JP5901046B2 - ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント - Google Patents
ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント Download PDFInfo
- Publication number
- JP5901046B2 JP5901046B2 JP2011032501A JP2011032501A JP5901046B2 JP 5901046 B2 JP5901046 B2 JP 5901046B2 JP 2011032501 A JP2011032501 A JP 2011032501A JP 2011032501 A JP2011032501 A JP 2011032501A JP 5901046 B2 JP5901046 B2 JP 5901046B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- oatp1b3
- base sequence
- nucleic acid
- cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims description 86
- 102000015661 Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 1B3 Human genes 0.000 title description 140
- 108091006730 SLCO1B3 Proteins 0.000 title description 139
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 105
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 105
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 105
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 103
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 93
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 73
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 54
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 42
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 35
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 35
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 31
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 30
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 26
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 20
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 18
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 11
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 7
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 108091006172 SLC21 Proteins 0.000 claims description 4
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 99
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 95
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 87
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 77
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 74
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 60
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 51
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 50
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 50
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 50
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 48
- 239000000047 product Substances 0.000 description 34
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 34
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 12
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 9
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 9
- 101150019786 SLCO1B3 gene Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 8
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 101000836284 Homo sapiens Solute carrier organic anion transporter family member 1B3 Proteins 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 7
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 4
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 3
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 3
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 3
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 101100281953 Homo sapiens GAPDH gene Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 102100027239 Solute carrier organic anion transporter family member 1B3 Human genes 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 102000050259 human SLCO1B3 Human genes 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000010224 Castration-Resistant Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108700015679 Nested Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010063829 Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 1B3 Proteins 0.000 description 1
- 208000000277 Splenic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 201000009036 biliary tract cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020790 biliary tract neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000003163 cell fusion method Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000010265 fast atom bombardment Methods 0.000 description 1
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002431 foraging effect Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010842 high-capacity cDNA reverse transcription kit Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000752 ionisation method Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N lucigenin Chemical compound [O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=C(C=CC=C2)C2=[N+](C)C2=CC=CC=C12 KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 201000002471 spleen cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
- C07K2319/41—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a Myc-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
- C07K2319/42—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a HA(hemagglutinin)-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
- C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Description
本発明は、新規ながんマーカーに関する。より詳細には、本発明は、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント、およびその用途に関する。
最近の医療技術の進歩により、がんの治療技術も大幅に改善されており、ある種のがんについては、死亡率の減少傾向を示すものもある。しかしながら、がんの発症を早期に発見することは、その治療効果に影響を与えるものであるため、がんの早期発見を可能にする方法の確立が望まれている。
がんの診断には、がん組織を超音波またはＸ線検査などにより視覚的に捉える方法のほか、患者から採取した組織を免疫組織学的手法により細胞形態等の異常を発見する方法、並びに、特定のがんの発症に伴い発現に変化が生じるタンパク質または遺伝子などのいわゆるがんマーカーの動態を検出する生化学的、免疫化学的方法などが知られている。
これらの方法において、組織を免疫組織学的手法によりその形態を観察する方法は、組織の標本化が必要であるため、がんの発症の有無の確認に時間を要し、また、観察された形態からがんの発症の有無を見極めるためにはかなりの熟練が必要となる。
したがって、比較的簡便でかつ客観的にがん発症の有無を判断することができるがんマーカーを用いる方法の適用が、しばしばおこなわれるようになってきた。しかしながら、ヒトのがんの診断において使用されるがんマーカーの多くは、正常組織細胞にもある程度発現していることから、当該がんマーカーの発現の変動をがん化の指標として用いなくてはならないことが多く、誤診断の可能性が常に存在している。
したがって、がん発症の有無を客観的により正確に検出するために、非がん細胞にはその存在が認められず、がん化した細胞だけが産生する物質をがんマーカーとして用いることが望ましい。例えば膵臓がんを例に挙げると、現時点において膵臓がんには有効なスクリーニング検査法が存在しないため、がん症状が表れた時には手遅れになっていることが多く、膵臓がんの早期発見のためには膵臓がん特異的ながんマーカーの使用が必要とされている。
ところで、有機アニオン輸送ポリペプチド１Ｂ３（ＯＡＴＰ１Ｂ３；Organic Anion Transporting Polypeptide 1B3、遺伝子名SLCO1B3）は、細胞膜上に発現するトランスポーターであり、幅広い基質認識性を示し、抗がん剤を含む多くの化合物の細胞内取り込みを担っている。ＯＡＴＰ１Ｂ３は通常肝細胞に特異的に発現するが、他の臓器でもがん化に伴い発現が認められるようになる。これまで、乳がんおよび前立腺がんにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３の発現や機能が患者の生存率に影響を及ぼすことが報告されている（非特許文献１および２を参照）。また、大腸がん細胞を用いた解析では、ＯＡＴＰ１Ｂ３の発現が細胞にアポトーシス抵抗性を付与するとの報告がある（非特許文献３を参照）。
以上のことから、ＯＡＴＰ１Ｂ３はがん細胞においてなんらかの役割を担っていると考えられる。このため、ＯＡＴＰ１Ｂ３の検出はがん治療における予後の診断や抗がん剤有効性診断に有用ながんマーカーとして期待されている。例えば、特許文献１には、ＬＳＴ−２（ＯＡＴＰ１Ｂ３の別名である）のＣ末端側細胞内ドメインを認識する抗ＬＳＴ−２モノクローナル抗体を用いて女性大腸がん患者のがん組織におけるＬＳＴ−２の発現を測定し、この測定値に基づいて当該患者の予後を予測する技術が開示されている。
しかしながら、がん細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ３の発現・機能については依然として不明な点が多く、がんマーカーとしての利用形態が十分に確立しているとはいえないのが現状である。
Muto et al. Human liver-specific organic anion transporter-2 is a potent prognostic factor for human breast carcinoma. (2007) Cancer Sci. 98:1570-6
Hamada et al. Effect of SLCO1B3 Haplotype on Testosterone Transport and Clinical Outcome in Caucasian Patients with Androgen-Independent Prostatic Cancer. (2008) Clin. Cancer Res. 14:3312-8
