CN104619841A - Cep55基因与ret基因的融合基因 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种鉴定可成为预测对癌利用药剂的治疗的有效性的指标的基因、将该基因作为靶点预测利用药剂的治疗的有效性的新型的方法，通过弥漫型胃癌的转录组测序，鉴定CEP55基因和RET基因的符合读框的融合转录产物。另外，也发现该基因融合导致RET蛋白质的激活，使细胞癌化。还证实了利用RET酪氨酸激酶抑制剂能够抑制上述基因融合导致的RET蛋白质的激活及癌化，发现了对于检测出所述基因融合的患者，利用RET酪氨酸激酶抑制剂的治疗是有效的。

Description

CEP55基因与RET基因的融合基因
技术领域
本发明涉及一种CEP55基因与RET基因的融合基因，更详细而言，涉及一种编码CEP55蛋白质或其一部分与RET蛋白质或其一部分的融合多肽的多核苷酸、该多核苷酸编码的多肽、及检测该多核苷酸或该多肽的方法。另外，本发明涉及一种判定以该多核苷酸或该多肽为靶点的利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性的方法。另外，本发明涉及一种利用了该有效性的判定的癌的治疗方法。并且，本发明也涉及一种用于这些方法的药剂。
背景技术
胃癌是世界死亡第二多的癌症，在东亚是有大量患者的癌症之一。随着以内窥镜为主的早期诊断技术的进步，尤其是在日本，其预后得以改善，但晚期癌和再发病例的治疗依然困难，在包括欧美的许多国家中，5年生存率为30％以下。
胃癌在病理组织学上大致分类为肠型(intestinal-type)和弥漫型(diffuse-type)这两种(Lauren分类)。后者年轻人居多，容易引起腹膜转移或淋巴节转移，为预后不良的癌。另外，作为胃癌的治疗法，基本上采用外科手术，但容易发生腹膜转移或向其它脏器等的转移，对于再发率高的弥漫型胃癌，难以通过外科手术应对。另外，对于包括弥漫型的胃癌，现状是仍没有开发出有效的抗癌剂，对于胃癌、特别是弥漫型胃癌，仍没有确立有效的治疗法。
另外，报道了在胃癌中有EGFR、FGFR2、MET、ERBB2、MYC基因的扩增、KRAS、TP53、CDH1基因的突变等。而且，以EGFR、FGFR2、ERBB2等为对象，目前一直在进行对胃癌的各种分子靶点治疗的研究。这样，在包括胃癌的癌中，鉴定参与它们的发生的突变基因(突变蛋白质)、融合基因(融合蛋白质)等癌基因，大大有助于以这些基因为靶点的新型的癌治疗方法、癌检查方法的开发，因此被强烈期望。
另外，关于其它癌，报道了在家族性及偶发性的甲状腺癌、一部分大肠癌、褐色细胞瘤中发生了RET基因的活性型突变。另外，还已知RET基因为多发性内分泌肿瘤综合征(MEN2A、MEN2B)的致病基因(非专利文献1)。另外，作为甲状腺癌中特征性的基因组异常，报道了PTC-RET融合基因(非专利文献2)，最近，在肺癌中也确认其存在(非专利文献3)。而且，作为肺腺癌中的基因组异常，也已知KIF5B-RET融合基因的存在(非专利文献3～5)。
另外，在针对RET的低分子抑制剂中，已知有vandatinib、motesanib、sorafenib、sunitinib、XL-184之类的低分子抑制剂，目前，关于这几种低分子抑制剂，进行了作为抗癌剂的临床开发研究。
另外，为了预测这些抑制剂对于癌的治疗效果，研究了将上述的突变基因或融合基因用作指标。例如，已知以EGFR或ALK蛋白质为靶点的酪氨酸激酶抑制剂对具有EGFR突变或ALK融合的肺腺癌的治疗特别有效。另外，开发了检测肺癌的4～5％中存在的ALK酪氨酸激酶基因的融合的方法作为对于ALK蛋白质的酪氨酸激酶的抑制药适应例的筛选法，进行了临床试验。
另一方面，已知CEP55基因为微管结合分子，在细胞分裂中发挥重要的作用(非专利文献6)。另外，推测该蛋白质具有包括N末端的多个卷曲螺旋(coiled coil)区域，可以形成二聚体。并且，CEP55蛋白质在癌细胞中广泛地高表达，另一方面，在正常组织中表达低，仅在精巢中高表达。这样，CEP55蛋白质作为所谓的癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen)已知，作为癌疫苗疗法的靶点被研究(非专利文献7)。
但是，现状是，包括胃癌的癌中的融合基因等的阐明还不能说是充分的，期望大大有助于新型的癌治疗方法或癌检查方法的开发，进而，可成为预测利用药剂的治疗的有效性的指标的融合基因等的鉴定。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Kouvaraki MA.等，Thyroid。2005年，15卷，531～544页
非专利文献2：Nikiforov YE.等，Nat Rev Endocrinol.，2011年，7卷，569～580页
非专利文献3：Takeuchi K.等，Nat Med.，2012年，18卷，378～381页
非专利文献4：Kohno T.等，Nat Med.，2012年，18卷，375～377页
非专利文献5：Lipson D.等，Nat Med.，2012年，18卷，382～384页
非专利文献6：Zhao WM.等，Mol Biol Cell.，2006年，17卷，3881～3896页
非专利文献7：Inoda S.等，J Immunother.，2009年，32卷，474～485页
发明内容
发明所要解决的课题
本发明是鉴于上述现有技术具有的课题而作出的，其目的在于，鉴定可成为预测对胃癌等利用药剂的治疗的有效性的指标的基因。另外，在于提供一种以该基因或其表达产物为靶点来预测利用药剂的治疗的有效性的新型的方法。另外，本发明的目的在于提供基于以该基因或其表达产物为靶点的利用药剂的治疗的有效性的预测来治疗胃癌等的方法。本发明的进一步目的在于，提供一种在这些方法中用于该基因或其表达产物的检测的药剂。
用于解决课题的方法
本发明的发明人为了实现上述目的，重复进行了深入研究，结果，通过13个病例的弥漫型胃癌的转录组测序，鉴定了CEP55基因与RET基因的符合读框的(In-flame)融合转录产物。因此，可以认为CEP55基因与RET基因的融合基因(CEP55-RET融合基因)是通过人第10号染色体间的相互转座或人第10号染色体内的切断及再结合而产生的。实际上，确认了基因组融合部位的碱基序列，结果发现了通过人第10号染色体内的切断及再结合而产生的融合例。
因此，将CEP55-RET融合基因导入于正常细胞中，结果确认了该细胞获得非贴壁依赖性的克隆形成能力，即癌化。另外，在这样的细胞中，确认了RET蛋白质激酶的激活，还可知作为其下游信号的AKT等的磷酸化也亢进。
另外，将表达有CEP55-RET融合基因的细胞移植到裸体小鼠的皮下，结果确认了该细胞具有体内(in vivo)的成癌能力。
另一方面，还确认了所述的RET蛋白质激酶的激活、AKT等的磷酸化、非贴壁依赖性的克隆形成能力、体内的成癌能力通过RET酪氨酸激酶抑制剂，或通过CEP55-RET融合多肽的激酶结构域的非活性化而显著地得到抑制。
基于以上几点，本发明的发明人发现，在弥漫型胃癌等中，能够以该基因融合为靶点预测利用药剂的治疗的有效性，并且，如果对在该预测中判定为利用药剂的治疗为有效的患者投与该药剂，则能够进行高效的治疗，从而完成了本发明。
因此，本发明涉及一种编码CEP55蛋白质或其一部分与RET蛋白质或其一部分的融合多肽的多核苷酸、由该多核苷酸编码的多肽、该多核苷酸或多肽的检测方法、以该多核苷酸或该多肽的存在为指标的判定利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性的方法、利用了该有效性的判定的癌的治疗方法、以及用于这些方法的药剂，更详细而言，提供以下的发明。
[1]一种多核苷酸，其编码CEP55蛋白质或其一部分与RET蛋白质或其一部分融合的多肽。
[2]一种由[1]所述的多核苷酸编码的多肽。
[3]一种检测试样中的[1]所述的多核苷酸或[2]所述的多肽的存在或不存在的方法，其中，包括：
(a)使用于特异性地检测试样中的该多核苷酸或该多肽的存在或不存在的药剂与试样接触的工序，和
(b)检测该多核苷酸或该多肽的存在或不存在的工序。
[4]一种用于通过[3]所述的方法检测试样中的[1]所述的多核苷酸或[2]所述的多肽的存在或不存在的药剂，其中，包含具有至少15个碱基的链长的下述(a)～(c)中任一项所述的多核苷酸、或下述(d)所述的抗体，
(a)作为选自与编码CEP55蛋白质的多核苷酸杂交的探针及与编码RET蛋白质的多核苷酸杂交的探针中的至少一个探针的多核苷酸，
(b)作为与编码CEP55蛋白质的多核苷酸和编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点杂交的探针的多核苷酸，
