク質チロシンキナーゼ(RPTK)ファミリーのレセプターと相互作用する因子またはリガンドがこの観点から特に重要である。これらのレセプターは、細胞の増殖および分化、ならびに多くの新形成の発生を含む、多くの細胞プログラムに関与している。従って、これらのレセプターと相互作用する因子またはリガンドは、組織が損傷している特定の器官の障害を処置することにおいて有用であると証明され得る。あるいは、腫瘍増殖をブロックするために、これらの因子とそれらのレセプターとの相互作用をブロックすることは有用であり得る。 Retプロトオンコジーンは、末梢神経系および中枢神経系ならびに腎臓を含む種々の組織において発生の間に発現される、レセプターチロシンキナーゼをコードする。retのヌルマウス(ret null mice)に存在する異常は、Retが、後腸への腸ニューロンの移動および神経支配のために、および腎臓発生の間の尿管芽上皮の増殖および分岐のために重要であることを示唆する(Nature 367、380-383、19 94)。Retシグナル伝達経路の鍵となる成分であるRetリガンドの調査は、集中的な研究の分野である。発明の要旨本発明は、任意のRetLの、しかし、特に、ラットretL1 cDNA(配列番号１)、部分的ヒトretL1 cDNA(配列番号８)、完全長ヒトretL1 cDNA(配列番号10)、ヒトre tL2 cDNA(配列番号12)、マウスretL3 cDNA(配列番号16)、部分的ヒトretL3 cDNA (配列番号18)またはヒトretL3 cDNA(配列番号20)を含むヌクレオチド配列を有するRetLをコードする、精製および単離されたDNA分子を提供する。本発明は、ラットRetL1(配列番号２)、部分的ヒトRetL1(配列番号９)、完全長ヒトRetL1(配列番号11)、ヒトRetL2(配列番号13)、マウスRetL3(配列番号17)、部分的ヒトRetL3 (配列番号19)またはヒトRetL3(配列番号21)のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するRetLタンパク質をさらに提供する。別の実施態様では、本発明は、ATCC No.97604であるクローンHRL20の挿入DNA の配列(部分的ヒトretL1 cDNA(配列番号８))、またはATCC No.98047であるクローン#230-5A-86-17の挿入DNAの配列(ラットretL1 cDNA(配列番号１))を包含する DNA配列を含む。本発明の別の実施態様では、ポリペプチド産物の原核生物または真核生物宿主細胞における発現を確実にする使用のための精製および単離されたDNA分子は、R etLの一次構造コンフォーメーションおよび生物学的活性の一部分を少なくとも有し；このDNAは、a）ラットretL1 cDNA、部分的ヒトretL1 cDNA、完全長ヒトre tL1 cDNA、ヒトretL2 cDNA、マウスretL3 cDNAもしくはヒトretL3 cDNA、またはラットretL1 cDNA、部分的ヒトretL1 cDNA、完全長ヒトretL1 cDNA、ヒトretL2 cDNA、マウスretL3 cDNAもしくはヒトretL3 cDNAの相補鎖を含むDNA分子；b）a ）で規定されたDNA分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA分子またはそのフラグメント；またはc）遺伝コードの縮重のために、a)およびb) で規定されるDNA分子にハイブリダイズするDNA分子であり得る。RetLの生物学的活性を有するヒトRetLのポリペプチドフラグメントまたは改変体をコードする精製および単離されたDNA分子もまた本発明に含まれる。本発明の任意の組換えDNA分子は、発現制御配列に作動可能に連結され得る。本明細書のいずこかに規定されるDNA分子または構築物を包含するベクターおよび送達系もまた本発明の範囲内に含まれる。このベクターは、RetLまたはRetL の改変体をコードするDNA分子を包含し得る。本発明は、ネイティブまたは改変体RetLをコードするDNA分子を含むベクターにより安定に形質転換またはトランスフェクトされた原核生物または真核生物宿主細胞を含む。他のヒトタンパク質を実質的に含まない精製および単離されたヒトRetLは、特に本発明の範囲内にある。RetLの一次構造コンフォーメーションおよび生物学的活性の一部分またはすべてを有するポリペプチド産物の産生のためのプロセスも本発明の範囲内にある。このようなプロセスは、適切な培養条件下で、本発明の任意のDNA分子で形質転換またはトランスフェクトされた原核生物または真核生物宿主細胞を、このようなポリペプチド産物の発現を可能にするような様式で増殖させる工程、およびRetLを回収する工程を包含し得る。DNAの原核生物または真核生物宿主細胞における発現のポリペプチド産物もまた含まれる。本発明はまた、可溶性であろうと膜結合性であろうと、タンパク質およびタンパク質フラグメント、改変体および誘導体を含む。選択された実施態様では、タンパク質は、ラットRetL1、部分的ヒトRetL1、完全長ヒトRetL1、ヒトRetL2、マウスRetL3もしくはヒトRetL3を含むか、またはこれら配列の１っの改変体である、アミノ酸配列を有する。他の実施態様では、タンパク質は、免疫グロブリン、トキシン、造影可能な化合物または放射性核種のような別の分子または分子フラグメントに融合された、RetまたはRetLを含む融合タンパク質である。RetLのキメラ分子もまた含まれる。本発明の他の実施態様は、本発明のRetLに対する特異的なモノクローナル抗体を含む。このような抗体は、トキシン、造影可能な化合物または放射性核種と結合され得る。本発明はまた、Retに対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株（これらは、AA.FF9、AA.HE3、AF.E9、BA.B1、BB.B6、AA.GE7、CD.F11 、AH.E3、CD.G4、AG.E7、BD.G6およびBH.G8、ならびにこれらのハイブリドーマのサブクローンを含む）、ならびにこれらのハイブリドーマまたはこれらハイブリドーマのサブクローンにより産生される抗体を含む。本発明は、被験体において、新規組織の増殖を促進する、または損傷組織の生存を促進する方法をさらに包含し、この方法は、被験体に、細胞Retと相互作用する治療的に有効な量の化合物を投与し、そしてそれによってRetの自己リン酸化を誘導する工程を包含する。この化合物は、RetL1、RetL2、もしくはRetL3、完全長RetLのフラグメント、またはRetに結合する抗体であり得る。この化合物は、GDNF、ニューロチュリン(neurturin)またはGDNF関連分子のような第２の化合物の治療的に有効な量と同時に投与され得る。これらの方法に対する目的の組織は任意の組織を含み得るが、好適な組織は、腎臓組織、神経組織、心臓、胃、小腸、脊髄、または肺を含む。１つの実施態様では、RetLは可溶性RetLである。この方法の被験体はヒトであり得る。本発明の別の方法では、RetLを発現する第１の細胞と第２の細胞との間のRet シグナル伝達は、この第１の細胞を、可溶性Retタンパク質またはRetLに対する抗体と接触させることにより阻害される。この可溶性Retタンパク質は融合タンパク質であり得る。本発明はまた、Retを発現する細胞にトキシン、造影可能な化合物または放射性核種を標的化する方法を含み、この方法は、細胞を、RetL融合タンパク質、またはトキシン、造影可能な化合物もしくは放射性核種に結合した抗Ret抗体と接触させる工程を包含する。RetLは、RetL1、RetL2またはRetL3であり得る。別の方法では、Retを発現する腫瘍細胞の増殖が抑制され、この方法の１工程は、細胞を、RetLとトキシンもしくは放射性核種との融合タンパク質、またはトキシンもしくは放射性核種に結合した抗Ret抗体と接触させることである。細胞は被験体内に存在し得、そしてタンパク質または結合抗体は被験体に投与される。 RetLを発現する細胞に、トキシン、造影可能な化合物または放射性核種を標的化する方法もまた本発明に包含され、この方法は、細胞を、Retとトキシン、造影可能な化合物もしくは放射性核種とを含む融合タンパク質、またはトキシン、造影可能な化合物もしくは放射性核種に結合した抗RetL抗体と接触させる工程を包含する。別の実施態様は、RetLを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を含み、この方法は、細胞を、Retとトキシンもしくは放射性核種との融合タンパク質、またはトキシンもしくは放射性核種に結合した抗RetL抗体と接触させる工程を包含する；細胞は被験体内に存在し得、そしてタンパク質は被験体に投与される。本発明の任意の方法のためのRetLは、RetL1、RetL2もしくはRetL3、またはRet L1、RetL2もしくはRetL3の改変体もしくはフラグメントであり得る。遺伝子治療の方法もまた本発明の範囲である。１つの実施態様は、Ret代謝の障害を有する被験体を処置する方法であって、この被験体に、RetLをコードする DNA分子を含むベクターを投与する工程を包含する方法、ならびに被験体において、新たな組織の増殖を促進する方法であって、このようなベクターを被験体に投与する工程を包含する方法である。別の実施態様は、被験体において、損傷組織の生存を促進する方法を含み、この方法の１つの工程は、RetLをコードするベクターの治療的に有効な量を被験体に投与することである。図面の簡単な説明図１は、ラットRetL1のcDNA配列(配列番号１)および推定のアミノ酸配列(配列番号２)である。ヌクレオチド配列は、配列番号１の塩基対201から塩基対1700まで伸び、そして完全なオープンリーディングフレームを含む。図2Aは、ヒトRetL1の部分的cDNA配列(配列番号８)および推定のアミノ酸配列( 配列番号９)である。この配列は、ATCC No.97604として寄託されたクローンHRL 20の挿入片の配列である。図2Bは、ヒトRetL1の複合完全長DNA配列(配列番号10)および推定のアミノ酸配列(配列番号11)である。図3Aは、ヒトRetL1のヌクレオチド配列(配列の上の行)と、ラットRetL1配列( 配列の下の行)のヌクレオチド配列との比較である。ヌクレオチド間の垂直の線はある位置での同一性を示し、一方点はその位置におけるギャップを示す。図3Bは、ヒトRetL1のアミノ酸配列(配列の上の行)と、ラットRetL1配列(配列の下の行)のアミノ酸配列との比較である。対応するアミノ酸間の垂直の線はある残基での同一性を示し、一方点はその残基における保存的置換を示す。図4Aは、後腎間葉細胞と尿管芽細胞との間の相互作用におけるRetおよびRetL の可能な役割の模式図である。図4Bは、RetLを発現するクローンについて、cDNAライブラリーのトランスフェクタントをスクリーニングする方法の模式図である。トランスフェクタント上の発現されたRetLの存在は、これらトランスフェクタントによる、Ret/IgG融合タンパク質またはRet/アルカリホスファターゼ融合タンパク質のいずれかの結合を評価することにより検出される。図５は、ラットRet/IgG融合タンパク質を発現するために用いられるプラスミドの構築を示す模式図である。図６は、ヒトRet/IgG融合タンパク質を発現するために用いられるプラスミドの構築を示す模式図である。図７は、クローンDSW240に見出されるような、ヒトretL2のcDNA配列(配列番号 12)および推定のアミノ酸配列(配列番号13)である。タンパク質リーディングフレームはヌクレオチド25〜1416内に含まれる。図８は、ヒトRetL2のアミノ酸配列(配列の上の行)と、ヒトRetL1配列(配列の下の行)のアミノ酸配列との比較である。アミノ酸間の垂直の線はある位置での同一性を示し、一方点はその位置におけるギャップを示す。図９は、マウスRetL3のcDNA配列(配列番号16)および推定のアミノ酸配列(配列番号17)である。図10は、ヒトRetL3のcDNA配列(配列番号20)および推定のアミノ酸配列(配列番号21)である。発明の詳細な説明配列識別番号本明細書中で言及されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の識別番号により示される。配列番号１‐ラットretL1 cDNA 配列番号２‐ラットRetL1 aa 配列番号３‐オリゴマーkid-13 配列番号４‐オリゴマーkid-14 配列番号５‐オリゴマーkid-15 配列番号６‐細胞外ラットretc DNA 配列番号７‐細胞外ラットRet aa 配列番号８‐部分的ヒトretL1 cDNA 配列番号９‐部分的ヒトRetL1 aa 配列番号10‐ヒトretL1 cDNA 配列番号11‐ヒトRetL1 aa 配列番号12‐ヒトretL2 cDNA 配列番号13‐ヒトRetL2 aa 配列番号14‐部分的マウスretL3 cDNA（EST AA50083）配列番号15‐部分的マウスRetL3 aa 配列番号16‐マウスretL3 cDNA 配列番号17‐マウスRetL3 aa 配列番号18‐部分的ヒトretL3 cDNA 配列番号19‐部分的ヒトRetL3 aa 配列番号20‐ヒトretL3 cDNA 配列番号21‐ヒトretL3 aa 定義本明細書中で使用される用語「RetL」は、レセプタータンパク質Retと特異的に相互作用し、そしてそれがRetと相互作用する場合、Retの二量体化および／またはRetのチロシンキナーゼドメインの自己リン酸化を引き起こす任意のタンパク質を意味する。RetLおよびRetをコードするDNA配列は、それぞれ、「retL」および「ret」と名付けられる。リガンドは、可溶性であり得るか、または自己リン酸化を引き起こすためのRet分子として同じ細胞上もしくは異なる細胞上の膜結合分子として存在し得る。特定の使用またはRetとの相互作用において、リガンドは、自己リン酸化を引き起こすためのさらなる分子を必要とし得る。本発明のリガンドは、共レセプター(co-receptor)またはアクセサリーリガンド補因子を含む。本発明のリガンドは、Retアンタゴニストとして働く抗Retモノクローナル抗体(mAbs)をさらに含み、これはRetの二量体化および自己リン酸化を引き起こす。リガンドはまた、種々の方法で（例えば、トキシンまたは放射性核種を用いて）改変され得る（例えば、融合タンパク質の一部として取り込まれ得る）。「配列のアラインメント」によって、一方の関連性のある部分の配列と、他方の配列との比較を可能にするために、一方の配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸のいずれか）の、別の配列との位置決めが意味される。この手順の１つの方法の例は、Needlemanら(J．Mol.Biol．48:443-453，1970)において示される。方法は、Alignプログラム(DNAstar，Inc.)のようなコンピュータープログラムにより都合良く実行され得る。当業者に理解されるように、相同なまたは機能的に等価な配列は、保存されたシステイン骨格内のシステイン残基の機能的に同等な配置を含む。これは、これらのシステインの直線的な配置を変えるが、タンパク質の折り畳み構造におけるそれらの関連を実質的に損なわないアミノ酸の挿入または欠失を含む。それゆえ、候補の配列中の内部ギャップおよびアミノ酸挿入は、候補と対照配列との間のアミノ酸配列相同性または同一性のレベルを計算する目的では無視される。