Lee et al. Overexpression of OATP1B3 confers apoptotic resistance in colon cancer. (2008) Cancer Res. 68:10315-23
上述したような従来技術に鑑み、本発明は、新規ながんマーカーおよびその用途を提供することを目的とする。より詳細には、本発明は、新規ながんマーカー、当該がんマーカーの測定方法および測定用キット、これを用いたがんの検出方法、がんの検出用キット、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法、並びに、がんワクチン等の医薬を提供することを目的とする。
本発明者らは、上述した従来技術に鑑み、ＯＡＴＰ１Ｂ３の発現・機能のさらなる探索を目的として、鋭意研究をおこなった。その過程で、驚くべきことに：
（１）従来報告されているＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡ（本明細書中、「ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ」とも称する；「ｗｔ」とは野生型（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）の意である）の選択的スプライシングバリアントが存在すること、
（２）この新たな選択的スプライシングバリアントが、がん細胞・組織において特異的に強く発現すること；および、
（３）この新たな選択的スプライシングバリアントから、いくつかのペプチドまたはタンパク質が発現しうること、
の３つの知見を得て（本明細書中、この選択的スプライシングバリアントを「ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ」とも称する；「ｃｔ」とはがん型（Ｃａｎｃｅｒ Ｔｙｐｅ）の意である）、これらの知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
（１）従来報告されているＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡ（本明細書中、「ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ」とも称する；「ｗｔ」とは野生型（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）の意である）の選択的スプライシングバリアントが存在すること、
（２）この新たな選択的スプライシングバリアントが、がん細胞・組織において特異的に強く発現すること；および、
（３）この新たな選択的スプライシングバリアントから、いくつかのペプチドまたはタンパク質が発現しうること、
の３つの知見を得て（本明細書中、この選択的スプライシングバリアントを「ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ」とも称する；「ｃｔ」とはがん型（Ｃａｎｃｅｒ Ｔｙｐｅ）の意である）、これらの知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明の第１の形態によれば、被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定方法が提供される。当該測定方法は、生体から分離した被検試料中の、配列表の配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡを、配列番号：２で表される塩基配列を含むｍＲＮＡと識別して測定することを含む。
この際、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔは、配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶの存在を指標として測定されることが好ましい（「エキソンＳＶ」についての詳細は後述する）。また、この測定は、例えば、エキソンＳＶを含む領域に設定したプライマーを一方のプライマーとして用いる核酸増幅法により、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔまたはそのｃＤＮＡの部分領域を特異的に増幅し、増幅産物を測定することを含む。なお、前記プライマーの塩基数は、好ましくは１５〜３５程度である。また、前記核酸増幅法は、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ法である。
また、本発明の第２の形態によれば、以下の条件を満足する核酸を提供する：
（１）配列番号：１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする；
（２）配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸が共存する場合に、ストリンジェントな条件下で、当該核酸とはハイブリダイズしないか、または、当該核酸とハイブリダイズした場合であってもその３’末端がミスマッチとなる。
（１）配列番号：１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする；
（２）配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸が共存する場合に、ストリンジェントな条件下で、当該核酸とはハイブリダイズしないか、または、当該核酸とハイブリダイズした場合であってもその３’末端がミスマッチとなる。
この際、当該核酸は、エキソンＳＶを含む領域とハイブリダイズすることが好ましい。また、当該核酸の塩基数は、好ましくは１０程度以上であり、より好ましくは１５〜３５程度である。さらに、当該核酸は、配列番号：１で表される塩基配列または当該塩基配列の部分領域と同じ塩基配列またはこれらの塩基配列のうち１０％以下の塩基が置換されてなる塩基配列からなることが好ましい。当該核酸は、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定に好適に用いられる。この際、当該核酸は、好ましくは核酸増幅用のプライマー、またはプローブである。
さらに、本発明の第３の形態によれば、本発明の第２の形態により提供される核酸を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定用キットが提供される。
また、本発明の第４の形態によれば、がんの検出方法も提供される。当該検出方法は、本発明の第１の形態により提供される測定方法により、または、本発明の第３の形態により提供される測定用キットを用いて、生体から分離した被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定することを含む。この際、配列番号：１で表される塩基配列を含むＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定することが好ましい。また、当該検出方法において、がんは、大腸がんまたは膵臓がんであることが好ましい。
さらに、本発明の第５の形態によれば、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法もまた、提供される。当該スクリーニング方法は、本発明の第１の形態により提供される測定方法により、または、本発明の第３の形態により提供される測定用キットを用いて、がん細胞を被検物質の存在下で培養して得られる培養細胞中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定する工程と、得られた測定結果を、前記被検物質の非存在下における場合と比較および／または評価する工程とを含む。
そして、本発明の第６の形態によれば、配列番号：１で表される塩基配列を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアント自体もまた、提供される。本選択的スプライシングバリアントは、例えば、該バリアントを培養細胞等に導入し強制発現させることにより、がん化培養細胞等を作成し、本発明の第５の形態のスクリーニング方法にも利用できる。
また、本発明の第７の形態によれば、
（１）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、あるいは、
（２）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、１０％以下のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチドが提供される。当該ポリペプチドは、好ましくは、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
（１）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、あるいは、
（２）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、１０％以下のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチドが提供される。当該ポリペプチドは、好ましくは、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
さらに、本発明の第８の形態によれば、第７の形態のポリペプチドをコードする核酸や、当該核酸を含む発現ベクター、当該発現ベクターで形質転換された細胞もまた、提供される。
また、本発明の第９の形態によれば、第７の形態のポリペプチドに結合する抗体や、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基を有する核酸もまた、提供される。
そして、本発明の第１０の形態によれば、生体から分離した被検試料中の、上記第７の形態のポリペプチドの量を測定することを含む、がんの検出方法が提供される。この際、上記第９の形態の抗体を測定に用いることが好ましい。また、当該抗体を含む、がんの検出用キットも提供されうる。
本発明の第１１の形態では、医薬が提供される。当該医薬は、第７の形態のポリペプチドまたはその断片や、第８の形態の核酸またはその断片を含み、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためのものである。当該医薬は、好ましくはがんワクチンである。
本発明によれば、新規ながんマーカーとしてヒトＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアントが提供され、その測定方法、当該測定に利用可能な核酸、および当該測定方法を実施するための手段（測定用キット）が提供される。また、本発明によれば、新規ながんの検出方法も提供され、さらには、がんの予防および／または治療剤の新規なスクリーニング方法も提供される。そして、がんの検出に用いられうるポリペプチドやこれに結合する抗体、当該ポリペプチドの量を指標としたがんの検出方法、当該抗体を含むがんの検出用キット、がんワクチン等としての医薬などもまた、提供される。
ヒトＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子は、染色体１２ｐ１２上に位置する約１０６ｋｂｐの遺伝子であり、この遺伝子から、２７１２ｂｐ（１５エキソン）からなるＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡ（ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ；Ｒｅｆｓｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１９８４４）が転写される。既に報告されているこのＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２および図１に示す。このＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔは、７０２アミノ酸からなるタンパク質（ＯＡＴＰ１Ｂ３タンパク質；ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０６２８１８）をコードしている。このＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３および図２に示す。なお、配列番号：２で表される塩基配列において、５’末端から１番目の塩基（本明細書中、「１ｎｔ」のように称する。他の位置の塩基も同様に５’末端から何番目に位置するかの数字にｎｔを付けて称する）から６１ｎｔまでがエキソン１、６２ｎｔ〜２１０ｎｔがエキソン２、２１１ｎｔ〜１９９１ｎｔがエキソン３〜エキソン１４であり、１９９２ｎｔ〜２７１２ｎｔがエキソン１５である。なお、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのコード領域（ＣＤＳ；Coding Sequence）は、エキソン２〜エキソン１５に跨る１２７〜２２３５ｎｔ（終止コドンＴＡＡを含む）であり、図１において大文字で表記されている。一方、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの非コード領域は、図１において小文字で表記されている。
後述する実施例に記載するように、本発明者らは、ヒトＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の転写開始点を決定する目的で、ヒト大腸がん組織由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとしてＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥ法をおこなったところ、既に報告されている転写開始点（図１に示す「ＴＳＳ」）の情報から予想されるサイズよりも分子量の小さい増幅産物が検出されることを見出した。そして、ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の新規転写開始点付近の塩基配列をヒトゲノムＤＮＡのデータベースと照合したところ、新規転写開始点はＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子のイントロン２の領域内に存在し、さらにここに新たなエキソンが存在することが明らかとなった（この新たなエキソンを「エキソンＳＶ」と称する）。また、このエキソンＳＶはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔでいうエキソン３へとスプライシングされていた（後述する図４を参照）。このようにして発見されたＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント（ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ）のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１および図１に示す。
上述したように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのエキソンＳＶはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン３へとスプライシングされていた。すなわち、配列番号：１で表される塩基配列において、１ｎｔ〜１３９ｎｔがエキソンＳＶである。また、配列番号：１で表される塩基配列における１４０ｎｔ〜１９２０ｎｔは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン３〜エキソン１４と実質的に同一の塩基配列を有する。そして、配列番号：１で表される塩基配列における１９２１ｎｔ〜２１７０ｎｔは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン１５の対応部分と同一の塩基配列を有する。
