WO2009081854A1 - アレルギー性疾患のバイオマーカーおよびその利用 - Google Patents

アレルギー性疾患のバイオマーカーおよびその利用 Download PDF

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WO2009081854A1
WO2009081854A1 PCT/JP2008/073175 JP2008073175W WO2009081854A1 WO 2009081854 A1 WO2009081854 A1 WO 2009081854A1 JP 2008073175 W JP2008073175 W JP 2008073175W WO 2009081854 A1 WO2009081854 A1 WO 2009081854A1
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biomarker
allergic
allergic disease
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Tsugunobu Andoh
Yasushi Kuraishi
Tasuku Nakano
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University Of Toyama
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    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
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    • G01N2333/96436—Granzymes
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to granzyme A as a biomarker for allergic diseases caused by allergic reactions that are not caused solely by histamine release, such as pruritus, and its use.
  • Non-patent Document 1 a raising substance and a pain-inducing substance are injected into the skin of the back of the mouse (the rostral part near the neck), only the raising substance causes a scratching action by the hind limbs, and the scratching action becomes an index of itching.
  • the present inventors As a model animal of allergic diseases such as itching, the present inventors induced an allergic reaction with a mosquito extract using a mouse sensitized with a mosquito salivary gland extract. It has been found that when a sensitized mouse is induced with a mosquito salivary gland extract, serine protease is released, and (2) mosquito allergic pruritus is suppressed by a protease inhibitor. In addition, the present inventors showed no or little change in the number of mast cells in sensitized mouse skin and non-sensitized mouse skin, while CD4 positive (CD4 +) in sensitized mouse skin. It has also been found that the number of T cells is increased from non-sensitized mouse skin.
  • the present inventors further studied diligently, and since protease activity is increased in the skin of sensitized mice compared to non-sensitized mice, when sensitized mice are induced with mosquito salivary gland extract, serine protease is released, It was also found that all of granzyme A, B and C expressed in lymphocytes increased in the skin of sensitized mice, but only granzyme A was expressed in CD4 + T cells. Furthermore, the time course of allergic pruritus reaction induced by antigen stimulation and release of granzyme A coincided, and CD4 + T cells were not observed in non-sensitized mouse skin but only in sensitized mouse skin.
  • mice injected intradermally with granzyme A produced a itch reaction
  • the presence of an allergic reaction via granzyme A was suggested. Since the release of granzyme A is specific to allergic diseases, a method of using granzyme A as a biomarker for diagnosis of allergy was devised, and the present invention was completed.
  • the present invention is as follows.
  • a biomarker for an allergic disease comprising a polynucleotide having a partial base sequence of the granzyme A gene and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide.
  • the allergic disease is caused by an allergic reaction that is not caused solely by histamine release, and is used as a probe or primer in the examination of the disease.
  • the allergic disease is an allergic disease accompanied by pruritus.
  • a method for diagnosing allergic disease comprising the following steps (A) and (B): (A) a step of measuring the expression level of the granzyme gene in the biological sample of the subject, and (B) a step of determining the presence or absence of an allergic disease based on the measurement result of (A).
  • a method for diagnosing allergic diseases comprising the following steps (a), (b) and (c): (A) a step of binding RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA and the biomarker according to any one of [1] to [3] above, (B) a step of measuring RNA derived from a biological sample bound to the biomarker or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA using the biomarker as an index; (C) A step of determining the presence or absence of an allergic disease based on the measurement result of (b). [6] A biomarker for an allergic disease comprising an antibody that recognizes granzyme A.
  • a method for diagnosing allergic diseases comprising the following steps (A) and (B): (A) a step of measuring the expression level of granzyme A in a biological sample of a subject, and (B) a step of determining the presence or absence of an allergic disease based on the measurement result of (A).
  • a method for diagnosing allergic diseases comprising the following steps (a), (b) and (c): (A) a step of binding a protein prepared from a biological sample of a subject and the biomarker according to any of [6] to [8] above, (B) a step of measuring a protein derived from a biological sample bound to the biomarker using the biomarker as an index, and (c) a step of determining the presence or absence of an allergic disease based on the measurement result of (b) .
  • a screening method for a substance that suppresses granzyme A expression comprising the following steps (a), (b), and (c): (a) contacting the test substance with cells capable of measuring the expression of granzyme A; (b) measuring the expression level of granzyme A in cells contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of granzyme A in control cells not contacted with the test substance; (c) A step of selecting a test substance that reduces the expression level of granzyme A based on the comparison result of (b).
  • a screening method for a substance that suppresses pruritus including the following steps (a), (b), and (c): (a) contacting the test substance with granzyme A; (b) measuring the inhibition of granzyme A activity by the test substance, and (c) A step of selecting a test substance that suppresses pruritus based on the measurement result of (b).
  • a therapeutic agent for allergic diseases comprising an antibody that binds to granzyme A.
  • a therapeutic agent for allergic diseases comprising a substance that suppresses the expression level of granzyme A as an active ingredient.
  • the biomarker of the present invention it is possible to provide an index of refractory pruritic skin disease in which conventional antiallergic drugs are difficult to be effective, and it is possible to make an easy and accurate diagnosis of the disease.
  • the method for diagnosing allergic diseases of the present invention it becomes possible to diagnose allergic diseases in which there is a type IV allergy-like reaction that does not depend on an antigen-antibody reaction system.
  • patients with allergic diseases that are ineffective or less effective when administered with antihistamines can be identified by the biomarkers of the present invention.
  • antihistamines are often prescribed as first-line drugs for allergy treatment. By identifying the above patients before treatment and taking another treatment plan, it is possible to avoid unnecessary treatment and achieve more effectiveness.
  • the treatment policy can be selected, the patient's economic and mental burden can be reduced, and the medical cost can be reduced.
  • the screening method of the present invention it becomes possible to develop a novel therapeutic agent for allergic diseases based on the mechanism of action of granzyme A.
  • the action of granzyme A can be specifically regulated, and it becomes possible to treat allergic diseases with few side effects.
  • FIG. 1 shows the protease activity of the skin of mouse sensitized with mosquito salivary gland extract and the skin of non-sensitized mice.
  • the vertical axis is the relative value when the protease activity in non-sensitized mice is 100.
  • FIG. 2 shows that serine protease is released when a mosquito salivary gland extract is administered to a mouse sensitized with the mosquito salivary gland extract.
  • FIG. 3 is a photograph comparing the number of mast cells in mouse skin sensitized by mosquito salivary gland extraction and non-sensitized mouse skin.
  • FIG. 4 is a photograph comparing the number of CD4 + T cells in mouse skin sensitized by mosquito salivary gland extraction and non-sensitized mouse skin.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of investigation by a real-time PCR method for granzyme subtypes expressed in the skin.
  • FIG. 6 is a view showing the results of examining the subtype of granzyme expressed in CD4 + T cells isolated from the skin by the real-time PCR method.
  • FIG. 7 is a diagram showing the induction of scratching motion when granzyme A is injected intradermally into healthy mice.
  • FIG. 8 is a diagram showing that the scratching action induced by intradermal injection of granzyme A is suppressed by naltrexone.
  • NC mouse which is an atopic dermatitis mouse
  • “gene” or “DNA” means not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA such as sense strand and antisense strand constituting the same.
  • the length is not particularly limited. Therefore, in this specification, unless otherwise specified, a gene (DNA) is a double-stranded DNA containing human genomic DNA and a single-stranded DNA containing DNA (positive strand) and a sequence having a sequence complementary to the positive strand. Both double-stranded DNA (complementary strand) and fragments thereof are included.
  • the “gene” or “DNA” has not only the “gene” or “DNA” represented by a specific base sequence (SEQ ID NO: 1) but also a biological function equivalent to the protein encoded by these.
  • genes or “DNA” that encode proteins (eg, homologs (homologs, splice variants, etc.), variants and derivatives).
  • the “gene” or “DNA” encoding the homologue, variant or derivative is, for example, any one of the specific base sequences represented by SEQ ID NO: 1 under the stringent conditions described below. Examples thereof include “gene” or “DNA” having a base sequence that hybridizes with a complementary sequence.
  • genes of other species such as mouse and rat corresponding to the human gene encoding the protein can be exemplified, and these genes (homologues) are homologous genes (http: / /www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/).
  • homologues are homologous genes (http: / /www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/).
  • BLAST Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) ( Get the accession number of the sequence (Score is the highest, E-value is 0 and Identity is 100%).
  • the UniGene Cluster ID (number indicated by Hs.) Obtained by inputting the accession number into UniGene (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) is input into the homologene. From the list showing the correlation of gene homologues between the other species gene and the human gene obtained as a result, genes of other species such as mice and rats as homologues corresponding to the human gene indicated by a specific base sequence Can be selected.
  • the gene or DNA does not ask for distinction of the functional region, and can include, for example, an expression control region, a coding region, an exon, or an intron.
  • protein or “(poly) peptide” refers not only to “protein” or “(poly) peptide” represented by a specific amino acid sequence (SEQ ID NO: 2), but also to biological functions thereof. To the extent that they are equivalent, it means homologues thereof (homologs and splice variants), mutants, derivatives, matured products and amino acid modified products.
  • homologs include proteins of other species such as mice and rats corresponding to human proteins, and these were identified by HomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/) It can be identified a priori from the base sequence of the gene.
  • Variants also include naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, and variants having amino acid sequences modified by artificial deletions, substitutions, additions and insertions.
  • Examples of the mutant include those that are at least 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and still more preferably 97% homologous to a protein or (poly) peptide without mutation.
  • the amino acid modifications include naturally occurring amino acid modifications and non-naturally occurring amino acid modifications, and specifically include phosphorylated forms of amino acids.
  • GZMA granzyme A protein
  • GZMA granzyme A
  • Human granzyme A and its homologues, mutants, derivatives, matured forms and amino acid modified forms are represented by a specific amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) unless otherwise specified by the SEQ ID NO.
  • Human granzyme A and its homologues, mutants, derivatives, matured forms and amino acid modified forms are represented by a specific amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) unless otherwise specified by the SEQ ID NO.
  • Human granzyme A and its homologues, mutants, derivatives, matured forms and amino acid modified forms Specific examples include human granzyme A having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (GenBank Accession No. NP_006135.1) and mouse homologues thereof (for example, GenBank Accession No. NP_034500.1).
  • antibody refers to a polyclonal antibody, monoclonal antibody, chimeric antibody, single-chain antibody, humanized antibody, or the above antibody having antigen-binding properties, such as a Fab fragment or a fragment generated by a Fab expression library. Means a part of
  • the term “biomarker” refers to a candidate substance useful for diagnosing the presence or absence of allergic disease, the degree of morbidity, the presence or absence of improvement, and the degree of improvement, and for the prevention and treatment of allergic diseases. It is used directly or indirectly for screening.
  • biological tissue to be diagnosed refers to a tissue or a cell in which the expression of the granzyme A gene of the present invention increases with an allergic disease caused by antigen stimulation.
  • specific examples include skin and CD4 + T cells.
  • allergic disease includes both type I allergies and non-type I allergies (non-immediate allergies) called so-called immediate allergies.
