DE69736428T2

DE69736428T2 - RET-LIGAND 3 (RetL3), UM NEURALES UND RENALES WACHSTUM ZU STIMULIEREN

Info

Publication number: DE69736428T2
Application number: DE69736428T
Authority: DE
Inventors: Michele Winchester SANICOLA-NADEL; Catherine Hingham Hession; L. Richard Weston CATE
Original assignee: Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 1996-05-08
Filing date: 1997-05-07
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2017-05-08
Also published as: IL126918A0; SK286115B6; EA199800990A1; CZ361598A3; NO20065528L; IS4884A; EP0914339B1; EA002544B1; DE69736428D1; CA2253871C; AU3472997A; ES2270465T3; BG64907B1; CZ296516B6; NO323612B1; PT914339E; AU732392B2; TR200103297T2; KR20060024843A; ATE335003T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Nukleotidsequenzen, die einen Ret-Liganden (RetL) enkodieren sowie Verfahren zur Stimulierung des Nerven- und Nierenwachstums durch die Behandlung von Zellen mit einer RetL-DNS oder einem RetL-Protein.
STAND DER TECHNIK
Eines der Ziele der derzeitigen Forschung im Hinblick auf Zellsignalisierung und Rezeptoraktivierung besteht darin, die therapeutische Modulation von Prozessen des Zellwachstums und -überlebens zu ermöglichen. Solche Prozesse sind für die Verläufe verschiedenster medizinischer Leiden entscheidend, darunter auch Organversagen, fötale Entwicklung und Tumorwachstum. Jede dieser Erkrankungen ist von weltweiter klinischer Bedeutung und verfügt über nur eingeschränkt wirkungsvolle Behandlungsoptionen. Es ist ein Gegenstand der Erfindung, die Zusammensetzungen und Verfahren zur Verbesserung der Regeneration oder des Überlebens von beschädigtem Gewebe bereitzustellen sowie auch Zusammensetzungen für die Behandlung von Erkrankungen, die mit abweichendem Wachstum und Fehlentwicklungen von Gewebe einhergehen bereitzustellen.
Gewebeverlust oder Organversagen im Endstadium betrifft jedes Jahr weltweit Millionen von Menschen und führt zu einer erheblichen Erhöhung der Kosten des Gesundheitswesens. Organ- oder Gewebeverluste werden gewöhnlich durch Transplantationen von Organen von Spendern, durch chirurgische Plastiken oder mechanische Vorrichtungen behandelt. Jede dieser Behandlungsmethoden weist Mängel auf. Transplantationen werden eingeschränkt durch die mangelnde Verfügbarkeit von Spendern, chirurgische Plastiken können andere langfristige Probleme verursachen und mechanische Vorrichtungen können nicht alle Funktionen des einzelnen Organs ausüben und somit nicht den fortschreitenden Verfall aufhalten. Aus diesem Grunde besteht ein medizinischer Bedarf an neuen Lösungen für diese Probleme.
Proteinfaktoren, die das Wachstum, die Differenzierung und/oder das Überleben von Zellen beeinflussen, können bei der Behandlung von Erkrankungen von Organen, welche reagierende Zellen umfassen, hilfreich sein. Faktoren oder Liganden, die mit den Rezeptoren der Familie der Rezeptor-Protein-Tyrosin-Kinase (RPTK) zusammenwirken, sind in dieser Hinsicht von besonderem Interesse. Diese Rezeptoren spielen bei vielen Zellabläufen eine Rolle, darunter auch beim Zellwachstum und der Zelldifferenzierung sowie der Genese von vielen Neoplasien. Aus diesem Grunde könnten sich die Faktoren oder Liganden, die mit diesen Rezeptoren zusammenwirken, bei der Behandlung von Erkrankungen einiger Organe, bei denen Gewebe beschädigt wurde, als hilfreich erweisen. Alternativ dazu kann es hilfreich sein, das Zusammenwirken dieser Faktoren mit ihren Rezeptoren zu blockieren, um das Tumorwachstum zu bremsen.
Das Ret-Protoonkogen verschlüsselt eine Rezeptor-Tyrosin-Kinase, die während der Entwicklung in einer Vielzahl von Geweben, darunter auch die der periphären und zentralen Nervensysteme und der Nieren, exprimiert wird. Abnormalitäten der Ret-Null Mäuse weisen darauf hin, dass Ret für die Migration und Innervation von enteralen Neuronen, die zum Enddarm führen, sowie für die Zellteilung und Verzweigung des Epithels der Harnleiterknospe während der Nierenentwicklung (Nature 367, 380-383, 1994) von besonderer Bedeutung ist. Die Suche nach einer Schlüsselkomponente des Ret-Signalpfades, also nach dem Ret-Liganden, ist deshalb ein Bereich intensiver Forschung gewesen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt eine isolierte Nukleinsäure bereit, die ein Polypeptid mit mindestens 80% Sequenzidentität zu einer Aminosäurensequenz, die aus einer Gruppe aus murinem RetL3 (SEQ ID NO. 17) und humanem RetL3 (SEQ ID NO. 21) ausgewählt ist, verschlüsselt, wobei besagtes Polypeptid mit einem Ret-Rezeptorprotein zusammenwirkt, um die Dimerisierung des Ret-Rezeptorproteins oder die Autophosphorilierung der Tyrosin-Kinase-Domäne des Ret-Rezeptorproteins auszulösen. Bei einer Ausführungsform behält diese isolierte Nukleinsäure mindestens 80% der Cysteine bei einem Alignment mit SEQ ID NO. 17 oder SEQ ID NO. 21 bei.
Bei einer anderen Ausführungsform weist das verschlüsselte Polypeptid eine mindestens 90%ige Sequenzidentität bzgl. einer Aminosäurensequenz auf, die aus der Gruppe der SEQ ID NO. 17 und SEQ ID NO. 21 ausgewählt wurde. Das enkodierte Polypeptid kann die SEQ ID NO. 17 oder die SEQ ID NO. 21 aufweisen. Die Erfindung stellt ferner eine isolierte Nukleinsäure bereit, die eine Nukleotidsequenz aus der Gruppe der murinen retL3-cDNS (SEQ ID NO. 16) und der humanen retL3 cDNS (SEQ ID NO. 20) umfasst.
Die Erfindung stellt ferner einen Vektor bereit, der ein Insert umfasst, welches wiederum eine der oben genannten Nukleinsäuren aufweist oder eine Wirtszelle, die solch einen Vektor umfasst. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend die Schritte des Anzüchtens der besagten Wirtszelle und der Gewinnung des Polypeptids, das aus dem Insert in der besagten Wirtszelle exprimiert wird, wird ebenso umfaßt.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Polypeptid, das durch eine der genannten Nukleinsäuren enkodiert ist, sowie ein isolierter monoklonaler Antikörper, der an ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe aus der Aminosäure mit partiellem murinem RetL3 (SEQ ID NO. 15), mit murinem RetL3 (SEQ ID NO. 17), mit partiellem humanem RetL3 (SEQ ID NO. 19) und mit humanem RetL3 (SEQ ID NO. 21) ausgewählt ist, umfaßt. Die Erfindung betrifft ferner eine Zusammensetzung, die den besagten Antikörper umfasst, der an ein Toxin, an ein bildgebendes Zusammensetzung oder an ein Radionuklid assoziiert ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein Fusionsprotein, das besagtes Polypeptid, das durch eine der Nukleinsäuren der Erfindung enkodiert ist, umfasst, wobei die Nukleinsäuren an ein Immunoglobulin, an ein Toxin, an ein bildgebendes Zusammensetzung oder an ein Radionuklid gebunden sind. Letztlich können alle Nukleinsäuren, Polypeptide, Vektoren, Antikörper oder gebundene Proteine der Erfindung zu Therapie- oder Diagnosezwecken verwendet werden.
Offenbart wird ein gereinigtes und isoliertes DNS-Molekül, das RetL enkodiert und das die Nukleotidsequenz von jedem RetL aufweisen kann, jedoch insbesondere retL1-cDNS der Ratte (SEQ ID N. 1), partielle humane retL1-cDNS (SEQ ID NO. 8), humane Gesamtlängen-retL1-cDNS (SEQ ID NO. 10), humane retL2-cDNS (SEQ ID NO. 12), murine retL3-cDNS (SEQ ID NO. 16), partielle humane retL3-cDNS (SEQ ID NO. 18) oder humane retL3-cDNS (SEQ ID NO. 20) umfasst. Ferner wird ein RetL-Protein offenbart, welches eine Aminosäurensequenz aufweist, die RetL1 der Ratte (SEQ ID NO. 2), das partielle humane RetL1 (SEQ ID N. 9), das humane Gesamtlängen-RetL1 (SEQ ID NO. 11), das humane RetL2 (SEQ ID NO. 13), das murine RetL3 (SEQ ID NO. 17), das partielle humane RetL3 (SEQ ID NO. 19) oder das humane RetL3 (SEQ ID NO. 21) umfasst.
Eine DNS-Sequenz, die die Sequenz des DNS-Inserts des Klons HRL20 umfasst (partielle humane retL1-cDNS (SEQ ID NO. 8)), welcher ATCC NO. 97604 ist, oder die Sequenz des DNS-Inserts des Klons #230-5A-86-17 (retL1-cDNS der Ratte (SEQ ID NO. 1)), welcher ATCC NO. 98047 ist, werden ebenso beschrieben.
Ferner wird ein gereinigtes und isoliertes DNS-Molekül zur Verwendung zur Sicherstellung der Expression eines Polypeptid-Produktes in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle offenbart, das mindestens einen Teil der primären strukturellen Konformation und der biologischen Aktivität von RetL aufweist; die DNS kann a) ein DNS-Molekül sein, welches die retL1-cDNS der Ratte, die partielle humane retL1-cDNS, die humane Gesamtlängen-retL1-cDNS, die humane retL2-cDNS, die murine retL3cDNS oder die humane RetL3-cDNS bzw. den komplementären Strang der retL1-cDNS der Ratte, der partiellen humanen retL1-cDNS, der humanen Gesamtlängen retL1-cDNS, der humanen retL2-cDNS, der murinen retL3-cDNS oder der humanen retL3-cDNS umfasst; b) DNS-Moleküle, die unter strengen Bedingungen mit der DNS hybridisieren, die in a) definiert wurde oder mit Fragmenten davon; oder c) DNS-Moleküle, bis auf die Degeneration des genetischen Codes mit den DNS-Molekülen hybridisieren würden, die in a) und b) definiert wurden. Ein gereinigtes und isoliertes DNS-Molekül, das ein Polypeptid-Fragment oder eine Variante des humanen RetL enkodiert, wobei dieses die biologische Aktivität von einem RetL aufweist, wird ebenso beschrieben.
Alle rekombinanten DNS-Moleküle, die oben genannt wurden, an eine Expressionskontrollsequenz gebunden, so dass sie funktionsfähig sind.
Ebenso offenbart werden Vektoren und Zuführungssysteme, die die DNS-Moleküle oder -Konstrukte, die anderswo in dieser Beschreibung definiert werden, umfassen. Der Vektor umfasst dabei ein DNS-Molekül, das ein RetL oder eine Variante des RetL enkodiert.
Die Erfindung schließt prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen mit ein, die stabil transformiert sind oder durch einen Vektor mit einem DNS-Molekül, welches ein natives oder variantes RetL umfasst, transfiziert werden.
Ein gereinigtes und isoliertes humanes RetL, das im Wesentlichen frei von anderen humanen Proteinen ist, wird insbesondere offenbart, sowie ein Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptid-Produktes, das einen Teil oder die gesamte primäre strukturelle Konformation und die biologische Aktivität eines RetL aufweist. Solch ein Verfahren kann die Schritte des Anzüchtens von prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen, die mit irgendeinem der hier offenbarten DNS-Moleküle transformiert oder transfiziert wurden unter geeigneten Bedingungen und in einer Weise, die die Expression eines solchen Polypeptid-Produktes und die Gewinnung eines RetL ermöglichen, umfaßt. Das Polypeptid-Produkt der Expression einer DNS einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle wird ebenso mit einbezogen.
Ebenso offenbart sind Proteine und Proteinfragmente, -varianten und -derivate, die entweder löslich sind oder an eine Membran gebunden sind. In einigen Fällen weist das Protein eine Aminosäurensequenz auf, die 1 der Ratte, das partielle humane RetL1, das humane Gesamtlängen-RetL1, das humane RetL2, das murine RetL3 oder das humane RetL3 umfasst oder eine Variante einer dieser Sequenzen darstellt. In anderen Fällen ist das Protein ein Fusionsprotein, das Ret oder ein RetL umfasst, welches an ein anderes Molekül oder an ein Molekül-Fragment gebunden ist, wobei dies ein Immunoglobulin, ein Toxin, ein bildgebendes Element oder ein Radionuklid sein kann. Ebenso mit einbezogen sind chimäre Moleküle von RetL.
Ferner werden spezifische monoklonale Antikörper eines RetL der Erfindung offenbart. Solch ein Antikörper kann mit einem Toxin, einer bildgebenden Zusammensetzung oder einem Radionuklid assoziiert sein. Solche Antikörper werden erzeugt durch Hybridoma-Zelllinien, darunter AA.FF9, AA.HE3, AF.E9, BA.B1, BB.B6, AA.GE7. CD.F11, AH.E3, CD.G4, AG.E7, BD.G6 und BH.G8 sowie Subklone dieser Hybridoma-Zellen. Antikörper, die durch diese Hybridoma- Zellen oder die Subklone dieser Hybridoma-Zellen erzeugt werden, werden ebenso beschrieben.
Die Offenbarung umfasst ferner die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, das mit dem zellulären Ret zusammenwirkt und dadurch die Autophosphorylierung des Ret bewirkt, zur Förderung des Wachstums des neuen Gewebes oder das Überleben des geschädigten Gewebes in einem Subjekt. Die Zusammensetzung kann RetL1, RetL2 oder RetL3, ein Fragment oder ein Gesamtlängen-RetL oder ein Antikörper, der an Ret bindet, sein. Die Zusammensetzung sollte gleichzeitig mit einer therapeutisch wirksamen Menge einer zweiten Zusammensetzung wie GDNF, Neurturin oder einem GDNF-verwandten Molekül verabreicht werden. Während Gewebe, das von Interesse ist, jede Art von Gewebe mit einbezieht, sind bevorzugte Gewebearten das Nierengewebe, das Nervengewebe sowie das Gewebe von Herz, Magen, Dünndarm, Rückenmark oder Lunge. Bei einer Ausführungsform ist RetL ein lösliches RetL. Das oben genannte Subjekt kann ein Mensch sein.
Bei einem anderen Verwendungszweck, der offenbart wird, ist die Ret-Signaltransduktion zwischen einer ersten Zelle, die ein RetL exprimiert und einer zweiten Zelle dadurch gehemmt, dass die erste Zelle mit einem löslichen Ret-Protein oder mit einem Antikörper des RetL Kontaktiert wird. Das lösliche Ret-Protein kann ein Fusionsprotein sein.
Ebenso beschrieben wird ein Verfahren zur gezielten Verabreichung eines Toxins, einer bildgebenden Zusammensetzung oder eines Radionuklids an eine Zelle, die Ret exprimiert, welches den Kontakt der Zelle mit einem RetL-Fusionsprotein oder mit einem Anti-Ret-Antikörper, der an ein Toxin, an eine bildgebende Zusammensetzung oder an ein Radionuklid gebunden ist, umfasst. Das RetL kann RetL1, RetL2 oder RetL3 sein. Bei einem anderen Verfahren wird das Wachstum einer Tumorzelle, die Ret exprimiert, unterdrückt, wobei ein Schritt des Verfahrens darin besteht, dass die Zelle in Kontakt mit einem Fusionsprotein eines RetL und eines Toxins oder Radionuklids oder einem Anti-Ret Antikörper, der an ein Toxin oder an Radionuklid gebunden ist, gebracht wird. Die Zelle kann sich in einem Subjekt befinden und das Protein oder der konjugierte Antikörper kann einem Subjekt verabreicht werden.
Ebenso offenbart wird ein Verfahren zur Zielgerichteten Verabreichung eines Toxins, einer bildgebenden Zusammensetzung oder eines Radionuklids an eine Zelle, die ein RetL exprimiert, wobei die Zelle in Kontakt mit einem Fusionsprotein ist, welches Ret und ein Toxin, eine bildgebende Zusammensetzung, einen Radionuklid oder einem Anti-RetL-Antikörper, der an ein Toxin, an eine bildgebende Zusammensetzung oder an ein Radionuklid gebunden ist. Eine andere Ausführungsform umfasst das Verfahren der Wachstumshemmung einer Tumorzelle, die ein RetL exprimiert, wobei dies den Kontakt der Zelle mit einem Fusionsprotein von Ret und einem Toxin oder Radionuklid oder mit einem Anti-RetL-Antikörper umfasst, der an ein Toxin oder Radionuklid gebunden ist; die Zelle kann sich dabei in einem Subjekt befinden, und das Protein kann diesem Subjekt verabreicht werden.
Das offenbarte RetL ist RetL1, RetL2, RetL3 oder eine Abwandlung oder ein Fragment von RetL1, RetL2 oder RetL3.
Ebenso wird die Verwendung der offenbarten Substanzen für die Gentherapie beschrieben. Eine Ausführungsform ist die Verwendung eines Vektors, der ein DNS Molekül umfasst, welches RetL enkodiert, um ein Subjekt mit einer Erkrankung, die mit einer Ret-Störung einhergeht, zu behandeln, sowie die Verwendung um das Wachstum von neuem Gewebe bei einem Subjekt zu fördern. Eine andere Ausführungsform umfasst die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Vektors, der ein RetL enkodiert, um das Überleben von geschädigtem Gewebe bei einem Subjekt zu fördern.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine cDNS-Sequenz (SEQ ID NO. 1) und eine daraus abgeleitete Aminosäurensequenz (SEQ ID NO. 2) von RetL1 der Ratte. Die Nukleotidsequenz erstreckt sich vom Basenpaar 201 bis zum Basenpaar 1700 der SEQ ID NO. 1 und umfasst den gesamten offenen Leserahmen.
