JPWO2014007369A1 - Ｆｇｆｒ２融合遺伝子 - Google Patents

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Abstract

がんにおいて薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる遺伝子を同定し、当該遺伝子を標的として薬剤による治療の有効性を予測する新規な方法を提供することを目的として、胆道がんのトランスクリプトームシークエンシングを行った。その結果、ＦＧＦＲ２遺伝子と他の遺伝子（ＢＩＣＣ１遺伝子又はＡＨＣＹＬ１遺伝子）とのインフレーム融合転写産物を同定した。また、当該遺伝子融合は、ＦＧＦＲ２タンパク質の活性化をもたらし、細胞をがん化させることも見出した。さらに、ＦＧＦＲ２阻害剤によって、前記遺伝子融合によるＦＧＦＲ２タンパク質の活性化及びがん化を抑制できることも実証し、前記遺伝子融合が検出される患者に対しては、ＦＧＦＲ２阻害剤による治療が有効であることを見出した。

Description

本発明は、ＦＧＦＲ２融合遺伝子に関し、より詳しくは、ＦＧＦＲ２タンパク質と他のタンパク質との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、及び、該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドを検出する方法に関する。また、本発明は、該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドを標的としたＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法に関する。さらに、本発明は、この有効性の判定を利用したがんの治療方法に関する。また、本発明は、これらの方法に用いるための薬剤にも関する。
胆道がんは、肝臓内（肝内胆道がん）及び肝臓外（肝外胆道がん）の胆管上皮細胞から発生する非常に浸潤性の高いがんである。東アジアを中心に発生頻度が高いが、近年欧米を含めて全世界的に発生頻度が増加している。発症早期の臨床症状に乏しいことから多くの症例では進行期で発見されることが多く、その予後は不良である。手術切除が唯一の完全治癒治療であるが、再発率が高く、５年生存率は手術可能症例の１５〜２５％である。手術不能例あるいは再発症例に対して、既存の化学療法で明らかな著効を示すものは知られていないが、最近、塩酸ゲムシタビン単独あるいは塩酸ゲムシタビンとプラチナ製剤との併用が他の化学療法と比較してやや有効な成績を示すという報告がある。従って、胆道がんに対し、分子標的治療を含む新たな有効な治療法が強く求められており、これまでに分子標的の候補としてＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ｃ−ＭＥＴといったものが報告されている。
胆道がんにおけるドライバー変異としては、ＫＲＡＳ及びＢＲＡＦ遺伝子変異が報告されており、また最近チロシンキナーゼの融合遺伝子として脳腫瘍で同定されたＧＯＰＣ−ＲＯＳ１が胆道がんでも報告された。これらの異常が見られない症例におけるドライバー変異は未同定のままである。
ＦＧＦＲ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：繊維芽細胞増殖因子受容体）ファミリーはＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：繊維芽細胞増殖因子）の受容体として機能する膜貫通型チロシンキナーゼ分子の総称である。ＦＧＦＲファミリーに属する分子は、ヒトではＦＧＦＲ１〜４の４種類が知られている。細胞外領域に３つのＩｇ−ｌｉｋｅ（イムノグロブロン様）領域、１カ所の膜貫通領域、細胞内領域にチロシンキナーゼ領域を有する。ＦＧＦＲファミリーは、胃がん、乳がん、子宮がん、膀胱がんを含む多くのがんの発生や進展に寄与していることが知られており、がんにおいて様々な種類のゲノム異常による活性化を起こしていることが報告されている（非特許文献１）。
例えば、ＦＧＦＲ１に関しては、乳がんや卵巣がんにおいて遺伝子増幅が、メラノーマにおいて遺伝子変異が、白血病や乳がんにおいて遺伝子転座が生じることが知られている。また、ＦＧＦＲ２に関しては、胃がんや乳がんにおいて遺伝子増幅が、子宮がんや胃がんにおいて遺伝子変異が生じることが知られている。また、ＦＧＦＲ３に関しては、膀胱がんや唾液腺がんにおいて遺伝子増幅が、膀胱がん、子宮がん、ミエローマ、及び前立腺がんにおいて遺伝子変異が生じることが知られている。
ＦＧＦＲが関与する融合遺伝子に関しては、これまでＦＧＦＲ１でのみ報告があり多くは血液腫瘍で同定されている。血液腫瘍ではＦＧＦＲ１ＯＰ２−ＦＧＦＲ１（非特許文献２）、ＺＮＦ１９８−ＦＧＦＲ１（非特許文献３）といったものが報告され、固形がんでは、乳がんにおいてＦＧＦＲ１−ＺＮＦ７０３（非特許文献４）が報告されている。胆道がんにおけるＦＧＦＲシグナルの異常に関しては、そのリガンドであるＦＧＦの発現が文献的に報告されている（非特許文献５）。
ＦＧＦＲを標的とした低分子阻害化合物としては、現在、ＡＺＤ４５４７、ＴＫＩ２５８、Ｅ３８１０、Ｅ７０８０、ＢＩＢＦ１１２０、Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ、ＢＧＪ３９８といったものについて臨床開発が進められている。またＦＧＦＲを標的とした抗体治療薬の開発も現在進行中である（非特許文献１）。
一方、ＢＩＣＣ１タンパク質は、ＲＮＡ結合領域及びタンパク質相互作用に関与するＳＡＭ（ステライル（ｓｔｅｒｉｌｅ）αモチーフ）領域を有する分子であり、Ｗｎｔ経路を負に制御する。また、このタンパク質の機能異常により、腎多発嚢胞と膵臓発生異常とを来すことが報告されている（非特許文献６）。また、ＡＨＣＹＬ１タンパク質は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素と類似した領域を有し、上皮細胞における分泌に関与していることが知られている（非特許文献７）。
しかしながら、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＢＩＣＣ１遺伝子及びＡＨＣＹＬ１遺伝子、これらいずれの遺伝子が関与する融合遺伝子の存在、並びにかかる融合遺伝子とがんとの関連性の有無については、明らかになっていなかった。また、胆道がんを含めたがんにおける融合遺伝子等の解明はいまだ十分とはいえず、薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる変異遺伝子や融合遺伝子の同定が望まれているのが現状である。
Ａｈｍａｄ Ｉ.ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．、２０１２年、１８２３巻、８５０〜８６０ページ Ｐｏｐｏｖｉｃｉ Ｃ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１９９９年、９３巻、１３８１〜１３８９ページ Ｘｉａｏ Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、１９９８年、１８巻、８４〜８７ページ 「がんにおける体細胞変異の一覧（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ） 転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ） 遺伝子（Ｇｅｎｅｓ）：ＦＧＦＲ１ ＺＮＦ７０３」、［ｏｎｌｉｎｅ］、最終更新日：２０１１年９月２８日、英国ウェルカム・トラスト サンガー研究所、インターネット〈ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｐｅｒｌ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／ｃｏｓｍｉｃ？ａｃｔｉｏｎ＝ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ＆ｉｄ＝１７４＆ｆｕｓｅｄ＝５９５３６〉 Ｏｇａｓａｗａｒａ Ｓ.ら、Ｈｅｐａｔｏｌ Ｒｅｓ．、２００１年、２０巻、９７〜１１３ページ Ｋｒａｕｓ ＭＲ．ら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．、２０１２年、３３巻、８６〜９０ページ Ｙａｎｇ Ｄ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、２０１１年、１２１巻、９５６〜９６５ページ
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、胆道がん等において薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる遺伝子を同定することにある。また、当該遺伝子やその発現産物を標的として薬剤による治療の有効性を予測する新規な方法を提供することにある。さらに、本発明は、当該遺伝子やその発現産物を標的とした薬剤による治療の有効性の予測に基づいて、胆道がん等を治療する方法を提供することを目的とする。さらなる本発明の目的は、これら方法において当該遺伝子やその発現産物の検出に用いるための薬剤を提供することにある。
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、８例の胆道がんのトランスクリプトームシークエンシングにより、ＦＧＦＲ２遺伝子と他の遺伝子（ＢＩＣＣ１遺伝子又はＡＨＣＹＬ１遺伝子）とのインフレーム（Ｉｎ−ｆｌａｍｅ）融合転写産物を同定した。ＦＧＦＲ２遺伝子とＢＩＣＣ１遺伝子の融合遺伝子（ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合遺伝子）は第１０染色体内の逆位によって生じるものであり、ＦＧＦＲ２遺伝子とＡＨＣＹＬ１遺伝子の融合遺伝子（ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合遺伝子）は第１番染色体と第１０番染色体の相互転座によって生じるものであった。また、１０２例の胆道がんにおいて、これら融合遺伝子の出現頻度を調べたところ、ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合遺伝子の出現頻度は約６．９％であり、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合遺伝子の出現頻度は約２．０％であった。
さらに、これらの遺伝子融合は、ＦＧＦＲ２タンパク質の活性化をもたらすものと考えられ、このような活性化が生じている患者においては、ＦＧＦＲ２阻害剤が治療において有効性を示すものと考えられる。そこで、これら融合遺伝子を各々正常細胞に導入したところ、これら細胞は足場非依存性のコロニー形成能を獲得し、すなわちがん化することが確認された。また、かかる細胞においては、ＦＧＦＲ２タンパク質キナーゼの活性化が認められ、さらにはその下流シグナルであるＭＡＰＫのリン酸化も亢進していることが明らかになった。
また、ＦＧＦＲ２融合遺伝子を発現している細胞をヌードマウスの皮下に移植したところ、該細胞はｉｎ−ｖｉｖｏにおける造腫瘍能を有していることが確認された。
一方、かかるＦＧＦＲ２タンパク質キナーゼの活性化、ＭＡＰＫのリン酸化、足場非依存性のコロニー形成能、ｉｎ−ｖｉｖｏにおける造腫瘍能は、ＦＧＦＲ２阻害剤により、若しくはＦＧＦＲ２融合ポリペプチドのキナーゼドメインの不活化により顕著に抑制されることも確認された。
以上の点に基づき、本発明者らは、胆道がん等において、当該遺伝子融合を標的としてＦＧＦＲ２阻害剤による治療の有効性を予測することが可能であり、さらに、この予測において薬剤による治療が有効であると判定された患者に当該薬剤を投与すれば、効率的に治療を行うことが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明は、ＦＧＦＲ２タンパク質と他のタンパク質との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このポリヌクレオチドやポリペプチドの検出方法、当該ポリヌクレオチドや当該ポリペプチドの存在を指標としたＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法、この有効性の判定を利用したがんの治療方法、並びに、これらの方法に用いるための薬剤に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