タンパク質の相同性の確立することにおいて頻繁に使用される一つの特徴は、一方のタンパク質と別のタンパク質との間でのシステイン残基の数および位置の類似性である。「クローニング」によって、特定の遺伝子または他のDNA配列をベクター分子内へ挿入するためのインビトロ組換え技術の使用が意味される。所望の遺伝子を首尾良くクローニングするために、DNAフラグメントを生成するための方法、フラグメントをベクター分子へ結合するための方法、複製し得る宿主細胞内へ複合性(composite)DNA分子を導入するための方法、およびレシピエントの宿主細胞由来の標的遺伝子を有するクローンを選択するための方法を使用する必要がある。「cDNA」によって、RNA依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）の働きによりRN Aテンプレートから産生される相補性DNAまたはコピーDNAが意味される。従って、「cDNAクローン」は、クローニングベクター中に有される目的のRNA分子に相補的な二重鎖DNA配列を意味する。「cDNAライブラリー」によって、全生物体または組織中に存在するmRNA分子の代わりを構成するcDNAインサートを含む組換えDNA分子の収集物を意味され、これはRNAテンプレートの供給源に依存する。そのようなcDNAライブラリーは、当業者に公知の方法、および例えば、Maniatisら，Molecular Cloning:A Laborato ry Manual ,前出に記載される方法により調整され得る。一般的に、RNAは、初めにゲノムからの特定の遺伝子のクローニングが所望される生物体の細胞から単離される。本発明の目的にとって、哺乳動物、そして特にヒトの細胞株が好ましい。あるいは、RNAは動物の腫瘍、そして好ましくはヒト腫瘍由来の腫瘍細胞から単離され得る。従って、ライブラリーは、例えば、ヒト副腎腫瘍から調製され得るが、任意の種瘍が使用され得る。本明細書中で使用される用語「DNA多型性」は、二つ以上の異なる核酸配列が、DNA中の特定の部位に存在し得る状態をいう。「発現ベクター」は、その中に含まれるDNA配列を発現する（即ち、コード配列は、それらの発現を達成し得る他の配列に作動可能に連結される）ことが可能なベクターを含む。それは、常にはっきりと述べられるわけではないが、これらの発現ベクターは、エピソームとしてまたは染色体DNAの組込み部分としてのいずれかで宿主生物内で複製されるべきであることが意味される。効率的な発現ベクターの有用であるが必要ではないエレメントはマーカーコード配列であり、これは、これらの細胞が容易に同定されることを可能にするタンパク質を含む細胞の表現型の特性（例えば、テトラサイクリン耐性）を生じるタンパク質をコードする配列である。つまり、「発現ベクター」は機能的な定義を示し、そして特定の含まれるDNAコードの発現を達成し得る任意のDNA配列が、特定の配列に適用されるように、この用語に含まれる。このようなベクターは、しばしばプラスミドの形態であり、それゆえ、「プラスミド」および「発現ベクター」はしばしば互換的に使用される。しかし、本発明は、同等の機能を供し、そしてその時々で当該分野で公知になり得る発現ベクター（ファージを含む）のその他の形態を含むことを意図される。同様に、本発明のタンパク質のいずれかの遺伝子の「機能的誘導体」は、遺伝子の「フラグメント」、「改変体」、および「類似体」を含むことが意味され、それらは、ヌクレオチド配列において「実質的に同様」であり得、そして類似の活性を有する分子をコードする。「GDNF-関連分子」は、GDNFまたはニューロチュリン(neurturin)のいずれかに少なくとも40％の相同で、そしてまた、RetLを特異的に結合し得る任意の分子を意味する。用語「遺伝子」はペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を意味する。「同種の」によって、ペプチドまたはDNAの配列をいう場合、検討中の組成物に存在する実質的に全ての分子の一次分子構造（すなわち、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列）が同一であることが意味される。プローブ、検出されるべきオリゴマーフラグメント、オリゴマーコントロール、非標識化ブロッキングオリゴマー、および配列の増幅のためのプライマーに言及するにおいて、本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、３つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子として定義される。その正確なサイズは、多くの要因に依存し、次いで最終的な機能、またはオリゴヌクレオチドの使用に依存する。用語「プローブ」は、標的の抗リガンドに選択的に結合し得る公知の性質のリガンドをいう。核酸に適用される場合、用語「プローブ」は、標的鎖に相補的な塩基配列を有する核酸の鎖をいう。「組み換え宿主細胞」は、組換えDNA技術を用いて構築されたベクターで形質転換されている細胞をいう。本明細書中で定義されるように、組換え宿主細胞により産生される抗体またはその改変体は、非形質転換宿主により産生される程度の、より少ない量、またはより通常には、検出可能量より少ない量においてよりもこの形質転換によってである。本明細書中で使用される用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、それぞれ特定のヌクレオチド配列で、または近くで二本鎖DNAを切断する細菌性の酵素をいう。本明細書中で使用される用語「制限断片長多型」（「RFLP」）は、特定の制限フラグメントの長さにおける個体間の差異をいう。分子が別の分子と、両分子においてそのアミノ酸配列が実質的に同一である場合、および両分子が同様の生物学的活性を所有する場合、「実質的に同一」といわれる。従って、２つの分子が類似の活性を有するならば、分子の一方が他方の分子で見出されない付加的アミノ酸残基を含む場合、またはアミノ酸残基の配列が同一でない場合でさえ、それらは本明細書中で使用される用語としての改変体であると見なされる。本明細書中で使用されるように、分子が、通常には分子の一部ではないさらなる化学的部分を含む場合、別の分子の「化学的誘導体」といわれる。そのような部分は、分子の可溶性、吸光度、生物学的半減期などを改善し得る。あるいは、この部分は分子の毒性を減少し得るか、分子の任意の所望でない副作用等を除去し得るか、または減弱し得る。このような効果を媒介し得る部分は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Mack Publis hing Co.，Easton，Penn.(1980)中に開示される。「ベクター」によって、その中にDNAのフラグメントが挿入され得るかまたはクローニングされ得るプラスミドまたはバクテリオファージに由来するDNA分子を意味される。ベクターは一つ以上の単一の制限部位を含み、そしてクローニングされた配列が複製できるように規定された宿主またはビヒクル生物体において自律的な複製が可能であり得る。「実質的に純粋な」によって、本発明の任意のタンパク質、または任意のそのようなタンパク質コードする任意の遺伝子を意味される。それらには、それぞれ、他のタンパク質もしくは他の遺伝子、または通常天然で見出される得る他の夾雑物が本質的に含まれず、そして天然で見出されないよいうな形態で存在する。本発明の化合物本発明は、RetLをコードするcDNA（例えば、ラットretL1 cDNA、部分的なヒト retL1 cDNA、完全長ヒトretL1 cDNA、ヒトretL2 cDNA、マウスretL3 cDNAまたはヒトretL3 cDNAのヌクレオチド配列）を含む。さらに、本発明の化合物は、上記の配列を含む配列を含むか、またはこれらの配列の一つの誘導体である。本発明はまた、ベクター、リポソーム、これらの配列の一つおよびこれらの配列の１つの誘導体を含む他のキャリアービヒクルを含む。本発明はまた、ラットretL1 cD NA、部分的なヒトretL1 cDNA、完全長ヒトretL1 cDNA、ヒトretL2 cDNA、マウス retL3 cDNAまたはヒトretL3 cDNAから転写および翻訳されるタンパク質を含むが、これらは、ラットRetL1、部分的ヒトRetL1、完全長ヒトRetL1、ヒトRetL2、マウスRetL3またはヒトRetL3、およびそれらの誘導体および改変体を含むが、これらに限定されない。本発明の１つの実施態様は、RetLの可溶性改変体を含む。可溶性改変体は、天然のRetLの膜内部位(section)の少なくとも一部を欠く。いくつかの例において、可溶性改変体は、天然のRetLのホスファチジルイノシトールグリカン結合を欠く。可溶性改変体は、ホスファチジルイノシトールモチーフを欠くRetLの誘導体を含む融合タンパク質を含む。改変体は、アミノ酸配列もしくは配列を含まない観点(ways)で、またはその両方において天然に生じるRetLとは異なり得る。アミノ酸配列における改変体は、天然に生じるRetLにおける１つ以上のアミノ酸が異なる天然のアミノ酸、アミノ酸誘導体、または非天然のアミノ酸と置換される場合、生成される。特に好ましい改変体は、天然に生じるRetL、または天然に生じるRetLの生物学的に活性なフラグメントを含み、その改変体の配列は、典型的には、タンパク質またはペプチドの２次構造および疎水的性質に対し最小限の影響を有する１つ以上の保存的アミノ酸の置換により野生型配列とは異なる。改変体はまた、RetLの生物学的活性を無効にしない１つ以上の非保存的アミノ酸の置換、欠失、または挿入により異なる配列を有する。保存的置換は、典型的には、１つのアミノ酸を同様の性質を有する別のアミノ酸との置換（例えば、以下の群内での置換：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン）を含む。非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。極性天然アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。他の保存的置換は、以下の表から引用され得、そしてさらに他はDayhoff in t he Atlas fo Protein Sequence and Structure(1988)に記載される。表１：保存的アミノ酸置換本発明の内の他の改変体は、ペプチドの安定性を増大する改変を有する改変体である。そのような改変体は、例えば、ペプチド配列内に１つ以上の非ペプチド結合（ペプチド結合を置換する）を含み得る。さらに以下のものが挙げられる：天然に生じるL-アミノ酸以外の残基（（例えば、D-アミノ酸または天然に生じないかもしくは合成アミノ酸（例えば、βまたはγアミノ酸および環状改変体））を含む改変体。ペプチド内へのL-アミノ酸のかわりのD-アミノ酸の取り込みは、そのプロテアーゼへの耐性を増加し得る。例えば、米国特許第5,219,990号を参照のこと。本発明のペプチドもまた、挿入、欠失、および置換のような種々の変化（このような変化が、それらの使用において特定の利点を提供し得る保存的または非保存的かのいずれか）により改変され得る。実質的完全長ポリペプチドに加えて、本発明は、ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを提供する。RetLポリペプチドまたはフラグメントは、それが天然に生じるRetLの生物学的活性を示す場合、生物学的に活性である。このような生物学的活性は、Retの細胞外部分に対する天然に生じるRetLの親和性の少なくとも50％で、そして好ましくは少なくとも等しい親和性で、RetLの細胞外部位に特異的に結合する能力を含む。別の生物学的活性は、天然に生じるRetL上に提示されるエピトープに指向される抗体に結合する能力である。別の実施態様において、より保存的でないアミノ酸置換を有する改変体もまた、所望の誘導体を（例えば、電荷、立体構造、および他の生物学的特性における変化を生じることによって）生じ得る。このような置換は、例えば、親水性残基の疎水性残基への置換、システインもしくはプロリンの別の残基への置換、小さな側鎖を有する残基のかさ高い側鎖を有する残基への置換、または正味陽性電荷を有する残基の正味陰性電荷を有する残基への置換を含む。所定の置換の結果が、確かな見込みを持って予測され得ない場合、誘導体は、所望の特性の存在または非存在を決定するために本明細書中に開示される方法に従って容易にアッセイされ得る。一般的に、Retポリペプチドの機能的特性における変化を誘導することが期待され得る置換は、これら：（I）親水性残基（例えば、セリンまたはスレオニン）は、疎水性残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、またはアラニン）に置換される。;(ii)システイン残基は、任意の他の残基へ（またはよって）置換される；(iii)正に帯電した残基（例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン）は、負に帯電した側鎖を有する残基（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸）により置換される。；または(iv)かさ高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）は、そのような側鎖を有さない（例えば、グリシン）残基へ（またはによって）置換される。本発明の範囲内の改変体は、ラットRetL1(配列番号２)、部分的ヒトRetL1(配列番号９)、完全長ヒトRetL1(配列番号11)、ヒトRetL2(配列番号13)、マウスRet L3(配列番号17)、部分的ヒトRetL3（配列番号19）、またはヒトRetL3（配列番号 21）と少なくとも60％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質およびペプチドを含む。より好ましくは、配列相同性は、少なくとも80％、少なくとも 90％、または少なくとも95％である。相同性を決定する目的のために、配列比較の長さは、一般には、少なくとも８アミノ酸残基であり、通常には、少なくとも 20アミノ酸残基である。本発明の化合物の改変体はまた、1)本発明のRetLタンパク質と少なくとも40％相同なアミノ酸配列を有し、そして２）RetL配列（図８中に、RetL1およびRetL2として示される）の最適なアラインメントで配置された後、本発明のRetLタンパク質内のシステインとそのシステイン残基が少なくとも80 ％整列される、任意のタンパク質も含む。骨格の置換基の置換が可能であれば、同様の性質により特徴づけられる基を有する骨格に結合される官能基の置換もまた可能である。そのような改変は、一次配列を変化しない。これらは、まず保存的である（すなわち、置換基は元の基とほぼ同じサイズ、形、疎水性および電荷を有する）。非配列改変は、例えば、インビボまたはインビトロでの天然に生じるRetLの一部の化学的誘導体化、ならびにアセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化またはグリコシル化における変化を含み得る。本発明のタンパク質、またはそのタンパク質のフラグメントに特異的に結合する因子もまた本発明内に含まれる。これらの因子は、Ig融合タンパク質および抗体（天然の、ヒト化された、霊長類化された(primatized)、またはキメラ化されたかのいずれかの、単鎖、２本鎖、Fabフラグメントなどを含む）。