WO2014185631A1 - Tgfbi를 이용한 패혈증 진단용 조성물 및 이를 이용한 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 이의 스크리닝 방법 - Google Patents

Tgfbi를 이용한 패혈증 진단용 조성물 및 이를 이용한 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 이의 스크리닝 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2014185631A1
WO2014185631A1 PCT/KR2014/003069 KR2014003069W WO2014185631A1 WO 2014185631 A1 WO2014185631 A1 WO 2014185631A1 KR 2014003069 W KR2014003069 W KR 2014003069W WO 2014185631 A1 WO2014185631 A1 WO 2014185631A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tgfbi
sepsis
tgfbip
protein
antibody
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/003069
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
배종섭
김인산
이원화
김신우
Original Assignee
경북대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교산학협력단 filed Critical 경북대학교산학협력단
Publication of WO2014185631A1 publication Critical patent/WO2014185631A1/ko

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Definitions

  • a composition for diagnosing sepsis using TGFBI a pharmaceutical composition for preventing or treating sepsis using the same, and a method for screening the same.
  • the present invention relates to a composition for diagnosing sepsis using TGFBI, a pharmaceutical composition for preventing or treating sepsis using the same, and a screening method thereof. More specifically, a method for screening a composition for preventing sepsis using TGFBI protein expression level measurement, TGFBI
  • the present invention relates to a composition for treating sepsis, including an inhibitor, a composition for diagnosing sepsis, including a TGFBI protein expression level measuring agent, a diagnostic kit, a diagnostic method, and the like.
  • Sepsis is caused by the failure of the first host response to suppress an infection, causing inflammation to spread to the body and cause multiple organ failure. Severe sepsis and septic shock are the third leading cause of death in developing countries, despite the development and intensive treatment of antibody therapy. The host response to sepsis is complex and the factors associated with pathogenicity and death are not yet fully understood.
  • the endothelial barrier separates blood from surrounding tissue and manages the exchange of nutrients between cells and body fluids.
  • endothelial activity and dysfunction in sepsis is a major cause of host reaction and suggests the complex pathophysiological phenomenon of sepsis.
  • endothelial it is necessary to identify factors that regulate endothelial cell levels, which can be used to diagnose and treat sepsis.
  • an object of the present invention is to contact a test substance with a cell or tissue expressing TGFBI (Transforming Growth Factor Beta Induced) protein; (b) measuring the expression level of TGFBI in cells or tissues in contact with the test substance; And (c) measuring the expression level of TGFBI in the cells or tissues to which the test substance has not been contacted, and selecting a test substance whose expression level is reduced in step (b).
  • TGFBI Transforming Growth Factor Beta Induced
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating sepsis, which contains an inhibitor of expression of TGFBI protein as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating sepsis, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an expression inhibiting agent of TGFBI protein.
  • Another object of the present invention is to provide an inhibitor of TGFBI expression for use in the prevention or treatment of sepsis.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing sepsis comprising a primer for detecting TGFBI or an antibody of TGFBI.
  • Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing sepsis, comprising measuring the expression level of TGFB1 protein from a biological sample of a subject suspected of sepsis using a primer for detecting TGFBI or an antibody of TGFBI.
  • Another object of the present invention is to provide a TGFBI detection primer or an antibody of TGFBI used for diagnosing sepsis.
  • Another object of the present invention is to provide a microarray for diagnosing sepsis using any one selected from the group consisting of mRNA of TGFBI gene, TGFBI protein and fragments thereof.
  • Another object of the present invention is to measure the expression level of TGFBI from a biological sample of a subject suspected of sepsis; And (b) the expression level of the normal control sample. It is intended to provide a method for providing information necessary for diagnosing sepsis, including comparing it with TGFBI expression levels.
  • the present invention comprises the steps of (a) contacting a test substance with cells or tissues expressing TGFBI (Transforming Growth Factor Beta Induced) protein; (b) measuring the expression level of TGFBI in the cell or tissue to which the test substance is contacted; And (c) measuring the expression level of TGFBI in cells or tissues that are not in contact with the test substance, and selecting a test substance whose expression level is reduced in step (b). Or a pharmaceutical composition screening method for treatment.
  • TGFBI Transforming Growth Factor Beta Induced
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of sepsis, which contains an inhibitor of TGFBI protein expression as an active ingredient.
  • a method for preventing or treating sepsis comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an expression inhibiting agent of TGFBI protein.
  • an inhibitor of TGFBI expression used for the prevention or treatment of sepsis.
  • the present invention provides a composition for diagnosing sepsis comprising a primer for detecting TGFBI or an antibody of TGFBI.
  • the present invention provides a method for diagnosing sepsis, comprising measuring the expression level of TGFB1 protein from a biological sample of a subject suspected of sepsis using a TGFBI detection primer or an antibody of TGFBI.
  • a primer for detecting TGFBI or an antibody of TGFBI is used for diagnosing sepsis.
  • the present invention provides a kit for diagnosing sepsis comprising a primer for detecting TGFBI or an antibody of TGFBI.
  • the present invention provides a microarray for diagnosing sepsis using any one selected from the group consisting of mRNA of the TGFBI gene, TGFBI protein and fragments thereof.
  • the present invention comprises the steps of (a) measuring the expression level of TGFBI from biological samples of individuals suspected of sepsis; And (b) said expression It provides a method for providing information necessary for diagnosing sepsis, including comparing the level with the TGFBI expression level of a normal control sample.
  • the present invention will be described in detail.
  • the present invention comprises the steps of (a) contacting a test substance with a cell or tissue expressing a transforming growth factor beta induced (TGFBI) protein; (b) measuring the expression level of TGFBI in the cell or tissue to which the test substance is contacted; And (c) measuring the expression level of TGFBI in the cells or tissues to which the test substance has not been contacted, and selecting a test substance whose expression level is reduced in step (b). Or a pharmaceutical composition screening method for treatment.
  • TGFBI transforming growth factor beta induced
  • the TGFBI protein is expressed in only a few cells as an extracellular gazal protein.
  • TGFBIp contains an N-terminal secretion signal peptide, a cysteine-rich domain, four consecutive FAS1 domains (four internal homologous repeats), and a C ⁇ terminal 'RGD' motif.
  • the TGFBI protein of the present invention may correspond to any known TGFBI protein, but preferably Genbank Accession No. It may be a protein described in NP_000349, NM_000358.2, Q15582, AAH04972, AAH00097, AAH26352, AAC08449, AAA6116, and more preferably may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • TGFBI transforming growth factor beta induced
  • Test material refers to an unknown material used in screening to test whether it affects the expression of the TGFBI protein of the present invention.
  • the test substance may be siRNACsmall interference RNA, shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme, DNAzyme, PNACpeptide nucleic acids, antisense oligonucleotides, antibodies, aptamers, natural extracts or Including but not limited to chemicals.
  • the cells used in the step (a) may be provided in the form of an experimental animal, in which case the screening method of the present invention is to add sepsis to the experimental animal Additional systems may be included, and contact with the test substance includes, but is not limited to, parenteral or oral administration, orthopedic injection, and one of ordinary skill in the art will be able to select an appropriate method for testing the test substance in animals.
  • Contact with the test substance means adding the test substance to the cell or tissue culture medium and then culturing the cells for a period of time.
  • contact with the test substance is not limited to those including parenteral or oral administration or stereotactic injection, and those skilled in the art can select an appropriate method for testing the test substance in the animal. There will be.
  • Expression level measurement can determine the mRNA expression level of the TGFBI gene or its protein expression level.
  • mRNA expression level measurement method can be used for all conventional expression level methods used in the art, and examples of the analysis method RT-PCR, competitive RT-PCRCcompetitive RT-PCR, Real-time RT-PCR ), RNase protection assay (RPA), northern blotting, DNA microarray chip, and the like.
  • the protein self-expression level measurement method can be used in all conventional methods used in the art, such as Western blotting (enzyme-1 inked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA) , Immunodiffusion, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemistry, immunoprecipitation, complement fixation, flow cytometry (FACS) or protein chip methods It is not.
  • step (c) measuring the expression level of TGFBI in the cells or tissues that are not in contact with the test substance, and selecting a test substance whose expression level reduced in step (b) is reduced;
  • step (c) the TGFBI expression level of the cells or tissues (control) to which the test substance has not been contacted is measured, and when compared with the TGFBI expression level measured in step (b), the measurement in step (b) is performed. If the value is lower, the test substance is a substance that inhibits the expression of TGFBI protein, and thus the test substance is selected as a substance for treating sepsis.
  • serum TGFBIp concentrations were measured in the normal control group, sepsis group, and septic Shoku patient group. As the sepsis increased, the concentration increased. In the case of sepsis-induced CLP-induced mice, blood TGFBIp concentrations were measured.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating sepsis, which contains an inhibitor of expression of TGFBI protein as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating sepsis, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the expression inhibitor of the TGFBI protein of the present invention.
  • the present invention also provides an agent for inhibiting expression of TGFBI for use in the prevention or treatment of sepsis of the present invention.
  • the "effective amount” refers to an amount that exhibits a higher response than the negative control, and preferably refers to an amount sufficient to treat sepsis.
  • the 'subject' may be an animal, preferably an animal including a mammal, particularly a human, or may be a cell, tissue, organ or the like derived from the animal.
  • the subject may be a patient in need of treatment.
  • the "inhibitor of expression of TGFBI protein” is to inhibit the expression of the TGFBI gene, It refers to a substance that inhibits the activity of TGFBI protein, the form of the substance is siRNA (small interference RA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme, DNAzyme, PNA (peptide nucleic acids) ), Antisense oligonucleotides, antibodies, 3 ⁇ 4tamers, natural extracts or chemicals.
  • siRNA small interference RA
  • shRNA short hairpin RNA
  • miRNA miRNA
  • PNA peptide nucleic acids
  • the agent is a nucleotide sequence encoding a TGFBI protein, a siRNA, shR A, miRNA, ribozyme, DNAzyme or antisense to a sequence complementary to the nucleotide sequence or a fragment of the nucleotide sequence. And may be an nucleotide and more preferably an antibody.
  • expression refers to the expression of TGFBI gene transcription and transcripts into proteins, and "activity” means a biological action that allows the expressed protein to function in the cell.
  • siRNA, shRNA and miRNA can be transcribed through RNA interference, e.g., short-length interfering RNA (siRNA) binds specifically to the transcript to form a RNA Induced Silencing Complex (RISC).
  • RISC RNA Induced Silencing Complex
  • the RNA cannot be expressed as a protein in the cell (silencing).
  • siRNA, shRNA or raiRNA have a sequence that is significantly complementary to its target sequence. By highly complementary sequence is meant at least about 70% complementarity, at least about 80% complementarity, at least about 90% complementarity, or about 100% complementarity with at least 15 consecutive base length sequences of the target gene.
  • Antisense oligonucleotides are as known in the art and are, for example, short synthetic nucleic acids that bind to any coding sequence of the target protein, thereby inhibiting / reducing the expression of the target protein.
  • the antisense RNA may have a suitable length depending on the target gene and the method of delivery, for example about 6, 8 or 10 to 40, 60 or 100 nucleotides.
  • an antibody refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site as a term known in the art.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to the TGFBI protein, which is a marker of the present invention, and such an antibody may be cloned into an expression vector according to a conventional method to the marker gene. Can be obtained by the conventional method from the protein obtained. It also includes partial peptides that can be made from these proteins.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited and any part thereof may be included in the antibody of the present invention, and any immunoglobulin antibody may be included as long as it is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or an antigen-binding agent.
  • Antibodies include special antibodies such as humanized antibodies.
  • Antibodies used for detection of sepsis diagnostic markers of the invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • the functional fragment of an antibody molecule means the fragment which carries an antigen binding function at least, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2, and Fv.