2A ist eine partielle cDNS-Sequenz (SEQ ID NO. 8) und eine daraus abgeleitete Aminosäurensequenz (SEQ ID NO. 9) des humanen RetL1. Diese Sequenz ist die des Inserts des Klons HRL20, hinterlegt als ATCC NO. 97604.
2B ist eine zusammengesetzte Gesamtlängen-DNS-Sequenz (SEQ ID NO. 10) und die daraus abgeleitete Aminosäurensequenz (SEQ ID NO. 11) des humanen RetL1.
3A ist ein Vergleich der Nukleotidsequenz des humanen RetL1 (obere Linie der Sequenz) mit der RetL1-Sequenz der Ratte (untere Linie der Sequenz). Vertikale Linien zwischen den Nukleotiden weisen auf die Übereinstimmung an einer Position hin, wohingegen ein Punkt auf die Nichtübereinstimmung an einer Position hinweist.
3B ist ein Vergleich einer Aminosäurensequenz des humanen RetL1 (obere Linie der Sequenz) mit der RetL1-Sequenz der Ratte (untere Linie der Sequenz). Vertikale Linien zwischen den entsprechenden Aminosäuren weisen auf die Übereinstimmung bei einem Rest hin, wohingegen Punkte auf eine konservative Substituierung bei diesem Rest hinweisen.
4A ist ein schematisches Diagramm einer möglichen Rolle von Ret und RetL im Zusammenwirken einer metanephrischen Mesenchymzelle und einer Ureterknospenzelle.
4B ist ein schematisches Diagramm eines Verfahrens zum Screening von transfizierten Zellen einer cDNS-Bank für Klone, die ein RetL exprimieren. Das Vorhandensein von exprimiertem RetL bei transfizierten Zellen wird festgestellt durch Einschätzung der Bindung durch solche transfizierten Zellen entweder der Ret/IgG-Fusionsproteine oder der Ret/Alkalin-Phosphatase-Fusionsproteine.
5 ist ein schematisches Diagramm, das den Aufbau der Plasmide aufzeigt, die verwendet werden, um das Ret/IgG-Fusionsprotein der Ratte zu exprimieren.
6 ist ein schematisches Diagramm, das den Aufbau der Plasmide aufzeigt, die verwendet werden, um das humane Ret/IgG-Fusionsprotein zu exprimieren.
7 ist eine cDNS-Sequenz (SEQ ID NO. 12) und eine daraus abgeleitete Aminosäurensequenz (SEQ ID NO. 13) des humanen retL2, wie es im Klon DSW240 gefunden wurde. Der Leserahmen des Proteins befindet sich in den Nukleotiden 25 bis 1416.
8 ist ein Vergleich der Aminosäurensequenz des humanen RetL2 (obere Linie der Sequenz) mit der humanen RetL1-Sequenz (untere Linie der Sequenz). Vertikale Linien zwischen den Aminosäuren weisen auf die Übereinstimmung an einer Position hin, während Punkte auf die Nichtübereinstimmung an einer Position hinweisen.
9 ist eine cDNS-Sequenz (SEQ ID NO. 16) und eine daraus abgeleitete Aminosäurensequenz (SEQ ID NO. 17) des murinen RetL3.
10 ist eine cDNS-Sequenz (SEQ ID NO. 20) und eine daraus gewonnene Aminosäurensequenz (SEQ ID NO. 21) des humanen RetL3.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Nummern zur Kennzeichnung der Sequenzen
Den Nukleotid- und Aminosäurensequenzen, auf die in der Beschreibung Bezug genommen wird, wurden die folgenden Nummern zur Kennzeichnung der Sequenzen gegeben:
SEQ ID NO. 1 – retL1·cDNS der Ratte
SEQ ID NO. 2 – RetL1 Aminosäure der Ratte
SEQ ID NO. 3 – Oligomer Kid-13
SEQ ID NO. 4 – Oligomer Kid-14
SEQ ID NO. 5 – Oligomer Kid-15
SEQ ID NO. 6 – extrazelluläre ret-cDNS der Ratte
SEQ ID NO. 7 – extrazelluläre Ret Aminosäure der Ratte
SEQ ID NO. 8 – partielle humane retL1-cDNS
SEQ ID NO. 9 – partielle humane RetL1 Aminosäure
SEQ ID NO. 10 – humane retL1-cDNS
SEQ ID NO. 11 – humane RetL1 Aminosäure
SEQ ID NO. 12 – humane retL2-cDNS
SEQ ID NO. 13 – humane RetL2 Aminosäure
SEQ ID NO. 14 – partielle murine retL3-cDNS (EST AA50083)
SEQ ID NO. 15 – partielle murine RetL3 Aminosäure
SEQ ID NO. 16 – murine retL3-cDNS
SEQ ID NO. 17 – murine RetL3 Aminosäure
SEQ ID NO. 18 – partielle humane retL3-cDNS
SEQ ID NO. 19 – partielle humane RetL3 Aminosäure
SEQ ID NO. 20 – humane retL3-cDNS
SEQ ID NO. 21 – humane retL3 Aminosäure
Definitionen
In diesem Zusammenhang meint der Begriff „RetL" jede Art von Protein, welches gezielt mit dem Ret-Rezeptorprotein zusammenwirkt und welches bei der Interaktion mit Ret die Ret-Dimerisierung und/oder Autophosphorylierung der Tyrosin-Kinase-Domäne von Ret auslöst. Die DNS-Sequenzen, die RetL und Ret kodieren, werden mit „retL" bzw. "ret" bezeichnet. Ein Ligand kannlöslich oder als Membrangebundenes Molekül auf der gleichen oder auf einer anderen Zelle wie das Ret-Molekül, durch welches die Autophosphorylierung ausgelöst wird, vorhanden sein. Bei einigen Verwendungszwecken oder Interaktionen mit Ret kann der Ligand zusätzliche Moleküle benötigen, um die Autophosphorylierung auszulösen. Liganden umfassen Ko-Rezeptoren oder unterstüztende Ko-Faktoren für die Liganden. Liganden umfassen ferner Anti-Ret-mAbs, die als Ret-Antagonisten fungieren, welche die Ret-Dimerisierung und Autophosphorylierung auslösen. Der Ligand kann auch auf verschiedene Weisen modifiziert sein, so wie als ein Teil eines Fusionsproteins eingebaut sein sowie mit einem Toxin oder Radionuklid zusammen vorhanden sein.
Unter „Alignment von Sequenzen" wird die Positionierung einer Sequenz, entweder einer Nukleotid- oder Aminosäurensequenz, mit einer anderen verstanden, um Sequenzen der relevanten Teile miteinander zu vergleichen. Ein Beispiel eines Verfahrens für diese Prozedur liefern Needleman et al. (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970). Das Verfahren kann im herkömmlichen Sinne durch Computerprogramme wie dem Align Programm (DNAstar, Inc.) verwendet werden. Fachleute wissen, dass homologe oder funktional equivalente Sequenzen funktionell gleichwertige Anordnungen der Cysteinreste innerhalb des konservierten Cysteingerüstes umfassen, darunter auch Insertionen oder Deletionen der Aminosäuren, die die lineare Anordnung dieser Cysteine verändern, jedoch ihre Beziehung in der gefalteten Struktur des Proteins nicht materiell beeinträchtigen. Aus diesem Grunde werden innere Lücken und Insertionen von Aminosäuren zum Zweck der Berechnung des Grades der Übereinstimmung der Aminosäurensequenz oder der Identität zwischen dem Kandidaten und den entsprechenden Sequenzen vernachlässigt. Ein Merkmal, das häufig bei der Feststellung der Übereinstimmung des Proteins angewendet wird, ist die Ähnlichkeit der Anzahl und der Lokalisierung der Cysteinreste zwischen zwei Proteinen.
Unter dem Begriff „Klonen" versteht man die Verwendung von In-Vitro-Rekombinationstechniken, um ein spezielles Gen oder eine andere DNS-Sequenz in ein Vektormolekül einzufügen. Um ein gewünschtes Gen erfolgreich zu klonen, ist es notwendig, Verfahren zur Erzeugung von DNS-Fragmenten anzuwenden, um die Fragmente mit den Vektormolekülen zu verbinden und die zusammengesetzten DNS-Moleküle in eine Wirtszelle einzubringen, in der diese repliziert werden können, sowie um den Klon mit dem gewünschten Gen aus den Wirtszellen, die das Molekül umfassen, auszuwählen.
Mit „cDNS" ist eine komplementäre oder kopierte DNS gemeint, die aus einem RNS-Template durch die Wirkung der RNS-abhängigen DNS-Polymerase (umgekehrte Transkriptase) erzeugt wird. Deshalb versteht man unter einem "cDNS-Klon" eine doppelte DNS-Sequenz, die zu einem gewünschten RNS-Molekül, das sich in einem Klonvektor befindet, komplementär ist und welche sich in einem Klonvektor befindet.
Unter „cDNS-Bank" versteht man eine Sammlung von rekombinanten DNS-Molekülen, die cDNS-Inserts umfassen, die alle zusammen mRNS-Moleküle umfassen, die in einem gesamten Organismus oder Gewebe, je nach Ursprung der RNS-Templates, vorhanden sind. Solch eine cDNS-Bank wird beispielweise durch in Fachkreisen bekannte Verfahren erstellt, und wurde zum Beispiel in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, beschrieben. Im Allgemeinen wird die RNS zunächst aus der Zelle eines Organismus, aus dessen Genom ein besonderes Gen geklont werden soll, isoliert. In Bezug auf die Zielsetzungen der vorliegenden Erfindung werden Säugetier- und insbesondere menschliche Zelllinien bevorzugt. Alternativ dazu kann die RNS aus einer Tumorzelle isoliert werden, die einem Tumor eines Tieres und vorzugsweise einem humanen Tumor entstammt. In diesem Sinne wird eine Bank zum Beispiel aus einem Tumor einer humanen Nebenniere aufbereitet, es kann jedoch auch jede andere Art von Tumor verwendet werden.
In der hiesigen Verwendung bezieht sich der Begriff „DNS-Polymorphismus" auf den Zustand, bei dem zwei oder mehrere verschiedene Nukleotidsequenzen an einer jeweiligen Stelle in der DNS vorkommen können.
Der Begriff „Expressionsvektor" umfasst Vektoren, die in der Lage sind, DNS-Sequenzen, die darin enthalten sind, zu exprimieren, d.h. die enkodierten Sequenzen so an andere Sequenzen gebunden, welche in der Lage sind, deren Expression zu ermöglichen, dass sie funktionsfähig sind. Dazu gehört auch, dass diese Expressionsvektoren in den Wirtsorganismen entweder als Episome oder als integrierter Bestandteil der Chromosomen-DNS replizierbar sein müssen, auch wenn nicht explizit darauf hingewiesen wird. Ein nützliches, jedoch nicht notwendiges Element eines wirksamen Expressionsvektors ist eine Marker-Kodierungssequenz, welche eine Sequenz darstellt, die ein Protein mit einer phänotypischen Eigenschaft (z.B. Tetracyclin-Resistenz) der Zellen, die das Protein, welches jenen Zellen gestattet, sofort identifiziert zu werden, umfasst. Insgesamt ist unter „Expressionsvektor" eine funktionale Definition zu verstehen, und jede DNS-Sequenz, die in der Lage ist, einen spezifischen DNS-Code zu exprimieren, fällt unter diesen Begriff, sofern er auf die beschriebene Sequenz angewendet wird. Solche Vektoren haben häufig die Form von Plasmiden, so dass „Plasmid" und „Expressionsvektor" häufig austauschbar verwendet werden. Die Erfindung hat jedoch zum Ziel, auch andere Formen von Expressionvektoren mit einzubeziehen, darunter auch Phagen, die gleichwertige Funktionen aufweisen und mehr und mehr in der Fachwelt bekannt werden.
In ähnlicher Weise umfasst ein „funktionales Derivat" eines Genes aus irgendeinem Protein der vorliegenden Erfindung auch „Fragmente", „Varianten" und „Analoge" der Gene, welche in der Nukleotidsequenz "im Wesentlichen ähnlich" sind und welche ein Molekül mit einer ähnlichen Aktivität kodieren.
„GDNF-verwandte Moleküle" sind alle Arten von Molekülen, die mindestens zu 40% sowohl mit dem GDNF als auch mit dem Neurturin übereinstimmen und die außerdem in der Lage sind, gezielt ein RetL zu binden.
Der Begriff „Gen" meint eine Polynukleotid-Sequenz, die ein Peptid enkodiert.
Unter „übereinstimmend" versteht man bezüglich eines Peptids oder einer DNS-Sequenz, dass die primäre Molekülstruktur (d.h. die Sequenz der Aminosäuren oder der Nukleotide) von im Wesentlichen allen Molekülen, die in der betreffenden Zusammensetzung vorhanden sind, identisch ist.
Der Begriff „Oligonukleotid" ist in diesem Zusammenhang in Bezug auf Proben der zu bestimmenden Oligomer-Fragmente, Oligomer-Kontrollen, nicht-markierte hemmenden Oligomere und Primer zur Amplifikation von Sequenzen als ein Molekül definiert, das sich aus mehr als drei Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden zusammensetzt. Die genaue Größe hängt von vielen Faktoren ab, die wiederum von der letztendlichen Funktion oder Verwendung der Oligonukleotide abhängen.
Der Begriff „Sonde" oder „Probe" bezieht sich auf einen Liganden mit bekannten Eigenschaften, der in der Lage ist, sich selektiv an einen gewünschten Anti-Liganden zu binden. In Bezug auf Nukleinsäuren bezieht sich der Begriff „Sonde" auf einen Nukleinsäurenstrang mit einer Basissequenz, die komplementär zum gewünschten Strang ist.
„Rekombinante Wirtszellen" bezieht sich auf Zellen, die mit Vektoren, die unter Verwendung von rekombinanten DNS-Techniken konstruiert wurden, transformiert wurden. So wie hier definiert, geht der Antikörper oder dessen Modifizierung, die durch eine rekombinante Wirtszelle erzeugt wurde, auf diese Transformation zurück und nicht auf die geringere Menge oder allgemeiner noch auf die geringe nicht-feststellbare Menge zurück, die durch nicht transformeirte Wirte produziert würde.
Die Begriffe „Restriktionsendonuklease" und „Restriktionsenzyme" beziehen sich hier auf bakterielle Enzyme, die jeweils die doppelsträngige DNS bei oder nahe einer spezifischen Nukleotidsequenz spalten.
Der Begriff „Restriktions Fragmentlängen-Polymorphismus" („RFLP") bezieht sich hier auf die Unterschiede in der Länge eines speziellen Restriktionsfragmentes zwischen Individuen.
Ein Molekül wird als „im Wesentlichen ähnlich" in Bezug auf ein anderes Molekül beschrieben, wenn die Sequenz der Aminosäuren bei beiden Molekülen im Wesentlichen gleich ist, und wenn beide Moleküle eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen. Demzufolge werden diese als Varianten bezeichnet, vorausgesetzt, es handelt sich um zwei Moleküle mit einer ähnlichen Aktivität, so dass der Begriff hier auch verwendet wird, wenn eines der Moleküle zusätzliche Aminosäurenreste umfasst, die in dem anderen Molekül nicht festgestellt wurden, oder wenn die Sequenz des Aminosäurenrestes nicht identisch ist. In der hiesigen Verwendung ist ein Molekül ein "chemisches Derivat" eines anderen Moleküles, wenn dieses zusätzliche chemische Reste umfasst, die normalerweise nicht ein Teil des Moleküls sind. Solche Reste erhöhen die Löslichkeit des Moleküls, dessen Absorption und die biologische Halbwertszeit usw. Die Reste senken alternativ dazu die Toxizität des Moleküles, eliminieren oder schwächen unerwünschte Nebenwirkungen der Moleküle usw. Reste, die in der Lage sind, solche Wirkungen zu vermitteln, sind zum Beispiel in den Remington's Pharmaceutical Scienes, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980) offenbart.
Unter „Vektor" versteht man ein DNS-Molekül, das ein Derivat eines Plasmids oder einer Bakterienphage ist und in welches DNS-Fragmente eingefügt oder geklont werden können. Ein Vektor umfasst eine oder mehrere Restriktionsstellen und kann in der Lage sein, sich in einem bestimmten Wirt oder Trägerorganismus selbstständig zu replizieren, so dass die geklonte Sequenz reproduzierbar ist.
Unter „im Wesentlichen rein" versteht man jede Art von Protein der vorliegenden Erfindung oder jedes Gen, das ein solches Protein enkodiert, welches im Wesentlichen frei von anderen Proteinen bzw. Genen oder anderen Kontaminanten ist, mit denen es normalerweise in der Natur vorgefunden wird, und welches in einer Form vorhanden ist, die in der Natur nicht vorkommt.
Zusammensetzungen der Erfindung
Die Erfindung umfasst eine cDNS, die ein RetL enkodiert, wie z.B. die Nukleotidsequenzen der murinen retL3-cDNS oder der humanen retL3-cDNS. Zusätzlich umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung Sequenzen, die die oben genannten Sequenzen umfassen oder sind Derivate einer dieser Sequenzen. Die Erfindung umfasst ebenso Vektoren, Liposome und andere Träger, welche eine dieser Sequenzen oder ein Derivat dieser Sequenzen umfassen. Die Erfindung umfasst außerdem Proteine, die aus muriner retL3-cDNS und humaner retL3-cDNS transkribiert und translatiert werden, worunter auch murines RetL3 oder humanes RetL3 und dessen Derivate und Varianten fallen, nicht jedoch auf diese beschränkt sind.
Eine Ausführungsform der Erfindung umfasst lösliche Varianten von einem RetL. Löslichen Varianten fehlt mindestens ein Teil des Intermembranbereiches des nativen RetL. Bei einigen Beispielen fehlt der löslichen Variante die Phosphatidylinositol-Glycan-Verkettung des nativen RetL. Lösliche Varianten umfassen Fusionsproteine, welche Derivate von RetL umfassen, denen ein Phosphatidylinositol-Motiv fehlt.