因子のこれらのカテゴリーのさらなる記述は、PCT出願95/16709にあり、その明細書は、本明細書中に参考として援用される。実験手順ストラテジーの概要 RetL1をクローニングするために使用される一般的なストラテジーを、図4Aおよび図4Bに示す。本発明者らのストラテジーは、（リガンドもまた可溶性形態で発現され得るにもかかわらず；図4A）少なくともRetLが、発生中の腎臓の後腎間葉で膜タンパク質として発現されるという前提に基づいていた。RetLは、尿管芽細胞においてRetレセプターと相互作用し、そのチロシンキナーゼ細胞質ドメインを活性化しそして核にシグナル（これは、増殖および尿管芽の分枝形成に関連する遺伝子を順番に活性化する）を伝達する。それゆえ、ヒト免疫グロブリンG1 （IgG1）のF_C部位またはアルカリホスファターゼ（AP）のいずれかに融合したRe tの細胞外ドメインを含むタンパク質は、図4Bに示されるようにRetLをクローニングするためのストラテジーの一部として使用され得る。融合タンパク質、発現ライブラリー、およびRetL1のクローニングで使用される他の試薬を以下に記載する。本発明者らは、まずラットRetL1のcDNAを単離し、そして次いでそれをヒトRet L1のcDNAを単離するためのプローブとして使用する。cDNAを、続いてRetL2およびRetL3について単離する。Ret リガンドの直接発現クローニングのために必要とされる試薬の作製１．ラットRet細胞外ドメインをコードするcDNAの単離 RetL1を同定するために、タンパク質（１つの例はヒトIgG1のFc部分であり、そして別の例はアルカリホスファターゼである）に融合した、ラットまたはヒトのいずれかのRetの細胞外ドメインから成る融合タンパク質を作製する。両方の融合パートナーは、図4Bに図示されるように、リガンドを発現する細胞を検出するために容易にアッセイされ得る。ラットRetをコードするcDNAが全く開示されていないので、本発明者らは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）法を使用してラットRetレセプターの細胞外ドメインをコードするcDNAを単離する。本発明者らは、ヒト（Genbank登録番号M57464およびX15262）retとマウス(Genbank登録番号X67812)retの２つのヌクレオチド配列を比較し、そして２つの配列間の高い同一性の領域からオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。kid-013（配列番号３；Genbank配列X15262 のヌクレオチド150〜169を含む）と呼ばれるセンスオリゴマーを、ATG開始コドンにオーバーラップするヒトret cDNA配列の5'末端から選択する。これは、クローニングの目的のために、その5'末端にNot1制限部位をコードするヌクレオチドを含む。kid-014（配列番号４；Genbank配列M57464のヌクレオチド1819〜1839の相補体を含む）およびkid-015（配列番号５；Genbank配列X67812のヌクレオチド 1894〜1914の相補体を含む）と呼ばれる２つのアンチセンスオリゴマーを、それぞれ、膜貫通ドメインをコードする配列のすぐ5'側のヒトおよびマウスcDNA配列から選択する。オリゴマーkid-014およびkid-015は、クローニングの目的のために、その5'末端にSal1制限部位をコードするさらなるヌクレオチドを含む。全RNAを、14日目の胚性ラット腎臓から単離し、そしてmRNAをオリゴ-dTクロマトグラフィーを使用して精製する。mRNAを、AMV逆転写酵素を使用してcDNAに変換し、そしてcDNAを二本鎖cDNAに変換し、そして標準的なポリメラーゼ連鎖反応においてオリゴマーkid-013およびkid-015を用いてTaqポリメラーゼを使用して増幅する。1942bp PCRフラグメントの合成を、１％アガロースゲルでPCR反応物のアリコートを泳動することにより確認する。残りのPCRフラグメントをNot1およびSal1で消化し、そしてNot1およびSal1で予め消化したpSAB132にクローニングする。得られるプラスミドをpJC011と呼ぶ。Not1およびSal1部位の間に含まれるプラスミドpJC011の挿入物全体を配列決定し、そして細胞外ラットret cDNA（配列番号６）として示す。この配列の翻訳は、細胞外ラットRetのペプチド配列（配列番号７）を明らかにする。PCRのためのオリゴマーが、ヒトおよびマウス配列のretから選択されたので、細胞外ラットret cDNAの配列として示されるヌクレオチド配列および細胞外ラットRetの配列として示されるペプチド配列は、k id-130およびkid-015配列の領域において、天然のラットretヌクレオチドおよび Retペプチド配列と異なり得る可能性がある。続いて、ret cDNAクローンを、18 日目のラット胚性腎臓cDNAライブラリーから単離し、そして幾つかのヌクレオチド変化が、プライマー領域に観察され、これは２つのアミノ酸変化となる。１つの変化はシグナル配列（５位でアルギニンからスレオニンへ）に存在し、そして１つの変化は細胞外ドメインの末端付近（633位でグルタミン酸からアラニンへ）に存在する。これらの両方の変化は、リガンド結合に影響を及ぼすべきではない。２．Ret/IgG融合タンパク質ヒトIgG1のFc部分に融合した、ラット（aa残基番号1〜637）Retレセプターおよびヒト（aa残基番号1〜636）Retレセプターの細胞外ドメインから成る融合タンパク質を作製する。ラットRet/IgG融合タンパク質を発現するために使用されるプラスミドの構築を、図５に模式的に示す。ラットRet/IgG融合タンパク質をコードする遺伝子を構築するために、本発明者らは、ラットRet細胞外ドメインを含むpJC011（上記）をSal1で消化し、そしてそれをプラスミド２-４からの700bp Sal1フラグメントに連結してプラスミドpJC012を作製する。このSal1フラグメントは、もともとプラスミドpSAB144に由来するヒトIgG1のFcドメインの部分を含む。プラスミド２-４を、以下の三者間連結を介して予め作製した：ウサギTGF-βII型レセプターの細胞外ドメインを含む、PCRにより作製されるNot1-Sal1フラグメント；ヒトIgG1のFcドメインの部分を含む、pSAB144からの693bp Sal1-Not1フラグメント；およびNot1消化pSAB132。図５に示されるように、Fcドメインを含むフラグメントは、700bp Sal1フラグメントとして２-４プラスミドから放出され得る。pJC 012をCOS細胞にトランスフェクトし、そしてラットRet/IgG融合タンパク質を、P rotein-A Sepharoseクロマトグラフィーを使用して48時間後に培地から精製する。ラットRet/IgGタンパク質を産生する安定な細胞株を作製するために、ラットR et/IgG融合タンパク質全体を含むpJC012からの2612bp Not1フラグメントを単離し、そして発現ベクターpMDR901のNot1部位にクローニングする。得られるプラスミドをpJC022と呼ぶ。プラスミドpJC022をCHO細胞にトランスフェクトし、安定な細胞株を作製する。最も高い産生を有する細胞株は、懸濁順応性である。ラットRet/IgG CHO株の代表的な収量は、75mg/Lである。ヒトRet/IgG融合タンパク質を発現するために使用されるプラスミドの構築を、図６に模式的に示す。ヒトRet/IgG融合タンパク質をコードする遺伝子を構築するために、本発明者らは、M．Takahashi博士（病理学部門、名古屋大学、医学部、名古屋、日本）から、ヒトRetレセプターをコードするcDNAを含むプラスミドを得る。PCRフラグメントを、オリゴマーkid-013およびkid-014を使用してこのプラスミドから作製する。PCRフラグメントをクレノウフラグメントで処理し、続いてNot1で消化し、１つのNot1接着末端および１つの平滑末端を有するPCR フラグメントを生成する。このフラグメントを、１つのNot1接着末端および１つの平滑末端を作製するために、予めEcoR1で消化して、クレノウフラグメントで処理し、そしてNot1で消化したベクターpGEM11zf(+)にクローニングする。得られるプラスミドをpJC013と呼ぶ。pJC013からの1916bp Not1-Sal1フラグメントを、Notlでの完全消化およびSal1での部分的消化の後単離し、そしてヒトIgG1のFc ドメインの部分を含むpSAB144からの693bp Sal1-Not1フラグメント、およびNot1 で消化したpSAB132発現ベクターに連結する。得られるプラスミドをpJC015と呼ぶ。プラスミドpJC013における挿入物を配列決定し、そしてヒトRetの細胞外ドメインにおいて１つのアミノ酸を変更する１つのヌクレオチド差異を含むことが見出される（Genbank配列M57464は812位にＣを有し、一方pJC013は相当する位置にＴを有する；これは、アミノ酸において、ヒトRetタンパク質配列の294位でアラニンからバリンへの変更を生じる）。このヌクレオチドは、プラスミドpJC013 の部位特異的変異誘発により、Genbank配列M57464に特定されるＣ残基に修正し、プラスミドpJC023を生成する。修復ヌクレオチド配列を含む、pJC023からの58 5bp BstE2のフラグメントを単離し、そしてプラスミドpJC015にクローニングし、ここから改変体ヌクレオチドを含む585bp BstE2フラグメントは除去されている。新しいプラスミドをpJC024と呼ぶ。ヒトRet/IgG融合タンパク質全体を含むp JC024からの2609bp Not1フラグメントを単離し、そして発現ベクターpMDR901のN ot1部位にクローニングする。得られるプラスミドをpJC025と呼ぶ。プラスミドp JC025をCHO細胞にトランスフェクトし、安定な細胞株を作製する。最も高い産生を有する細胞株は懸濁順応性である。ヒトRet/IgG CHO株の代表的な収量は6mg/L である。本発明の方法において使用されるベクターの作製についてのさらなる詳細は、 PCT出願94/01456および92/02050で与えられ、これらの明細書は、本明細書中に参考として援用される。３．Ret/IgG融合タンパク質の生物活性本発明者らが作製するRet/IgG融合タンパク質が生物活性があり、それゆえRet Lのクローニングのための良いスクリーニング試薬であるか否かを決定するために、本発明者らは、生物活性について幾つかの器官培養アッセイを行う。器官培養アッセイは、50μg/mlの濃度でRet/Ig融合タンパク質の存在下で、３〜５日の器官培養において、13〜14日目の胚性ラット腎臓を増殖することからなる。腎臓をまた、LFA-3TIP/IgGまたはビヒクル緩衝液の存在下で培養する。培養期間の後、幾つかの腎臓を、集合管組織（これは尿管芽由来の上皮細胞である）を染色する蛍光レクチンDolichos Biflorus Agglutinin（DBレクチン）で染色する。これらの「DB」ポジティブ細胞は、Retが尿管芽およびその上皮誘導体において発現されるので、Retポジティブ細胞を識別する。これは胚性腎臓の増殖および発生におけるRet/IgG融合タンパク質の全体の評価を提供する。LFA-3TIPとともに培養されている腎臓とラットRet/IgG融合タンパク質とともに培養されている腎臓との間で、集合管の形態および増殖において明らかな差異がある。Ret/IgG処理した腎臓は、全体的に有意に少ない分枝形成および代表的により小さい大きさを示す集合管を有する。組織学的検査のために、他の腎臓からパラフィン切片を調製する。胚性腎臓をコントロール緩衝液またはRet/IgGで処理し、次いでヘマトキシリンおよびエオジンで染色する。Ret/Ig処理した胚性腎臓は、コントロール緩衝液処理した胚性腎臓よりも少ない集合管の分枝形成を示す。さらに、Ret/IgG処理した腎臓はより少ない尿細管を有する。本発明者らはまた、この効果をヒトRet/IgG融合タンパク質で観察した。これらの観察は、間葉と尿管芽との間の誘導性シグナルをブロックする融合タンパク質と一致する。それゆえ、本発明者らは、融合タンパク質がRetLのクローニングのための良好な試薬であると結論づける。４．Ret/アルカリホスファターゼ融合タンパク質レセプター／アルカリホスファターゼ（AP）融合タンパク質は、オーファンレセプター（Cell 79：157，1994）のephファミリーのメンバーに対するリガンドであるc-kitのリガンド（Cell 63：185，1990）を同定およびクローニングするため、ならびに最近ではob遺伝子（Cell 83：1263，1995）の産物であるレプチンのレセプターをクローニングするために、首尾よく使用されている。ラットRe t/AP融合タンパク質をコードするプラスミドを構築し、そしてラットRet/APタンパク質は細胞ファクトリー（factory）において、COS7細胞内で産生される。続いて、平均10mg/Lの融合タンパク質を発現して、安定なNIH3T3細胞株は作製される。ラットRet/APタンパク質のSDS-PAGE分析はそのサイズが推定分子量と一致することを示し、およびゲル濾過分析はそれが二量体として産生されることを示す。部分精製を、抗APカラムにおいてアフィニティークロマトグラフィーにより達成する。５．抗Ret抗体ウサギポリクローナル抗体を、ラットRet/IgG融合タンパク質に対して作製する。抗体を、ウェスタンブロット、Retポジティブ細胞株のFACS分析、および胚性腎臓切片の免疫組織化学に使用する。ハムスター抗ラットRetモノクローナル抗体のパネルを作製する。Protein A S epharoseに結合したラットRet/IgG融合タンパク質を、アルメニアハムスターを免疫化するために使用する。融合の後、316個のクローンを得、そしてELISAアッセイにおいてラットRet融合タンパク質および／またはヒトIgGに結合するそれらの能力についてスクリーニングする。11個のクローンは、ラットRet/IgG（およびラットRet/AP）にのみ結合するが、ヒトIgGには結合しない抗体を産生する。ヒトRetに対する交差反応性を、FACSによりアッセイする；４個のクローンは、R etポジティブヒト細胞株THP-1に結合し得る抗体を産生する。以下の表は、12個のモノクローナル抗体のRet結合特性をまとめる。６．cDNA発現ライブラリー本発明者らは、ラット胚性腎臓からcDNAライブラリーを調製する。CDM8ベクターにおけるcDNAライブラリーは、増幅のためにSV40起点を利用し、そして改変In Vitrogenベクター（pCEP4）におけるcDNAライブラリーは、増幅のためにEBV起点を利用する。この改変ベクター（CH269）は、取り出されたEBNA-1遺伝子配列を有する。EBNA-1タンパク質はEBV起点と相互作用するが、この遺伝子は、EBNA タンパク質を安定に発現する細胞が使用される場合、ベクター上に必要でない。 CDM8ベクターにおけるライブラリーは、1.18kbの平均挿入物サイズを有する1.5 ×10⁶クローンを含み、一方CH269ベクターにおけるライブラリーは、1.5kbの平均挿入物サイズを有するおよそ１×10⁶クローンを含む。Ret リガンドRetL1の発現クローニングＡ．ラットRetリガンドRetL1のクローニング１．Ret リガンドRetL1-の発現クローニングの最初の試み RetL1をクローニングするために、多くの直接発現方法が試みられている。