  • allergic diseases are immediate allergic reactions.
  • an allergic disease caused by a non-immediate allergic reaction which does not depend solely on histamine release.
  • An allergic disease that does not depend only on histamine release is an allergic disease that involves histamine release or an allergic disease that does not involve histamine release, and is an allergy mediated by other factors such as granzyme A. That is, in the case of allergic diseases accompanied by the release of histamine, it means that allergic reaction occurs through at least histamine and granzyme A, and in the case of allergic diseases not accompanied by the release of histamine, allergic reactions occur. The case where a reaction occurs.
  • Specific examples of allergic diseases include atopic dermatitis, pruritus, and itching due to insect bites such as mosquitoes, gnats and caterpillars.
  • the biomarker of the present invention is characterized by containing a polynucleotide having a partial base and / or a polynucleotide complementary thereto in the base sequence of the granzyme A gene.
  • the biomarker of the present invention comprises a polynucleotide having at least 15 consecutive bases and / or a polynucleotide complementary thereto in the base sequence of the granzyme A gene shown in SEQ ID NO: 1. The thing to contain can be mentioned.
  • the complementary polynucleotide (complementary strand, reverse strand) is the full-length sequence of a polynucleotide consisting of the base sequence of granzyme A gene, or in the base sequence, for example, a sequence having a base sequence of 15 bases in length.
  • a polynucleotide that is basically complementary to a partial sequence (for convenience, these are also referred to as “positive strands”) based on a base pair relationship such as A: T and G: C. It is.
  • such a complementary strand is not limited to the case where it forms a completely complementary sequence with the target positive strand base sequence, but has a complementary relationship that allows it to hybridize with the target positive strand under stringent conditions. You may have.
  • stringent conditions here combine the complex or probe as taught by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). It can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid. For example, as washing conditions after hybridization, conditions of about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be mentioned.
  • Tm melting temperature
  • the complementary strand is preferably one that maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions.
  • the more stringent hybridization conditions are about “0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, and the more severe hybridization conditions are “0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”.
  • a complementary strand a strand consisting of a base sequence that is completely complementary to the target base strand, and at least 90%, preferably 95% homology with the strand.
  • An example is a chain composed of a base sequence having the same.
  • the polynucleotide on the positive strand side includes not only those having the base sequence of the granzyme A gene or a partial sequence thereof, but also base sequences having a complementary relationship to the base sequence of the complementary strand. Can be included.
  • the above-mentioned normal and complementary (reverse) polynucleotides may be used as biomarkers in the form of single strands, or may be used as biomarkers in the form of double strands.
  • the biomarker for allergic diseases of the present invention may specifically be a polynucleotide comprising the base sequence (full-length sequence) of granzyme A gene or a polynucleotide comprising the complementary sequence thereof. Moreover, as long as it selectively recognizes (specifically) the granzyme A gene or a polynucleotide derived from the gene, it may be a polynucleotide comprising the full-length sequence or a partial sequence of its complementary sequence. In this case, examples of the partial sequence include a polynucleotide having a length of 15 consecutive bases arbitrarily selected from the base sequence of the full-length sequence or its complementary sequence.
  • “selectively (specifically) recognize” means that, for example, in Northern blotting, granzyme A gene or a polynucleotide derived therefrom can be specifically detected, and in RT-PCR method. Means that the granzyme A gene or a polynucleotide derived therefrom is specifically produced, but the present invention is not limited thereto, and those skilled in the art are able to derive the above detection product or product from these genes. Anything that can be determined.
  • the biomarker of the present invention is, for example, based on the base sequence of the human granzyme A gene described in SEQ ID NO: 1, for example, primer 3 (HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/ It can be designed using primer / primer3.cgi) or Vector NTI® (Infomax).
  • primer 3 HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/ It can be designed using primer / primer3.cgi) or Vector NTI® (Infomax).
  • a primer or probe candidate sequence obtained by applying the nucleotide sequence of the gene of the present invention to primer 3 or vector NTI software, or at least a sequence partially containing the sequence may be used as a primer or probe. it can.
  • the biomarker of the present invention When the biomarker of the present invention is used as a primer in the detection of allergic diseases, those having a base length of usually 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 50 bp, more preferably 15 bp to 35 bp can be exemplified.
  • those having a base length of usually 15 bp to the total number of sequences preferably 15 bp to 1 kb, more preferably 100 bp to 1 kb can be exemplified.
  • the biomarker of the present invention is used as a primer or probe according to a conventional method in a known method for specifically detecting a specific gene such as Northern blot method, RT-PCR method, DNA chip analysis method, in situ hybridization method, etc. can do. With this use, the presence or absence or expression level (expression level) of granzyme A gene in allergic diseases can be evaluated.
  • the allergic disease diagnosis method of the present invention comprises the following steps (A) and (B): (A) a step of measuring the expression level of the granzyme gene in the biological sample of the subject, and (B) a step of determining the presence or absence of an allergic disease based on the measurement result of (A).
  • the allergic disease diagnosis method of the present invention includes the following steps (a), (b) and (c): (A) a step of binding the biomarker of the present invention to RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA; (B) a step of measuring RNA derived from a biological sample bound to the biomarker or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA using the biomarker as an index; (C) A step of determining the presence or absence of an allergic disease based on the measurement result of (b).
  • the diagnostic method of the present invention uses the biomarker of the present invention as a primer or a probe, Northern blot method, RT-PCR method, DNA chip analysis method, in It can be carried out by using as an indicator that the amount of RNA or its transcript bound to the biomarker is increased by in situ hybridization analysis or the like.
  • RNA prepared from a specimen obtained by recovering existing cells according to a conventional method may be used, and various polynucleotides prepared based on the RNA may also be used.
  • the presence or absence of the expression of the granzyme A gene in RNA and its expression level can be detected and measured by using the biomarker of the present invention as a probe.
  • the biomarker (complementary strand) of the present invention is labeled with a radioisotope (RI) or a fluorescent substance, and hybridized with RNA derived from the biological tissue of the subject transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method.
  • RI radioisotope
  • RNA derived from the biological tissue of the subject transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method.
  • RI radioisotope
  • a signal derived from a biomarker label RI or fluorescent substance
  • a radiation detector or a fluorescence detector for the formed biomarker (DNA) and RNA duplex.
  • the presence or absence and expression level of granzyme A gene in RNA can be detected and measured by using the biomarker of the present invention as a primer.
  • a pair of primers prepared from the biomarker of the present invention is prepared so that cDNA can be prepared from RNA derived from a biological tissue of a subject according to a conventional method and a target granzyme A gene region can be amplified using this as a template.
  • a method for detecting the amplified double-stranded DNA obtained by hybridizing the above-described cDNA ( ⁇ strand) and the reverse strand binding to the + strand and performing PCR according to a conventional method It can be illustrated.
  • the detection of the amplified double-stranded DNA was performed by a method for detecting the labeled double-stranded DNA produced by performing the PCR using a primer previously labeled with RI or a fluorescent substance.
  • a method may be used in which double-stranded DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and a labeled biomarker is used as a probe to hybridize with this to detect it.
  • the produced labeled double-stranded DNA product can be measured with a bioanalyzer or the like.
  • a DNA chip on which the biomarker of the present invention is attached as a DNA probe is prepared.
  • Examples include a method in which a double strand of DNA and cRNA formed by hybridization with a cRNA prepared by a method and labeled with biotin is detected with fluorescently labeled avidin.
  • the biological tissue of the subject is collected by biopsy and a section is prepared.
  • a specific antisense probe or sense probe of the biomarker gene of the present invention is prepared.
  • the probe is labeled with an RI label or a non-RI label (eg, DIG label).
  • the section is deparaffinized (in the case of a paraffin section) and pretreated, and then fixed with ethanol or the like. After pre-hybridizing the fixed section and hybridizing with the probe, washing and RNase treatment are performed, and a detection method according to the label (for example, development for RI labeling, immunological detection for non-RI labeling) The presence or absence of the expression of the granzyme A gene in the living tissue and the expression level thereof can be detected and measured.
  • the determination of the presence or absence of allergic disease in the step (c) increases the amount of binding to the biomarker by comparing the measurement result obtained for the subject with the measurement result obtained for the normal subject. It is preferable that the measurement is performed using the above as an index.
  • the biomarker of the present invention is characterized by containing an antibody that recognizes granzyme A.
  • the antibody is a tool (biomarker) that can measure whether or not a subject suffers from an allergic disease by detecting the presence or degree of granzyme A protein in a biological sample of the subject. Useful as.
  • the antibody is also useful as a tool (biomarker) for detecting changes in the expression of granzyme A protein in the prevention and prediction of symptoms of allergic diseases described below.
  • the form of the antibody is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody using granzyme A protein as an immunizing antigen or a monoclonal antibody thereof. Furthermore, it may be a chimeric antibody, a single chain antibody, a humanized antibody, or a fragment generated by a Fab fragment or Fab expression library prepared based on the gene encoding the monoclonal antibody.
  • the antibodies can also be produced according to conventional methods (Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12-11.13 (2000)).
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody
  • an oligopeptide having a partial amino acid sequence of these proteins is synthesized using a granzyme A protein expressed and purified in Escherichia coli according to a conventional method, or according to a conventional method.
  • non-human animals such as rabbits and goats and obtain them from the sera of the immunized animals according to a conventional method.
  • spleen cells and myeloma cells obtained by immunizing non-human animals such as mice with oligopeptides having a partial amino acid sequence of granzyme A protein expressed and purified in accordance with conventional methods can be obtained from hybridoma cells prepared by cell fusion (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubelet al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11.).
  • Granzyme A protein used as an immunizing antigen for antibody production is based on DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into a host, based on the sequence information (SEQ ID NO: 1 etc.) of the gene provided by the present invention, etc. It can be obtained by culturing the transformant and recovering the protein from the culture. These operations are based on methods known to those skilled in the art or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). Can be done.
  • a recombinant DNA capable of expressing a gene encoding granzyme A protein in a desired host cell is prepared, introduced into the host cell, transformed, and the transformant is cultured.
  • a protein as an immunizing antigen for producing the antibody of the present invention can be obtained.
  • the partial peptides of these granzyme A proteins can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) according to the amino acid sequence information (SEQ ID NO: 2 etc.) provided by the present invention and the like.
  • kits can also be in the form of kits.
  • the kit includes, for example, a polynucleotide comprising a partial base sequence of the granzyme A gene and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide, and an anti-granzyme A antibody.
  • a kit containing a polynucleotide it further includes dNTP, reverse transcriptase, DNA synthase, buffer solution, etc., but is not limited thereto, and those skilled in the art will be able to use other configurations included in the kit as necessary Can be selected.
  • a kit containing an anti-granzyme A antibody a buffer solution, a secondary antibody, a marker, etc.
  • kits can be included depending on the Western blotting method, ELISA method, RIA method, fluorescent antibody method, and immunohistochemical staining method.
  • the trader can select other configurations included in the kit as needed. Moreover, it can also be set as the kit which measures the activity of granzyme A directly or indirectly using an anti- granzyme A antibody and a substrate peptide.
