CN104619840A

CN104619840A - Fgfr2融合基因

Info

Publication number: CN104619840A
Application number: CN201380035840.5A
Authority: CN
Inventors: 柴田龙弘
Original assignee: National Cancer Center Japan; LSIP LLC
Current assignee: National Cancer Center Japan; LSIP LLC
Priority date: 2012-07-05
Filing date: 2013-07-05
Publication date: 2015-05-13
Also published as: EP2871236A1; US20150191791A1; JPWO2014007369A1; EP2871236A4; WO2014007369A1

Abstract

为了鉴定可成为预测在癌中药剂的治疗有效性的指标的基因、提供将该基因作为标靶预测药剂的治疗有效性的新型的方法，进行了胆道癌的转录组测序。其结果，鉴定出了FGFR2基因与其它基因(BICC1基因或AHCYL1基因)的框内融合转录产物。另外，也发现该基因融合导致FGFR2蛋白质的活化，使细胞癌化。进而也证实利用FGFR2抑制剂能够抑制上述基因融合引起的FGFR2蛋白质的活化及癌化，并发现对于检测出上述基因融合的患者，利用FGFR2抑制剂治疗是有效的。

Description

FGFR2融合基因

技术领域

本发明涉及一种FGFR2融合基因，更详细而言，涉及一种编码FGFR2蛋白质和其它蛋白质的融合多肽的多核苷酸、该多核苷酸编码的多肽以及检测该多核苷酸或该多肽的方法。另外，本发明涉及一种判定以该多核苷酸或该多肽为标靶的利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性的方法。进而，本发明涉及一种利用了该有效性判定的癌治疗方法。另外，本发明也涉及用于这些方法的药剂。

背景技术

胆道癌为由肝脏内(肝内胆道癌)及肝脏外(肝外胆道癌)的胆管上皮细胞发生的浸润性非常高的癌。以东亚为中心发生频率很高，但近年来，包括欧美在内全世界性发生频率增加。由于发病早期缺乏临床症状，因此很多病例大多在晚期被发现，其预后不良。手术切除为唯一的完全治愈的治疗，但复发率高，5年生存率为手术可能病例的15～25％。对于不能手术的病例或复发病例，以现有化学疗法显示显著疗效的情况尚未得知，但最近有报告，与其它化疗法相比，盐酸吉西他滨单独使用或盐酸吉西他滨和铂制剂的并用显示稍微有效的成绩。因此，对于胆道癌，强烈要求包括分子标靶治疗的新的有效的治疗方法，迄今为止，作为分子标靶的候补，报告有EGFR、VEGFR、c-MET等。

作为胆道癌中的驱动突变，报告有KRAS及BRAF基因突变，另外，最近，作为酪氨酸激酶的融合基因，在胆道癌中也报告有在脑肿瘤中被鉴定的GOPC-ROS1。没有看到这些异常的病例中的驱动突变仍旧尚未得到鉴定。

FGFR(Fibroblast growth factor receptor：成纤维细胞生长因子受体)家族为作为FGF(Fibroblast growth factor：成纤维细胞生长因子)的受体发挥作用的跨膜型酪氨酸激酶分子的总称。在人类中，属于FGFR家族的分子已知有FGFR1～4这4种。在细胞外区域具有3个Ig-like(免疫球蛋白样)区域、1处跨膜区域，在细胞内区域具有酪氨酸激酶区域。已知FGFR家族促进包含胃癌、乳腺癌、子宫癌、膀胱癌的许多癌的发生或进展，有报告在癌中引起各种基因组异常导致的活化(非专利文献1)。

例如，关于FGFR1，已知在乳腺癌和卵巢癌中发生基因扩增，在恶性黑色素瘤中发生基因突变，在白血病和乳腺癌中发生基因易位。另外，关于FGFR2，已知在胃癌和乳腺癌中发生基因扩增，在子宫癌或胃癌中发生基因突变。另外，关于FGFR3，已知在膀胱癌和唾液腺癌中发生基因扩增，在膀胱癌、子宫癌、骨髓瘤和前列腺癌中发生基因突变。

关于FGFR参与的融合基因，迄今为止仅在FGFR1中有报告，多在血液肿瘤中被鉴定。在血液肿瘤中报告有FGFR1OP2-FGFR1(非专利文献2)、ZNF198-FGFR1(非专利文献3)这样的融合基因，就实体癌而言，在乳腺癌中报告有FGFR1-ZNF703(非专利文献4)。关于胆道癌中的FGFR信号异常，在文献中报告了作为其配体的FGF的表达(非专利文献5)。

作为以FGFR为标靶的低分子抑制化合物，现在，对AZD4547、TKI258、E3810、E7080、BIBF1120、Masitinib、BGJ398这样的物质进行了临床开发。另外，以FGFR为标靶的抗体治疗药的开发目前也在进行中(非专利文献1)。

另一方面，BICC1蛋白质为具有参与RNA结合区域及蛋白质相互作用的SAM(sterile α motif)区域的分子，对Wnt通路进行负调节。另外，有报告因该蛋白质的功能异常而导致多囊性肾病和胰腺发生异常(非专利文献6)。另外，已知AHCYL1蛋白质具有与S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶类似的区域，参与上皮细胞中的分泌(非专利文献7)。

但是，关于FGFR2基因、BICC1基因及AHCYL1基因这些任一种基因参与的融合基因的存在、以及该融合基因与癌的关联性的有无尚不清楚。另外，在包括胆道癌在内的癌中的融合基因等的阐明还不能说充分，目前的现状是期望鉴定可成为预测药剂的治疗有效性指标的突变基因或融合基因。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Ahmad I.等，Biochim Biophys Acta.，2012年，1823卷，850～860页

非专利文献2：Popovici C.等，Blood，1999年，93卷，1381～1389页

非专利文献3：Xiao S.等，Nature Genet.，1998年，18卷，84～87页

非专利文献4：“癌中的体细胞突变一览(Catalogue of SomaticMutations in Cancer)易位(translocation)基因(Genes)：FGFR1ZNF703”，[online]，最终更新日：2011年9月28日，英国Welcome TrustSanger研究所，因特网〈URL:http://www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/cosmic？action＝translocations&id＝174&fused＝59536〉

非专利文献5：Ogasawara S.等，Hepatol Res.，2001年，20卷，97～113页

非专利文献6：Kraus MR.等，Hum Mutat.，2012年，33卷，86～90页

非专利文献7：Yang D.等，J Clin Invest.，2011年，121卷，956～965页

发明内容

本发明就是鉴于上述现有技术具有的课题而完成的发明，其目的在于鉴定可成为在胆道癌等中预测药剂的治疗有效性的指标的基因。另外，本发明的目的在于提供一种以该基因或其表达产物为标靶而预测药剂的治疗有效性的新型的方法。进而，本发明的目的在于基于以该基因或其表达产物为标靶的药剂的治疗有效性的预测而提供一种治疗胆道癌等的方法。进而，本发明的目的在于提供一种用于在这些方法中检测该基因或其表达产物的药剂。

本发明的发明人为了达到上述目的而进行了反复深入的研究，结果，通过8例胆道癌的转录组测序，鉴定了FGFR2基因与其它基因(BICC1基因或AHCYL1基因)的框内(In-flame)融合转录产物。FGFR2基因与BICC1基因的融合基因(FGFR2-BICC1融合基因)是由第10号染色体内的倒位而产生的，FGFR2基因与AHCYL1基因的融合基因(FGFR2-AHCYL1融合基因)是由第1号染色体和第10号染色体的相互易位而产生的。另外，在102例的胆道癌中研究了这些融合基因的出现频率，结果，FGFR2-AHCYL1融合基因的出现频率约为6.9％，FGFR2-BICC1融合基因的出现频率约为2.0％。

进而，认为这些基因融合导致FGFR2蛋白质的活化，在产生这种活化的患者中，认为FGFR2抑制剂为在治疗中显示有效性的物质。为此，将这些融合基因分别导入于正常细胞，结果确认这些细胞获得贴壁非依赖性的集落形成能力，即癌化。另外得知，在该细胞中观察到FGFR2蛋白激酶的活化，进而，作为其下游信号的MAPK的磷酸化也亢进。