これらの方法の全ては、図4Bに図示される概念に基づく。cDNAライブラリーからの cDNAを、哺乳動物細胞内に導入する；RetL1を受ける細胞を、Ret融合タンパク質を用いて同定し得る。以下の３つのアプローチが失敗であったが、重要な知識および専門的意見が得られ、これは成功した後のアプローチで展開した。ａ．Ret/IgG を用いるパンニング方法-パンニング方法を使用する直接発現クローニングにより、ラットRet/IgG融合タンパク質を、RetL1を単離するための試みで使用する（AruffoおよびSeed，Proc．Natl．Acad．Sci．84:8753-8757(1987) ）。CDM8における18日目の胚性ラット腎臓cDNAライブラリーを、パンニングの試みのために使用する。このライブラリーからのcDNAのプール(１つのプールあたり5,000〜10,000個のcDNA)を、DEAEデキストラン方法を用いてCOS細胞内に導入する。48時間後、EDTAを用いてプレートから細胞を取り出し、融合タンパク質とともにインキュベートし、そして続いて抗ヒトIgG₁抗体でコートしたプレート上にパンニングする。接着した細胞からDNAを回収し、E．coliに形質転換し直し、そして続いて２回目のパンニングのために単離する。本発明者らは、３回目のパンニングの後に結合するいかなる細胞も観察し得ず、そしてHirt DNAをE．col iに形質転換し直した後、非常に少量のクローンが得られる。抗VCAMモノクローナル抗体に関連してポジティブコントロールとして使用されるVCAM cDNAは、１：１00の比にのみ希釈し得、そして依然として検出され得る。これは、本発明者らのプールサイズがおそらく大き過ぎることを示す。２回目のパンニングの後得られる幾つかのクローンの分析は、クローンが再配列および欠失を受けることを示す。ｂ．Ret/IgG を用いる調整用FACS方法-18日目の胚性ラット腎臓ライブラリー（ CDM8ベクター）からの80,000個のcDNAクローンを、C0S7細胞に導入し、そしてラットRet/IgGタンパク質を用いて調整用FACS、続いて蛍光タグ化二次抗体に供する。頂点の0.5％および0.9％の蛍光細胞を収集し、そしてプラスミドDNAを、Hir t溶解により回収する。DNAを、E．coli内にエレクトロポレートし直す：0.5％プールについて228個のクローンを得、そして0.9％プールについて752個のクローンを得る。DNAを細菌クローンから回収し、そして２回目の調整用FACSを行う。２回目の終わりに細菌クローンから回収されたプラスミドを分析し、そして大きな欠失および再配列を含むことを見出す。ｃ．Ret/AP を用いる比色検出方法-COS細胞を、18日目のラット胚性腎臓cDNAライブラリー（CDM8ベクター）からのcDNAクローンの400個のプール（１つのプールあたり1000個のクローン）でトランスフェクトし、そしてRet/APタンパク質およびアルカリホスファターゼについての比色基質で染色する。トランスフェクト細胞を、ポジティブシグナルについて顕微鏡下で観察する。１つの実施態様において、５個の強力なポジティブを再度分析したが、全てネガティブであった。 Ret/APタンパク質のコントロールとして、ヒトVCAMの最初の２つのドメインを胎盤APのN末端に融合することにより、VCAM/APタンパク質を生成する。（VCAMは、２つの鎖、α-4およびβ-1から構成されるインテグリンVLA4に結合する）。CO S細胞の一過性トランスフェクションは、コントロール実験のために十分なVCAM/ A Pタンパク質を生成する。α-4鎖cDNAでトランスフェクトされたCOS細胞（COS細胞はすでにβ-1鎖を発現する）でVLA4を検出するそれらの能力を評価するために、VCAM/APタンパク質を、APに直接結合したVCAM/IgG、ならびにVCAM/IgGおよびA P結合二次抗体と比較する。結果は、VCAM/APタンパク質がトランスフェクト細胞上でVLA4を検出し得る一方、最も良い検出は、AP結合二次抗体と組合せたVCAM/I gGタンパク質により与えられることを示す。ｄ．方法論的な結論これらの最初のクローニングの試みから得られる３つの主要な結論：１）プラスミドDNAが後の回のために回収されることを必要とする方法（すなわちパンニングおよび調整用FACS）は、標的cDNAの量が少ない場合、これらの後の回の間に起こる再配列および欠失のため、適切でない。Retの低い発現に基づいて、RetL1の発現もまた低いと推測する良い理由がある。好ましいアプローチは、プール内にトランスフェクトし、そしてポジティブプールが同定されるのを可能にする検出方法を使用することである。次いで、トランスフェクト細胞から一過性で発現したDNAを回収する必要はなく、本来のプールを破壊し得る。２）Ret/IgGタンパク質は、二次試薬と結合させた場合、Ret/APタンパク質よりもよい検出能力を与える。３）VCAM/IgGコントロールタンパク質（およびAP結合二次抗体）およびα-4インテグリンcDNA（CDM8ベクターに希釈し、そしてCOS細胞にトランスフェクトした）を用いたコントロール実験は、本発明者らの検出能力がちょうど約1000分の１（すなわちプールサイズは1000クローンを超えられない）であることを示す。改良したレベルの感度を達成するために、本発明者らはSV40起点に基づくベクター（COS細胞で発現される）からEBV起点に基づくベクター（EBNAポジティブ細胞株で発現される）へ変更した。EBV起点に基づくベクターは、エピソームとして維持され、増殖後、SV40起点に基づくベクターのように細胞に対して毒性でない。遺伝子がこれらのベクターにおいて高いレベルで発現され得、そしてcDNAが非常に大きく希釈され得（すなわち、１：80,000まで）、そしてなお検出され得るという考慮すべき証拠が存在する。２．EBV 起点に基づくcDNAライブラリーからのプールのスクリーニング本発明者らは、18日目のラット胚性腎臓cDNAライブラリー（EBV起点を有するC H269ベクター）からのクローンのプールを、ラットRet/IgG融合タンパク質を用いて、スクリーニングする。実験では、それぞれ、ライブラリー由来の5000個のクローンを含む256個のプールを作製した。手短に言えば、cDNAライブラリーのアリコートを、力価測定し、5000個の細胞をプレートし（256回）、そして一晩増殖させる。コロニーを、培地中にこすりつける：培養の一部を用いてプールのグリセロールストック（-70で保存）を作製し、そして一部を用いてプラスミド調製する。256個のプールからのDNAを、リポフェクション方法を用いて293/EBNA 細胞（60mmプレート上で８×10⁵個）中に個々にトランスフェクトする。48時間後、細胞をHBHA緩衝液（0.5mg/ml BSA、0.1％NaN₃、20mM HEPES（pH7.0））で２回洗浄し、そしてTris緩衝化生理食塩水ならびに１mM MgCl₂およびCaCl₂中の20 μg/mlラットRet/IgGを用いてRTで60〜90分間インキュベートする。このインキュベーションの後、細胞をHBHA緩衝液で４回洗浄し、次いで60％アセトン／３％ホルムアルデヒド／20mM HEPES（pH7.0）で30秒間固定する。HBS緩衝液（150mM NaCl、20mM HEPES（pH7.0））での２回の洗浄後、細胞を、AP結合２次抗体（ヤギ抗ヒトIgG Fc-γ特異的F(ab')₂（Jackson Immuno Research laboratories;カタログ番号109-056-098；Tris緩衝化生理食塩水ならびに１mM MgCl₂およびCaCl₂ 中で1:5000希釈））を用いてRTで60分間インキュベートする。次いで細胞を、HB S緩衝液で２回、および2×Pierce Immuno Pure^R Phosphatase suppressor（カタログ番号35002）を含有するAP基質緩衝液（100mM Tris-HCl（pH9.5）、100mM Na Cl、５mM MgCl₂）で２回洗浄する。最後の洗浄は、15分間にする。次いで、AP基質NBT（0.33mg/ml）およびBCIP（0.17mg/ml）を、Pierce APインヒビターを含有するAP基質緩衝液中に添加し、そして細胞と共に５〜20分間インキュベートする。次いで、プレートを、水で２回洗浄する。次いで、プレートを、紫染色細胞の存在について、解剖顕微鏡下で調べる。 256個のプールについての分析から、17個のポジティブプールが一次スクリーニングにおいて同定される。各ポジテイブプールからのDNAを、293/EBNA細胞中に再トランスフェクトし、そして観察された染色がRet/IgG特異的であることを確認するためにいくらかのさらなるコントロール実験により、上記の手順を繰り返す。17個のポジティブプールのうち10個のみがRet/IgG融合タンパク質で染色され、別のIgG融合タンパク質では染色しない。３．プール番号230の分析例として、上記のポジティブプールの１つ（番号230と称する）を、Ret/IgG融合タンパク質への結合を与えているプール中のcDNAを同定するために小さなサブプールに分ける。プール番号230についてのグリセロールストックからの600個の細胞をプレートし（10回）、そして一晩増殖させる。これらのプレート上のコロニーを、培地中にこすりつける：培養物の10分の１を用いてグリセロールストックを作製し、そして残りの部分をDNA調製に用いる。600個のクローンの10個のサブプールを、230-1A〜230-5Aおよび230-1B〜230-5Bと称する。これらのサブプール由来のDNAを、293/EBNA細胞中にトランスフェクトし、そしてRet/IgG融合タンパク質での染色についての上記の手順を繰り返す。１つのサブプール番号230-5A は、Ret/IgGタンパク質での染色に対してポジティブである。プール番号230-5Aを、Ret/IgG融合タンパク質への結合を与えるこのサブプールでのcDNAを同定するためにさらに分ける。プール230-5Aのグリセロールストックからの細胞をプレートし、そして一晩増殖させる。コロニーを、７枚の96ウェ 20個のクローンのうち４個のプールおよび16個のクローンのうち１個のプールを作製する。従って、35個のプールを、230-5A-71〜230-5A-105と称される７枚のB A細胞中にトランスフェクトし、そしてRet/IgG融合タンパク質を上記のように用いて再アッセイする。プール番号230-5A-86がポジティブである。プール番号230-5A-86を、Bioblockに戻し、そしてこのプールを作製するために一緒に混合された20個のクローンを同定することにより分ける。DNAを20個のクローンすべてから作製し、そして293/EBNA細胞中に個々にトランスフェクトし、そして上記のようにRet/IgGについて再アッセイする。プール番号230-5A-86-1 7 はポジティブであることが見出される。４．クローン番号230-5A-86-17の特徴付けクローン番号230-5A-86-17（retL-17またはクローン17と呼ばれ、そしてATCC9 8047として寄託された）を、DNA配列決定によりさらに分析する。このクローンの挿入物のヌクレオチド配列全体は配列番号１（ラットretL1 cDNA）であり、そしてこのヌクレオチド配列の一部を図１に示す。このヌクレオチド配列中で、発明者らは、468アミノ酸のタンパク質（ラットRetL1）をコードするフレームを見出した。推定タンパク質は、アミノ酸24の後ろで推定の切断を有するシグナル配列を有する（Von Heijneら，Nucl.Acid Res．14:14683(1986)）。疎水性Ｃ末端は、このタンパク質が、ホスファチジルイノシトールグリカン結合を介して細胞に連結し得ることを示す。３つの推定のＮ結合型グリコシル化部位が存在する。これらの特性は、Retのリガンドについて予測された特性と一致する。本発明者らは、疎水性Ｃ末端の前で遺伝子を短縮化することにより、可溶性形態のラットRetL1タンパク質を発現させ得る。例えば、これは、リジン435の後ろで短縮化することにより行われ得る（ラットRetL1）。このアミノ酸の上流での短縮化はまた、可溶性形態のラットRetL1タンパク質の発現となるはずである。可溶性ラットRetL1タンパク質は、それ自体で、またはヒト免疫グロブリン、ヒスチジンタグ、または抗体により認識される小さなエピトープとの融合タンパク質の一部として発現され得る。Ｂ．ヒトRetリガンドRetL1のクローニングベクターλgt10中のヒト胚性腎臓cDNAライブラリーを、Clontechから購入する（カタログ番号HL5004A）。ファージストックからの百万個のプラーク形成単位を、10枚のNunc^TMプレートにプレートする。二連のプラークリフトを、Schleich erおよびSchuell Optitran^TMフィルター上に作製する。プローブを、プラスミドラットRetL1を制限酵素Pvullで消化すること、その後ラットRetLヌクレオチド配列のnt 242〜1582に対応する1.34kbフラグメント（ラットretL1 cDNA）のアガロースゲル単離により作製する。このコード領域のプローブを、ランダムプライミング（FeinbergおよびVogelstein，Anal.Biochem．13 7:266-267，1984）によりＰ³²標識する。フィルターを、10％デキストラン硫酸、100μg/ml tRNA、および6.7×10⁷CPMのラットプローブを含有する、300mlプラークスクリーンPSB緩衝液（50mM Tris pH7.5，１ＭN aCl、0.1％リン酸ナトリウム、0.2％ PVP、および0.2％ Ficoll）中で一晩、55℃でハイブリダイズする。これらを、プラークスクリーン緩衝液で２回、および２×SSC／１％SDSで２回、 55℃にて洗浄し、そして増感スクリーンを用いて−70℃でフィルムに曝露した。２個のポジティブを、マスタープレートからSM（100mM NaCl、10mM SO₄、50mM Tris pH7.5）およびゼラチン中に抜き取った。これらのポジティブのうち24個を、プラーク精製する。精製した候補プラークからのλミニプレップDNAを、Not 1で消化し、１％アガロースゲルで電気泳動し、そしてサザンブロットする。サザンブロットを、ラットRetL1コード領域のプローブを用いてハイブリダイズする。クローンHRL20は、最長の挿入物（4.4kb）を有し、これは、ラットプローブに激しくハイブリダイズする。DNA配列（部分的なヒトretL1 cDNA；配列番号８；図2A）および推定のペプチド配列（部分的ヒトRetL1；配列番号９；図2A）は、このクローンから得られている。このことは、これがヒトホモログであることを確認する。このクローンは、コード領域の3'末端を含むコード領域のほとんどをコードする。ヒトcDNAの5'末端を得るために、ヒトの胎児腎Marathon-Ready^TM cDNAキットを、Clontech（カタログ番号7423-1）から購入する。配列番号８（部分的ヒトre tL1 cDNA）のヌクレオチド62〜81の相補体に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドKid-155、および配列番号８（部分的ヒトretL1 cDNA）のヌクレオチド17 〜43の相補体に対応するKid-154を、合成する。PCRを、Marathon^TM cDNA試薬およびオリゴヌクレオチドKid-155またはKid-154と組み合わせたAdvantage^TM cDNA PCRキット（Clontechカタログ番号8417-1）を用いて行う。