  • the allergic disease diagnosis method of the present invention comprises the following steps (A) and (B): (A) a step of measuring the expression level of granzyme A in a biological sample of a subject, and (B) a step of determining the presence or absence of an allergic disease based on the measurement result of (A).
  • the allergic disease diagnosis method of the present invention is characterized by using the biomarker of the present invention. Since the biomarker has a property of specifically binding to granzyme A protein, granzyme A protein expressed in animal tissues can be specifically detected.
  • the diagnostic method for allergic diseases of the present invention can be carried out by a method comprising the following steps (a), (b) and (c): (a) a step of binding a protein prepared from a biological sample of a subject and the biomarker (antibody) of the present invention; (b) measuring a protein derived from a biological sample bound to the biomarker using the biomarker as an index, (c) A step of determining the morbidity of the allergic disease based on the measurement result of (b).
  • the diagnostic method of the present invention uses the biomarker (antibody) of the present invention as an antibody for granzyme A detection, Western blotting method, radioisotope immunoassay method (RIA method), ELISA method, fluorescent antibody method, immunohistochemical staining method, etc. can be carried out by using as an indicator that the amount of protein binding to the biomarker has increased.
  • a sample obtained by collecting a part of a subject's tissue such as skin with a biopsy or collecting cells or the like present in a body fluid such as blood Or a protein prepared in accordance with a conventional method or a protein dissolved in a body fluid can be used.
  • the amount of granzyme A protein bound to the marker is increased by Western blotting or the like using the biomarker (antibody) of the present invention. Can be implemented by using as an index.
  • the biomarker of the present invention is used as a primary antibody, followed by a secondary antibody labeled with a radioisotope such as 125 I, a fluorescent substance, an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), or the like.
  • a secondary antibody an antibody that binds to the primary antibody
  • a signal derived from a radioisotope, a fluorescent substance, or the like of the obtained labeled compound is detected and measured by a radiation measuring instrument, a fluorescence detector, or the like.
  • cells expressing granzyme A can be measured using an enzyme-labeled antibody and its chromogenic substrate.
  • the diagnosis of allergic disease is based on the expression level of granzyme A gene such as CD4 + T cells in the skin biopsy tissue, blood, or the amount, function or activity of granzyme A protein (hereinafter referred to as “protein level”). Can be performed by measuring.
  • the screening method for a substance that suppresses the expression of granzyme A of the present invention includes the following steps (a), (b), and (c): (A) contacting the test substance with a cell capable of measuring the expression of granzyme A, (B) measuring the expression level of granzyme in cells contacted with the test substance and comparing the expression level with the expression level of granzyme A in control cells not contacted with the test substance; (C) A step of selecting a test substance that reduces the expression level of granzyme A based on the comparison result of (b).
  • the test substance may be any known substance or new substance, for example, a nucleic acid, a carbohydrate, a lipid, a protein, a peptide, a low molecular weight organic compound, or a combinatorial chemistry technique.
  • examples include compound libraries, random peptide libraries prepared by solid phase synthesis or phage display methods, or natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like.
  • Examples of cells capable of measuring the expression of granzyme A in step (a) include all cultured cells that express granzyme A, whether endogenous or exogenous, and cells containing a reporter gene. Whether or not these genes are expressed in cultured cells can be easily confirmed by detecting the expression of these genes by a known Northern blot method or RT-PCR method.
  • CD4 + T cells or cell lines isolated and prepared from animals with allergic diseases cells introduced with any of the genes of the present invention; cells introduced with a reporter (luciferase, GFP, etc.) gene And so on.
  • a reporter luciferase, GFP, etc.
  • any animal model known as an animal model for allergic diseases can be used, and specific examples include NC mice raised in a normal environment.
  • Examples of cells for gene transfer include CHO, MCF-7 Mammary carcinoma cell, H295R adrenal cell, and the like.
  • the test substance is contacted with a cell capable of measuring the expression of granzyme A in a culture medium.
  • a cell capable of measuring the expression of granzyme A in a culture medium.
  • the culture medium is appropriately selected depending on the cells capable of measuring the expression of granzyme A.
  • a minimal essential medium (MEM) containing about 5 to 20% fetal calf serum, Dulbecco's modified minimal essential medium (DMEM) ), RPMI1640 medium, 199 medium, and the like.
  • the culture conditions are appropriately determined in the same manner.
  • the pH of the medium is about 6 to 8
  • the culture temperature is usually about 30 to 40 ° C.
  • the culture time is about 12 to 72 hours.
  • step (b) the expression level is measured for mRNA or protein.
  • the expression level of mRNA is measured, for example, by preparing total RNA from cells and performing RT-PCR, Northern blotting, or the like.
  • the expression level of protein can be measured, for example, by preparing an extract from cells and immunologically.
  • Western blotting, radioisotope immunoassay (RIA method), ELISA, fluorescent antibody method and the like can be used.
  • a cell containing a reporter gene eg, a cell into which a vector operably linked to a reporter gene (for example, luciferase, GFP) is introduced downstream of the promoter of granzyme A
  • the expression level is It is measured based on the signal intensity of the reporter gene.
  • step (b) the expression level is compared based on the presence or absence of a significant difference in the expression level of granzyme A in the presence or absence of the test substance.
  • the expression level of granzyme A in the control cells not contacted with the test substance is the expression level measured at the same time even if the expression level is measured in advance with respect to the expression level of granzyme A in the cells contacted with the test substance.
  • it may be an amount, it is preferably an expression amount measured simultaneously from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.
  • a test substance that reduces the expression level of granzyme A is selected.
  • the test substance thus selected includes substances that can vary the expression level of granzyme A due to the nature of the present screening method.
  • the selected test substance is useful not only as a candidate for a therapeutic agent for allergic diseases accompanied by pruritus (for example, a therapeutic agent for atopic dermatitis, particularly a therapeutic agent for histamine-resistant pruritus), but also as a research reagent. It is.
  • the screening method of the substance which suppresses pruritus of the present invention includes the following steps (a), (b) and (c): (A) contacting the test substance with granzyme A; (B) a step of measuring the inhibition of granzyme A activity by the test substance, and (c) a step of selecting a test substance that suppresses pruritus based on the measurement result of (b).
  • step (a) the test substance is as described above.
  • step (a) the test substance is brought into contact with granzyme A, and this may be carried out according to the usual step of measuring enzyme inhibition.
  • step (b) granzyme A activity inhibition is measured by measuring the amount of free nitroanilide having a specific absorption wavelength that is cleaved by an enzyme from nitroanilide bound to a specific substrate peptide.
  • a test substance that inhibits the activity of granzyme A is selected.
  • the test substance thus selected is not only a candidate for a therapeutic agent for allergic diseases accompanied by pruritus (for example, a therapeutic agent for atopic dermatitis, particularly a therapeutic agent for histamine-resistant pruritus), but also a research reagent. It is also useful.
  • biomarkers of the present invention a biomarker containing the above antibody can be applied to animals to prevent or treat changes in the state of allergic diseases, and the present invention provides such a method.
  • neutralizing antibodies are particularly preferable.
  • the animals are preferably humans and vertebrates other than humans, and particularly domestic animals such as cows, horses, pigs, sheep, goats, chickens, dogs and cats, or pets.
  • the present invention provides a therapeutic agent for an allergic disease containing, as an active ingredient, a substance that inhibits the amount or action of the biomarker.
  • the therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as it inhibits the amount or action of granzyme A, and examples thereof include the aforementioned various antibodies and known serine protease inhibitors.
  • the therapeutic agent of the present invention is used as a therapeutic agent for allergic diseases, preferably a therapeutic agent for allergic diseases accompanied by pruritus.
  • the therapeutic agent of the present invention may be the active ingredient as it is or may contain a known pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier include excipients such as sucrose, starch, mannitol, sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate; cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, polypropylpyrrolidone, gelatin, Arabic Binders such as rubber, polyethylene glycol, sucrose, starch; disintegrants such as starch, carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, sodium carboxymethyl starch, sodium bicarbonate, calcium phosphate, calcium citrate; magnesium stearate, aerosil, talc, Lubricants such as sodium lauryl sulfate; Fragrances such as citric acid, menthol, glycyrrhizin / ammonium salt, glycine, orange powder; sodium benzoate Preservatives such as um, sodium bisulfite, methylparaben
  • the therapeutic agent of the present invention contains a substance that suppresses the expression of the granzyme A gene as an active ingredient.
  • the substance is an antisense nucleic acid, ribozyme, decoy nucleic acid or siRNA against granzyme A gene.
  • Antisense nucleic acid means a nucleotide sequence that can hybridize to the target mRNA (initial transcript) under physiological conditions of a cell that expresses the target mRNA (early transcript), and A nucleic acid capable of inhibiting translation of a polypeptide encoded by a target mRNA (early transcript).
  • the type of the antisense nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera.
  • RNA having an enzyme activity that cleaves nucleic acid refers to RNA having an enzyme activity that cleaves nucleic acid. Recently, it has been clarified that oligo DNA having the base sequence of the enzyme active site also has a nucleic acid cleaving activity. In the invention, as long as it has a sequence-specific nucleic acid cleavage activity, it is used as a concept including DNA.
  • Decoy nucleic acid refers to a nucleic acid molecule that mimics a region to which a transcriptional regulatory factor binds. Decoy nucleic acid as a substance that suppresses granzyme A expression mimics a region to which a transcriptional activator for granzyme A binds. It can be a nucleic acid molecule.
  • an oligonucleotide (S-oligo) having a thiophosphate diester bond in which the oxygen atom of the phosphodiester bond portion is substituted with a sulfur atom, or a methyl phosphate group having no phosphodiester bond as a charge And oligonucleotides modified to make the oligonucleotide less susceptible to degradation in vivo.
  • the decoy nucleic acid may be completely coincident with the region to which the transcriptional activator binds, but it is sufficient that the decoy nucleic acid retains the identity that allows the transcriptional activator to bind to granzyme A.
  • the length of the decoy nucleic acid is not particularly limited as long as a transcriptional activator binds.
  • the decoy nucleic acid may contain the same region repeatedly.
  • RNA is a double-stranded oligo RNA complementary to a partial sequence within the coding region of granzyme A mRNA or the initial transcription product (including an intron in the case of the initial transcription product).
  • RNAi RNA interference
  • the antisense nucleic acid, ribozyme, decoy nucleic acid, and siRNA can be prepared according to a known method.
  • the mosquito used in the experiment was an adult female Aedes albopictus provided by the Department of Infection Prevention Medicine, University of Toyama. Adults were raised in cloth cages (30 ⁇ 30 ⁇ 30 cm) and freely ingested with 3% sucrose aqueous solution. Larvae were bred by placing ion-exchanged water in a plastic cage (25 ⁇ 35 ⁇ 12 cm), circulating air with an air pump, and fed dry yeast and baby food in a ratio of 1: 1 as food. The cocoons were collected in a container containing ion exchange water, and then put into a cloth cage to be hatched.