  • the antibody may be, but is not limited to, a monoclonal antibody that can specifically recognize an epitope of TGFBI, and the epitope is not limited thereto.
  • the polypeptide may be represented.
  • Monoclonal antibodies in the present invention are terms known in the art and are highly specific antibodies directed against a single antigenic site. Unlike polyclonal antibodies, which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), monoclonal antibodies are directed against a single determinant on an antigen. Monoclonal antibodies of the invention can be prepared using conventional cloning and cell fusion techniques. For example, an immunogen of interest (antigen) can be administered to wild type or breeding mice (eg BALB / c) to produce natural or human monoclonal antibodies. Such antigens can be administered alone, in combination with an adjuvant, can be expressed from a vector and can induce immune response as DNA or fusion proteins.
  • an immunogen of interest eg BALB / c
  • Fusion proteins include carrier proteins coupled with peptides intended for immune response, such as ⁇ -galactosidase, glutathione S-transferase, keyhole limpet hemocyanin (KLH), and bovine serum albumin
  • carrier proteins coupled with peptides intended for immune response, such as ⁇ -galactosidase, glutathione S-transferase, keyhole limpet hemocyanin (KLH), and bovine serum albumin
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • bovine serum albumin The carrier protein is not limited thereto. In this case the peptide acts as a hapten for the carrier protein.
  • the monoclonal antibody production method will be briefly described as follows. After booting the animal, the spleen is removed and the spleen cells are extracted by methods known in the art [Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)]. The hybrid cells obtained are cloned in a conventional manner, for example by restriction dilution, and the obtained clones are cultured to produce the desired monoclonal antibody. Monoclonal antibodies have the advantage of improving the selectivity and specificity of diagnostic and analytical assays using antigen-antibody binding, and because they are synthesized by hybridoma culture, they are not contaminated by daron immunoglobulins. Has an advantage. Antibody was obtained by culturing the prepared hybrid cells alone. Alternatively, the hybrid cell may be injected into an animal by another method, and the ascites fluid may be obtained and then obtained from the ascites fluid.
  • Hybridoma cells in the present invention are known in the art and include antibody producing cells and immortal cells, such as myeloma. It means a cell formed by fusion with a cell.
  • the hybridoma cells can continue to supply antibodies.
  • 'epitope' is an antigen-determining site specifically recognized by an antibody. The mortality of the CLP sepsis model administered with a monoclonal antibody epitope of the TGFBI protein and specifically binding to the polypeptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was lower than that of the CLP sepsis model administered with immunoglobin. (Experiment 3, see FIG. 8).
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating sepsis of the present invention is a compound which maintains / increases the solubility and / or absorption of one or more active ingredients or the active ingredients which exhibit the same or similar functions in addition to the TGFBI expression inhibitors mentioned above. It may further contain. It may also be used alone or in combination with methods using surgery, medication and biological response modifiers for the treatment or prevention of sepsis. Pharmacy of the present invention.
  • the composition may be prepared by including at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above-mentioned active ingredient.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with one or more of saline, sterile water, Ringer's solution, saturated saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes and son components. Therefore, other conventional additives, such as antioxidants, complete fluids, bacteriostatics, can be added. It can also be formulated into injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules or tablets with the addition of diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants, specific to the target organ. Target organ specific antibodies or other ligands can be used in combination with the carrier to act as a carrier. Furthermore, the formulation is preferably formulated according to each disease or component using an appropriate method in the art or using the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, East on PA. Can be mad.
  • the administration method of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited thereto, and known administration methods may be applied, and parenteral administration according to a desired method (for example, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or topical). Application) or orally, parenteral
  • a desired method for example, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or topical.
  • parenteral In the case of oral administration, it can be administered through the patch-type, nasal / respiratory affix to the skin, and intravenous injection is preferable to obtain a rapid therapeutic effect.
  • the dosage range varies widely depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, the rate of excretion and the severity of the disease, and the dosage of a known TGFBI inhibitor can be applied.
  • Parenteral administration may be preferred for protein preparations, including siRNAs, miRNAs, antisense oligonucleotides, shRNA preparations and polypeptides targeting TGFBI, but do not exclude other routes and means.
  • a typical drug dosage unit is, for example, including, from about 0.01 mg to about 100 mg does not exclude the range below and above the range.
  • the daily dose may be about lyg to 10g, and may be administered once to several times a day.
  • the present invention provides a composition for diagnosing sepsis and a diagnostic kit comprising a primer for detecting TGFBI or an antibody of TGFBI. The higher the level of TGFBI expression, the more severe the sepsis.
  • the present invention provides a method for diagnosing sepsis, comprising measuring the expression level of TGFB1 protein from a biological sample of a subject suspected of sepsis using the TGFBI detection primer or the antibody of TGFBI of the present invention.
  • the present invention provides a TGFBI detection primer or an antibody of TGFBI used in the diagnosis of sepsis of the present invention.
  • diagnosis means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether sepsis develops.
  • the "primer” is the starting point for template-directed DNA synthesis under appropriate conditions (e.g., four different nucleoside triphosphates and polymerases such as DNA, RNA polymerase or reverse transcriptase) and appropriate temperatures
  • a single stranded oligonucleotide capable of acting, the appropriate length of the primer may vary depending on the intended use, but is typically 15 to 30 nucleotides
  • Short primer molecules generally have lower temperatures to form stable moieties with the template.
  • the primer sequence need not be completely complementary to the template, but should be sufficiently complementary to hybridize with the template, which primers hybridize to the target DNA containing the polymorphic site and the primer is intact. Amplification of allelic forms of homology are initiated.
  • Primers are made to the second primer pair and the common torch on the other side Used. By amplification the product is amplified from the two primers, which means that a specific allelic form is present.
  • Primers of the present invention include polynucleotide fragments used in ligase chainreaction (LCR).
  • LCR ligase chainreaction
  • the primers are primer pairs represented by SEQ ID NOs: 3 and 5 or SEQ ID NO: 4 And it may be a primer pair represented by 5.
  • the primer is a primer used in genotyping after preparing TGFBIp-knockout mice in Experimental Invention 6 of the present specification. These primers can amplify the portion containing axon 3 of TGFBI. By performing PCR with the primers, it can be seen from FIG.
  • the antibody of TGFBI may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and preferably, the monoclonal antibody specifically recognizes a polypeptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 which is an epitope of TGFBI protein.
  • the sepsis diagnostic kit of the present invention may include one or more other constituent compositions, solutions or devices suitable for analytical methods, as well as antibodies or primers that selectively recognize markers for measuring the expression level of TGFBI.
  • the diagnostic kit may be a diagnostic kit comprising essential elements necessary for performing reverse transcription polymerase reaction.
  • the reverse transcription polymerase reaction kit includes each primer pair specific for the marker gene.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of each marker gene, and is about 7 bp to 50 bp in length, more preferably about 10 bp to 30 bp in length. It may also include primers specific for the nucleic acid sequence of the control gene.
  • reverse transcription polymerase reaction kits include test tubes or other suitable containers, reaction fluids (pH and magnesium concentrations vary), enzymes such as deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerases and reverse transcriptases, DMse , RNAse inhibitor DEPC-water, sterile water, and the like.
  • reaction fluids pH and magnesium concentrations vary
  • enzymes such as deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerases and reverse transcriptases, DMse , RNAse inhibitor DEPC-water, sterile water, and the like.
  • the DNA chip kit may include a substrate on which a cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or fragment thereof is attached, and reagents, preparations, enzymes, etc. for preparing a fluorescent probe. have.
  • the substrate may also include cDNA or oligonucleotides corresponding to the control gene or fragment thereof.
  • ELISA kits contain specific antibodies to the marker protein. Antibodies are antibodies with high specificity and affinity for each marker protein and little cross-reactivity to other proteins, such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • the ELISA kit can also include antibodies specific for the control protein.
  • Other ELISA kits are capable of binding reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg conjugated with antibodies) and their substrates or antibodies. Other materials and the like.
  • the kit of the present invention may include a washing solution or an eluent that can remove enzymes, color reaction substrates, unbound proteins and the like and retain only bound protein markers.
  • Samples used for analysis include biological samples capable of identifying disease specific polypeptides that can be distinguished from normal conditions such as serum, urine, and tear saliva.
  • a biological liquid sample for example blood, serum, plasma.
  • Samples may be prepared to increase the detection sensitivity of protein markers, for example serum samples obtained from patients may be anion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion chromatography, liquid chromatography. It can be pretreated using methods such as graphy, sequential extraction or gel electrophoresis.
  • the present invention provides a microarray for diagnosing sepsis using any one selected from the group consisting of mRNA of TGFBI gene, TGFBI protein and fragments thereof.
  • the probe is immobilized on the solid surface of the microarray.
  • the probe is used as a hybridizable array element and is immobilized on a substrate.
  • Preferred gases are suitable rigid or semi-rigid supports such as membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic beads or nonmagnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, microparticles and capillaries.
  • Said localization array element is arranged and immobilized on said gas. Such immobilization may be chemically coupled or covalently bonded, such as UV.
  • the hybridization array element can be bonded to a glass surface modified to include an epoxy compound or an aldehyde group, and can also be bonded by UV at the polylysine coating surface.
  • the localization array element can be coupled to the gas via a linker (eg, ethylene glycol oligomer and diamine).
  • sample RNA, protein or fragment thereof applied to the microarray of the present invention may be labeled and is shaken with the array element on the microarray.
  • the conditions for homogenization can vary. Detection and analysis of the degree of localization may vary depending on the labeling agent.
  • the label of the probe can provide a signal to detect whether it has been shaken.
  • Suitable labels include fluorophores (e.g. fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine; and Cy3 and Cy5 (Pharmacia), chromophores, chemilumines, magnetic particles , Radioisotopes (P32 and S35), mass markers, electron integrators, enzymes (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase), cofactors, substrates for enzymes, heavy metals (eg gold) and antibodies, Hapten with specific binding partners, such as, but not limited to, straptavidin, biotin, digoxigenin and chelating groups.
  • Labeling can be performed in a variety of ways conventionally practiced in the art, such as nick translation methods, random priming methods (Multiprime DNA labeling systems booklet, "Amersham” (1989)), and chination methods (Maxam & Gilbert, Methods). in Enzymology, 65: 499 (1986)). Labels provide signals that can be detected by fluorescence, radioactivity, colorimetry, gravimetric, X-ray diffraction or absorption, magnetism, enzymatic activity, mass analysis, binding affinity, polarization high frequency, nanocrystals .
  • suitable isomerization conditions can be determined by a series of procedures by an optimization procedure. This procedure is carried out by a person skilled in the art in order to establish a protocol for use in the laboratory. For example, conditions such as temperature, concentration of components, localization and wash time, complete solution components and their pH and ionic strength depend on various factors such as probe length and GC amount and target nucleotide sequence. Detailed conditions for the shake are described by Joseph Sambrook, et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); and MLM Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer— Ver lag New York Inc. NY (1999).
  • high stringency conditions among these stringent conditions are common at 65 ° C in 0.5 M NaHP04, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1 mM EDTA. It means to ignite and wash at 68 ° C in 0.1 x SSC (standard saline citrate) / 0.1% SDS.
  • high stringency conditions mean washing at 48 ° C in 6 X SSC / 0.05% sodium pyrophosphate.
  • Low stringency means, for example, washing at 42 ° C in 0.2 X SSC / 0.1% SDS.
  • the localization signal can be carried out by various methods, for example, depending on the type of label bound to the probe. For example, if the probe is labeled with an enzyme, the substrate can be reacted with the result of the reaction to determine whether it is localized.