＜１＞ ＦＧＦＲ２タンパク質と他のタンパク質とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、がん細胞において発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜２＞ 他のタンパク質がＢＩＣＣ１タンパク質又はＡＨＣＹＬ１タンパク質である、＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜３＞ がん細胞が胆道がん細胞である、＜１＞又は＜２＞に記載のポリヌクレオチド。
＜４＞ ＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
＜５＞ 試料中における＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド又は＜４＞に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出する方法であって、
（ａ）試料中における該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を特異的に検出するための薬剤と試料とを接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程、
を含む方法。
＜６＞ ＜５＞に記載の方法により、試料中における＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド又は＜４＞に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド、又は、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤
（ａ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
（ｃ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
（ｄ）ＦＧＦＲ２タンパク質と他のタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
＜７＞ ＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法であって、患者から単離した試料における＜１＞〜＜３＞のうちいずれか一に記載のポリヌクレオチド又は＜４＞に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程を含み、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの存在が検出されれば、前記患者における前記ＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法。
＜８＞ ＜７＞に記載の方法によりＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド、又は、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤
（ａ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
（ｃ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
（ｄ）ＦＧＦＲ２タンパク質と他のタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
＜９＞ がんを治療する方法であって、＜７＞に記載の方法によりＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に、前記ＦＧＦＲ２阻害剤を投与する工程を含む方法。
＜１０＞ ＦＧＦＲ２阻害剤を有効成分とするがんの治療剤であって、＜７＞に記載の方法によりＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に投与される治療剤。
本発明によれば、ＦＧＦＲ２遺伝子と他の遺伝子との融合遺伝子やその発現産物を効率的に検出することが可能となる。また、本発明によれば、当該融合遺伝子やその発現産物の検出により、がんに対する治療の有効性を予測すること、特にＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性を予測することが可能となる。そして、これにより、薬剤を投与することが有効ではないと考えられるがん患者への薬剤の投与を回避することができるため、効率的ながん治療を実現することが可能となる。
ヒト１０番染色体内での逆位によって生じた、ＦＧＦＲ２遺伝子とＢＩＣＣ１遺伝子との融合を示す概略図である。 ＦＧＦＲ２タンパク質とＢＩＣＣ１タンパク質との融合を示す概略図である。すなわち、ＦＧＦＲ２タンパク質の膜外ドメイン（ＩｇI〜ＩｇIII)、膜貫通（ＴＭ）ドメイン及びキナーゼドメインと、ＢＩＣＣ１タンパク質のＣ末端部分とが融合していることを示す概略図である。また、ＦＧＦＲ２遺伝子のキナーゼ領域内のエクソン１６又はエクソン１８と、ＢＩＣＣ１遺伝子のエクソン７／８又はエクソン２１とに、ハイブリダイズするＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーを利用することにより、ＦＧＦＲ２キナーゼ領域を含む全てのＦＧＦＲ２融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出することができることを示す概略図である。 ヒト１番染色体とヒト１０番染色体との均衡転座（相互転座）によって生じた、ＦＧＦＲ２遺伝子とＡＨＣＹＬ１遺伝子との融合を示す概略図である。 ＦＧＦＲ２タンパク質とＡＨＣＹＬ１タンパク質との融合を示す概略図である。すなわち、ＦＧＦＲ２タンパク質の膜外ドメイン（ＩｇI〜ＩｇIII)、膜貫通（ＴＭ）ドメイン及びキナーゼドメインと、ＡＨＣＹＬ１タンパク質のＣ末端部分とが融合していることを示す概略図である。また、ＦＧＦＲ２遺伝子のキナーゼ領域内のエクソン１６又はエクソン１８と、ＡＨＣＹＬ１遺伝子のエクソン９又はエクソン２０とに、ハイブリダイズするＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーを利用することにより、ＦＧＦＲ２キナーゼ領域を含む全てのＦＧＦＲ２融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出することができることを示す概略図である。 ＦＩＳＨ法により本発明の融合遺伝子を検出する方法を示す概略図である。すなわち、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合遺伝子については、ＦＧＦＲ２遺伝子５’側及びＢＩＣＣ１遺伝子の３’側にそれぞれＦＩＳＨ用プローブを設計することで、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合遺伝子の存在を検出できることを示す概略図である。 ＦＩＳＨ法により本発明の融合遺伝子を検出する方法を示す概略図である。すなわち、ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合遺伝子については、ＦＧＦＲ２遺伝子５’側及びＡＨＣＹＬ１遺伝子の３’側にそれぞれＦＩＳＨ用プローブを設計することで、ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合遺伝子の存在を検出できることを示す概略図である。 野性型又は変異型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを安定的に発現するマウス正常繊維芽細胞株をソフトアガー培地に播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成を顕微鏡下にて観察した結果を示す写真である。図中、「ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１」は野生型のＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示し、「ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１−ＫＤ」は変異型のＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示し、「ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１」は野生型のＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示し、「ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１−ＫＤ」は変異型のＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示す。また、各バーは１００μｍであることを示す。 野性型又は変異型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを安定的に発現するマウス正常繊維芽細胞株をソフトアガー培地に播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成能を解析した結果を示すグラフである。図中、縦軸は野性型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを発現している細胞株が形成したコロニーの数を１００とした際の、対応する変異型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを発現している細胞株が形成したコロニーの数の相対値を示すものである。アスタリスクは有意差が認められたこと（Ｐ値が０．０５以下であること）を示す。 ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤（ＢＧＪ３９８又はＰＤ１７３０７４）を添加したソフトアガー培地に、野性型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを安定的に発現するマウス正常繊維芽細胞株又はＥＺＲ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドを安定的に発現するマウス正常繊維芽細胞株を播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成能を解析した結果を示すグラフである。図中、「ＢＧＪ」はＢＧＪ３９８存在下（培地中のＢＧＪ３９８の濃度：０．２ｎｍｏｌ／ｍＬ）におけるコロニー形成の結果を示し、「ＰＤ」はＰＤ１７３０７４存在下（培地中のＰＤ１７３０７４の濃度：０．２ｎｍｏｌ／ｍＬ）におけるコロニー形成の結果を示し、「非添加」はＦＧＦＲキナーゼ阻害剤非存在下におけるコロニー形成の結果を示す。また縦軸は、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤非存在下において、各融合ポリペプチドを発現している細胞株が形成したコロニーの数を１００とした際の相対値を示すものである。アスタリスクは有意差が認められたこと（Ｐ値が０．０５以下であること）を示す。 野性型のＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリペプチドを安定的に発現するマウス正常繊維芽細胞株（ＦＧＦＲ２−ＡＨ）又はＥＺＲ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドを安定的に発現するマウス正常繊維芽細胞株（ＥＺＲ−ＲＯＳ１）を血清飢餓処理を施した後、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤（ＢＧＪ３９８又はＰＤ１７３０７４）の存在下にて培養し、これら細胞における各種タンパク質のリン酸化を、ウエスタンブロッティングにより解析した結果を示す写真である。図中、左から１番目及び６番目のレーンはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤非存在下における培養の結果を示し、左から２番目及び７番目のレーンはＢＧＪ３９８存在下（培地中のＢＧＪ３９８の濃度：０．２ｎｍｏｌ／ｍＬ）における培養の結果を示し、左から３番目及び８番目のレーンはＢＧＪ３９８存在下（培地中のＢＧＪ３９８の濃度：１．０ｎｍｏｌ／ｍＬ）における培養の結果を示し、左から４番目及び９番目のレーンはＰＤ１７３０７４存在下（培地中のＰＤ１７３０７４の濃度：０．２ｎｍｏｌ／ｍＬ）における培養の結果を示し、左から５番目及び１０番目のレーンはＰＤ１７３０７４存在下（培地中のＰＤ１７３０７４の濃度：１．