最初のPCR反応を、以下の通りに設定する：35.5μl H₂O；5.0μl 10×Klen Taq Buffer：1.0μl 10 mM dNTP混合物；1.0μl 50×AdvantageTM KlenTaq Polymerase混合物。これらの試薬を組み合わせ、そして混合する。次いで、5.0μl Marathon-Ready^TM Fetal Kidney cDNA；1.0μl 10μM APIプライマーおよび1.5μl 6.4μM Kid-155を添加する（最終容量＝50μl）。PCRを、Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480において以下のサイクル条件で実施する：94℃にて１分間の１サイクル；94℃にて 30秒間、55℃にて30秒間、68℃にて４分間を30サイクル。ネスティッドPCRを、最初のPCR反応の産物を用いて行う。第１に、５μlのPCR産物番号１を、TEで50 倍希釈する（最終容量250μl）。ネスティッドPCR反応物は、35.5μl H₂O；5.0 μl 10×KlenTaq Buffer；1.0μl 10mM dNTP混合物；1.0μl 50×Advantage^TM K lenTaq Polymerase混合物を含む。これらの試薬を上記のように混合する。次いで、5.0μlの希釈したPCR産物番号１；1.0μl 10μM AP2プライマーおよび1.5μ l 6.9μM Kid-154を添加する。サイクル条件は、上記と同じである。約700bpの生成産物を、１％低融点アガロースゲル上で精製し、そしてフェノール抽出する。精製したDNAを、pZErO^TM（Invitrogenカタログ番号K2510-01）のEcoR5部位中にクローニングする。配列情報を、複数の単離物(HRL7G6およびHRL7G8と呼ばれるクローンを含む）から得る。クローンHRL7G8から得られた配列は、クローンHRL20（部分的ヒトretL1 cDNA ）の配列とオーバーラップすることが見出され、そして図2Bにも示される、ヒト RetL1の完全長配列（完全長ヒトretL1 cDNA）を作製するために用いられる。クローンHRL7G8から得たヌクレオチド配列は、完全長ヒトretL1 cDNAのヌクレオチド１〜502を示し；クローンHRL20からのヌクレオチド配列は、完全長ヒトretL1 cDNAのヌクレオチド460〜1682を示す。クローンHRL7G8からの配列を、上記のヒト胚性腎臓λgt10 cDNAライブラリーから単離した別のcDNAクローン（GJ102）を、クローンHRL7G6に由来するプローブを用いて配列決定することにより確認する。ヌクレオチド118〜1497は、完全長ヒトretL1 cDNAのタンパク質リーディングフレームを含む。ヒトRetL1の完全なアミノ酸配列をまた、図2Bに示す。図3Aに示すBESTFIT分析により示されるように、ヒトretL1 cDNAは、ラットretL1 cDNAに対して88.2％同一である。ペプチドの比較（図3B）は、ヒトの推定ペプチド配列が、ラットの推定ペプチド配列に対して93.3％同一であり、そして97.2％相同であることを示す。Ret リガンドRetL2のクローニングＡ．ヒトRetL2のクローニングラットRetL1のペプチド配列（ラットRetL1）を用いて、関連するタンパク質（すなわち、アイソログ）を同定するためにプログラムBLASTを用いてGenBankデータベースを検索する。BLAST、すなわちBasic Local Alignment Search Toolは、 Altschulら（J.Mol.Biol．215：403-410，1990）の方法を使用して、照会配列と配列データベース内の全ての配列との間の類似性を検索する。照会配列および検索されるデータベースは、任意の組合せのペプチドまたはヌクレオチドのいずれかであり得る。ラットRetL1ペプチド配列が発現配列タグ（EST）ヌクレオチドデータベースに対して照会される場合、２つの有意な適合が得られる。片方は、Ge nBank登録番号R02249を有する、ヒト胎児肝臓および脾臓を組み合せたcDNAライブラリーからの229bpのESTであり、そして他方は、GenBank登録番号H12981を有する、ヒト幼児脳cDNAライブラリーからの521bpのESTである。２つのESTは、オーバーラップの領域において99％同一性を共有する。このことは、これらが同じ cDNAに由来することを示す。オリゴヌクレオチドを、H12981 EST：KID-228（GAA TGA CAA CTG CAA GAA GCT GCG CTC CTC；配列番号12のヌクレオチド38〜67およびヌクレオチド534〜563にも対応する）およびアンチセンスヌクレオチドKID-22 9（GTG TAC TCG CTG GGC ACC CG；配列番号12のヌクレオチド156〜175の相補体およびヌクレオチド652〜671の相補体にも対応する）から作製する。 Clontech Human Fetal Liver 5'-Stretch Plus λ GT10 cDNAライブラリー（カタログ番号HL5003a）からの１×10⁶のプラーク形成単位を、OPTITRAN^TMフィルター上で二連でスクリーニングする。フィルターを、³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドKID-228およびKID-229を用いて、10％デキストラン硫酸および100μg/ml tRNA ならびに80pmoleの各³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドを含有するプラークスクリーン緩衝液（50mM Tris pH7.5，１Ｍ NaCl、0.1％ピロリン酸ナトリウム、0.2％ポリビニルピロリジン、および0.2％ Ficoll）の400ml中で65℃にて一晩ハイブリダイズする。これらを、２×SSC／１％ SDSで２回、および１×SSC／１％ SDSで２回洗浄し、そしてフィルムに曝露する。11個の二重ポジティブを精製する。これらのクローンの各々からのDNAを、制限酵素消化、その後のアガロースゲル電気泳動およびサザンブロッティングにより分析する。フィルターを、KID-228 およびKID-229にハイブリダイズさせて、挿入物がプローブにハイブリダイズすることを確認する。クローンDSW240の挿入物を完全に配列決定（ヒトretL2 cDNA 、配列番号12）し、そして図７に示す。ヌクレオチド25〜1416は、ヒトretL2 cDNAのタンパク質リーディングフレームを含む。これは、464アミノ酸のタンパク質（ヒトRetL2；配列番号13）をコードし、そして図７に示される。図８に示されるBESTFIT分析により示されるように、ヒトRetL2タンパク質は、ヒトRetL1タンパク質に対して49.1％同一および63.7 ％相同である。これは、ヒトRetL1と共通して、シグナル配列を示す疎水性Ｎ末端およびホスファチジルイノシトールグリカン連結モチーフを示す疎水性Ｃ末端を共有する。さらに、各タンパク質中に存在する31個のうち30個のシステインが保存される。Ｂ．RetL2がRetのリガンドであることの実証本発明者らは、293/EBNA細胞を、クローンDSW240の挿入物を含む発現プラスミドでトランスフェクトすることにより、およびこの細胞が可溶性Ret/IgG融合タンパク質に結合し得ることを示すことにより、RetL2が、Retのリガンドであることを実証する。 DSW240の挿入物を、Not1を用いて取り出し、そしてEBV起点を含みEBNAポジティブ細胞株中での高発現を可能にする発現ベクターCH269中にクローニングする。制限消化を行い、正確な方向を有するクローンを同定する。プラスミドDNAを、正しい方向を有するクローンから調製する。プラスミドDNA（retL2発現プラスミド、ポジティブコントロールのためのretL 1発現プラスミド、およびネガティブコントロールのための関連しないタンパク質を含む発現プラスミド）を、リポフェクション方法を用いて293/EBNA細胞（60 mmプレート上で８×10⁵個）中にトランスフェクトする。48時間後、細胞を、HBH A緩衝液（0.5mg/ml BSA、0.1％ NaN₃、20mM HEPES（pH7.0））で２回洗浄し、そしてTris緩衝化生理食塩水ならびに１mM MgCl₂およびCaCl₂中の20μg/mlラットR et/IgGを用いて室温にて60〜90分間インキュベートする。このインキュベーションの後、細胞を、HBHA緩衝液で４回洗浄し、次いで60％アセトン／３％ホルムアルデヒド／20mM HEPES（pH7.0）で30秒間固定する。HBS緩衝液（150mM NaCl、 20mM HEPES（pH7.0））での２回の洗浄後、細胞を、APカップリング２次抗体（ヤギ抗ヒトIgGFc-γ特異的F(ab')₂（Jackson Immuno Research Laboratories:カタログ番号109-056-098；Tris緩衝化生理食塩水ならびに１mM MgCl₂およびCaCl₂ 中で1:5000希釈））を用いてRTにて60分間インキュベートする。次いで、サー（カタログ番号35002）を含むAP基質緩衝液（100mM Tris-HCl(pH9.5)、100m M NaCl、５mM MgCl₂）で２回洗浄する。最後の洗浄を、15分間放置する。次いで、AP基質NBT（0.33mg/ml）およびBCIP（0.17mg/ml）を、Pierce APインヒビターを含有するAP基質緩衝液中に添加し、そして細胞を５〜20分間インキュベートする。次いで、プレートを、水で２回洗浄する。次いで、プレートを、紫に染色された細胞の存在について解剖顕微鏡下で調べる。紫色に染色された細胞の存在は、Ret/融合タンパク質が細胞に結合したこと、およびRetL2タンパク質はRetのリガンドであることを示す。紫色に染色された細胞はまた、retL1発現ベクターでのトランスフェクションの後でも観察されるが、しかしネガティブコントロールのベクターでは観察されない。Ret リガンドRetL3のクローニングＡ．マウスRetL3 ラットRetL1アミノ酸配列でのESTデータベースの検索は、Retリガンドに相同性を有する２つのマウスESTを開示する。これらのESTは、AA049894およびAA0500 83（これは、部分的なマウスretL3 cDNA、配列番号14である）である。これらの ESTをコードするプラスミドは、Genome Systems Inc.（カタログ番号475791および番号475497）から細菌スタブ（stab）として得られる。プラスミドDNAを、スタブをLB Ampプレート上にストリークすることにより得たシングルコロニーから調製する。これらのプラスミドからの挿入物を、これらの全体について配列決定する。２つの配列の比較は、AA049894（これは1.4kb挿入物を有する）は、1.9kb 挿入物を有するAA050083中に含まれていることを実証する。AA050083からのDNA 配列の翻訳は、NT205からNT1242へと連続するオープンリーディングフレーム（部分的なマウスRetL3；配列番号15）が存在することを示す。このORFは、ラット retL1のORFに対して37.5％の同一性、およびラットretL2に対して40.2％の同一性を有していた。しかし、オープンリーディングフレームは、5'末端でMetまたはシグナル配列をコードしない。本発明者らは、この領域の上流の5'ORFを調べ、そして転写開始のためのKozakコンセンサス配列および表面での発現／分泌のための潜在的なシグナル配列の状況においてMetを見出す。このORFは、下流のOR Fのフレームの外にある。このことは、EST AA050083は、潜在的な変異（例えば、挿入、欠失、イントロンまたはクローニングアーチファクト）をその5'末端に含むことを示す。正確な5'末端を得るために、本発明者らは、Marathon RACEを用いる。マウス1 1日目胚性Marathon-Ready^TM cDNA（カタログ番号7458-1）およびAdvantage^TM ki t（カタログ番号8417-1）を、Clontechから購入する。配列番号14のヌクレオチド847〜866の相補体に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドKid-366、および配列番号14のヌクレオチド589〜615の相補体に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドKid-365を、合成する。PCRを、Marathon^TM cDNA試薬およびオリゴヌクレオチドKid-366と組み合わせたAdvantage^TM cDNA PCRキット（Clontechカタログ番号8417-1）を用いて行う。最初のPCR反応を、以下の通りに設定する：35. 3μl H₂O；5.0μl 10×Klen Taq Buffer；1.0μl 10mM dNTP混合物；1.0μl 50 ×Advantage^TM KlenTaq Polymerase混合物。これらの試薬を組み合わせ、そして混合する。次いで、5.0μl Marathon-Ready^TM マウス11日目胚性cDNA；1.0μl 1 0μM AP1プライマーおよび1.7μl 5.88μM Kid-366を添加する（最終容量＝50μ l）。PCRを、Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480において以下のサイクル条件で実施する：94℃にて１分間の１サイクル；94℃にて30秒間、72℃にて４分間の５サイクル；94℃にて30秒間、70℃にて４分間の５サイクル；94℃にて 30秒間、68℃にて４分間を25サイクル。ネスティッドPCRを、最初のPCR反応の産物を用いて行う。第１に、５μlのPCR産物番号１を、TEで50倍希釈する（最終容量250μl）。ネスティッドPCR反応物は、35.5μl H₂O；5.0μl 10×KlenTaq Buf fer；1.0μl 10mM dNTP混合物；1.0μl 50×Advantage^TM KlenTaq Polymerase混合物を含む。これらの試薬を上記のように混合する。次いで、5.0μlの希釈したPCR産物番号１；1.0μl 10μM AP2プライマーおよび3.6μl 2.8μM Kid-366を添加する。サイクル条件は、上記と同じである。約665bpの得られる産物を、１％低融点アガロースゲル上で精製し、そしてQiaex II（Qiagenカタログ番号20021）抽出する。精製したDNAを、PRIME PCR CLONER^TMクローニングシステム（5 Prime-> 3 Primeカタログ番号1-725029）を使用してpNoTA/T7^TM中にクローニングする。配列情報を、複数の単離物（DSW252およびDSW253と呼ばれるクローンを含む）から得る。 DSW252の配列は、さらなるＴが配列番号14の配列のNT 252とNT 253との間に存在することを除いて、配列番号14とオーバーラップすることが見出される。このＴはまた、他の単離物DSW251およびDSW253にも存在する。このさらなる塩基の挿入は、397アミノ酸をコードする単一の1191bpのORF（最初のMetから数える）が得られるように、ORFを修正する。このORFは、正規な翻訳開始コンセンサス配列（Kozak）の状況においてMetをコードし、そして表面の発現／分泌のためのシグナルを含む。