另外，将表达FGFR2融合基因的细胞移植在裸鼠的皮下，结果确认该细胞具有体内成瘤能力。

另一方面，也确认该FGFR2蛋白激酶的活化、MAPK的磷酸化、贴壁非依赖性的集落形成能力、体内成瘤能力通过FGFR2抑制剂、或通过FGFR2融合多肽的激酶结构域的失活而显著地得到抑制。

基于以上几点，本发明的发明人能够在胆道癌等中以该基因融合为标靶预测利用FGFR2抑制剂的治疗有效性，进而发现，如果对在该预测中判定为药剂治疗有效的患者投与该药剂，则能够有效地进行治疗，从而完成了本发明。

因此，本发明涉及一种编码FGFR2蛋白质与其它蛋白质的融合多肽的多核苷酸、由该多核苷酸编码的多肽、该多核苷酸或多肽的检测方法、以该多核苷酸或该多肽的存在为指标判定利用FGFR2抑制剂的癌治疗有效性的方法、利用了该有效性判定的癌治疗方法、以及用于这些方法的药剂，更详细而言，提供以下的发明。

＜1＞一种多核苷酸，其为编码FGFR2蛋白质与其它蛋白质融合的多肽的多核苷酸，其编码在癌细胞中表达的多肽。

＜2＞如＜1＞所述的多核苷酸，其中，其它蛋白质为BICC1蛋白质或AHCYL1蛋白质。

＜3＞如＜1＞或＜2＞所述的多核苷酸，其中，癌细胞为胆道癌细胞。

＜4＞一种由＜1＞～＜3＞中任一项所述的多核苷酸编码的多肽。

＜5＞一种检测试样中的＜1＞～＜3＞中任一项所述的多核苷酸或＜4＞所述的多肽存在或不存在的方法，其包括：

(a)使药剂与试样接触的工序，该药剂用于特异性地检测试样中的该多核苷酸或该多肽存在或不存在、以及

(b)检测该多核苷酸或该多肽存在或不存在的工序。

＜6＞一种药剂，其用于利用＜5＞所述的方法检测试样中的＜1＞～＜3＞中任一项所述的多核苷酸或＜4＞所述的多肽存在或不存在，所述药剂包含具有至少15个碱基的链长的下述(a)～(c)中任一项所述的多核苷酸或下述(d)所述的抗体，

(a)作为选自与编码FGFR2蛋白质的多核苷酸杂交的探针和与编码其它蛋白质的多核苷酸杂交的探针中的至少一个探针的多核苷酸，

(b)作为与编码FGFR2蛋白质的多核苷酸和编码其它蛋白质的多核苷酸的融合点杂交的探针的多核苷酸，

(c)作为以夹有编码FGFR2蛋白质的多核苷酸和编码其它蛋白质的多核苷酸的融合点的方式设计的一对引物的多核苷酸，

(d)与FGFR2蛋白质和其它蛋白质融合的多肽结合的抗体。

＜7＞一种判定利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性的方法，其包括检测从患者分离的试样中的＜1＞～＜3＞中任一项所述的多核苷酸或＜4＞所述的多肽存在或不存在的工序，如果检测出所述多核苷酸或所述多肽存在，则判定为所述患者利用所述FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性高。

＜8＞一种药剂，其用于利用＜7＞所述的方法判定利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性，所述药剂包含具有至少15个碱基的链长的下述(a)～(c)中任一项所述的多核苷酸或下述(d)所述的抗体，

(d)与FGFR2蛋白质和其它蛋白质融合的多肽结合的抗体。

＜9＞一种治疗癌的方法，其包括对利用＜7＞所述的方法判定为利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性高的患者投与所述FGFR2抑制剂的工序。

＜10＞一种治疗剂，其为以FGFR2抑制剂为有效成分的癌的治疗剂，对利用＜7＞所述的方法判定为利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性高的患者投与。

发明的效果

根据本发明，能够有效地检测FGFR2基因与其它基因的融合基因或其表达产物。另外，根据本发明，通过该融合基因或其表达产物的检测，能够预测对癌的治疗有效性，特别是能够预测利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性。而且，由此能够避免对于认为投与药剂无效的癌患者投与药剂，因此能够实现有效的癌治疗。

附图说明

图1是表示由人10号染色体内的倒位产生的FGFR2基因与BICC1基因的融合的概略图。

图2是表示FGFR2蛋白质与BICC1蛋白质的融合的概略图。即，是表示FGFR2蛋白质的膜外结构域(IgI～IgIII)、跨膜(TM)结构域及激酶结构域与BICC1蛋白质的C末端部分融合的概略图。另外，是表示通过利用与FGFR2基因的激酶区域内的外显子16或外显子18和BICC1基因的外显子7/8或外显子21杂交的RT-PCR用的引物，能够检测编码包含FGFR2激酶区域的全部的FGFR2融合多肽的多核苷酸的概略图。

图3是表示由人1号染色体和人10号染色体的平衡易位(相互易位)产生的FGFR2基因和AHCYL1基因的融合的概略图。

图4是表示FGFR2蛋白质与AHCYL1蛋白质的融合的概略图。即，是表示FGFR2蛋白质的膜外结构域(IgI～IgIII)、跨膜(TM)结构域及激酶结构域与AHCYL1蛋白质的C末端部分融合的概略图。另外，是表示通过利用与FGFR2基因的激酶区域内的外显子16或外显子18和AHCYL1基因的外显子9或外显子20杂交的RT-PCR用的引物，能够检测编码包含FGFR2激酶区域的全部的FGFR2融合多肽的多核苷酸的概略图。

图5是表示利用FISH法检测本发明的融合基因的方法的概略图。即，是表示对于FGFR2-BICC1融合基因而言，通过在FGFR2基因5’侧及BICC1基因的3’侧分别设计FISH用探针，能够检测FGFR2-BICC1融合基因的存在的概略图。

图6是表示利用FISH法检测本发明的融合基因的方法的概略图。即，是表示对于FGFR2-AHCYL1融合基因而言，通过在FGFR2基因5’侧及AHCYL1基因的3’侧分别设计FISH用探针，能够检测FGFR2-AHCYL1融合基因的存在的概略图。

图7是表示将稳定表达野生型或突变型的FGFR2融合多肽的小鼠正常成纤维细胞株接种于软琼脂培养基上，在显微镜下观察这些细胞株的贴壁非依赖性集落形成的结果的照片。图中，“FGFR2-AHCYL1”表示表达野生型的FGFR2-AHCYL1融合多肽的细胞株的结果，“FGFR2-AHCYL1-KD”表示表达突变型的FGFR2-AHCYL1融合多肽的细胞株的结果，“FGFR2-BICC1”表示表达野生型的FGFR2-BICC1融合多肽的细胞株的结果，“FGFR2-BICC1-KD”表示表达突变型的FGFR2-BICC1融合多肽的细胞株的结果。另外，各杠(bar)表示100μm。

图8是表示将稳定表达野生型或突变型的FGFR2融合多肽的小鼠正常成纤维细胞株接种于软琼脂培养基上，分析这些细胞株的贴壁非依赖性集落形成能力的结果的坐标图。图中，纵轴表示将表达野生型的FGFR2融合多肽的细胞株形成的集落数设为100时的、表达对应的突变型的FGFR2融合多肽的细胞株形成的集落数的相对值。星号表示看到显著性差异(P值为0.05以下)。

图9是表示在添加有FGFR激酶抑制剂(BGJ398或PD173074)的软琼脂培养基上接种稳定表达野生型的FGFR2融合多肽的小鼠正常成纤维细胞株或稳定表达EZR-ROS1融合多肽的小鼠正常成纤维细胞株，分析了这些细胞株的贴壁非依赖性集落形成能力的结果的坐标图。图中，“BGJ”表示BGJ398存在下(培养基中的BGJ398的浓度：0.2nmol/mL)的集落形成的结果，“PD”表示PD173074存在下(培养基中的PD173074的浓度：0.2nmol/mL)的集落形成的结果，“不添加”表示FGFR激酶抑制剂不存在下的集落形成的结果。另外，纵轴表示将在FGFR激酶抑制剂不存在下表达各融合多肽的细胞株形成的集落数设为100时的相对值。星号表示看到显著性差异(P值为0.05以下)。