０ｎｍｏｌ／ｍＬ）における培養の結果を示す。また、各融合ポリペプチドはＦＬＡＧタグを更に結合させ、細胞内にて発現させているため、図中「ＦＬＡＧ ｔａｇ」は、該タグを通して各融合ポリペプチドを検出した結果を示す。「ｐ−ＦＧＦＲ（Ｙ６５３／Ｙ６５４）」は、リン酸化されたＦＧＦＲを検出した結果を示す。「ＳＴＡＴ３」及び「ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）」は、ＳＴＡＴ３及びリン酸化ＳＴＡＴ３を検出した結果を各々示す。「ＡＫＴ」及び「ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）」は、ＡＫＴ及びリン酸化ＡＫＴを検出した結果を各々示す。「ＭＡＰＫ」及び「ｐ−ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）」は、ＭＡＰＫ及びリン酸化ＭＡＰＫを検出した結果を各々示す。「β−ａｃｔｉｎ」は、内部標準として各レーンにおけるタンパク質量が揃っていることを示す。 野生型又は変異型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを発現しているマウス正常繊維芽細胞株を、免疫不全マウスの皮下に移植した結果を示す写真である。図中、「野生型」は、野生型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを発現している細胞株を免疫不全マウスの皮下に移植し、その１８日後の該マウスを観察した写真である。三角は形成された腫瘍を示す。「８／８」は当該細胞を４匹のマウスに２箇所ずつ計８箇所に移植し、その８箇所全てにおいて腫瘍の形成が認められたことを示す。「変異型」は、変異型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを発現している細胞株を免疫不全マウスの皮下に移植し、その１８日後の該マウスを観察した写真である。「０／６」は当該細胞を３匹のマウスに２箇所ずつ計６箇所に移植し、その６箇所全ておいて腫瘍の形成が認められなかったことを示す。
＜ＦＧＦＲ２タンパク質と他のタンパク質との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド＞
後述の実施例において示す通り、ＦＧＦＲ２遺伝子と他の遺伝子との融合例が本発明において初めて明らかになった。したがって、本発明は、ＦＧＦＲ２タンパク質と他のタンパク質との融合ポリペプチド（以下、「ＦＧＦＲ２融合ポリペプチド」とも称する）をコードするポリヌクレオチド（以下、「ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド」とも称する）を提供する。
本発明の「ＦＧＦＲ２融合ポリペプチド」とは、ＦＧＦＲ２タンパク質の全長又はその一部と、他のタンパク質の全長又はその一部とが融合しているポリペプチドを意味する。また、本発明の「ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド」とは、ＦＧＦＲ２タンパク質の全長又はその一部をコードするポリヌクレオチドと、他のタンパク質の全長又はその一部をコードするポリヌクレオチドとが融合しているポリヌクレオチドを意味する。
ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチドとしては、例えば、ＦＧＦＲ２タンパク質とＢＩＣＣ１タンパク質との融合ポリペプチド（以下、「ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合ポリペプチド」とも称する）をコードするポリヌクレオチド（以下、「ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合ポリヌクレオチド」とも称する）、及びＦＧＦＲ２タンパク質とＡＨＣＹＬ１タンパク質との融合ポリペプチド（以下、「ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリペプチド」とも称する）をコードするポリヌクレオチド（以下、「ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリヌクレオチド」とも称する）が挙げられる。
本発明にかかる「ＦＧＦＲ２（線維芽細胞増殖因子受容体２、ＦＩＢＲＯＢＬＡＳＴ ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ２）タンパク質」は、ヒトにおいては１０番染色体長腕部（１０ｑ２６）に座乗している遺伝子にコードされているタンパク質である。本発明において、「ＦＧＦＲ２タンパク質」は、ヒト由来のものであれば、例えば、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０００１３２で特定されるタンパク質（アイソフォーム１）、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０７５２５９で特定されるタンパク質（アイソフォーム２）、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００１１３８３８５で特定されるタンパク質（アイソフォーム３）、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００１１３８３８６で特定されるタンパク質（アイソフォーム４）、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００１１３８３８７で特定されるタンパク質（アイソフォーム５）、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００１１３８３８８で特定されるタンパク質（アイソフォーム６）、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００１１３８３８９で特定されるタンパク質（アイソフォーム７）、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００１１３８３９０で特定されるタンパク質（アイソフォーム８）及びＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００１１３８３９１で特定されるタンパク質（アイソフォーム９）が挙げられ、これらＦＧＦＲ２タンパク質のタンパク質のアイソフォームは、膜外ドメインの構造（ＩｇＩの有無等、図２及び４参照）において互いに少し異なる構造を有している。また、本発明において、「ＦＧＦＲ２タンパク質」は、ヒト由来のものであれば、典型的には配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（アイソフォーム１）である。該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、典型的には配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明にかかる「ＢＩＣＣ１（ＢＩＣＡＵＤＡＬ Ｃ，ＤＲＯＳＯＰＨＩＬＡ，ＨＯＭＯＬＯＧ ＯＦ，１、ＢＩＣＣ）タンパク質」は、ヒトにおいて１０番染色体長腕部（１０ｑ２１．１）に座乗している遺伝子にコードされているタンパク質である。本発明において、「ＢＩＣＣ１タンパク質」は、ヒト由来のものであれば、典型的には配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、典型的には配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明にかかる「ＡＨＣＹＬ１（Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素様タンパク質１、Ｓ−ＡＤＥＮＯＳＹＬＨＯＭＯＣＹＳＴＥＩＮＥ ＨＹＤＲＯＬＡＳＥ−ＬＩＫＥ １、ＡＨＣＹ−ＬＩＫＥ １）タンパク質」は、ＩＲＢＩＴ（イノシトール１，４，５−三リン酸と共に放出されるイノシトール１，４，５−三リン酸受容体結合タンパク質、ＩＮＯＳＩＴＯＬ １，４，５−ＴＲＩＳＰＨＯＳＰＨＡＴＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲ １−ＢＩＮＤＩＮＧ ＰＲＯＴＥＩＮ ＲＥＬＥＡＳＥＤ ＷＩＴＨ ＩＮＯＳＩＴＯＬ １，４，５−ＴＲＩＳＰＨＯＳＰＨＡＴＥ、ＩＰ３と共に放出されるＩＴＰＲ１結合タンパク質、ＩＲＢＩＴ、ＩＴＰＲ１−ＢＩＮＤＩＮＧ ＰＲＯＴＥＩＮ ＲＥＬＥＡＳＥＤ ＷＩＴＨ ＩＰ３）又はＤＣＡＬ（樹状細胞発現ＡＨＣＹ様タンパク質、ＤＥＮＤＲＩＴＩＣ ＣＥＬＬ−ＥＸＰＲＥＳＳＥＤ ＡＨＣＹ−ＬＩＫＥ ＰＲＯＴＥＩＮ）とも称され、ヒトにおいて１番染色体短腕部（１ｐ１３．２）に座乗している遺伝子にコードされているタンパク質である。本発明において、「ＡＨＣＹＬ１タンパク質」は、ヒト由来のものであれば、例えば、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００６６１２で特定されるタンパク質（アイソフォームａ）及びＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００１２２９６０３で特定されるタンパク質（アイソフォームｂ）が挙げられ、ＡＨＣＹＬ１タンパク質のアイソフォームａは、アイソフォームｂよりＮ末端が長いという特徴を有している。また、本発明において、「ＡＨＣＹＬ１タンパク質」は、ヒト由来のものであれば、典型的には配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（アイソフォームａ）である。該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、典型的には配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチドは、典型的には、ＦＧＦＲ２タンパク質のＮ末端部分と、他のタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本発明において、「ＦＧＦＲ２タンパク質のＮ末端部分」とは、典型的には、前記ＦＧＦＲ２タンパク質の膜外ドメイン、膜貫通ドメイン及びキナーゼドメインを含むものである（図２及び４参照）。
本発明の「ＦＧＦＲ２タンパク質のＮ末端部分と、ＢＩＣＣ１タンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」としては、典型的には、図１及び５において示す通り、第１０染色体内の逆位によって生じるものである。より具体的には、前記ＦＧＦＲ２タンパク質のうち、エクソン１〜１９によりコードされるポリペプチド領域（膜外ドメイン、膜貫通ドメイン及びキナーゼドメイン）と前記ＢＩＣＣ１タンパク質のうち、エクソン３〜２１によりコードされるポリペプチド領域とが融合しているポリペプチド（例えば、配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドは、例えば、配列番号：７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明の「ＦＧＦＲ２タンパク質のＮ末端部分と、ＡＨＣＹＬ１タンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」としては、典型的には、図３及び６において示す通り、第１番染色体と第１０番染色体の相互転座によって生じるものである。より具体的には、前記ＦＧＦＲ２タンパク質のうち、エクソン１〜１９によりコードされるポリペプチド領域（膜外ドメイン、膜貫通ドメイン及びキナーゼドメイン）と前記ＡＨＣＹＬ１タンパク質のうち、エクソン５〜２０によりコードされるポリペプチド領域とが融合しているポリペプチド（例えば、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドは、例えば、配列番号：９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明にかかる「ＦＧＦＲ２タンパク質」、「ＢＩＣＣ１タンパク質」及び「ＡＨＣＹＬ１タンパク質」のアミノ酸配列、並びにこれらタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、「ＦＧＦＲ２融合ポリペプチド」のアミノ酸配列及び「ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド」の塩基配列も、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。また、これらアミノ酸配列や塩基配列は、人工的に改変することもできる。本発明には、このような変異体も含まれる。
ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合ポリペプチドの変異体の一態様としては、配列番号：８に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリペプチドの変異体の一態様としては、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
ここで「複数」とは、通常５０アミノ酸以内、好ましくは３０アミノ酸以内、より好ましくは１０アミノ酸以内、特に好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合ポリペプチドの変異体の他の態様としては、配列番号：７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするポリペプチドが挙げられる。ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリペプチドの変異体の他の態様としては、配列番号：９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするポリペプチドが挙げられる。
ここで高ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。
ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合ポリペプチドの変異体のさらなる他の態様としては、配列番号：８に記載のアミノ酸配列と８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリペプチドの変異体のさらなる他の態様としては、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列と８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
ここで配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＰによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合ポリヌクレオチドの変異体としては、上記ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチド及びアミノ酸の変異を伴なわない縮重変異体をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。また、ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリヌクレオチドの変異体としては、上記ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチド及びアミノ酸の変異を伴なわない縮重変異体をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明の「ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド」の形態には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等が含まれる。「ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド」は、当業者であれば、ＦＧＦＲ２遺伝子と他の遺伝子との融合遺伝子を保持する胆道がん等から調製したｃＤＮＡのライブラリー又はゲノムＤＮＡのライブラリーから、公知のハイブリダイゼーション技術を利用して単離することができる。また、前記胆道がん等から調製したｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを鋳型として公知の遺伝子増幅技術（ＰＣＲ)を利用することにより増幅し、調製することもできる。
さらに、このようにして調製したポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入してインキュベーションすることにより、また該ベクターを適当な細胞（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞）に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを調製することができる。
なお、上記の通り、本発明の「ＦＧＦＲ２融合ポリペプチド」及び「ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド」は、広義には、天然型の配列を有するもの（自然界において変異が生じたものも含む）及び人工的に配列が改変されたものの双方を含む。しかしながら、特に、後述する検出の対象としての「ＦＧＦＲ２融合ポリペプチド」及び「ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド」を指す場合には、主として、天然型の配列を有するもの（自然界において変異が生じたものも含む）を意味することに留意されたい。
＜ＦＧＦＲ２融合ポリペプチド又はＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチドの存在又は非存在の検出方法＞
本発明は、また、試料中におけるＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド又はＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの存在又は非存在を検出する方法を提供する。本発明の検出方法は、（ａ）試料中における該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を特異的に検出するための薬剤と試料とを接触させる工程、及び（ｂ）該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程、を含む。
本発明において「試料」とは、生体試料（例えば、細胞、組織、臓器、体液（血液、リンパ液等）、消化液、喀痰、肺胞・気管支洗浄液、尿、便）のみならず、これらの生体試料から得られる核酸抽出物（ゲノムＤＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物から調製されたｃＤＮＡ調製物やｃＲＮＡ調製物等）やタンパク質抽出物も含む。また、前記試料は、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施してあるものでもよい。
さらに、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はタンパク質は、当業者であれば、前記試料の種類及び状態等を考慮し、それに適した公知の手法を選択して調製することが可能である。
本発明において「ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド又はＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの存在又は非存在の検出」は、前記融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ、前記ゲノムＤＮＡからの転写産物、前記転写産物からの翻訳産物を対象として行うことができる。
また、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、第１０染色体内の逆位によって形成されるものであるから、「ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合ポリヌクレオチドの存在又は非存在の検出」においては、この逆位という現象を検出してもよい（図１及び５参照のこと）。かかる逆位の検出においては、例えば、ＦＧＦＲ２遺伝子のエクソン１９のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域と、ＦＧＦＲ２遺伝子のエクソン２０のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域との分離を検出してもよく、また、ＢＩＣＣ１遺伝子のエクソン２のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域と、ＢＩＣＣ１遺伝子のエクソン３のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域との分離を検出してもよい。
一方、ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、第１番染色体と第１０番染色体の相互転座によって形成されるものであるから、「ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリヌクレオチドの存在又は非存在の検出」においては、この相互転座という現象を検出してもよい（図３及び６参照のこと）。かかる相互転座の検出においては、例えば、ＦＧＦＲ２遺伝子のエクソン１９のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域と、ＦＧＦＲ２遺伝子のエクソン２０のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域との分離を検出してもよく、また、ＡＨＣＹＬ１遺伝子のエクソン１ａのコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域と、ＡＨＣＹＬ１遺伝子のエクソン５のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域との分離を検出してもよい。
本発明における「ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチドの存在又は非存在の検出」には、公知の手法を用いることができる。「前記融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ」を対象とする場合においては、例えば、蛍光等を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ゲノムＰＣＲ法、ダイレクトシークエンシング、サザンブロッティング、ゲノムマイクロアレイ解析を用いることができる。また、「前記ゲノムＤＮＡからの転写産物」を対象とする場合においては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ダイレクトシークエンシング、ノーザンブロッティング、ドットブロット法、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析を用いることができる。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいては、前記生体試料に、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを接触させることにより、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができる。
（ａ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの検出において、本発明にかかるＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヒト由来のものであれば、典型的にはＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＧ＿０１２４４９で特定されるゲノムの配列のうち１〜１２０１２９番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子（ＦＧＦＲ２遺伝子）である。
また、本発明にかかるＢＩＣＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヒト由来のものであれば、典型的にはＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＧ＿０２９７５９で特定されるゲノムの配列のうち１〜３１５９４２番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子（ＢＩＣＣ１遺伝子）である。