発現され得る完全長マウスクローンを得るために、DSW252の630bp Not1-BamH1 フラグメントおよびAA050083の1308bp BamH1-Not1フラグメントを精製し、そしてNot1消化した発現ベクターCH269に連結する。連結物を、E．coli XL1-Blue（S trategeneカタログ番号200236）に形質転換する。Qiawell Ultraミニプレップを、得られる形質転換体について実施する。これらを、制限消化により分析し、そして正確なサイズおよび方向についてゲル電気泳動する。この構築物をDSW254と呼ぶ。DSW254の挿入物を、その全体（マウスretL3；配列番号16）について配列決定し、そしてORFを、397アミノ酸のタンパク質（マウスRetL3；配列番号17）をコードするとして確認する。これらの配列をまた、配列番号９に示す。RetL3 のＣ末端は、疎水性であり、そしてホスファチジルイノシトールグリカン連結モチーフを示す。Ｂ．ヒトRetL3 ヒトRetL3をクローニングするための候補組織供給源を見出すために、本発明者らは、マウス組織のノーザンブロットを利用して、マウスRetL3の発現パターンを決定する。調査した組織の中で、RetL3の発現は、心臓組織において最も高い。ベクターλgt10中のヒト成人心臓cDNAライブラリーを、Clontechから購入する（カタログ番号HL3026a）。ファージストックからの100万プラーク形成単位を 10個のNuncプレートに播種する。二連のプラークリフトをSchleicher and Schue ll Optitran^TMフィルター上で作製する。プローブを、PCRによりプライマーKid-366およびKid-367（AA050083配列のヌクレオチド397〜420に対応する）を用いて作製する。PCR反応を以下のように設定する：10μl 10×PFU緩衝液、2.0μl 10mM dNTP混合液、72.1μlH₂O、3.1μl1 3.2μM Kid-367、6.8μl 5.88μM Kid-366、5.0μl 0.1μg/μl AA050083 DNAおよび2.0μl 2.5単位/μl PFU（Stratageneカタログ番号600154）を混合する。PC Rを、Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler480中で以下の条件で実施する：9 4℃１分間、53℃１分間、72℃４分間を25サイクル。産物をフェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール50:49：１での抽出により精製し、次に切断フラグメントの低融解温度アガロースゲル電気泳動およびQiaexIIを行う。このコード領域プローブを、ランダムプライミングによりP³²標識する（FeinbergおよびV ogelstein）。フィルターを、200mlプラークスクリーニング緩衝液（10％デキストランサルフェート、100μg/ml tRNAおよび1.8×10⁸CPMのマウスプローブを含む）中で65℃で一晩ハイブリダイズした。これらをプラークスクリーニング緩衝液で２回、２×SSC/１％SDSで２回、１×SSC/１％SDSで65℃で２回洗浄し、そして増幅スクリーンで−70℃でフィルムに曝露する。２連のポジティブをプラーク精製する。精製した候補プラーク由来のλミニプレップDNAをEcoRIで消化し、１％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてサザンブロットする。サザンブロットをマウスプローブとハイブリダイズさせる。クローンGJ128は1.3kbインサートを有しており、マウスコード領域プローブに強度にハイブリダイズする。DNA配列（部分的なヒトretL3 cDNA；配列番号18）および推定ペプチド配列（部分的ヒト RetL3：配列番号19）をこのクローンから得、これがヒトの相同体であることを確認する。このクローンは、コード領域の3'末端を含むコード領域のほとんどをコードする。 GJ128由来の1.3kbインサートを精製し、P³²で標識し、5'末端を有するクローンを得るためにこれを使用して、Clontechヒト成人心臓ライブラリーをスクリーニングする。このライブラリーからは、２×10⁶プラークのスクリーニングにおいては5'末端を含むクローンを得ない。製造者により供給されるプロトコルを使用する、同じプローブとハイブリダイズするヒト成体組織mRNAブロット（Clonte chカタログ#7760-1、7759-1、および7767-1）のノーザン分析は、ヒトRetL3がヒト成人脊髄、胃、心臓、膵臓、小腸、結腸、前立腺、および精巣において発現されることを示す。Clontechヒト成人脊髄cDNAライブラリー（カタログ番号#5001a ）をGJ128インサートでスクリーニングする。３つの独立クローンを精製して、そして最長であるGJ135を配列決定する。GJ135のインサートの配列は、GJ128のインサートと重複し、完全長ヒトretL3cDNA（配列番号20）の成分配列の作製および完全長ヒトRetL3（配列番号21）の決定を可能にする。これらの配列をまた、図10に示す。ヒトRetL3は、ヒトRetL1およびヒトRetL2と、それぞれ34.3％および34.9％同一である。これは、マウスRetL3とは76.8％の同一性を有する。本発明の化合物の治療的使用ネイティブおよび変異RetL、抗RetL抗体、抗Ret抗体、ならびにRetおよびRetL の融合タンパク質は、Retシグナル伝達経路を遮断するか、または活性化すること、細胞が欠損または障害を受ける疾患状態における腎細胞および／もしくは神経細胞の増殖もしくは生存を刺激するためか、またはRetもしくはRetLを発現する腫瘍細胞のような所望されない細胞の増殖抑制または殺傷することが所望される場合における治療的有用性を有し得る。一般に、Retに結合して、二量体化および／またはRetの自己リン酸化を誘導する本発明の化合物は、Ret発現組織の増殖刺激または傷害を限定するために有用である。本発明の化合物は、腎臓組織増殖および／または生存を刺激すること、腎機能を支持すること、ならびに種々の侵襲後の腎臓組織への傷害を最小化することにおいて有用である。本発明の化合物で有利に処置され得る特定の状態は、急性腎不全、急性腎炎、慢性腎不全、腎炎症候群、腎尿細管欠陥、腎移植、毒性傷害、低酸素傷害、および外傷を含む。腎尿細管欠陥は、遺伝性の、または後天性の特質のいずれか（例えば、腎多嚢胞症、髄質性嚢胞症、および髄質性海綿症）を含む。このリストは限定されておらず、そして他の多くの腎障害（例えば、 Harrison's Principles of Internal Medicine，第13版、1994を参照のこと。これは、本明細書中で参考として援用される）を含み得る。他の適用において、本発明の遺伝子およびタンパク質は、神経増殖および再生が所望される状態を処置するために使用され得る。これは、神経再生の障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、トウーレット病、筋萎縮性側索硬化症、ならびに運動ニューロン疾患）、脱髄疾患（例えば、多発性硬化症）、細菌性疾患（例えば、髄膜炎、膿瘍、または蓄膿症）、ウイルス疾患（例えば、HIV随伴腎随症）、プリオン疾患（クロイツフェルト-ヤコブ病を含む）の任意の状態を含む。新生物侵害、損傷、または脳血管の事象（例えば、出血もしくは塞栓）のいずれかによって起こされる、神経組織の傷害の障害もまた、含まれる。脳神経および脊髄の疾患（損傷、炎症、接触、または血管疫学を含む）が、自律神経系に影響する疾患の場合、特に含まれる。神経発達障害（例えば、精神薄弱、自閉症、胎児性アルコール症候群、ダウン症候群、および脳性小児麻痺）もまた、含まれる。本発明の化合物はまた、末梢神経系に関与する症候群を処置するために使用され得る。これらの疾患は、以前に列記した任意の因子により生じる疾患を含み、そして、特に、ライム病、HIV随伴神経症、多発性筋炎、筋ジストロフィー、および重症筋無力症を含む。ラットRetL、部分的ヒトRetLI、完全長ヒトRetL1、ヒトRetL2、マウスRetL3またはヒトRetL3のタンパク質、またはこれらのタンパク質のフラグメントに特異的に結合する、本発明の抗RetL抗体およびRet融合タンパク質は、いくつかの方法において有用である。本化合物は、Retレセプターシグナル伝達を阻害するかまたはブロックするために（例えば、増殖のためのRetシグナル伝達の活性化に依存する腫瘍の成長をブロックするために）治療的に使用され得る。これらの薬剤はまた、検出可能なマーカー（例えば、蛍光透視または放射線透過の不透明な物質）に融合され得、そしてRetLを発現する組織の造影を可能にさせるために、被験体に投与され得る。薬剤はまた、物質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）に結合され得、これは、組織学断片上でのRetL陽性細胞の領域の視覚化を可能にするために、免疫細胞化学的染色剤として使用され得る。特異的な抗体は、この様式において単独で使用され得、そしてそれが結合する部位は、それ自体が検出可能なマーカーに結合される抗イムノグロブリン抗体を用いる、サンドイッチアッセイにおいて可視化され得る。任意のRetLに特異的な抗体はまた、所定の抗体が特異性を有する物質を定量するイムノアッセイにおいて有用である。RetL に特異的な抗体はまた、固相支持体（例えば、ビーズまたはディッシュ）に結合され得、そして、タンパク質を精製する際または溶液からそれを除去する際の使用のいずれかのために、溶液からリガンドを取り出すために使用され得る。これらの技術の各々は、免疫学の当業者には日常作業である。本発明の他の方法は、Retを抗Retモノクローナル抗体と接触させることによる、Ret-RetLシグナル伝達の調節を含む。このようなmAb-Ret接触の効果は、Retシグナル伝達経路の活性化をブロックするかまたは刺激するかのいずれかであり得、これはRetとの特定のmAbの各々の相互作用の特徴に依存する。特定のmAbは、R etとアゴニストとして相互作用し、アゴニストmAb-Ret結合が、Retの二量体化および自己リン酸化を引き起こす。他のmAbは、Retアンタゴニストとして作用する。RetのアンタゴニストmAbとの相互作用は、他のRetLのアンタゴニストまたはRe tLのアンタゴニストを含む複合体により、Retシグナル伝達活性化を阻害する。これは、そうでなければ、Retシグナル伝達経路を活性化する。 RetLおよび／またはRetもしくはRet融合タンパク質に対する抗体は、Retを発現する組織の造影を可能にするために、またはRetLに対する抗体についての上記の免疫組織学的法もしくは調製方法において使用され得る。 RetLおよび／または抗Ret抗体を含む融合タンパク質は、Retを発現するガンおよび腫瘍に対する医療的治療を特異的に標的化するために使用され得る。このような腫瘍は、Retにおいて変異に関連するいくつかの異なる腫瘍表現型を含み得る（N．Engl．J．Med．335:943-951,1996;Nature 367:319-320,1996:Trends Gen ．12:138-144,1996）。RetLを発現する新生物に対する治療的介入は、Retおよび／または抗RetL抗体を取り込んだ融合タンパク質を利用する。抗Ret抗体または抗RetL抗体は、Fcドメインにより媒介される抗体依存性および補体依存性細胞溶解を介して、それ自体によって効果的であり得る。このようなハイブリッドリガンドおよび抗体は、それらを抗腫瘍薬、トキシンおよび細胞殺傷放射性核種（例えば、イットリウム90）のための送達ビヒクルとして使用することにより、ガン治療剤としてより効果的に作製され得る。細胞傷害エフェクター細胞は、異種結合抗体を使用して腫瘍細胞に対して標的化され得る。ここで、腫瘍により発現されるRetまたはRetLのいずれかに対して特異的な抗体が、細胞傷害性エフェクター細胞（例えば、NK細胞またはCTL）上の表面タンパク質に対する抗体に共有結合されている。抗Ret抗体またはRetL治療の一例は、リシンの毒性Ａ鎖またはリシンの改変完全長形態（細胞には結合し得なくなっている）を、RetLまたは悪性細胞の表面に発現したRetポリペプチドに対する抗体に結合させることである。別の実施態様において、トキシンは、Retまたは抗RetL抗体を結合され、RetL陽性細胞（例えば、RetLを発現する腫瘍）を選択的に標的化しそして殺傷する。このようなアプローチは、ほとんどの腫瘍細胞上に発現するCD19抗原に対するモノクローナル抗体に結合したブロックされたリシンを用いて、首尾良いことが証明されている（ Grossbardら、Blood 9:576,1992）。他のトキシンは、当業者に公知なように同等に有用である。このようなトキシンは、シュードモナスエキソトキシン、ジフテリアトキシン、およびサポリンを含むが、これらに限定されない。このアプローチは、RetLまたは抗Ret抗体を使用すれば、抗CD19抗原アプローチと比較してより首尾良いことが証明されるはずである。なぜなら、Retは、非常に限定された数の組織中で発現されるからである。上記のリシンまたは他のトキシンの融合物を用いるアプローチは、RetLのトキシン結合体または抗Ret抗体のトキシン結合体に同等に適用可能である；これらは、Ret陽性細胞（例えば、Ret発現腫瘍細胞）を選択的に標的化し、そして殺傷するのに有用である。このような医学的治療に対する別のアプローチは、放射同位体標識RetLまたは放射同位体標識抗Ret抗体を使用することである。このような放射標識化合物は、Ret発現細胞中で、正常組織を回避しながら、優先的に腫瘍部位に対して放射能を標的化する。使用される放射同位体に依存して、腫瘍細胞に結合される放射標識抗体から放射される放射線はまた、近くのRetを発現しない悪性腫瘍細胞を殺傷し得る。種々の放射性核種が使用され得る。β線を放射する同位体（例えば、¹³¹ I）は、Ｂ細胞リンパ球上に存在するCD20に対するモノクローナル抗体と使用した場合に首尾良い（Kaminskiら、N．Engl．J．Med．329:459(1993)；Pressら、N．Engl．J．Med.329:1219(1993)）。β粒子を放射する放射性核種は、いくつかの細胞直径を貫通する距離にわたり腫瘍殺傷性である放射能放射を生じる。これは、抗原陰性細胞の根絶を可能にし、そして腫瘍において抗体またはリガンドの非相同的沈着という結果を低減する。 α粒子を放射する放射性核種もまた、使用され得る。放射核種標識RetLまたは抗Ret抗体により生成される低用量比照射は、従来の照射治療において外的に送達される瞬間的照射よりも、治療的により効果的であり得る。低用量比照射は、特定の細胞株においてアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導し得る（Mackli sら、Radiat．Res．130:220(1992)；Maklisら、Radiopharm．5:339(1992)）。本発明の化合物は、治療的有効量で投与され得る。治療的有効量とは、処置される特定の状態において医学的に所望される結果を生じさせるかまたは影響を与える化合物の量を意味する。本明細書中で用いられる用語「被験体」は、Retリガンドまたは遺伝子が投与され得る任意の哺乳動物を意味するとされる。本発明の方法を用いる処置について特に意図される被験体は、ヒト、ならびに非ヒト霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ラット、およびマウス、ならびに、これらの宿主に由来するかこれらを起源とする器官、腫瘍、および細胞を含む。