图10是表示对稳定表达野生型的FGFR2-AHCYL1融合多肽的小鼠正常成纤维细胞株(FGFR2-AH)或稳定表达EZR-ROS1融合多肽的小鼠正常成纤维细胞株(EZR-ROS1)实施血清饥饿处理后，在FGFR激酶抑制剂(BGJ398或PD173074)的存在下进行培养，利用免疫印迹法分析这些细胞中的各种蛋白质的磷酸化的结果的照片。图中，左起第1及第6泳道表示FGFR激酶抑制剂不存在下的培养结果，左起第2及第7泳道表示BGJ398存在下(培养基中的BGJ398的浓度：0.2nmol/mL)的培养的结果，左起第3及第8的泳道表示BGJ398存在下(培养基中的BGJ398的浓度：1.0nmol/mL)的培养结果，左起第4及第9的泳道表示PD173074存在下(培养基中的PD173074的浓度：0.2nmol/mL)的培养结果，左起第5及第10的泳道表示PD173074存在下(培养基中的PD173074的浓度：1.0nmol/mL)的培养结果。另外，由于各融合多肽进一步结合FLAG标签而在细胞内进行表达，因此，图中“FLAG tag”表示通过该标签检测各融合多肽的结果。“p-FGFR(Y653/Y654)”表示检测了被磷酸化的FGFR的结果。“STAT3”及“p-STAT3(Y705)”各自表示检测了STAT3及磷酸化STAT3的结果。“AKT”及“p-AKT(S473)”各自表示检测了AKT及磷酸化AKT的结果。“MAPK”及“p-MAPK(T202/Y204)”各自表示检测了MAPK及磷酸化MAPK的结果。“β-actin”表示作为内部标准各泳道中的蛋白质量一致。

图11是表示将表达野生型或突变型的FGFR2融合多肽的小鼠正常成纤维细胞株移植于免疫缺陷小鼠皮下的结果的照片。图中，“野生型”是将表达野生型的FGFR2融合多肽的细胞株移植于免疫缺陷小鼠的皮下，观察其18天后的该小鼠的照片。三角表示所形成的肿瘤。“8/8”表示将该细胞移植于4只小鼠，每只小鼠2处计8处，在其8处全部看到肿瘤的形成。“突变型”是将表达突变型的FGFR2融合多肽的细胞株移植于免疫缺陷小鼠的皮下，观察其18天后的该小鼠的照片。“0/6”表示将该细胞移植于3只小鼠，每只小鼠2处计6处，在其6处全部没有看到肿瘤的形成。

具体实施方式

＜编码FGFR2蛋白质与其它蛋白质的融合多肽的多核苷酸、由该多核苷酸编码的多肽＞

如后述的实施例中所示，FGFR2基因与其它基因的融合例在本发明中第一次明确。因此，本发明提供一种编码FGFR2蛋白质与其它蛋白质的融合多肽(以下，也称为“FGFR2融合多肽”)的多核苷酸(以下，也称为“FGFR2融合多核苷酸”)。

本发明的“FGFR2融合多肽”是指FGFR2蛋白质的全长或其一部分与其它蛋白质的全长或其一部分融合的多肽。另外，本发明的“FGFR2融合多核苷酸”是指编码FGFR2蛋白质的全长或其一部分的多核苷酸与编码其它蛋白质的全长或其一部分的多核苷酸融合的多核苷酸。

作为FGFR2融合多核苷酸，可列举例如：编码FGFR2蛋白质与BICC1蛋白质的融合多肽(以下，也称为“FGFR2-BICC1融合多肽”)的多核苷酸(以下，也称为“FGFR2-BICC1融合多核苷酸”)、及编码FGFR2蛋白质与AHCYL1蛋白质的融合多肽(以下，也称为“FGFR2-AHCYL1融合多肽”)的多核苷酸(以下，也称为“FGFR2-AHCYL1融合多核苷酸”)。

本发明所述的“FGFR2(成纤维细胞生长因子受体2，FIBROBLASTGROWTH FACTOR RECEPTOR 2)蛋白质”为在人体中定位于10号染色体长臂(10q26)的基因所编码的蛋白质。在本发明中，“FGFR2蛋白质”若为来自人的FGFR2蛋白质，可列举例如：RefSeq ID：NP_000132中规定的蛋白质(亚型1)、RefSeq ID：NP_075259中规定的蛋白质(亚型2)、RefSeq ID：NP_001138385中规定的蛋白质(亚型3)、RefSeq ID：NP_001138386中规定的蛋白质(亚型4)、RefSeq ID：NP_001138387中规定的蛋白质(亚型5)、RefSeq ID：NP_001138388中规定的蛋白质(亚型6)、RefSeq ID：NP_001138389中规定的蛋白质(亚型7)、RefSeq ID：NP_001138390中规定的蛋白质(亚型8)及RefSeq ID：NP_001138391中规定的蛋白质(亚型9)，这些FGFR2蛋白质的蛋白质亚型在膜外结构域的结构(IgI的有无等，参照图2及4)中具有相互稍微不同的结构。另外，在本发明中，“FGFR2蛋白质”若为来自人的FGFR2蛋白质，典型而言，为由序列号：2中记载的氨基酸序列构成的蛋白质(亚型1)。对于编码该蛋白质的多核苷酸典型而言，为由序列号：1中记载的碱基序列构成的多核苷酸。

本发明所述的“BICC1(BICAUDAL C,DROSOPHILA,HOMOLOGOF,1，BICC，果蝇双尾C同源物1)蛋白质”为在人体定位于10号染色体长臂(10q21.1)的基因所编码的蛋白质。在本发明中，“BICC1蛋白质”若为来自人的BICC1蛋白质，典型而言，为由序列号：4中记载的氨基酸序列构成的蛋白质。编码该蛋白质的多核苷酸典型而言，为由序列号：3中记载的碱基序列构成的多核苷酸。

本发明所述的“AHCYL1(S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶样蛋白质1，S-ADENOSYLHOMOCYSTEINE HYDROLASE-LIKE 1，AHCY-LIKE1)蛋白质”也称为IRBIT(与1,4,5-三磷酸肌醇共同释放的1,4,5-三磷酸肌醇受体结合蛋白质，INOSITOL 1,4,5-TRISPHOSPHATERECEPTOR 1-BINDING PROTEIN RELEASED WITH INOSITOL1,4,5-TRISPHOSPHATE，与IP3共同释放的ITPR1结合蛋白质，IRBIT，ITPR1-BINDING PROTEIN RELEASED WITH IP3)或DCAL(树突状细胞表达AHCY样蛋白质，DENDRITIC CELL-EXPRESSEDAHCY-LIKE PROTEIN)，为在人体中定位于1号染色体短臂(1p13.2)的基因所编码的蛋白质。在本发明中，“AHCYL1蛋白质”若为来自人的AHCYL1蛋白质，可列举例如RefSeq ID：NP_006612中规定的蛋白质(亚型a)及RefSeq ID：NP_001229603中规定的蛋白质(亚型b)，AHCYL1蛋白质的亚型a具有与亚型b相比N末端长的特征。另外，在本发明中，“AHCYL1蛋白质”若为来自人的AHCYL1蛋白质，典型而言，为由序列号：6中记载的氨基酸序列构成的蛋白质(亚型a)。编码该蛋白质的多核苷酸典型而言，为由序列号：5中记载的碱基序列构成的多核苷酸。