また、本発明にかかるＡＨＣＹＬ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヒト由来のものであれば、典型的にはＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＧ＿０２９１８２で特定されるゲノムの配列のうち１〜３８９７９番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子（ＡＨＣＹＬ１遺伝子）である。
しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、このような天然の変異体も本発明の対象になりうる（以下、同様）。
本発明の（ａ）又は（ｂ）に記載ポリヌクレオチドの長さは少なくとも１５塩基であるが、少なくとも２０塩基であることが好ましく、１００〜１０００塩基であることがより好ましい。
本発明の（ａ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、前記生体試料におけるＦＧＦＲ２融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、好ましくは、下記（ａ１）〜（ａ５）に記載のポリヌクレオチドである。
（ａ１） ＦＧＦＲ２遺伝子のエクソン１９のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５’ＦＧＦＲ２プローブ」とも称する）と、ＢＩＣＣ１遺伝子のエクソン３のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＢＩＣＣ１プローブ」とも称する）との組み合わせ
（ａ２） ５’ＦＧＦＲ２プローブと、ＡＨＣＹＬ１遺伝子のエクソン５のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＡＨＣＹＬ１プローブ」とも称する）との組み合わせ
（ａ３） ５’ＦＧＦＲ２プローブと、ＦＧＦＲ２遺伝子のエクソン２０のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＦＧＦＲ２プローブ」とも称する）との組み合わせ
（ａ４） ＢＩＣＣ１遺伝子のエクソン２のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５’ＢＩＣＣ１プローブ」とも称する）と、３’ＢＩＣＣ１プローブとの組み合わせ
（ａ５） ＡＨＣＹＬ１遺伝子のエクソン１ａのコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５’ＡＨＣＹＬ１プローブ」とも称する）と、３’ＡＨＣＹＬ１プローブとの組み合わせ。
本発明において、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ１）又は（ａ２）に記載のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域（標的塩基配列）としては、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点から１００００００塩基以内の領域であることが好ましく、また、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ３）〜（ａ５）に記載のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域としては、同観点から、ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＢＩＣＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＡＨＣＹＬ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおける切断点から１００００００塩基以内の領域であることが好ましい。
また、本発明において、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズすることにより、前記生体試料におけるＦＧＦＲ２融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、典型例としては、配列番号：７又は９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドをコードするゲノムＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド、例えば、ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
また、本発明において、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度をより向上させるという観点から、前記標的塩基配列全体をカバーすることのできる、複数種のポリヌクレオチドからなる集団であることが好ましい。かかる場合、該集団を構成するポリヌクレオチドの長さは少なくとも１５塩基であるが、少なくとも２０塩基であることが好ましく、１００〜１０００塩基であることがより好ましい。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、検出のため、蛍光色素等によって標識されていることが好ましい。かかる蛍光色素としては、例えば、ＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに制限されない。また、蛍光色素以外にＤＡＢ等の色素（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）や酵素的金属沈着に基づく銀等によって、前記ポリヌクレオチドを標識してもよい。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するプローブと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するプローブは互いに異なる色素にて標識されていることが好ましい。異なる色素にて標識した上記（ａ１）又は（ａ２）のプローブの組み合わせを用いてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、各プローブの標識が発するシグナルの重なりが観察された場合、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。一方、異なる色素にて標識した上記（ａ３）〜（ａ５）のいずれかのプローブの組み合わせを用いてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、各プローブの標識が発するシグナルの分離が観察された場合、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。
なお、ポリヌクレオチドの標識は、公知の手法により行うことができる。例えば、ニックトランスレーション法やランダムプライム法により、蛍光色素等によって標識された基質塩基をポリヌクレオチドに取り込ませ、該ポリヌクレオチドを標識することができる。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドと前記生体試料とを接触させる際の条件は、当該ポリヌクレオチドの長さ等の諸要因により変動し得るが、高ストリンジェンシーな条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーな条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。なお、当業者であれば、塩濃度（ＳＳＣの希釈率等）と温度の他、例えば、界面活性剤（ＮＰ−４０等）の濃度、ホルムアミドの濃度、ｐＨ等の諸条件を適宜選択することで、前記条件と同様のストリンジェントな条件を実現することができる。
前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを用いて、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、前記ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション以外に、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング及びドットブロッティングが挙げられる。これら方法においては、前記生体試料から得られる核酸抽出物を転写したメンブレンに、前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、前記融合遺伝子を検出する。前記（ａ）のポリヌクレオチドを用いた場合、ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドとが、メンブレンにおいて展開された同一のバンドを認識した場合に、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができたと判定することができる。
前記（ｂ）のポリヌクレオチドを用いてＦＧＦＲ２融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、さらに、ゲノムマイクロアレイ解析やＤＮＡマイクロアレイ解析が挙げられる。これら方法においては、前記（ｂ）のポリヌクレオチドを基板に固定したアレイを作製し、当該アレイ上のポリヌクレオチドに前記生体試料を接触させることにより、当該ゲノムＤＮＡを検出する。
ＰＣＲやシークエンシングにおいては、前記生体試料から調製したＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）やＲＮＡを鋳型としてＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチドの一部又は全部を特異的に増幅するために、下記（ｃ）のポリヌクレオチドを用いることができる。
（ｃ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド。
「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となる前記融合ポリヌクレオチド等において、片方のプライマーがＦＧＦＲ２遺伝子領域にハイブリダイズし、他方のプライマーが他の遺伝子領域にハイブリダイズするプライマーセットである。これらポリヌクレオチドの長さは、通常１５〜１００塩基であり、好ましくは１７〜３０塩基である。
また、本発明の（ｃ）に記載のポリヌクレオチドは、ＰＣＲ法による検出の精度や感度の観点から、ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点から５０００塩基内の前記融合ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列であることが好ましい。
「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となるＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド等の塩基配列に基づき、公知の手法により適宜設計することができる。公知の手法としては、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ソフトウェア（登録商標、ＡＢＩ社製）を利用する方法が挙げられる。
「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」の好適な例としては、好ましくは、下記（ｃ１）及び（ｃ２）に記載のポリヌクレオチドである。
（ｃ１） ＦＧＦＲ２遺伝子のエクソン１９のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５’ＦＧＦＲ２プライマー」とも称する）と、ＢＩＣＣ１遺伝子のエクソン３のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＢＩＣＣ１プライマー」とも称する）との組み合わせ
（ｃ２） ５’ＦＧＦＲ２プライマーと、ＡＨＣＹＬ１遺伝子のエクソン５のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＡＨＣＹＬ１プライマー」とも称する）との組み合わせ。