(c)作为以夹有编码CEP55蛋白质的多核苷酸与编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点的方式设计的一对引物的多核苷酸，
(d)与CEP55蛋白质与RET蛋白质融合得到的多肽结合的抗体。
[5]一种判定利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性的方法，其中，包括检测从患者分离的试样中的[1]所述的多核苷酸或[2]所述的多肽的存在或不存在的工序，如果检测出上述多核苷酸或上述多肽的存在，则判定为上述患者的上述利用RET抑制剂的癌治疗的有效性高。
[6]一种用于通过[5]所述的方法判定利用RET抑制剂的癌治疗的有效性的药剂，其中，包含具有至少15个碱基的链长的下述(a)～(c)中任一项所述的多核苷酸、或下述(d)所述的抗体，
(a)作为选自与编码CEP55蛋白质的多核苷酸杂交的探针及与编码RET蛋白质的多核苷酸杂交的探针中的至少一个探针的多核苷酸，
(b)作为与编码CEP55蛋白质的多核苷酸和编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点杂交的探针的多核苷酸，
(c)作为以夹有编码CEP55蛋白质的多核苷酸与编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点的方式设计的一对引物的多核苷酸，
(d)与CEP55蛋白质与RET蛋白质融合得到的多肽结合的抗体。
[7]一种治疗癌的方法，其中，包括对通过[5]所述的方法判定为利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性高的患者投与上述RET酪氨酸激酶抑制剂的工序。
[8]一种以RET酪氨酸激酶抑制剂为有效成分的癌的治疗剂，对通过[5]所述的方法判定为利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性高的患者进行给药。
发明的效果
根据本发明，能够高效地检测CEP55基因与RET基因的融合基因或其表达产物。另外，根据本发明，通过该融合基因或其表达产物的检测，能够预测对于癌的治疗的有效性，特别是能够预测利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性。而且，由此能够避免对认为是投与药剂无效的癌患者的药剂的给药，因此，能够实现高效的癌治疗。
附图说明
图1是表示CEP55基因与RET基因的融合方式的概略图。图中左侧表示通过人第10号染色体间的相互转座而产生的CEP55基因与RET基因的融合例，图中右侧表示通过人第10号染色体内的切断及再结合而产生的融合例。
图2是表示CEP55蛋白质与RET蛋白质的融合的概略图。即，是表示CEP55蛋白质的N末端部分与含有RET蛋白质的酪氨酸激酶结构域的C末端部分融合的概略图。另外，是表示对CEP55基因的外显子2和RET基因的外显子14能够通过利用杂交的RT-PCR用的引物检测出编码CEP55蛋白质与RET蛋白质的融合多肽的多核苷酸的概略图。
图3是表示利用ISH法检测本发明的融合基因的方法的概略图。即，是表示对于CEP55-RET融合基因，能够通过在CEP55基因5′侧及RET基因的3′侧分别设计ISH用探针，检测通过人第10号染色体间的相互转座而产生的CEP55-RET融合基因的存在的概略图。图中，黑圆表示在CEP55基因5′侧杂交的探针，白圆表示在RET基因的3′侧杂交的探针(关于探针的表述，在图4中也相同)。
图4是表示利用ISH法检测本发明的融合基因的方法的概略图。即，是表示对于CEP55-RET融合基因，能够通过在CEP55基因5′侧及RET基因的3′侧分别设计ISH用探针，检测通过人第10号染色体内的切断及再结合而产生的CEP55-RET融合基因的存在的概略图。
图5是表示将稳定地表达野生型或突变型的RET融合多肽的小鼠正常成纤维细胞株播种于软琼脂培养基上，在显微镜下观察这些细胞株的非贴壁依赖性克隆形成的结果的照片。图中，“CEP55-RET”表示表达野生型的CEP55-RET融合多肽的细胞株的结果，“CEP55-RET-KD”表示表达突变型的CEP55-RET融合多肽的细胞株的结果，“KIF5B-RET”表示表达野生型的KIF5B-RET融合多肽的细胞株的结果，“KIF5B-RET-KD”表示表达突变型的KIF5B-RET融合多肽的细胞株的结果。另外，各棒表示100μm。
图6是表示将稳定地表达野生型的RET融合多肽的小鼠正常成纤维细胞株播种于添加有RET酪氨酸激酶抑制剂(Vandetanib或XL184)的软琼脂培养基上，分析这些细胞株的非贴壁依赖性克隆形成能力的结果的坐标图。图中，“CEP55-RET”表示表达野生型的CEP55-RET融合多肽的细胞株的结果，“KIF5B-RET”表示表达野生型的KIF5B-RET融合多肽的细胞株的结果。“VD”表示Vandetanib存在下(培养基中的Vandetanib的浓度：0.2μM)中的克隆形成的结果，“XL”表示XL184存在下(培养基中的XL184的浓度：0.2μM)中的克隆形成的结果，“无添加”表示不存在RET酪氨酸激酶抑制剂时的克隆形成的结果。另外，纵轴表示不存在RET酪氨酸激酶抑制剂时将表达野生型的各RET融合多肽的细胞株形成的克隆的数设为100时的相对值。
图7是表示对稳定地表达RET融合多肽的小鼠正常成纤维细胞株分别实施血清饥饿处理后，在RET酪氨酸激酶抑制剂(Vandetanib或XL184)的存在下进行培养，利用Western Blotting法分析这些细胞中的各种蛋白质的磷酸化的结果的照片。图中，“CEP55-RET”表示表达CEP55-RET融合多肽的细胞株的结果，“KIF5B-RET”表示表达KIF5B-RET融合多肽的细胞株的结果。标记有“W”的列表示不存在RET酪氨酸激酶抑制剂时的野生型RET融合多肽表达细胞株的培养的结果，标记有“V”的列表示Vandetanib存在下(培养基中的Vandetanib的浓度：1μM)的野生型RET融合多肽表达细胞株的培养的结果，标记有“X”的列表示XL184存在下(培养基中的XL184的浓度：1μM)的野生型RET融合多肽表达细胞株的培养的结果，标记有“KD”的列表示不存在RET酪氨酸激酶抑制剂时的突变型RET融合多肽表达细胞株的培养的结果。另外，各融合多肽中，FLAG标记进一步结合，在细胞内进行表达，因此，图中“FLAG tag”表示通过该标记检测各融合多肽的结果。“p-RET(Y1062)”表示检测磷酸化的RET的结果。“STAT3”及“p-STAT3(Y705)”分别表示检测STAT3及磷酸化STAT3的结果。“AKT”及“p-AKT(S473)”分别表示检测AKT及磷酸化AKT的结果。“MAPK”及“p-MAPK(T202/Y204)”分别表示检测MAPK及磷酸化MAPK的结果。“β-actin”作为内部标准，表示各列中的蛋白质量一致。
图8是表示将表达有RET融合多肽的小鼠正常成纤维细胞株移植到免疫缺陷小鼠的皮下的结果的照片。图中，“CEP55-RET”是将表达有野生型的CEP55-RET融合多肽的细胞株移植到免疫缺陷小鼠的皮下，观察其18天后的该小鼠的照片。“KIF5B-RET”是将表达有野生型的KIF5B-RET融合多肽的细胞株移植到免疫缺陷小鼠的皮下，观察其18天后的该小鼠的照片。三角表示所形成的肿瘤，“8/8”表示将该细胞移植到4只小鼠各2处，总计8处，在该8处全部中看到肿瘤的形成。“CEP55-RET-KD”是将表达有突变型的CEP55-RET融合多肽的细胞株移植到免疫缺陷小鼠的皮下，观察其18天后的该小鼠的照片。“0/6”表示将该细胞移植到3只小鼠各2处，总计6处，在该6处全部中没有看到肿瘤的形成。
具体实施方式
＜编码CEP55蛋白质与RET蛋白质的融合多肽的多核苷酸、由该多核苷酸编码的多肽＞
如后述的实施例中所示，CEP55基因与RET基因的融合例在本发明中首次发现。因此，本发明提供一种编码CEP55蛋白质或其一部分与RET蛋白质或其一部分的融合多肽(以下，也称为“CEP55-RET融合多肽”)的多核苷酸(以下，也称为“CEP55-RET融合多核苷酸”)。
本发明的“CEP55-RET融合多肽”是指CEP55蛋白质的全长或其一部分与RET蛋白质的全长或其一部分融合的多肽。另外，本发明的“CEP55-RET融合多核苷酸”是指编码CEP55蛋白质的全长或其一部分的多核苷酸与编码RET蛋白质的全长或其一部分的多核苷酸融合的多核苷酸。
本发明中这样的“CEP55蛋白质(中心体蛋白质55KDa)”为人体内位于10号染色体长臂部(10q23.3)的基因所编码的蛋白质。在本发明中，“CEP55蛋白质”只要是来自人的蛋白质即可，典型而言，可以列举由序列号：2所述的氨基酸序列构成的蛋白质。另外，编码该蛋白质的多核苷酸，典型而言，为由序列号：1所述的碱基序列构成的多核苷酸。