FGFR2融合多核苷酸典型而言，为编码FGFR2蛋白质的N末端部分与其它蛋白质的C末端部分融合的多肽的多核苷酸。

在本发明中，“FGFR2蛋白质的N末端部分”典型而言包含上述FGFR2蛋白质的膜外结构域、跨膜结构域及激酶结构域(参照图2及4)。

作为本发明的“编码FGFR2蛋白质的N末端部分与BICC1蛋白质的C末端部分融合的多肽的多核苷酸”，典型而言，如图1及5中所示，是通过第10染色体内的倒位而产生的。更具体而言，为编码上述FGFR2蛋白质中由外显子1～19编码的多肽区域(膜外结构域、跨膜结构域及激酶结构域)与上述BICC1蛋白质中由外显子3～21编码的多肽区域融合的多肽(例如为由序列号：8中记载的氨基酸序列构成的多肽)的多核苷酸。这种多核苷酸例如为由序列号：7中记载的碱基序列构成的多核苷酸。

作为本发明的“编码FGFR2蛋白质的N末端部分与AHCYL1蛋白质的C末端部分融合的多肽的多核苷酸”，典型而言，如图3及6中所示，是通过第1号染色体和第10号染色体的相互易位而产生的。更具体而言，为编码上述FGFR2蛋白质中由外显子1～19编码的多肽区域(膜外结构域、跨膜结构域及激酶结构域)与上述AHCYL1蛋白质中由外显子5～20编码的多肽区域融合的多肽(例如为由序列号：10中记载的氨基酸序列构成的多肽)的多核苷酸。这种多核苷酸例如为由序列号：9中记载的碱基序列构成的多核苷酸。

本发明所述的“FGFR2蛋白质”、“BICC1蛋白质”及“AHCYL1蛋白质”的氨基酸序列、以及编码这些蛋白质的基因的碱基序列在自然界中可以(即非人工性地)突变。因此，“FGFR2融合多肽”的氨基酸序列及“FGFR2融合多核苷酸”的碱基序列也在自然界中(即非人工性地)可以突变。另外，这些氨基酸序列或碱基序列也可以人工改变。在本发明中也包含这种突变体。

作为FGFR2-BICC1融合多肽的突变体的一个形态，可列举由在序列号：8中记载的氨基酸序列中1或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列构成的蛋白质。作为FGFR2-AHCYL1融合多肽的突变体的一个形态，可列举由在序列号：10中记载的氨基酸序列中1或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列构成的蛋白质。

在此，“多个”通常为50个氨基酸以内，优选30个氨基酸以内，更优选10个氨基酸以内，特别优选数个氨基酸以内(例如为5个氨基酸以内，3个氨基酸以内，2个氨基酸以内，1个氨基酸)。

作为FGFR2-BICC1融合多肽的突变体的其它形态，可列举与由序列号：7中记载的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的多肽。作为FGFR2-AHCYL1融合多肽的突变体的其它形态，可列举与由序列号：9中记载的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的多肽。

在此，作为高严格性的杂交条件，可列举例如0.2×SSC、65℃这样的条件，作为低严格性的杂交条件，可列举例如2.0×SSC、50℃这样的条件。

作为FGFR2-BICC1融合多肽的突变体的进一步其它形态，可列举由与序列号：8中记载的氨基酸序列具有80％以上(例如85％、90％、95％、97％、99％以上)的相同性的氨基酸序列构成的多肽。作为FGFR2-AHCYL1融合多肽的突变体的进一步其它形态，可列举由与序列号：10中记载的氨基酸序列具有80％以上(例如85％、90％、95％、97％、99％以上)的相同性的氨基酸序列构成的多肽。

在此，序列的相同性可以利用BLASTP(氨基酸水平)的程序(Altschul et al.J.Mol.Biol.,215：403-410,1990)而确定。该程序基于Karlin及Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：2264-2268,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：5873-5877,1993)。在利用BLASTP分析氨基酸序列的情况下，参数设为例如score＝50、wordlength＝3。另外，在使用Gapped BLAST程序分析氨基酸序列的情况下，可以如Altschul等(Nucleic Acids Res.25：3389-3402,1997)中记载的那样进行。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情况下，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法为公知的。

作为FGFR2-BICC1融合多核苷酸的突变体，可列举编码上述FGFR2-BICC1融合多肽的突变体的多核苷酸以及编码不伴有氨基酸突变的同义突变体的多核苷酸。另外，作为FGFR2-AHCYL1融合多核苷酸的突变体，可列举编码上述FGFR2-AHCYL1融合多肽的突变体的多核苷酸以及编码不伴有氨基酸突变的同义突变体的多核苷酸。

在本发明的“FGFR2融合多核苷酸”的形态中包含mRNA、cDNA、基因组DNA等。就“FGFR2融合多核苷酸”而言，只要是本领域技术人员，就能够从由保持FGFR2基因与其它基因的融合基因的胆道癌等制备的cDNA文库或基因组DNA文库中利用公知的杂交技术而分离。另外，也可以通过以由上述胆道癌等制备得到的mRNA、cDNA或基因组DNA为模板利用公知的基因扩增技术(PCR)而扩增、制备。

进而，通过将这样制备的多核苷酸插入适当的表达载体中，将该载体导入无细胞蛋白质合成系统(例如网织红细胞提取液、小麦胚芽提取液)并进行孵育，另外，通过将该载体导入适当的细胞(例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞)中，将得到的转化体进行培养，能够制备FGFR2融合多肽。

需要说明的是，如上所述，本发明的“FGFR2融合多肽”及“FGFR2融合多核苷酸”广义上包含具有天然型的序列的物质(也包含在自然界中产生突变的物质)及人工改变了序列的物质这两者。但是，希望注意的是，在特别是指后述的作为检测对象的“FGFR2融合多肽”及“FGFR2融合多核苷酸”的情况下，主要是指具有天然型的序列的物质(也包含在自然界中产生了突变的物质)。

＜FGFR2融合多肽或FGFR2融合多核苷酸存在或不存在的检测方法＞

本发明还提供一种检测试样中的FGFR2融合多核苷酸或FGFR2融合多肽存在或不存在的方法。本发明的检测方法包括(a)使用于特异性地检测试样中的该多核苷酸或该多肽存在或不存在的药剂与试样接触的工序、及(b)检测该多核苷酸或该多肽存在或不存在的工序。

在本发明中，“试样”不仅包含生物体试样(例如细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、痰、肺胞-气管支清洗液、尿、便)，也包含由这些生物体试样得到的核酸提取物(基因组DNA提取物、mRNA提取物、由mRNA提取物制备的cDNA制备物或cRNA制备物等)或蛋白质提取物。另外，可以对上述试样实施福尔马林固定处理、醇固定处理、冷冻处理或石蜡包埋处理。

进而，就基因组DNA、mRNA、cDNA或蛋白质而言，只要是本领域技术人员，就能够考虑上述试样的种类及状态等选择适于其的公知的方法而制备。

在本发明中，“FGFR2融合多核苷酸或FGFR2融合多肽存在或不存在的检测”可以将编码上述融合多肽的基因组DNA、来自上述基因组DNA的转录产物、来自上述转录产物的翻译产物作为对象而进行。

另外，由于编码FGFR2-BICC1融合多肽的基因组DNA通过第10染色体内的倒位而形成，因此，在“FGFR2-BICC1融合多核苷酸存在或不存在的检测”中，可以检测该倒位这样的现象(参照图1及5)。在所述倒位的检测中，例如，可以检测FGFR2基因的外显子19的编码区域及比该编码区域更靠5’侧的上游区域和FGFR2基因的外显子20的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域的分离，另外，可以检测BICC1基因的外显子2的编码区域及比该编码区域更靠5’侧的上游区域和BICC1基因的外显子3的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域的分离。

另一方面，由于编码FGFR2-AHCYL1融合多肽的基因组DNA是通过第1号染色体和第10号染色体的相互易位而形成的，因此，在“FGFR2-AHCYL1融合多核苷酸存在或不存在的检测”中，可以检测该相互易位这样的现象(参照图3及6)。在所述相互易位的检测中，例如可以检测FGFR2基因的外显子19的编码区域及比该编码区域更靠5’侧的上游区域和FGFR2基因的外显子20的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域的分离，另外，可以检测AHCYL1基因的外显子1a的编码区域及比该编码区域更靠5’侧的上游区域和AHCYL1基因的外显子5的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域的分离。