Varianten können sich von natürlich vorkommendem RetL in der Aminosäurensequenz oder in Bereichen unterscheiden, die keine Sequenzen umfassen sowie auch in beiden Hinsichten. Varianten der Aminosäurensequenz entstehen, wenn eine oder mehrere Aminosäuren bei dem natürlich vorkommenden RetL durch eine andere natürliche Aminosäure, ein Aminosäurenderivat oder eine nicht-native Aminosäure ersetzt werden. Insbesondere bevorzugte Varianten umfassen natürlich vorkommendes RetL oder biologisch aktive Fragmente des natürlich vorkommenden RetL, dessen Sequenzen sich von der Sequenz des Wildtyps durch eine oder mehrere konservative Aminosäurensubstituierungen unterscheiden, welche typischerweise einen minmimalen Einfluss auf die Sekundärstruktur und die hydrophobe Natur des Proteins oder Peptids haben. Varianten können ebenso Sequenzen aufweisen, die sich durch eine oder mehrere nicht-konservative Aminosäurensubstituierungen, durch Deletionen oder Insertionen, die die biologische Aktivität von RetL nicht aufleben, unterscheiden. Konservative Substituierungen umfassen typischerweise die Substituierung einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Merkmalen, darunter Substituierungen aus den folgenden Gruppen: Valin, Glycin; Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren umfassen Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polarneutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (Basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure.
Andere konservative Substituierungen können der untenstehenden Tabelle entnommen werden und weitere Substituierungen werden beschrieben durch Dayhoff im Atlas of Protein Sequence and Structure (1988).
TABELLE 1: KONSERVATIVE AMINOSÄURENSUBSTITUIERUNGEN
Andere Varianten, die ebenso Zusammensetzungen der Erfindung sind, sind solche mit Modifizierungen, die die Peptidstabilität erhöhen. Solche Varianten können zum Beispiel eine oder mehrere Nicht-Peptid-Bindungen (die die Peptidbindungen ersetzen) in der Peptidsequenz umfassen. Ebenso darunter fallen: Varianten, die Reste umfassen, die nicht unter die natürlich vorkommenden L-Aminosäuren fallen, wie D-Aminosäuren oder nicht natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäuren wie Beta- oder Gamma-Aminosäuren und zyklische Varianten. Die Einfügung von D- anstelle von L-Aminosäuren in das Polypeptid kann dessen Widerstandsfähigkeit gegen Proteasen erhöhen. Siehe dazu z.B. die US-Patentschrift 5,219,990.
Die Peptide dieser Erfindung können ebenso durch verschiedene Veränderungen wie Insertionen, Deletionen und Substituierungen modifiziert werden, sowohl auf konservative als auch auf nicht-konservative Weise, wobei solche Veränderungen gewisse Vorteile für die Verwendung bieten. Splice Varianten sind insbesondere Bestandteil der Erfindung.
Zusätzlich zu den im Wesentlichen Gesamtlängen-Polypeptiden stellt die vorliegende Erfindung biologisch aktive Fragmente von Polypeptiden bereit. Ein RetL-Polypeptid oder ein Fragment dessen ist biologisch aktiv, wenn es eine biologische Aktivität des natürlich vorkommenden RetL aufweist. Solche biologischen Aktivitäten umfassen die Fähigkeit, insbesondere den extrazellulären Teil von Ret mit einer Affinität zu binden, die mindestens 50% von diesem betrifft und vorzugsweise mindestens die gleiche Affinität besitzt wie das natürlich vorkommende RetL beim extrazellulären Teil von Ret. Eine andere biologische Aktivität meint die Fähigkeit, sich an einen Antikörper zu binden, der sich auf ein Epitop richtet, das in dem natürlich vorkommenden RetL vorhanden ist.
Bei anderen Ausführungsformen führen Varianten mit Aminosäurensubstituierungen, die weniger konservativ sind, zu gewünschten Derivaten, z.B. durch das Auslösen von Veränderungen in der Ladung, in der Konformation und anderen biologischen Eigenschaften. Solche Substituierungen umfassen zum Beispiel die Substituierung eines hydrophilen Restes durch einen hydrophoben Rest, die Substituierung eines Cysteins oder Prolins durch einen anderen Rest, die Substituierung eines Restes mit einer kleinen Seitenkette durch einen Rest mit einer großen Seitenkette oder die Substituierung eines Restes mit einer positiven Nettoladung durch einen Rest mit einer negativen Nettoladung. Wenn das Ergebnis einer solchen Substituierung nicht mit Gewissheit vorhergesagt werden kann, müssen die Derivate sofort entsprechend der hier offenbarten Verfahren untersucht werden, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit der gewünschten Merkmale zu bestimmen.
Im Allgemeinen sind Substituierungen, bei denen man davon ausgeht, dass diese zu Veränderungen in den funktionellen Eigenschaften der Ret-Polypeptide führen, die Folgenden: (I) ein hydrophiler Rest, z.B. Serin oder Threonin, wird substituiert durch einen hydrophoben Rest, z.B. Leucin, Isoleucin, Phenylalanin oder Alanin; (ii) ein Cysteinrest wird ersetzt durch (oder mit) einem anderen Rest; (iii) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysin, Arginin oder Histidin, wird ersetzt durch (oder mit) einem Rest mit einer elektronegativen Ladung, z.B. Glutaminsäure oder Asparaginsäure; oder (iv) ein Rest mit einer großen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, wird ersetzt durch (oder mit) einem Rest ohne eine solche Seitenkette, z.B. Glycin.
Hier offenbarte Varianten umfassen Proteine und Peptide mit Aminosäuresequenzen, die mit dem RetL der Ratte (SEQ ID NO. 2), dem partiellen humanen RetL1 (SEQ ID NO. 9), dem humanen Gesamtlängen-RetL (SEQ ID NO. 11), dem humanen RetL2 (SEQ ID NO. 13), dem murinen RetL3 (SEQ ID NO. 17), dem partiellen humanen RetL3 (SEQ ID NO. 19) oder dem humanen RetL3 (SEQ ID NO. 21) zu mindestens sechzig Prozent übereinstimmen. Insbesondere beträgt die Übereinstimmung der Sequenz mindestens achtzig, mindestens neunzig oder mindestens fünfundneunzig Prozent. Zum Zweck der Bestimmung des Grades der Übereinstimmung beträgt die Länge der Vergleichssequenzen im Allgemeinen mindestens 8 Aminosäurenreste, gewöhnlich mindestens 20 Aminosäurenreste. Varianten der Zusammensetzungen der Erfindung umfassen ebenso jedes Protein, welches 1) eine Aminosäurensequenz mit mindestens vierzig Prozent Übereinstimmung mit einem RetL-Protein der Erfindung aufweist und bei dem ebenso 2) nach einem optimalen Alignment mit der RetL-Sequenz (wie für RetL1 und RetL2 in 8 dargestellt) mindestens 80% seiner Cysteinreste mit den Cysteinen im RetL-Protein der Erfindung ausgerichtet sind.
Da es möglich ist, Substituenten des Aufbaus zu ersetzen, ist es ebenso möglich, funktionale Gruppen, die an den Aufbau von Gruppen, die gekennzeichnet sind durch ähnliche Merkmale, gebunden sind, zu ersetzen. Solche Modifikationen ändern die primäre Sequenz nicht. Diese sind zunächst konservativ, d.h. die ersetzende Gruppe hat etwa die gleiche Größe, Form, Hydrophobizität und Ladung wie die ursprüngliche Gruppe. Nicht-Sequenz-Modifizierungen umfassen z.B. chemische In-Vivo- oder In-Vitro-Derivatisierungen von Teilen des natürlich vorkommenden RetL sowie auch Veränderungen in der Azetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Carboxylierung oder Glycosylierung.
Ebenso unter die Erfindung fallen Wirkstoffe, die sich insbesondere an ein Protein der Erfindung oder an ein Fragment eines solchen Proteins binden. Diese Wirkstoffe umfassen Ig-Fusionsproteine und Antikörper (darunter Einzelketten, Doppelketten, Fab-Fragmente und andere, unabhängig davon, ob diese nativ, humanisiert, primatized oder chimärisch sind). Zusätzliche Beschreibungen dieser Kategorien von Wirkstoffen sind in der PCT-Anmeldung 95/16709 dargelegt.
EXPERIMENTELLE VERFAHRENSWEISE
Überblick über die Strategie
Die allgemein angewandte Strategie für das Klonen von RetL1 wird in den 4A und 4B aufgezeigt. Unsere Strategie basierte auf der Prämisse, dass mindestens ein RetL auf dem metanephrischen Mesenchym der sich entwickelnden Niere als ein Membranprotein exprimiert wird (obwohl es möglich ist, dass der Ligand auch in einer löslichen Form exprimiert wird; 4A). Das RetL wirkt zusammen mit dem Ret-Rezeptor auf der Zelle der Ureterknospe, wobei dessen cytoplasmische Tyrosin-Kinase-Domäne aktiviert wird und ein Signal zum Zellkern gesendet wird, welches wiederum Wachstumsgene und solche, die für die Verästelung der Zelle der Ureterknospe zuständig sind, aktiviert. Aus diesem Grunde können Proteine, die die extrazelluläre Domäne von Ret umfassen, die entweder mit dem F_c, dem Teil des humanen Immunoglobulins G1 (IgG1), oder der Alkalin-Phosphatase (AP) verbunden sind, als Teil einer Strategie verwendet werden, um RetL, wie in 4B aufgezeigt, zu klonen. Die Fusionsproteine, die Expressions-Banken und andere Reagenzen, die beim Klonen von RetL1 verwendet werden, werden weiter unten beschrieben.
Zunächst wurde eine cDNS für das RetL1 der Ratte isoliert und dann als eine Probe zur Isolierung einer cDNS für das humane RetL1 verwendet. cDNS wurden nachfolgend für RetL2 und RetL3 isoliert.
Erzeugung der erforderlichen Reagenzen für das Klonen von Ret-Liganden mittels direkter Expression
1. Isolierung der cDNS, die die extrazelluläre Ret-Domäne der Ratte enkodiert
Um RetL1 zu identifizieren, wurden Fusionsproteine erzeugt, die aus extrazellulären Domänen aus dem an ein Protein gebundenen Ret entweder der Ratte oder des Menschen bestanden, wobei dies bei einem Beispiel der humane Fc-Teil von IgG1 war und bei einem anderen Beispiel die Alkalin-Phosphatase. Beide Fusionspartner können auf einfache Weise untersucht werden, um Zellen zu bestimmen, die den Liganden, so wie in 4B dargestellt, exprimieren.
Da eine cDNS, die das Ret der Ratte enkodiert, noch nie offenbart wurde, isolierten wir eine cDNS, die die extrazelluläre Domäne des Ret-Rezeptors der Ratte enkodiert, indem wir das Verfahren der Kettenreaktion der umgekehrten Transkriptase-Polymerase (RT-PCR) anwendeten. Wir verglichen die zwei Nukleotidsequenzen des humanen (Genbank Zugangsnummern M57464 und X15262) und des murinen (Genbank Zugangsnummer X67812) Ret und entwarfen Oligonukleotid-Primer für Bereiche, an denen eine hohe Übereinstimmung der beiden Sequenzen festgestellt worden war. Ein Sense-Oligomer unter der Bezeichnung Kid-013 (SEQ ID NO. 3, welches die Nukleotide 150-169 der Genbank-Sequenz X15262 umfasst) wurde vom 5' Ende der humanen ret-cDNS-Sequenz, die sich mit dem ATG-Initiationscodon überschneidet, ausgewählt. Dieses umfasst Nukleotide an seinem 5' Ende und enkodiert zum Zweck des Klonens eine kontrollierte Not1-Site. Zwei Antisense-Oligomere unter der Bezeichnung Kid-014 (SEQ ID NO. 4, welches das Komplementärstück der Nukleotide 1819-1839 der Genbank-Sequenz M57464 umfasst) und Kid-015 (SEQ ID NO. 5, welches das Komplementärstück der Nukleotide 1894-1914 der Genbank-Sequenz X67812 umfasst) wurden ausgewählt aus entweder den humanen oder murinen cDNS-Sequenzen am 5'-Ende der Sequenzen, die die Transmembran-Domäne kodieren. Die Oligomere Kid-014 und Kid-015 enthielten zusätzliche Nukleotide an ihren 5'-Enden, die eine Sal1-Restriktionssite zum Zweck des Klonens kodierten.
Die gesamte RNS wurde aus der embryonalen Niere einer Ratte vom Tag 14 isoliert und die mRNS wurde durch eine Oligo-dT-Chromatographie gereinigt. Die mRNS wurde umgewandelt in cDNS, indem die AMV-Reverse-Transkriptase angewendet wurde und die cDNS in eine doppelsträngige cDNS umgewandelt wurde und unter Verwendung der Taq Polymerase in einer Standard-Polymerase-Kettenreaktion mit den Oligomeren Kid-013 und Kid-015 erweitert wurde. Die Synthese eines 1942 bp PCR-Fragmentes wurde bestätigt durch eine Aliquotierung der PCR-Reaktion auf einem 1 %igen Agarose-Gel. Der Rest des PCR-Fragmentes wurde einer Digestion mit Not1 und Sal1 unterzogen und in pSAB132, welches vorher einer Digestion mit Not1 und Sal1 unterzogen wurde, geklont. Das entstandene Plasmid wurde pJC011 genannt. Das gesamte Insert des Plasmids pJC011 zwischen den Not1- und Sal1-Sites wurde sequenziert und als extrazelluläre Ret-cDNS der Ratte dargelegt (SEQ ID NO. 6). Eine Translation dieser Sequenz legte die Peptidsequenz (SEQ ID NO. 7) für das extrazelluläre Ret der Ratte offen. Da Oligomere für PCR aus Ret-Sequenzen vom Menschen und von Mäusen ausgewählt wurden, war es möglich, dass sich die Nukleotidsequenz, die als extrazelluläre Ret-cDNS der Ratte aufgezeigt wurde und die Peptidsequenz, die als extrazelluläres Ret der Ratte aufgezeigt wurde, von den natürlichen Ret-Nukleotidsequenzen der Ratte und den Ret-Peptidsequenzen in den Bereichen der Kid-013- und Kid-015-Sequenzen unterschieden. Nun wurden ret-cDNS-Klone von einer cDNS vom Tag 18 aus der cDNS-Bank der embryonalen Niere der Ratte isoliert und einige nukleotide Veränderungen wurden in den Primerregionen beobachtet, die zu Veränderungen von zwei Aminosäuren geführt hatten. Eine Veränderung lag in der Signalsequenz (Arginin bei Position 5 zu Threonin) und eine Veränderung lag nahe des Endes der extrazellulären Domäne (Glutaminsäure bei Position 633 zu Alanin). Beide Veränderungen sollten keinen Einfluss auf die Bindung des Liganden haben.
2. Ret/IgG-Fusionproteine
Fusionsproteine wurden aus den extrazellulären Domänen der Ret-Rezeptoren der Ratte (als Reste #1-637) und des Menschen (als Reste #1-636) erzeugt, wobei die Rezeptoren an die Fc-Bereiche des humanen IgG1 gebunden waren.
Der Aufbau der Plasmide, die verwendet wurden, um die Ret/IgG-Fusionsproteine der Ratte zu exprimieren, wird schematisch in 5 dargestellt. Um ein Gen zu konstruieren, das das Ret/IgG-Fusionsprotein der Ratte enkodiert, extrahierten wir pJC011 (wie oben beschrieben), welches die extrazelluläre Domäne vom Ret der Ratte mit Sal1 enthält und ligierten dieses an ein 700 bp Sal1-Fragment von Plasmid 2-4, um das Plasmid pJC012 zu erzeugen. Dieses Sal1-Fragment enthielt Teile der Fc-Domäne des humanen IgG1, das ursprünglich aus dem Plasmid pSAB 144 gewonnen worden war. Plasmid 2-4 wurde zuvor mittels einer Drei-Wege-Ligierung erzeugt: ein Not1-Sal1-Fragment, das durch PCR mit der extrazellulären Domäne des Rezeptors des TGF-Beta-Typus II des Hasen erzeugt wurde; ein 693 bp Sal1-Not1-Fragment aus pSAB144 mit Teilen der Fc-Domäne des humanen IgG1; und Not1, das aus pSAB132 extrahiert wurde. Wie in 5 gezeigt, kann ein Fragment, das die Fc-Domäne enthält, aus dem Plasmid 2-4 als ein 700 bp Sal1-Fragment freigesetzt werden. pJC012 wurde in COS-Zellen transfiziert und das Fusionsprotein Ret/IgG der Ratte wurde aus dem Medium 48 Stunden später unter Verwendung der Protein-A-Sepharose-Chromatographie gereinigt. Um eine stabile Zelllinie herzustellen, die das Ret/IgG-Protein der Ratte produziert, wurde das 2612 bp Not1-Fragment aus pJC012, das das gesamte Ret/IgG-Fusionsprotein der Ratte enthielt, isoliert und in die Not1-Site des Expressionsvektors pMDR901 geklont. Das entstandene Plasmid wurde pJC022 genannt. Das Plasmid pJC022 wurde in CHO-Zellen transfiziert, um stabile Zelllinien zu erzeugen. Die am meisten produzierende Zelllinie wurde an die Suspension angepasst. Eine typische Ausbeute der Ret/IgG-CHO-Linie betrug 75mg/L.