  • peroxidases eg horseradish peroxidase
  • chloro nap aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N-methyla Crinidium Nitrate), Lesorupine Benzyl Ether, Luminol, Amflex Red Reagent (10-Acetyl-3, 7-Dihydroxyphenoxazine), HYR (-pheny 1 ened i am i ne-HC 1 and pyrocatechol) Tetramethylbenzidine, TMB (2,2-Azine-di [3-ethylbenzthiazol ine sulfonate]), o_phenylenediamine (OPD) and naph / pyronine; Alkaline phosphatase and bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphth-AS-B1
  • BCIP bromochloroindolyl
  • the present invention comprises the steps of (a) measuring the expression level of TGFBI from biological samples of individuals suspected of sepsis; And (b) comparing the expression level with the TGFBI expression level of the normal control sample.
  • biological samples include, but are not limited to, samples such as tissues, cells, blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine.
  • blood, serum or plasma Preferably blood, serum or plasma.
  • the method can diagnose the actual sepsis of the suspect subject by comparing the TGFBI fragment expression level in the normal control group with the expression level in the sepsis suspect subject. If the TGFBI protein expression level is higher than that of the normal control group, the subject providing the sample can be predicted as sepsis.
  • RNA expression level or protein expression level can be analyzed.
  • analytical methods RT-PCR, competitive RT- Competitive RT-PCR, Real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), Northern blotting, DNA microarray chip, Western blotting ( Western Blotting), enzyme-1 inked immunosorbent assay, radioimmunoassay (RIA), radioimmunoassay, oukteroniimmunoimmunoassay, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemistry, immunoprecipitation (i ⁇ ) unoprecipitation, complement fixation assay, flow cytometry (FACS) or protein chip, but is not limited thereto.
  • TGFBIp is significantly increased when sepsis occurs. Reducing the expression of TGFBIp reduces mortality due to sepsis and permeability of vascular endothelial cells. Therefore, TGFBIp can be used to select a sepsis treatment agent, a pharmaceutical composition for preventing or treating sepsis can be prepared with a TGFBIp inhibitor, and the expression level of TGFBI protein is effective for diagnosing sepsis.
  • TGFBIp-/- is a genetic manipulation guided to produce knock out mouse
  • FIG. 2 shows the blood TGFBIp concentrations of the normal, sepsis, and septic shock groups.
  • Figure 3 is the result of measuring the blood TGFBIp concentration of the sepsis model subjected to CLP procedure.
  • Figure 4 shows the results of Western blotting TGFBIp release of vascular endothelial cells (HUVECs) following LPS treatment. (sup: supernatant, cell lysate: cell lysate, cont: control group without LPS, LPS (30 min): experimental group treated with LPS 30 minutes, LPS (60 min): experimental group treated with LPS 60 minutes)
  • FIG. 5 is the result of observing the TGFBIp release of vascular endothelial cells (HUVECs) following LPS treatment by ELISA. (sup: supernatant, cell lysate: cell debris, cont: control group without LPS treatment, LPS (30 min): experimental group treated with LPS 30 minutes, LPS (60 min): experimental group treated with LPS 60 minutes)
  • FIG. 6 is a schematic of the method of anti-TGFBIp antibody administration experiment.
  • Figure 7 is the result of measuring the effect of anti-TGFBIp antibody administration on blood TGFBIp concentration.
  • CLP CLP sepsis model
  • CLP + IgG CLP sepsis model was used for immunoglobulin G
  • TGFBIp Neut Ab experimental group administered with TGFBIp neutralizing antibody to CLP sepsis model
  • CLP ( ⁇ ) CLP sepsis model
  • CLP + IgG ( ⁇ ) Experimental group to which immunoglobulin G was administered to CLP sepsis model
  • Figure 9 is the result of measuring the blood TGFBIp concentration of the wild type model and knockout model (TGFBIp- /-).
  • ⁇ Wild model
  • K0 Knockout model
  • Figure 10 is the result of measuring the survival rate due to CLP-induced sepsis of the wild type model and knockout model (TGFBIp- /-).
  • FIG. 11 is a result of measuring the effect of TGFBIp on vascular permeability using the degree to which the BSA-Evans Blue dye was released.
  • FIG. 12 is a result of measuring the effect of TGFBIp on the endothelial cell permeability of knockout mice and wild-type mice using the degree to which the BSA-Evans blue dye was released.
  • Figure 13 shows the results of PCR genotyping whether knockout mice were successfully prepared. (S1 / A: Result performed with sense primer S1 and antisense primer A, S2 / A: Result performed with sense primer S2 and antisense primer A)
  • TGFBIp protein SEQ ID NO: 1
  • Triton X-114 Sigma, St. Louis, M0 was used to remove endotoxins from bacterial cell lysates.
  • Anti-human TGFBI monoclonal antibodies are produced in BALb / c mice after inducing repeated immunization with recombinant human-TGFBIp epitope (SEQ ID NO: 2, amino acid portion 502632 of human -TGFBIp) produced by E. col i. It was. Continuously positive hybridoma clones (Clone 18B3) produce ascites by the method described by Harlow and Lane (Ant i bodies: A Laboratory. Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY, 1988). It was. Ascites fluid was removed by centrifugation to remove lipid layer and cell granules and purified by Protein A affinity chromatography according to the manufacturer's protocol. Specificity of anti-human TGFBI antibody was examined by Western blot, and as a result, it was confirmed that cross-reaction with mouse TGFBIp.
  • HUVECs Primary HUVECs were obtained from Cambrex Bio Science (Charles City, IA) and described in 'Bae, JS et.al. , Blood; 118: 3952-3959,2011 '. Briefly, cells were cultured at 37 ° C. and 5% C02 conditions in basal medium containing EBM-2 growth aid (Cambrex Bio Science). HUVECs with 3 or 5 passage numbers were used for the experiment.
  • Endothelial cells were isolated using anti-CD31 antibody and Dynal beads binding to Dynal magnetic holder as described by the manufacturer (Dynal Biotec, Lake Success, NY). Briefly, 4-6 mice (6-10 weeks old) were euthanized to isolate endothelial cells and exposed to peritoneal cavity, then the lungs and heart were cut and placed in RPMI medium to remove other tissues from the heart and lungs. It was then washed once with PBS.
  • Dynal beads were washed with a MACS buffer (PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA) in a magnetic holder (invitrogen). Dynal beads resuspended in 600 ⁇ l MACS buffer were incubated at 4 ° C. for 12 hours with the addition of 5 mg of anti-mouse CD31 per 10 ul beads. Cells were incubated at room temperature for 10 minutes with Dynal beads binding to anti-mouse CD31 antibody and placed in magnetic holder. The pipette was placed towards the tube wall and the cell suspension was slowly transferred to a 15 ml tube. After incubation for 5 minutes, PBS was carefully sucked. Dynal beads binding to anti-mouse CD31 antibody are washed three times with cold PBS, pel let is resuspended in EBM-2 growth medium and placed in collagen-coated culture dishes.
  • MACS buffer PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
  • TGFBIp-knockout mouse models were made using Cre / LoxP targeting.
  • Target constructs containing the ⁇ portions on both sides of exon 3 were replicated into a vector containing a PGK-neomycin selection cassette with FLP recombinase target (FRT) sequences on both sides.
  • FRT FLP recombinase target
  • Embryonic stem cells with target vectors were microinjected with C57BL / 6 blastocysts to produce chimeras.
  • PGK-neo cassettes surrounded by FRT were removed by recombination of Flp mediated ACTFLPe transgenic mice.
  • TGFBIflox / + mice were crossed with protamine I-Cre (Prml-Cre) transgenic mice to remove Exon3, producing TGFBIp +/ ⁇ heterozygous mice. Finally, TGFBIp ⁇ / ⁇ mice were produced with TGFBIp +/ ⁇ heterozygous mouse crosses.
  • FIG. 1 A schematic of the genetic map for knockout mouse production is shown in FIG. 1. All animal testing procedures were performed with the approval of Kyungpook National University.
  • TGFBIp concentrations in cell culture medium or mouse serum were measured by a competitive ELISA method (Bae, J.S. et.al., biognb Biophys Res Commun; 294: 940-948,2002).
  • HUVECs were activated with LPS (100 ng / ml), pellets and supernatants were collected. Immunoassay was performed with polyclonal rabbit anti-TGFBIp antibody after SDS-PAGE. ⁇ -Actin was used as loading control.
  • Endothelial cell permeability with increasing TGFBIp concentration was quantified by spectroscopically measuring the flow of Evans blue binding to albumin penetrating the monolayer of functional cells using a modified 2-compartment chamber model (Bae, JS et.al). .,
  • HUVECs were plated for 3 days in 3- ⁇ pore size and 12-mm diameter transwells (5 x loVwell). Fusion monolayers were incubated for 6 hours with increasing concentrations of TGFBIp (0-5 ⁇ g / ml). When appropriate, cells were pre-incubated for 30 minutes with a function blocking integrin antibody. Dilution with growth medium (4% BSA) Inserts were washed with PBS pH 7.4 before adding Evans Blue (0.5 ml). Fresh growth medium was added to the lower chamber and the middle part of the upper chamber was replaced with Evansblue / BSA. After 10 minutes, the light density of the lower chamber was measured at 650 nm. The experiment was performed in triplicate and at least three times. 11. Statistical Analysis
  • TGFBIp concentrations of sepsis patients were measured.
  • the median serum TGFBIp concentration in 21 healthy volunteers was 316.10 (292.92 to 368.38) ng / mL.
  • Serum TGFBIp levels were measured in a mouse model of CLPCcecal ligation and puncture (CLP) -induced sepsis. This is because the CLP model is very similar to human sepsis. After 24 hours, the animals developed sepsis. Serum TGFBIp concentrations increased CLP-induced time-dependently (see Figure 3).
  • the experimental group treated with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) cells treated with LPS (100 ng / mL, 0.5 hr, 1 hr) and the untreated control group Ready.
  • HUVEC-releasing supernatant and cell debris were separated from the cells of the experimental group and analyzed by Western blotting and ELISA, and the results are shown in FIGS. 4 and 5.
  • TGFBIp is present only in cell debris when HUVEC-resting, but is present in the supernatant when stimulated with LPS. That is, it can be seen that TGFBIp is secreted from HUVECs during LPS stimulation. 3. Survival rate of anti-TGFBIp antibody and sepsis model
  • TGFBIp serum concentration was significantly decreased.
  • TGFBIp knockout mice were produced using Cre / LoxP. Testing of the knockout mouse blood revealed no TGFBIp (see FIG. 9).
  • TGFBIp-/ — endothelial vascular permeability isolated from wild-type, knockout mice
  • TGFBIp enhances vascular permeability
  • TGFBIp-/- vascular permeability of knockout mice compared to wild-type And lower, from which it can be seen that TGFBIp at least to some extent regulates the firmness of blood vessels in sepsis (see FIG. 12).
  • TGFBIp is significantly increased when sepsis occurs. Reducing the expression of TGFBIp reduces mortality due to sepsis and permeability of vascular endothelial cells. Therefore, it is possible to select a treatment for sepsis using TGFBIp, and to manufacture a pharmaceutical composition for preventing or treating sepsis with a TGFBIp inhibitor, which has high industrial applicability.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 TGFBI를 이용한 패혈증 진단용 조성물 및 이를 이용한 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TGFBI 단백질 발현 수준 측정을 이용한 패혈증 예방 치료용 조성물 스크리닝 방법, TGFBI 억제제를 포함하는 패혈증 치료용 조성물, TGFBI 단백질 발현 수준 측정 제제를 포함하는 패혈증 진단용 조성물, 진단용 키트, 진단 방법 등에 관한 것이다. TGFBIp는 패혈증 발생 시, 현저히 증가하는데 TGFBIp의 발현을 감소시키면, 패혈증으로 인한 치사율, 혈관 내피 세포의 투과성을 줄일 수 있다. 따라서 TGFBIp를 이용하여 패혈증 치료제를 선별할 수 있고, TGFBIp 억제제로 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조할 수 있고, TGFBI 단백질의 발현 수준 측정으로 패혈증을 진단하는데 효과적이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭]
TGFBI를 이용한 패혈증 진단용 조성물 및 이를 이용한 패혈증 예방 또는 치 료용 약학적 조성물과 이의 스크리닝 방법 .