例えば、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合ポリヌクレオチドの検出においては、ＦＧＦＲ２遺伝子のキナーゼ領域内のエクソン１６又はエクソン１８、ＢＩＣＣ１遺伝子のエクソン７／８又はエクソン２１に対してプライマーを設計することで、ＦＧＦＲ２キナーゼ領域を含む全てのバリアント、すなわち、膜外構造（ＩｇIの有無等）において互いに異なる構造を有しているＦＧＦＲ２遺伝子アイソフォーム１〜９と、ＢＩＣＣ１遺伝子との融合遺伝子が検出できる（図２参照）。また、ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリヌクレオチドの検出においては、ＦＧＦＲ２遺伝子のキナーゼ領域内のエクソン１６又はエクソン１８、ＡＨＣＹＬ１遺伝子のエクソン９又はエクソン２０に対してプライマーを設計することで、ＦＧＦＲ２キナーゼ領域を含む全てのバリアント、すなわち、膜外構造において互いに異なる構造を有しているＦＧＦＲ２遺伝子アイソフォーム１〜９と、Ｎ末端部分の長さが異なるＡＨＣＹＬ１遺伝子アイソフォームａ及びｂとの融合遺伝子が検出できる（図４参照）。
本発明において、ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチドの翻訳産物を検出する方法としては、例えば、免疫染色法、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、免疫沈降法、抗体アレイ解析が挙げられる。これら方法においては、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドに結合する抗体が用いられる。かかる抗体としては、例えば、ＦＧＦＲ２タンパク質と他のタンパク質との融合点を含むポリペプチドに特異的な抗体（以下、「融合点特異的抗体」とも称する）、ＦＧＦＲ２タンパク質の前記融合点よりＮ末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体（以下、「ＦＧＦＲ２−Ｎ末抗体」とも称する）、他のタンパク質の前記融合点よりＣ末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体（以下、「他のタンパク質−Ｃ末抗体」とも称する）が挙げられる。ここで、「融合点特異的抗体」とは、前記融合点を含むポリペプチドに特異的に結合するが、野生型（正常型）のＦＧＦＲ２タンパク質及び野生型（正常型）の他のタンパク質のいずれにも結合しない抗体を意味する。
ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドは、前記融合点特異的抗体により、また、前記ＦＧＦＲ２−Ｎ末抗体と前記他のタンパク質−Ｃ末抗体との組み合わせにより検出することができる。
「ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドに結合する抗体」は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して調製することができる。かかる公知の手法としては、前記他のタンパク質のＣ末端部分からなるポリペプチド、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチド、前記ＦＧＦＲ２タンパク質のＮ末端部分からなるポリペプチド等を免疫動物に接種し、該動物の免疫系を活性化させた後、該動物の血清（ポリクローナル抗体）を回収する方法や、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法等のモノクローナル抗体の作製方法が挙げられる。標識物質を結合させた抗体を用いれば、当該標識を検出することにより、標的蛋白質を直接検出することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、検出可能なものであれば特に制限されることはなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、アルカリホスファターゼ、ビオチン及び放射性物質が挙げられる。さらに、標識物質を結合させた抗体を用いて標的蛋白質を直接検出する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体、プロテインＧ又はプロテインＡ等を用いて標的蛋白質を間接的に検出する方法を利用することもできる。
＜ＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法＞
後述の実施例において示す通り、ＦＧＦＲ２遺伝子と他の遺伝子との融合は、ＦＧＦＲ２タンパク質の活性化をもたらし、がんの悪性化等に寄与してと考えられる。そのため、このような融合が検出されるがん患者においては、ＦＧＦＲ２阻害剤による治療が有効である蓋然性が高い。
従って、本発明は、ＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法であって、患者から単離した試料におけるＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド又はＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程を含み、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの存在が検出されれば、前記患者における前記ＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法を提供する。
本発明において「患者」とは、がんに罹患しているヒトのみならず、がんに罹患していると疑いのあるヒトであってもよい。本発明の方法を適用する対象となる「がん」としては、ＦＧＦＲ２融合遺伝子の発現が認められるがんであれば特に制限はない。好ましくは胆道がんである。患者からの生体試料の採取は、生体試料の種類に応じて公知の手法により行うことができる。
本発明においてがん治療の有効性を評価する対象となる「ＦＧＦＲ２阻害剤」としては、ＦＧＦＲ２タンパク質の機能を直接的に又は間接的に抑制できる物質であれば特に制限はない。本発明に適用し得る公知のＦＧＦＲ２阻害剤としては、３−［２，４−ジメチル−５−［［（Ｚ）−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドール−３−イリデン］メチル］−１Ｈ−ピロール−３−イル］プロパン酸（例えば、ＳＵ６６６８（一般名称；オランチニブ（ｏｒａｎｔｉｎｉｂ）））、Ｎ−｛５−［２−（３，５−ジメトキシフェニル）エチル］−１Ｈ−ピラゾール−３−イル｝−４−［（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ジメチルピぺラジン−１−イル］ベンズアミド（例えば、ＡＺＤ４５４７）、１−［（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−アジド−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−５−メチルピリミジン−２，４−ジオン（例えば、ＤＳ４１５２（一般名称；テコガランナトリウム（ｔｅｃｏｇａｌａｎ ｓｏｄｉｕｍ））、ＦＧＦＲ２−IIIｂ特異的抗体（例えば、ＡＶ３６９ｂ）、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシフェニル）−１−［６−［［４−（４−エチルピぺラジン−１−イル）フェニル］アミノ］ピリミジン−４−イル］−１−メチルウレア（例えば、ＢＧＪ３９８）、（Ｓ）−（Ｒ）−１−（（４−（（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）オキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル）オキシ）プロパン−２−イル ２−アミノプロピオン酸（例えば、ＢＭＳ−５８２６６４（一般名称；ブリバニブアラニナート（ｂｒｉｖａｎｉｂ ａｌａｎｉｎａｔｅ））、Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）−ウレア（例えば、ＰＤ１７３０７４）が挙げられる。
「試料」の定義、試料からのＤＮＡやＲＮＡ等の抽出方法、ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド及びＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの存在又は非存在の検出の手法等は、上記の通りである。
本発明の方法により、患者から単離した試料において、ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド又はＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの存在が検出された場合、当該患者は、ＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定され、一方、当該ポリヌクレオチド又は当該ポリペプチドの存在が検出されなかった場合は、当該患者は、ＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性が低いと判定される。
＜ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド又はＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの存在又は非存在を検出するための薬剤、並びにＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤＞
上記の通り、少なくとも１５塩基の鎖長を有する、下記（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかであるポリヌクレオチドは、ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチドの存在又は非存在の検出に好適に用いることができる。従って、また、ＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性の判定にも好適に用いることができる。
（ａ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
（ｃ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
これらポリヌクレオチドは、標的遺伝子の特定の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。ここで「相補的」とは、ハイブリダイズする限り、完全に相補的でなくともよい。これらポリヌクレオチドは、該特定の塩基配列に対して、通常、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％の相同性を有する。
なお、（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、またその一部又は全部において、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ペプチド核酸）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、架橋化核酸）、ＥＮＡ（登録商標、２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、ＧＮＡ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、グリセロール核酸）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、トレオ―ス核酸）等の人工核酸によって、ヌクレオチドが置換されているものであってもよい。
また、上記の通り、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドに結合する抗体は、ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチドの翻訳産物（ＦＧＦＲ２融合ポリペプチド）の検出に好適に用いることができる。
本発明の薬剤においては、有効成分としての前記物質（ポリヌクレオチド、抗体）に加え、薬理学上許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、防腐剤、生理食塩等が挙げられる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