Der Aufbau der Plasmide, die verwendet wurden, um das humane Ret/IgG-Fusionsprotein zu exprimieren, wird schematisch in 6 dargestellt. Um ein Gen zu konstruieren, das das humane Ret/IgG-Fusionsprotein enkodiert, schufen wir ein Plasmid, das eine cDNS umfasst, die den humanen Ret-Rezeptor von Dr M. Takahashi enkodiert (Abteilung für Pathologie, Nagoya University, School of Medicine, Nagoya, Japan). Ein PCR-Fragment wurde aus diesem Plasmid unter Verwendung der Oligomere Kid-013 und Kid-014 erzeugt. Das PCR-Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment behandelt und dann einer Digestion mit Not1 unterzogen, um ein PCR-Fragment mit einem haftenden Not1-Ende und einem stumpfen Ende zu erzeugen. Das entstandene Fragment wurde in den pGEM11zf(+)-Vektor geklont, welcheses zuvor einer Digestion mit EcoR1 unterzogen wurde, mit dem Klenow-Fragment behandelt wurden und einer Not1 Digetion unterzogen wurde, um ein haftendes Not1-Ende und ein stumpfes Ende zu erzeugen. Das entstandene Plasmid wurde pJC013 genannt. Das 1916 bp Not1-Sal1-Fragment aus pJC013 wurde nach einer vollständigen Digestion mit Not1 und einer partiellen Digestion mit Sal1 isoliert und an das 693 bp Sal1 Not1-Fragment aus pSAB144, das den Teil der Fc-Domäne des humanen IgG1 umfasst, ligiert, und der pSAB132-Expressionsvektor wurde einer Digestion mit Not1 unterzogen. Das entstandene Plasmid wurde pJC015 genannt. Das Insert im Plasmid pJC013 wurde sequenziert, wobei man herausfand, dass es einen einzigen Unterschied in Bezug auf die Nukleotide aufwies, welcher darin lag, dass eine Aminosäure in der extrazellulären Domäne des humanen Ret verändert war (die Genbank-Sequenz M57464 hat ein C an Position 812, wohingegen pJC413 ein T an der entsprechenden Position aufweist; dies führte zu Veränderungen in den Aminosäuren von Alanin zu Valin an der Position 294 der humanen Ret-Proteinsequenz). Dieser Nukleotid wurde zurück korrigiert zum C-Rest, welcher in der Genbank-Sequenz M57464 durch die stellenspezifische Mutagenese des Plasmids pJC013 spezifiziert wurde, wodurch das Plasmid pJC023 erzeugt wurde. Ein 585 bp BstE2-Fragment aus pJC023, welches die reparierte Nukleotidsequenz umfasste, wurde isoliert und in das Plasmid pJC015, aus dem das 585 bp BstE2-Fragment mit dem abweichenden Nukleotid entfernt worden war, geklont. Das neue Plasmid wurde pJC024 genannt. Das 2609 bp Not1-Fragment aus pJC024, das das gesamte humane Ret/IgG-Fusionsprotein enthielt, wurde isoliert und in die Not1-Site des Expressionsvektors pMDR901 geklont. Das entstandene Plasmid wurde pJC025 genannt. Das Plasmid pJC025 wurde in CHO-Zellen transfiziert, um stabile Zelllinien auszubilden. Die Zelllinie mit der höchsten Produktion wurde an die Suspension angepasst. Eine typische Ausbeute der humanen Ret/IgG-CHO-Linie betrug 6 mg/L.
Weitere Ausführungen zur Herstellung der Vektoren, die in den Verfahren der Erfindung Verwendung finden, werden in den PCT-Anmeldungen 94/01456 und 92/02050 geliefert, wobei die entsprechenden Beschreibungen hierbei mit Bezugszeichen angegeben werden.
3. Bioaktivität der Ret/IgG-Fusionsproteine
Um zu bestimmen, ob die Ret/IgG-Fusionsproteine, die wir hergestellt haben, bioaktiv sind und damit gute Screening-Reagenzen für das Klönen eines RetL darstellen, haben wir verschiedene Untersuchungen zur Bioaktivität mittels Organkulturen durchgeführt. Das Organkultur-Assay bestand aus dem Anzüchten von 13-14 Tage alten embryonalen Nieren der Ratte in einer Organkultur während 3 bis 5 Tagen, wobei das Ret/1g-Fusionsprotein bei einer Konzentration von 50 ug/ml vorhanden war. Nieren wurden auch in der Anwesenheit von LFA-3TIP/IgG oder einem Trägerpuffer kultiviert. Nach der Phase der Kultivierung wurden einige der Nieren mit dem fluoreszierenden Lektin Dolichos Biflorus Agglutinin (DB-Lektin) angefärbt, welches das Gewebe der Auffangkanäle färbt, wobei diese Epithelzellen sind, die aus der Ureterknospe abgeleitet wurden. Diese „DB"-positiven Zellen markierten die Ret-positiven Zellen, da Ret in der Ureterknospe und deren epithelialen Derivaten exprimiert wird. Dadurch wurde eine grobe Einschätzung des Ret/IgG-Fusionsproteins in Bezug auf das Wachstum und die Entwicklung der embryonalen Niere möglich. Es bestand ein erheblicher Unterschied in der Morphologie der Auffankanäle und dem Wachstum zwischen den Nieren, die mit LFA-3TIP kultiviert worden waren und denen, die mit dem Ret/IgG-Fusionsprotein der Ratte kultiviert worden waren. Die Ret/IgG-behandelten Nieren wiesen Auffangkanäle mit signifikant weniger Verzweigungen auf und hatten typischerweise ein kleineres Gesamtbild.
Paraffin-Schnitte wurden aus anderen Nieren zum Zweck der histologischen Untersuchung aufbereitet. Embryonale Nieren wurden mit Control-Puffern oder mit Ret/IgG behandelt, und dann mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Die embryonale Niere, die mit Ret/IgG behandelt worden war, zeigte weniger Verzweigungen der Auffangkanäle auf als die embryonalen Nieren, die mit Kontroll-Puffern behandelt worden waren. Zusätzlich wiesen die mit Ret/IgG behandelten Nieren weniger Röhrchen auf. Wir haben diesen Effekt auch beim humanen Ret/IgG-Fusionsprotein beobachtet. Diese Beobachtungen stimmten überein mit den Fusionsproteinen, die das induktive Signal zwischen dem Mesenchym und der Ureterknospe blockieren. Aus diesem Grunde schlossen wir daraus, dass das Fusionsprotein eine gute Reagenz für das Klonen eines RetL ist.
4. Ret/Alkalin-Phosphatase-Fusionsprotein
Rezeptor/Alkalin-Phosphatase-(AP)-Fusionsproteine wurden erfolgreich verwendet, um Liganden für c-Kits (Cell 63: 185, 1990) und Liganden für die Mitglieder der eph-Familie der Orphanrezeptoren (Cell 79: 157, 1994) zu identifizieren und nun auch, um einen Rezeptor für Leptin zu klonen, welches ein Produkt des ob-Gens ist (Cell 83: 1263, 1995). Plasmide, die das Ret/AP-Fusionsprotein der Ratte enkodieren, wurden konstruiert und das Ret/AP-Protein der Ratte wurde in COS7-Zellen in Zellfabriken produziert. Anschließend wurde eine stabile NIH3T3-Zelllinie erzeugt, die im Durchschnitt 10mg/L des Fusionsproteins exprimierte. SDS-PAGE-Analysen des Ret/AP-Proteins der Ratte wiesen darauf hin, dass dessen Größe mit dem vorhergesagten molekularen Gewicht übereinstimmte und die Analyse mittels Gelfiltration wies darauf hin, dass dieses als ein Dimer produziert wurde. Die partielle Reinigung wurde durch eine Affinitätschromatographie auf einer Anti-AP-Säule erreicht.
5. Anti-Ret-Antikörper
Ein polyklonaler Antikörper des Hasen wurde gegen das Ret/IgG-Fusionsprotein der Ratte erzeugt. Der Antikörper funktionierte an Western-Blots, den FACS-Analysen der Ret-positiven Zelllinien und an der Immunohistochemie der Bereiche der embryonalen Niere.
Ein Panel mit Anti-Rat-Ret monoklonalen Antikörpern des Hamsters wurde erzeugt. Das Ret/IgG-Fusionsprotein der Ratte, das an das A-Sepharose-Protein gekoppelt war, wurde verwendet, um Armenian-Hamster zu immunisieren. 316 Klone erhielt man nach der Fusion, wobei diese hinsichtlich ihrer Fähigkeit, sich an die Ret-Fusionsproteine der Ratte und/oder an das humane IgG zu binden, in einer ELISA-Studie untersucht wurden. 11 Klone produzierten Antikörper, die sich nur mit dem Ret/IgG der Ratte (und dem Ret/AP der Ratte) verbinden, aber nicht mit dem humanen IgG. Die Überkreuz-Reaktivität des humanen Ret wurde durch FACS untersucht; vier Klone produzierten Antikörper, die sich an die Ret-positive humane Zelllinie THP-1 binden konnten. Die nachfolgende Tabelle fasst die Eigenschaften der Ret-Bindung von zwölf monoklonalen Antikörpern zusammen.
6. cDNS-Expressionsbanken
Wir bereiteten cDNS-Banken aus der embryonalen Niere der Ratte auf, wobei sich davon eine im CDM8-Vektor, der das SV40-Origin für die Erweiterung verwendete, befand, und eine sich in einem modifizierten InVitrogen-Vektor pCEP4, der die EBV-Origin für die Erweiterung verwendete, befand. Bei diesem modifizierten Vektor, CH269, wurden die EBNA-1 Gensequenzen entfernt. Das EBNA-1-Protein wirkte mit dem EBV-Origin zusammen, das Gen war jedoch auf dem Vektor nicht erforderlich, da Zellen verwendet wurden, die das EBNA-Protein stabil exprimierten. Die Bank des CDM8-Vektors enthielt 1,5 × 10⁶ Klone mit einer Durchschnittsgröße des Inserts von 1,18 kb, wohingegen die Bank im CH269-Vektor etwa 1 × 10⁶ Klone mit einer Durchschnittsgröße des Inserts von 1,5 kb aufwies.
Expressionsklonen des Ret-Liganden RetL1
A. Klonen des Ret-Liganden von RetL1 der Ratte
1. Erste Herangehensweisen beim Expressionsklonen des Ret-Liganden RetL1
Es wurden etliche direkte Expressionsverfahren angewendet, um RetL1 zu klonen. Alle diese Verfahren basierten auf dem Konzept, das in 4B dargestellt wird. cDNS aus einer cDNS-Bank wurden in Zellen von Säugetieren eingebracht; Zellen, die RetL1 aufnehmen, konnten festgestellt werden, indem Ret-Fusionsproteine verwendet wurden. Obwohl die drei Ansätze, die nachfolgend beschrieben werden, erfolglos verliefen, lieferten sie herausragende Erkenntnisse und Fachwissen, welche in einem nachfolgenden Versuch, der dann erfolgreich verlief, eingesetzt wurden.
a. Panning-Methode mit Ret/IgG
Das Ret/IgG Fusionsprotein der Ratte wurde in dem Versuch verwendet, RetL1 durch direktes Expressionsklonen unter Verwendung einer Panning-Methode zu isolieren (Aruffo und Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8753-8757 (1987)). Eine 18 Tage alte embryonale Niere der Ratte der cDNS-Bank in CDM8 wurde für die Panning-Methode herangezogen. Pools mit der cDNS aus dieser Bank (5.000-10.000 cDNS pro Pool) wurden in COS-Zellen unter Verwendung der DEAE-Dextran-Methode eingebracht. Nach 48 Stunden wurden die Zellen aus den Platten mit EDTA entfernt, mit dem Fusionsprotein inkubiert und dann auf Platten, die mit dem anti-humanen IgG-Antikörper beschichtet waren, geschwenkt. Die DNS wurde aus den Zellen, die daran haften blieben, entnommen, zurück in E. Coli umgewandelt und dann zum Zweck einer zweiten Runde mit der Panning-Methode isoliert. Wir konnten keine Zellbindungen nach der dritten Runde mit der Panning-Methode feststellen und nur sehr wenige Klone wurden nach der Transformation der Hirt-DNS zurück zu E. Coli erhalten. Eine VCAM-cDNS, die in Verbindung mit einem monoklonalen Anti-VCAM-Antikörper als eine positive Kontrolle verwendet wurde, konnte nur in einem Verhältnis von 1:100 gelöst und noch festgestellt werden, was darauf hinweist, dass die Größe unseres Pools wahrscheinlich zu groß war. Die Untersuchung von einigen der Klone, die wir nach der zweiten Runde mit der Panning-Methode erhalten hatten, ergab, dass die Klone sich neu organisierten und deletiert wurden.
b. Präparative FACS-Verfahren mit Ret/IgG
80.000 cDNS-Klone aus der Bank der embryonalen Nieren der Ratte (CDMB-Vektor) von Tag 18 wurden in COS7-Zellen eingebracht und dem präparativen FACS-Verfahren unter Verwendung des Ret/IgG-Proteins der Ratte und anschließend eines Fluor-markierten sekundären Antikörpers unterworfen. Die obersten 0,5% und 0,9% der fluoreszierenden Zellen wurden entnommen und die Plasmid-DNS wurde durch eine Hirt-Lyse gewonnen. Die DNS wurde zurück in E. Coli elektroporiert: 228 Klone wurden aus dem 0,5%-Pool und 752 aus dem 0,9%-Pool gewonnen. Die DNS wurde den bakteriellen Klonen entnommen und eine zweite Runde des präparativen FACS-Verfahrens wurde durchgeführt. Plasmide, die aus den bakteriellen Klonen am Ende der zweiten Runde gewonnen wurden, wurden analysiert und wiesen dabei ausgeprägte Deletionen und Neuanordnungen auf.
c. Kolorimetrisches Feststellungsverfahren mit Ret/AP
COS-Zellen wurden mit 400 Pools der cDNS-Klone der 18 Tage alten embryonalen Niere der Ratte aus der cDNS-Bank (CDM8-Vektor) transfiziert (1000 Klone pro Pool) und mit dem Ret/AP-Protein und einem Färbesubstrat für die Alkalin-Phosphotase angefärbt. Die transfizierten Zellen wurden unter einem Mikroskop im Hinblick auf positive Signale untersucht. Bei einem Experiment wurden fünf potenziell positive Signale neu untersucht, stellten sich jedoch alle als negativ heraus.
Als Kontrolle für das Ret/AP-Protein wurde ein VCAM/AP-Protein durch Verbinden der ersten zwei Domänen des humanen VCAM mit dem N-Terminus des plazentalen AP hergestellt. (VCAM bindet sich an das gesamte VLA4, welches sich aus zwei Ketten, alpha-4 und beta-1, zusammensetzt). Vorübergehende Transfizierungen der COS-Zellen produzierten genügende VCAM/AP-Proteine für Kontrollexperimente. Das VCAM/AP-Protein wurde mit dem VCAM/IgG verglichen, das direkt an AP gekoppelt ist und mit VCAM/IgG mit einem an AP gekoppelten sekundären Antikörper, um dessen Fähigkeit, VLA4 auf COS-Zellen, die mit der cDNS der alpha-4-Ketten transfiziert wurden (COS-Zellen exprimieren schon die Beta-1-Ketten), zu untersuchen. Das Ergebnis zeigte, dass das VCAM/IgG-Protein in Kombination mit einem an AP gekoppelten sekundären Antikörper den höchsten Nachweis erzielt, während das VCAM/AP-Protein VLA4 auf transfizierten Zellen feststellt.
d. Methodische Schlussfolgerungen:
Drei hauptsächliche Schlussfolgerungen ergaben sich aus diesen anfänglichen Versuchen des Klonens:

1) Verfahren, bei denen es erforderlich ist, dass die Plasmid-DNS zum Zweck von weiteren Runden (d.h. Panning-Methode und präparative FACS) zurückgewonnen wird, sind aufgrund der Neuanordnungen und Deletionen, die im Laufe der nachfolgenden Runden auftreten, nicht brauchbar, wenn das Vorhandensein der angestrebten cDNS nur gering ist. Basierend auf der geringen Expression von Ret gibt es einen guten Grund, davon auszugehen, dass die Expression von RetL1 ebenso gering ist. Die bevorzugte Herangehensweise muss darin bestehen, die Transfizierung in Pools vorzunehmen und ein Feststellungsverfahren anzuwenden, durch das ein positiver Pool identifiziert werden kann. Der ursprüngliche Pool kann dann aufgeschlüsselt werden, ohne dass es nötig ist, die vorübergehend exprimierte DNS der transfizierten Zellen zurückzugewinnen.
2) Das Ret/IgG-Protein gewährleistet bei der Koppelung an eine zweite Reagenz eine bessere Feststellbarkeit als das Ret/AP-Protein.
3) Kontrollexperimente mit einem VCAM/IgG-Kontrollprotein (und mit einem an AP gekoppelten sekundären Antikörper) und der alpha-4 Integrin-cDNS (verdünnt in einem CDM8-Vektor und transfiziert in COS-Zellen) weisen darauf hin, dass unsere Feststellbarkeit bei nur eins zu tausend liegt (d.h. die Größe des Pools darf 1000 Klone nicht überschreiten). Um einen erhöhten Grad an Empfindlichkeit zu erhalten, wechselten wir von einem Vektor mit SV40-Origin (exprimiert in COS-Zellen) zu einem Vektor mit EBV-Origin (exprimiert in EBNA-positiven Zelllinien). Vektoren mit dem ursprünglichen EBV-Origin erhält man in Form von Episomen, wobei diese für die Zelle nicht so toxisch sind wie die Vektoren mit SV40-Origin nach der Erweiterung. Ein beachtlicher Hinweis liegt darin, dass Gene in diesen Vektoren bei einem höheren Grad exprimiert werden können und dass cDNS viel mehr verdünnt werden können (d.h. bis zu 1:80.000) und dabei immer noch feststellbar sind.