【기술분야】
본 출원은 2013년 5월 15일에 출원된 대한민국 특허출원 제 1으 2013-0054969 호 (출원번호)를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이 다.
본 발명은 TGFBI를 이용한 패혈증 진단용 조성물 및 이를 이용한 패혈증 예 방 또는 치료용 약학적 조성물과 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로， 더욱 상세하 게는 TGFBI 단백질 발현 수준 측정을 이용한 패혈증 예방 치료용 조성물 스크리닝 방법 , TGFBI 억제제를 포함하는 패혈증 치료용 조성물， TGFBI 단백질 발현 수준 측 정 제제를 포함하는 패혈증 진단용 조성물， 진단용 키트， 진단 방법 등에 관한 것 이다.
【배경기술】
패혈증은 첫 숙주 반응이 감염을 억제하는데 실패하여 발생하는 것으로， 이 로 인해 염증이 몸에 퍼지고, 다발성 장기부전 (multiple organ failure)을 일으킨 다. 중증 패혈증와 패혈성 쇼크는 항체 치료법이 발달하고 집중적인 치료에도 불구 하고， 개발도상국에서 사망원인 중 세 번째로 높다. 패혈증에 대한 숙주반응은 복 잡하고, 병원성과 죽음과 관련된 요인들은 아직 완벽히 밝혀지지 않았다. 가장 큰 기관이라 할 수 있는 혈관계는 기관 기능의 항상성에 매우 중요한 역할을 한다. 내 피 장벽 (endothelial barrier)은 주변 조직으로부터 혈액을 분리하고， 세포와 체액 간의 영양소 교환도 관리한다.
패혈증 발병 시， 내독성 물질 또는 염증촉진 사이토킨의 방출은 내피세포 계 에서 항상성을 손상시키는 반응을 유도한다. 패혈증에서 내피의 활성과 장애는 숙 주 반웅의 주요 원인이고, 패혈증의 복잡한 병태생리학적 현상을 말해준다. 내피의 이런 중요한 역할 속에서， 내피세포 수준을 조절하는 요인을 규명할 필요가 있고， 이 요인으로 패혈증을 진단하고 치료하는데 이용할 수 있다.
【발명의 상세한 설명】 【기술적 과제】
이에 본 발명자는 패혈증 조건에서 발현이 증가하는 TGFBI 단백질이 패혈증 으로 인한 내피 세포의 투과성 증가를 촉진하고， 패혈증으로 인한 치사율에 있어서 TGFBI-넉아웃 마우스가 야생형보다 낮은 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다 . 따라서 본 발명 의 목적은 (a) 시험물질을 TGFBI (Transforming growth factor beta induced) 단백질을 발현하는 세포 또는 조직과 접촉시 키는 단계 ; (b) 상기 시 험물질이 접촉된 세포 또는 조직에서 TGFBI의 발현 수준을 측정하는 단계 ; 및 (c) 상기 시험물질이 접촉되지 않은 세포 또는 조직에서의 TGFBI의 발현수준을 측정하 여， 상기 (b) 단계에서 측정된 발현 수준이 감소된 시 험물질을 선별하는 단계를 포 함하는， 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 스크리 닝 방법을 제공하는 것 이 다.
본 발명의 다른 목적은 TGFBI 단백질의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하 는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다 .
본 발명의 다른 목적은 TGFBI 단백질의 발현 억 제제의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것 이다 .
본 발명의 다른 목적은 패혈증 예방 또는 치료에 사용되는 TGFBI 발현 억제 제를 제공하는 것이다 .
본 발명의 다른 목적은 TGFBI 검출용 프라이머 또는 TGFBI의 항체를 포함하 는 패혈증 진단용 조성물을 제공하는 것 이다.
본 발명의 다른 목적은 TGFBI 검출용 프라이머 또는 TGFBI의 항체를 이용하 여 패혈증이 의심되는 개체의 생물학적 시료로부터 TGFB1 단백질의 발현 수준을 측 정하는 단계를 포함하는 패혈증 진단 방법을 제공하는 것 이다 .
본 발명의 다른 목적은 패혈증 진단에 사용되는 TGFBI 검출용 프라이 머 또는 TGFBI의 항체를 제공하는 것 이다 .
본 발명의 다른 목적은 TGFBI 검출용 프라이머 또는 TGFBI의 항체를 포함하 는 패혈증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명 의 다른 목적은 TGFBI 유전자의 mRNA, TGFBI 단백질 및 이들의 단편 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 프로브로 하는 패혈증 진단용 마이크로 어 레이를 제공하는 것이다 .
본 발명 의 다른 목적은 (a)패혈증이 의심되는 개체의 생물학적 시료로부터 TGFBI의 발현수준을 측정하는 단계 ; 및 (b) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 TGFBI 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는 패혈증 진단에 필요한 정보를 제공하 는 방법을 제공하는 것 이다 .
【기술적 해결방법】
상기 본 발명 의 목적을 달성하기 위해， 본 발명은 (a) 시험물질을 TGFBI (Transforming growth factor beta induced) 단백질을 발현하는 세포 또는 조 직과 접촉시 키는 단계 ; (b) 상기 시험물질이 접촉된 세포 또는 조직에서 TGFBI의 발현 수준올 측정하는 단계 ; 및 (c) 상기 시험물질이 접촉되지 않은 세포 또는 조 직에서의 TGFBI의 발현수준을 측정하여， 상기 (b) 단계에서 측정된 발현 수준이 감 소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 , 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성 물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명 의 다른 목적을 달성하기 위해， 본 발명은 TGFBI 단백질의 발현 억 제 제를 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다 . 본 발명 의 다른 목적을 달성하기 위해， TGFBI 단백질의 발현 억 제제의 유효 량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명 의 다른 목적을 달성하기 위 해， 패혈증 예방 또는 치료에 사용되는 TGFBI 발현 억제제를 제공한다 .
본 발명 의 다른 목적을 달성하기 위해 , 본 발명은 TGFBI 검출용 프라이머 또 는 TGFBI의 항체를 포함하는 패혈증 진단용 조성물을 제공한다 .
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해， TGFBI 검출용 프라이 머 또는 TGFBI의 항체를 이용하여 패혈증이 의심되는 개체의 생물학적 시료로부터 TGFB1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 패혈증 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 패혈증 진단에 사용되는 TGFBI 검출용 프라이머 또는 TGFBI의 항체를 제공한다 .
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해， 본 발명은 TGFBI 검출용 프라이머 또 는 TGFBI의 항체를 포함하는 패혈증 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해， 본 발명은 TGFBI 유전자의 mRNA, TGFBI 단백질 및 이들의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 프로브로 하는 패혈증 진단용 마이크로어 레이를 제공한다 .
본 발명 의 다른 목적을 달성하기 위해， 본 발명은 (a)패혈증이 의심되는 개 체의 생물학적 시료로부터 TGFBI의 발현수준을 측정하는 단계 ; 및 (b) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 TGFBI 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는 패혈증 진 단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 이하본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 (a) 시험물질을 TGFBI (Transforming growth factor beta induced) 단백질을 발현하는 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계; (b) 상기 시험물질이 접촉 된 세포 또는 조직에서 TGFBI의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질 이 접촉되지 않은 세포 또는 조직에서의 TGFBI의 발현수준을 측정하여, 상기 (b) 단계에서 측정된 발현 수준이 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는， 패혈 증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 TGFBI 단백질은 세포외 기잘 단백질로서 몇몇 세포에서만 발현 된다. TGFBIp는 N-말단 분비 신호 펩타이드, 시스테인 -rich domain, 4개의 연속적 인 FAS1 domain(four internal homologous repeats) , a Cᅳ terminal 'RGD' motif 를 포함하고 있다. 본 발명의 TGFBI 단백질은 공지된 TGFBI 단백질이라면 이에 해당될 수 있으나， 바람직하게는 Genbank Accession No. NP_000349, NM_000358.2, Q15582, AAH04972, AAH00097, AAH26352, AAC08449, AAA6116에 기재된 단백질일 수 있으며， 더 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
(a) 시험물질을 TGFBI (Transforming growth factor beta induced) 단백질을 발현하는 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계;
본 발명의 TGFBI 단백질을 발현하는 세포 또는 조직은 TGFBI 단백질이 내인 적으로 (endogenous) 발현 또는 일시적으로 TGFBI 고발현 된 세포 또는 조직을 포함 하며, 이에 특별히 제한되지 않는다. 본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되 는 용어 "시험물질"은 본 발명의 TGFBI 단백질의 발현에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 siRNACsmall interference RNA)， shRNA( short hairpin RNA) , miRNA(microRNA) , 리 보자임 (ribozyme), DNAzyme, PNACpeptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레 오타이드, 항체， 앱타머， 천연추출물 또는 화학물질을 포함하나, 이에 한정되는 것 은 아니다.
또한, 상기 (a) 단계에서 사용되는 세포는 실험동물의 형태로 제공될 수 있 으며， 이 경우 본 발명의 스크리닝 방법은 상기 실험동물에게 패혈증를 가하는 단 계를 추가로 포함하며, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구 투여, 정위주사를 포함하나， 이로 제한하는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하 기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
시험물질과의 접촉은 시험물질을 세포 또는 조직 배양 배지에 추가한 후 세 포를 일정 시간 배양하는 것을 의미한다. 상기 세포가 실험동물 형태로 제공될 때， 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구 투여, 정위주사를 포함하는 이로 제한되는 것은 아니며， 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선 택할 수 있을 것이다.
(b) 상기 시험물질이 접촉된 세포 또는 조직에서 TGFBI의 발현 수준을 측정 하는 단계 ;
발현 수준 측정은 TGFBI 유전자의 mRNA발현 수준 또는 이의 단백질 발현 수 준을 측정할 수.있다. mRNA 발현 수준 측정 측정방법은 당업계에서 이용되는 통상 의 발현 수준 방법 모두 사용될 수 있으며, 분석 방법의 예로 RT-PCR, 경쟁적 RT- PCRCcompetitive RT-PCR) , 실시간 RT-PCR (Real -time RT-PCR) , RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay) , 노던 블랏팅 (northern blotting), DNA 마이크로어 레이 칩 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한， 단백질 자체 발현 수준 측정 방법은 당업계에서 사용하는 통상의 방법 모두 사용될 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블럿팅 (Western Blotting), 효소면역분석법 (enzyme-1 inked immunosorbent assay) , 방사능면역분석법 (RIA)， 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법， 로케 트 면역 전기영동, 면역조직화학, 면역침전법 (immunoprecipitation), 보체 고정 분 석법, 유세포 분석법 (FACS) 또는 단백질 칩 방법 등이 있고， 이에 한정되는 것은 아니다.