本发明中这样的“RET(转染中的重排列，REARRANGED DURINGTRANSFECTION)蛋白质”也称为RET酪氨酸激酶蛋白质或RET受体型酪氨酸激酶蛋白质，为在人体内位于10q11.2的基因所编码的蛋白质。在本发明中，“RET蛋白质”只要是来自人的蛋白质即可，典型而言，可以列举由序列号：4所述的氨基酸序列构成的蛋白质(RET51、RET亚型a)及由序列号：6所述的氨基酸序列构成的蛋白质(RET9、RET亚型c)。另外，上述编码蛋白质的多核苷酸，典型而言，分别为由序列号：3所述的碱基序列构成的多核苷酸(RET转录产物突变体2)及由序列号：5所述的碱基序列构成的多核苷酸(RET转录产物突变体4)。此外，如图2所示，由序列号：4所述的氨基酸序列构成的蛋白质(RET51)和由序列号：6所述的氨基酸序列构成的蛋白质(RET9)从1位的蛋氨酸残基至1063位的甘氨酸残基氨基酸序列一致，但C末端部分的序列及长度不同。
CEP55-RET融合多核苷酸，典型而言，为编码CEP55蛋白质的N末端部分与RET蛋白质的C末端部分融合的多肽的多核苷酸。
在本发明中，“CEP55蛋白质的N末端部分”，典型而言，包括由上述CEP55蛋白质的1位的蛋氨酸残基～153位的谷酰胺残基构成的区域。另外，“RET蛋白质的C末端部分”，典型而言，包括上述RET蛋白质的酪氨酸激酶结构域(参照图2)。
作为本发明的“编码CEP55蛋白质的N末端部分与RET蛋白质的C末端部分融合的多肽的多核苷酸”，典型而言，如图1～4中所示，是通过人第10号染色体间的相互转座或10号染色体内的切断及再结合而产生的。更具体而言，是编码上述CEP55蛋白质中由外显子1～3所编码的多肽区域和上述RET蛋白质中由外显子12～19b或外显子12～20所编码的多肽区域融合的多肽(例如由序列号：8或10所述的氨基酸序列构成的多肽)的多核苷酸。这样的多核苷酸例如为由序列号：7或9所述的碱基序列构成的多核苷酸。
本发明中这样的“CEP55蛋白质”及“RET蛋白质”的氨基酸序列、以及编码这些蛋白质的基因的碱基序列可以在自然界中(即非人工地)产生突变。因此，“CEP55-RET融合多肽”的氨基酸序列及“CEP55-RET融合多核苷酸”的碱基序列也可以在自然界中(即非人工地)产生突变。另外，这些氨基酸序列或碱基序列也可以人工地改变。在本发明中也包括这样的突变体。
作为CEP55-RET融合多肽的突变体的一方式，可以列举由序列号：8或10所述的氨基酸序列中1个或多个氨基酸置换、缺失、添加、和/或插入的氨基酸序列构成的蛋白质。
这里，“多个”通常为50个氨基酸以内，优选30个氨基酸以内，更优选10个氨基酸以内，特别优选数个氨基酸以内(例如5个氨基酸以内、3个氨基酸以内、2个氨基酸以内、1个氨基酸)。
作为CEP55-RET融合多肽的突变体的其它方式，可以列举由序列号：7或9所述的碱基序列构成的DNA和在严格的条件下杂交的DNA所编码的多肽。
这里，作为高严格性的杂交的条件，可以列举例如0.2×SSC、65℃的条件，作为低严格性的杂交的条件，可以列举例如2.0×SSC、50℃的条件。
作为CEP55-RET融合多肽的突变体的另外的其它方式，可以列举由序列号：8所述的氨基酸序列和具有80％以上(例如、85％、90％、95％、97％、99％以上)的同源性的氨基酸序列构成的多肽。
这里，序列的同源性能够利用BLASTX或BLASTP(氨基酸水平)的程序(Altschul et al.J.Mol.Biol.，215：403-410，1990)来确定。该程序基于Karlin及Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2264-2268，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877，1993)。在利用BLASTX分析氨基酸序列的情况下，参数设为例如score＝50、wordlength＝3。另外，在使用Gapped BLAST程序分析氨基酸序列的情况下，可以如Altschul等(Nucleic Acids Res.25：3389-3402,1997)所记载的那样进行。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情况下，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体的方法为公知的。
作为CEP55-RET融合多核苷酸的突变体，可以列举不伴有编码上述CEP55-RET融合多肽的突变体的多核苷酸及氨基酸的突变的简并突变体(degenerated mutant)的多核苷酸。
在本发明的“CEP55-RET融合多核苷酸”的形态中包括mRNA、cDNA、基因组DNA等。就“CEP55-RET融合多核苷酸”而言，只要是本领域技术人员，就能够从由保持CEP55基因与RET基因的融合基因的弥漫型胃癌等所制备的cDNA文库或基因组DNA文库利用公知的杂交技术来分离。另外，也能够通过以由上述弥漫型胃癌等制备的mRNA、cDNA或基因组DNA为模板、利用公知的基因扩增技术(PCR)来扩增、制备。
另外，将这样操作而制备得到的多核苷酸插入适当的表达载体中，将该载体导入无细胞蛋白质合成系统(例如，网状红细胞提取液、小麦胚芽提取液)中进行孵育，并将该载体导入适当的细胞(例如，大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞)中，将所得到的转化体进行培养，由此，能够制备CEP55-RET融合多肽。
此外，如上所述，本发明的“CEP55-RET融合多肽”及“CEP55-RET融合多核苷酸”广义上包括具有天然型的序列(也包括在自然界中产生突变)及人工地改变了序列这两者。但是，需要注意，在特别是指作为后述的检测的对象的“CEP55-RET融合多肽”及“CEP55-RET融合多核苷酸”的情况下，主要是指具有天然型的序列(也包括在自然界中产生突变的序列)。
＜CEP55-RET融合多肽或CEP55-RET融合多核苷酸的存在或不存在的检测方法＞
本发明还提供一种检测试样中的CEP55-RET融合多核苷酸或CEP55-RET融合多肽的存在或不存在的方法。本发明的检测方法包含(a)使用于特异性地检测试样中的该多核苷酸或该多肽的存在或不存在的药剂和试样接触的工序、及(b)检测该多核苷酸或该多肽的存在或不存在的工序。
在本发明中，“试样”不仅包括生物体试样(例如，细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞·气管支清洗液、尿、便)，也包括由这些生物体试样得到的核酸提取物(基因组DNA提取物、mRNA提取物、由mRNA提取物制备的cDNA制备物或cRNA制备物等)或蛋白质提取物。另外，也可以对上述试样实施福尔马林固定处理、醇固定处理、冻结处理或石蜡包埋处理。
另外，就基因组DNA、mRNA、cDNA或蛋白质而言，只要是本领域技术人员，就能够考虑上述试样的种类及状态等选择合适的公知的方法来制备。
在本发明中，“CEP55-RET融合多核苷酸或CEP55-RET融合多肽的存在或不存在的检测”能够将编码上述融合多肽的基因组DNA、来自上述基因组DNA的转录产物、来自上述转录产物的翻译产物作为对象来进行。
另外，编码CEP55-RET融合多肽的基因组DNA是通过人第10号染色体间的相互转座或10号染色体内的切断及再结合而形成的，因此，在“CEP55-RET融合多核苷酸的存在或不存在的检测”中，可以检测该相互转座这样的现象(参照图1及3)。在这样的相互转座的检测中，例如，可以检测CEP55基因的外显子3的编码区域及比该编码区域更靠5′侧的上游区域与CEP55基因的外显子4的编码区域及比该编码区域更靠3′侧的下游区域的分离，另外，也可以检测RET基因的外显子11的编码区域及比该编码区域更靠5′侧的上游区域与RET基因的外显子12的编码区域及比该编码区域更靠3′侧的下游区域的分离。
本发明中的“CEP55-RET融合多核苷酸的存在或不存在的检测”中能够使用公知的方法。在以“编码上述融合多肽的基因组DNA”为对象的情况下，例如，能够采用使用荧光等的原位(in situ)杂交(ISH)、基因组PCR法、直接测序、Southern Blotting、基因组微阵列分析。另外，在以“来自上述基因组DNA的转录产物”为对象的情况下，例如，能够采用RT-PCR法、直接测序、Northern Blotting、斑点印迹(Dot Blot)法、cDNA微阵列分析。