本発明において見出された選択的スプライシングバリアント（例えば、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ）は、後述する実施例に記載のように、がん細胞においてその発現量が増大していることが確認された。したがって、生体から分離した被検試料中の当該選択的スプライシングバリアントを測定することにより、がんの検出が可能である。
以下、本発明の具体的な好ましい実施形態についてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の具体的な実施形態や実施例によって限定されるべきではない。
本発明の第１の形態により提供されるＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定方法では、生体から分離した被検試料中の、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡ（例えば、配列番号：１で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ）を、配列番号：２で表される塩基配列を含むｍＲＮＡ（例えば、配列番号：２で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ）と識別して測定することを含む。なお、配列番号：１の塩基配列は、ｍＲＮＡおよびこれをテンプレートとして得られるｃＤＮＡの塩基配列を兼用して示すものであり、ｍＲＮＡを示す場合には、当然ながら、チミン（ｔ）に代えてウラシル（ｕ）が含まれるため、ｔをｕに読み替える。また、「測定」には、定量、半定量および検出のいずれの概念も包含される。さらに、「ｍＲＮＡを測定する」ことには、ｍＲＮＡを直接的に測定する場合のほか、ｍＲＮＡを一旦ｃＤＮＡへと変換した後に当該ｃＤＮＡを測定する場合（後述するＲＴ−ＰＣＲ等）や、ｍＲＮＡの翻訳産物を測定する場合のように、ｍＲＮＡを間接的に測定する場合も包含される。また、以下の説明では、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、核酸等を、「配列番号：１のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、核酸等」と称することがある。
なお、配列表には、規則により、二本鎖核酸であってもそのうちの一本鎖（ポリペプチドをコードする核酸ではセンス鎖）のみを記載することになっている。このため、二本鎖核酸の場合には、配列表に現実に記載されている配列は一本鎖であっても、実際にはその相補鎖も配列表に記載されていると解することができる。したがって、本願明細書においても、ある配列番号で表される塩基配列を含むもしくはこれからなる核酸が二本鎖核酸である場合または二本鎖核酸であってもよい場合には、その配列番号で表される塩基配列は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、その相補鎖をも包含するものとする。例えば、「配列番号：１で表される塩基配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸」とは、配列番号：１に現実に記載されているセンス鎖にハイブリダイズする核酸のほか、当該センス鎖に相補的な塩基配列からなるアンチセンス鎖にハイブリダイズする核酸をも意味するのである。
配列番号：１のｍＲＮＡを配列番号：２のｍＲＮＡと識別して測定することは、当業者にとって容易であり、種々の方法により可能である。例えば、エキソンＳＶ内とエキソン３以降の領域にプライマーを設定して逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）をおこない、増幅産物の分子量に基づいて、そのｍＲＮＡがＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔか選択的スプライシングバリアント（例えば、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ）かを識別してｍＲＮＡを測定することができる。また、得られた増幅産物について塩基配列を決定してもよい（ダイレクトシークエンス）。
配列番号：１のｍＲＮＡには、上述したように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔには存在しないエキソンであるエキソンＳＶが存在する。このため、このエキソンＳＶの存在を指標として選択的スプライシングバリアントを測定することができる。すなわち、配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶの存在を指標として、配列番号：１で表される塩基配列を含む選択的スプライシングバリアントを測定することができる。
エキソンＳＶの存在を指標として選択的スプライシングバリアントを測定する好ましい方法としては、エキソンＳＶを含む領域にハイブリダイズするプライマーを用いた核酸増幅法を用いる方法や、エキソンＳＶを含む領域にハイブリダイズするプローブを用いる方法を挙げることができる。
核酸増幅法を用いる方法には、エキソンＳＶを含む領域に設定したプライマーを一方のプライマーとして用いる核酸増幅法により配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡの部分領域を特異的に増幅し、増幅産物を測定することを含む。ここで、「領域に設定した」とは、その領域とハイブリダイズするという意味であり、また、ＰＣＲのような核酸増幅法により増幅される核酸は二本鎖であるから、上述したように、配列表に現実に記載されているセンス鎖にハイブリダイズするプライマー（リバース側プライマー）を用いる場合と、当該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖にハイブリダイズするプライマー（フォワード側プライマー）を用いる場合の両者が包含される。したがって、例えば、「エキソンＳＶを含む領域に設定したプライマー」とは、配列番号：１に現実に記載されたセンス鎖のエキソンＳＶを含む領域（つまり、１ｎｔ〜１３９ｎｔ）にハイブリダイズするプライマー（リバース側プライマー）または当該プライマーに相補的な塩基配列を有するプライマー（フォワード側プライマー）を意味する。また、「特異的に増幅する」とは、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡの部分領域は増幅されるが、配列番号：２で表される塩基配列を含むｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡの部分領域は増幅されないことを意味する。なお、配列番号：１で表される塩基配列において、１ｎｔ〜１３９ｎｔがエキソンＳＶであり、エキソン３は１４０ｎｔから始まる。したがって、配列番号：１で表される塩基配列において、１３９ｎｔと１４０ｎｔとの融合点は、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔには存在しないエキソンＳＶとエキソン３との特異的融合点である。ただし、図１からも明らかなように、上記特異的融合点の上流側２塩基は、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔとＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔとで共通している。したがって、配列番号：１で表される塩基配列における１３９ｎｔと１４０ｎｔとの融合点よりも、これに最も近接した他の特異的融合点である１３７ｎｔと１３８ｎｔとの融合点が、エキソンＳＶとエキソン３との特異的融合点としてより適切である。このことから、本明細書において、「エキソンＳＶを含む領域」としては、１ｎｔ〜１３７ｎｔがより好ましい。
テンプレートとなるｍＲＮＡの部分領域と同じ塩基配列（ただしｕはｔになる）を有するＤＮＡを増幅する核酸増幅法の好ましい例として、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。ＲＴ−ＰＣＲでは、細胞からｍＲＮＡを常法により抽出し、逆転写酵素の作用によりｍＲＮＡをテンプレートとして第一鎖ｃＤＮＡを生成させ、さらにこの第一鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして相補鎖を生成させて、二本鎖ｃＤＮＡを得る。次いで、得られた二本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲをおこない、該ｃＤＮＡまたはその部分領域を増幅する。ＲＴ−ＰＣＲ自体は周知の技術であり、そのためのキットや装置も市販されているため、容易に実施することができる。選択的スプライシングバリアント由来のｃＤＮＡを特異的に増幅するために、上述した特異的融合点を含む領域に設定したプライマーを一方のプライマーとして用いる。他方のプライマーは、増幅すべきスプライシングバリアントの任意の領域に設定することができる。なお、プライマーのサイズは特に限定されないが、通常１５〜３５塩基程度であり、好ましくは１５〜２５塩基程度である。
例えば、配列番号：１のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより測定する場合、配列番号：１で表される塩基配列中のエクソンＳＶを含む領域に設定したプライマーを一方のプライマー（フォワード側プライマーでもリバース側プライマーでもよい）として用いる。ここで、選択的スプライシングバリアント由来のｃＤＮＡを特異的に増幅するためには、プライマーとして、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１のｃＤＮＡにはハイブリダイズするが、配列番号：２のｃＤＮＡにはハイブリダイズしないものを用いることが好ましい。ここで「ストリンジェントな条件」とは、プライマーがｃＤＮＡに対して特異的にハイブリダイゼーションする条件をいい、例えば成書に記載の条件（サムブルック（Sambrook）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー、特に１１．４５節“Conditions for Hybridization of Oligonucleotide probes”等）にしたがって決定でき、特に制限されない。ストリンジェントな条件は、塩濃度、温度、およびその他の条件によって決まり、例えば、塩濃度が低いほど、温度が高いほど、ストリンジェンシーは高くなり、プライマーとｃＤＮＡとがハイブリダイゼーションしにくくなる。塩濃度は、一般に、ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ＋クエン酸三ナトリウム）の濃度を調節することによって調節され、ストリンジェントな塩濃度は、例えば、ＮａＣｌ約２５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約２５ｍＭ以下である。ストリンジェントな温度は、一般に、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より１５〜２５℃低い温度であり、例えば、約３０℃以上である。溶液に有機溶媒（例えばホルムアミド）を加えることにより、温度を下げることができる。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。好ましい例として、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１％ ＳＤＳ、５０％ ホルムアミド、２００μg／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションをおこなう。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度および温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。好ましい例として、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ クエン酸三ナトリウムおよび０．１％ ＳＤＳの条件で、６８℃の温度にて洗浄をおこなう。
配列番号：１のｃＤＮＡにはハイブリダイズするが、配列番号：２のｃＤＮＡにはハイブリダイズしないことを確保するために、ストリンジェントな条件下で、プライマーの２０％以上がエキソンＳＶを含む領域とハイブリダイズするものであることが好ましい。あるいは、ストリンジェントな条件下でも配列番号：２のｃＤＮＡとハイブリダイズした場合には、プライマーの３’末端がミスマッチとなるプライマーを用いることが好ましい。たとえストリンジェントな条件下で配列番号：２のｃＤＮＡとハイブリダイズしても、プライマーの３’末端がミスマッチであれば増幅は実質的に起きない。さらには、その少なくとも２０％以上がエキソンＳＶ内の領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであって、かつ、その３’末端が配列番号：２のｃＤＮＡとはミスマッチになるプライマーを用いることが特に好ましい。以上のようなプライマーを一方のプライマーとして用いることにより、配列番号：２のｃＤＮＡの共存下であっても、配列番号：１のｃＤＮＡのみを特異的に増幅することができる。なお、プライマーとしては、プライマーがハイブリダイズする配列番号：１の塩基配列中の領域と完全に相補的なものが好ましいが、通常、１０％以下程度のミスマッチがあってもプライマーとして利用できる場合が多い（ただし、上述したようにプライマーの３’末端がミスマッチとなるものは除く）。
ＰＣＲ自体は常法に従っておこなうことができる。そして、ＰＣＲによる増幅後に、増幅産物を測定する。かような増幅産物の測定も、常法によりおこなうことができる。上述したように、本発明における「測定」には、検出および定量の両者が包含される。さらに、増幅産物の電気泳動バンドの蛍光強度測定や、太さの目視判定のような、簡易定量または半定量も「測定」の概念に包含される。増幅産物の測定は、例えば増幅産物を電気泳動にかけ、増幅バンドを検出することによりおこなうことができる。また、蛍光標識したヌクレオチド三リン酸の存在下にＰＣＲをおこなうことによって増幅産物を蛍光標識し、増幅バンドの蛍光強度を測定することによっても、増幅産物の測定をおこなうことができる。さらに、電気泳動パターンをナイロンやニトロセルロースからなるメンブレンに転写し、増幅産物にハイブリダイズする標識プローブをハイブリダイズさせて、標識を検出または定量する（ＰＣＲ−サザン（Southern）法）によってもおこなうことができる。さらには、増幅産物にハイブリダイズするプローブを固相化し、上記増幅工程を標識ヌクレオチド三リン酸の存在下におこない、固相化プローブに増幅産物を結合させ、固相に結合された増幅産物を測定することによってもおこなうことができる。これらはいずれも常法であり、周知の知見が適宜参照されうる。
あるいは、上述したＲＴ−ＰＣＲのＰＣＲを、リアルタイム検出ＰＣＲによりおこなうと、より正確に増幅産物を定量することができるため、好ましい。リアルタイム検出ＰＣＲでは、通常のＰＣＲを、増幅産物にハイブリダイズする２種類の蛍光色素を結合したプローブの存在下でおこなう。２種類の蛍光色素の一方は、他方の蛍光色素からの蛍光発光を打ち消すクエンチャー色素であり、２種類の蛍光色素が同一のプローブ分子に結合されている状態では蛍光は測定されない。これに対し、ＰＣＲにより増幅が起きると、まず、プローブが増幅産物にハイブリダイズする。そして、増幅に用いられるＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプローブが消化されて２種類の蛍光色素がバラバラになると、クエンチャー色素による消光が起きないので蛍光が測定されるようになるのである。測定される蛍光強度が急激に大きくなるサイクル数が、試料中の核酸テンプレートの濃度に依存して変化することから、連続的に反応溶液の蛍光を測定することにより試料中の鋳型核酸の濃度を定量することができる。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ自体は周知の技術であり、そのためのキットも市販されているため、この市販のキットを用いて容易に実施することができる。