(c) 상기 시험물질이 접촉되지 않은 세포 또는 조직에서의 TGFBI의 발현수준 을 측정하여， 상기 (b) 단계에서 축정된 발현 수준이 감소된 시험물질을 선별하는 단계;
상기 (c) 단계는 시험물질이 접촉안 된 세포 또는 조직 (대조군)의 TGFBI 발 현 수준을 측정한 후, (b)단계에서 측정된 TGFBI 발현 수준과 비교해 봤을 때, (b) 단계에서 측정한 값이 더 낮을 경우, 상기 시험물질은 TGFBI 단백질의 발현을 억제 하는 물질이므로 시험물질을 패혈증 치료용 물질로 택하는 단계이다. 패혈증과 TGFBI 단백질의 관계를 알아보기 위해, 정상대조군, 패혈증 환자 군， 패혈증성 쇼쿠 환자군의 혈중 TGFBIp 농도를 축정한 결과， 패혈증 증세가 심할 수록 농도가 증가하였다. CLP로 패혈증 유도한 마우스로도 혈중 TGFBIp 농도를 측 정한 결과， CLP시술 한 시간이 지날수록 농도가 증가하였다 (실험결과 1 참조). 패혈증 발병 시, 내독성 물질 또는 염증촉진 사이토킨의 방출은 내피세포 손 상을 일으키는데， 내피세포 손상과 TGFBIp 분비의 관계를 알아보기 위해, LPS로 혈 관내피세포인 HUVECs를 자극하여 TGFBIp 분비량을 분석한 결과， LPS 처리 시간이 길수록 TGFBIp분비량도 증가하였다 (실험결과 2 참조).
또한， 항 -TGFBIp 항체를 패혈증 모델에 투여한 결과， 혈중 TGFBIp 농도가 현 저하게 감소하고, 치사율 또한 감소하였다 (실험결과 3 참조). TGFBIp-knock out model에서도 야생형 마우스보다 패혈증으로 인한 사망률이 유의적으로 적었다 (실험 결과 4 참조). TGFBIp를 마우스에 정짹주사하면 혈관 투과도가 현저히 증가하였고 ( 실험결과 5-2, 도 11 참조), knock out model (TGFBIp-/-)과 야생형 모델에 CLP 시 술로 패혈증을 유도하였을 때, 넉아웃 모델의 혈관투과성이 야생형 모델보다 현저 히 낮았다 (실험결과 5-2, 도 12 참조).
상기와 같은 결과는 TGFBIp 수준의 감소가 여러 종의 미생물에 의한 패혈증 사망과 TGFBIp 중화로부터 보호받을 수 있다는 점에서 패혈증과 패혈증성 쇼크에 대한 치료전략이 될 수 있다는 것을 시사해준다. 따라서 본 발명은 TGFBI 단백질의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 패 혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 TGFBI 단백질의 발현 억제제의 유효량을 이를 필 요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료 방법을 제공한 다.
또한 본 발명은 본 발명의 패혈증 예방 또는 치료에 사용되는 TGFBI 발현 억 제제를 제공한다.
상기 "유효량"이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말 하며 바람직하게는 패혈증을 치료하기에 충분한 양을 말한다.
상기 '개체 (subject)'란 동물, 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하 는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세포, 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개 체는 치료가 필요한 환자 (patient)일 수 있다.
상기 "TGFBI 단백질의 발현 억제제 "는 TGFBI 유전자의 발현을 억제하거나， TGFBI 단백질의 활성을 억제하는 물질을 의미하고， 상기 물질의 형태는 siRNA(small interference R A) , shRNA( short hairpin RNA) , miRNA(microRNA) , 리 보자임 (ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 을리고뉴클레 오타이드， 항체, ¾타머, 천연추출물 또는 화학물질일 수 있다. 보다 바람직하게 는， 상기 물질은 TGFBI 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열， 상기 뉴클레오타 이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대한 siRNA, shR A, miRNA, 리보자임 (ribozyme)， DNAzyme 또는 안티센스 을리고뉴클레오타이드 일 수 있고， 더 바람직하게는 항체일 수 있다. 본 명세서에서 "발현"이란 TGFBI 유 전자의 전사 및 전사체의 단백질로의 발현을 의미하며， "활성' '이란 발현된 단백질 이 세포내에서 제 기능할 수 있도록 하는 생물학적 작용을 의미한다.
siRNA, shRNA 및 miRNA는 RNA 간섭 (interference) 작용을 통해, 예를 들면 짧은 길이의 간섭 RNA (siRNA)가 서열 특이적으로 전사체에 결합하여， RISC(RNA Induced Silencing Complex)를 형성하여, 전사된 RNA가 세포내에 단백질로 발현될 수 없도록 (silencing) 한다. siRNA, shRNA 또는 raiRNA는 그 표적 서열에 상당히 상보적인 서열을 갖는다. 상당히 상보적 서열이란， 표적 유전자의 적어도 연속적인 15 베이스 길이의 서열과 적어도 약 70% 상보성, 적어도 약 80% 상보성， 적어도 약 90%상보성 , 또는 약 100%상보성을 의미한다.
안티센스 을리고뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 바와 같으며, 예를 들면 표적 단백질의 임의의 코딩 서열에 결합하여， 표적 단백질의 발현을 억제 /감소시키 는 짧은 합성 핵산이다. 안테센스 RNA는 표적 유전자 및 전달 방법에 따라 적절한 길이를 가질 수 있으며， 예를 들면 약 6, 8 또는 10 내지 40, 60 또는 100 뉴클레 오타이드이다.
TGFBI 단백질의 활성을 억제할 수 있는 물질로 TGFBI를 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 들 수 있다. 본 발명에서 용어， "항체"란 당해 분야에서 공지된 용 어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명 의 목적상， 항체는 본 발명의 마커인 TGFBI 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항 체를 의미하며， 이러한 항체는， 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현백터에 클 로닝 하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고， 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있 는 부분 펩티드도 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴 리클로날 항체， 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가， 본 발명 의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. - 본 발명의 패혈증 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기 능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능올 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv등이 있다.
상기 항체는 이에 한정하지는 않지만， 바람직하게는 TGFBI의 에피토프 (epitope)를 특이적으로 인식할 수 있는 단일클론항체 일 수 있고， 상기 에피토프 는 이에 한정하지는 않지만, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명에서 단일클론 항체는 당해 분야에 공지된 용어이며, 단일 항원성 부 위에 대해서 지시되는 고도로 특이적인 항체이다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피 토프)에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다중클론 항체와는 다르게， 단클 론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 본 발명의 단클론 항체는 통 상적인 클로닝 및 세포 융합 기술들을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 관심 대상의 면역원 (항원)을 야생형이나 육종된 마우스 (예를 들면， BALB/c)에 투여하여 천연 또는 사람 단클론 항체를 생산할 수 있다. 이러한 항원은 단독으로 투여되거 나， 애주번트와 흔합하여 투여되거나， 백터로부터 발현될 수 있으며 DNA또는 융합 단백질로서 면역 반웅을 유도할 수 있다. 융합 단백질은 면역 반웅에 의도된 펩타 이드와 커플링된 담체 단백질， 예를 들면， β-갈락토시다제， 글루타티온 S-트랜스 퍼라제， 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 및 소 혈청 알부민을 포함하며， 담체 단백질 은 이에 제한되지는 않는다. 상기의 경우에 펩타이드는 담체 단백질에 대해서 합텐 (hapten)으로 작용한다.
상기 단일클론 항체 제조 방법을 간략히 설명하면 다음과 같다. 동물을 부스 팅시킨 후, 비장을 제거하고 비장 세포를 추출하여 당해 분야에 공지된 방법 [Kohler and Milstein, Nature 256： 495-497 (1975)； and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)]으로 골수종 세포와 융합시킨다. 수득되는 하이브리드 세포를 통상적인 방 법， 예를 들면, 제한 회석으로 클로닝하고， 목적하는 단일클론 항체를 생산하는 수 득된 클론을 배양하는 것이다. 단일클론 항체는 항원 -항체 결합을 사용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며， 또한, 하이브 리도마 배양에 의해 합성되기 때문에, 다론 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다 는 또 다른 장점을 갖는다. 제조된 하이브리드 세포를 단독배양하여 항체를 수득할 수 있고， 다른 방법으로는 하이브리드 세포를 동물에 주입하여， 복수액을 체취한 후, 복수액으로부터 수득할 수도 있다.
본 발명에서 하이브리도마 세포는 당해 분야에 공지되어 있으며， 항체 생산 세포와 불멸 세포， 예를 들면 골수종. 세포와의 융합에 의해서 형성된 세포를 의미 한다. 상기 하이브리도마 세포는 항체를 지속적으로 공급할 수 있다. 본 명세서에서 '에피토프 (epitope)'는 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항 원결정부위이다. TGFBI 단백질의 에피토프 (epitope)이고， 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 투여한 CLP 패혈증 모델의 치사율이 면역글로빈을 투여한 CLP 패혈증 모델의 치사율보다 낮았 다 (실험결과 3， 도 8 참조). 본 발명의 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 언급한 TGFBI 발 현 억제제 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및 /또는 흡수성을 유지 /증가시키는 화합물을 추가로 함유 할 수 있다. 또한 패혈증의 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술， 약물치 료 및 생물학적 반웅조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 본 발 명의 약학적. 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가 능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수， 멸균수， 링거액， 완층 식염수， 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액， 글 리세를, 에탄올, 리포좀 및 아들 성분 중 1 성분 이상을 흔합하여 사용할 수 있으 며， 필요에 따라 항산화제， 완층액， 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있 다. 또한 회석제， 분산제， 계면활성계, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액， 현탁액， 유탁액 등과 같은 주사용 제형， 환약， 캡슬， 과립 또는 정제로 제 제화할 수 있으며， 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항 체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기 술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science (최근판), Mack Publishing Company, East on PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며， 공지된 투여방법을 적용할 수 있으며， 목적하는 방법에 따라 비경구 투여 (예를 들 어 정맥 내， 피하， 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며， 비경 구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형， 코 /호흡기를 통해 투여할 수 있으며， 신속 한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다. 투여량은 환 자의 체중， 연령， 성별， 건강상태， 식이, 투여시간, 투여방법 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며， 공지된 TGFBI 억제제의 투여량을 적용 할 수 있다. TGFBI를 표적으로 하는 siRNA, miRNA, 안테센스 올리고뉴클레오타이 드, shRNA 제제 및 폴리펩타이드를 포함한 단백질 제제의 경우 비경구 투여가 선호 될 수 있으나 다른 경로 및 수단을 배제하는 것은 아니다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는 ,· 예를 들어 약 0.01 mg 내지 100 mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 lyg 내지 10g 일 수 있으 며， 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 본 발명은 TGFBI 검출용 프라이머 또는 TGFBI의 항체를 포함하는 패혈증 진 단용 조성물 및 진단용 키트를 제공한다. TGFBI 발현수준이 높을수록， 패혈증 증세 가 심한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 TGFBI 검출용 프라이머 또는 TGFBI의 항체를 이용 하여 패혈증이 의심되는 개체의 생물학적 시료로부터 TGFB1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 패혈증 진단 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 패혈증 진단에 사용되는 TGFBI 검출용 프라이머 또는 TGFBI의 항체를 제공한다. 본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상， 진단은 패혈증 발병 여부를 확인하는 것이다.
상기 "프라이머' '란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중 합제) 및 적당한 온도 하에서 주형 -지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적 에 따라 달라질 수 있으나， 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분 자는 일반적으로 주형과 안정한 흔성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요 로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 흔성 화 할 정도로 층분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 흔성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 흔성화하는 제 2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고， 이는 특정 대 립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머에는 리가제 연쇄 반 웅 (ligase chainreaction ： LCR)에서는 사용되는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한 다 본 발명에 있어서 상기 프라이머로는 상기 프라이머는 서열번호 3 및 5로 표시 되는 프라이머 쌍 또는 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 쌍일 수 있다. 상기 프라이머는 본 명세서의 실험발명 6에서 TGFBIp-knockout 마우스를 제작한 후， genotyping을 할 때 사용했던 프라이머이다. 이 프라이머들은 TGFBI의 액손 3이 포 함된 부분을 증폭할 수 있다. 상기 프라이머들로 PCR을 실행하면， TGFBI의 발현을 비교할 수 있음을 도 13을 통해 확인할 수 있다. 상기 TGFBI의 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있고, 바람직하게 는 상기 단클론 항체는 TGFBI 단백질의 에피토프 (epitope)인 서열번호 2의 아미노 산서열로 표시되는 폴리펩타이드를 특이적으로 인식한다.