在原位杂交中，通过使具有至少15个碱基的链长的下述(a)或(b)所述的多核苷酸与上述生物体试样接触，能够检测编码CEP55-RET融合多肽的基因组DNA。
(a)作为选自与编码CEP55蛋白质的多核苷酸杂交的探针及与编码RET蛋白质的多核苷酸杂交的探针中的至少一个探针的多核苷酸，
(b)作为与编码CEP55蛋白质的多核苷酸和编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点杂交的探针的多核苷酸。
在编码CEP55-RET融合多肽的基因组DNA的检测中，本发明中这样的编码CEP55-RET蛋白质的多核苷酸只要是来自人的多核苷酸即可，典型而言，为由RefSeq ID：NC＿000010.10中特定的基因组的序列中的第95256369～95288849号的DNA序列构成的基因(CEP55基因)。
另外，本发明中这样的编码RET蛋白质的多核苷酸只要是来自人的多核苷酸即可，典型而言，为由RefSeq ID：NC＿000010.10中特定的基因组的序列中的第43572517～43625799号的DNA序列构成的基因(RET基因)。
但是，基因的DNA序列可以通过其突变等在自然界中(即非人工地)产生突变。因此，这样的天然的突变体也可成为本发明的对象(以下同样)。
本发明的(a)所述的多核苷酸只要是能够通过与作为该多核苷酸的靶点碱基序列的编码CEP55蛋白质的多核苷酸或编码RET蛋白质的多核苷酸杂交来检测编码上述生物体试样中的CEP55-RET融合多肽的基因组DNA的存在的多核苷酸即可，优选为下述(a1)～(a3)所述的多核苷酸。
(a1)与CEP55基因的外显子3的编码区域及比该编码区域更靠5′侧的上游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“5′CEP55探针”)和与RET基因的外显子12的编码区域及比该编码区域更靠3′侧的下游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“3′RET探针”)的组合
(a2)5′CEP55探针和与CEP55基因的外显子4的编码区域和比该编码区域更靠3′侧的下游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“3′CEP55探针”)的组合
(a3)与RET基因的外显子11的编码区域及比该编码区域更靠5′侧的上游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“5′RET探针”)和3′RET探针的组合。
在本发明中，作为原位杂交中所使用的上述(a1)所述的多核苷酸所杂交的区域(靶点碱基序列)，从对于靶点碱基序列的特异性及检测的灵敏度的观点出发，优选为距编码CEP55蛋白质的多核苷酸与编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点1000000个碱基以内的区域，另外，作为原位杂交中所使用的上述(a2)或(a3)所述的多核苷酸杂交的区域，从同样的观点出发，优选为距编码CEP55蛋白质的多核苷酸或编码RET蛋白质的多核苷酸中的切断点1000000碱基以内的区域。
另外，在本发明中，原位杂交中所使用的上述(b)所述的多核苷酸只要是通过能够与作为该多核苷酸的靶点碱基序列的编码CEP55蛋白质的多核苷酸与编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点杂交来检测编码上述生物体试样中的CEP55-RET融合多肽基因组DNA的存在的多核苷酸即可，作为典型例，为与编码由序列号：7或9所述的碱基序列构成的多核苷酸的基因组DNA杂交的多核苷酸，例如为与编码CEP55蛋白质的多核苷酸和编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点杂交的多核苷酸。
另外，在本发明中，从进一步提高对于靶点碱基序列的特异性及检测的灵敏度的观点出发，原位杂交中所使用的(a)或(b)所述的多核苷酸优选为能够覆盖上述靶点碱基序列整体的、由多种多核苷酸构成的集合。此时，构成该集合的多核苷酸的长度至少为15个碱基，优选为100～1000个碱基。
原位杂交中所使用的上述(a)或(b)所述的多核苷酸优选通过用于检测的荧光色素等进行标记。作为这样的荧光色素，例如，可以列举DEAC、FITC、R6G、TexRed、Cy5，但并不限制于这些。另外，除荧光色素之外，也可以通过DAB等色素(chromogen，色原体)或基于酶的金属沉积的银等来标记上述多核苷酸。
在原位杂交中，优选针对编码CEP55蛋白质的多核苷酸的探针和针对编码RET蛋白质的多核苷酸的探针以相互不同的色素进行标记。使用以不同的色素标记的上述(a1)的探针的组合进行原位杂交并观察到各探针的标记发出的信号的重叠的情况下，能够判定为检测出编码CEP55-RET融合多肽的基因组DNA(参照图3及4)。另一方面，使用以不同的色素标记的上述(a2)及(a3)的任一个探针的组合进行原位杂交并观察到各探针的标记发出的信号的分离的情况下，能够判定为检测出编码CEP55-RET融合多肽的基因组DNA。
此外，多核苷酸的标记能够利用公知的方法来进行。例如，能够利用切口平移法、随机引物法将通过荧光色素等标记的基质碱基插入多核苷酸中，来标记该多核苷酸。
在原位杂交中，使上述(a)或(b)所述的多核苷酸与上述生物体试样接触时的条件可以根据该多核苷酸的长度等各种因素而变动，作为高严格性的条件，例如，可以列举0.2×SSC、65℃这样的条件，作为低严格性的条件，例如，可以列举2.0×SSC、50℃这样的条件。此外，只要是本领域技术人员，除了盐浓度(SSC的稀释率等)和温度之外，例如，还能够通过适当选择表面活性剂(NP-40等)的浓度、甲酰胺的浓度、pH等各种条件，来实现与上述条件同样的严格的条件。
作为使用上述(a)或(b)所述的多核苷酸检测编码CEP55-RET融合多肽的基因组DNA的方法，除了上述原位杂交之外，还可以列举Southern blotting、Northern Blotting及斑点印迹法。在这些方法中，通过使上述(a)或(b)所述的多核苷酸与转印有由上述生物体试样得到的核酸提取物的膜杂交，检测上述融合基因。使用上述(a)的多核苷酸的情况下，与编码CEP55蛋白质的多核苷酸杂交的多核苷酸和与编码RET蛋白质的多核苷酸杂交的多核苷酸在识别为薄膜中展开的相同的带的情况下，能够判定为检测出编码CEP55-RET融合多肽的基因组DNA。
作为使用上述(b)的多核苷酸检测编码CEP55-RET融合多肽的基因组DNA的方法，还可以列举基因组微阵列分析、DNA微阵列分析。在这些方法中，通过制作将上述(b)的多核苷酸固定于基板的阵列，使上述生物体试样与该阵列上的多核苷酸接触，检测该基因组DNA。
在PCR或测序中，为了以从上述生物体试样制备的DNA(基因组DNA、cDNA)或RNA为模板特异性地扩增CEP55-RET融合多核苷酸的一部分或全部，能够使用下述(c)的多核苷酸。
(c)作为以夹有编码CEP55蛋白质的多核苷酸与编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点的方式设计的一对引物的多核苷酸。
“作为一对引物的多核苷酸”为在成为靶点的上述融合多核苷酸等中，一个引物与CEP55基因区域杂交，另一个引物与RET基因区域杂交的引物对。这些多核苷酸的长度通常为15～100个碱基，优选为17～30个碱基。
另外，从利用PCR法的检测的精度、灵敏度的观点出发，优选本发明的(c)所述的多核苷酸为与距编码CEP55蛋白质的多核苷酸与编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点5000个碱基内的上述融合多核苷酸的碱基序列互补的序列。
“作为一对引物的多核苷酸”能够基于作为靶点的CEP55-RET融合多核苷酸等的碱基序列，利用公知的方法适当设计。作为公知的方法，例如，可以列举利用Primer ExPress软件(注册商标，ABI公司制)的方法。
作为“作为一对引物的多核苷酸”的优选例，优选为下述(c1)所述的多核苷酸。
(c1)与CEP55基因的外显子3的编码区域及比该编码区域更靠5′侧的上游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“5′CEP55引物”)和与RET基因的外显子12的编码区域及比该编码区域更靠3′侧的下游区域的碱基序列杂交的多核苷酸(以下，也称为“3′RET引物”)的组合。
例如，在CEP55-RET融合多核苷酸的检测中，通过对包含CEP55基因的起始密码子的外显子2、在RET基因的激酶区域内的外显子14设计引物，能够检测包含RET蛋白质的酪氨酸激酶区域的全部的变体(variant)与CEP55基因的融合基因(参照图2)。