なお、ＲＴ−ＰＣＲをおこなう場合、最初のｍＲＮＡの抽出時に混入するゲノムＤＮＡに含まれる偽遺伝子を鋳型とする増幅が起きる場合がある。従って、用いるプライマーセットは、このような偽遺伝子に起因する増幅が起きないプライマーを選択したセットであることが好ましい。偽遺伝子に起因する増幅が起きるか否かは、例えば、そのプライマーセットを用い、ゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲをおこなった場合に、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲをおこなった場合と同じサイズの増幅産物のみが生成するか否かにより判定することができる。後述する実施例で具体的に用いられているプライマーセット（表３）は、このような偽遺伝子による増幅が起きないものである。また、場合によっては、ＲＴ−ＰＣＲをおこなう前に、用いる予定のＲＮＡをテンプレートとして、ヒトグリセルアルデヒド−３−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）などのハウスキーピング遺伝子を増幅するプライマーセット（例えば、表１に記載のもの）を用いたＰＣＲをおこない、増幅産物が得られないことを確認することによっても、ゲノムＤＮＡの混入がないことが保証されうる。
以上、本発明の測定方法をＲＴ−ＰＣＲ法によりおこなう場合を例に挙げて詳細に説明したが、本発明の測定方法は、上述したプライマーを用いて選択的スプライシングバリアントのｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡまたはその部分領域の増幅をおこなう方法であれば、ＲＴ−ＰＣＲ法によりおこなわれるものに限定されず、他のいずれの核酸増幅法を利用するものであってもよい。例えば、ＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）によりｍＲＮＡを増幅することもできる。ＮＡＳＢＡ法では、リバース側プライマーの５’末端にＴ７プロモーター配列を付加したものをリバース側プライマーとして、ＡＭＴ−ＲＴ等の逆転写酵素の存在下で、ｍＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を形成する。得られたＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖ハイブリッドのＲＮＡ鎖をＲＮａｓｅＨにより分解して一本鎖ｃＤＮＡ（アンチセンス鎖）とする。次に、この一本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとし、フォワード側プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素としてＡＭＴ−ＲＴを用いる場合には、ＡＭＴ−ＲＴがＤＮＡポリメラーゼ活性を有するため、これで兼用する）の存在下で相補鎖を形成して、二本鎖ｃＤＮＡとする。この二本鎖ｃＤＮＡは、Ｔ７プロモーター配列を含んでいることから、これにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを作用させると、転写によりＲＮＡ（アンチセンス鎖）が次々に形成される。さらに、形成された二本鎖ｃＤＮＡについて、変性工程、上記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーとのアニーリング工程、相補鎖の伸長工程を繰り返すことにより、二本鎖ｃＤＮＡが増幅され、これを鋳型とした転写によってさらにＲＮＡ（アンチセンス鎖）が形成される。このようなＮＡＳＢＡ法においても、一方のプライマーとして、上記したプライマーを用いることにより、選択的スプライシングバリアントのみを増幅することができる（ただし、生成物は上記の通りアンチセンス鎖である）。なお、ＮＡＳＢＡ法自体は周知の技術であり、このためのキットも市販されているため、この市販のキットを用いて容易に実施することができる。
エキソンＳＶの存在を指標として選択的スプライシングバリアントを測定する他の好ましい方法としては、このエキソンＳＶを含む領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを用いる方法がある（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法）。プローブとしては、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１で表される塩基配列を有する核酸中のエキソンＳＶの領域にハイブリダイズするが、配列番号：２で表される塩基配列を有する核酸にはハイブリダイズしないものが用いられる。このような特異性を確保するために、プローブの全長の２０〜８０％、より好ましくは４０〜６０％がエキソンＳＶ領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、残りが隣接するエキソン３領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。プローブのサイズは、特に限定されないが、オリゴヌクレオチドの場合、通常、１０塩基〜全長であり、１０塩基〜１００塩基程度が好ましく、さらに好ましくは１５塩基〜３５塩基程度であり、ｃＲＮＡやｃＤＮＡの場合、通常、３００塩基〜８００塩基程度である。また、プライマーの場合と同様、プローブがハイブリダイズする領域と完全に同一の塩基配列を有することが最も好ましいが、プローブ全長の１０％以下の塩基が置換していてもよい。
プローブは、上記核酸に蛍光標識、ビオチン標識、放射標識、酵素標識等の周知の標識を結合して標識プローブとすることもできる。また、プローブは、例えば固相化プローブとして用いる場合に、固相に結合させる領域や、分枝プローブにおける標識を結合させるための分枝のような、被検核酸とは無関係な任意の核酸が結合されたものであってもよい。
プローブは、被検試料中に含まれる選択的スプライシングバリアントのｍＲＮＡの直接的な測定に用いることもできるし、ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ等の核酸増幅法で増幅した後、増幅された増幅核酸を測定する目的にも用いることができる。増幅産物をプローブで特異的に測定する場合、核酸増幅には、エキソンＳＶが増幅産物中に含まれるようにプライマーを設定する。この場合のプライマーは、選択的スプライシングバリアントに特異的なものである必要はなく、測定の特異性はプローブにより確保される。
本発明はまた、配列番号：１で表される塩基配列を含む核酸とはハイブリダイズするが、配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸が共存していても当該核酸とはハイブリダイズしない核酸、または、配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸とハイブリダイズした場合にその３’末端がミスマッチとなる核酸をも提供する。このような核酸は、上述したプライマーやプローブとして用いることができる。このような核酸としては、配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶを含む領域とハイブリダイズするが、配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸が共存していても当該核酸とはハイブリダイズしない核酸、または、配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸とハイブリダイズした場合にその３’末端がミスマッチとなる核酸が、選択的スプライシングバリアントの特異的な測定のためには好ましい。このような本発明の核酸は、塩基数が１０以上であることが好ましく、特に塩基数が１５〜３５であることが好ましい。また、本発明の核酸は、配列番号：１で表される塩基配列またはその部分領域と同じ塩基配列または当該塩基配列のうち１０％以下の塩基が置換した塩基配列を有することが好ましく、特に配列番号：１で表される塩基配列またはその部分領域と同じ塩基配列をからなることが好ましい。
このような本発明の核酸は、核酸増幅法のプライマーやプローブ等の、選択的スプライシングバリアントの測定用核酸として用いられうる。
さらに、本発明は、上述した本発明の測定用核酸を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定用キットをも提供する。キットに含まれる試薬類は、本発明の測定用核酸以外は周知のものであってよく、例えば、プライマーセットのほか、逆転写酵素、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ランダムプライマー、ＲＮａｓｅ阻害剤、緩衝液等を含めて測定用キットにすることができる。あるいは、キットは、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのみからなるプライマーセットとし、他の試薬類は、市販のＲＴ−ＰＣＲ用キット等を利用するようにしてもよい。
上述した選択的スプライシングバリアントは、がんマーカーとして利用することができる。すなわち、本発明により提供される選択的スプライシングバリアントは、がん細胞・組織において特異的に強く発現することが判明している。よって、本発明により提供される測定方法や測定用キットは、がんの検出に利用することができる。この際、検出対象とされるがんの種類は特に制限されず、例えば、大腸がん、膵臓がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、甲状腺がん、脳腫瘍、造血器腫瘍などの検出に利用されうる。特に、後述する実施例に記載のように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔは、ヒト大腸がん組織に加えて、ヒトの大腸がん由来の細胞（ＬＳ１８０、ＨＣＴ１１６）およびヒトの膵臓がん由来の細胞（ＰＫ４５ｐ）にも強く発現していることが確認されている。これに対し、ヒト正常大腸由来の組織にはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの発現が確認されなかったことから、本発明により提供される選択的スプライシングバリアントは、大腸がんおよび膵臓がんのマーカーとして特に有用である。
本発明の他の形態によれば、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法が提供される。このスクリーニング方法は、まず、がん細胞を被検物質の存在下で培養する。そして、得られる培養細胞において、上述した本発明の選択的スプライシングバリアントを測定する。次いで、得られた測定結果を、上記被検物質の非存在下における場合と比較および／または評価する。
具体的には、上述した各種がん由来のがん細胞株を、抗がん剤、抗がん候補物質、低分子化合物、天然有機高分子物質、天然の動植物の抽出物、ペプチドなどの被検物質の存在下で培養し、当該培養細胞における本発明の選択的スプライシングバリアントを測定（検出、半定量、または定量）し、選択的スプライシングバリアントの形態が、被検物質の非存在下における場合と比べて有意に減少しているときに、被検物質は上記細胞株が由来とするがんの予防および／または治療剤として有用である可能性があると判断する。
本発明のスクリーニング方法において、ヒト大腸がん由来の細胞株（例えば、ＬＳ１８０やＨＣＴ１１６）を用いることで、ヒト大腸がんの予防および／または治療剤のスクリーニングをおこなうことができる。同様に、ヒト膵臓がん由来の細胞株（例えば、ＰＫ４５ｐ）を用いることで、ヒト膵臓がんの予防および／または治療剤のスクリーニングをおこなうことができる。その他の周知のがん・腫瘍由来の細胞株についても、同様に用いることで各種がん・腫瘍の予防および／または治療剤のスクリーニングをおこなうことが可能である。
また、本発明のスクリーニング方法において、選択的スプライシングバリアントを測定する方法としては、上述した本発明の測定方法や測定用キットが同様に用いられうる。よって、ここでは詳細な説明を省略する。
本発明者らの検討によれば、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡから少なくとも４種のポリペプチドが発現しうることが判明した。具体的には、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、および配列番号：１１のそれぞれで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡから発現しうることが確認された。これらのポリペプチドは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡからは理論上発現できず、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡに特異的なものである。このため、これらのポリペプチドは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡと同様にがんマーカーとしての有用性を有するものである。
上記の観点から、本発明の他の形態によれば、
（１）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；および、
（２）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、あるいは、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、１０％以下のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド（以下、「機能的等価改変体」とも称する）；および、
が提供される。
（１）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；および、
（２）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、あるいは、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、１０％以下のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド（以下、「機能的等価改変体」とも称する）；および、
が提供される。
「（２）機能的等価改変体」としては、「配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド」、あるいは、「配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、０〜１０％、好ましくは０〜７％、さらに好ましくは０〜５％、特に好ましくは０〜２％のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド」が含まれる。
「がん細胞またはがん組織において発現が増強する」とは、非がん細胞または非がん組織と比較してがん細胞またはがん組織において発現が２倍以上増強することを意味する。