2. Screening der Pools aus der cDNS-Bank mit EBV-Origin
Wir haben Pools mit Klonen aus der cDNS-Bank mit 18 Tage alten embryonalen Nieren der Ratte (CH269-Vektor mit dem EBV-Origin) mit dem Ret/IgG-Fusionsprotein der Ratte durchsucht. Bei einem Experiment wurden 256 Pools mit jeweils 5000 Klonen aus der Bank erzeugt. Kurz gesagt wurde ein Aliquot der cDNS-Bank getitert und 5000 Zellen wurden platiert (256 Mal), so dass sie über Nacht wachsen konnten. Die Kolonien wurden in ein Medium eingebracht: Ein Teil der Kultur wurde dazu verwendet, um einen Glycerol-Vorrat für den Pool anzulegen (gelagert bei –70°C) und ein Teil wurde für eine Plasmid-Aufbereitung genutzt. DNS aus den 256 Pools wurden einzeln in 293/EBNA-Zellen (8 × 10⁵ auf einer 60mm Platte) unter Verwendung des Lipofektionsverfahrens transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen zweimal mit einem HBHA-Puffer gewaschen (0,5 mg/ml BSA, 0,1% NaN₃, 20mM HEPES (pH-Wert 7,0)) und mit 20 ug/ml Ret/IgG der Ratte in Tris-gepufferter Saline plus 1 mM MgCl₂ und CaCl₂ während 60 bis 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss an diese Inkubation wurden die Zellen viermal mit dem HBHA-Puffer gewaschen und dann mit 60%igem Azeton/3%igem Formaldehyd/20mM HEPES (pH-Wert 7,0)) 30 Sekunden lang fixiert. Nach zweimaligem Waschen mit dem HBS-Puffer (150mM NaCl, 20 mM HEPES (pH-Wert 7,0)) wurden die Zellen mit einem AP-gekoppelten sekundären Antikörper (Anti-humanes-IgG-Fc-Gamma-spezifisches F (ab')₂ der Ziege), (Jackson Immuno Research Laboratories; Katalog # 109-056-098; 1:5000 Verdünnung in Tris-gepufferter Saline plus 1 mM MgCl₂ und CaCl₂) 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit dem HBS-Puffer sowie zweimal mit dem AP-Substrat-Puffer gewaschen (100 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂), welcher 2 × den Pierce Immuno Pure^R Phosphatase Suppressor (Katalog # 35002) enthält. Das letzte Waschen dauerte 15 Minuten. Die AP-Substrate NBT (0,33 mg/mgl) und BCIP (0,17 mg/ml) wurden dann zum AP-Substrat-Puffer, der den Pierce AP-Hemmer enthielt, hinzugefügt und mit den Zellen 5 bis 20 Minuten lang inkubiert. Die Platten wurden nun zweimal mit Wasser gewaschen. Die Platten wurden dann unter einem Präpariermikroskop im Hinblick auf das Vorhandensein von lila angefärbten Zellen untersucht.
Bei einer Analyse von 256 Pools wurden 17 positive Pools in der ersten Untersuchung festgestellt. Die DNS aus jedem positiven Pool wurde erneut in 293/EBNA-Zellen übertragen und die oben genannten Verfahrensweisen wurden mit Hilfe einiger zusätzlicher Kontrollexperimente wiederholt, um sicherzustellen, dass die beobachtete Färbung Ret/IgG-spezifisch ist. Nun zeigten 10 der 17 positiven Pools zusammen mit dem Ret/IgG-Fusionsprotein eine Färbung, aber nicht mit einem anderen IgG-Fusionsprotein.
3. Aufschlüsselung des Pools #230
Als Exempel wurde einer der oben beschriebenen positiven Pools mit der Bezeichnung #230 in kleinere Subpools aufgegliedert, um die cDNS des Pools, die die Bindung an das Ret/IgG-Fusionsprotein gestattet, zu festzustellen. 600 Zellen aus dem Glycerol-Vorrat für Pool #230 wurden platiert (10 Mal) und über Nacht angezüchtet. Kolonien auf diesen Platten wurden in ein Medium eingebracht: Ein Zehntel der Kultur wurde verwendet, einen Glycerol-Vorrat anzulegen und der verbleibende Teil wurde für eine DNS-Aufbereitung verwendet. Die zehn Subpools der 600 Klone wurden mit 230-1A bis 230-5A und mit 230-1B bis 230-5B bezeichnet. Die DNS aus diesen Subpools wurde in 293/EBNA-Zellen transfiziert und das oben beschriebene Verfahren zur Anfärbung mit dem Ret/IgG-Fusionsprotein wurde wiederholt. Ein Subpool mit der Bezeichnung #230-5A war hinsichtlich der Färbung mit dem Ret/IgG-Protein positiv.
Pool #230-5A wurde ferner aufgeschlüsselt, um die cDNS dieses Subpools, die die Bindung an das Ret/IgG-Fusionsprotein ermöglicht, zu identifizieren. Zellen aus dem Glycerol-Vorrat des Pools 230-5A wurden platiert und über Nacht angezüchtet. Kolonien wurden in Behälter mit sieben 96-well Bioblocks^® übertragen und über Nacht angezüchtet. Aus jedem 96-well Bioblock wurden 4 Pools zu 20 Klonen und 1 Pool zu 16 Klonen hergestellt. Dementsprechend wurden 35 Pools aus den sieben Bioblocks^® unter der Bezeichnung 230-5A-71 bis 230-5A-105 erzeugt. Die DNS wurde aus jedem dieser Pools aufbereitet und in 293/EBNA-Zellen transfiziert und dann erneut mit dem Ret/IgG-Fusionsprotein wie oben beschrieben untersucht. Pool #230-5A-86 war positiv.
Pool #230-5A-86 wurde aufgeschlüsselt durch Rückgriff auf den Bioblock und die Identifizierung der 20 Klone, die zur Erzeugung dieses Pools vermischt worden waren. Aus all den zwanzig Klonen wurde DNS erzeugt und einzeln in 293/EBNA-Zellen transfiziert und erneut im Hinblick auf Ret/IgG, wie oben beschrieben, untersucht. Pool #230-5A-86-17 wurde als positiv befunden.
4. Kennzeichnung des Klons #230-5A-86-17
Der Klon #230-5A-86-17 (genannt retL-17 oder Klon 17 und hinterlegt als ATCC 98047) wurde ferner anhand der DNS-Sequenzierung analysiert. Die gesamte Nukleotidsequenz des Inserts dieses Klons ist SEQ ID NO. 1 (retL1-cDNS der Ratte), wovon ein Teil der Nukleotidsequenz in 1 gezeigt wird. Innerhalb dieser Nukleotidsequenz fanden wir einen Leserahmen, der ein Protein mit 468 Aminosäuren enkodiert (RetL1 der Ratte). Das vorhergesagte Protein hatte eine Signalsequenz mit einer vorhergesagten Spaltung nach der Aminosäure 24 (Von Heijne et al., Nucl. Acid Res. 14: 14683 (1986)). Der hydrophobe C-Terminus wies darauf hin, dass das Protein über eine Phosphatidylinositol-Glycan-Verbindung mit der Zelle verbunden war. Es ergaben sich drei vorhergesagte N-gekoppelte Glycosylationsstellen. Diese Eigenschaften stimmten mit denen, die man bei einem Liganden für Ret erwartete, überein.
Wir konnten lösliche Formen des RetL1-Proteins der Ratte durch Kürzen des Gens vor dem hydrophoben C-Terminus exprimieren. So konnte dies beispielsweise durchgeführt werden, indem man das Gen hinter Lysin 435 (RetL1 der Ratte) kürzte. Das Kürzen aufwärts, entlang dieser Aminosäure, sollte ebenso zu der Expression einer löslichen Form des RetL1-Proteins der Ratte führen. Das lösliche RetL1-Protein der Ratte konnte durch sich selbst oder als Teil einer Fusion mit dem humanen Immunoglobulin, als ein Histidin-Tag oder als ein kleines Epitop mit einem Antikörper exprimiert werden.
B. Klonen des Humanen Ret-Liganden RetL1
Eine cDNS-Bank mit der humanen embryonalen Niere im Vektor lambda gt10 wurde von Clontech (Katalog # HL5004A) erworben. Eine Millionen Plaques, die Einheiten aus dem Phagen-Vorrat bildeten, wurden auf 10 Nunc^TM-Platten platiert. Duplikate der Plaque Lifts wurden auf Schleicher und Schuell Optitran^TM -Filtern erzeugt.
Eine Probe wurde durch die Digestion des Plasmids RetL1 der Ratte mit dem Restriktionsenzym Pvul1 erzeugt, dann wurde eine Isolation mit Hilfe des Agarose-Gels mit einem Fragment von 1,34 kb durchgeführt, wobei das Fragment nt 242 bis 1582 der RetL-Nukleotidsequenz der Ratte (retL1-cDNS der Ratte) entsprach.
Diese Probe des Kodierungsbereiches wurde anhand des Random-Primings mit P³² markiert (Feinberg und Vogelstein, Anal. Biochem. 137: 266-267, 1984). Die Filter wurden über Nacht bei 55°C in 300 ml des Plaques-Screen-PSB-Puffers hybridisiert (50mM Tris, pH-Wert 7,5, 1M NaCl, 0,1% Sodium-Pyrophosphat, 0,2% PVP und 0,2% Ficoll), wobei dieser 10% Dextransulfat, 100 ug/ml tRNS und 6,7 × 10⁷ CPM der Probe der Ratte enthielt. Die Filter wurden zweimal mit dem Plaque-Screen-Puffer und zweimal mit 2 × SSC/1%SDS bei 55°C gewaschen und bei –70 °C mittels eines Intensivierungs-Screens belichtet.
Duplikat-Positive wurden aus den Master-Platten in SM (100 mM NaCl, 10 mM 50₄, 50mM Tris, pH-Wert 7,5) plus Gelatin entkernt. 24 dieser Positive sind plaquegereinigt. Lambda Miniprep-DNS aus den gereinigten Plaques wurde einer Digestion mit Not1 unterzogen und auf 1%igem Agarose-Gel elektrophoresziert sowie der Southernblot-Technik unterzogen. Die Southernblot-Hybridisierung fand in dem Bereich statt, der das RetL1 der Ratte enkodiert. Der Klon HRL20 hatte das längste Insert (4,4 kb), welches die Probe der Ratte besonders stark hybridisiert. Die DNS-Sequenz (partielle humane retL1-cDNS; SEQ ID NO. 8, 2A) und die daraus abgeleitete Peptidsequenz (partielles humanes RetL1; SEQ ID NO. 9; 2A) erhielt man aus diesem Klon, was bestätigte, dass dieser dem humanen Klon entsprach. Dieser Klon enkodierte die meisten Kodierungsbereiche, auch das 3'-Ende des Kodierungsbereiches.
Um das 5'-Ende der humanen cDNS zu erhalten, wurde eine humane Marathon-Ready^TM-cDNS der fötalen Niere über Clontech (Katalog # 7423-1) erworben. Das Antisense-Oligonukleotid Kid-155, das dem Komplementärstück der Nukleotide 62-81 der SEQ ID NO. 8 (partielle humane retL1-cDNS) entsprach und das Antisense-Oligonukleotid Kid-154, das dem Komplementärstück der Nukleotide 17-43 der SEQ ID NO. 8 (partielle humane retL1-cDNS) entsprach, wurden synthetisiert. Das PCR-Verfahren wurde unter Verwendung des Advantage^TM-cDNS PCR-Kits (Clontech Katalog # 8417-1) in Kombination mit den Marathon^TM-cDNS-Reagenzen und den Oligonukleotiden Kid-155 oder Kid-154 durchgeführt. Die erste PCR-Reaktion wurde folgendermaßen angelegt: 35,5 μl H₂O; 5,0 μl 10 × KlenTaq-Puffer: 1,0 μl 10mM dNTP-Mix; 1,0 μl 50 × Advantage^TM KlenTaq Polymerase Mix. Diese Reagenzen wurden kombiniert und vermischt. Dann wurden 5,0 μl der Marathon-Ready^TM fötalen Nieren-cDNS; 1,0 μl 10μM AP1 Primer und 1,5 μl 6,4μM Kid-155 hinzugefügt (Endvolumen = 50 μl). Das PCR-Verfahren wurde in einem Perkin-Elmer Cetus-DNS-Thermal-Cycler 480 unter den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: 1 Zyklus bei 94°C während einer Minute; 30 Zyklen bei 94°C während 30 Sekunden, bei 55°C 30 Sekunden, bei 68°C 4 Minuten. Eine nested-PCR wurde durchgeführt unter Verwendung des Produktes der ersten PCR-Reaktion. Zunächst wurden 5 μl des PCR-Produktes #1 50fach mit TE (Endvolumen 250 μl) verdünnt. Die Reaktion der nested-PCR enthielt 35,5 μl H₂O; 5.0 μl 10 × KlenTaq-Puffer; 1,0 μl 10mM dNTP Mix; 1,0 μl 50 × Advantage^TM KlenTaq-Polymerase Mix. Diese Reagenzen wurden wie oben beschrieben vermischt. 5,0 μl des verdünnten PCR-Produktes #1; 1,0 μl 10μM AP2-Primer und 1,5 μl 6,9μM Kid-154 wurden hinzugefügt. Die Zyklusbedingungen waren die gleichen wie oben beschrieben. Das entstandene Produkt von etwa 700 bp wurde auf einem 1 %igen low-melt Agarose-Gel gereinigt und mit Phenol extrahiert. Die gereinigte DNS wurde in die Site EcoRS von pZErO^TM geklont (Invitrogen Katalog # K2510-01). Die Informationen zur Sequenz erhielt man aus verschiedensten Isolaten, darunter auch die Klone mit der Bezeichnung HRL7G6 und HRL7G8.
Bei der aus dem Klon HRL7G8 erhaltenen Sequenz stellte man fest, dass sich diese mit der Sequenz des Klons HRL20 (partielle humane retL1-cDNS) überschneidet, weshalb sie dazu verwendet wurde, eine Gesamtlängensequenz des humanen RetL1 zu erzeugen (humane Gesamtlängen-retL1-cDNS), wie auch in 2B gezeigt. Die Nukleotidsequenz, die man aus dem Klon HRL7G8 erhalten hatte, stellte die Nukleotide 1 bis 502 der humanen Gesamtlängen-retL1-cDNS dar; die Nukleotidsequenz des Klons HRL20 stellte die Nukleotide 460 bis 1682 der humanen Gesamtlängen-retL1-cDNS dar. Die Sequenz aus Klon HRL7G8 wurde bestätigt durch Sequenzierung eines anderen cDNS-Klons (GJ102), der aus der cDNS-Bank der humanen embryonalen Niere lambda gt10 wie oben beschrieben isoliert wurde, wobei eine Probe verwendet wurde, die aus dem Klon HRL7G6 stammte. Die Nukleotide 118 bis 1497 umfassten den Leserahmen des Proteins der humanen Gesamtlängen-retL1-cDNS.
Die vollständige Aminosäurensequenz des humanen RetL1 wird auch in 2B gezeigt. Wie durch die BESTFIT-Analyse aufgezeigt, die in 3A ausgestellt wird, ist die humane retL1-cDNS zu 88,2% identisch mit der retL1-cDNS der Ratte. Der Vergleich der Peptide (3B) zeigt, dass die mutmaßliche humane Peptidsequenz zu 93,3% identisch und zu 97,2% der Sequenz der Ratte ähnlich ist.
Klonen des Ret-Liganden RetL2
A. Klonen des humanen RetL2
Die Peptidsequenz von RetL1 der Ratte (rat RetL1) wurde verwendet, um die GenBank-Datenbank mit dem BLAST-Programm zu durchsuchen, um verwandte Proteine zu identifizieren (d.h. Isologe). Das BLAST oder Basic Local Alignment Search Tool arbeitet mit dem Verfahren von Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990), das Ähnlichkeiten zwischen einer gesuchten Sequenz und allen Sequenzen in der Sequenz-Datenbank sucht. Die gesuchte Sequenz und die Datenbank, in der gesucht wird, können Peptide oder auch Nukleotide in jeder möglichen Kombination sein. Bei der Durchsuchung der RetL1-Peptidsequenz der Ratte in der Nukleotid-Datenbank in Bezug auf die exprimierten Sequenz-Tags (EST) erhielt man zwei signifikante Treffer. Einer mit der Genbank-Zugangsnummer # R02249, der ein 229 bp EST aus einer cDNS-Bank einer kombinierten humanen fötalen Leber und Milz ist und der andere mit der Genbank-Zugangsnummer # H12981, welcher ein 521 bp EST aus einer cDNS-Bank eines humanen kindlichen Gehirns ist. Die zwei ESTs zeigen eine 99%ige Übereinstimmung in einem Bereich der Überschneidung, was darauf hinweist, dass sie der gleichen cDNS entstammen. Oligonukleotide wurden aus H12981 erzeugt: KID-228 (GAA TGA CAA CTG CAA GAA GCT GCG CTC CTC; entsprechend den Nukleotiden 38-67 und ebenso den Nukleotiden 534-563 der SEQ ID NO: 12), sowie das Antisense-Oligonukleotid KID-229 (GTG TAC TCG CTG GGC ACC CG; entsprechend des Komplementärstückes der Nukleotide 156-175 sowie des Komplementärstückes der Nukleotide 652-671 der SEQ ID NO: 12).
1 × 10⁶ Plaque ausbildende Einheit einer cDNS-Bank von Clontech mit einer 5'-Stretch Plus lambda GT10 cDNS einer humanen fötalen Leber (Katalog # HL5003a) wurden in Duplikaten auf OPTITRAN^TM-Filtern gescreent. Die Filter wurden mit den ³²P-markierten Oligonukleotiden KID-228 und KID-229 in 400 ml Plaque Screen-Puffer über Nacht bei 65 °C hybridisiert (50mM Tris, pH-Wert 7,5, 1 M NaCl, 0,1 % Sodium Pyrophosphat, 0,2 % Polyvinylpyrolidin und 0,2 % Ficoll), wobei dieser 10 % Dextransulfat und 100 ug/ml tRNS sowie 80 pmole eines jeden ³²P-markierten Oligonukleotids enthielt. Die Filter wurden zweimal mit 2 × SSC/1% SDS und zweimal mit 1 × SSC/1% SDS gewaschen und dann belichtet. 11 Duplikat-Positive wurden gereinigt. Die DNS aus jeder dieser Klone wurde durch Digestion der Restriktionsenzyme analysiert und danach einer Elektrophorese mit Hilfe eines Agarose-Gels und des Southernblottings unterzogen. Die Filter wurden zu KID-228 und KID-229 hybridisiert, um zu bestätigen, dass die Inserts die Probe hybridisieren. Das Insert von Klon DSW240 wurde vollständig sequenziert (humane retL2-cDNS, SEQ ID NO: 12), wie in 7 aufgezeigt.