在本发明中，作为检测CEP55-RET融合多核苷酸的翻译产物的方法，例如，可以列举免疫染色法、Western Blotting法、ELISA法、流式细胞仪法、免疫沉淀法、抗体阵列分析。在这些方法中，可以使用与CEP55-RET融合多肽结合的抗体。作为这样的抗体，例如，可以列举对包含CEP55蛋白质和RET蛋白质的融合点的多肽特异性的抗体(以下，也称为“融合点特异的抗体”)、与由比CEP55蛋白质的上述融合点更靠N末端侧的区域构成的多肽结合的抗体(以下，也称为“CEP55-N末端抗体”)、与由比RET蛋白质的上述融合点C末端侧的区域构成的多肽结合的抗体(以下，也称为“RET蛋白质-C末端抗体”)。这里，“融合点特异的抗体”是指与包含上述融合点的多肽中特异性地结合、但与野生型(正常型)的CEP55蛋白质及野生型(正常型)的RET蛋白质均不结合的抗体。
CEP55-RET融合多肽能够通过上述融合点特异的抗体来检测，另外，也能够通过上述CEP55-N末端抗体和上述RET蛋白质-C末端抗体的组合来检测。
就“与CEP55-RET融合多肽结合的抗体”而言，只要是本领域技术人员，就能够适当选择公知的方法来制备。作为这样的公知的方法，可以列举将由上述RET蛋白质的C末端部分构成的多肽、CEP55-RET融合多肽、由上述CEP55蛋白质的N末端部分构成的多肽等接种于免疫动物，使该动物的免疫系统激活之后，回收该动物的血清(多克隆抗体)的方法；杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体法等单克隆抗体的制作方法。使用结合有标记物质的抗体时，通过检测该标记，能够直接检测靶点蛋白质。作为标记物质，只要是能够与抗体结合、能够检测的物质即可，没有特别限定，例如，可以列举过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、微过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明异硫氰酸盐(RITC)、碱性磷酸酶、生物素及放射性物质。另外，除使用结合有标记物质的抗体直接检测靶点蛋白质的方法以外，也能够利用使用结合有标记物质的二次抗体、蛋白质G或蛋白质A等间接地检测靶点蛋白质的方法。
＜判定利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性的方法＞
如后述的实施例所示，可以认为CEP55基因与RET基因的融合导致RET蛋白质的激活，参与癌的恶化等。因此，在检测出这样的融合的癌患者中，利用RET酪氨酸激酶抑制剂的治疗为有效的可能性高。
因此，本发明提供一种判定利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性的方法，其中，包括检测从患者分离的试样中的CEP55-RET融合多核苷酸或CEP55-RET融合多肽的存在或不存在的工序，如果检测出上述多核苷酸或上述多肽的存在，则判定为上述患者的上述利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性高。
在本发明中，“患者”不仅是患有癌的人，也可以是怀疑患有癌的某个人。作为成为适用本发明的方法的对象的“癌”，只要是确认CEP55-RET融合基因的表达的癌即可，没有特别限制。优选为弥漫型胃癌。来自患者的生物体试样的收集，能够根据生物体试样的种类，利用公知的方法来进行。
在本发明中，作为成为评价癌治疗的有效性的对象的“RET酪氨酸激酶抑制剂”，只要是能够直接地或间接地抑制RET蛋白质的功能的物质即可，没有特别限制。作为可适用于本发明的公知的RET酪氨酸激酶抑制剂，可以列举4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(常用名：凡德他尼(Vandetanib)；以VEGFR、EGFR及RET为靶点的化合物)、4-[4-[3-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]酰脲]苯氧基]-N-甲基吡啶-2-甲酰胺(常用名：索拉非尼(Sorafenib)；以BRAF及RET等为靶点的化合物)、N-[2-(二乙基氨基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰氨基-单[(2S)-2-羟基琥珀酸酯](常用名：舒尼替尼(Sunitinib)；以PDGFR、VEGFR、RET等为靶点的化合物)、N-(3,3-二甲基吲哚啉-6-基)-2-(吡啶-4-基甲基氨基)烟酰胺(常用名：莫特塞尼(Motesanib)；以PDGFR、VEGFR、RET等为靶点的化合物)、N-(4-(6,7-二甲氧基喹啉-4-基氧基)苯基)-N-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺(常用名：XL184/卡博替尼(Cabozantinib)；以MET、RET等为靶点的化合物)。
“试样”的定义、来自试样的DNA或RNA等提取方法、CEP55-RET融合多核苷酸及CEP55-RET融合多肽的存在或不存在的检测的方法等如上所述。
在利用本发明的方法检测出在从患者分离的试样中存在CEP55-RET融合多核苷酸或CEP55-RET融合多肽的情况下，该患者被判定为利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性高，另一方面，没有检测出该多核苷酸或该多肽的存在的情况下，该患者被判定为利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性低。
＜用于检测CEP55-RET融合多核苷酸或CEP55-RET融合多肽的存在或不存在的药剂、以及用于判定利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性的药剂＞
如上所述，具有至少15个碱基的链长的、作为下述(a)～(c)所述的任一种的多核苷酸能够适用于CEP55-RET融合多核苷酸的存在或不存在的检测。因此，还能够适用于利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性的判定。
(a)作为选自与编码CEP55蛋白质的多核苷酸杂交的探针及与编码RET蛋白质的多核苷酸杂交的探针中的至少一个探针的多核苷酸，
(b)作为与编码CEP55蛋白质的多核苷酸和编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点杂交的探针的多核苷酸，
(c)作为以夹有编码CEP55蛋白质的多核苷酸与编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点的方式设计的一对引物的多核苷酸。
这些多核苷酸具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。
此外，(a)～(c)的多核苷酸可以为DNA，也可以为RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged NucleicAcid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleicacids)、GNA(Glycerol nucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleicacid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。
另外，如上所述，与CEP55-RET融合多肽结合的抗体能够适用于CEP55-RET融合多核苷酸的翻译产物(CEP55-RET融合多肽)的检测。
在本发明的药剂中，除作为有效成分的上述物质(多核苷酸、抗体)之外，还能够含有药学上可接受的其它成分。作为这样的其它成分，例如，可以列举缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐等。作为缓冲剂，能够使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为乳化剂，能够使用阿拉伯树胶、海藻酸钠、西黄芪胶等。作为悬浮剂，能够使用单硬脂酸甘油、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为稳定剂，能够使用丙二醇、二亚乙基亚硫酸盐、抗坏血酸等。作为防腐剂，能够使用叠氮化钠、苯扎氯铵、对羟苯甲酸、氯丁醇等。