以上、本形態のポリペプチドについて説明したが、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および上記機能的等価改変体を総称して、以下、「本発明のポリペプチド」とも称する。また、「本発明のポリペプチド」のうち、配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ｆ１−１」、配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ｆ１−２」、配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ｆ２」、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ｆ３」とそれぞれ称する。
本発明のポリペプチドとしては、ｆ１−１またはｆ３が特に好ましい。
本発明のさらに他の形態によれば、本発明のポリペプチドをコードする核酸もまた、提供される。
ここで、本発明のポリペプチドであるｆ１−１をコードする塩基配列からなる核酸は、配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるｆ１−１、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列であれば特に制限はない。好ましくは、配列番号：５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸であり、さらに好ましくは、配列番号:４で表される塩基配列からなる核酸である。
同様に、本発明のポリペプチドであるｆ１−２をコードする塩基配列からなる核酸は、配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなるｆ１−２、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列であれば特に制限はない。好ましくは、配列番号：７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸であり、さらに好ましくは、配列番号:６で表される塩基配列からなる核酸である。
また、本発明のポリペプチドであるｆ２をコードする塩基配列からなる核酸は、配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるｆ２、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列であれば特に制限はない。好ましくは、配列番号：９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸であり、さらに好ましくは、配列番号:８で表される塩基配列からなる核酸である。
さらに、本発明のポリペプチドであるｆ３をコードする塩基配列からなる核酸は、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるｆ３、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列であれば特に制限はない。好ましくは、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸であり、さらに好ましくは、配列番号:１０で表される塩基配列からなる核酸である。
また、本発明のさらに他の形態によれば、上記核酸を含む発現ベクター、当該発現ベクターで形質転換された細胞もまた、提供される。
本発明の発現ベクターや細胞は、従来公知の知見を参照することにより作製することができる。例えば、単離された本発明の核酸を、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物または原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現に関連する配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において核酸を発現させることが可能である。
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明の核酸を挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
また、本発明の細胞も、本発明の発現ベクターでトランスフェクションされ、本発明の核酸を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明の核酸が、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であってもよいし、あるいは、本発明の核酸を含む発現ベクターの形で含有する細胞であってもよい。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であってもよいし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であってもよい。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。
上記で得られる所望の細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により本発明のポリペプチドが生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものが適宜選択されうる。
上記により、形質転換細胞に生産される本発明のポリペプチドは、その物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離・精製することができる。
本発明のポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることで、その発現の確認、精製等が可能になる。マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧ ｅｐｉｔｏｐｅ、Ｈｅｘａ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ、Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｔａｇ、ｍｙｃ ｅｐｉｔｏｐｅなどがある。また、マーカー配列とポリペプチドとの間にエンテロキナーゼ、ファクターＸａ、トロンビンなどのプロテアーゼが認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することも可能である。
本発明の核酸は、それ自体、またはその一部をがんの検出方法においてハイブリダイズプローブとして用いることができ、がんの検出に有用である。また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体の作製や、発現レベルを検出・定量する際のコントロールとして用いることができる。
本発明によれば、本発明のポリペプチドに結合する抗体（以下、「本発明の抗体」とも称する）もまた、提供されうる。本発明の抗体の製造方法は、特に限定されるものではない。本発明の抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）は、例えば、各種動物に配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、配列番号：５で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、あるいは、配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全部またはその断片を直接投与することにより、得ることができる。また、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を導入したプラスミドを用いてＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は前記ポリペプチドまたはその断片をフロイント完全アジュバントなどの適当なアジュバントに乳濁し、腹腔、皮下または静脈等に免疫して感作した動物、例えばウサギ、ラット、ヤギ、またはニワトリ等の血清または卵から製造される。このように製造されたポリクローナル抗体は常法のタンパク質単離精製法により、分離精製することができ、常法のタンパク質単離精製法としては例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、プロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法が挙げられる。
モノクローナル抗体は、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により当業者が容易に製造することが可能である。
本発明のさらに他の形態によれば、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基を有する核酸もまた、提供される。なお、「ストリンジェントな条件」については上述した通りである。このような核酸は、本発明の核酸を検出、単離するためのプローブとして、また、本発明の核酸を増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜４０ｂｐの鎖長を有する。プライマーとして好ましい塩基配列は、後述する実施例の「９．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合ｃｔＯＡＴＰ１Ｂ３ペプチド発現プラスミドの作製」においてｆ１−１、ｆ１−２、ｆ２およびｆ３のそれぞれを増幅するのに用いられているプライマーの塩基配列が挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、本発明の核酸の一部もしくは全部の配列（またはその相補配列）を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。
上記核酸を用いたプローブやプライマーは、がんの検出に利用することができる。
なお、本発明に基づいて、本発明の核酸の塩基配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することもできる。アレイ技法は公知で、遺伝子発現を解析するために用いられている（Ｃｈｅｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，．２７４，６１０−６１３）。
本発明のポリペプチドは、がんの検出方法にも適用されうる。すなわち、本発明の他の形態によれば、生体から分離した被検試料中の、本発明のポリペプチドの量を測定することを含む、がんの検出方法が提供される。この際、上述した本発明の抗体を測定に用いることが好ましい。また、当該抗体を含む、がんの検出用キットも提供されうる。以下、この形態について、より詳細に説明する。
被検試料中の、本発明のポリペプチドの検出は、例えば、被検試料を各種の分子量測定法、例えば、ゲル電気泳動や、各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化法など）、質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など）を組み合わせる方法等に供し、本発明のポリペプチドの分子量と一致するバンドもしくはスポット、またはピークを検出することによりおこなうことができるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドはアミノ酸配列が既知であることから、当該アミノ酸配列を認識する抗体を作製して、ウエスタンブロッティングや各種イムノアッセイにより本発明のポリペプチドを検出する方法が、より好ましく用いられうる。なお、当該抗体の作製方法については、上述した通りである。本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドを検出する方法は、最適化されたイムノアッセイ系を構築してこれをキット化すれば、質量分析装置のような特殊な装置を使用することなく、高感度かつ高精度に本発明のポリペプチドを検出することができる点で、特に有用である。
本発明の抗体を用いる本発明のがんの検出方法は、特に制限されないが、被検試料中の抗原量に対応した抗体、抗原または抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法等が好適に用いられる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。
抗原または抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、またはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被検試料を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、被検試料中の本発明のペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序におこなっても、また、同時におこなってもよいし時間をずらしておこなってもよい。
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることもできる。
競合法では、被検試料中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ／Ｆいずれかの標識量を測定し、被検試料中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検試料の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、または、被検試料中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検試料中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内または溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検試料中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の検出方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和49年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和53年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第2版）（医学書院、昭和57年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第3版）（医学書院、昭和62年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: HybridomaTechnology and Monoclonal Antibodies))（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和49年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和53年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第2版）（医学書院、昭和57年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第3版）（医学書院、昭和62年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: HybridomaTechnology and Monoclonal Antibodies))（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