遺伝子治療における本発明の化合物の使用本発明のRetL遺伝子は、傷害組織に導入されて、トランスフェクトされた細胞によりRetLの産生を刺激し、Retを発現する細胞増殖および／または細胞の生存を促進する。遺伝子治療方法の特定の実施態様において、RetL遺伝子は、選択した腎臓または神経標的組織に導入され得る。次いで、RetLは安定して発現され、そしてRetL レセプター陽性細胞を刺激して、細胞を増殖、分裂、分化させ、そして／または細胞生存性を増強する。さらに、RetL遺伝子は、ウイルスまたは非ウイルスベースの戦略のいずれかを使用する、種々の周知の方法を使用して標的細胞に導入され得る。非ウイルス方法は、エレクトロポレーション、リポソームとの膜融合、DNAコード微粒子銃での高速ボンバードメント、リン酸カルシウム-DNA沈降物とのインキュベーション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、および単一細胞への直接マイクロインジェクションを含む。例えば、RetL遺伝子は、リン酸カルシウム共沈澱により細胞に導入され得る（Pillicerら、Science、209:1414-1422 (1980)）；機械的マイクロインジェクションおよび／または粒子加速（Anderson ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:5399-5403(1980)）；リポソームベースのDNA 移入（例えば、LIPOFECTIN媒介トランスフェクション−Fefgnerら、Proc.Nat.Ac ad．Sci．USA，84:471-477,1987;GaoおよびHuang、Biochim．Biophys．Res．Com m.，179:280-285,1991）；DEAEデキストラン媒介トランスフェクション；エレクトロポレーション（米国特許第4,956,288号）；またはDNAを結合してDNAを優先的に肝細胞に送達させるポリリジンベースの方法（Wolffら、Science、247:465- 468,1990；Curielら、Human Gene Therapy 3:147-154，1992）。標的細胞は、直接的な遺伝子移入により、本発明の遺伝子でトランスフェクトされ得る。例えば、Wolffら、"Direct Gene Transfer Into Mouse Muscle In Vi vo"，Science 247:1465-68,1990を参照のこと。多くの場合、ベクター媒介のトランスフェクションが所望される。ベクターへのポリヌクレオチド配列の挿入のための、当該分野で公知の任意の方法が使用され得る。例えば、Sambrookら、"M olecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Col d Spring Harbor，NY（1989）およびAusubelら、Current Protocols in Molecul ar Biology，J．Wiley & Sons，NY(1992)を参照のこと。両方とも本明細書中で参考として援用する。プロモーター活性化は、組織特異的であり得、代謝産物または投与された物質により誘導され得る。このようなプロモーター／エンハンサーは、ネイティブのRetLプロモーター、サイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサー（Karasuyamaら、J.Exp.Med.,169:13(1989)）；ヒトβアクチンプロモーター（Gunningら、Proc．Nat．Acad．Sci．USA．84:4831(1987)）；マウス乳房腫瘍ウイルス長末端反復（MMTV LTR）のグルココルチコイド誘導性プロモーター（Klessigら、Mol.Cell.Biol.、4:1354(1984)）；モロニーマウス白血病ウイルスの長末端反復配列（MuLV LTR）(Weissら、RNA Tumor Viruses，Col d Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1985))；SV40初期領域プロモーター(BernoistおよびChambon，Nature、290:304(1981))；ラウス肉腫ウイルス（RSV）のプロモーター（Yamamotoら、Cell,22:787(1980)）；単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、Proc.Nat．Acad． Sci．USA,78:1441(1981))；アデノウイルスプロモーター(Yamadaら、Proc.Nat.A cad.Sci.USA.82:3567(1985))。 RetL遺伝子はまた、現在充分に確立している遺伝子移入系における使用のための特異的なウイルスベクターにより導入され得る。例えば、Madzakら、J ．Gen.V irol.， 73;1533-36、1992（パポバウイルスSV40）；Berknerら、Curr.Top Micro biol.Immunol. ,158:39-61，1992(アデノウイルス）；Hofmannら、Proc.Natl.Aca d.Sci.92:10099-10103、1995（バキュロウイルス）；Mossら、Curr.Top.Microbi ol.Immunol. ,158:25-38、1992（ワクシニアウイルス）；Muzyczka、Curr.Top.Mi croblol ．Immunol. ，158：97-123、1992（アデノ随伴ウイルス）；Margulskee，Curr.Top.Microbiol.Immunol. ， 158:67-93、1992(単純ヘルペスウイルス(HSV)およびEpstein-Barrウイルス（HBV）)；Miller、Curr.Top.Microbiol.Immunol.,15 8:1-24、1992（レトロウイルス）；Brandyopadhyayら、Mol.Cell.Biol.,4:749-7 54、1984（レトロウイルス）；Millerら、Nature、357:455-450、1992(レトロウイルス)；Anderson、Science,256:808-813、1992（レトロウイルス）、Current Protocols in Molecular Biology:セクション9.10-9.14（Ausubelら、編）、Gre ene Publishing Associates,1989を参照のこと。これらすべては本明細書中で参考として援用する。好ましいベクターはDNAウイルスであり、これは、アデノウイルス（好ましくは、Ad-2またはAd-5に基づくベクター）、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス（好ましくは、単純ヘルペスウイルスに基づくベクター）、およびパルボウイルス（好ましくは、「欠損」または非自律性パルボウイルスに基づくベクター、より好ましくは、アデノ随伴ウイルスに基づくベクター、最も好ましくは、AAV-2 に基づくベクター）を含む。例えば、Aliら、Gene Therapy 1:367-384,1994;米国特許第4,797,368号および同第5,399,346号、ならびに以下の議論を参照のこと。例えば、RetL配列を移入するための特定のベクター系の選択は、種々の要素に依存する。１つの重要な要素は、標的細胞集団の性質である。レトロウイルスベクターは広範に研究され、そして多数の遺伝子治療適用において使用されているが、それらは、一般に分裂しない細胞を感染するためには適していないが、ガン治療において有用であり得る。なぜなら、それらは、複製中の細胞においてそれらの遺伝子を組み込み、そして発現するだけだからである。それらは、エクスビボアプローチに有用であり、そしてこの点で標的細胞ゲノムへのその安定な組み込みによって魅力的である。アデノウイルスは、真核細胞DNAウイルスであり、これは、治療的トランスジーンまたはレポータートランスジーンを種々の細胞型へと効率的に送達するように改変され得る。通常のアデノウイルス２型および５型（それぞれ、Ad-2および Ad-5）は、ヒトにおいて呼吸器疾患を生じ、そして現在デュシェーヌ筋ジストロフィー（DMD）および嚢胞性線維症（CF）の遺伝子治療のために開発されている。Ad-2およびAd-5の両方が、ヒト悪性腫瘍に随伴しないアデノウイルスの亜網に属する。アデノウイルスベクターは、有糸分裂状態に関係なく極度に高レベルのトランスジーンの実質的にすべての細胞型への送達を提供し得る。組換えウイルスの高度の力価（10¹³プラーク形成単位/ml）は、293細胞（アデノウイルスで形質転換された、相補性ヒト胚性腎細胞株：ATCC CRL1573）において容易に生成され得、そして目に見えるほどの欠失なく長期間凍結保存され得る。遺伝的アンバランスを補完する治療的トランスジーンをインビボで送達することにおけるこの系の効力は、種々の障害の動物モデルにおいて実証されている。Y．Watanabe、A therosclerosis 、36:261-268（1986）；K．Tanzawaら、FEBS Letters、118(1)： 81-84(1980)；J.L．Golastenら、New Engl.J.Med.,309(11983):288-296(1983)； S.Ishibashiら、J.Clin.Invest.,92:883-893(1993)；およびS．Ishibashiら、J. Clin.Invest. ,93:1889-1892(1994)を参照のこと。これらの全ては本明細書中で参考として援用される。実際、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（CFTR）のためのcD NAをコードする組換え複製欠損のアデノウイルスは、少なくとも２つのヒトCF臨床試験における使用を承認されている。例えば、J.Wilson，Nature，365:691-692 （1993年10月21日）を参照のこと。遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの安全性のさらなる支持は、ヒト集団における生アデノウイルスワクチンの広範な経験である。ヒトアデノウイルスは、直線状の、およそ36kbの二本鎖DNAゲノムからなり、これは、100マップ単位（m.u.）に分割され、その各々が360bpの長さである。DN Aは短い逆方向末端反復配列（ITR）をゲノムの各末端に含み、これは、ウイルス DNA複製に必要とされる。遺伝子産物は、ウイルスDNA合成の開始の前または後の発現に基づき、初期（E1〜E4）および後期（L1〜L5）領域へと分類される。例えば、Horwitz,Virology,第２版、B.N.Field編,RavenPress Ltd．、New York(1990 )を参照のこと。 DMDおよび他の遺伝障害の遺伝子治療のために開発されている第一世代の組換え複製欠損アデノウイルスは、E1aの全体およびE1b領域の一部の欠失を含む。この複製欠損ウイルスは、トランスに作用するE1aタンパク質を提供する機能的なアデノウイルスE1遺伝子を含む293細胞において増殖される。E1失ウイルスは、2 93細胞において感染性ウイルスを複製し得、そして生成し得、これは、トランスにE1aおよびE1b領域遺伝子産物を提供する。得られるウイルスは、多くの細胞型を感染させ得、そして導入された遺伝子を発現し得る（自身のプロモーターを保有している場合）が、細胞が非常に高い感染多重度で感染しない限り、E1領域の DNAを有さない細胞において複製し得ない。アデノウイルスは、それらが広い宿主範囲を有しているという利点を有し、ニューロンのような静止細胞または最後まで分化した細胞に感染し得、そして本質的に非オンコジーン性のようである。アデノウイルスは、宿主ゲノムへは取り込まれないようである。それらが染色体外に存在するので、挿入変異誘発の危険性は、多大に低減される。Aliら、前出、373。組換えアデノウイルス(rAdV)は、非常に高い力価を生成する。ウイルス粒子は、中程度に安定で、発現レベルは高く、そして広範囲の細胞が感染され得る。これらの天然の宿主細胞は、気道上皮であるので、それらは肺ガンの治療のために有用である。バキュロウイルス媒介移入は、いくつかの利点を有する。バキュロウイルス遺伝子移入は、複製中の細胞または複製中でない細胞において生じ得、そして腎細胞ならびに肝細胞、神経細胞、脾臓、皮膚、および筋肉において生じ得る。バキュロウイルスは、哺乳動物細胞において非複製および非病原性である。ヒトは、感染をブロックし得る、組換えバキュロウイルスに対する予め存在する抗体を欠く。さらに、バキュロウイルスは、非常に大きなDNA挿入物を取り込み得、そして形質導入し得る。アデノ随伴ウイルス（AAV）もまた、体細胞性遺伝子治療のためのベクターとして使用され得る。AAVは、単純なゲノム体制（4.7kb）を有する小さな１本鎖(s s)のDNAウイルスであり、そのため遺伝子操作に理想的な基質となっている。２つのオープンリーディングフレームは、一連のrepおよびcapポリペプチドをコードする。Repポリペプチド（rep78、rep68、rep62、およびrep40）は、AAVゲノムの複製、レスキュー、および組み込みに関与する。capタンパク質（VP1、VP2、およびVP3）は、ビリオンキャプシドを形成する。repおよびcapオープンリーディングフレームの5'および3'末端に隣接して、145bp逆方向末端反復配列（ITR）が存在し、その最初のl25bpは、Y-およびT-形状の二重鎖構造を形成し得る。AAV ベクターの開発のために重要なことは、全体のrepドメインおよびcapドメインが切り出され得、そして治療的またはレポータートランスジーンで置換され得る。 B.J.Carter、Handbook of Parvoviruses、P.Tijsser編、CRC Press、155〜168頁（1990）を参照のこと。ITRは、AAVゲノムの複製、レスキュー、パッケージング、および組み込みに必要とされる最小配列を表すことが示されている。 AAVの生活環は、二相であり、潜在相および溶解相の両方からなる。潜在的な感染の間、AAVビリオンは、キャプシド化された（encapsilated）ssDNAとして細胞に入り、そしてそのすぐ後、核に送達され、そこでAAV DNAが、宿主細胞の分裂の明らかな必要性を伴わずに安定に宿主染色体に組み込まれ得る。ヘルパーウイルスの非存在下で、組み込まれたAAVゲノムは、潜在性のままであるが、活性化され得、そしてレスキューされ得る。生活環の溶解相は、AAVプロウイルスを有する細胞が、AAVによりリクルートされて宿主クロマチンからの切除を補助するヘルパー機能をコードするヘルペスウイルスまたはアデノウイルスにより二次感染で抗原投与される時に始まる（B.J．Carter、前出）。感染する親ssDNAは、二重鎖の複製形態（RF）DNAに、rep依存性の様式で拡大される。レスキューされたAAVゲノムは、予め形成されたタンパク質キャプシド（直径およそ20nmの対称性の正20面体）にパッケージングされ、そして細胞溶解の後、+ssDNAまたは-ssD NAゲノムをパッケージングした感染性ビリオンとして放出される。アデノ随伴ウイルス（AAV）は、遺伝子治療において有意な可能性を有する。ウイルス粒子は、非常に安定であり、そして組換えAAV（rAAV）は、ペレット化によるかまたはCsCl勾配バンド形成によりrAAVが精製され得るという点で、「薬物様」の特徴を有する。