  • ESGM mosquito salivary gland extract
  • Female human striped mosquitoes were frozen to death and the legs, heels, head, and abdomen were excised under a microscope, and only the chest was isolated and collected in an Eppendorf tube.
  • Add a small amount of distilled water homogenize (1,500 rpm, 4 ° C, 5 minutes), centrifuge (approximately 9,000 ⁇ g, 30 minutes), and pass the supernatant through a filter (cellulose acetate 0.45 ⁇ m, Advantech Toyo) .
  • ESGM was dissolved in physiological saline so that the amount of protein in 50 ⁇ L was 10 ⁇ g.
  • a sensitized mouse was prepared by injecting it into the caudal dorsal region of the mouse twice a week for a total of 8 times. After sensitization, ESGM (10 ⁇ g / site) was injected intradermally into the rostral back of mice to induce scratching.
  • the synthetic substrate was adjusted to 10 mg / mL with dimethyl sulfoxide, and further diluted to 480 ⁇ g / mL with Reaction Solution A was used as the substrate solution. After reacting 49 ⁇ L of the reaction solution, 1 ⁇ L of the sample, and 50 ⁇ L of the substrate solution at 37 ° C. for 1 hour, the absorbance at 420 nm was measured.
  • a vinyl chloride tube (p-10 tube) was adhered to the part where the dialysis tube protruded from the skin with an adhesive. Thereafter, an enzyme solution (pH 7.3; containing 0.5 mM Tris and 0.1 M sodium chloride) was perfused into the skin for 1 hour at a flow rate of 1 ⁇ l / min using EICOM EP-60 MICRO SYRINGE PUMP (Eicom). This was pretreated, and the subsequent skin perfusate was collected every 5 minutes in an ice bath.
  • reaction solution B pH 7.77; 85.74 mM Tris, 0.572% dimethyl sulfoxide, 42.87 ⁇ g / mL heparin
  • reaction solution B synthetic substrate to dimethyl sulfoxide to 10 mg / mL
  • reaction solution B to 480 ⁇ g / mL.
  • a sample collected from 2 mice and 50 ⁇ L of the substrate solution diluted in mL was reacted at 37 ° C. for 2 days in a volume of 20 ⁇ L, and the absorbance at 420 nm was measured.
  • mice were bled using 0.1 M phosphate buffered saline (PBS; pH 7.4) and fixed with 4% paraformaldehyde (PFA). After the skin was removed, it was fixed with 4% PFA for 4 hours and then replaced with 30% sucrose (containing 0.1 M phosphate buffer). After 24 hours, it was embedded with OTC compound (Sakura Fine Technical) and frozen. Samples for toluidine blue staining were sliced to 20 ⁇ m with a cryostat, pasted on a gelatin-coated slide glass, and stored in the dark at -80 ° C. until staining. Samples for immunostaining were sliced into 40 ⁇ m with a cryostat and stored in 0.1 M PBS (containing 0.02% sodium azide) at 4 ° C. in the dark until staining.
  • PBS phosphate buffered saline
  • PFA paraformaldehyde
  • Toluidine blue staining Sections were soaked in 0.1% toluidine blue for 15-20 minutes. When the tissue stained blue, the sections were washed with water and sealed with polymount. The tissue specimen was observed using an optical microscope (AX80, Olympus Optical Co., Ltd.).
  • mice Under anesthesia with ethyl carbonate (1.8 g / kg), the mice were bled using 0.1 M phosphate buffered saline (PBS; pH 7.4), and the skin and spleen were removed and fragmented. Samples were frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C until use. Samples were placed in Trizol reagent (Invitrogen) and homogenized. After standing at room temperature for 5 minutes, chloroform: isoamyl alcohol (CIA) was added and stirred for 15 seconds, followed by centrifugation at 14,000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes.
  • PBS phosphate buffered saline
  • ⁇ Composition A (total amount 15 ⁇ L)> ⁇ 5 ⁇ Reaction buffer (Wako Pure Chemicals) 4 ⁇ L ⁇ MgCl2 (25mM) (Wako Pure Chemical Industries) Final concentration 3mM 2.4 ⁇ L ⁇ DNTP (2 mM each dNTP) (ABI, USA) final concentration 0.5 mM 5 ⁇ L ⁇ RNase inhibitor (Toyobo) Final concentration 1U / ⁇ L 0.5 ⁇ L ⁇ ReverScript III (Wako Pure Chemical Industries) 1 ⁇ L ⁇ RNase free water 2.1 ⁇ L
  • PCR reaction The reverse transcription (RT) product was mixed with the following composition B, and reacted with a thermal cycler (Takara Bio). The mixed solution was reacted at 95 ° C. for 2 minutes, and subsequently reacted 30 times in a cycle of 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 50 seconds. Finally, the reaction was performed at 72 ° C for 5 minutes, and then the reaction was terminated at 4 ° C.
  • the PCR products were separated by electrophoresis on a 1% agarose gel, and then the agarose gel was immersed in an ethidium bromide solution. After 20 minutes, the gel was photographed in a state where the gel was irradiated with UV.
  • ⁇ Composition B (total amount 50 ⁇ L)> ⁇ 5 ⁇ Green GoTaq Flexi Buffer (Promega, USA) 10 ⁇ L ⁇ MgCl 2 (25mM) (Wako Pure Chemical Industries) final concentration 1.5mM 3 ⁇ L ⁇ DNTP (2 mM each dNTP) (ABI, USA) Final concentration 0.2 mM 5 ⁇ L ⁇ Sens primer * 1 (Hokkaido System Science) Final concentration 1 ⁇ M 1 ⁇ L ⁇ Anti-sens primer * 1 (Hokkaido System Science) Final concentration 1 ⁇ M 1 ⁇ L ⁇ GoTaq DNA polymerase (5 u / ⁇ L) (Promega, USA) Final concentration 1.25u 0.25 ⁇ L ⁇ Template DNA 1 ⁇ L ⁇ Sterile water 28.75 ⁇ L * 1: Sens primer and Anti-sens primer are shown in Table 1.
  • [Real-time PCR] RT products were mixed at the following composition C and reacted with Mx3000P & Mx3005P Real-Time PCR System (STRATAGENE, USA). The mixture was allowed to react at 95 ° C. for 1 minute, and subsequently reacted 40 times in a cycle of 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 50 seconds. Finally, the reaction was performed at 72 ° C for 5 minutes, and then the reaction was terminated at 4 ° C. PCR product amplification was analyzed by MxPro QPCR Software (STRATAGENE, USA).
  • Naltrexone was injected subcutaneously at a dose of 0.1 mL per 10 g body weight of mice 15 minutes prior to granzyme A administration. Post-injection behavior was observed by video playback. For the scratching motion, the number of scratching motions at and near the injection site by the hind limbs was counted. Mice usually scratch several times per second, and this series of movements was measured as a single scratch.

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Abstract

　掻痒などの、ヒスタミン遊離のみを原因とするものではないアレルギー反応に起因するアレルギー疾患に対するバイオマーカーとその利用を提供する。 　バイオマーカーとしてグランザイムＡを利用する、従来の抗アレルギー薬が効きにくい難治性の掻痒性皮膚疾患の指標を提供することが可能となり、当該疾患の容易かつ的確な診断をすることができる。また、抗原抗体反応系に依存したものでないIV型アレルギー様な反応が存在するアレルギー疾患の診断等が可能となる。また、グランザイムＡを利用するスクリーニングにより、新規なアレルギー性疾患の治療剤の開発が可能となる。また、グランザイムの作用を特異的に調節する薬剤により、副作用の少ないアレルギー性疾患の治療が可能となる。

Description

アレルギー性疾患のバイオマーカーおよびその利用
　アレルギー性疾患のバイオマーカーおよびその利用に関する。詳しくは掻痒等の、ヒスタミン遊離のみを原因とするものではないアレルギー反応に起因するアレルギー疾患に対するバイオマーカーとしてのグランザイムＡとその利用に関する。
　痒みは、ヒトに掻きたいとの衝動を引き起こす感覚として容易に理解される。しかし、「古典的な起痒物質のヒスタミン（histamine）がマウスなどの動物に掻き動作を起こさない」、「慢性痛モデル動物のアジュバント関節炎ラットの掻き動作が鎮痛薬で抑制される」などから，動物の掻き動作が必ずしもヒトの痒みの指標とはならないとされてきた。
　マウスの背中（首に近い吻側部）の皮膚に起痒物質と発痛物質を注射すると、起痒物質のみが後肢による掻き動作を引き起こし、掻き動作が痒みの指標となる（非特許文献１）。ヒトは、身体のほとんどの部位を手で掻くことができる。しかし、マウスは後肢を掻くことが出来ない。マウスは、後肢に痒み刺激を加えると噛む反応を示し、痛み刺激では舐める反応を示す（非特許文献２）。
　蚊に刺されると多くのヒトが強い痒みを感じる。蚊刺しによる皮膚反応と痒みは、アレルギー性反応だと考えられている。初回の蚊刺しはマウスに掻き動作をほとんど起こさないが、1週間に2回の頻度で蚊刺しを繰返すと、次第に掻き動作が増加する。蚊唾液腺抽出物の反復注射でも掻き動作が次第に増加する。この掻き動作の増加は、肥満細胞（マスト細胞）欠損マウスでも観察される。また、感作マウスでは、蚊刺による血漿血管漏出がＨ1ヒスタミン受容体遮断薬によって抑制されるが、掻き動作は抑制されない。すなわち、皮膚の即時型アレルギーによる痒みには、マスト細胞－ヒスタミン系以外の機序が重要である（非特許文献３）。
　蚊唾液腺抽出物の反復注射で増加するマウスの掻き動作は、各種の抗アレルギー作用を有するアレルギー治療薬であるアゼラスチンにより抑制されるが、Ｈ1ヒスタミン受容体遮断薬のテルフェナジンやステロイドのデキサメタゾンでは抑制されない。また、感作マウスに蚊唾液腺抽出物を注射すると、一次求心線維の活動が増加する。この反応をアゼラスチンは抑制するが、テルフェナジンは抑制しない（非特許文献４）。