あるいは、本発明の抗体を用いる別の本発明の検出方法として、当該抗体を上述したような質量分析計に適合しうるプローブの表面上に固定化し、当該プローブ上の当該抗体に被検試料を接触させ、当該抗体に捕捉された生体試料成分を質量分析にかけ、当該抗体が認識するマーカーペプチドの分子量に相当するピークを検出する方法が挙げられる。
上記のいずれかの方法により、被検試料において、本発明のポリペプチドが、コントロール試料におけるレベルと統計学的に有意な差をもって検出された場合には、被検試料中にがん細胞またはがん組織が含まれている可能性が高いと診断することができる。
本発明のさらに他の形態では、医薬が提供される。当該医薬は、上述した本発明のポリペプチドもしくはその断片、または本発明の核酸もしくはその断片を含み、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するためのものである。当該医薬は、好ましくはがんワクチンである。以下、この形態について、より詳細に説明する。
本発明の医薬が本発明のポリペプチドまたはその断片を含む場合、当該ポリペプチドまたはその断片は、ＨＬＡと結合して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導しうるものである必要がある。この観点から、当該ポリペプチドまたはその断片は、本発明のポリペプチドにおける連続する８〜１１個のアミノ酸残基からなることが好ましい。なお、特異的なＣＴＬを誘導するポリペプチドの断片は、本技術分野における公知の知見を参照して容易に作製することができる。
「ＨＬＡと結合して特異的なＣＴＬを誘導しうる」とは、本発明のポリペプチドもしくはその断片、または本発明の核酸もしくはその断片がＨＬＡと結合して複合体を形成し、かかる複合体をＣＴＬが認識できることをいう。換言すれば、本発明のポリペプチドもしくはその断片、または本発明の核酸もしくはその断片が、ＨＬＡとの結合活性を有し、かつ、ＨＬＡとの複合体の形で、特異的なＣＴＬを誘導する活性を有することを意味する。
一方、本発明の医薬が本発明の核酸またはその断片を含む場合、当該核酸がコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドは、それ自体がＣＴＬにより認識され、当該ＣＴＬを活性化するか、そのような活性を有するポリペプチド断片を与えることができ、腫瘍抗原として機能しうる。本形態において用いられる核酸またはその断片は、本発明のポリペプチドをコードする領域に対応する少なくとも２４個以上の塩基からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖であることが好ましい。このようなポリヌクレオチドは、例えば公知のタンパク質発現系を利用して発現ペプチドを確認することにより選択されうる。
本発明の医薬は、例えば、がんワクチンとして使用することができる。１種類のポリペプチドもしくはその断片または核酸もしくはその断片のみでもがんワクチンとして有効であるが、複数種類のものを組み合わせて使用するのが好ましい。これは、がん患者のＣＴＬが複数の異なる種類の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることから、複数種類の腫瘍抗原を組み合わせてがんワクチンとして使用する方がより効果的であると期待されるためである。また、本発明のポリペプチドや本発明の核酸は、これら以外のポリペプチドや核酸と併用されてもよい。
本発明により提供されるがんワクチンは、適当なアジュバントの存在または非存在下で、単独で、または製薬的に許容される担体と結合して使用することができる。担体は、人体に有害な作用を起こさなければ特に制限はなく、例えば、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が使用できる。剤形は、ペプチド製剤について周知の剤形が選択可能である。投与量は、ＣＴＬによる認識性、治療すべき疾患、患者の年齢、体重等により変化するが、ペプチドの場合、活性本体として、通常、0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg〜100mg、さらに好ましくは0.1〜10ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日、数週、または数ヶ月に１回投与すればよい。
本発明の医薬はまた、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする核酸またはその断片を適当なベクターに組み込み、in vivoまたはex vivoで導入するのに利用することができる。ベクターとしては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等が挙げられるが、レトロウイルス系が好ましい。投与量は、ＣＴＬによる認識性により変化するが、ＤＮＡ含量として０．１μｇ〜１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは１μｇ〜５０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日、数週、または数ヶ月に１回投与すればよい。
以下、実施例および参考例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されない。
１．プライマー
ゲノムＤＮＡコンタミネーションチェック、５’ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ媒介迅速増幅（RLM-RACE;RNA ligase-mediated rapid amplification of 5’cDNA）、逆転写ＰＣＲ（RT-PCR;Reverse Transcription-Polymeraze Chain Reaction）、ｃＤＮＡクローニング、定量的リアルタイムＰＣＲ（Quantitative real-time PCR）、およびＧＦＰ融合ペプチド発現プラスミドからのペプチド発現に用いたプライマーは、インビトロジェン（カールスバッド，カリフォルニア州，アメリカ）またはグライナー−バイオ−ワン（タウフキルヒェン，ドイツ）に依頼して合成したものであり、それぞれ下記の表１〜表６に示す塩基配列を有する。
ゲノムＤＮＡコンタミネーションチェック、５’ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ媒介迅速増幅（RLM-RACE;RNA ligase-mediated rapid amplification of 5’cDNA）、逆転写ＰＣＲ（RT-PCR;Reverse Transcription-Polymeraze Chain Reaction）、ｃＤＮＡクローニング、定量的リアルタイムＰＣＲ（Quantitative real-time PCR）、およびＧＦＰ融合ペプチド発現プラスミドからのペプチド発現に用いたプライマーは、インビトロジェン（カールスバッド，カリフォルニア州，アメリカ）またはグライナー−バイオ−ワン（タウフキルヒェン，ドイツ）に依頼して合成したものであり、それぞれ下記の表１〜表６に示す塩基配列を有する。
２．細胞培養法
ヒト結腸がん由来細胞株であるＬＳ１８０細胞は大日本住友製薬（大阪）より購入した。ヒト大腸がん由来細胞株であるＨＣＴ１１６細胞はボーゲルシュタイン博士（Ｄｒ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）（ジョンズホプキンス大学、ボルチモア、メリーランド州）よりご恵与いただいた。ヒト膵臓がん由来細胞株であるＰＫ４５ｐ細胞は東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センター（仙台）より入手した。ＬＳ１８０細胞およびＰＫ４５ｐ細胞は、それぞれ１０％非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ジェミニ バイオ−プロダクツ，カリフォルニア州）および５０単位／ｍＬペニシリン−５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（インビトロジェン）を加えた最小必須培地（MEM;Minimum Essential Medium）（インビトロジェン）またはＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute）１６４０培地（インビトロジェン）を培地とし、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒを気相とした３７℃のＣＯ２インキュベーター内にて培養した。
ヒト結腸がん由来細胞株であるＬＳ１８０細胞は大日本住友製薬（大阪）より購入した。ヒト大腸がん由来細胞株であるＨＣＴ１１６細胞はボーゲルシュタイン博士（Ｄｒ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）（ジョンズホプキンス大学、ボルチモア、メリーランド州）よりご恵与いただいた。ヒト膵臓がん由来細胞株であるＰＫ４５ｐ細胞は東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センター（仙台）より入手した。ＬＳ１８０細胞およびＰＫ４５ｐ細胞は、それぞれ１０％非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ジェミニ バイオ−プロダクツ，カリフォルニア州）および５０単位／ｍＬペニシリン−５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（インビトロジェン）を加えた最小必須培地（MEM;Minimum Essential Medium）（インビトロジェン）またはＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute）１６４０培地（インビトロジェン）を培地とし、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒを気相とした３７℃のＣＯ２インキュベーター内にて培養した。
３．実験検体
白人種肝検体は、ＨＡＢ（Human and Animal Bridging）協議会（東京）より入手した。上記検体は、米国立疾病研究互助組織（NDRI;National Disease Research Interchange）（フィラデルフィア，ペンシルバニア州）を介して米国から輸入された移植不適合のヒト肝組織である。なお、上記肝組織は肝炎等の感染症のないものを用いた。なお、本研究におけるこれら検体の研究利用は、千葉大学大学院薬学研究院倫理委員会において事前に承認されている。
白人種肝検体は、ＨＡＢ（Human and Animal Bridging）協議会（東京）より入手した。上記検体は、米国立疾病研究互助組織（NDRI;National Disease Research Interchange）（フィラデルフィア，ペンシルバニア州）を介して米国から輸入された移植不適合のヒト肝組織である。なお、上記肝組織は肝炎等の感染症のないものを用いた。なお、本研究におけるこれら検体の研究利用は、千葉大学大学院薬学研究院倫理委員会において事前に承認されている。
４．Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出
細胞からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出は、FastPureTMRNA Isolation Kit（タカラバイオ株式会社，滋賀）を用いてプロトコールに従いおこなった。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡにゲノムＤＮＡの混入がないことを、２０μＬ中にＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（プロメガ，マディソン，ワイオミング州）１０μＬ、並びに、プライマー（上記表１に記載のヒトグリセルアルデヒド−３−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ） ＦおよびＧＡＰＤＨ Ｒ）各０．５μＬ、ＲＮＡ １μＬを含む反応溶液を用いたＰＣＲにより確認した。ＰＣＲ反応は、９５℃にて３０秒間加熱した後、９５℃１０秒、５０℃１０秒および７２℃３０秒のサイクルを４０回おこなった。白人種肝からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出についても、FastPureTM RNA Isolation Kitを用いてプロトコールに従いおこなった。ヒト大腸がん/正常大腸ペアｔｏｔａｌ ＲＮＡは、アプライドバイオシステムズ（フォスターシティ，マサチューセッツ州）より購入した。
細胞からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出は、FastPureTMRNA Isolation Kit（タカラバイオ株式会社，滋賀）を用いてプロトコールに従いおこなった。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡにゲノムＤＮＡの混入がないことを、２０μＬ中にＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（プロメガ，マディソン，ワイオミング州）１０μＬ、並びに、プライマー（上記表１に記載のヒトグリセルアルデヒド−３−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ） ＦおよびＧＡＰＤＨ Ｒ）各０．５μＬ、ＲＮＡ １μＬを含む反応溶液を用いたＰＣＲにより確認した。ＰＣＲ反応は、９５℃にて３０秒間加熱した後、９５℃１０秒、５０℃１０秒および７２℃３０秒のサイクルを４０回おこなった。白人種肝からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出についても、FastPureTM RNA Isolation Kitを用いてプロトコールに従いおこなった。ヒト大腸がん/正常大腸ペアｔｏｔａｌ ＲＮＡは、アプライドバイオシステムズ（フォスターシティ，マサチューセッツ州）より購入した。
５．ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の転写開始点の決定