항체에 대한 정의 및 범위는 상기 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 설명에서 서술한 바와 같다.
본 발명의 패혈증 진단용 키트에는 TGFBI의 발현 수준을 측정하기 위하여 선 택적으로 마커를 인지하는 항체 또는 프라이머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물， 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 구체적인 일 양태로서， 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반웅을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역 전사 중합효소반웅 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포 함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레 오타이드로서 , 약 7 bp 내지 50 bp의 길이， 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반웅 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이 너， 반웅 완층액 (pH 및 마그네슴 농도는 다양)， 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소， DMse, RNAse 억제제 DEPC-수 (DEPC- water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는， 바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA칩 키트는 유전자 또는 그 의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판， 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴 클레오티드를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는， ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것 을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적 인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로， 단클론 항체， 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약， 예를 들면， 표지된 2차 항체， 발색단 (chromophores), 효소 (예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또 는 항체와 결합할수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한， 본 발명의 키트는 효소와 발색 반웅할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함 할 수 있다. 분석을 위해 사용되는 시료는 혈청， 뇨， 눈물 타액 등 정상적인 상태 와 구별될 수 있는 질환 특이적 폴리펩타이드를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함 한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료， 예를 들어 혈액, 혈청， 혈장으로부터 측 정될 수 있다. 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도톡 준비될 수 있는데 예를 들어 환자로부터 수득한 혈청 시료는 음이온 교환 크로마토그래피， 친화도 크 로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피， 연속추출 (sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전 처리될 수 있다. 본 발명은 TGFBI 유전자의 mRNA, TGFBI 단백질 및 이들의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 프로브로 하는 패혈증 진단용 마이크로어레이를 제공한 다. 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 마이크 로어레이에 있어서， 상기한 프로브는 흔성화 어레이 요소 (hybridizable array element)로서 이용되며, 기체 (substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합 한 견고성 또는 반ᅳ견고성 지지체로서， 예컨대， 막， 필터， 칩， 슬라이드, 웨이퍼， 파이버， 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔， 튜빙， 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 흔성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어， 상기 흔성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한， 상기 흔성화 어레이 요소는 링커 ( 예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.
한편， 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 RNA, 단백질 또는 이의 단 편은 표지 (labeling) 될 수 있고， 마이크로어레이상의 어레이 요소와 흔성화된다. 흔성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 흔성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
프로브의 표지는 흔성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있다. 적합 한 표지는 형광단 (예컨대， 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민， 리사민 (lissamine；)， 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia))， 발 색단， 화학발광단， 자기입자， 방사능동위원소 (P32 및 S35), 매스 표지， 전자밀집입 자， 효소 (알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제)， 조인자， 효소에 대 한 기질， 중금속 (예컨대， 금) 그리고 항체, 스트랩타비딘， 바이오틴， 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법， 예컨대， 닉 트랜스 레이션 (nick translation) 방법， 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65 :499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광， 방사 능， 발색 측정， 중량 측정， X-선 회절 또는 흡수, 자기， 효소적 활성， 매스 분석， 결합 친화도， 흔성화 고주파， 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제 공한다.
본 발명에서， 적합한 흔성화 조건은 최적화 절차에 의하껴 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어， 온도, 성분의 농도， 흔성 화 및 세척 시간, 완층액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길 이 및 GC 양 및 타겟 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 흔성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al . , Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , N.Y. (2001)； 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer— Ver lag New York Inc. N.Y. (1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어， 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHP04, 7% SDS( sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65°C 조건으로 흔 성화하고， 0.1 x SSC( standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68°C 조건으로 세척 하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 X SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에 서 48 °C 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어， 0.2 X SSC/0.1% SDS에서 42 °C 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
흔성화 반웅 이후에， 흔성화 반웅을 통하여 나오는 흔성화 시그널을 검출한 다. 흔성화 시그널은 예컨대， 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으 로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우， 이 효소의 기 질을 흔성화 반웅 결과물과 반응시켜 흔성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있 는 효소 /기질의 조합은, 퍼옥시다아제 (예컨대， 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로 나프를， 아미노에틸카바졸， 디아미노벤지딘, D-루시페린， 루시게닌 (비스 -N-메틸아 크리디늄 니트레이트)， 레소루핀 벤질 에테르， 루미놀， 암플렉스 레드 시약 (10-아 세틸 -3, 7-디하이드록시페녹사진)， HYR ( -pheny 1 ened i am i ne-HC 1 and pyrocatechol ) , TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2-Azine-di [3-ethylbenzthiazol ine sulfonate]), o_페닐렌디아민 (OPD) 및 나프를 /파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브 로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프를 -AS- B1—포스페이트 (naphthol-AS-Bl-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t— NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 또한， 본 발명은 (a)패혈증이 의심되는 개체의 생물학적 시료로부터 TGFBI의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 TGFBI 발 현수준과 비교하는 단계를 포함하는 패혈증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 생물학적 시료는 조직， 세포， 혈액， 혈청, 혈장, 타액, 객담， 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나， 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 는 혈액， 혈청 또는 혈장일 수 있다.
상기 방법은 정상 대조군에서의 TGFBI 단편 발현 수준을 패혈증 의심 개체에 서의 발현 수준과 비교함으로써 의심 개체의 실제 패혈증 여부를 진단할 수 있다. TGFBI 단백질 발현 수준이 정상 대조군의 것보다 높을 경우， 시료를 제공한 개체를 패혈증으로 예측할 수 있는 것이다.
TGFBI 단백질 발현 수준을 측정하기 위해서는 mRNA 발현 수준 또는 단백질 발현 수준을 분석할 수 있는데， 분석 방법으로는， RT-PCR, 경쟁적 RT- PCR( competitive RT-PCR) , 실시간 RT-PCR( Real -time RT-PCR) , RNase 보호 분석법 (RPA:RNase protection assay) , 노던 블랏팅 (northern blotting), DNA 마이크로어 레이 칩， 웨스턴 블럿팅 (Western Blotting), 효소면역분석법 (enzyme-1 inked immunosorbent assay) , 방사능면역분석법 (RIA), 방사면역확산법， 오우크테로니 면 역 확산법， 로케트 면역 전기영동， 면역조직화학， 면역침전법 (i謹 unoprecipitation), 보체 고정 분석법， 유세포 분석법 (FACS) 또는 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
【유리한 효과】
TGFBIp는 패혈증 발생 시， 현저히 증가하는데 TGFBIp의 발현을 감소시키면， 패혈증으로 인한 치사율， 혈관 내피 세포의 투과성을 줄일 수 있다. 따라서 TGFBIp를 이용하여 패혈증 치료제를 선별할 수 있고， TGFBIp 억제제로 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조할 수 있고, TGFBI 단백질의 발현 수준 측정으로 패혈증을 진단하는데 효과적이다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 knock out mouse (TGFBIp-/-)를 생산하기 위해 시행한 유전자 조작 지 도이다.
도 2는 정상 환자군 (normal), 패혈증 환자군 (sepsis), 패혈증성 쇼크 환자군 (septic shock)의 혈중 TGFBIp농도를 나타낸다.
도 3은 CLP시술을 한패혈증 모델의 혈중 TGFBIp농도를 측정한 결과이다. 도 4는 LPS처리에 따른 혈관내피세포 (HUVECs)의 TGFBIp 방출을 웨스턴 블랏 팅으로 관찰한 결과이다. (sup:상등액， cell lysate ： 세포 파쇄물， cont ： LPS 처 리 안한 대조군, LPS(30 min) ： LPS 30분 처리한 실험군， LPS(60 min) ： LPS 60분 처리한 실험군)
ᅳ 도 5는 LPS 처리에 따른 혈관내피세포 (HUVECs)의 TGFBIp 방출을 ELISA로 관 찰한 결과이다. (sup:상둥액, cell lysate ： 세포 파쇄물， cont ： LPS 처리 안한 대조군, LPS(30 min) ： LPS 30분 처리한 실험군， LPS(60 min) ： LPS 60분 처리한 실험군)
도 6은 항 -TGFBIp항체 투여 실험을 진행한 방법을 도식화 한 것이다.
도 7은 항 -TGFBIp항체 투여가 혈중 TGFBIp 농도에 미치는 영향을 측정한 결 과이다. (CLP ： CLP 패혈증 모델， CLP+IgG ： CLP 패혈증 모델에 면역글로블린 G를 투여한 실험군， CLP + TGFBIp Neut Ab ： CLP 패혈증 모델에 TGFBIp 중화항체 투여 한 실험군)
도 8은 항 -TGFBIp 항체 투여가 CLP 패혈증 모델의 생존률에 미치는 영향을 측정한 결과이다. (CLP (·) ： CLP 패혈증 모델, CLP+IgG (□) ： CLP 패혈증 모델 에 면역글로블린 G를 투여한 실험군， CLP + TGFBIp Neut Ab (■) ： CLP 패혈증 모 델에 TGFBIp 중화항체 투여한 실험군)
도 9는 야생형 모델과 넉아웃 모델 (TGFBIp-/-)의 혈중 TGFBIp 농도를 측정 한 결과이다. ΟΓΓ ： 야생형 모델， K0 ： 넉아웃 모델)
도 10은 야생형 모델과 넉아웃 모델 (TGFBIp-/-)의 CLP-유도 패혈증으로 인한 생존율을 측정한 결과이다.
도 11은 TGFBIp가 혈관투과성에 주는 효과를 BSA-에반스 블루 염색약이 빠져 나오는 정도를 아용하여 측정한 결과이다.
도 12는 넉아웃 마우스와 야생형 마우스의 내피세포 투과성에 TGFBIp가 주는 영향을 BSA-에반스 블루 염색약이 빠져나오는 정도를 이용하여 측정한 결과이다. 도 13은 넉아웃 마우스가 성공적으로 제조되었는지 genotyping 한 PCR 결과 이다. (S1/A ： 센스 프라이머 S1과 안티센스 프라이머 A로 수행한 결과 ， S2/A ： 센 스 프라이머 S2와 안티센스 프라이머 A로 수행한 결과)
【발명의 실시를 위한 형태】
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. 시약들
세균성 지다당류 (LPS, 혈청형: 0111:B4, L5293)와 항생제 (페니실린 G, 스트렙 토마이신)은 Sigma(St. Louis, M0)에서 구입하였다. TGFBIp 단백질 (서열번호 1)은 참고문헌 (Kim J.E. et.al. J Cell Biochem: 77 :169-178 ,2000 & Bae J,S, et.al., Biochem Biophys Res Commun; 294 :940-948， 2002)에서 서술한 방법으로 얻고 정제하 였다. Triton X-114 (Sigma, St. Louis, M0)은 세균세포용해물의 내독소를 제거하 는데 사용되었다. 2. 중화 TGFBIp항체
항 -인간 TGFBI 단일클론항체는 E. col i에서 생산한 재조합 인간 -TGFBIp 에피 토프 (서열번호 2， 인간 -TGFBIp의 502632번째 아미노산 부분)로 반복적인 면역화를 유도한 후, BALb/c 마우스에서 생산하였다. 지속적으로 양성인 하이브리도마 클론 (Clone 18B3)으로 Harlow and Lane ( Ant i bodies： A Laboratory. Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY, 1988)이 서술한 방법으로 복수액 (ascites)을 생산하였다. 복수액은 원심분리를 통해 지질층과 세포 알갱이를 제거 하고 제조사의 프로토콜에 따라 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 통해 정제되었 다. 항 -인간 TGFBI 항체의 특이성은 웨스턴 블롯으로 검사했고， 그 결과， 마우스 TGFBIp에 교차반웅하는 것을 확인하였다.