Die Nukleotide 25-1416 enthielten den Leserahmen des Proteins der humanen retL2-cDNS, welcher ein Protein mit 464 Aminosäuren enkodiert (humanes RetL2; SEQ ID NO: 13), und welches in 7 gezeigt wird. Wie durch die BESTFIT-Analyse aufgezeigt, die in 8 dargestellt wird, ist das humane RetL2-Protein in Bezug auf das humane RetL1-Protein zu 49,1% identisch und zu 63,7% ähnlich.
Es teilt sich mit dem humanen RetL1 einen hydrophoben N-Terminus, der auf eine Signalsequenz hinweist und einen hydrophoben C-Terminus, der auf ein Motiv der Phosphatidylinositol-Glycan-Verbindung hinweist. Zusätzlich werden 30 Cysteine der 31 vorhandenen Cysteine in jedem Protein konserviert.
B. Beweisführung, dass RetL2 ein Ligand für Ret ist
Wir konnten aufzeigen, dass RetL2 ein Ligand für Ret ist, indem wir 293/EBNA-Zellen mit einem Expressionsplasmiden transfizierten, welches das Insert von Klon DSW240 enthielt und konnten dadurch aufzeigen, dass die Zellen sich an ein lösliches Ret/IgG-Fusionsprotein binden können.
Das Insert von DSW240 wurde unter Verwendung von Not1 entfernt und in den Expressionsvektor CH269 geklont, der ein EBV-Origin enthielt und eine hohe Expression in EBNA-positiven Zelllinien gestattete. Die Restriktionsdigestionen wurden durchgeführt, um Klone zu identifizieren, die die richtige Orientierung aufwiesen. Die Plasmid-DNS wurde aus einem Klon mit der richtigen Orientierung aufbereitet.
Plasmid-DNS (das retL2-Expressionsplasmid, ein retL1-Expressionsplasmid für eine positive Kontrolle und ein Expressionsplasmid, dass ein nicht verwandtes Protein für eine negative Kontrolle enthielt) wurden in 293/EBNA-Zellen (8 × 10⁵ auf einer 60 mm Platte) unter Verwendung des Lipofektionsverfahrens transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen zweimal mit dem HBHA-Puffer gewaschen (0,5 mg/ml BSA, 0,1% NaN₃, 20 mM HEPES (pH-Wert 7,0)) und mit 20 ug/ml Ret/IgG in einer Tris-gepufferten Saline plus 1mM MgCl₂ und CaCl₂ 60 bis zu 90 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss an diese Inkubation wurden die Zellen viermal mit dem HBHA-Puffer gewaschen und dann mit 60% Azeton/3% Formaldehyd/20 mM HEPES (pH-Wert 7,0) 30 Sekunden lang fixiert. Im Anschluss an das zweimalige Waschen mit dem HBS-Puffer (150 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH-Wert 7,0)) wurden die Zellen mit einem AP- gekoppelten sekundären Antikörper (Anti-humanes IgG Fc-Gamma-spezifisches F (ab')₂ der Ziege), (Jackson Immuno Research Laboratories; Katalog # 109-056-098; 1:5000 Verdünnung in dreifach gepufferter Saline plus 1 mM MgCl₂ und CaCl₂) 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit dem HBS-Puffer und zweimal mit dem AP-Substrat-Puffer gewaschen (100 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂), welcher 2 × den Pierce Immuno Pure^® Phosphatase Hemmer enthielt (Katalog # 35002). Zuletzt wurden die Zellen 15 Minuten lang gewaschen. Die AP-Substrate NBT (0,33 mg/ml) und BCIP (0,17 mg/ml) wurden dann einem AP-Substrat-Puffer, der den Pierce AP-Hemmer enthielt, hinzugefügt und mit den Zellen 5 bis 20 Minuten lang inkubiert. Die Platten wurden dann zweimal mit Wasser gewaschen. Diese wurden schließlich unter einem Präpariermikroskop im Hinblick auf das Vorhandensein von lila angefärbten Zellen untersucht. Das Vorhandensein von lila angefärbten Zellen wies darauf hin, dass sich das Ret/-Fusionsprotein mit den Zellen verbunden hatte und dass das RetL2-Protein ein Ligand für Ret war. Lila angefärbte Zellen wurden auch im Anschluss an die Transfizierung mit dem retL1-Expressionsvektor beobachtet, jedoch nicht nach der Transfizierung mit dem negativen Kontrollvektor.
Klonen des Ret-Liganden RetL3
A. Murines RetL3
Eine Durchsuchung der EST-Datenbank mit der RetL1-Aminosäurensequenz der Ratte offenbarte zwei murine ESTs mit einer Übereinstimmung der Ret-Liganden. Diese ESTs waren AA049894 und AA050083 (welche die partielle murine retL3-cDNS, SEQ ID NO. 14 darstellen). Plasmide, die diese ESTs enkodieren, erhielt man über Genome Systems Inc. (Katalog # 475791 und # 475497) als Bakterienstämme. Die Plasmid-DNS wurde aus einzelnen Kolonien aufbereitet, die man durch einen Abstrich der Stämme auf LB-Amp-Platten erhielt. Die Inserts aus diesen Plasmiden wurden in ihrer Gesamtheit sequenziert. Ein Vergleich der zwei Sequenzen zeigte, dass AA049894, welches ein Insert von 1,4 kb aufweist, in AA050083 enthalten ist, welches wiederum ein Insert von 1,9 kb aufweist. Die Translation der DNS-Sequenz aus AA050083 wies darauf hin, dass ein kontinuierlicher offener Leserahmen von NT205 bis NT1242 vorhanden ist (partielles murines RetL3, SEQ ID NO. 15). Dieser offene Leserahmen stimmte zu 37,5% mit dem von retL1 der Ratte und zu 40,2% mit dem von retL2 der Ratte überein. Der offene Leserahmen enkodierte jedoch nicht ein Met oder eine Signalsequenz am 5'-Ende. Wir untersuchten die Weiterführung des offenen Leserahmens am 5'-Ende in diesem Bereich und fanden ein Met im Kontext einer Kozak-Konsens-Sequenz für die Initialisierung der Translation und eine potenzielle Signalsequenz für die Expression/Sekretion der Oberfläche. Dieser offene Leserahmen befand sich nicht in dem darauf folgenden Leserahmen und wies somit darauf hin, dass EST AA050083 an seinem 5' Ende eine mögliche Mutation umfasste, wie beispielsweise eine Insertion, Deletion, ein Intron oder Klonartefakt.
Um das richtige 5'-Ende zu erhalten, wendeten wir das Verfahren des Marathon RACE-Kit an. Eine 11 Tage alte cDNS eines Mausembryos von Marathon-Ready^TM (Katalog # 7458-1) und ein Advantage^TM-Kit (Katalog # 8417-1) wurden über Clontech erworben. Das Antisense-Oligonukleotid, Kid-366, das dem Komplementärstück der Nukleotide 847-866 der SEQ ID NO. 14 und Kid-365, was dem Komplementärstück der Nukleotide 589-615 der SEQ ID NO. 14 entsprach, wurden synthetisiert. Das PCR-Verfahren wurde unter Verwendung eines Advantage^TM-cDNS PCR-Kits (Clontech Katalog # 8417-1) in Kombination mit den Reagenzen der Marathon^TM-cDNS und dem Oligonukleotid Kid-366 durchgeführt. Die erste PCR-Reaktion wurde folgendermaßen angelegt: 35,3 μl H₂O; 5,0 μl 10 × KlenTaq-Puffer, 1,0 μl 10mM dNTP-Mix; 1,0 μl 50 × Advantage^TM KlenTaq Polymerase Mix. Diese Reagenzen wurden kombiniert und vermischt. Dann wurden 5,0 μl der 11 Tage alten cDNS des Mausembryos von Marathon Ready^TM; 1,0 μl 10μM AP1-Primer und 1,7 μl 5,88μl Kid-366 hinzugefügt (Endvolumen = 50 μl). Das PCR-Verfahren wurde in einem Perkin Elmer Cetus DNS Thermal Cycler 480 unter den folgenden Zyklusbedingungen ausgeführt: 1 Zyklus bei 94 °C 1 Minute lang; 5 Zyklen bei 94 °C 30 Sekunden lang; bei 72 °C 4 Minuten lang; 5 Zyklen bei 94 °C 30 Sekunden lang; bei 70 °C 4 Minuten lang; 25 Zyklen bei 94 °C 30 Sekunden lang; bei 68 °C 4 Minuten lang. Ein nested-PCR-Verfahren wurde unter Verwendung des Produktes der ersten PCR-Reaktion durchgeführt. Zunächst wurden 5 μl des PCR-Produktes #1 50fach mit TE (Endvolumen 250 μl) gelöst. Die nested-PCR-Reaktion enthielt 35,5 μl H₂O; 5,0 μl 10 × Klen Taq-Puffer; 1,0 μl 10mM dNTP-Mix; 1,0 μl 50 × Advantage^TM KlenTaq Polymerase Mix. Diese Reagenzen wurden wie oben beschrieben vermischt. 5,0 μl des verdünnten PCR-Produktes #1; 1,0 μl 10μM AP2-Primer und 3,6 μl 2,8μM Kid-365 wurden hinzugefügt. Die Zyklusbedingungen waren dieselben wie oben beschrieben. Das entstandene Produkt von etwa 665 bp wurde auf einem 1 %igen low-melt Agarose-Gel gereinigt und mit Hilfe von Qiaex II (Qiagen Katalog # 20021) extrahiert. Die gereinigte DNS wurde in pNoTA/T7^TM geklont, wobei das PRIME PCR CLONER^TM Klon-System verwendet wurde (5 Primer → 3 Primer Katalog # 1-725029). Die Sequenzinformationen erhielt man aus zahlreichen Isolaten, darunter auch die Klone mit der Bezeichnung DSW252 und DSW253.
Bei der Sequenz DSW252 stellte man fest, dass sich diese mit SEQ ID NO. 14 überschneidet, jedoch ein zusätzliches T zwischen NT252 und NT253 der SEQ ID NO. 14-Sequenz vorhanden war. Dieses T zeigte sich ebenso in den anderen Isolaten DSW251 und DSW253. Die Insertion dieser zusätzlichen Basis korrigierte den offenen Leserahmen, so dass ein einzelnes 1191 bp des offenen Leserahmens (gezählt vom ersten Met), welches 397 Aminosäuren enkodiert, erhalten wurde. Dieser Leserahmen enkodierte ein Met im Kontext der vorschriftsmäßigen Initialisierung der Translation der Konsens-Sequenz (Kozak) und umfasste eine Signalsequenz für die Expression/Sekretion der Oberfläche.
Um ein murines Gesamtlängen-Klon zu erhalten, das in der Lage ist, exprimiert zu werden, wurden ein 630 bp Not1-BamH1-Fragment von DSW252 und ein 1308 bp BamH1-Not1-Fragment von AA050083 gereinigt und an den Expressionsvektor CH269 von Not1, der zuvor einer Digestion unterzogen wurde, gehängt. Die Ligation wurde in E.Coli XL1-Blue (Strategene-Katalog # 200236) übertragen. Qiawell Ultra Minipreps wurden mit den entstandenen Transformationen durchgeführt. Diese wurden durch kontrollierte Digestion und mittels Gel-Elektrophorese analysiert, um eine korrekte Größe und Ausrichtung zu garantieren. Dieses Konstrukt wurde DSW254 genannt. Das Insert von DSW254 wurde in seiner Gesamtheit sequenziert (murines retL3; SEQ ID NO. 16) und es wurde bestätigt, dass der offene Leserahmen ein Protein der 397 Aminosäuren enkodierte (murines RetL3; SEQ ID NO. 17). Diese Sequenzen werden in 9 gezeigt. Der C-Terminus von Ret1L3 war hydrophob und wies auf ein Motiv einer Phosphatidylinositol-Glykan-Verbindung hin.
B. Humanes RetL3
Um eine mögliche Gewebequelle für das Klonen des humanen RetL3 zu finden, verwendeten wir Northern Blots aus Mäusegewebe, um die Expressionsstruktur von murinem RetL3 zu bestimmen. Von den beobachteten Geweben war die Expression von RetL3 im Herzgewebe die höchste. Eine cDNS-Bank des humanen erwachsenen Herzes im lambda gt10 Vektor wurde über Clontech (Katalog # HL3026a) erworben. Eine Million Plaque ausformende Einheiten aus dem Phagen-Vorrat wurden auf 10 Nunc-Platten platiert. Duplikate der Plaque-Lifts wurden auf Schleicher und Schuell Optitran^TM-Filtern erzeugt.
Eine Probe wurde durch das PCR-Verfahren mit den Primer Kid-366 und Kid-367, die den Nukleotiden 397-420 der AA050083-Sequenz entsprechen, erzeugt. Die PCR-Reaktion wurde folgendermaßen durchgeführt: 10 μl 10 × PFU-Puffer; 2,0 μl 10mM dNTP Mix; 72,1 μl H₂O; 3,1 μl 13,2 μM Kid-367; 6,8 μl 5,88 μM Kid-366; 5,0 μl 0,1 μg/μl AA050083 DNS und 2,0 μl 1,5 Einheiten/μl PFU (Strategene- Katalog # 600154) wurden vermischt. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt in einem Perkin Elmer Cetus DNS Thermal Cycler 480 unter den folgenden Bedingungen: 25 Zyklen bei 94 °C während einer Zeit von 1 Minute; bei 53 °C 1 Minute lang; bei 72 °C 4 Minuten. Das Produkt wurde durch die Extraktion mit Phenol, Chloroform, Isoamylalkohol in einem Verhältnis von 50:49:1 gereinigt und danach einer Elektrophorese mit einem low-melt Agarose-Gel und einer QiaexII-Reinigung des ausgeschnittenen Fragmentes unterzogen. Die Probe des Kodierungsbereiches wurde durch Random Priming mit P³² markiert (Feinberg und Vogelstein). Die Filter wurden über Nacht in 200 ml Plaque-Screen-Puffern mit 10% Dextransulphat, 100 ug/ml tRNS und 1,8 × 10⁸ CPM aus der Mausprobe bei 65 °C hybridisiert. Sie wurden zweimal mit dem Plaque-Screen-Puffer, zweimal mit 2 × SSC/1% SDS, zweimal mit 1 × SSC/1%SDS bei 65 °C gewaschen und bei 70 °C mittels eines Intensivierungsscreens belichtet. Duplikat-positive Plaques wurden gereinigt. Die Lambda-Miniprep-DNS aus den jeweiligen gereinigten Plaques wurde zusammen mit EcoR1 einer Digestion unterzogen und auf einem 1 %igen Agarose-Gel elektrophoresziert und dem Southernblotting unterzogen. Die Southern Blots wurden zusammen mit der Probe der Maus hybridisiert. Das Klon GJ128, das ein Insert von 1,3 kb aufwies, wurde intensiv mit der Probe des murinen Kodierungsbereichs hybridisiert. Die DNS-Sequenz (partielle humane retL3-cDNS; SEQ ID NO. 18) und die daraus gewonnene Peptidsequenz (partielles humanes RetL3; SEQ ID NO. 19) wurden aus diesem Klon gewonnen, wodurch bestätigt wurde, dass dieser mit dem humanen Klon übereinstimmte. Dieser Klon enkodiert die meisten der Kodierungsbereiche, darunter auch das 3'-Ende des Kodierungsbereiches.
Das Insert mit 1,3 kb aus GJ128 wurde gereinigt, mit P³² markiert und dazu verwendet, um die Clontech-Bank aus dem menschlichen Herz eines Erwachsenen im Hinblick auf die Erhaltung eines Klons mit einem 5'-Ende zu durchsuchen. In einer Untersuchung von 2 × 10⁶ Plaques aus dieser Bank erhielt man keine Klone mit dem 5'-Ende. Die Northern-Analyse der mRNS-Blots aus menschlichem erwachsenem Gewebe (Clontech Katalog # 7760-1, 7759-1 und 7767-1), die mit der gleichen Probe unter Anwendung der vom Hersteller gelieferten Bestimmungen hybridisiert wurde, wies darauf hin, dass das humane RetL3 im Rückenmark des menschlichen Erwachsenen exprimiert wird sowie im Magen, Herz, in der Bauchspeicheldrüse, dem Dünndarm, dem Dickdarm, der Prostata und dem Holden. Eine Clontech cDNS-Bank aus dem Rückenmark eines Erwachsenen (Katalog # 5001a) wurde mittels des GJ128-Inserts durchsucht. Drei unabhängige Klone wurden gereinigt und der längste Klon, GJ135, wurde sequenziert. Die Sequenz des Inserts von GJ135 überschnitt sich mit dem Insert GJ128, wodurch die Erzeugung einer zusammengesetzten Sequenz der humanen Gesamtlängen-retL3-cDNS (SEQ ID NO. 20) möglich wurde sowie die Bestimmung des humanen Gesamtlängen-RetL3 (SEQ ID NO. 21). Diese Sequenzen werden auch in 10 gezeigt. Das humane RetL3 stimmte zu 34,3% mit dem humanen RetL1 und zu 34,9% mit dem humanen RetL2 überein. Es zeigte eine 76,8%ige Übereinstimmung mit dem RetL3 der Maus.
THERAPEUTISCHE VERWENDUNG DER ZUSAMMENSETZUNGEN DER ERFINDUNG
Native und abweichende RetLs, Anti-RetL-Antikörper, Anti-Ret-Antikörper sowie Fusionsproteine von Ret und RetL sind in Situationen, in denen es wünschenswert ist, den Ret-Signalpfad zu blockieren oder zu aktivieren, sowie das Wachstum oder Überleben der Nieren- und/oder Nervenzellen zu stimulieren, bei Erkrankungen, bei denen diese Zellen verloren gegangen oder beschädigt wurden, oder wenn es darum geht, das Wachstum von unerwünschten Zellen zu stoppen oder diese zu töten, wie z.B. bei Tumorzellen, die Ret oder ein RetL exprimieren, von therapeutischem Nutzen.