Eur. J. Pharmacol., 275: 229-233 (1995) Pain Res., 14: 53-59 (1999) Jpn. J. Pharmacol., 86: 97-105 (2001) J. Pharmacol. Sci., 91: 263-266 (2003)
　従来、アレルギーの診断としては、マスト細胞からのヒスタミン遊離に基づいた抗原抗体反応を応用したものが多い。しかし、抗原抗体反応系に依存したものでないIV型アレルギーの様な反応が存在する。また、これまでの抗アレルギー薬は、マスト細胞の膜安定化及びその遊離物質に対する拮抗薬を中心に開発されてきた。しかし，難治性の掻痒性皮膚疾患の痒みには、第一選択薬として使用されている抗ヒスタミン薬が無効である場合が多く、新規な鎮痒薬の開発が望まれている。
　本発明者らは、痒み等のアレルギー疾患のモデル動物として、蚊唾液腺抽出物を用い感作したマウスを用いて蚊抽出物によりアレルギー反応を惹起し、アレルギー性の痒みを検討した結果、（１）感作マウスを蚊唾液腺抽出物で惹起すると、セリンプロテアーゼが遊離すること、（２）蚊アレルギー性掻痒がプロテアーゼ阻害剤で抑制されることを見出していた。
　また、本発明者らは、感作マウス皮膚と非感作マウス皮膚に対しては、マスト細胞の数の変化はみられないか、少ない一方で、感作マウス皮膚において、ＣＤ４陽性(ＣＤ４＋)Ｔ細胞の数は、非感作マウス皮膚より増加することをも見出していた。
　本発明者らは、さらに鋭意検討を加え、感作マウス皮膚でプロテアーゼ活性が非感作マウスに比べて増加することから、感作マウスを蚊唾液腺抽出物で惹起すると、セリンプロテアーゼが遊離し、またリンパ球で発現するグランザイムＡ、ＢおよびＣの全てが感作マウス皮膚で増加するが、ＣＤ４＋Ｔ細胞においてはグランザイムＡのみ発現していることを見出した。さらに抗原刺激により誘発されるアレルギー性掻痒反応とグランザイムＡの遊離の時間経過が一致し、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、非感作マウス皮膚には認められず、感作マウス皮膚でのみ認められた。さらに、グランザイムＡを皮内注射したマウスが、痒み反応を生じたことから、グランザイムＡを介したアレルギー反応の存在が示唆された。グランザイムＡの遊離がアレルギー疾患特異的であることから、グランザイムＡをアレルギーの診断のバイオマーカーとして使用する方法を考案し、本発明を完成するに至った。本願発明は、以下に示す通りである。
［１］グランザイムＡ遺伝子の一部の塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび／または当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有してなるアレルギー性疾患のバイオマーカー。
［２］アレルギー性疾患が、ヒスタミン遊離のみを原因とするものではないアレルギー反応に起因し、当該疾患の検査においてプローブまたはプライマーとして使用される上記［１］記載のバイオマーカー。
［３］アレルギー性疾患が掻痒を伴うアレルギー性疾患である上記［１］または［２］に記載のバイオマーカー。
［４］下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（Ａ）被験者の生体試料中のグランザイム遺伝子の発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
［５］下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと上記［１］～［３］いずれかに記載のバイオマーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該バイオマーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、前記バイオマーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
［６］グランザイムＡを認識する抗体を含有してなるアレルギー性疾患のバイオマーカー。
［７］アレルギー性疾患が、ヒスタミン遊離のみを原因とするものではないアレルギー反応に起因し、当該疾患の検査においてグランザイムＡ検出用抗体として使用される上記［６］記載のバイオマーカー。
［８］アレルギー性疾患が掻痒を伴うアレルギー性疾患である上記［６］または［７］に記載のバイオマーカー。
［９］下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（Ａ）被験者の生体試料中のグランザイムＡの発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
［１０］下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むアレルギー性疾患の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と上記［６］～［８］いずれかに記載のバイオマーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該バイオマーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、前記バイオマーカーを指標として測定する工程、および
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
［１１］下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、グランザイムＡの発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質とグランザイムＡの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させた細胞におけるグランザイムＡの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるグランザイムＡの発現量と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、グランザイムＡの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
［１２］下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、掻痒を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質をグランザイムＡに接触させる工程、
(ｂ)被験物質によるグランザイムＡ活性の阻害を測定する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の測定結果に基づいて、掻痒を抑制する被験物質を選択する工程。
［１３］前記掻痒がアレルギー性疾患に伴うものである、上記［１２］に記載のスクリーニング方法。
「１４」グランザイムＡに結合する抗体を含有してなるアレルギー性疾患の治療剤。
［１５］グランザイムＡの発現量を抑制する物質を有効成分とする、アレルギー性疾患の治療剤。
［１６］前記物質がグランザイムＡに対する抗体または当該抗体をコードする核酸分子を含む発現ベクターである上記［１５］に記載の治療剤。
［１７］セリンプロテアーゼ阻害作用を有するものである上記［１５］または［１６］のいずれかに記載の治療剤。
［１８］グランザイムＡ遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とする、アレルギー性疾患の治療剤。
［１９］前記物質が、グランザイムＡ遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸またはｓｉＲＮＡである上記［１８］に記載の治療剤。
［２０］セリンプロテアーゼ阻害作用を有するものである上記［１８］または［１９］に記載の治療剤。
　本発明のバイオマーカーによると、従来の抗アレルギー薬が効きにくい難治性の掻痒性皮膚疾患の指標を提供することが可能となり、当該疾患の容易かつ的確な診断をすることができる。本発明のアレルギー性疾患の診断方法によると、抗原抗体反応系に依存したものでないIV型アレルギー様な反応が存在するアレルギー疾患の診断等が可能となる。
　特に、抗ヒスタミン薬を投与しても効果がない又は効果が低いアレルギー疾患の患者を、本発明のバイオマーカーにより同定することができる。アレルギー治療において第一選択薬として抗ヒスタミン薬が処方されることが多い現状の下では、上記患者を治療前に同定して、別の治療計画を取ることにより、無駄な治療を避け、より効果的な治療方針を選択でき、患者の経済的及び精神的な負担が軽減できるとともに、医療費の削減を図ることができる。
　本発明のスクリーニング方法によると、グランザイムＡの作用機序に基づく新規なアレルギー性疾患の治療剤の開発が可能となる。本発明の治療剤によると、グランザイムＡの作用を特異的に調節することができ、副作用の少ないアレルギー性疾患の治療が可能となる。
図１は、蚊唾液腺抽出物で感作したマウス皮膚と非感作マウスの皮膚のプロテアーゼ活性を示した図である。縦軸は、非感作マウスにおけるプロテアーゼ活性を１００としたときの相対値である。 図２は、蚊唾液腺抽出物で感作したマウスに蚊唾液腺抽出物を投与すると、セリンプロテアーゼが遊離することを示す図である。 図３は、蚊唾液腺抽出で感作したマウス皮膚と非感作マウス皮膚について、マスト細胞数を比べた写真である。 図４は、蚊唾液腺抽出で感作したマウス皮膚と非感作マウス皮膚について、ＣＤ４＋Ｔ細胞数を比べた写真である。 図５は、皮膚で発現しているグランザイムのサブタイプについて、リアルタイムＰＣＲ法で調べた結果を示す図である。 図６は、皮膚から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞に発現しているグランザイムのサブタイプについて、リアルタイムＰＣＲ法で調べた結果を示す図である。 図７は、健常マウスにグランザイムＡを皮内注射した場合における掻き動作の誘発を示す図である。 図８は、グランザイムＡの皮内注射で誘発された掻き動作が、ナルトレキソンで抑制されることを示す図である。 図９は、アトピー性皮膚炎マウスであるＮＣマウスについて、痒みや皮膚炎の発生していない（SPF飼育）マウス皮膚より、痒みや皮膚炎の発生しているマウス（コンベンショナル飼育）でグランザイムＡのｍＲＮＡの発現が増加することを示す図である。
　本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
　本明細書において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖となどの各１本鎖ＤＮＡを意味する。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子(ＤＮＡ)とは、特に断らない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「遺伝子」または「ＤＮＡ」には、特定の塩基配列（配列番号１）で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば同族体（ホモログ、スプライスバリアントなど）、変異体および誘導体）をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」が含まれる。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」としては、具体的には、後述のストリンジェントな条件下で、前記の配列番号１で示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」または「ＤＮＡ」を挙げることができる。
　例えばヒト由来のタンパク質のホモログをコードする遺伝子としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（ホモログ）は、HomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）にかけて一致する（Scoreが最も高く、E-valueが0でかつ Identityが100%を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGene（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）に入力して得られたUniGene Cluster ID（Hs.で示す番号）をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）としてマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜することができる。
　なお、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
　本明細書において「グランザイムＡ遺伝子」または「グランザイムＡのＤＮＡ」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定塩基配列（配列番号１）で示されるヒトグランザイムＡ遺伝子（ＤＮＡ）や、その同族体、変異体および誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を含む。具体的には、配列番号:１に記載のヒトグランザイムＡ遺伝子（GenBank Accession No. NM_006144）や、そのマウスホモログ（例えば、GenBank Accession No. NM_010370, XM_906760）などが挙げられる。
　本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」とは、特定のアミノ酸配列（配列番号２）で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などを意味する。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらは HomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、および人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。またアミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体を含み、具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。
　本明細書において「グランザイムＡタンパク質」または単に「グランザイムＡ（以下、ＧＺＭＡと略することもある）」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号２）で示されるヒトグランザイムＡやその同族体、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などを意味する。具体的には、配列番号２（GenBank Accession No. NP_006135.1）に記載のアミノ酸配列を有するヒトグランザイムＡや、そのマウスホモログ（例えば、GenBank Accession No. NP_034500.1）などが挙げられる。
　本明細書において「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部を意味する。
　本明細書において「バイオマーカー」とは、アレルギー性疾患の罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断するために、またアレルギー性疾患の予防、治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接または間接的に利用されるものをいう。これには、アレルギー性疾患の罹患に関連して生体内において、発現が変動する遺伝子またはタンパク質を特異的に認識し、また結合することのできる（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドまたは抗体が含まれる。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子およびタンパク質を検出するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
　本明細書において診断対象となる「生体組織」とは、抗原刺激によるアレルギー性疾患に伴い本発明のグランザイムＡ遺伝子が発現上昇する組織または細胞をいう。具体的には、皮膚、ＣＤ４＋Ｔ細胞などが挙げられる。