3. 실험참여 환자및 정상혈청 시료
건강한 지원자가 대조군의 역할을 하였고， 환자의 분류는 패혈증 합의 회의 위원회 (bone, R.C. , et.al., Chest； 101： 1644-1655 & 1481-1483, 1992)에 따라 나눠 졌다. 대조군 및 환자군의 임상자료, 진단， 치료 양상과 혈액 시료를 수집하였다. 혈청시료는 전혈 수집 후 48시간 내에 얻어졌고 (2000 X g, 5분 원심분리) 혈청들은 분석전까지 -20C에 보관되었으며， 연구 프로토콜은 경북대학교 병원 (대구, 대한민 국) 기관 검토 위원회로부터 승인되었다 (KNUH 2012-01-010) .
4. 세포배양
1차 HUVECs는 Cambrex Bio Science (Charles City, IA)로부터 얻었고 'Bae, J.S. et.al. , Blood; 118:3952-3959,2011'에 서술한 방법으로 유지하였다. 간략하 게， 세포는 EBM-2 성장보조물 (Cambrex Bio Science)를 포함한 기저 배지에서 37°C， 5% C02 조건으로 배양하였다. passage number가 3또는 5인 HUVECs를 실험에 사용 하였다.
5. 마우스로부터 내피세포의 분리
내피세포는 항 -CD31항체와 Dynal 자기홀더에 결합하는 Dynal비드를 이용하여 제조사 (Dynal Biotec, Lake Success, NY)의 설명에 따라 분리하였다. 간략하게， 내 피세포의 분리를 위해서 4-6마리의 마우스 (6-10주령)를 안락사하여 복막 구멍을 노 출시킨 후， 폐와 심장을 잘라 RPMI 배지에 넣고 심장과 폐로부터 다른 조직들을 제 거한 후 PBS로 한번 씻어냈다. 폐와 심장에 1.0 mg/ml의 아교질가수분해효소를 넣 고 50 ml 튜브에서 1시간 동안 37°C에서 진탕 배양하면서， 배양 중 5분마다 튜브를 몇 초간 조심스럽게 흔들어주고， 부유물은 새로운 50 ml 튜브에 옮긴 후 70 um 조 직체 (BD falcon)를 통과시켰다. 여과된 세포 부유물은 10분간 lOOOrpm에서 원심분 리하여， 상층액을 제거한 후 세포 덩어리는 새로운 15ml 튜브에서 차가운 PBS로 한 번 씻어냈다. Dynal비드에 결합하는 항-마우스 CD31 항체를 준비하기 위해서 60 ml Dynal비드를 자석홀더 (invitrogen)에서 MACS버퍼 (PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA)로 세 척했다. 600 μ 1 MACS 버퍼로 재부유 시킨 Dynal비드를 10ul 비드 당 5 mg의 항-마 우스 CD31를 첨가하여 4°C에서 12시간동안 배양시켰다. 세포를 항-마우스 CD31항체 에 결합하는 Dynal비즈와 함께 10분간 상온에서 배양한 후 자기홀더 안에 놓아두었 다. 피펫을 튜브벽 쪽으로 놓고， 세포 부유액을 15 ml 튜브로 천천히 옮겼다. 5분 간 배양한 후 PBS를 조심스럽게 빨아들였다. 항-마우스 CD31항체에 결합하는 Dynal 비즈는 차가운 PBS로 3번 씻어내고 , pel let은 EBM— 2 성장 배지에서 재부유시킨 후， 콜라겐이 코팅된 배양접시에 놓는다.
6. TGFBIp-Knockout실험쥐 생산
TGFBIp-knockout 실험쥐 모델을 Cre/LoxP targeting올 사용하여 만들었다. 엑손 3 양 측면의 ΙοχΡ 부분을 포함하는 표적구조물은 양 쪽에 FLP recombinase target (FRT)서열이 있는 PGK-네오마이신 (neo) 선택 카세트를 포함하는 백터 내로 복제되었다. 표적백터가 삽입 된 배아줄기세포는 키메라를 생산하기 위해 C57BL/6 배반포로 미세주입되었다. FRT에 둘러싸인 PGK-neo 카세트를 Flp 매개 ACTFLPe 유 전자변형 마우스의 재조합에 의해 제거하였다. Exon3를 제거하기 위해 TGFBIflox/+ 마우스를 프로타민 I-Cre (Prml-Cre) 유전자변형 마우스와 교배시켜， TGFBIp+/- 이 형접합성 마우스를 생산했다. 마지막으로， TGFBIp-/-마우스는 TGFBIp+/-이형접합성 마우스 교배로 생산했다. 넉아웃 마우스 생산을 위한 유전자 지도 모식도는 도 1에 표시하였다. 모든 동물실험에 관한 절차는 경북대학교의 승인에 의해 수행되었다. 모든 유전자형검사는 센스 프라이머 Sl(5'-CCATACTCTGACTTCCAGGTTATTA-3'， 서열번 호 3)， 센스 프라이머 S2(5'-AGTCATCAGTTATGAGTGCTGT-3' , 서열번호 4)와 안티센스 프라이머 A (5 ' -TGGCAGACTAGCAAGGGTTT-3 ' , 서열번호 5)를 사용한 유전자 DNA의 PCR 을 통해 수행되었고 1099bp, 602bp (야생형), 376bp(TGFBI 녹아웃)의 산물을 생성하 였다. PCR결과는 도 13에 기재하였다.
7. CLP유도 패혈증마우스모델 생산 패혈증을 유도하기 위해 수컷 마우스를 졸레틸 50(zoletil 50)과 럼푼 (rotnpun)으로 마취시켰다. CLP 유도-패혈증모델은 이전에 기술 (Wang, H., et.al. , Nat Med; 10: 12161221 ,2004)한 방법으로 준비하였다. 간략하게， 장에 붙어있는 막창 자가 노출되도록 2cm의 정중선 절개하였다. 막창자 끝에서 5.0隱 부분을 3.0 실크 봉합사로 단단히 봉합시키고 22치수의 바늘로 찌른 후， 막창자를 조심스럽게 쥐어 짜서 구멍으로부터 적은 양의 변을 나오게 하고 복막 구멍으로 다시 되돌려 놓았 다. 개복한 부위는 4.0 실크로 봉합하였다. 대조군 동물들은 막창자가 노출되게 한 후 봉합하거나 찔러보지 않고 복막구명으로 되돌려 놓았다. 이 프로토콜은 사전에 경북대학교 동물관리위원회로부터 승인되었다.
8. TGFBIp의 ELISA
세포 배양 배지 혹은 마우스 혈청의 TGFBIp 농도는 경쟁적 ELISA 방법 (Bae, J.S. et.al., biognb Biophys Res Commun; 294 :940-948 ,2002)으로 측정하였다.
9. 웨스턴블롯
HUVECs를 LPS (100 ng/ml)로 활성화 시킨 후, 펠렛과 상층액을 수집하였다. SDS-PAGE 후 다중클론 토끼 항 -TGFBIp 항체로 면역분석법을 수행하였다. α-Actin은 로딩 컨트를로 사용하였다.
10. 투과성 분석 (in vitro)
TGFBIp 농도의 증가에 따른 내피세포 투과성은 modified 2-compartment chamber model을 이용하여 기능 세포의 단층막을 투과하는 알부민에 결합하는 에반 스 블루의 흐름을 분광학적으로 측정하여 정량 하였다 (Bae, J.S. et.al.,
Blood；118 :3952-3959 ,2011 참조). HUVECs은 3-μπι 구멍크기와 지름 12-隨의 transwell에서 3일간 평판배양했다 (5 x loVwell).융합 단층들은 TGFBIp (0 - 5 μ g/ml) 의 농도를 높여가며 6시간 배양하였다. 적당할 때 세포들은 기능 차단 인테 그린 항체로 30분간 미리 배양하였다. 성장 배지 (4% BSA)로 희석함 에반스 블루 (0.5ml)를 첨가하기 전， 삽입물은 PBS(pH 7.4)로 세척했다. 신선한 성장 배지를 아 래쪽 챔버에 첨가하고 위쪽 챔버의 중간 부분은 에반스블루 / BSA로 교체되었다. 10 분 후， 650nm에서 아래쪽 챔버의 광밀도를 측정하였다. 실험은 삼중으로 수행되었 고, 적어도 3회 실시하였다. 11. 통계분석
모든 실험은 독립적으로 적어도 3번 수행되었고， 값은 土 SDs 방법으로 표현 했다. 실험집단 간의 통계학적으로 유의적인 차이는 SPSS for Windows, version 16.0 (SPSS, Chicago, IL)를 이용했고, 통계적 연관성은 분산분석 (AN0VA)를 통해 분 석하였다. (p<0.05)
<실험결과>
1. 패혈증과 혈중 TGFBIp농도의 관계
1-1. 패혈증환자의 혈중 TGFBIp농도측정
패혈증 환자의 TGFBIp 농도를 측정하였다. 21명의 건강한 지원자의 혈청 TGFBIp 농도의 중앙값은 316.10 (292.92 ~ 368.38) ng/mL 였다. 패혈증 증세가 심 할수록 TGFBIp 농도는 증가하였는데， 일반적인 패혈증 환자는 551.55 (454.54891.84, n=53), 중증 패혈증 환자는 670.32 (472.11806.07, n=22), 패혈성 쇼크 환자는 874.98 (774.961067.57, n=30) ng/mL로 나왔다 (도 2 참조).
1-2. 패혈증마우스의 혈중 TGFBIp농도측정
CLPCcecal ligation and puncture, CLP) 유도 패혈증 마우스 모델의 혈중 TGFBIp 농도를 측정했다. CLP모델이 인간 패혈증과 매우 유사하기 때문이다. 24시 간 후， 동물들은 패혈증 증세를 보였다. 혈청 TGFBIp 농도는 CLP유도한 시간 -의존 적으로 증가했다 (도 3 참조).
2. 혈관내피세포자극과 TGFBIp분비
TGFBIp의 분비가 내피 세포의 상태에 따라 어떻게 변하는지 알아보기 위해， HUVECs (human umbilical vein endothelial cells) 세포에 LPS(100 ng/mL, 0.5 hr, 1 hr)를 처리한 실험군과 처리안 한 대조군을 준비했다. 상기 실험군에서 HUVEC-방 출 상등액과 세포 파쇄물을 상기 실험군의 세포들에서 분리하여 웨스턴 블랏팅과 ELISA로 분석을 하였고， 결과는 도 4및 도 5에 기재하였다.
상기 도면에서 HUVEC- resting상태일 때에는 TGFBIp가 세포 파쇄물에만 존 재하지만， LPS로 자극한 경우에는 상등액에 존재한다. 즉， LPS자극 시에 HUVECs로 부터 TGFBIp가 분비된다는 것을 알 수 있다. 3. 항 -TGFBIp항체와패혈증모델의 생존률
상기 실험결과로부터, 항 -TGFBI 중화 항체 (neutralizing antibody)는 생존률 과 관련된 CLP 모델의 해로운 효과를 개선시킬 수 있다고 판단하였다. 중화 TGFBIp-단일클론항체가 CLPᅳ유도 패혈증 실험쥐의 생존 및 TGFBIp 혈청 농도에 미 치는 영향를 확인하기 위해， 중화 TGFBIp 항체 (300 mg/kg, 12 h after CLP i.v.)를 투여했다. CLP 시술 시기, TGFBIp 중화 항체 투여 시기， ELISA 분석을 하기 위해 혈액 채취 시기 등은 도 6에 표시했다.
그 결과， TGFBIp 혈청농도는 현저하게 감소하였다. TGFBIp 중화 항체 대신 면역글로블린 G(300 mg/kg, 정맥주사)를 투여한 실험군보다도 현저히 감소했고 (도 7참조), 치사율도 감소했다 (도 8 참조).