Im Allgemeinen sind die Zusammensetzungen der Erfindung, die sich an Ret binden und die Dimerisierung und/oder Autophosphorylierung von Ret herbeiführen, für die Anregung des Wachstums oder zur Beschränkung von Schädigungen von Ret-exprimierenden Geweben hilfreich. Die Zusammensetzungen der Erfindung tragen zur Stimulation des Wachstums und/oder zum Überleben von Nierenzellen, zur Unterstützung der Nierenfunktion und zur Minimierung von Schäden am Nierengewebe im Anschluss an verschiedene Erkrankungen bei. Besondere Erkrankungen, bei denen die Behandlung durch die Zusammensetzungen der Erfindung von Vorteil ist, umfassen akutes Nierenversagen, akute Nierenentzündung, chronisches Nierenversagen, das nephrotische Syndrom, Defekte des Nierentubulus, Nierentransplantationen, Schäden durch Vergiftungen, Hypoxieverletzungen und Traumata. Defekte des Nierentubulus umfassen solche, die sowohl erblich bedingt als auch erworben sind, wie zum Beispiel die Polyzystische Nierenerkrankung, die Meduläre Zystenerkrankung und die Meduläre Schwammniere. Diese Liste ist nicht vollständig und kann viele weitere Nierenerkrankungen mit umfassen (siehe z.B. Harrisons's Principles of Internal Medicine, 13. Ausgabe, 1994).
Bei anderen Verwendungen können die Gene und Proteine der Erfindung dazu verwendet werden, um Krankheiten, bei denen das Nervenwachstum und die Nervenregeneration erwünscht sind, zu behandeln. Dies schließt alle Krankheiten mit neuralen Störungen wie Alzheimer, Parkinson, Huntington, Tourette, Amyotrophisch-laterale-Sklerose sowie auch die Motor-Neuron-Krankheit, demyelinisierende Krankheiten wie Multiple Sklerose, bakterielle Erkrankungen wie Meningitis, Abszesse oder Empyeme, virale Erkrankungen wie Myelopathie im Zusammenhang mit HIV, Prion-Erkrankungen, darunter auch die Creutzfeld-Jakob-Krankheit, ein. Ebenso darunter fallen Krankheiten, bei denen das Nervengewebe beschädigt wurde, egal, ob dies durch krebsartige Wucherungen, Traumata oder durch cerebrovaskuläre Vorkommnisse wie Blutungen oder Embolien verursacht wurde. Erkrankungen der Hirnnerven und des Rückenmarks, darunter Erkrankungen mit traumatischen, entzündlichen, angeborenen oder vaskulären Äthiologien sind insbesondere mit betroffen, da sie Erkrankungen sind, die das autonome Nervensystem beeinträchtigen. Ebenso mit eingeschlossen sind Erkrankungen der neuralen Entwicklung wie mentale Verzögerungen, Autismus, fötales Alkoholsyndrom, das Down-Syndrom und zerebrale Lähmung. Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch angewendet werden bei der Behandlung von Syndromen, worunter auch das periphäre Nervensystem fällt. Diese Krankheiten umfassen solche, die durch irgendeinen der zuvor aufgelisteten Faktoren ausgelöst werden, und insbesondere die Lyme-Krankheit, Neuropathien im Zusammenhang mit HIV, Polymyositis, Muskeldystrophie und Myasthenia Gravis.
Anti-RetL-Antikörper und Ret-Fusionsproteine der Erfindung, die sich insbesondere mit dem Protein des murinen oder humanen RetL3 verbinden oder mit Fragmenten dieses Proteins, sind bei zahlreichen Verfahren hilfreich. Die Bestandteile können therapeutisch zur Hemmung oder zur Blockierung der Ret-Rezeptorsignalübertragung verwendet werden, wie z.B. um das Wachstum von Tumoren zu stoppen, wobei das Wachstum von der Aktivierung der Ret-Signalübertragung abhängt. Diese Wirkstoffe können auch mit feststellbaren Markern verbunden werden, wie z.B. fluoroskopisch oder radiographisch undurchlässige Substanzen, und an ein Subjekt verabreicht werden, um Gewebe, das ein RetL exprimiert, sichtbar zu machen. Die Wirkstoffe können ebenso an Substanzen gebunden werden, wie z.B. an die Meerrettich-Peroxidase, welche als immunocytochemische Färbungen die Sichtbarmachung der Bereiche der RetL-positiven Zellen in histologischen Bereichen gestatten. Ein spezifischer Antikörper könnte allein auf diese Weise verwendet werden und Stellen, mit denen er verbunden ist, können in einem Sandwich-Assay unter Verwendung eines Anti-Immunoglobulin-Antikörpers, der selbst an einen feststellbaren Marker gebunden ist, visualisiert werden. Spezifische Antikörper für alle RetLs sind ebenso nützlich bei Immunoassays, um die Substanz, für die ein bestimmter Antikörper spezifisch ist, zu quantifizieren. Spezifische Antikörper eines RetL können ebenso an solide Trägerstoffe gebunden sein, z.B. an Kugeln oder Platten und dazu verwendet werden, um den Liganden aus einer Lösung zu entfernen oder zur Verwendung bei der Reinigung des Proteins oder der Entfernung des Proteins aus der Lösung. Jede dieser Techniken ist für Fachleute, die sich in der immunologischen Wissenschaft auskennen, Routine.
Andere Verfahren der Erfindung umfassen das Modulieren der Ret-RetL-Signalübertragung durch Verbinden des Ret mit einem monoklonalen Anti-Ret-Antikörper. Die Wirkung eines solchen mAb-Ret-Kontaktes kann entweder in der Blockierung oder in der Stimulierung des Ret-signalübertragenden Pfades liegen, je nach den Merkmalen des Zusammenwirkens eines jeden mAb mit Ret. Gewisse mAbs wirken mit Ret als Agonisten zusammen, wobei die agonistische mAb-Ret-Verbindung die Dimerisierung und Autophosphorylisierung von Ret auslöst. Andere mAbs agieren als Ret-Antagonisten. Dieses Zusammenspiel von Ret mit einem mAb-Antagonisten schützt vor der Aktivierung der Ret-Signalübertragung durch andere RetLs oder durch Komplexe, die RetLs umfassen, welche ansonsten den Ret-signalübertragenden Pfad aktivieren würden.
Ein RetL und/oder die Antikörper von Ret oder eines Ret-Fusionsproteins können verwendet werden, um die Sichtbarmachung von Gewebe, welches Ret exprimiert, zu ermöglichen oder im Zuge von immunohistologischen oder präparativen Verfahren, die zuvor schon für die Antikörper eines RetLs beschrieben wurden.
Fusionsproteine, die ein RetL und/oder Anti-Ret-Antikörper umfassen, können in speziellen medizinischen Therapien gegen Krebs und Tumore, die Ret exprimieren, eingesetzt werden. Solche Tumore umfassen die verschiedenen Phänotypen der Tumore, die mit den Mutationen im Ret im Zusammenhang stehen (N. Engl. J. Med. 335: 943-951, 1996; Nature 367: 319-320, 1996; Trends Gen. 12: 138-144, 1996). Therapeutische Interventionen gegen Neoplasien, die ein RetL exprimieren, arbeiten mit Fusionsproteinen, die ein Ret und/oder einen RetL-Antikörper einbinden. Der Anti-Ret-Antikörper oder Anti-RetL-Antikörper ist an sich schon wirksam durch die in Abhängigkeit vom Antikörper und vom Komplementär stattfindende Zystolyse, die durch die Fc-Domäne vermittelt wird. Solche Hybrid-Liganden und Antikörper können als Heilmittel gegen Krebs effizienter gestaltet werden, indem sie als Träger-Vehikel für antineoplastische Medikamente, Toxine und zytozidale Radionuklide wie Yttrium 90 verwendet werden. Zytotoxische Effektorzellen können unter Verwendung von heterokonjugierten Antikörpern gegen Tumorzellen eingesetzt werden, wobei ein spezifischer Antikörper sowohl für Ret als auch für ein RetL, das durch einen Tumor exprimiert wird, kovalent an einen Antikörper gebunden ist, der sich gegen ein Oberflächenprotein auf zytotoxischen Effektorzellen wie NK-Zellen oder CTLs richtet.
Ein Beispiel für einen Anti-Ret-Antikörper oder eine RetL-Therapie ist die Verbindung der toxischen A-Kette von Rizin oder einer modifizierten Gesamtlängen-Form von Rizin (welche keine Zellen mehr binden kann) an ein RetL oder an einen Antikörper, der gegen das Ret-Polypeptid, das auf der Oberfläche der bösartigen Zellen exprimiert wird, gerichtet wird. Bei anderen Ausführungsformen ist ein Toxin an Ret oder an einen Anti-RetL-Antikörper gebunden, um wahlweise RetL-positive Zellen wie einen Tumor, der ein RetL exprimiert, anzuzielen oder zu eliminieren. Solch eine Herangehensweise hat sich bei blockiertem Rizin, das an einen monoklonalen Antikörper gegen das CD19-Antigen, das auf den meisten neoplastischen Zellen exprimiert wird, gebunden ist, als erfolgreich erwiesen (Grossbard et al., Blood 79: 576, 1992). Andere Toxine sind im gleichen Sinne nützlich, darunter jene, die in der Fachwelt bekannt sind. Solche Toxine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Pseudomonas Exotoxin, Diphtherie Toxin und Saporin. Diese Herangehensweise müsste sich bei der Verwendung eines RetL oder Anti-Ret-Antikörpers im Gegensatz zur bekannten Herangehensweise mit dem Anti-CD19-Antigen als noch erfolgreicher erweisen, da Ret in einer sehr begrenzten Anzahl von Geweben exprimiert wird.
Die oben beschriebenen Ansätze, die Fusionen von Rizin oder anderen Toxinen nutzen, sind gleichwertig anwendbar auf toxische Verbindungen von RetL oder von einem Anti-Ret-Antikörper; diese sind nützlich beim selektiven Anzielen oder Eliminieren von Ret-positiven Zellen wie Tumorzellen, die Ret exprimieren.
Andere Herangehensweisen bei solchen medizinischen Therapien beruhen auf der Verwendung von RetL oder Anti-Ret-Antikörpern, die als Radioisotope markiert sind. Solche radiomarkierten Bestandteile leiten vorzugsweise die Radioaktivität auf Tumore in Zellen, die Ret exprimieren, wobei sie normales Gewebe schonen. Je nach verwendetem Radioisotop kann die Bestrahlung, die von einem radiomarkierten Antikörper, der an eine Tumorzelle gebunden ist, ausgeht, auch benachbarte bösartige Tumorzellen töten, die kein Ret exprimieren. Eine Vielzahl an Radionukliden kann verwendet werden. Isotope, die β-Partikel aussenden (zum Beispiel ¹³¹I) waren dann erfolgreich, wenn sie zusammen mit monoklonalen Antikörpern gegen CD20 auf B-Zellen-Lymphosomen verwendet wurden (Kaminski et al., N. Engl. J. Med. 329: 459 (1993); Press et al., N. Engl. J. Med. 329: 1219 (1993)). Radionuklide, die β-Partikel aussenden, erzeugen radioaktive Strahlen, die über Entfernungen von mehreren Zelldurchmessern tumorizidal sind, wodurch sie die Zerstörung der Antigen-negativen Zellen und die Verringerung der Folgen der nicht homogenen Ablagerung des Antikörpers oder der Liganden in Tumoren gestatten.
Radionuklide, die α-Partikel aussenden, können ebenso verwendet werden. Die Niedrigbestrahlung, die vom markierten Radionuklid RetL oder dem Anti-Ret-Antikörper ausgeht, ist therapeutisch effizienter als die unmittelbare Bestrahlung, die bei der konventionellen Strahlentherapie von außen ausgesendet wird. Niedrigbestrahlung kann eine Apoptose (einen programmierten Zelltod) in gewissen Zelllinien herbeiführen (Macklis et al., Radiat. Res. 130: 220 (1992); Maklis et al., Radiopharm. 5: 339 (1992)).
Die Zusammensetzungen der Erfindung werden in therapeutisch wirksamen Dosierungen verabreicht, was eine Menge eines Präparates bedeutet, die ein medizinisch wünschenswertes Ergebnis herbeiführt oder einen Einfluss auf die jeweilige zu behandelnde Krankheit hat.
Der Begriff „Subjekt", der hier verwendet wird, meint jedes Säugetier, an das Ret-Liganden oder -Gene verabreicht werden können. Subjekte, die insbesondere mit den Verfahren der Erfindung behandelt werden können, umfassen Menschen sowie auch nicht humane Primaten, Schafe, Pferde, Rinder, Ziegen, Schweine, Hunde, Katzen, Hasen, Meerschweinchen, Hamster, Rennmäuse, Ratten und Mäuse sowie auch die Organe, Tumore und Zellen, die von diesen Wirten abgeleitet werden oder diesen entstammen.
Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung in der Gentherapie Die RetL-Gene der Erfindung werden in beschädigtes Gewebe eingebracht, um die Produktion eines RetL durch die transfizierten Zellen zu stimulieren und um das Zellwachstum und/oder das Überleben der Zellen, die Ret exprimieren, zu fördern.
Bei einer spezifischen Ausführungsform einer Verwendung in der Gentherapie wird ein RetL-Gen in ein gewünschtes Nieren- oder Nervengewebe injiziert. Ein RetL wird dann stabil exprimiert und regt die Ret-Rezeptor-positiven Zellen an, zu wachsen, sich zu teilen, zu differenzieren und/oder potenziert das Zellüberleben.
Des Weiteren werden RetL-Gene in die angezielte Zelle unter Verwendung einer Vielzahl von allgemein bekannten Verfahren injiziert, wobei diese entweder auf virale oder nicht-virale Strategien beruhen.
Nicht-virale Verfahren umfassen die Elektroporation, die Membranfusion mit Liposomen, den Beschuss mit DNS-beschichteten Mikroprojektilen unter Hochgeschwindigkeit, die Inkubation mit Calcium-Phosphat-DNS-Präzipitat, die DEAE-Dextran-Transfizierung und die direkte Mikro-Injektion in einzelne Zellen. Zum Beispiel kann ein RetL-Gen in eine Zelle durch Calcium-Phosphat-Copräzipitation injiziert werden (Pillicer et al., Science, 209: 1414-1422 (1980); durch mechanische Mikroinjektion und/oder durch Partikelbeschleunigung (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5399-5403 (1980); durch einen DNS-Transfer auf Basis von Liposomen (z.B. LIPOFECTIN-Transfektion Fefgner et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 84: 471-477, 1987: Gao and Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm., 179: 280-285, 1991); durch DEAE-Dextran-Transfektion; Elektroporation (US-Patentschrift NO. 4,956,288); oder durch Polylysin-Verfahren, bei denen die DNS konjugiert wird, um diese vorzugsweise an das Hepatocyten der Leber abzugeben (Wolff et al., Science, 247: 465-468, 1980; Curiel et al., Human Gene Therapy 3: 147-154, 1992).
Die Zielzellen werden mit den Genen der Erfindung durch direkten Gentransfer transfiziert. Siehe dazu zum Beispiel Wolff et al., „Direct Gene Transfer Into Moose Muscle in Vivo", Science 247: 1465-1468, 1990. In vielen Fällen ist eine Transfektion über Vektoren wünschenswert. Alle Verfahren, die in der Fachwelt für die Injizierung von Polynukleotidsequenzen in einen Vektor bekannt sind, können angewendet werden. Siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY (1992).
Die Aktivierung von Promotoren sollte gewebespezifisch sein und durch ein metabolisches Produkt oder eine verabreichte Substanz ableitbar sein. Solche Promotoren/Verstärker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf den nativen RetL-Promotor, den Cytomegalovirus Immediate-Early-Promotor/-Verstärker (Karasuyama et al., J. Exp. Med., 169: 13 (1989); den humanen Beta-Actin-Promotor (Gunning et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84: 4831 (1987); den von Glucocorticoid ableitbaren Promotor, der in der langen DNS-Wiederholungseinheit des Virus des Brusttumors der Maus vorhanden ist (MMTV LTR) (Klessig et al., Mol. Cell. Bio., 4: 1354 (1984)); die langen DNS-Wiederholungseinheiten bei Mäusen, die mit dem Moloney Leukämie-Virus infiziert sind (MuLV LTR) (Weiss et al., RNS Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1985)); der frühen SV40 Promotor-Region (Bernoist and Chambon, Nature, 290: 304 (1981)); den Promotor des Rous Sarcoma Virus (RSV) (Yamamoto et al., Cell, 22: 787 (1980))); den Thymidin-Kinase-Promotor des Herpes Simplex Virus (HSV) (Wagner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78: 1441 (1981)); sowie den Adenovirus Promotor (Yamada et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 3567 (1985)).
Die RetL-Gene können ebenso durch spezifische virale Vektoren, die in Systemen des Gentransfers verwendet werden und die mittlerweile fest etabliert sind, eingebracht werden. Siehe zum Beispiel: Madzak et al., J. Gen. Virol., 73: 1533-1536, 1992 (Papovavirus SV40); Berkner et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 39-61, 1992 (Adenovirus); Hofmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 10099-10103, 1995 (Baculovirus); Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38, 1992 (Vaccinia Virus); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123, 1992 (Adeno-Virus); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 67-93, 1992 (Herpes Simplex Virus (HSV) und Epstein-Barr-Virus (HBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 1-24, 1992 (Retrovirus); Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol., 4: 749-754, 1984 (Retrovirus); Miller et al., Nature, 357: 455-450, 1992 (Retrovirus); Anderson, Science, 256: 808-813, 1992 (Retrovirus), Current Protocols in Molecular Biology: Abschnitte 9.10-9.14 (Ausubel et al., Eds.), Greene Publishing Associates, 1989.