另外，除包含多核苷酸、抗体的标准品之外，也能够组合附加于多核苷酸、抗体上的标记的检测中所需要的基质、阳性对照(例如，CEP55-RET融合多核苷酸、CEP55-RET融合多肽、或保持它们的细胞等)、阴性对照、原位杂交等中所使用的对比染色用试剂(DAPI等)、抗体的检测中所需要的分子(例如，二次抗体、蛋白质G、蛋白质A)、用于试样的稀释、清洗的缓冲液等标准品，制成用于本发明的方法的试剂盒。在该试剂盒中能够包括该试剂盒的使用说明书。本发明也提供用于上述本发明的方法的试剂盒。
＜治疗癌的方法、癌的治疗剂＞
如上所述，可以认为通过本发明的方法检测出CEP55-RET融合多核苷酸或CEP55-RET融合多肽的存在的患者利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性高。因此，通过对癌患者中的保持CEP55-RET融合基因的患者选择性地投与RET酪氨酸激酶抑制剂，能够有效地进行癌的治疗。因此，本发明提供一种治疗癌的方法，其中，包括对通过上述本发明的方法判定为利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性高的患者投与上述RET酪氨酸激酶抑制剂的工序。
另外，本发明提供一种以RET酪氨酸激酶抑制剂为有效成分的癌的治疗剂，其中，对通过上述本发明的方法判定为利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性高的患者进行给药。
作为“RET酪氨酸激酶抑制剂”，如上所述，只要是能够直接地或间接地抑制RET蛋白质的功能的物质即可，没有特别限制。作为可以适用于本发明的公知的RET酪氨酸激酶抑制剂的例子，如上所述。
对患者投与RET酪氨酸激酶抑制剂的方法可以根据该抑制剂的种类、癌的种类等适当选择，例如，能够采用口服、静脉内、腹腔内、经皮、肌肉内、气管内(喷雾剂)、直肠内、阴道内等给药方式。
实施例
以下，基于实施例，更具体地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
＜实验材料＞
以弥漫型胃癌手术切除冻结标本13个病例为研究对象。另外，作为阴性对照，使用正常胃粘膜组织。
＜RNA提取＞
将在液氮内冻结保存的肿瘤组织以CryoPrep(制品名：CP02，Covaris公司制)进行粉碎。接着，从粉碎的肿瘤组织使用总RNA提取用试剂盒(制品名：RNAeasy，QIAGEN公司制)提取总RNA。
＜RNA序列＞
使用上述制备的总RNA 2μg，利用mRNAseq样品制备试剂盒(Illumina公司制)进行文库的合成。即，首先，将2μg的总RNA在94℃处理5分钟，片段化之后，进行cDNA合成。接着，在所得到的cDNA的两端结合测序用的接头(adapter)，其后在琼脂糖凝胶中泳动、精制。而且，以精制的cDNA为模板，进行PCR，制作300个碱基长的文库。将制得的cDNA文库使用高速测序仪(GA2X，Illumina公司制)序列解读其两端的50bp。
＜序列信息的分析＞
由所得到的序列信息中利用PCR去除重复克隆之后，使用Bowtie软件，在已知的数据库(Refseq及Ensemble)中进行比对，提取两端的序列为不同的基因由来的序列(参照非专利文献4)。
＜利用RT-PCR及桑格法的确认＞
由RNA测序中所用的相同的总RNA，使用新的逆转录酶(SuperScript III第一(1st)-链合成系统，Invitrogen公司制)合成cDNA。以所得到的序列为基础合成PCR引物，使用ExTaq HS(Takara公司制)进行PCR，其后，通过电泳确认PCR产物。另外，由琼脂糖凝胶提取PCR产物，使用相同引物、BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems公司制)及ABI 3730测序仪，通过桑格法进行测序分析。并且，由所得到的结果确认了融合基因的融合点和阅读框。
转录反应及PCR反应的条件如下所述。
＜逆转录反应＞
首先，在上述总RNA5μg(8μL)中混合随机六聚体引物(50ng/μL)1μL和10mM dNTP混合物1μL，在65℃反应5分钟，在冰上进行骤冷。接着，依次添加10×RT缓冲液2μL、25mM MgCl24μL、0.1M DTT 2μL、RNaseOUT(40U/μL)1μL、SuperScript III RT(200U/μL)1μL。接着，以在25℃10分钟、在50℃50分钟、在85℃5分钟、在4℃5分钟的条件进行逆转录反应。接着，在所得到的逆转录产物中添加RNaseH1μL，在37℃将总RNA消化20分钟之后，在－20℃保存至使用。
＜PCR反应＞
混合上述制得的1st链cDNA 2μL、10×ExTaq缓冲液1μL、2.5mMdNTPs 1.2μL、H2O 4.7μL、ExTaq HS 0.1μL、2μM CF/CR混合物引物1μL，首先，将在95℃反应3分钟，接着在94℃反应30秒、在58℃反应30秒及在72℃反应30秒，以上述反应为一个反应循环，重复35个循环之后，在72℃反应5分钟。
(实施例1)
[利用RNA测序的新型激酶融合基因的鉴定]
在从13个病例的弥漫型胃癌临床检测体，在利用PCR除去重复克隆的基础上，分别得到8.0×107以上的成对碱基序列。将这些对照现有的基因数据库，结果，如图2所示，在1例中检测出编码CEP55基因与RET基因的融合基因候选(编码CEP55蛋白质与RET9蛋白质融合的多肽的多核苷酸、编码CEP55蛋白质与RET51蛋白质融合的多肽的多核苷酸，以下也称为“CEP55-RET融合基因”)。
[利用RT-PCR及桑格测序的确认]
接着，使用相同检测体进行利用RT-PCR和桑格测序的融合基因的验证。其结果，通过RT-PCR，对于上述融合基因，发现病例特异性的扩增、即仅在弥漫型胃癌中发现上述融合基因的表达，在正常胃粘膜组织中，上述融合基因不表达。
另外，通过将所得到的PCR产物进行测序分析，在CEP55基因与RET基因的融合基因中，如图2及序列号：7及9所示，发现通过CEP55的外显子3(由序列号：1、7或9的488～763位中记载的碱基序列构成的多核苷酸)与RET基因的外显子12(由序列号：3或5的2327～2474位中记载的碱基序列构成的多核苷酸)直接结合，这些基因的阅读框不发生错位地融合。
因此，以上的结果暗示：由于CEP55基因和RET基因同样在10号染色体以相同的方向存在，因此，在弥漫型胃癌等癌细胞中特异性地通过10号染色体间的相互转座(参照图1左侧)或10号染色体内的切断及再结合(参照图1右侧)而产生CEP55基因与RET基因的融合。实际上，根据由未分化胃癌患者由来的癌组织所得到的基因组DNA的融合部位的碱基序列分析发现，在该患者癌组织中，通过10号染色体内的切断及再结合，产生CEP55基因与RET基因的融合。
(实施例2)
[对于CEP55-RET融合多肽的功能以及RET酪氨酸激酶抑制剂对表达该多肽的癌细胞的有效性的分析]
可以认为上述的基因融合导致RET蛋白质的激活，进而认为，通过该激活，其下游的信号也被激活，细胞癌化。因此，可以认为，对于发生这样的激活的患者，RET酪氨酸激酶抑制剂在治疗中显示有效性。因此，为了这些看法，如下所示，按照适当的常规方法，对CEP55-RET融合基因进行分析。
首先，将编码FLAG表位标记(epitope tag)的cDNA与由未分化胃癌患者由来的癌组织所得到的CEP55-RET融合基因(编码CEP55蛋白质与RET51蛋白质融合的多肽的多核苷酸)的cDNA的5′侧符合翻译的阅读框地连接，在PMXs逆转录病毒载体进行克隆。
另外，在该载体导入部位特异性的突变，制作编码将RET激酶部位内的1个氨基酸取代的激酶活性突变体(KD突变型CEP55-RET融合多肽：K758M)的载体。
接着，使这样制备得到的逆转录病毒载体分别感染小鼠正常成纤维细胞株NIH-3T3细胞，得到稳定地表达野生型或突变型的CEP55-RET融合多肽的细胞株。
另外，对于在肺腺癌中检测出的RET融合基因(KIF5B基因于RET基因的融合基因，以下也称为“KIF5B-RET融合基因”)，也与上述同样地制作编码该基因的逆转录病毒载体。并且，也与上述同样地制作编码将RET激酶部位内的赖氨酸取代为蛋氨酸的激酶活性突变体的逆转录病毒载体。接着，使这些逆转录病毒载体分别感染NIH-3T3细胞，制备稳定地表达野生型或突变型的KIF5B-RET融合多肽的细胞株。接着，将该细胞株作为对照组供于以下所示的实验。
此外，对于KIF5B-RET融合基因，参照Kohno T.等、Nature Medicine、2012年2月12日在线公开、18卷、3号、375～377页。另外，在本实施例中用作对照的KIF5B-RET融合基因为该文献中记载的“KIF5B-RET fusion variant 1”。