4. TGFBIp -넉아웃마우스 (TGFBIp-/-)의 패혈증유도사망률.
패혈증에서 TGFBIp의 결정적인 역할을 조사하기 위해 Cre/LoxP를 이용하여 TGFBIp 넉아웃 마우스를 생산하였다. 상기 넉아웃 마우스 혈액을 검사해본 결과 TGFBIp가 검출되지 않았다 (도 9 참조).
TGFBIp 제거의 효과를 검사하기 위해， CLP 수술로 유도된 패혈증 모델의 사 망를을 조사하였고， 결과는 도 10 에 기재하였다. 상기 결과에서 야생형보다 넉아 웃 마우스의 생존율이 상당히 높다는 것을 확인할 수 있다.
5. 혈관투과성에 미치는 TCFBIp의 영향
5-1. 내생성 TGFBIp와혈관투과성
분자적 기작과 패혈증에서 TGFBIp의 역할을 알아보기 위해, 혈관투과성에 미 치는 TGFBIp의 효과를 조사하였다. 외부로부터 첨가된 Endotoxine free-TGFBIp는 야생형， 넉아웃 마우스 (TGFBIp-/— )에서 분리한 내피세포 혈관 투과성을 농도의존적 으로 비슷하게 높였다 (도 10 참조). 그러나 TGFBIp와 LPS를 같이 배양한 일차세포 에서는， 야생형 마우스의 내피세포 혈관투과성이 닉아웃 마우스보다 높게 나왔고, 이는 내생성 (endogenous) TGFBIp가 혈관투과성에 기여한다는 것을 보여준다.
5-2. 혈관투과성을높이는 TGFBIp
혈관을 약하게 만드는 TGFBIp의 생체 내 효과를 확인하기 위해， TGFBIp를 마 우스에 정맥주사한 후， 혈장ᅳ에서 복막강으로 BSA-에반스블루 염색약이 빠져나오는 정도를 이용하여 혈관투과도를 측정하였고， 결과는 도 11에 표시하였다. 상기 결과 에서 TGFBIp로 인한 혈관투과도의 현저한 증가는 야생형， 넉아웃 마우스 모두에서 나타났음을 확인할 수 있고, 이는 TGFBIp가 생체 내에서 혈관을 약하게 만드는 효 과와 관련이 있다는 것을 알게 해준다.
혈관장벽의 견고함 (integrity) 조절에 대한 TGFBIp의 중요성을 더 뒷받침하 기 위해， 넉아웃 마우스 (TGFBIp-/-)에 CLP 시술을 한 후， 넉아웃 마우스의 혈관투 과성을 야생형과 비교해봤을 때， 더 낮았고， 이로부터 TGFBIp가 최소한 어느 정도 는 패혈증에서 혈관의 견고함을 조절해준다는 것을 알 수 있다 (도 12 참조).
【산업상 이용가능성】
TGFBIp는 패혈증 발생 시， 현저히 증가하는데 TGFBIp의 발현을 감소시키면， 패혈증으로 인한 치사율， 혈관 내피 세포의 투과성을 줄일 수 있다. 따라서 TGFBIp를 이용하여 패혈증 치료제를 선별할 수 있고， TGFBIp 억제제로 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조할 수 있어， 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

【청구의 범위]
【청구항 11
(a) 시험물질을 TGFBI (Transforming growth factor beta induced) 단백질을 발현하는 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질이 접촉된 세포 또는 조직에서 TGFBI의 발현 수준올 측정 하는 단계 ; 및
(c) 상기 시험물질이 접촉되지 않은 세포 또는 조직에서의 TGFBI의 발현수준 을 측정하여, 상기 (b) 단계에서 측정된 발현 수준이 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는， 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 스크리닝 방법.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 TGFBI 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되 는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
【청구항 3】 ᅳ
제 1항에 있어서， 상기 단계 (b)는 RT-PCR, 경쟁적 RT—PCR( competitive RT- PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR) , RNase 보호 분석법 (RPA:RNase protection assay) , 노던 블랏팅 (northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩, 웨스턴 블럿팅 (Western Blotting) , 효소면역분석법 (enzyme— 1 inked immunosorbent assay) , 방사능 면역분석법 (RIA), 방사면역확산법， 오우크테로니 면역 확산법， 로케트 면역 전기영 동， 면역조직화학， 면역침전법 (i隱 unoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법 (FACS) 및 단백질 칩 방법으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
【청구항 4】
TGFBI 단백질의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치 료용 약학적 조성물.
【청구항 5】
TGFBI 단백질의 발현 억제제의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료 방법.
【청구항 6】
패혈증 예방 또는 치료에 사용되는 TGFBI 발현 억제제.
【청구항 7】
제 4항에 있어서, 상기 발현 억제제는 siRNA, shR A, miRNA, 리보자임 (ribozyme), DNAzyme, PNA( peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이 드， 펩타이드， 항체， 앱타머, 천연추출물 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 8】
제 7항에 있어서， 상기 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 폴리 펩타이드를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성
【청구항 9】
TGFBI 검출용 프라이머 또는 TGFBI의 항체를 포함하는 패혈증 진단용 조성 물
【청구항 10】
TGFBI 검출용 프라이머 또는 TGFBI의 항체를 이용하여 패혈증이 의심되는 개 체의 생물학적 시료로부터 TGFB1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 패혈증 진단 방법
【청구항 11】
패혈증 진단에 사용되는 TGFBI 검출용 프라이머 또는 TGFBI의 항체.
【청구항 12]
제 9항에 있어서， 상기 프라이머는 서열번호 3 및 5로 표시되는 프라이머 쌍 또는 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 패혈증 진단 용 조성물.
【청구항 13] 제 12항에 있어서， 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체를 포함하는 것 올 특징으로 하는 패혈증 진단용 조성물.
【청구항 14】 .
제 13항에 있어서， 상기 단클론 항체는 TGFBI 단백질의 에피토프 (epitope)인 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 패혈증 진단용 조성물.
【청구항 15】
TGFBI 검출용 프라이머 '또는 TGFBI의 항체를 포함하는 패혈증 진단용 키트.
【청구항 16】
TGFBI 유전자의 mRNA, TGFBI 단백질 및 이들의 단편으로 이루어진 군에서 선 택된 어느 하나를 프로브로 하는 패혈증 진단용 마이크로어레이 .
【청구항 17]
(a)패혈증이 의심되는 개체의 생물학적 시료로부터 TGFBI의 발현수준을 측정 하는 단계； 및
(b) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 TGFBI 발현수준과 비교하는 단계 를 포함하는 패혈증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. *
【청구항 18】 - 제 17항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
PCT/KR2014/003069 2013-05-15 2014-04-09 Tgfbi를 이용한 패혈증 진단용 조성물 및 이를 이용한 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 이의 스크리닝 방법 WO2014185631A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130054969A KR101515700B1 (ko) 2013-05-15 2013-05-15 Tgfbi를 이용한 패혈증 진단용 조성물 및 이를 이용한 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 이의 스크리닝 방법
KR10-2013-0054969 2013-05-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014185631A1 true WO2014185631A1 (ko) 2014-11-20

Family

ID=51898575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2014/003069 WO2014185631A1 (ko) 2013-05-15 2014-04-09 Tgfbi를 이용한 패혈증 진단용 조성물 및 이를 이용한 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 이의 스크리닝 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101515700B1 (ko)
WO (1) WO2014185631A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101869509B1 (ko) * 2017-02-20 2018-07-20 경북대학교 산학협력단 테스티칸-1을 이용한 패혈증 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법
KR102368983B1 (ko) 2019-02-28 2022-03-03 단디바이오사이언스 주식회사 항균활성을 갖는 폴리펩타이드, 이를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물, 및 항균용 조성물
CN111269942A (zh) * 2020-02-28 2020-06-12 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Tgfbi作为调控间充质干细胞成骨分化的标志物的应用
KR102281512B1 (ko) * 2020-03-26 2021-07-23 경북대학교 산학협력단 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물
KR102649080B1 (ko) * 2020-07-21 2024-03-20 동국대학교 산학협력단 Emp2의 바이러스성 폐렴 또는 패혈증의 진단을 위한 용도
KR102538055B1 (ko) 2021-04-23 2023-05-30 인제대학교 산학협력단 사이토카인 폭풍 조절제 스크리닝 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080286763A1 (en) * 2004-03-01 2008-11-20 Stefan Russwurm Method For The Identification Of Sepsis
US20110105350A1 (en) * 2005-04-15 2011-05-05 Becton, Dickinson And Company Diagnosis of sepsis
US20110217301A1 (en) * 2009-12-22 2011-09-08 The Children's Research Instute Methods for treating or screening for compounds for the treatment of sepsis
KR20110127637A (ko) * 2008-12-22 2011-11-25 칠드런스리서치인스티튜트 패혈증 검출 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080286763A1 (en) * 2004-03-01 2008-11-20 Stefan Russwurm Method For The Identification Of Sepsis
US20110105350A1 (en) * 2005-04-15 2011-05-05 Becton, Dickinson And Company Diagnosis of sepsis
KR20110127637A (ko) * 2008-12-22 2011-11-25 칠드런스리서치인스티튜트 패혈증 검출 방법
US20110217301A1 (en) * 2009-12-22 2011-09-08 The Children's Research Instute Methods for treating or screening for compounds for the treatment of sepsis

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE NCBI 2 January 2007 (2007-01-02), accession no. C129900.1 *
DATABASE NCBL 14 December 2004 (2004-12-14), accession no. C132886.18 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140134923A (ko) 2014-11-25
KR101515700B1 (ko) 2015-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2081586T3 (en) RSPONDINES AS MODULATORS OF ANGIOGENESE AND VASCULOGENESES
JP5901046B2 (ja) ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント
US20060088532A1 (en) Lymphatic and blood endothelial cell genes
WO2014185631A1 (ko) Tgfbi를 이용한 패혈증 진단용 조성물 및 이를 이용한 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 이의 스크리닝 방법
WO2014017491A1 (ja) Ｃｅｐ５５遺伝子とｒｅｔ遺伝子との融合遺伝子
TW200920406A (en) EBI3, DLX5, NPTX1 and CDKN3 for target genes of lung cancer therapy and diagnosis
WO2021128516A1 (zh) CircRNA PVT1及肽段在肿瘤生长预测、转移预测、预后评估和治疗中的应用
KR20070073802A (ko) Ｗｎｔ 단백질 및 암의 검출 및 치료
KR101820572B1 (ko) 만성골수성백혈병에 관한 정보 제공 방법
WO2007026895A1 (ja) 尿路上皮ガンの検出用キットおよび方法
KR102503593B1 (ko) 항암제 내성 진단 또는 치료용 조성물
US20210087247A1 (en) Mps peptides and use thereof
JP5773315B2 (ja) 膵癌のバイオマーカーとしてのｃｘｃｌ４ｌ１
WO2014018683A2 (en) A novel method to detect resistance to chemotherapy in patients with lung cancer
CN106153944B (zh) 肺癌和结直肠癌中的bard1同工型、其检测方法及其应用
WO2009141440A1 (en) Netrin-1 overexpression as a biological marker and a survival factor for aggressive neuroblastoma
WO2011129427A1 (ja) 癌の診断剤および治療剤
KR102055350B1 (ko) 대장암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도
JP6341859B2 (ja) がんマーカーおよびその用途
MXPA06014972A (es) Metodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades poliquisticas.
KR100861464B1 (ko) 발암/전이유전자 ｔｉｐ41과 이에 의해 코드되는 단백질 및이를 이용한 발암 및 전이 진단 키트
WO2009081854A1 (ja) アレルギー性疾患のバイオマーカーおよびその利用
JP6721571B2 (ja) １５種類の男性生殖関連タンパク質またはその組み合わせの使用
EP0960337B1 (en) Cathepsin K and breast cancer
US20040138161A1 (en) Methods of modulating proliferative conditions

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14797698

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14797698

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1