GeneRacerTMKit（インビトロジェン）を用いたＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥ法により、ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の転写開始点を決定した。テンプレートとしてヒト大腸がん由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡまたは白人種肝由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡを用い、手順はプロトコールに従いおこなった。ＰＣＲ反応は、２０μＬ中にGoTaq Green Master Mix １０μＬ、Reverse transcriptionテンプレート １μＬ、１０μＭ GeneRacerTM５’プライマーおよびReverse gene specificプライマー（上記表２に記載の「SLCO1B3 648R」）各０．５μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９４℃にて２分間加熱した後、９４℃３０秒、６８℃３０秒、７２℃１分のサイクルを５回、９４℃３０秒、６６℃３０秒、７２℃１分のサイクルを５回、９４℃３０秒、６５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを３０回繰り返したＴｏｕｃｈ−ｄｏｗｎＰＣＲをおこなった。このＴｏｕｃｈ−ｄｏｗｎＰＣＲの後、ＰＣＲ反応溶液を滅菌水で５倍希釈したものをテンプレートとして、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲをおこなった。Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲは、２０μＬ中にGoTaq Green Master Mix １０μＬ、テンプレート１μＬ、１０μＭ GeneRacerTM５’ NestedプライマーおよびReverse Nested gene specificプライマー（上記表２に記載の「SLCO1B3 424Rnest」）各０．５μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃にて３０秒間加熱した後、９５℃１０秒、５３℃１０秒および７２℃３０秒のサイクルを４０回繰り返した。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動をおこない、エチジウムブロマイド染色により可視化した。電気泳動の結果を図３に示す。図３に示すように、白人種肝由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして用いたサンプルでは、既報の転写開始点（図１に示す「ＴＳＳ」）由来のバンドが確認された。これに対し、ヒト大腸がん由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして用いたサンプルでは、既報の転写開始点由来のバンドよりも塩基長の短いバンドが確認された。この結果から、ヒト大腸がん由来ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡにおいては、既報とは異なる（既報のものよりも下流（３’）側に位置する）転写開始点が存在することが示唆された。なお、図３に示す「Non-template control」とは、テンプレートを含まない陰性コントロールである（後述する図５における「ＮＴＣ」も同旨である）。
GeneRacerTMKit（インビトロジェン）を用いたＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥ法により、ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の転写開始点を決定した。テンプレートとしてヒト大腸がん由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡまたは白人種肝由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡを用い、手順はプロトコールに従いおこなった。ＰＣＲ反応は、２０μＬ中にGoTaq Green Master Mix １０μＬ、Reverse transcriptionテンプレート １μＬ、１０μＭ GeneRacerTM５’プライマーおよびReverse gene specificプライマー（上記表２に記載の「SLCO1B3 648R」）各０．５μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９４℃にて２分間加熱した後、９４℃３０秒、６８℃３０秒、７２℃１分のサイクルを５回、９４℃３０秒、６６℃３０秒、７２℃１分のサイクルを５回、９４℃３０秒、６５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを３０回繰り返したＴｏｕｃｈ−ｄｏｗｎＰＣＲをおこなった。このＴｏｕｃｈ−ｄｏｗｎＰＣＲの後、ＰＣＲ反応溶液を滅菌水で５倍希釈したものをテンプレートとして、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲをおこなった。Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲは、２０μＬ中にGoTaq Green Master Mix １０μＬ、テンプレート１μＬ、１０μＭ GeneRacerTM５’ NestedプライマーおよびReverse Nested gene specificプライマー（上記表２に記載の「SLCO1B3 424Rnest」）各０．５μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃にて３０秒間加熱した後、９５℃１０秒、５３℃１０秒および７２℃３０秒のサイクルを４０回繰り返した。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動をおこない、エチジウムブロマイド染色により可視化した。電気泳動の結果を図３に示す。図３に示すように、白人種肝由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして用いたサンプルでは、既報の転写開始点（図１に示す「ＴＳＳ」）由来のバンドが確認された。これに対し、ヒト大腸がん由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして用いたサンプルでは、既報の転写開始点由来のバンドよりも塩基長の短いバンドが確認された。この結果から、ヒト大腸がん由来ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡにおいては、既報とは異なる（既報のものよりも下流（３’）側に位置する）転写開始点が存在することが示唆された。なお、図３に示す「Non-template control」とは、テンプレートを含まない陰性コントロールである（後述する図５における「ＮＴＣ」も同旨である）。
続いて、上記で得られたＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ産物を含むＤＮＡ断片を分離精製した後、DynaExpress TA PCR Cloning Kit（株式会社バイオダイナミクス研究所、東京）を用いてｐＴＡＣ−１ベクターに挿入し、アンピシリンを用いて選択した。プラスミドＤＮＡはPlasmid Miniprep Kit（バイオ−ラッド ラボラトリーズ）を用いて精製した。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列は、CEQTM DTCS-Quick Start Mix（ベックマン コールター、フラートン、カリフォルニア州）を用いてサイクルシークエンス反応をおこない、CEQ 2000 XL DNA analysis system（ベックマン コールター）により解析し、ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の新規な転写開始点を同定した。
ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の新規転写開始点付近の塩基配列をヒトゲノムＤＮＡのデータベースと照合したところ、新規転写開始点はＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子のイントロン２の領域内に存在し、さらにここに新たなエキソン（エキソンＳＶ）が存在することが明らかとなった。また、このエキソンＳＶはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン３へとスプライシングされていた（図４を参照）。
６．ｃＤＮＡの作製およびＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現解析
上記４．に記載の手法により抽出したＬＳ１８０細胞ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ＰＫ４５ｐ細胞、ヒト大腸がん／正常大腸ペアＲＮＡおよび白人種肝由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして用い、High Capacity cDNA Reverse Transcription kit（アプライド バイオシステムズ）を用いて逆転写反応をおこない、ｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡをテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲをおこない、新規ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの発現量を解析した。ＰＣＲは、２０μＬ中にGoTaq Green Master Mix １０μＬ、テンプレートｃＤＮＡ 1μＬ、１０μＭ ＦｏｒｗａｒｄおよびＲｅｖｅｒｓｅプライマー（上記表３に記載の「SLCO1B3 TSS in cancer 33F」および「SLCO1B3 TSS in cancer 145R」）各０．５μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃にて３０秒間加熱した後、９５℃１０秒、各プライマーに適したアニーリング温度（上記表３に記載の「アニーリング温度」）１０秒および７２℃１５〜２０秒のサイクルを３８回おこなった。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動をおこない、エチジウムブロマイド染色により可視化した。電気泳動の結果を図５に示す。図５に示すように、ヒト大腸がん組織に加え、大腸がん由来ＬＳ１８０細胞およびＨＣＴ１１６細胞、膵臓がん由来ＰＫ４５ｐ細胞においても新規ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの発現が認められた。一方、正常ヒト大腸組織においてはこのｍＲＮＡの発現は認められなかった。これらの結果より、新規ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡはがん細胞／組織に高く発現する分子種であると考えられることから、これを「ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ」とした。
上記４．に記載の手法により抽出したＬＳ１８０細胞ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ＰＫ４５ｐ細胞、ヒト大腸がん／正常大腸ペアＲＮＡおよび白人種肝由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして用い、High Capacity cDNA Reverse Transcription kit（アプライド バイオシステムズ）を用いて逆転写反応をおこない、ｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡをテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲをおこない、新規ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの発現量を解析した。ＰＣＲは、２０μＬ中にGoTaq Green Master Mix １０μＬ、テンプレートｃＤＮＡ 1μＬ、１０μＭ ＦｏｒｗａｒｄおよびＲｅｖｅｒｓｅプライマー（上記表３に記載の「SLCO1B3 TSS in cancer 33F」および「SLCO1B3 TSS in cancer 145R」）各０．５μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃にて３０秒間加熱した後、９５℃１０秒、各プライマーに適したアニーリング温度（上記表３に記載の「アニーリング温度」）１０秒および７２℃１５〜２０秒のサイクルを３８回おこなった。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動をおこない、エチジウムブロマイド染色により可視化した。電気泳動の結果を図５に示す。図５に示すように、ヒト大腸がん組織に加え、大腸がん由来ＬＳ１８０細胞およびＨＣＴ１１６細胞、膵臓がん由来ＰＫ４５ｐ細胞においても新規ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの発現が認められた。一方、正常ヒト大腸組織においてはこのｍＲＮＡの発現は認められなかった。これらの結果より、新規ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡはがん細胞／組織に高く発現する分子種であると考えられることから、これを「ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ」とした。
７．ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニング
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングは、ヒト大腸がん由来のｃＤＮＡをテンプレートとして、上記表４に記載のプライマーセット（ctSLCO1B3 cloning F33およびctSLCO1B3 cloning 2149R）並びにPrimeSTAR HS DNA polymerase（タカラバイオ株式会社，滋賀）を用いたＰＣＲによりおこなった。なお、表４に示すように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングに用いたフォワードプライマーは、上記「６．ｃＤＮＡの作製およびＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現解析」のＲＴ−ＰＣＲに用いた「SLCO1B3 TSS in cancer 33F」と同一である。ＰＣＲは９４℃３分の後、９８℃１０分、５８℃５秒、７２℃２分３０秒を４０サイクル繰り返し、７２℃３分を最終ステップとした条件でおこなった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲル電気泳動により分離し、抽出精製した後、pCR Blunt-II TOPO vector（インビトロジェン）に挿入した。得られた構築物をXbaI（ニッポンジーン、東京）およびBamHI（ニッポンジーン）で処理することにより、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｃＤＮＡを切り出し、これを同様に処理したpcDNA3.1(-) Neo vector（インビトロジェン）とライゲーションすることにより、OATP1B3/ct/pcDNA3.1(-)を作製した。
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングは、ヒト大腸がん由来のｃＤＮＡをテンプレートとして、上記表４に記載のプライマーセット（ctSLCO1B3 cloning F33およびctSLCO1B3 cloning 2149R）並びにPrimeSTAR HS DNA polymerase（タカラバイオ株式会社，滋賀）を用いたＰＣＲによりおこなった。なお、表４に示すように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングに用いたフォワードプライマーは、上記「６．ｃＤＮＡの作製およびＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現解析」のＲＴ−ＰＣＲに用いた「SLCO1B3 TSS in cancer 33F」と同一である。ＰＣＲは９４℃３分の後、９８℃１０分、５８℃５秒、７２℃２分３０秒を４０サイクル繰り返し、７２℃３分を最終ステップとした条件でおこなった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲル電気泳動により分離し、抽出精製した後、pCR Blunt-II TOPO vector（インビトロジェン）に挿入した。得られた構築物をXbaI（ニッポンジーン、東京）およびBamHI（ニッポンジーン）で処理することにより、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｃＤＮＡを切り出し、これを同様に処理したpcDNA3.1(-) Neo vector（インビトロジェン）とライゲーションすることにより、OATP1B3/ct/pcDNA3.1(-)を作製した。