在本发明中的“FGFR2融合多核苷酸存在或不存在的检测”中可以使用公知的方法。在以“编码上述融合多肽的基因组DNA”为对象的情况下，可以使用例如使用荧光等的原位杂交(ISH)、基因组PCR法、直接测序、DNA印迹法、基因组微阵列分析。另外，在以“来自上述基因组DNA的转录产物”为对象的情况下，可以使用例如RT-PCR法、直接测序、RNA印迹法、斑点印迹法、cDNA微阵列分析。

在原位杂交中，通过使具有至少15个碱基的链长的下述(a)或(b)中记载的多核苷酸与上述生物体试样接触，可以检测编码FGFR2融合多肽的基因组DNA。

(b)作为与编码FGFR2蛋白质的多核苷酸和编码其它蛋白质的多核苷酸的融合点杂交的探针的多核苷酸。

在编码FGFR2融合多肽的基因组DNA的检测中，本发明所述的编码FGFR2蛋白质的多核苷酸若为来自人的多核苷酸，典型而言，为由RefSeq ID：NG-012449中规定的基因组的序列中第1～120129位的DNA序列构成的基因(FGFR2基因)。

另外，本发明所述的编码BICC1蛋白质的多核苷酸若为来自人的多核苷酸，典型而言，为由RefSeq ID：NG-029759中规定的基因组的序列中的第1～315942位的DNA序列构成的基因(BICC1基因)。

另外，本发明所述的编码AHCYL1蛋白质的多核苷酸若为来自人的多核苷酸，典型而言，为由RefSeq ID：NG-029182中规定的基因组的序列中的第1～38979位的DNA序列构成的基因(AHCYL1基因)。

但是，基因的DNA序列通过其突变等，可以在自然界中(即非人工性地)突变。因此，这种天然的突变体也可成为本发明的对象(以下同样)。

本发明的(a)或(b)中记载多核苷酸的长度为至少15个碱基，优选为至少20个碱基，更优选为100～1000个碱基。

本发明的(a)中记载的多核苷酸只要是通过与作为该多核苷酸的标靶碱基序列的、编码FGFR2蛋白质的多核苷酸或编码其它蛋白质的多核苷酸杂交，可以检测上述生物体试样中的编码FGFR2融合多肽的基因组DNA的存在的多核苷酸即可，优选为下述(a1)～(a5)中记载的多核苷酸。

(a1)与FGFR2基因的外显子19的编码区域及比该编码区域更靠5’侧的上游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“5’FGFR2探针”)和与BICC1基因的外显子3的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“3’BICC1探针”)的组合，

(a2)5’FGFR2探针和与AHCYL1基因的外显子5的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“3’AHCYL1探针”)的组合，

(a3)5’FGFR2探针和与FGFR2基因的外显子20的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“3’FGFR2探针”)的组合，

(a4)与BICC1基因的外显子2的编码区域及比该编码区域更靠5’侧的上游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“5’BICC1探针”)和3’BICC1探针的组合，

(a5)与AHCYL1基因的外显子1a的编码区域及比该编码区域更靠5’侧的上游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“5’AHCYL1探针”)和3’AHCYL1探针的组合。

在本发明中，作为用于原位杂交的上述(a1)或(a2)中记载的多核苷酸杂交的区域(标靶碱基序列)，从对于标靶碱基序列的特异性及检测灵敏度的观点出发，优选为距离编码FGFR2蛋白质的多核苷酸与编码其它蛋白质的多核苷酸的融合点1000000个碱基以内的区域，另外，作为用于原位杂交的上述(a3)～(a5)中记载的多核苷酸杂交的区域，从相同观点出发，优选为距离编码FGFR2蛋白质的多核苷酸、编码BICC1蛋白质的多核苷酸或编码AHCYL1蛋白质的多核苷酸中的切断点1000000个碱基以内的区域。

另外，在本发明中，在原位杂交中使用的上述(b)中记载的多核苷酸，只要是通过与作为该多核苷酸的标靶碱基序列的、编码FGFR2蛋白质的多核苷酸与编码其它蛋白质的多核苷酸的融合点杂交，可以检测上述生物体试样中的编码FGFR2融合多肽的基因组DNA的存在的多核苷酸即可，作为典型例，为与编码由序列号：7或9中记载的碱基序列构成的多核苷酸的基因组DNA杂交的多核苷酸，例如与编码FGFR2蛋白质的多核苷酸和编码其它蛋白质的多核苷酸的融合点杂交的多核苷酸。

另外，在本发明中，从进一步提高对于标靶碱基序列的特异性及检测灵敏度的观点出发，用于原位杂交的(a)或(b)中记载的多核苷酸优选为可以覆盖上述标靶碱基序列整体的、由多种多核苷酸构成的集团。在该情况下，构成该集团的多核苷酸的长度为至少15个碱基，优选为至少20个碱基，更优选为100～1000个碱基。

用于原位杂交的上述(a)或(b)中记载的多核苷酸，为了检测，优选利用荧光色素等进行标记。作为该荧光色素，可列举例如DEAC、FITC、R6G、TexRed、Cy5，但并不限制于这些。另外，除荧光色素以外，可以利用DAB等色素(chromogen)或基于酶催化金属沉积而利用银等标记上述多核苷酸。

在原位杂交中，优选用相互不同的色素标记对于编码FGFR2蛋白质的多核苷酸的探针和对于编码其它蛋白质的多核苷酸的探针。当使用用不同的色素标记的上述(a1)或(a2)的探针的组合进行原位杂交，当观察到各探针的标记发出的信号的重叠时，可以判定为能够检测编码FGFR2融合多肽的基因组DNA。另一方面，使用以不同的色素标记的上述(a3)～(a5)中任一个探针的组合进行原位杂交，当观察到各探针的标记发出的信号分离时，可以判定能够检测编码FGFR2融合多肽的基因组DNA。

需要说明的是，多核苷酸的标记可以利用公知的方法来进行。例如，可以利用切口平移法或随机引物法将利用荧光色素等标记的基质碱基摄入多核苷酸中，标记该多核苷酸。

在原位杂交中，使上述(a)或(b)中记载的多核苷酸与上述生物体试样接触时的条件可以根据该多核苷酸的长度等各种因素而变动，作为高严格性的条件，可列举例如0.2×SSC、65℃这样的条件，作为低严格性的条件，可列举例如2.0×SSC、50℃这样的条件。需要说明的是，只要是本领域技术人员，除了盐浓度(SSC的稀释率等)和温度之外，能够通过适当选择例如表面活性剂(NP-40等)的浓度、甲酰胺的浓度、pH等各种条件而实现与上述条件同样严格的条件。

作为使用上述(a)或(b)中记载的多核苷酸检测编码FGFR2融合多肽的基因组DNA的方法，除上述原位杂交以外，可列举DNA印迹法、RNA印迹法及斑点印迹。在这些方法中，通过使上述(a)或(b)中记载的多核苷酸与转印有由上述生物体试样得到的核酸提取物的薄膜杂交，检测上述融合基因。在使用上述(a)的多核苷酸的情况下，当与编码FGFR2蛋白质的多核苷酸杂交的多核苷酸和与编码其它蛋白质的多核苷酸杂交的多核苷酸作为在薄膜中展开的相同条带而被识别时，可以判定为能够检测编码FGFR2融合多肽的基因组DNA。

作为使用上述(b)的多核苷酸检测编码FGFR2融合多肽的基因组DNA的方法，还可以列举基因组微阵列分析或DNA微阵列分析。在这些方法中，制作将上述(b)的多核苷酸固定于基板上的阵列，使上述生物体试样与该阵列上的多核苷酸接触，由此检测该基因组DNA。

在PCR或测序中，为了以由上述生物体试样制备的DNA(基因组DNA、cDNA)或RNA为模板特异性地扩增FGFR2融合多核苷酸的一部分或全部，可以使用下述(c)的多核苷酸。

(c)作为以夹有编码FGFR2蛋白质的多核苷酸和编码其它蛋白质的多核苷酸的融合点的方式设计的一对引物的多核苷酸。

“作为一对引物的多核苷酸”为在成为标靶的上述融合多核苷酸等中，一个引物与FGFR2基因区域杂交，另一个引物与其它基因区域杂交的引物组。这些多核苷酸的长度通常为15～100个碱基，优选为17～30个碱基。