　本明細書において「アレルギー疾患」とは、いわゆる即時型アレルギーと呼ばれるＩ型アレルギー及び非Ｉ型アレルギー（非即時型アレルギー）の両者を含み、好ましくは、「アレルギー疾患」とは、即時型アレルギー反応および非即時型アレルギー反応に起因するアレルギー疾患であって、ヒスタミン遊離のみに依存しないアレルギー疾患をいう。ヒスタミン遊離のみに依存しないアレルギー疾患とは、ヒスタミン遊離を伴うアレルギー疾患又はヒスタミンの遊離を伴わないアレルギー疾患であって、グランザイムＡのような他の因子が介在するアレルギーをいう。すなわち、ヒスタミンの遊離を伴うアレルギー疾患の場合には、少なくともヒスタミン及びグランザイムＡを介してアレルギー反応が生じる場合をいい、ヒスタミンの遊離を伴わないアレルギー疾患の場合には、少なくともグランザイムＡを介してアレルギー反応が生じる場合をいう。具体的なアレルギー疾患の例として、例えば、アトピー性皮膚炎、掻痒症、蚊・ブヨ・毛虫などの虫刺されによるかゆみなどが挙げられる。
　本発明のバイオマーカーは、グランザイムＡ遺伝子の塩基配列において、一部の塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはそれに相補的なポリヌクレオチドを含有することを特徴とするものである。具体的には、本発明のバイオマーカーは、配列番号1に記載のグランザイムＡ遺伝子の塩基配列において、一部、例えば、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはそれに相補的なポリヌクレオチドを含有するものを挙げることができる。
　ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、グランザイムＡ遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において、例えば、連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体またはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも９０％、好ましくは９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
　ここで、正鎖側のポリヌクレオチドには、前記グランザイムＡ遺伝子の塩基配列、またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
　さらに上記正鎖のポリヌクレオチドおよび相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態でバイオマーカーとして使用されても、また二本鎖の形態でバイオマーカーとして使用されてもよい。
　本発明のアレルギー性疾患のバイオマーカーは、具体的には、グランザイムＡ遺伝子の塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。またこれらグランザイムＡ遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列またはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される例えば、１５個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
　なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、グランザイムＡ遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またＲＴ－ＰＣＲ法においては、グランザイムＡ遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
　本発明のバイオマーカーは、例えば、配列番号１に記載のヒトグランザイムＡ遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）またはベクターNTI （Infomax社製）を利用して設計することができる。具体的には前記本発明遺伝子の塩基配列を primer 3またはベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、もしくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
　本発明バイオマーカーをアレルギー性疾患の検出においてプライマーとして用いる場合には、通常15bp～100bp、好ましくは15bp～50bp、より好ましくは15bp～35bpの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp～全配列の塩基数、好ましくは 15bp～1kb、より好ましくは100bp～1kbの塩基長を有するものが例示できる。
　本発明のバイオマーカーは、ノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、in situハイブリダーゼーション法などの特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。該利用によってアレルギー性疾患におけるグランザイムＡ遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。
　本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする：
（Ａ）被験者の生体試料中のグランザイム遺伝子の発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
　例えば、本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと本発明バイオマーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該バイオマーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、前記バイオマーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
　測定対象物としてＲＮＡを利用する場合、具体的には、本発明の診断方法は、本発明のバイオマーカーをプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などにより前記バイオマーカーへのＲＮＡまたはその転写物の結合量が増大していることを指標として行うことにより実施できる。
　測定対象の生体試料としては、使用する検出手段の種類に応じて、被験者の生体組織、例えば、皮膚や粘膜の一部をバイオプシ（生検）等で採取するか、または血液などの体液中に存在する細胞を回収して得られた検体から常法に従って調製したtotal ＲＮＡを用いてもよいし、さらに該ＲＮＡをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
　ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記バイオマーカーをプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中のグランザイムＡ遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明のバイオマーカー（相補鎖）を放射性同位元素（ＲＩ）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、形成されたバイオマーカー（ＤＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖を、バイオマーカーの標識物（ＲＩもしくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。
　ＲＴ－ＰＣＲ法を利用する場合は、本発明の上記バイオマーカーをプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中のグランザイムＡ遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的のグランザイムＡ遺伝子の領域が増幅できるように、本発明のバイオマーカーから調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（－鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めＲＩや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識したバイオマーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はバイオアナライザーなどで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems社製)で該プロトコールに従ってＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製し、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
　ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記バイオマーカーをＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、例えば、これに被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法によって調製し、ビオチンで標識されたｃＲＮＡとハイブリダイズさせて、形成されたＤＮＡとｃＲＮＡとの二本鎖を、蛍光標識されたアビジンで検出する方法を挙げることができる。
　In situハイブリダイゼーション法を利用する場合は、前述の被験者の生体組織を生検によって採取し、切片を調製する。本発明のバイオマーカー遺伝子の特異的アンチセンスプローブまたはセンスプローブを作製する。前記プローブは、ＲＩ標識または非ＲＩ標識（例えば、ＤＩＧ標識）でラベリングする。前記切片を脱パラフィン（パラフィン切片の場合）および前処理した後、エタノール等で固定する。固定した切片をプレハイブリダイズし、前記プローブとハイブリダイズした後、洗浄およびＲＮａｓｅ処理を行い、標識に応じた検出方法（例えば、ＲＩ標識の場合は現像、非ＲＩ標識の場合は免疫学的検出と検鏡）により生体組織におけるグランザイムＡ遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。
　本発明の診断方法において、前記工程（ｃ）におけるアレルギー性疾患の有無の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、バイオマーカーへの結合量が増大していることを指標として行われることが好ましい。
　別の態様として、本発明のバイオマーカーは、グランザイムＡを認識する抗体を含有することを特徴とするものである。
　前記抗体は、被験者の生体試料におけるグランザイムＡタンパク質の有無またはその程度を検出することによって、該被験者がアレルギー性疾患に罹患しているか否かまたはその程度を測定することのできるツール（バイオマーカー）として有用である。
　また前記抗体は、後述するアレルギー性疾患の症状の予防、予想において、グランザイムＡタンパク質の発現変動を検出するためのツール（バイオマーカー）としても有用である。
　前記抗体は、その形態に特に制限はなく、グランザイムＡタンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらに、前記モノクローナル抗体をコードする遺伝子に基づいて作製されたキメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントであってもよい。
　これらの抗体の製造方法は公知であり、前記抗体も常法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12～11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したグランザイムＡタンパク質を用いて、あるいは常法に従ってこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、ウサギ、ヤギなどの非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したグランザイムＡタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウスなどの非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubelet al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4～11.11）。
　抗体の作製に免疫抗原として使用されるグランザイムＡタンパク質は、本発明などにより提供される遺伝子の配列情報（配列番号１等）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
　具体的には、グランザイムＡタンパク質をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えＤＮＡ（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また、これらグランザイムＡタンパク質の部分ペプチドは、本発明等により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号２等）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
　これらのバイオマーカーは、キットの形状とすることもできる。キットは、例えば、グランザイムＡ遺伝子の一部の塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび／または当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドや、抗グランザイムＡ抗体を含む。ポリヌクレオチドを含むキットの場合には、ｄＮＴＰ、逆転写酵素、ＤＮＡ合成酵素、緩衝液などをさらに含むが、これらに限定されることなく、当業者は必要に応じてキットに含まれる他の構成を選択することができる。抗グランザイムＡ抗体を含むキットの場合には、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、免疫組織染色法に応じて、緩衝液、２次抗体、マーカー等を含むことができ、当業者は必要に応じてキットに含まれる他の構成を選択することができる。
　また、抗グランザイムＡ抗体及び基質ペプチドを用いて、グランザイムＡの活性を直接又は間接的に測定するキットとすることもできる。
　本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする：
（Ａ）被験者の生体試料中のグランザイムＡの発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
　１つの態様において、本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、本発明のバイオマーカーを用いることを特徴とする。前記バイオマーカーは、グランザイムＡタンパク質に特異的に結合する性質を有することから、動物の組織内に発現したグランザイムＡタンパク質を特異的に検出することができる。
　例えば、本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、下記の工程(ａ)、(ｂ)および(ｃ)を含む方法によって実施することができる：
(ａ)被験者の生体試料から調製されたタンパク質と本発明のバイオマーカー（抗体）とを結合させる工程、
(ｂ)該バイオマーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、上記バイオマーカーを指標として測定する工程、
(ｃ)上記(ｂ)の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の罹患を判断する工程。
　測定対象物としてタンパク質を利用する場合、具体的には、本発明の診断方法は、本発明のバイオマーカー（抗体）をグランザイムＡ検出用抗体として用いて、ウェスタンブロッティング法、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、免疫組織染色法などの検出手段により前記バイオマーカーへのタンパク質の結合量が増大していることを指標として行うことにより実施できる。