それらは、熱安定性で、そして凍結乾燥により粉末になり得、そして再水和されて完全な活性になり得る。それらのDNAは、宿主染色体に安定に組み込まれるので発現は長期である。それらの宿主範囲は広範であり、そしてAAVは公知の疾患を発症させず、それゆえ組換えベクターは非毒性である。一旦、標的細胞に導入されると、目的の配列は、従来の方法（例えば、ベクターの挿入された遺伝子配列に相同／相補的である配列を含むプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーション）により同定され得る。別のアプローチにおいて、配列は、標的細胞への発現ベクターの導入により生じる「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性など）の存在または非存在により同定され得る。処方および投与本発明の化合物は、医学的に受容可能な任意の様式で投与され得る。これは、非経口経路（例えば、静脈内、血管内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、脳室内、硬膜内など）による注射、ならびに、経口、経鼻、眼科的、直腸内、または局所的な経路を含み得る。貯蔵注射または腐食性移植片のような手段による徐放投与もまた、特に本発明に含まれる。１つ以上の動脈（例えば、腎動脈、または局所的な腫瘍へ供給する血管）へのカテーテルを介しての送達のような手段による局所的送達もまた特に意図される。用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、１つ以上の有機的または無機的な天然または合成の内容物で、これによって変異体プロトオンコジーンまたは変異体オンコプロテインを組み合わせてその適用を容易にするものを意味する。適切なキャリアは、滅菌生理食塩水を含むが、薬学的に受容可能であることが当業者に公知の他の水性または非水性の等張性滅菌溶液および滅菌懸濁液が当業者に公知である。この点に関して、用語「キャリア」は、リポソームおよびHIV-1 tatタンパク質（Chenら、Anal．Biochem．227:168-175,1995を参照のこと）ならびに任意のプラスミドおよびウイルス発現ベクターを含む。「有効量」は、罹患、変性、および損傷状態の進行を改善し得るかまたは遅滞させ得る量をいう。有効量は、個人ベースで決定され得、そして部分的には処置されるべき症候および求める結果の考慮に基づく。有効量は、このような要素を使用し、そして日常的な実験以上を使用せずに当業者により決定され得る。リポソーム系は、任意の種々の単層ベシクル、多層ベシクル、または安定な複層ベシクルであり得、そして当業者に周知の方法に従って（例えば、米国特許第第5,169,637号、同第4,762,915号、同第5,000,958号、または同第5,185,154号の教示に従って）調製され、そして投与され得る。さらに、リポソームへのそれらの結合を増強するために、本発明の新規のポリペプチドおよび他の選択されたポリペプチドをリポタンパク質として発現することが所望され得る。一例として、リポソームでカプセル化されたRetLでのヒトの急性腎不全の処置は、インビボで、リポソームを用いて、このような治療を必要とする細胞にRetLを導入することにより実施され得る。リポソームは、カテーテルを介して腎動脈に送達され得る。組換えRetLタンパク質は、例えば、CHO細胞から免疫親和性クロマトグラフィーまたは他の任意の便利な方法により精製され、次いでリポソームと混合され、そして高効率でそれらに取り込まれる。カプセル化されたタンパク質は、インビトロで細胞増殖の刺激への何らかの影響について試験され得る。本発明はまた、本発明の新規のポリペプチドが、それらの安定性および／または免疫原性を増強するためにリポソーム送達系を介して動物に投与され得ることを意図する。リポソームを介した新規のポリペプチドの送達は、特に有利であり得る。なぜなら、リポソームは、処置される動物において食細胞により内部移行され得るからであり得る。この様な細胞は、リポソーム膜の取り込みに続いて、強力な免疫応答を惹起するのに必要とされる他の分子とともに免疫系に対してポリペプチドを提示する。本発明の任意の新規のRetLポリペプチドは、薬学的に受容可能な塩の形態で使用され得る。本発明のポリペプチドと塩を形成し得る適切な酸および塩基は、当業者に周知であり、そして無機酸および無機塩基ならびに有機酸および有機塩基を含む。上記の発明は、理解の明瞭性の目的で、図例および実施例という方法でいくらか詳細に記載されているが、特定の変更および改変が本発明の範囲内で実施され得、添付の請求の範囲によってのみ制限されることは当業者に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 13/12 Ｃ０７Ｋ 14/47 25/00 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号６０／０２１，８５９ (32)優先日平成８年７月16日(1996．7．16) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ケイト，リチャードエル. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02193，ウェストン，アロウヘッドロード 64

Claims

【特許請求の範囲】１．c-Retリガンドをコードする核酸であって、該リガンドは、少なくとも約400 アミノ酸のポリペプチドを含み、疎水性Ｎ末端シグナル配列およびホスファチジルイノシトールグリカン結合モチーフを含む疎水性Ｃ末端配列を有する、核酸。２．ラットRetL1（配列番号２）、ヒトRetL1（配列番号11）、ヒトRetL2（配列番号13）、マウスRetL3（配列番号17）、およびヒトRetL3（配列番号21）から選択されるc-Retリガンドをコードする、請求項１に記載の核酸。３．ラットRetL1（配列番号２）、ヒトRetL1（配列番号11）、ヒトRe1L2（配列番号13）、マウスRetL3（配列番号17）、およびヒトRet3（配列番号21）から選択されるc-Retリガンドのアミノ酸置換改変体をコードする、請求項１に記載の核酸。４．前記置換改変体が、ラットRetL1（配列番号２）、ヒトRetL1（配列番号11）、ヒトRetL2（配列番号13）、マウスRetL3（配列番号17）、およびヒトRetL3（配列番号21）から選択されるc-Retリガンドと整列される場合、それらと少なくとも40％の配列類似性を共有し、さらに該置換改変体が、整列されたシステイン残基の少なくとも80％を該c-Retリガンドと共有する、請求項３に記載の核酸。５．前記置換改変体が、ラットRetL1（配列番号２）、ヒトRetL1（配列番号11）、ヒトRetL2（配列番号13）、マウスRetL3（配列番号17）、およびヒトRetL3（配列番号21）から選択されるc-Retリガンドと整列される場合、それらと少なくとも80％の配列類似性を共有する、請求項３に記載の核酸。６．ラットRetL1（配列番号２）、ヒトRetL1（配列番号11）、ヒトRetL2（配列番号13）、マウスRetL3（配列番号17）、およびヒトRetL3（配列番号21）から選択されるc-Retリガンドの短縮型改変体をコードする、請求項１に記載の核酸。７．前記短縮型改変体が、前記ホスファチジルイノシトールグリカン結合モチーフを欠損する、請求項４に記載の核酸。８．ヌクレオチド配列を有する核酸であって、該ヌクレオチド配列が： (a)ラットretL1 cDNA（配列番号１）、部分的ヒトretL1 cDNA（配列番号８）、ヒトretL1 cDNA（配列番号10）、ヒトretL2（配列番号12）、マウスretL3（配列番号16）、部分的ヒトretL3（配列番号18）、およびヒトretL3（配列番号20）から選択される配列；または (b)ラットretL1 cDNA（配列番号１）、部分的ヒトretL1 cDNA（配列番号８）、ヒトretL1 cDNA（配列番号10）、ヒトretL2（配列番号12）、マウスretL3（配列番号16）、部分的ヒトretL3（配列番号18）、およびヒトretL3（配列番号20）から選択される配列の縮重改変体；または (c)ラットretL1 cDNA（配列番号１）、部分的ヒトretL1 cDNA（配列番号８）、ヒトretL1 cDNA（配列番号10）、ヒトretL2（配列番号12）、マウスretL3（配列番号16）、部分的ヒトretL3（配列番号18）、およびヒトretL3（配列番号20）から選択される配列の多型改変体、を含む、核酸。９．その中の挿入物として存在する請求項１、２、３、６、７、または８に記載の核酸を有するベクターであって、該ベクターは必要に応じて、該挿入物に作動可能に連結された発現制御配列を含む、ベクター。１０．請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。１１．ポリペプチド産生方法であって：細胞培養培地において請求項１０に記載の宿主細胞を培養する工程；および該宿主細胞内のベクター挿入物から発現されるc-Retリガンドポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。１２．c-Retリガンドポリペプチドであって、少なくとも約400アミノ酸を含み、疎水性Ｎ末端シグナル配列およびホスファチジルイノシトールグリカン結合モチーフを含む疎水性Ｃ末端配列を有する、c-Retリガンドポリペプチド。１３．c-Retリガンドポリペプチドであって、少なくとも約400アミノ酸を含み、ホスファチジルイノシトールグリカン結合モチーフを含む疎水性Ｃ末端配列を有し、該ポリペプチドは、疎水性Ｎ末端シグナル配列の除去によってプロセスされている、c-Retリガンドポリペプチド。１４．c-Retに結合する場合、そのダイマー化または自己リン酸化を誘発する、請求項１３に記載のc-Retリガンドポリペプチド。１５．c-Retリガンドであって、以下の配列： (a)ラットRetL1（配列番号２）、部分的ヒトRetL1（配列番号９）、ヒトRetL1 （配列番号11）、ヒトRetL2（配列番号13）、部分的マウスRetL3（配列番号15）、マウスRetL3（配列番号17）、部分的ヒトRetL3（配列番号19）、およびヒトRe tL3（配列番号21）；または (b)ラットRetL1（配列番号２）、部分的ヒトRetL1（配列番号９）、ヒトRetL1 （配列番号11）、ヒトRetL2（配列番号13）、部分的マウスRetL3（配列番号15）、マウスRetL3（配列番号17）、部分的ヒトRetL3（配列番号19）、およびヒトRe tL3（配列番号21）のアミノ酸置換改変体、から選択される、c-Retリガンド。１６．可溶性の短縮型c-Retリガンドポリペプチドであって、少なくとも約400アミノ酸を含み、ホスファチジルイノシトールグリカン結合モチーフを含む疎水性Ｃ末端配列を有し、該ポリペプチドは、疎水性Ｎ末端シグナル配列の除去および該ホスファチジルイノシトールグリカン結合モチーフの除去によってプロセスされている、c-Retリガンドポリペプチド。１７．融合タンパク質であって、免疫グロブリンポリペプチドまたはトキシンポリペプチドに融合した請求項１２、１３、１４、１５、または１６に記載のc-Re tリガンドポリペプチドを含む、融合タンパク質。１８．免疫グロブリンポリペプチドまたはトキシンポリペプチドに融合したc-Re tポリペプチドを含む、融合タンパク質。１９．請求項１２、１３、１４、１５、または１６に記載のc-Retリガンドポリペプチドに特異的に結合する、抗体。２０．前記c-Retリガンドポリペプチドの前記c-Retポリペプチドへの結合をブロックする、抗体。２１．c-Retポリペプチドに特異的に結合する、請求項２０に記載の抗体。２２．請求項１２、１３、１４、１５、または１６に記載のc-Retリガンドポリペプチドの、治療における使用。２３．請求項１７または１８に記載の融合タンパク質の、治療における使用。２４．請求項１９、２０、または２１に記載の抗体の、治療における使用。２５．被験体におけるc-Ret発現組織の増殖を刺激するかまたは該組織に対する損傷を制限する方法であって、請求項１２、１３、１４、１５、もしくは１６に記載のc-Retリガンドポリペプチド、または請求項１７もしくは１８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質、または請求項２０もしくは２１に記載の抗体の治療的有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。２６．前記c-Retリガンドポリペプチドが、GDNF関連ポリペプチドと同時に投与される、請求項２５に記載の方法。２７．前記c-Ret発現組織が、腎臓組織または神経組織である、請求項２５に記載の方法。２８．c-Retを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該細胞を、請求項１６に記載のc-Retリガンドポリペプチド、請求項１７に記載の融合タンパク質、または請求項２０もしくは２１に記載の抗体の有効量と接触させる工程を包含する、方法。２９．c-Retリガンドポリペプチドを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該細胞を、請求項１６に記載のc-Retリガンドポリペプチド、請求項１８に記載の融合タンパク質、または請求項１９もしくは２０に記載の抗体の有効量と接触させる工程を包含する、方法。３０．c-Retポリペプチドまたはc-Retリガンドポリペプチドのいずれかを発現する細胞に関与するc-Retシグナル伝達を調節する方法であって、該細胞を、請求項１６に記載のc-Retリガンドポリペプチド、請求項１７もしくは１８に記載の融合タンパク質、または請求項２０に記載の抗体の有効量と接触させる工程を包含する、方法。３１．c-Retポリペプチドまたはc-Retリガンドポリペプチドのいずれかを発現する細胞に対して、トキシン、造影可能な化合物、または放射性核種を標的化する方法であって、該細胞を、該トキシン、造影可能な化合物、もしくは放射性核種に結合した請求項１６に記載のc-Retリガンドポリペプチド；請求項１７もしくは１８に記載の融合タンパク質；または該トキシン、造影可能な化合物、もしくは放射性核種に結合した請求項２０に記載の抗体と接触させる工程を包含する、方法。３２．c-Retポリペプチドまたはc-Retリガンドポリペプチドのいずれかを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該細胞と、該トキシンもしくは放射性核種に結合した請求項１６に記載のc-Retリガンドポリペプチド；請求項１７もしくは１８に記載の融合タンパク質；または該トキシンもしくは放射性核種に結合した請求項２０に記載の抗体と接触させる工程を包含する、方法。３３．請求項９に記載のベクターの、治療における使用。３４．c-Ret代謝の障害を有する被験体を処置する方法であって、請求項９に記載のベクターを該被験体に投与する工程を包含する、方法。３５．被験体におけるc-Ret発現組織の増殖を刺激するかまたは該組織に対する損傷を制限する方法であって、請求項９に記載のベクターを該被験体に投与する工程を包含する、方法。３６．前記c-Ret発現組織が腎臓組織または神経組織である、請求項３５に記載の方法。