另外，从利用PCR法的检测精度或灵敏度的观点出发，本发明的(c)中记载的多核苷酸优选为与距离编码FGFR2蛋白质的多核苷酸和编码其它蛋白质的多核苷酸的融合点5000个碱基内的上述融合多核苷酸的碱基序列互补的序列。

“作为一对引物的多核苷酸”可以基于成为标靶的FGFR2融合多核苷酸等的碱基序列利用公知的方法适当设计。作为公知的方法，可列举例如利用Primer Express软件(注册商标，ABI公司制)的方法。

“作为一对引物的多核苷酸”的优选的实例，优选为下述(c1)及(c2)中记载的多核苷酸。

(c1)与FGFR2基因的外显子19的编码区域及比该编码区域更靠5’侧的上游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“5’FGFR2引物”)和与BICC1基因的外显子3的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“3’BICC1引物”)的组合，

(c2)5’FGFR2引物和与AHCYL1基因的外显子5的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域杂交的多核苷酸(以下，也称为“3’AHCYL1引物”)的组合。

例如，在FGFR2-BICC1融合多核苷酸的检测中，通过对FGFR2基因的激酶区域内的外显子16或外显子18、BICC1基因的外显子7/8或外显子21设计引物，可以检测包含FGFR2激酶区域的全部的变异型、即在膜外结构(IgI的有无等)中具有相互不同的结构的FGFR2基因亚型1～9与BICC1基因的融合基因(参照图2)。另外，在FGFR2-AHCYL1融合多核苷酸的检测中，通过对FGFR2基因的激酶区域内的外显子16或外显子18、AHCYL1基因的外显子9或外显子20设计引物，可以检测包含FGFR2激酶区域的全部的变异型、即在膜外结构中具有相互不同的结构的FGFR2基因亚型1～9与N末端部分的长度不同的AHCYL1基因亚型a及b的融合基因(参照图4)。

在本发明中，作为检测FGFR2融合多核苷酸的翻译产物的方法，可列举例如：免疫染色法、免疫印迹法、ELISA法、流式细胞法、免疫沉降法、抗体阵列分析。在这些方法中，可使用与FGFR2融合多肽结合的抗体。作为该抗体，可列举例如：对含有FGFR2蛋白质与其它蛋白质的融合点的多肽特异性的抗体(以下，也称为“融合点特异性抗体”)、与由比FGFR2蛋白质的上述融合点更靠N末端侧的区域构成的多肽结合的抗体(以下，也称为“FGFR2-N末抗体”)、与由比其它蛋白质的上述融合点更靠C末端侧的区域构成的多肽结合的抗体(以下，也称为“其它蛋白质-C末抗体”)。在此，“融合点特异性抗体”是指与含有上述融合点的多肽特异性地结合、但与野生型(正常型)的FGFR2蛋白质及野生型(正常型)的其它蛋白质均不结合的抗体。

FGFR2融合多肽可以通过上述融合点特异性抗体来检测，还可以通过上述FGFR2-N末抗体和上述其它蛋白质-C末抗体的组合来检测。

就“与FGFR2融合多肽结合的抗体”而言，只要是本领域技术人员，就可以选择适当公知的方法而制备。作为该公知的方法，可列举：将由上述其它蛋白质的C末端部分构成的多肽、FGFR2融合多肽、由上述FGFR2蛋白质的N末端部分构成的多肽等接种于免疫动物，使该动物的免疫系统活化之后，回收该动物的血清(多克隆抗体)的方法；或杂种瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法等单克隆抗体的制作方法。如果使用结合有标记物质的抗体，则通过检测该标记，就可以直接检测标靶蛋白质。作为标记物质，只要为可以与抗体结合、可以检测的物质，就没有特别限制，可列举例如：过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、微过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明异硫氰酸盐(RITC)、碱性磷酸酶、生物素及放射性物质。进而，除使用结合有标记物质的抗体直接检测标靶蛋白质的方法以外，也可以利用使用结合有标记物质的二次抗体、蛋白G或蛋白A等间接地检测标靶蛋白质的方法。

＜利用FGFR2抑制剂判定癌治疗的有效性的方法＞

如后述的实施例中所示，FGFR2基因与其它基因的融合认为导致FGFR2蛋白质的活化，有助于癌的恶化等。因此，在被检出有这种融合的癌患者中，利用FGFR2抑制剂的治疗为有效的可能性高。

因此，本发明提供一种利用FGFR2抑制剂判定癌治疗的有效性的方法，其包括检测从患者中分离的试样中的FGFR2融合多核苷酸或FGFR2融合多肽存在或不存在的工序，如果检测出上述多核苷酸或上述多肽的存在，则判定为上述患者利用上述FGFR2抑制剂的癌治疗有效性高。

在本发明中，“患者”不仅为患有癌的人，也可以为怀疑患有癌的人。作为成为适用本发明的方法的对象的“癌”，只要是看到FGFR2融合基因的表达的癌，就没有特别限制。优选为胆道癌。来自患者的生物体试样的采取可以根据生物体试样的种类利用公知的方法来进行。

在本发明中，作为成为评价癌治疗的有效性的对象的“FGFR2抑制剂”，若为可以直接地或间接地抑制FGFR2蛋白质的功能的物质，就没有特别限制。作为可以适用于本发明的公知的FGFR2抑制剂，可列举：3-[2,4-二甲基-5-[[(Z)-2,3-二氢-2-氧代-1H-吲哚-3-亚基]甲基]-1H-吡咯-3-基]丙酸(例如SU6668(一般名称：orantinib))、N-{5-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙基]-1H-吡唑-3-基}-4-[(3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺(例如AZD4547)、1-[(2R,4S,5S)-4-叠氮-5-(羟甲基)氧杂环戊-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮(例如DS4152(一般名称：替可加兰钠(tecogalan sodium))、FGFR2-IIIb特异性抗体(例如AV369b)、3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-[6-[[4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯基]氨基]嘧啶-4-基]-1-甲基脲(例如BGJ398)、(S)-(R)-1-((4-((4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基)氧基)-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基)氧基)丙烷-2-基2-氨基丙酸(例如BMS-582664(一般名称：丙氨酸布立尼布(brivanibalaninate))、N-[2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N’-(1,1-二甲基乙基)-脲(例如PD173074)。

“试样”的定义、从试样提取DNA或RNA等的方法、FGFR2融合多核苷酸及FGFR2融合多肽存在或不存在的检测方法等如上所述。

在利用本发明的方法检测出从患者中分离的试样中存在FGFR2融合多核苷酸或FGFR2融合多肽的情况下，该患者被判定为利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性高，另一方面，没有检测出该多核苷酸或该多肽的存在的情况下，该患者被判定为利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性低。

＜用于检测FGFR2融合多核苷酸或FGFR2融合多肽存在或不存在的药剂、以及用于判定利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性的药剂＞

如上所述，具有至少15个碱基的链长的、作为下述(a)～(c)中记载的任一种的多核苷酸可以优选用于FGFR2融合多核苷酸存在或不存在的检测。因此，另外也可以优选用于利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性的判定。

(a)作为选自与编码FGFR2蛋白质的多核苷酸杂交的探针和与编码其它蛋白质的多核苷酸杂交的探针中的至少一个探针的多核苷酸

(b)作为与编码FGFR2蛋白质的多核苷酸和编码其它蛋白质的多核苷酸的融合点杂交的探针的多核苷酸

(c)作为以夹有编码FGFR2蛋白质的多核苷酸和编码其它蛋白质的多核苷酸的融合点的方式设计的一对引物的多核苷酸

这些多核苷酸具有与标靶基因的规定的碱基序列互补的碱基序列。在此，所谓“互补”，只要可以杂交，择可以不是完全互补。这些多核苷酸相对于该规定的碱基序列通常具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的相同性。

需要说明的是，(a)～(c)的多核苷酸可以为DNA，也可以为RNA，另外，可以为在其一部分或全部中利用PNA(polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged NucleicAcid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2’-O,4’-C-Ethylene-bridged nucleicacid)、GNA(Glycerol nucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleicacid，苏糖核酸)等人工核酸取代核苷酸的多核苷酸。