　測定対象試料としては、使用する検出手段の種類に応じて、皮膚など被験者の組織の一部をバイオプシー等で採取するか、または血液など体液中に存在する細胞等を回収して得られた検体から常法に従って調製したタンパク質または体液中に溶解しているタンパク質を用いることができる。
　より具体的には、本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、本発明のバイオマーカー（抗体）を用いて、ウェスタンブロット法などにより当該マーカーへのグランザイムＡタンパク質の結合量が増大していることを指標として行うことにより実施できる。
　ウェスタンブロット法を利用する場合は、一次抗体として本発明バイオマーカーを用いた後、二次抗体として125Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した二次抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。
　免疫組織染色法を利用する場合は、例えば、グランザイムＡが発現している細胞を酵素標識抗体とその発色基質を用いて測定することができる。
　アレルギー性疾患の診断は、被験者の皮膚生検組織中、血液中、ＣＤ４＋Ｔ細胞などのグランザイムＡ遺伝子の発現レベル、またはグランザイムＡタンパク質の量、機能もしくは活性（以下これらを合わせて「タンパク質レベル」ということがある）を、測定することによって行うことができる。
　本発明のグランザイムＡの発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質とグランザイムＡの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるグランザイムの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるグランザイムＡの発現量と比較する工程、
（ｃ）前記(ｂ)の比較結果に基づいて、グランザイムＡの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
　工程（ａ）において、被験物質としては、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などが挙げられる。
　工程（ａ）において、グランザイムＡの発現を測定可能な細胞としては、内在性および外来性を問わずグランザイムＡを発現する培養細胞全般、レポーター遺伝子を含む細胞などを挙げることができる。培養細胞においてこれら遺伝子が発現しているか否かは、公知のノーザンブロット法やＲＴ－ＰＣＲ法にてこれらの遺伝子発現を検出することにより、容易に確認することができる。
　具体的には、例えば、アレルギー性疾患の動物より単離、調製したＣＤ４＋Ｔ細胞またはその細胞株；本発明遺伝子のいずれかを導入した細胞；レポーター（ルシフェラーゼ、ＧＦＰ等）遺伝子を導入した細胞などを挙げることができる。
　動物モデルとしては、アレルギー性疾患の動物モデルとして周知である如何なる動物モデルをも用いることができ、具体的には、通常環境下で飼育したＮＣ系マウスなどを挙げることができる。
　遺伝子導入用の細胞としては、ＣＨＯ、ＭＣＦ－７Mammary carcinoma cell、Ｈ２９５Ｒ adrenal cellなどをあげることができる。
　工程（ａ）において、被験物質は、グランザイムＡの発現を測定可能な細胞と培養培地中で接触される。前記細胞としては、掻痒を伴うアレルギー性疾患の動物より単離、調製したＣＤ４＋Ｔ細胞が好ましく用いられ得る。前記培養培地は、グランザイムＡの発現を測定可能な細胞に応じて適宜選択されるが、例えば、約5～20％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ1640培地、199培地などが挙げられる。培養条件も同様に適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約6～8であり、培養温度は通常約30～40℃であり、培養時間は約12～72時間である。
　工程（ｂ）において、発現量の測定は、ｍＲＮＡまたはタンパク質を対象として行なわれる。ｍＲＮＡの発現量は、例えば、細胞からtotal ＲＮＡを調製し、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティングなどにより測定される。タンパク質の発現量は、例えば、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定することができる。免疫学的手法としては、ウェスタンブロッティング法、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法などを用いることができる。また、レポーター遺伝子を含む細胞（例、グランザイムＡのプロモーターの下流に機能可能にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ）が連結されたベクターが導入された細胞）が用いられた場合、発現量は、レポーター遺伝子のシグナル強度に基づき測定される。
　工程（ｂ）において、発現量の比較は、被験物質の存在下、非存在下において、グランザイムＡの発現量における有意差の有無に基づいて行なわれる。なお、被験物質を接触させない対照細胞におけるグランザイムＡの発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるグランザイムＡの発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
　工程（ｃ）において、グランザイムＡの発現量を減少させる被験物質が選択される。このように選択された被験物質には、本スクリーニング方法の性質上、グランザイムＡの発現量を変動させ得る物質をも含まれる。選択された被験物質は、掻痒を伴うアレルギー性疾患の治療剤（例えば、アトピー性皮膚炎の治療薬、特に、ヒスタミン抵抗性の掻痒に対する治療剤）の候補のみならず、研究用試薬としても有用である。
　また、本発明の掻痒を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質をグランザイムＡに接触させる工程、
（ｂ）被験物質によるグランザイムＡの活性阻害を測定する工程、および
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、掻痒を抑制する被験物質を選択する工程。
　工程（ａ）において、被験物質としては、前記したとおりである。
　工程（ａ）において、被験物質を、グランザイムＡと接触させるが、これは、通常の酵素阻害を測定する工程に準じて行えばよい。
　工程（ｂ）において、グランザイムＡの活性阻害の測定は、特異的基質ペプチドに結合したニトロアニリドから酵素により切断され遊離した特定の吸収波長を持つ遊離ニトロアニリドの量を測定する。
　工程（ｃ）において、グランザイムＡの活性を阻害する被験物質が選択される。このように選択された被験物質は、掻痒を伴うアレルギー性疾患の治療剤（例えば、アトピー性皮膚炎の治療薬、特に、ヒスタミン抵抗性の掻痒に対する治療剤）の候補のみならず、研究用試薬としても有用である。
　本発明のバイオマーカーのうち、上記抗体を含有するバイオマーカーは、動物に適用することによって、アレルギー性疾患の状態の変動を予防または治療することができ、本発明はかかる方法を提供する。上記抗体の中でも、特に、中和抗体が好ましい。
　前記動物は、ヒトおよびヒトを除く脊椎動物であることが好ましく、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、ネコなどの家畜または愛玩動物が好ましい。
　本発明は、前記バイオマーカーの量または作用を阻害する物質を有効成分として含有するアレルギー性疾患の治療剤を提供する。
　本発明の治療剤は、グランザイムＡの量または作用を阻害するものであれば特に制限されるものではなく、例えば、前記各種抗体、公知のセリンプロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。
　本発明の治療剤は、アレルギー性疾患の治療剤、好ましく掻痒を伴うアレルギー疾患の治療剤として用いられる。
　本発明の治療剤は、前記有効成分そのままであってもよく、公知の薬学的に許容される担体などを含んでもよい。前記担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなどの賦形剤；セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプンなどの結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウムなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウムなどの滑剤；クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉などの芳香剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベンなどの保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸などの安定剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウムなどの懸濁剤；界面活性剤などの分散剤；水、生理食塩水などの希釈剤；カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油などのベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
　別の態様として、本発明の治療剤は、グランザイムＡ遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有するものである。
　前記物質は、グランザイムＡ遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸またはｓｉＲＮＡであることが好ましい。
　「アンチセンス核酸」とは、標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。
　「リボザイム」とは、核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本発明では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。
　「デコイ核酸」とは、転写調節因子が結合する領域を模倣する核酸分子をいい、グランザイムＡの発現を抑制する物質としてのデコイ核酸は、グランザイムＡに対する転写活性化因子が結合する領域を模倣する核酸分子であり得る。本発明では、デコイ核酸としては、リン酸ジエステル結合部分の酸素原子を硫黄原子で置換したチオリン酸ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（Ｓ－オリゴ）、又はリン酸ジエステル結合を電荷を持たないメチルホスフェート基で置換したオリゴヌクレオチドなど、生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変したオリゴヌクレオチドなどが含まれる。デコイ核酸は転写活性化因子が結合する領域と完全に一致していてもよいが、グランザイムＡに対する転写活性化因子が結合し得る程度の同一性を保持していればよい。デコイ核酸の長さは転写活性化因子が結合する限り特に制限されない。また、デコイ核酸は、同一領域を反復して含んでいてもよい。
　「ｓｉＲＮＡ」とは、グランザイムＡのｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な二本鎖オリゴＲＮＡである。ｓｉＲＮＡを細胞に導入することによって、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象が起こり、前記リボザイムと同様の効果が期待される。
　前記アンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸、およびｓｉＲＮＡは、公知の方法にしたがって作製することができる。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
［蚊の飼育］
　実験に用いた蚊は、富山大学医学部感染予防医学教室から提供されたヒトスジシマカ (Aedes albopictus) 雌成虫を使用した。成虫は、布製のケージ (30×30×30 cm) で飼育し、3%スクロース水溶液を自由摂取させた。幼虫はプラスチックケージ (25×35×12 cm) にイオン交換水を入れ、エアーポンプで空気を循環させ飼育し、餌として乾燥酵母とベビーフードを1:1の割合で混ぜたものを与えた。蛹はイオン交換水を入れた容器に集めた後、布製のケージに入れ孵化させた。
［蚊の唾液腺抽出物(ESGM) の調製と感作マウスの作製］
雌性ヒトスジシマカを凍死させ、顕微鏡下で足、翅、頭部、腹部を切除し、胸部のみを単離し、エッペンドルフチューブに集めた。少量の蒸留水を加え、ホモジナイズ (1,500rpm, 4℃, 5分間)した後、遠心 (約9,000×g, 30分間) し、上清をフィルター (セルロースアセテート0.45μm、アドバンテック東洋社)に通した。Bio-Rad Dye ReagentとLyophilized Bovine Serum Albumin (Bio-Red Laboratories, 米国) を用いて590 nmでの吸光度からタンパク量を求め、エッペンドルフチューブ1本あたり100μgになるように分注し、凍結乾燥後、-80℃で保存した。
　ESGMを50μL中のタンパク量が10μgになるように生理食塩水に溶解した。これをマウスの尾側背部に週2回，計8回皮内注射することにより，感作マウスを作製した。感作後、ESGM (10μg /site)をマウスの吻側背部に皮内注射し、掻き動作を惹起した。
［皮膚内トリプターゼ(tryptase)様セリンプロテアーゼ活性測定］
　Wolter et al. (2001) の手法を参考に、トリプターゼの合成基質を用いて皮膚内トリプターゼ様セリンプロテアーゼ活性を測定した。N-p-Tosyl-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilideacetate salt (シグマ・アルドリッチ社) を合成基質として用いた。酵素の活性は，遊離ニトロアニリド量を分光光度計 (ImmunoMini NJ-2300) で測定することによって求めた。
　実験前日にマウスの吻側背部を除毛し、実験当日に皮膚 (直径17mm) を採取した。採取後の皮膚は1.5mLの10mMトリス溶液 (pH6.1; 2M塩化ナトリウム含有) 中でホモジナイズした。10分間の超音波処理後、4℃、5000rpmで5分間遠心し上清を採取した。0.06Mトリス溶液(pH7.8; 0.4%ジメチルスルホキシド, 30μg/mLヘパリン含有) を反応用溶液Ａとした。合成基質をジメチルスルホキシドで10mg/mLに調整し、さらに反応用溶液Ａを用いて480μg/mLに希釈したものを基質溶液とした。反応用溶液49μLとサンプル1μL、基質溶液50μLを37℃で1時間反応させた後、420nmにおける吸光度を測定した。
［皮膚内遊離トリプターゼ様セリンプロテアーゼ活性測定］
　実験前々日にマウスの背部を除毛した。実験当日、マウスをウレタン(1.8g/kg) 麻酔下で腹這いの状態で保温板上に固定した。その後、23Gの注射針を2本、約1cm間隔でマウスの吻側背部の皮内に通し、ステンレス針金を通した透析チューブを皮内中の針の中に通し、透析チューブを傷つけないよう針だけを抜き取った。透析チューブを乾燥させないよう注意しながら、塩化ビニルチューブ(p-10 tube) を、透析チューブが皮膚から出ている部分に接着剤で接着させた。その後，EICOM EP-60 MICRO SYRINGE PUMP (エイコム社)を用い、酵素用溶液(pH7.3; 0.5mMトリス、0.1M塩化ナトリウム含有) を1μl/minの流速で1時間皮膚内に灌流させた。これを予備処理とし、その後の皮膚灌流液を氷浴中で5分毎に採取し
た。予備処理後15分間のサンプルを採取した後、灌流を一時止めてESGMまたは生理食塩水を透析チューブ周辺に4回、特定の箇所に50μLの容量で透析チューブを傷つけないように皮内注射した。注射直後に灌流を再開し、注射後40分まで皮膚灌流液を採取した。反応用溶液Ｂ(pH7.77; 85.74mMトリス, 0.572%ジメチルスルホキシド, 42.87μg/mLヘパリン含有)を30μLに、合成基質をジメチルスルホキシドで10mg/mLに調製し、さらに反応用溶液Ｂで480μg/mLに希釈した基質溶液50μL、マウス2匹から採取したサンプルを20μLの容量で37℃で2日間反応させ、420nmにおける吸光度を測定した。
［ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離］
　前日にマウスの吻側背部の皮膚を除毛した。当日、マウスをエチルカーボネート(1.8 g/kg) 麻酔下で、0.1Mリン酸緩衝食塩液(PBS; pH7.4)を用いて脱血し、エタノールで消毒した皮膚を摘出した。摘出皮膚を10mLのRPMI1640 (0.25%colagenaseA含有)に漬けて、37℃で30分間攪拌した。最終濃度10mMになるようにエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加え、直ちに氷浴で冷やした。5分後、浮いている細胞を集め、残留皮膚をPBS (10mM EDTA含有)で2回洗浄し、洗浄に用いた液を集めた。集めた液を70μmおよび40μmのナイロンメッシュに通過させた。通過した液を4℃、2000rpmで20分間遠心した。上清を捨て、5mLのRPMI1640で再度懸濁し、懸濁液からLympholyte-M (CEDARLANE社,カナダ)を用いてリンパ球を単離した。引き続きＣＤ４カラム(RD systems社,米国)を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。
［切片標本作製］
　マウスをエチルカーボネート(1.8g/kg) 麻酔下で、0.1Mリン酸緩衝食塩液(PBS; pH7.4)を用いて脱血し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定した。皮膚を摘出後、4% PFAで4時間後固定し、その後30%スクロース(含0.1Mリン酸緩衝液)で置換した。24時間後，OTC compound (サクラファインテクニカル社) で包埋し凍結した。トルイジンブルー染色用サンプルはクリオスタットにて20μmに薄切し、ゼラチンコーティングしてあるスライドグラスに貼り付け、染色時まで-80℃で遮光保存した。免疫染色用サンプルはクリオスタットにて40μmに薄切し，染色時まで0.1M PBS (0.02%アジ化ナトリウム含有) 中にて、4℃で遮光保存した。
・トルイジンブルー染色
　切片を0.1%トルイジンブルーに15-20分間浸した。組織が青く染まったら、切片を水で洗浄し、ポリマウントで封入した。組織標本は光学顕微鏡 (AX80, オリンパス光学工業)を用いて観察した。
・免疫染色
　切片を1.5%ウシ胎仔血清(FCS)でブロッキング後、ラット抗マウスＣＤ４モノクローナル抗体(1:100, BD Pharmingen社,米国) と4℃で一晩反応させた。PBST (0.2%Tween20含有PBS)で2回洗浄後、Cy3標識抗ラットIgGポリクローナル抗体 (1:1000, Chemicon社,米国)と室温で2時間反応させた。PBSTで洗浄後、スライドグラスに貼り付け、乾燥後にDABCO(1,4-diazabicyclo[2,2,2] octane)で封入した。組織標本は共焦点/多光子レーザー走査顕微鏡 (Radeance 2100 MP; Bio-Rad社,米国) を用いて観察した。
［ＲＮＡ抽出］
　マウスをエチルカーボネート(1.8g/kg) 麻酔下で、0.1Mリン酸緩衝食塩液(PBS; pH7.4)を用いて脱血し、皮膚および脾臓を摘出し断片化した。サンプルは液体窒素により凍結し、-80℃で使用するまで保管した。Trizol reagent (インビトロゲン社)にサンプルを入れ、ホモジナイズした。室温で5分静置後、クロロホルム:イソアミルアルコール(CIA)を加え、15秒撹拌した後、14,000rpm、4℃で15分間遠心した。上清を集め、等量の100%エタノールを加え、撹拌し、カラム (シグマ・アルドリッチ社) に入れた。15,000rpmで15秒間遠心し、遺伝子をカラムに吸着させた。カラムをWash solution Iで洗浄後，DNase I処理 (室温, 15分)し、再度Wash solution Iで洗浄した。さらにWash solution IIで二度洗浄後に，elution solutionを用いて、ＲＮＡをカラムから溶出させた。ＲＮＡ量はNanoDrop（LMS社)で測定した。
［逆転写反応］
　サンプルＲＮＡ1μg、oligo dT16 primer 25 pmolをＰＣＲチューブに入れ、RNase free waterで全量が5μLになるように調製し、これを70℃で5分間反応させ、その後4℃で5分間急冷した。下記の組成Ａの反応液を1サンプルに15μLずつ加え、25℃で5分間、37℃で1時間、72℃で15分間の順で反応させた。
＜組成Ａ（全量15μL）＞
・5×Reaction buffer      (和光純薬) 4μL
・MgCl2 (25mM) (和光純薬)　最終濃度3mM　2.4μL
・dNTP (2mM each dNTP)（ABI，USA）最終濃度0.5mM　5μL
・RNase inhibitor（東洋紡積） 最終濃度1U/μL　0.5μL
・ReverScript III（和光純薬）1μL
・RNase free water　2.1μL
［ＰＣＲ反応］
　逆転写（ＲＴ）産物を下記の組成Ｂで混合し、サーマルサイクラー (タカラバイオ) にて反応した。混合液は95℃で2分間反応させ、続いて95℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で50秒間のサイクルで繰り返し30回反応させた。最後に72℃で5分間反応させた後、4℃で反応を終了させた。ＰＣＲ産物を1%アガロースゲルで電気泳動により分離した後、アガロースゲルをエチジウムブロマイド溶液に漬けた。20分後、ＵＶをゲルに照射した状態でゲルを撮影した。
＜組成Ｂ（全量50μL）＞
・5×Green GoTaq Flexi Buffer（Promega,米国）10μL
・MgCl2(25mM)（和光純薬）最終濃度1.5mM 3μL
・dNTP (2mM each dNTP)（ABI,米国)最終濃度0.2mM 5μL
・Sens primer*1（北海道システムサイエンス）最終濃度1μM 1μL
・Anti-sens primer*1（北海道システムサイエンス）最終濃度1μM 1μL
・GoTaq DNA polymerase (5 u/μL)（Promega,米国) 最終濃度1.25u　0.25μL
・Template DNA　1μL
・滅菌水　28.75μL
＊１：Sens primerおよび・Anti-sens primerを表１に示す
［リアルタイムＰＣＲ］
ＲＴ産物を下記の組成Ｃで混合しMx3000P & Mx3005P Real-Time PCR System (STRATAGENE,米国)にて反応した。混合液は95℃で1分間反応させ、続いて95℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で50秒間のサイクルで繰り返し40回反応させた。最後に72℃で5分間反応させた後、4℃で反応を終了させた。MxPro QPCR Software (STRATAGENE,米国) によりＰＣＲ産物の増幅を解析した。
＜組成Ｃ（全量25μL）＞
・2×SYBR Premix Ex Taq（タカラバイオ）12.5μL
・Sens primer*1（北海道システムサイエンス）最終濃度1μM 1μL
・Anti-sens primer*1（北海道システムサイエンス）最終濃度1μM 1μL
・GoTaq DNA polymerase (5 u/μl)（Promega, USA) 最終濃度1.25u　0.25μL
・Template DNA　1μL
・滅菌水　10.5μL
＊１：Sens primerおよび・Anti-sens primerを表１に示す
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［行動実験］
　実験前日にマウスの吻側背部を除毛し、実験当日、マウスを環境に慣れさせるため、1時間、観察用ケージに入れて放置した。慣らし後、グランザイムＡ(0.1-100μg/site) またはESGM (10μg/50μL) をマウスの吻側背部に皮内注射した。投与後、直ちにマウスを観察用ケージ(13×9×30 cm) に戻し、無人環境下での行動を8ミリビデオカメラで撮影した。プロテアーゼインヒビターは、マウスの体重10gあたり0.05mLの用量で、ESGM投与の30秒前に尾静脈内注射した。ナルトレキソンは、マウスの体重10 gあたり0.1mLの用量で、グランザイムＡ投与の15分前に皮下注射した。注射後の行動をビデオの再生により観察した。掻き動作は後肢による注射部位及びその近傍への掻き動作の回数を数えた。マウスは，通常約1秒間に数回の掻き動作を行うが，この一連の動作を1回の掻き動作として測定した。
実験結果
（１）蚊唾液腺抽出物で感作したマウス皮膚のプロテアーゼ活性は、非感作マウスと比べて有意に増加している（図１）。
（２）皮膚灌流法を用いて採取した灌流液を用い、セリンプロテアーゼ特異的基質を利用して活性化試験を行った結果、蚊唾液腺抽出物で感作したマウスに蚊唾液腺抽出物を投与すると、セリンプロテアーゼが遊離する（図２）。
（３）蚊唾液腺抽出で感作したマウス皮膚と非感作マウス皮膚では、マスト細胞の数は変化しない(図３）。
（４）蚊唾液腺抽出で感作したマウス皮膚では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が非感作マウス皮膚と比べ増加している(図４）。
（５）リンパ球で発現が報告されているグランザイムについて、どのサブタイプが皮膚で発現しているかをリアルタイムＰＣＲ法で調べた。グランザイムＡ、ＢおよびＣが蚊唾液腺抽出で感作したマウス皮膚で増加していた（図５）。
（６）皮膚から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞には、グランザイムＡのみ発現していた(図６)。
（７）健常マウスへのグランザイムＡの皮内注射により10μg/siteをピークとして掻き動作が誘発された (図７)。
（８）グランザイムＡを皮内注射すると掻き動作を誘発されるが（図７）、掻き動作は、ナルトレキソンで抑制される（図８）。痒み反応と推測される。
（９）アトピー性皮膚炎マウスであるＮＣマウスでは、痒みや皮膚炎の発生していない（SPF飼育）マウス皮膚より、痒みや皮膚炎の発生しているマウス（コンベンショナル飼育）でグランザイムＡのｍＲＮＡの発現が増加していた（図９）。
　本発明によれば、従来の抗アレルギー薬が効きにくい難治性の掻痒性皮膚疾患の指標を提供することが可能となり、当該疾患の容易かつ的確な診断をすることができるとともに、グランザイムＡの作用機序に基づく新規なアレルギー性疾患の治療剤の開発が可能となる。

Claims (20)

  1. 　グランザイムＡ遺伝子の一部の塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび／または当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有してなるアレルギー性疾患のバイオマーカー。
  2. 　アレルギー性疾患が、ヒスタミン遊離のみを原因とするものではないアレルギー反応に起因し、当該疾患の検査においてプローブまたはプライマーとして使用される請求項１記載のバイオマーカー。
  3. 　アレルギー性疾患が掻痒を伴うアレルギー性疾患である請求項１または２に記載のバイオマーカー。
  4. 　下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
    （Ａ）被験者の生体試料中のグランザイム遺伝子の発現量を測定する工程、および
    （Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
  5. 　下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
    （ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと請求項１～３いずれかに記載のバイオマーカーとを結合させる工程、
    （ｂ）該バイオマーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、前記バイオマーカーを指標として測定する工程、
    （ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
  6. 　グランザイムＡを認識する抗体を含有してなるアレルギー性疾患のバイオマーカー。
  7. 　アレルギー性疾患が、ヒスタミン遊離のみを原因とするものではないアレルギー反応に起因し、当該疾患の検査においてグランザイムＡ検出用抗体として使用される請求項６記載のバイオマーカー。
  8. 　アレルギー性疾患が掻痒を伴うアレルギー性疾患である請求項６または７に記載のバイオマーカー。
  9. 下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
    （Ａ）被験者の生体試料中のグランザイムＡの発現量を測定する工程、および
    （Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
  10. 下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むアレルギー性疾患の診断方法：
    （ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と請求項６～８いずれかに記載のバイオマーカーとを結合させる工程、
    （ｂ）該バイオマーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、前記バイオマーカーを指標として測定する工程、および
    （ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
  11. 下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、グランザイムＡの発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
    (ａ)被験物質とグランザイムＡの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
    (ｂ)被験物質を接触させた細胞におけるグランザイムＡの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるグランザイムＡの発現量と比較する工程、および
    (ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、グランザイムＡの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
  12. 下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、掻痒を抑制する物質のスクリーニング方法：
    (ａ)被験物質をグランザイムＡに接触させる工程、
    (ｂ)被験物質によるグランザイムＡの活性阻害を測定する工程、および
    (ｃ)前記（ｂ）の測定結果に基づいて、掻痒を抑制する被験物質を選択する工程。
  13. 前記掻痒がアレルギー性疾患に伴うものである、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
  14. グランザイムＡに結合する抗体を含有してなるアレルギー性疾患の治療剤。
  15. グランザイムＡの発現量を抑制する物質を有効成分とする、アレルギー性疾患の治療剤。
  16. 前記物質がグランザイムＡに対する抗体または当該抗体をコードする核酸分子を含む発現ベクターである請求項１５に記載の治療剤。
  17. セリンプロテアーゼ阻害作用を有するものである請求項１５または１６のいずれかに記載の治療剤。
  18. グランザイムＡ遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とする、アレルギー性疾患の治療剤。
  19. 前記物質が、グランザイムＡ遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸またはｓｉＲＮＡである請求項１８に記載の治療剤。
  20. セリンプロテアーゼ阻害作用を有するものである請求項１８または１９に記載の治療剤。
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