另外，在本说明书中，也将CEP55-RET融合基因及KIF5B-RET融合基因(或CEP55-RET融合多肽及KIF5B-RET融合多肽)总称为“RET融合基因(或RET融合多肽)”。
将稳定地表达野生型或突变型的RET融合多肽的上述细胞株播种于软琼脂培养基(培养基中的琼脂的浓度：4mg/mL，以下相同)，评价这些细胞株的非贴壁依赖性克隆形成能力，由此研究RET融合多肽的转化能力。在图5中表示所得到的结果。
另外，在添加有低分子RET酪氨酸激酶抑制剂(Vandetanib或XL184)的软琼脂培养基上分别播种稳定地表达野生型的RET融合多肽的上述细胞株，评价这些细胞株的非贴壁依赖性克隆形成能力，由此研究利用RET融合多肽得到的对转化的RET酪氨酸激酶抑制剂的效果。在图6中表示所得到的结果。
另外，在液体培养基分别培养稳定地表达野生型或突变型的RET融合多肽的上述细胞株，实施血清饥饿处理之后，更换为添加有RET酪氨酸激酶抑制剂(Vandetanib或XL184)的液体培养基，进行培养。接着，从这样得到的各细胞株提取蛋白质，使用对各种磷酸化蛋白质或非磷酸化蛋白质的抗体进行Western Blotting分析，由此，对RET融合中的多肽的下游信号进行分析。在图7中表示所得到的结果。
另外，将稳定地表达野生型或突变型的CEP55-RET融合多肽的上述细胞株或稳定地表达野生型的KIF5B-RET融合多肽的上述细胞株在免疫缺陷小鼠(BALB/c-nu/nu)的皮下每1处移植细胞1×106个，研究表达这些RET融合多肽的细胞的体内的成癌能力。在图8中表示所得到的结果。
由图5所示的结果可知，通过CEP55-RET融合多肽的表达，NIH-3T3细胞显示非贴壁依赖性的克隆形成。另一方面，可知通过将RET蛋白质的激酶活性非活性化，显著地抑制CEP55-RET融合多肽导致的非贴壁依赖性克隆形成能力。
另外，如图6所示，还可知这样的CEP55-RET融合多肽导致的非贴壁依赖性克隆形成能力被RET酪氨酸激酶抑制剂显著地抑制。
另外，由图7所示的结果可知，通过CEP55-RET融合多肽的表达，在NIH-3T3细胞中看到RET激酶结构域强的磷酸化(在图7的“p-RET(Y1062)”中，参照标记有“W”的列)。另外，还可知该磷酸化被RET酪氨酸激酶抑制剂处理或RET蛋白质中的激酶活性的非活性化显著地抑制(在图7的“p-RET(Y1062)”中，参照附记“V”及“X”、或“KD”的列)。
另外，如图7所示，AKT的磷酸化是由CEP55-RET融合多肽强烈引起的(在图7的“p-AKT(S473)”中，参照标记有“W”的列)。另外，还可知STAT3及MAPK的磷酸化也由于该融合肽而亢进(在图7的“p-STAT3(Y705)”及“p-MAPK(T202/Y204705)”中，参照标记有“W”的列)。但是，还可知这些磷酸化也由于RET酪氨酸激酶抑制剂处理或RET蛋白质中的激酶活性的非活性化而显著地得到抑制(在图7的“p-RET(Y1062)”、“p-STAT3(Y705)”及“p-MAPK(T202/Y204705)”中，参照附记“V”及“X”、或“KD”的通道)。
另外，如图8所示，将表达野生型的CEP55-RET融合多肽的NIH-3T3细胞移植于免疫缺陷小鼠的皮下，结果，在该移植后14天以内观察到肿瘤形成。另一方面，即使将表达突变型的CEP55-RET融合多肽的NIH-3T3细胞移植于免疫缺陷小鼠的皮下，在至该移植后30天的观察中，完全没有确认到肿瘤的形成。
因此，可知CEP55-RET融合基因具有转化能力，作为癌基因起作用，并且，在该转化中需要RET激酶活性的激活。
另外，还可知这样的CEP55-RET融合多肽导致的转化能力通过由RET酪氨酸激酶抑制剂抑制该融合多肽中的RET酪氨酸激酶的激活或作为其下游的信号的AKT等激活而得到抑制。
工业上的可利用性
如以上说明的那样，根据本发明，能够检测编码CEP55蛋白质或其一部分与RET蛋白质或其一部分的融合多肽的多核苷酸或其表达产物，并且，能够通过该检测预测利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性。该融合导致RET蛋白质的激活，进而使细胞癌化。另外，如上述中所证实的那样，这样的RET的激活及癌化能够由RET酪氨酸激酶抑制剂显著地抑制。因此，CEP55基因与RET基因的融合可以成为RET酪氨酸激酶抑制剂的靶点，因此，本发明在提高癌治疗的效率方面是非常有用的。

Claims (8)

1.一种多核苷酸，其特征在于：
编码CEP55蛋白质或其一部分与RET蛋白质或其一部分融合的多肽。
2.一种多肽，其特征在于：
由权利要求1所述的多核苷酸编码。
3.一种检测试样中的权利要求1所述的多核苷酸或权利要求2所述的多肽的存在或不存在的方法，其特征在于，包括：
(a)使用于特异性地检测试样中的该多核苷酸或该多肽的存在或不存在的药剂与试样接触的工序，和
(b)检测该多核苷酸或该多肽的存在或不存在的工序。
4.一种用于通过权利要求3所述的方法检测试样中的权利要求1所述的多核苷酸或权利要求2所述的多肽的存在或不存在的药剂，其特征在于：
包含具有至少15个碱基的链长的下述(a)～(c)中任一项所述的多核苷酸、或下述(d)所述的抗体，
(a)作为选自与编码CEP55蛋白质的多核苷酸杂交的探针及与编码RET蛋白质的多核苷酸杂交的探针中的至少一个探针的多核苷酸，
(b)作为与编码CEP55蛋白质的多核苷酸和编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点杂交的探针的多核苷酸，
(c)作为以夹有编码CEP55蛋白质的多核苷酸与编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点的方式设计的一对引物的多核苷酸，
(d)与CEP55蛋白质与RET蛋白质融合得到的多肽结合的抗体。
5.一种判定利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性的方法，其特征在于：
包括检测从患者分离的试样中的权利要求1所述的多核苷酸或权利要求2所述的多肽的存在或不存在的工序，如果检测出所述多核苷酸或所述多肽的存在，则判定为所述患者的所述利用RET抑制剂的癌治疗的有效性高。
6.一种用于通过权利要求5所述的方法判定利用RET抑制剂的癌治疗的有效性的药剂，其特征在于：
包含具有至少15个碱基的链长的下述(a)～(c)中任一项所述的多核苷酸、或下述(d)所述的抗体，
(a)作为选自与编码CEP55蛋白质的多核苷酸杂交的探针及与编码RET蛋白质的多核苷酸杂交的探针中的至少一个探针的多核苷酸，
(b)作为与编码CEP55蛋白质的多核苷酸和编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点杂交的探针的多核苷酸，
(c)作为以夹有编码CEP55蛋白质的多核苷酸与编码RET蛋白质的多核苷酸的融合点的方式设计的一对引物的多核苷酸，
(d)与CEP55蛋白质与RET蛋白质融合得到的多肽结合的抗体。
7.一种治疗癌的方法，其特征在于：
包括对通过权利要求5所述的方法判定为利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性高的患者投与所述RET酪氨酸激酶抑制剂的工序。
8.一种以RET酪氨酸激酶抑制剂为有效成分的癌的治疗剂，其特征在于：
对通过权利要求5所述的方法判定为利用RET酪氨酸激酶抑制剂的癌治疗的有效性高的患者进行给药。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105255927A (zh) * 2015-09-30 2016-01-20 温州医科大学附属第一医院 一种kiaa1217-ret融合基因
CN112062827A (zh) * 2020-09-16 2020-12-11 军事科学院军事医学研究院生物医学分析中心 Cep55蛋白在调控纤毛去组装和制备纤毛相关疾病模型中的应用

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3205654B1 (en) 2010-05-20 2019-01-02 Array Biopharma, Inc. Macrocyclic compounds as trk kinase inhibitors
MX2015003704A (es) 2012-09-25 2015-07-06 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Inhibidor de quinasas reordenadas durante la transfeccion (ret).