另外，如上所述，与FGFR2融合多肽结合的抗体可以优选用于FGFR2融合多核苷酸的翻译产物(FGFR2融合多肽)的检测。

在本发明的药剂中，除作为有效成分的上述物质(多核苷酸、抗体)之外，还可以含有药理学上可接受的其它成分。作为这种其它成分，可列举例如缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、藻酸钠、黄蓍胶等。作为悬浮剂，可以使用单硬脂酸甘油、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、十二烷基硫酸钠等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、二亚乙基亚硫酸盐、抗坏血酸等。作为防腐剂，可以使用叠氮钠、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

另外，除含有多核苷酸或抗体的标准品之外，也可以将多核苷酸或抗体上附加的标记的检测所需要的底物、阳性对照(例如FGFR2融合多核苷酸、FGFR2融合多肽、或保持它们的细胞等)或阴性对照、原位杂交等中使用的对比染色用试剂(DAPI等)、抗体的检测中需要的分子(例如二次抗体、蛋白G、蛋白A)、用于试样的稀释或清洗的缓冲液等的标准品组合，做成用于本发明的方法的试剂盒。在该试剂盒中可以含有该试剂盒的使用说明书。本发明也提供用于上述本发明的方法的试剂盒。

＜治疗癌的方法、癌的治疗剂＞

如上所述，利用本发明的方法检测出FGFR2融合多核苷酸或FGFR2融合多肽存在的患者认为是利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性高。因此，通过对癌患者中的保持有FGFR2融合基因的患者选择性地投与FGFR2抑制剂，可以有效地进行癌的治疗。因此，本发明提供一种治疗癌的方法，其包括对利用上述本发明的方法判定为利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性高的患者投与上述FGFR2抑制剂的工序。

另外，本发明提供一种以FGFR2抑制剂为有效成分的癌的治疗剂，对通过上述本发明的方法判定为利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性高的患者投与。

作为“FGFR2抑制剂”，如上所述，只要是可以直接地或间接地抑制FGFR2蛋白质的功能的物质，就没有特别限制。作为可以适用于本发明的公知的FGFR2抑制剂的实例，如上所述。

向患者投与FGFR2抑制剂的方法根据该抑制剂的种类或癌的种类等适当选择，可以采用例如口服、静脉内、腹腔内、经皮、肌肉内、气管内(气溶胶)、直肠内、阴道内等给药方式。

实施例

以下，基于实施例对本发明更具体地进行说明，但本发明并不限定于以下的实施例。

＜实验材料＞

以KRAS/BRAF突变阴性的胆道癌手术切除冷冻标本(肿瘤组织)8病例为研究对象。另外，作为阴性对照，正常组织(含有胆管上皮的肝脏组织)也与该肿瘤组织同样地用以下的方法进行处理并分析。

＜RNA提取＞

将在液氮内冷冻保存的肿瘤组织用cryoPREP(制品名：CP02，Covaris公司制)进行粉碎。接着，从被粉碎的肿瘤组织中，使用总RNA纯化用试剂盒(制品名：RNAeasy，QIAGEN公司制)提取总RNA。

＜RNA序列＞

使用上述制备的总RNA 2μg，利用mRNAseq样品制备试剂盒(Illumina公司制)进行文库的合成。即，首先，将2μg的总RNA在94℃处理5分钟，片段化之后，进行cDNA合成。接着，在得到的cDNA的两端结合测序用的接头，然后在琼脂糖凝胶中电泳并纯化。进而，以纯化的cDNA为模板进行PCR，制作了300个碱基长度的文库。将制作的cDNA文库使用高效测序仪(GA2X，Illumina公司制)，将其两端50bp进行测序解读。

＜序列信息的分析＞

从得到的序列信息中除外由PCR得到的重复克隆后，使用Bowtie软件在已知的数据库(Refseq及Ensemble)中映射，提取两端的序列为来自不同的基因的序列的物质(参照Kohno T.等，Nature Med，2012年，18卷，375～377页)。

＜利用RT-PCR及链终止法的确认＞

由用于RNA测序的相同的总RNA重新使用逆转录酶(SuperScriptIII First-Strand Synthesis System，Invitrogen公司制)合成cDNA。以得到的序列为基础，合成PCR引物，使用ExTaq HS(Takara公司制)进行PCR，然后通过电泳确认PCR产物。进而，从琼脂糖凝胶中提取PCR产物，使用同引物、BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit(Biosystems公司制)及ABI 3730测序仪，利用链终止法进行测序分析。进而，由得到的结果确认融合基因的融合点和阅读框。逆转录反应及PCR反应的条件如下所述。

＜逆转录反应＞

首先，在上述总RNA 5μg(8μL)中混合随机六聚物引物(50ng/μL)1μL和10mM dNTP混合物1μL，在65℃下反应5分钟，在冰上进行骤冷。接着，按顺序添加10×RT缓冲液2μL、25mM MgCl₂ 4μL、0.1M DTT2μL、RNaseOUT(40U/μL)1μL和SuperScript III RT(200U/μL)1μL。进而，以25℃ 10分钟、50℃ 50分钟、85℃ 5分钟、4℃ 5分钟的条件进行逆转录反应。接着，在得到的逆转录产物中添加RNaseH 1μL，在37℃下用20分钟将总RNA消化之后，在使用前保存于－20℃。

＜PCR反应＞

将上述制备的第一链cDNA 2μL、10×ExTaq缓冲液1μL、2.5mMdNTPs 1.2μL、H₂O 4.7μL、ExTaq HS 0.1μL和2μM CF/CR混合引物1μL进行混合，首先在95℃下3分钟，接着以94℃ 30秒、58℃ 30秒及72℃30秒的反应循环重复35个循环后，在72℃下反应5分钟。

(实施例1)

[利用RNA测序的新型激酶融合基因的鉴定]

从8病例的KRAS/BRAF阴性胆道癌临床检体中将由PCR得到的重复克隆除外后，各自得到了5.2×10⁷以上的成对碱基序列。将这些成对碱基序列参照现有基因数据库，结果，如图2及4所示，检测出了FGFR2基因与BICC1基因的融合基因(以下，也称为“FGFR2-BICC1融合基因”)、FGFR2基因与AHCYL1基因的融合基因(以下，也称为“FGFR2-AHCYL1融合基因”)这2种融合基因候补各1例。

[利用RT-PCR及链终止法测序的确认]

接着，使用相同检体利用RT-PCR和链终止法测序进行了融合基因的验证。其结果得知，在RT-PCR中，对上述2种的任一种融合基因而言，病例特异性扩增，即，仅在胆道癌中，这些融合基因进行表达，在正常组织(含有胆管上皮的肝脏组织)中，这些融合基因没有表达。

进而，通过将得到的PCR产物进行测序分析，得知在任一种融合基因中，其阅读框没有发生移位，2个基因发生融合。

即，得知：在FGFR2基因和BICC1基因的融合基因中，如图2及序列号：7所示，通过FGFR2基因(亚型1)的外显子19(由序列号：1或7的2843～2948位中记载的碱基序列构成的多核苷酸)与BICC1基因的外显子3(由序列号：3的238～307位中记载的碱基序列构成的多核苷酸)直接结合，在这些基因的阅读框中不产生位移而融合。

另外得知：在FGFR2基因和AHCYL1基因的融合基因中，如图4及序列号：9所示，通过FGFR2基因(亚型1)的外显子19(由序列号：1或7的2843～2948位中记载的碱基序列构成的多核苷酸)与AHCYL1基因(亚型a)的外显子5(由序列号：5的410～521位中记载的碱基序列构成的多核苷酸)直接结合，在这些基因的阅读框中不产生位移而融合。

因此，由以上的结果得知：胆道癌等癌细胞特异性地发生10号染色体内的倒位，由此产生FGFR2基因与BICC1基因的融合，另外，发生1号染色体与10号染色体的相互易位，由此产生FGFR2基因与AHCYL1基因的融合。

(实施例2)

[对FGFR2融合基因的出现频率的分析]