Bevorzugte Vektoren sind DNS-Viren, die Adenoviren umfassen (vorzugsweise Vektoren basierend auf Ad-2 oder Ad-5), Baculoviren, Herpes Viren (vorzugsweise Vektoren, die auf dem Herpes Simplex beruhen) und Parvoviren (vorzugsweise "defekte" oder nicht-autonome Vektoren, die auf Parvoviren basieren, insbesondere Vektoren, die auf dem Adenovirus basieren und möglichst Vektoren, die auf AAV-2 basieren). Siehe zum Beispiel Ali et al., Gene Therany 1: 367-384, 1994; US-Patentschrift NO. 4,797,368 und 5,399,346 und die untenstehende Diskussion.
Die Auswahl des jeweiligen Vektorsystems für die Transfizierung beispielsweise einer RetL-Sequenz hängt von vielen Faktoren ab. Ein wichtiger Faktor ist die Beschaffenheit der angezielten Zellpopulation. Obwohl retrovirale Vektoren schon eingehend untersucht wurden und in einer Vielzahl von Verwendungen der Gentherapie eingesetzt wurden, sind sie im Allgemeinen nicht geeignet für die Infizierung von Zellen, die sich nicht teilen, sind jedoch nützlich bei der Krebstherapie, da sie bei der Replikation von Zellen nur ihre eigenen Gene integrieren und exprimieren. Bei Ex-Vivo-Ansätzen sind sie von Nutzen und in dieser Hinsicht aufgrund ihrer stabilen Integration in das Genom der Zielzelle attraktiv.
Adenoviren sind eukaryontische DNS-Viren, die modifiziert werden können, um wirksam ein therapeutisches oder ein Reporter-Transgen auf eine Vielzahl von Zelltypen zu übertragen. Die allgemeinen Adenoviren des Typ 2 und 5 (Ad2 bzw. Ad5), die bei Menschen Atemwegserkrankungen hervorrufen, werden derzeit für die Gentherapie der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) und der Cystischen Fibrose (CF) weiterentwickelt. Sowohl Ad2 als auch Ad5 gehören zu einer Untergruppe der Adenoviren, die nicht mit den humanen Malignomen im Zusammenhang stehen. Vektoren der Adenoviren sind in der Lage, einen extrem hohen Grad der Transgen-Abgabe an eigentlich alle Zelltypen bereitzustellen, unabhängig vom mitotischen Zustand. Hohe Titer (10¹³ Plaque ausbildende Einheiten/ml) des rekombinanten Virus können auf einfache Weise in 293 Zellen erzeugt werden (eine mit dem Adenovirus transformierte und komplementierte Zelllinie der embryonalen Niere des Menschen: ATCC CRL 1573) und mit Hilfe des Kryo-Systems während langer Zeitspannen ohne bemerkenswerte Verluste gelagert werden. Die Effizienz dieses Systems im Hinblick auf die Abgabe eines therapeutischen Transgens in vivo, das ein genetisches Ungleichgewicht komplementiert, wurde im Rahmen von Tierversuchen in Bezug auf zahlreiche Erkrankungen demonstriert. Siehe dazu Y. Watanabe, Atherosclerosis, 36: 261-268 (1986); K. Tanzawa et al., FEBS Letters, 118 (1): 81-84 (1980); J.L. Golasten et al., New Eng. J. Med., 309 (1983): 288-296 (1983); S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest., 92: 883-893 (1993); und S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest., 93: 1889-1893 (1994).
Tatsächlich wurden rekombinante und replikationsdefekte Adenoviren, die eine cDNS für den Transmembran-Regulator der cystischen Fibrose (CFTR) kodieren, für diesen Verwendungszweck in mindestens schon zwei humanen klinischen CF-Studien bestätigt. Siehe zum Beispiel J. Wilson, Nature, 365: 691-692 (21. Okt. 1993). Eine weitere Rückendeckung für die Sicherheit der rekombinanten Adenoviren für die Gentherapie liefert die weitreichende Erfahrung mit Lebendimpfstoffen mit Adenoviren bei Menschenpopulationen.
Humane Adenoviren setzen sich zusammen aus einem linearen, etwa 36 kb langen doppelsträngigen DNS-Genom, welches in 100 Map Units (m.u.) unterteilt ist, wobei jede Einheit eine Länge von 360 bp aufweist. Die DNS umfasst kurze eingefügte Wiederholungseinheiten (ITR) an jedem Ende des Genoms, welche für die virale DNS-Replikation erforderlich sind. Die Gen-Produkte sind in frühen (E1 durch E4) und späten (L1 durch L5) Regionen organisiert, welche auf der Expression vor oder nach der Initialisierung der viralen DNS-Synthese basieren. Siehe zum Beispiel Horwitz, Virology, 2. Ausgabe, ed. B.N. Fields, Raven Press Ltd., New York (1990).
Die rekombinanten, replikationsdefekten Adenoviren der ersten Generation, die für die Gentherapie von DMD und anderen vererbbaren Krankheiten entwickelt wurden, umfassen Deletionen der gesamten E1a und aus Teilen des E1b-Bereichs. Der replikationsdefekte Virus entwickelt sich in 293-Zellen, die ein funktionales E1a-Gen des Adenovirus enthalten, welches ein E1a-Protein, das die Abwicklung vornimmt, bereitstellt. E1-deletierte Viren sind in der Lage, infektiöse Viren in 293-Zellen zu replizieren und zu produzieren, was zu der Bereitstellung von in trans-Gen-Produkten der E1a- und E1b-Regionen führt. Der entstandene Virus ist in der Lage, viele Zelltypen zu infizieren sowie auch das injizierte Gen zu exprimieren (vorausgesetzt, es trägt seinen eigenen Promotor), kann sich jedoch nicht in einer Zelle replizieren, die keine DNS der E1-Region trägt, außer die Zelle wird mit einer sehr hohen Infektionsmultiplizität infiziert. Adenoviren haben den Vorteil, dass sie über eine große Bandbreite von Wirten verfügen und untätige oder begrenzt differenzierte Zellen wie Neuronen infizieren können und im Wesentlichen nicht onkogenisch sind. Adenoviren fügen sich nicht in das Genom der Wirtszelle ein. Da sie extrachromosomal präsent sind, wird das Risiko der Mutagenese durch die Insertion erheblich reduziert (Ali et al., supra, 373). Rekombinante Adenoviren (rAdV) produzieren sehr hohe Titer, die viralen Partikel sind mäßig stabil, der Grad der Expression ist hoch und eine Vielzahl von Zellen kann infiziert werden. Ihre natürlichen Wirtszellen sind das Epithel der Luftwege, so dass diese Viren bei der Therapie des Lungenkrebses von Nutzen sind.
Der Transfer über Baculoviren bietet viele Vorteile. Der Transfer von baculoviralen Genen kann sich in der Replikation oder Non-Replikation von Zellen äußern und kann in Nierenzellen sowie auch in Hepatocyten, Nervenzellen, in der Milz, der Haut und den Muskeln auftreten. In den Zellen von Säugetieren ist der Baculovirus nicht replizierend und nicht krankheitserregend. Beim Menschen gibt es keine vorhandenen Antikörper für den rekombinanten Baculovirus, welche die Infektion blockieren könnten. Zusätzlich ist der Baculovirus in der Lage, sehr lange DNS-Inserts aufzunehmen und umzuwandeln.
Adenoviren (AAV) wurden ebenso als Vektoren für die somatische Gentherapie eingesetzt. Der Adenovirus ist ein Virus mit einer kleinen, einzelsträngigen (ss) DNS mit einer einfachen genomischen Organisation (4,7 kb), so dass er ein ideales Substrat für die Gentechnik ist. Zwei offene Leserahmen kodieren eine Reihe von rep- und cap-Polypeptiden. Rep-Polypeptide (rep78, rep68, rep62 und rep40) spielen eine Rolle bei der Replikation, dem Rescue und der Integration des AAV-Genoms. Die cap-Proteine (VP1, VP2 und VP3) bilden die Hohlkugel des Virions. Angrenzend an die offenen Leserahmen von rep und cap am 5'- und 3'-Ende befinden sich 145 bp seitenverkehrte Wiederholungseinheiten (ITRs), wobei die ersten 125 bp in der Lage sind, Y- oder T-förmige Doppelstrukturen auszubilden. Bedeutsam für die Entwicklung der AAV-Vektoren ist die Tatsache, dass die gesamten rep- und cap-Domänen herausgeschnitten und mit einem therapeutischen oder Reporter-Transgen ersetzt werden können. Siehe B.J. Carter, im Handbuch der Parvoviren, ed., P. Tijsser, CRC Press, S. 155-168 (1990). Es wurde aufgezeigt, dass die ITRs die minimalen Sequenzen darstellen, die für die Replikation, Rescue, Verpackung und Integration des AAV-Genoms erforderlich sind.
Der AAV-Lebenszyklus ist biphasisch und setzt sich aus sowohl latenten und lytischen Abschnitten zusammen. Während einer latenten Infektion treten AAV-Virione in eine Zelle als eingekapselte ssDNS ein und werden kurz danach schon an den Zellkern weitergeleitet, wo die AAV DNS-stabil in ein Wirtschromosom eingebaut wird, ohne den ersichtlichen Bedarf einer Teilung der Wirtszelle. Bei der Abwesenheit eines Helfervirus bleibt das integrierte AAV-Genom latent, ist jedoch in der Lage, aktiviert und geborgen zu werden. Die lytische Phase des Lebenszyklus beginnt, wenn ein AAV-Provirus, der eine Zelle beherbergt, mit einer zweiten Infektion durch einen Herpesvirus oder einen Adenovirus gechallenged wird, wobei der Adenovirus Helferfunktionen enkodiert, die durch AAV erneuert werden, um bei seiner Ausschneidung aus dem Wirtschromatin zu helfen (B.J. Carter, supra). Die infizierende parentale ssDNS wird erweitert, um die Replikationsform (RF) der DNS in einer von rep abhängigen Weise zu duplizieren. Die wiedergewonnenen AAV-Genome werden in vorgeformte Proteinkapside gepackt (die ikosahedrale Symmetrie beträgt etwa 20nm im Durchmesser) und als infektiöse Virionen freigesetzt, die entweder + oder – ssDNS-Genome, denen später die Zelllyse folgt, verpackt haben.
Adenoviren (AAV) haben ein signifikantes Potenzial für die Gentherapie. Die viralen Partikel sind sehr stabil und rekombinante AAVs (rAAV) haben „medikamenten-ähnliche" Merkmale, da der rAAV durch Pelletieren oder durch CsCl „Gradient Banding" gereinigt werden kann. Die Viren sind hitzestabil und können zu einem Puder lyophilisiert und zum Zweck der vollen Aktivität rehydratisiert werden. Ihre DNS wird stabil in Wirtschromosome eingebaut, so dass die Expression langfristig ist. Ihre Bandbreite an Wirten ist groß und AAV verursacht keine bekannten Krankheiten, so dass die rekombinanten Vektoren nicht toxisch sind.
Nach der Einführung in eine Zielzelle können Sequenzen, die von Interesse sind, durch herkömmliche Verfahren wie die Nukleinsäure-Hybridisierung unter Verwendung von Proben, die die Sequenzen aufweisen, welche mit der eingefügten Gensequenz des Vektors übereinstimmen/dazu komplementär sind, identifiziert werden. Bei einer anderen Herangehensweise wird/werden die Sequenzen) durch das Vorhandensein oder die Abwesenheit von einem "Marker"-Gen (z.B. eine Thyrnidin-Kinase-Aktivität, Antibiotika-Resistenz und dergleichen), die auf die Injizierung des Expressionsvektors in die Zellziele zurückgehen, identifiziert werden.
Formeln und Darreichungsformen
Die Zusammensetzungen der Erfindung können auf jede medizinisch akzeptable Weise verabreicht werden. Dies umfasst Injektionen durch parenterale Routen wie z.B. intravenös, intravaskulär, intraarteriell, subkutan, intramuskulär, durch einen Tumor, durch das Bauchfell, intraventrikulär, intraepidural oder über andere Wege wie oral, nasal, über das Auge, rektal oder oberflächlich. Die Verabreichung über eine nachhaltige Freisetzung ist ebenso ein spezifisches Element der Erfindung durch Mittel wie Depotinjektionen oder erodierbare Implantate. Die lokale Abgabe wird insbesondere in Betracht gezogen durch Mittel wie die Abgabe über einen Katheter an eine oder mehrere Arterien wie die Nierenarterie oder ein Gefäß, das zu einem entdeckten Tumor führt.
Der Begriff „pharmazeutisch akzeptabler Träger" meint einen oder mehrere organische oder anorganische Bestandteile, die natürlich oder synthetisch sein können, und durch die das mutierende Protoonkogen oder das mutierende Onkoprotein kombiniert wird, um dessen Anwendbarkeit zu vereinfachen. Ein geeigneter Träger umfasst sterile Saline, sowie auch andere wasserhaltige und nicht wasserhaltigen isotonische und sterile Lösungen sowie sterile Suspensionen, die pharmazeutisch akzeptabel und den Fachleuten bekannt sind. In dieser Hinsicht umfasst der Begriff „Träger" Liposomen und das HIV-1 Tat-Protein (Siehe Chen et al., Anal. Biochem. 227: 168-175, 1995) sowie auch alle Plasmide und Vektoren mit viraler Expression. Eine "wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge, die in der Lage ist, den Fortschritt der Erkrankung, die Degeneration oder Schädigung zu beschleunigen oder zu verlangsamen. Eine wirksame Menge kann auf einer individuellen Grundlage gemessen werden und basiert zum Teil auf der Abwägung der zu behandelnden Symptome und der gewünschten Resultate. Eine wirksame Menge kann durch den Fachmann mittels der Verwendung solcher Faktoren und unter Verwendung von reinen Routineexperimenten bestimmt werden.
Das Liposomensystem kann aus jeder Art von unilamellaren Bläschen, multilamellaren Bläschen oder stabilen plurilamellaren Bläschen bestehen und wird gemäß der in der Fachwelt bekannten Verfahren aufbereitet und verabreicht, zum Beispiel gemäß der Lehre der US-Patentschriften 5,169,637; 4,762,915; 5,000,958 oder 5,185,154. Zusätzlich kann es wünschenswert sein, die neuartigen Polypeptide dieser Erfindung sowie auch andere ausgewählte Polypeptide, als Lipoproteine, zu exprimieren, um ihre Bindung an die Liposomen zu verbessern. Beispielsweise kann die Behandlung von akutem humanem Nierenversagen mit RetL, das in Liposomen eingekapselt ist, in vivo durch die Injizierung von RetL in Zellen durchgeführt werden, wenn eine solche Behandlung unter Verwendung von Liposomen notwendig ist. Die Liposomen können über einen Katheter in die Nierenarterie abgegeben werden. Das rekombinante RetL-Protein wird zum Beispiel aus den CHO-Zellen durch Immunoaffinitäts-Chromatographie oder andere geeignete Verfahren gereinigt und dann mit Liposomen gemischt und mit einer hohen Effizienz in diese eingebaut. Das eingekapselte Protein kann in vitro getestet werden, um die Stimulierung des Zellwachstums zu prüfen.
Diese Erfindung zieht ebenso in Erwägung, dass das neuartige Polypeptid dieser Erfindung über ein Liposomen-Abgabesystem an ein Tier verabreicht werden kann, um dessen Stabilität und/oder Immunogenizität zu erhöhen. Die Verabreichung der neuartigen Polypeptide über Liposomen ist insbesondere vorteilhaft, da die Liposomen durch phagozytische Zellen im behandelten Tier aufgenommen werden. Solche Zellen nehmen die liposomale Membran auf und geben dann die Polypeptide zusammen mit anderen Molekülen an das Immunsystem weiter, wobei die Moleküle erforderlich sind, um eine dauerhafte Immunreaktion auszulösen.
Jedes der neuartigen RetL-Polypeptide dieser Erfindung kann in Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes verwendet werden. Geeignete Säuren und Basen, die in der Lage sind, Salze mit den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung auszubilden, sind in der Fachwelt gut bekannt und umfassen anorganische und organische Säuren und Basen.
SEQUENZLISTE

Claims

Eine isolierte Nukleinsäure, welche ein Polypeptid enkodiert, das mindestens 80% Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz hat, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 21 ausgewählt ist, wobei besagtes Polypeptid mit einem Ret Rezeptorprotein interagiert, um die Dimerisierung des Ret Rezeptorproteins oder die Autophosphorylierung einer Tyrosinkinase Domäne des Ret Rezeptorproteins auszulösen.
Die Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz des enkodierten Polypeptids in einem Alignment mit SEQ ID NO: 17 oder SEQ ID NO: 21 mindestens 80% der Cysteine beibehält.
Die Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei das enkodierte Polypeptid mindestens 90% Sequenzidentität zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 21 hat.
Die Nukleinsäure gemäß Anspruch 3, wobei das enkodierte Polypeptid SEQ ID NO: 17 oder SEQ ID NO: 21 ist.
Eine isolierte Nukleinsäure unfassend eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 20.
Ein Vektor umfassend einen Insert umfassend die Nukleinsäure gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1-5.
Eine Wirtszelle umfassend den Vektor gemäß Anspruch 6.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend die Schritte der: Kultivierung der Wirtszelle gemäß Anspruch 7; und Gewinnung des Polypeptids, das von dem Insert innerhalb besagter Wirtszelle exprimiert wird.
Ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäure gemäß einer beliebigen der Ansprüche 1-5 enkodiert wird.
Ein isolierter monoklonaler Antikörper, welcher ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 21 bindet.
Der Antikörper gemäß Anspruch 10, wobei der Antikörper an das Polypeptid von SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 bindet.
Eine Zusammensetzung umfassend: (a) einen Antikörper gemäß Anspruch 10 oder 11, verbunden mit (b) einem Toxin, einer bildgebenden Verbindung oder einem Radionuklid.
Ein Fusionsprotein umfassend ein Polypeptid gemäß Anspruch 9 fusioniert mit einem Immunoglobulin, einem Toxin, einer bildgebenden Verbindung oder einem Radionuklid.
Die Nukleinsäure gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1-5, das Polypeptid gemäß Anspruch 9, der Vektor gemäß Anspruch 6, der Antikörper gemäß Anspruch 10 oder 11, die Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 oder das Fusionsprotein gemäß Anspruch 13 zur Verwendung in der Therapie oder in der Diagnose.