US10202365B2 (en) 2015-02-06 2019-02-12 Blueprint Medicines Corporation 2-(pyridin-3-yl)-pyrimidine derivatives as RET inhibitors
PL3322706T4 (pl) 2015-07-16 2021-07-19 Array Biopharma, Inc. Podstawione związki pirazolo[1,5-a]pirydynowe jako inhibitory kinazy ret
MY194262A (en) 2015-11-02 2022-11-25 Blueprint Medicines Corp Inhibitors of ret
WO2017161269A1 (en) 2016-03-17 2017-09-21 Blueprint Medicines Corporation Inhibitors of ret receptor tyrosine kinases
WO2018017983A1 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Blueprint Medicines Corporation Compounds useful for treating disorders related to ret
JOP20190077A1 (ar) 2016-10-10 2019-04-09 Array Biopharma Inc مركبات بيرازولو [1، 5-a]بيريدين بها استبدال كمثبطات كيناز ret
TWI704148B (zh) 2016-10-10 2020-09-11 美商亞雷生物製藥股份有限公司 作為ｒｅｔ激酶抑制劑之經取代吡唑并[1,5-a]吡啶化合物
CN110267960B (zh) 2017-01-18 2022-04-26 阿雷生物药品公司 作为RET激酶抑制剂的取代的吡唑并[1,5-a]吡嗪化合物
JOP20190213A1 (ar) 2017-03-16 2019-09-16 Array Biopharma Inc مركبات حلقية ضخمة كمثبطات لكيناز ros1
JP2020519672A (ja) 2017-05-15 2020-07-02 ブループリント メディシンズ コーポレイション ＲＥＴ阻害剤とｍＴＯＲＣ１阻害剤との組合せ及び異常なＲＥＴ活性によって媒介されるがんを処置するためのその使用
TWI791053B (zh) * 2017-10-10 2023-02-01 美商亞雷生物製藥股份有限公司 6-(2-羥基-2-甲基丙氧基)-4-(6-(6-((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-3,6-二氮雜雙環[3.1.1]庚-3-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲腈之結晶形式及其醫藥組合物
JP2021500346A (ja) * 2017-10-20 2021-01-07 カラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｒｅｔ９及びｖｅｇｆｒ２阻害剤
EP3740491A1 (en) 2018-01-18 2020-11-25 Array Biopharma, Inc. Substituted pyrrolo[2,3-d]pyrimidines compounds as ret kinase inhibitors
CA3087972C (en) 2018-01-18 2023-01-10 Array Biopharma Inc. Substituted pyrazolyl[4,3-c]pyridinecompounds as ret kinase inhibitors
TW201938169A (zh) 2018-01-18 2019-10-01 美商亞雷生物製藥股份有限公司 作為RET激酶抑制劑之經取代吡唑并[3,4-d]嘧啶化合物
BR112020020273A2 (pt) 2018-04-03 2021-04-06 Blueprint Medicines Corporation Inibidor de ret para uso no tratamento de câncer tendo uma alteração de ret
EP3833372A4 (en) 2018-08-10 2022-06-08 Blueprint Medicines Corporation TREATMENT OF EGFR MUTANT CANCER
US11964988B2 (en) 2018-09-10 2024-04-23 Array Biopharma Inc. Fused heterocyclic compounds as RET kinase inhibitors

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1624126A (zh) * 1996-05-08 2005-06-08 拜奥根有限公司 刺激神经和肾生长的RET配体（RetL）
US20050222029A1 (en) * 2001-01-04 2005-10-06 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating diseases
CN101563104A (zh) * 2006-02-01 2009-10-21 约翰霍普金斯大学 用于肿瘤或传染性疾病免疫预防或免疫治疗的多肽-核酸结合物
CN101595219A (zh) * 2006-11-13 2009-12-02 阿特纳赞塔里斯有限公司 作为编码抗原和蛋白毒素的核苷酸序列的载体的微生物，其制备方法和用途
CN102203092A (zh) * 2008-09-08 2011-09-28 米兰-比科卡大学 NPM-ALK、RET和BCR-ABL的α-咔啉抑制剂
WO2012014795A1 (ja) * 2010-07-26 2012-02-02 アステラス製薬株式会社 新規ｒｅｔ融合体の検出法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2007329740B2 (en) * 2006-10-26 2014-05-01 Genentech, Inc. Genetic variations associated with tumors

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1624126A (zh) * 1996-05-08 2005-06-08 拜奥根有限公司 刺激神经和肾生长的RET配体（RetL）
US20050222029A1 (en) * 2001-01-04 2005-10-06 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating diseases
CN101563104A (zh) * 2006-02-01 2009-10-21 约翰霍普金斯大学 用于肿瘤或传染性疾病免疫预防或免疫治疗的多肽-核酸结合物
CN101595219A (zh) * 2006-11-13 2009-12-02 阿特纳赞塔里斯有限公司 作为编码抗原和蛋白毒素的核苷酸序列的载体的微生物，其制备方法和用途
CN102203092A (zh) * 2008-09-08 2011-09-28 米兰-比科卡大学 NPM-ALK、RET和BCR-ABL的α-咔啉抑制剂
WO2012014795A1 (ja) * 2010-07-26 2012-02-02 アステラス製薬株式会社 新規ｒｅｔ融合体の検出法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DORON LIPSON ET AL.: "Identification of new ALK and RET gene fusions ofrom colorectal and lung cancer biopsies", 《NATURE MEDICINE》 *
JHIANG S.M: "The RET PROTO-ONCEGENE IN HUMAN CANCERS", 《NATURE PUBLISHING GROUP》 *
TAKASHI KOHNO ET AL.: "KIF5B-RET fusions in lung adenocarcinoma", 《NATURE MEDICINE》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105255927A (zh) * 2015-09-30 2016-01-20 温州医科大学附属第一医院 一种kiaa1217-ret融合基因
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CN112062827A (zh) * 2020-09-16 2020-12-11 军事科学院军事医学研究院生物医学分析中心 Cep55蛋白在调控纤毛去组装和制备纤毛相关疾病模型中的应用

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