对上述中得知的癌细胞特异性融合基因FGFR2-AHCYL1融合基因及FGFR2-BICC1融合基因分析各自的出现频率。即，对来自胆道癌患者的癌组织102例，利用上述RT-PCR分析各融合基因的出现频率。

其结果，胆道癌102例中，FGFR2基因与AHCYL1基因的融合例看到7例(出现频率：约6.9％)，FGFR2基因与BICC1基因的融合例看到2例(出现频率：约2.0％)。

(实施例3)

[关于FGFR2融合多肽的功能、以及FGFR激酶抑制剂对表达该多肽的癌细胞的有效性的分析]

认为上述基因融合导致FGFR2蛋白质的活化，并进而通过该活化，其下游的信号也被活化，细胞癌化。因此认为，对于产生这种活化的患者，FGFR2抑制剂在治疗中显示有效性。因此，为了对这些方面进行确认，如以下所示，适当按照常规方法对FGFR2融合基因进行分析。

首先，在由来自胆道癌患者的癌组织得到的FGFR2融合基因的cDNA(FGFR2-AHCYL1融合基因的cDNA或FGFR2-BICC1融合基因的cDNA)的5’侧，将编码FLAG表位标签的cDNA以符合翻译的阅读框的方式连结，克隆入pMXs逆转录病毒载体。

另外，在该载体中导入部位特异性的突变，也制作了编码FGFR2激酶部位内的2个氨基酸被取代的激酶活性突变体(KD突变型FGFR2融合多肽：Y568F/Y569F)的载体。

接着，将这样制备得到的逆转录病毒载体分别转染小鼠正常成纤维细胞株NIH-3T3细胞，得到了稳定表达野生型或突变型的FGFR2融合多肽的细胞株。

另外，对于在肺癌中被检测的酪氨酸激酶融合基因(EZR基因与ROS1基因的融合基因，以下也称为“EZR-ROS1融合基因”)，也与上述同样地制作编码该基因的逆转录病毒载体，转染NIH-3T3细胞，制备了稳定表达EZR-ROS1融合多肽的细胞株。进而，以该细胞株为对照组，供于以下所示的实验。

将稳定表达野生型或突变型的FGFR2融合多肽的上述细胞株接种于软琼脂培养基(培养基中的琼脂浓度：4mg/mL，以下相同)，评价这些细胞株的贴壁非依赖性集落形成能力，由此，研究FGFR2融合多肽的转化能。将得到的结果示于图7及8。

另外，在添加有低分子FGFR激酶抑制剂(BGJ398或PD173074)的软琼脂培养基上接种稳定表达野生型的FGFR2融合多肽的上述细胞株或稳定表达EZR-ROS1融合多肽的上述细胞株，通过评价这些细胞株的贴壁非依赖性集落形成能力，研究FGFR激酶抑制剂对于FGFR2融合多肽的转化的效果。将得到的结果示于图9。

进而，将稳定表达野生型的FGFR2-AHCYL1融合多肽的上述细胞株或稳定表达EZR-ROS1融合多肽的上述细胞株在液体培养基中进行培养，实施血清饥饿处理之后，更换添加有FGFR激酶抑制剂(BGJ398或PD173074)的液体培养基进行培养。进而，从这样得到的各细胞株中提取蛋白质，使用有针对各种磷酸化蛋白质或非磷酸化蛋白质的抗体进行免疫印迹分析，由此，对FGFR2融合多肽的下游的信号进行分析。将得到的结果示于图10。

另外，将稳定表达野生型或突变型的FGFR2融合多肽的上述细胞株在免疫缺陷小鼠(BALB/c-nu/nu)的皮下每1处移植1×10⁶个细胞，研究这些表达FGFR2融合多肽的细胞的体内成瘤能力。将得到的结果示于图11。

由图7及8所示的结果得知：通过FGFR2融合多肽的表达，NIH-3T3细胞显示贴壁非依赖性的集落形成。另一方面，得知通过将FGFR2蛋白质的激酶活性失活，由FGFR2融合多肽获得的贴壁非依赖性集落形成能力被显著地抑制。

进而也得知，如图9所示，所述的由FGFR2融合多肽获得的贴壁非依赖性集落形成能力被FGFR激酶抑制剂显著地抑制。

另外，由图10所示的结果得知，通过FGFR2融合多肽的表达，在NIH-3T3细胞中看到FGFR激酶结构域的强磷酸化(参照图10的p-FGFR(Y653/Y654)的右起第5条泳道)。进而也得知，该磷酸化通过FGFR激酶抑制剂处理而被显著地抑制(参照图10的p-FGFR(Y653/Y654)的右起第1～4条泳道)。

另外得知，如图10所示，MAPK的磷酸化由FGFR2融合多肽强烈引起，但该磷酸化也通过FGFR激酶抑制剂处理而显著地得到抑制(参照图10的p-MAPK(T202/Y204)的右起第5条及第1～4条泳道)。需要说明的是，没有看到FGFR2融合多肽的表达引起的AKT及STAT3的磷酸化的亢进。

另外，如图11所示，将表达野生型的FGFR2融合多肽的NIH-3T3细胞移植于免疫缺陷小鼠的皮下，结果，在该移植后14天以内观察到肿瘤形成。另一方面，将表达突变型的FGFR2融合多肽的NIH-3T3细胞移植于免疫缺陷小鼠的皮下，但在该移植后至30天的观察中不能完全确认肿瘤形成。

因此得知，FGFR2融合基因具有转化能并作为癌基因起作用，进而在该转化中，需要FGFR2激酶活性的活化。

另外也得知，该FGFR2融合多肽引起的转化能能够通过利用FGFR激酶抑制剂抑制该融合多肽中的FGFR2激酶的活化或作为其下游的信号的MAPK的活化而得到抑制。

产业上的可利用性

如以上说明的那样，根据本发明，可以检测编码FGFR2蛋白质与其它蛋白质的融合多肽的多核苷酸和其表达产物，进而，通过该检测，可以预测利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性。如上所述，FGFR2基因与其它基因的框内融合发生于多个病例中，该融合导致FGFR2的活化，进而使细胞癌化。进而，如上述中所证实的那样，该FGFR2的活化及癌化可以被FGFR2抑制剂显著地抑制。因此，FGFR2与其它基因的融合可成为FGFR2抑制剂的标靶，因此，本发明在提高癌治疗的效率上是非常有用的。

Claims

1.一种多核苷酸，其特征在于：

其为编码FGFR2蛋白质与其它蛋白质融合的多肽的多核苷酸，其编码在癌细胞中表达的多肽。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于：

其它蛋白质为BICC1蛋白质或AHCYL1蛋白质。

3.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于：

癌细胞为胆道癌细胞。

4.一种由权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸编码的多肽。

5.一种检测试样中的权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸或权利要求4所述的多肽存在或不存在的方法，其特征在于，包括：

(b)检测该多核苷酸或该多肽存在或不存在的工序。

6.一种药剂，其用于利用权利要求5所述的方法检测试样中的权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸或权利要求4所述的多肽存在或不存在，所述药剂的特征在于：

其包含具有至少15个碱基的链长的下述(a)～(c)中任一项所述的多核苷酸或下述(d)所述的抗体，

(d)与FGFR2蛋白质和其它蛋白质融合的多肽结合的抗体。

7.一种判定利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性的方法，其特征在于：

包括检测从患者分离的试样中的权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸或权利要求4所述的多肽存在或不存在的工序，如果检测出所述多核苷酸或所述多肽存在，则判定为所述患者利用所述FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性高。

8.一种药剂，其用于利用权利要求7所述的方法判定利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性，所述药剂的特征在于：

(d)与FGFR2蛋白质和其它蛋白质融合的多肽结合的抗体。

9.一种治疗癌的方法，其特征在于：

包括对利用权利要求7所述的方法判定为利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性高的患者投与所述FGFR2抑制剂的工序。

10.一种治疗剂，其特征在于：

其为以FGFR2抑制剂为有效成分的癌的治疗剂，对利用权利要求7所述的方法判定为利用FGFR2抑制剂的癌治疗的有效性高的患者投与。