また、ポリヌクレオチドや抗体を含む標品に加えて、ポリヌクレオチドや抗体に付加した標識の検出に必要な基質、陽性対照（例えば、ＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチド、又はこれらを保持する細胞等）や陰性対照、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等において用いられる対比染色用試薬（ＤＡＰＩ等）、抗体の検出に必要な分子（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ）、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等の標品を組み合わせ、本発明の方法に用いるためのキットとすることもできる。当該キットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットをも提供するものである。
＜がんを治療する方法、がんの治療剤＞
上記の通り、本発明の方法によりＦＧＦＲ２融合ポリヌクレオチド又はＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの存在を検出された患者は、ＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性が高いと考えられる。このため、がん患者のうち、ＦＧＦＲ２融合遺伝子を保持する患者に選択的に、ＦＧＦＲ２阻害剤を投与することにより、効率的にがんの治療を行うことが可能である。従って、本発明は、がんを治療する方法であって、上記本発明の方法によりＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に、前記ＦＧＦＲ２阻害剤を投与する工程を含む方法を提供するものである。
また、本発明は、ＦＧＦＲ２阻害剤を有効成分とするがんの治療剤であって、上記本発明の方法によりＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に投与される治療剤を提供するものである。
「ＦＧＦＲ２阻害剤」としては、上記の通り、ＦＧＦＲ２タンパク質の機能を直接的に又は間接的に抑制できる物質であれば特に制限はない。本発明に適用し得る公知のＦＧＦＲ２阻害剤の例としては、前述の通りである。
患者へのＦＧＦＲ２阻害剤の投与方法は、当該阻害剤の種類やがんの種類等に応じて適宜選択されるが、例えば、経口、静脈内、腹腔内、経皮、筋肉内、気管内（エアゾール）、直腸内、膣内等の投与形態を採用することができる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜実験材料＞
ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ変異陰性の胆道がん手術切除凍結標本（腫瘍組織）８症例を研究対象とした。また、陰性対照として、正常組織（胆管上皮を含む肝臓組織）も、該腫瘍組織同様に以下の方法にて処理して解析した。
＜ＲＮＡ抽出＞
液体窒素内にて凍結保存されていた腫瘍組織を、クライオプレップ（製品名：ＣＰ０２、コバリス社製）にて粉砕した。次いで、粉砕された腫瘍組織から、トータルＲＮＡ精製用キット（製品名：ＲＮＡｅａｓｙ、キアゲン社製）を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。
＜ＲＮＡシークエンス＞
前記にて調製したトータルＲＮＡ２μｇを用いて、ｍＲＮＡｓｅｑサンプル調製キット（イルミナ社製）により、ライブラリーの合成を行なった。すなわち、先ず２μｇのトータルＲＮＡを９４℃にて５分間処理し、断片化した後、ｃＤＮＡ合成を行なった。次いで、得られたｃＤＮＡの両端にシークエンス用のアダプターを結合し、その後アガロースゲルに泳動、精製した。そして、精製したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、３００塩基長のライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡライブラリーを高速シークエンサー（ＧＡ２Ｘ、イルミナ社製）を用いて、その両端５０ｂｐをシークエンス解読した。
＜シークエンス情報の解析＞
得られた配列情報からＰＣＲによる重複クローンを除外した後、Ｂｏｗｔｉｅソフトを用いて既知のデータベース（Ｒｅｆｓｅｑ及びＥｎｓｅｍｂｌｅ）にマッピングし、両端の配列が、異なる遺伝子由来の配列であるものを抽出した（Ｋｏｈｎｏ Ｔ.ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、２０１２年、１８巻、３７５〜３７７ページ 参照）。
＜ＲＴ−ＰＣＲ及びサンガー法による確認＞
ＲＮＡシークエンスに用いた同じトータルＲＮＡから、新たに逆転写酵素（スーパースクリプトIIIファースト（１ｓｔ）−ストランド合成システム、インビトロゲン社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。得られた配列を元にＰＣＲプライマーを合成し、ＥｘＴａｑ ＨＳ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行い、その後、電気泳動にてＰＣＲ産物を確認した。さらに、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから抽出し、同プライマー、ビッグダイターミネーターｖ３．１サイクルシークエンシングキット（アプライドバイオシステム社製）及びＡＢＩ ３７３０シークエンサーを用いて、サンガー法によりシークエンシング解析を行った。そして、得られた結果から、融合遺伝子の融合点と読み枠とを確認した。逆転写反応及びＰＣＲ反応の条件は以下の通りである。
＜逆転写反応＞
先ず、前記トータルＲＮＡ５μｇ（８μＬ）に、ランダムヘキサマーズプライマー（５０ｎｇ／μＬ）１μＬと、１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス１μＬとを混ぜ、６５℃にて５分間反応し、氷上にて急冷した。次いで、１０×ＲＴバッファー２μＬと、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２４μＬと、０．１Ｍ ＤＴＴ２μＬと，ＲＮａｓｅＯＵＴ（４０Ｕ／μＬ）１μＬと、スーパースクリプトIIIＲＴ（２００Ｕ／μＬ）１μＬとを順番に添加した。そして、２５℃にて１０分間、５０℃にて５０分間、８５℃にて５分間、４℃にて５分間という条件にて、逆転写反応を行った。次いで、得られた逆転写産物に、ＲＮａｓｅＨ １μＬを添加し、３７℃にて２０分間かけ、トータルＲＮＡを消化した後、使用するまで、−２０℃にて保存した。
＜ＰＣＲ反応＞
前記にて調製した１ｓｔストランドｃＤＮＡ２μＬと、１０×ＥｘＴａｑバッファー１μＬと、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ１．２μＬと、Ｈ２Ｏ４．７μＬと、ＥｘＴａｑ ＨＳ ０．１μＬと、２μＭ ＣＦ／ＣＲミックスプライマー １μＬとを混合し、先ず、９５℃にて３分間、次いで、９４℃にて３０秒間、５８℃にて３０秒間及び７２℃にて３０秒間とういう反応サイクルを３５サイクル繰り返した後、７２℃にて５分間反応した。
（実施例１）
［ＲＮＡシークエンスによる新規キナーゼ融合遺伝子の同定］
８症例のＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ陰性胆道がん臨床検体から、ＰＣＲによる重複クローンを除外した上で、各々５．２ｘ１０７以上のペア塩基配列が得られた。それらを既存の遺伝子データベースに参照した結果、図２及び４に示す通り、ＦＧＦＲ２遺伝子とＢＩＣＣ１遺伝子との融合遺伝子（以下、「ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合遺伝子」とも称する）、ＦＧＦＲ２遺伝子とＡＨＣＹＬ１遺伝子との融合遺伝子（以下、「ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合遺伝子」とも称する）という、２種類の融合遺伝子候補を各々１例ずつ検出した。
［ＲＴ−ＰＣＲ及びサンガーシークエンスによる確認］
次に、同一検体を用いてＲＴ−ＰＣＲとサンガーシークエンスによる融合遺伝子の検証を行なった。その結果、ＲＴ−ＰＣＲにて、前記２種のいずれの融合遺伝子について、症例特異的な増幅、すなわち、胆道がんのみにおいて、これら融合遺伝子が発現しており、正常組織（胆管上皮を含む肝臓組織）においては、これら融合遺伝子が発現していないことが明らかになった。
さらに、得られたＰＣＲ産物をシークエンス解析することによって、いずれの融合遺伝子においても、これらの読み枠にずれが生じることなく、２つの遺伝子が融合していることが明らかになった。
すなわち、ＦＧＦＲ２遺伝子とＢＩＣＣ１遺伝子との融合遺伝子においては、図２及び配列番号：７に示す通り、ＦＧＦＲ２遺伝子（アイソフォーム１）のエクソン１９（配列番号：１又は７の２８４３〜２９４８位に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド）と、ＢＩＣＣ１遺伝子のエクソン３（配列番号：３の２３８〜３０７位に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド）とが直接結合することにより、これら遺伝子の読み枠にずれが生じることなく融合していることが明らかになった。
また、ＦＧＦＲ２遺伝子とＡＨＣＹＬ１遺伝子との融合遺伝子においては、図４及び配列番号：９に示す通り、ＦＧＦＲ２遺伝子（アイソフォーム１）のエクソン１９（配列番号：１又は７の２８４３〜２９４８位に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド）と、ＡＨＣＹＬ１遺伝子（アイソフォームａ）のエクソン５（配列番号：５の４１０〜５２１位に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド）とが直接結合することにより、これら遺伝子の読み枠にずれが生じることなく融合していることが明らかになった。
従って、以上の結果から、胆道がん等のがん細胞特異的に、１０番染色体内の逆位が生じることにより、ＦＧＦＲ２遺伝子とＢＩＣＣ１遺伝子とのとの融合が生じ、また、１番染色体と１０番染色体との相互転座が生じることにより、ＦＧＦＲ２遺伝子とＡＨＣＹＬ１遺伝子との融合が生じていることが明らかになった。
（実施例２）
［ＦＧＦＲ２融合遺伝子の出現頻度についての解析］
前記にて明らかになったがん細胞特異的融合遺伝子、ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合遺伝子及びＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合遺伝子について、各々の出現頻度を解析した。すなわち、胆道がん患者由来のがん組織１０２例について、上記ＲＴ−ＰＣＲにより、各融合遺伝子の出現頻度を解析した。
その結果、胆道がん１０２例中、ＦＧＦＲ２遺伝子とＡＨＣＹＬ１遺伝子との融合例は７例（出現頻度：約６．９％）、ＦＧＦＲ２遺伝子とＢＩＣＣ１遺伝子との融合例は２例（出現頻度：約２．０％）認められた。
（実施例３）
［ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの機能、並びに該ポリペプチドを発現しているがん細胞に対するＦＧＦＲキナーゼ阻害剤の有効性についての解析］
前述の遺伝子融合は、ＦＧＦＲ２タンパク質の活性化をもたらすものと考えられ、さらには該活性化によりその下流のシグナルも活性化され、細胞ががん化することが考えられる。したがって、このような活性化が生じている患者に対し、ＦＧＦＲ２阻害剤が治療において有効性を示すものと考えられる。そこで、これらの点について確認すべく、以下に示す通り、適宜定法に従い、ＦＧＦＲ２融合遺伝子について解析を行った。
先ず、胆道がん患者由来のがん組織より得たＦＧＦＲ２融合遺伝子のｃＤＮＡ（ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合遺伝子のｃＤＮＡ又はＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１融合遺伝子のｃＤＮＡ）の５’側に、ＦＬＡＧエピトープタグをコードするｃＤＮＡを翻訳の読み枠を合わせて連結し、ｐＭＸｓレトロウイルスベクターにクローニングした。
また、このベクターに部位特異的な変異を導入し、ＦＧＦＲ２キナーゼ部位内の２アミノ酸を置換したキナーゼ活性変異体（ＫＤ変異型ＦＧＦＲ２融合ポリペプチド：Ｙ５６８Ｆ／Ｙ５６９Ｆ）をコードするベクターも作製した。
次に、このように調製して得られたレトロウイルスベクターを、マウス正常繊維芽細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３細胞に各々感染させ、野性型又は変異型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを安定的に発現する細胞株を得た。
また、肺がんにおいて検出されるチロシンキナーゼ融合遺伝子（ＥＺＲ遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との融合遺伝子、以下「ＥＺＲ−ＲＯＳ１融合遺伝子」とも称する）についても、前記同様に該遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを作製し、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞に感染させ、ＥＺＲ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドを安定的に発現する細胞株を調製した。そして、この細胞株を対照群として以下に示す実験に供した。
野性型又は変異型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株をソフトアガー培地（培地中のアガーの濃度：４ｍｇ／ｍＬ、以下同じ）に播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成能を評価することによって、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの形質転換能を調べた。得られた結果を図７及び８に示す。
また、低分子ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤（ＢＧＪ３９８又はＰＤ１７３０７４）を添加したソフトアガー培地に、野性型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株又はＥＺＲ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株を播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成能を評価することによって、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドによる形質転換に対するＦＧＦＲキナーゼ阻害剤の効果を調べた。得られた結果を図９に示す。
さらに、野性型のＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株又はＥＺＲ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株を液体培地にて培養し、血清飢餓処理を施した後に、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤（ＢＧＪ３９８又はＰＤ１７３０７４）を添加した液体培地に交換して培養した。そして、このようにして得られた各細胞株から、タンパク質を抽出し、各種リン酸化タンパク質又は非リン酸化タンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロット解析を行うことにより、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの下流のシグナルについて解析を行った。得られた結果を図１０に示す。
また、野性型又は変異型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株を免疫不全マウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ）の皮下に、１箇所につき細胞１ｘ１０６個を移植し、これらＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを発現する細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける造腫瘍能を調べた。得られた結果を図１１に示す。
図７及び８に示した結果から明らかなように、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの発現によって、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は足場非依存性のコロニー形成を示した。一方、ＦＧＦＲ２タンパク質のキナーゼ活性を不活性化することによって、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドによる足場非依存性コロニー形成能は顕著に抑制されることが明らかになった。
さらに、図９に示す通り、かかるＦＧＦＲ２融合ポリペプチドによる足場非依存性コロニー形成能は、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤によって著しく阻害されることも明らかになった。
また、図１０に示した結果から明らかなように、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの発現によって、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞ではＦＧＦＲキナーゼドメインの強いリン酸化が認められた（図１０のｐ−ＦＧＦＲ（Ｙ６５３／Ｙ６５４）の右から５番目のレーン 参照）。さらに、このリン酸化はＦＧＦＲキナーゼ阻害剤処理によって顕著に抑制されることも明らかになった（図１０のｐ−ＦＧＦＲ（Ｙ６５３／Ｙ６５４）の右から１〜４番目のレーン 参照）。
また、図１０に示す通り、ＭＡＰＫのリン酸化は、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドによって強く引き起こされたが、このリン酸化もＦＧＦＲキナーゼ阻害剤処理によって顕著に抑制されることが明らかになった（図１０のｐ−ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）の右から５番目及び１〜４番目のレーン 参照）。なお、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの発現によるＡＫＴ及びＳＴＡＴ３のリン酸化の亢進は認められなかった。
また、図１１に示す通り、野生型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを発現しているＮＩＨ−３Ｔ３細胞を免疫不全マウスの皮下に移植した結果、その移植後１４日以内に腫瘍形成が観察された。一方、変異型のＦＧＦＲ２融合ポリペプチドを発現しているＮＩＨ−３Ｔ３細胞を免疫不全マウスの皮下に移植しても、その移植後３０日迄の観察において、腫瘍形成を全く確認することができなかった。
したがって、ＦＧＦＲ２融合遺伝子は形質転換能を有してがん遺伝子として働いること、さらには該形質転換にはＦＧＦＲ２キナーゼ活性の活性化が必要であることが明らかになった。
また、かかるＦＧＦＲ２融合ポリペプチドによる形質転換能は、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤によって、該融合ポリペプチドにおけるＦＧＦＲ２キナーゼの活性化やその下流のシグナルであるＭＡＰＫの活性化が阻害されることにより、抑制されることも明らかになった。
以上説明したように、本発明によれば、ＦＧＦＲ２タンパク質と他のタンパク質との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドやその発現産物を検出することが可能となり、さらに、この検出により、ＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性を予測することが可能となる。上記の通り、ＦＧＦＲ２遺伝子と他の遺伝子とのインフレーム融合が複数例で生じており、この融合はＦＧＦＲ２の活性化をもたらし、ひいては細胞をがん化してしまう。さらに、上記にて実証している通り、かかるＦＧＦＲ２の活性化及びがん化は、ＦＧＦＲ２阻害剤により顕著に抑制することができる。従って、ＦＧＦＲ２と他の遺伝子との融合は、ＦＧＦＲ２阻害剤の標的となりうるため、本発明は、がん治療の効率を高める上で、極めて有用である。

Claims (10)

  1. ＦＧＦＲ２タンパク質と他のタンパク質とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、がん細胞において発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  2. 他のタンパク質がＢＩＣＣ１タンパク質又はＡＨＣＹＬ１タンパク質である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. がん細胞が胆道がん細胞である、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
  5. 試料中における請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項４に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出する方法であって、
    （ａ）試料中における該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を特異的に検出するための薬剤と試料とを接触させる工程、及び
    （ｂ）該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程、
    を含む方法。
  6. 請求項５に記載の方法により、試料中における請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項４に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド、又は、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤。
    （ａ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
    （ｂ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
    （ｃ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
    （ｄ）ＦＧＦＲ２タンパク質と他のタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
  7. ＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法であって、患者から単離した試料における請求項１〜３のうちいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項４に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程を含み、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの存在が検出されれば、前記患者における前記ＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法。
  8. 請求項７に記載の方法によりＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド、又は、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤
    （ａ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
    （ｂ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
    （ｃ）ＦＧＦＲ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
    （ｄ）ＦＧＦＲ２タンパク質と他のタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
  9. がんを治療する方法であって、請求項７に記載の方法によりＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に、前記ＦＧＦＲ２阻害剤を投与する工程を含む方法。
  10. ＦＧＦＲ２阻害剤を有効成分とするがんの治療剤であって、請求項７に記載の方法によりＦＧＦＲ２阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に投与される治療剤。
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