なお、同様の手法により、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡクローニングもおこなった。具体的には、白人種肝由来のｃＤＮＡをテンプレートとして、上記表４に記載のプライマーセット（SLCO1B3 F27およびSLCO1B3 2184R）並びにKOD-plus-Polymerase （TOYOBO、大阪）を用いたＰＣＲによりおこなった。ＰＣＲ反応は９４℃３分の後、９４℃３０秒、４８℃３０秒、６８℃２分３０秒を３５サイクル繰り返し、６８℃５分を最終ステップとした条件でおこなった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲル電気泳動により分離し、抽出精製した後、pCR Blunt-II TOPO vector（インビトロジェン）に挿入した。得られた構築物をApaI（ニッポンジーン）およびＢａｍＨＩで処理することによってＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｃＤＮＡを切り出し、これを同様に処理したpcDNA3.1(-) Neo vectorとライゲーションすることにより、OATP1B3/wt/pcDNA3.1(-)を作製した。
上記で作製した２つのプラスミド中のＯＡＴＰ１Ｂ３/ｃｔまたはＯＡＴＰ１Ｂ３/ｗｔの塩基配列を、CEQ 2000 Dye terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit（ベックマン コールター）およびCEQ 2000 XL DNA analysis system（ベックマン コールター）を用いて解析した。図１には、これにより配列決定されたＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡ配列（配列番号：１）が、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡ配列（Ｒｅｆｓｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１９８４４、配列番号：２）とともに示されている。また、図１および図４に示すように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔでは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン１およびエキソン２が欠失しており、これに代えてエキソンＳＶが存在し、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン３へとスプライシングされていることが確認される。
８．定量的リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ発現解析
上記６．に記載の手法により作製したGHL pool（５つの日本人肝サンプルから調製したｃＤＮＡプール）、HHL pool（５つの白人種肝サンプルから調製したｃＤＮＡプール）、ヒト大腸がん組織、ＬＳ１８０細胞、ＰＫ４５ｐ細胞、およびＨＣＴ１１６細胞のそれぞれのｃＤＮＡ、並びに、上記７．に記載の手法により作製したプラスミドを用いて定量的リアルタイムＰＣＲをおこない、検量線法を用いてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔおよびＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのそれぞれのｍＲＮＡの定量をおこなった。ＰＣＲおよびＤＮＡ増幅の検出には、ABI PRISM（登録商標） 7000（アプライド バイオシステムズ）を用いた。
上記６．に記載の手法により作製したGHL pool（５つの日本人肝サンプルから調製したｃＤＮＡプール）、HHL pool（５つの白人種肝サンプルから調製したｃＤＮＡプール）、ヒト大腸がん組織、ＬＳ１８０細胞、ＰＫ４５ｐ細胞、およびＨＣＴ１１６細胞のそれぞれのｃＤＮＡ、並びに、上記７．に記載の手法により作製したプラスミドを用いて定量的リアルタイムＰＣＲをおこない、検量線法を用いてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔおよびＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのそれぞれのｍＲＮＡの定量をおこなった。ＰＣＲおよびＤＮＡ増幅の検出には、ABI PRISM（登録商標） 7000（アプライド バイオシステムズ）を用いた。
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡの検出は、２０μＬ中にｃＤＮＡテンプレート １μＬ、２×ＦastStart Universal Probe Master (ROX)（ロシュ、ペンツバーグ、ドイツ）１０μＬ、Universal Probe ＃59 (ロシュ) ０．２μＬ、および上記表５に記載のプライマーセット（ctSLCO1B3 Left 59-76、およびctSLCO1B3Right 130-151）各０．４μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃５分の後、９５℃１５秒、６０℃１分のサイクルを４５回繰り返した２ ｓｔｅｐ ＰＣＲでおこなった。
一方、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡの検出は、２０μＬ中にｃＤＮＡテンプレート １ μＬ、２×SYBER Premix Ex Taq II（タカラバイオ）１０μＬ、５０×ROX Reference Dye（タカラバイオ）０．４μＬおよび上記表５に記載のプライマーセット（SLCO1B3 F153 for real-time、およびSLCO1B3R194 for real-time）各０．８μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃２０秒の後、９５℃５秒、６０℃３３秒のサイクルを４０回繰り返した２ ｓｔｅｐ ＰＣＲでおこなった。
検量線用サンプルは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡ測定には上記７．に記載の手法により作製したＯＡＴＰ１Ｂ３／ｐＴＯＰＯをテンプレートとし、１ウェルあたりのモル数が２．８６×１０−２３〜１．４３×１０−１７モル内の５点を用いて作製した。一方、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡ測定には上記７．に記載の手法により作製したＯＡＴＰ１Ｂ３／ｐｃＤＮＡ３．１（−）をテンプレートとし、１ウェルあたりのモル数が１．０９×１０−２３〜１．０９×１０−１７モル内の５点を用いて作製した。ＰＣＲおよびＤＮＡ増幅の検出はｃＤＮＡサンプルと同様におこなった。また、検量線は最小二乗法により直線回帰して得た。
定量的リアルタイムＰＣＲの結果得られたｍＲＮＡ発現プロファイルを図６に示す。図６のＡは、各組織・細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの発現レベルを示す。また、図６のＢは、各組織・細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの発現レベルを示す。なお、図６に示す棒グラフは、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡのコピー数を、３回の独立した実験における平均値±標準偏差として示したものである。さらに、図６のＣは、発現レベルの比（ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのコピー数／ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのコピー数）を示す。
図６のＡに示すように、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １ｎｇ中に存在するＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡコピー数はGHL pool（日本人肝）では８であり、HHL pool（白人種肝）では４であった。これに対し、ヒト大腸がん組織h colon Tu ＃1 および ＃2ではそれぞれ１８１２、８９であり、また、ＬＳ１８０細胞では２４１１、ＰＫ４５ｐ細胞では２８９、ＨＣＴ１１６細胞では６４４であった。一方、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡコピー数はGHL poolでは１２１８７、HHL poolでは７４７３であり、h colon Tu ＃1および＃2ではそれぞれ３０、３であり、また、ＬＳ１８０細胞では８６５、ＰＫ４５ｐ細胞では２、ＨＣＴ１１６細胞では１７２であった。したがって、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡ発現量はＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡ発現量に対して、ヒト大腸がん組織であるh colon Tu ＃1および ＃2 でそれぞれ６０倍、３０倍、ヒト大腸がん由来細胞であるＬＳ１８０細胞で２．８倍、ＰＫ４５ｐ細胞で１４４．５倍、ＨＣＴ１１６細胞で３．７倍と高かった（図６のＣ）。一方、GHL poolおよびHHL poolでは、ＯＡＴＰ１Ｂ３/ｃｔ ｍＲＮＡの発現量はＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ発現量のそれぞれ約１／１５００、約１／１７００であった。以上のことから、ヒト大腸がん組織ではＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡがほぼ特異的に発現しており、また、ヒト大腸がん由来細胞においても、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡが非常に優位に発現していることが示される。つまり、本願の発明者らによって、がん細胞・組織で発現しているのは既報のＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔではなく、今回新たに発見された選択的スプライシングバリアントであるということが明らかとされたのである。
９．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合ｃｔＯＡＴＰ１Ｂ３ペプチド発現プラスミドの作製
図７に示すように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡの各フレームには推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）が存在する。フレーム１の２つのＯＲＦはそれぞれ１０アミノ酸からなるペプチドおよび２７アミノ酸からなるペプチドをコードすると推定される（ｆ１−１、ｆ１−２）。また、フレーム２のＯＲＦはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのフレームの途中を開始コドンとしてそのままＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの終止コドンを共有する６５５アミノ酸からなるタンパク質をコードすると推定される（ｆ２）。さらに、フレーム３のＯＲＦは４３アミノ酸からなるペプチドをコードすると推定される（ｆ３）。これら翻訳産物の発現を解析するため、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡのフレーム１およびフレーム３に存在するペプチドコード領域（ｆ１−１、ｆ１−２、ｆ３）並びに、フレーム２に存在するタンパク質コード領域のＮ末端領域２０アミノ酸（ｆ２）のＣ末端側のそれぞれにＧＦＰを融合したタンパク質（ｆ１−１／ＧＦＰ、ｆ１−２／ＧＦＰ、ｆ２／ＧＦＰ、ｆ３／ＧＦＰ）を発現させるプラスミドを作製した。
図７に示すように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡの各フレームには推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）が存在する。フレーム１の２つのＯＲＦはそれぞれ１０アミノ酸からなるペプチドおよび２７アミノ酸からなるペプチドをコードすると推定される（ｆ１−１、ｆ１−２）。また、フレーム２のＯＲＦはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのフレームの途中を開始コドンとしてそのままＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの終止コドンを共有する６５５アミノ酸からなるタンパク質をコードすると推定される（ｆ２）。さらに、フレーム３のＯＲＦは４３アミノ酸からなるペプチドをコードすると推定される（ｆ３）。これら翻訳産物の発現を解析するため、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡのフレーム１およびフレーム３に存在するペプチドコード領域（ｆ１−１、ｆ１−２、ｆ３）並びに、フレーム２に存在するタンパク質コード領域のＮ末端領域２０アミノ酸（ｆ２）のＣ末端側のそれぞれにＧＦＰを融合したタンパク質（ｆ１−１／ＧＦＰ、ｆ１−２／ＧＦＰ、ｆ２／ＧＦＰ、ｆ３／ＧＦＰ）を発現させるプラスミドを作製した。
OATP1B3/ct/pcDNA3.1(-)をテンプレートとして、ｆ１−２領域、ｆ２領域およびｆ３領域を表６に示すプライマーを用いてＰＣＲ（９５℃３０秒の後、９５℃10秒、６０℃１０秒、７２℃２０秒を４０回繰り返し、７２℃１０秒を最終ステップ）により増幅した。また、ＧＦＰおよびｆ１−１／ＧＦＰについては、pAcGFP-c1をテンプレートとして表６に示すプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃３分の後、９８℃１０秒、５９℃５秒、７２℃５０秒を４０回繰り返し、７２℃３分を最終ステップ）により増幅した。ＧＦＰのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ処理し、同様にＢａｍＨＩ処理したｆ１−２、ｆ２およびｆ３のそれぞれのＰＣＲ産物とライゲーションした。これをテンプレートとして表６に示すプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃２分の後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒を３５回繰り返し、７２℃３０秒を最終ステップ）により増幅した。得られたｆ１−２／ＧＦＰ、ｆ３／ＧＦＰはDynaExpress TA PCR Cloning Kit (BioDynamics Laboratory Inc., 東京) を用いてpTAC-1vectorに挿入した。また、得られたｆ１−１／ＧＦＰ、ｆ２／ＧＦＰはpCR Blunt-II TOPO vector（インビトロジェン）に挿入した。これらプラスミドをＸｂａＩおよびＫｐｎＩで処理し、同様に処理したpcDNA3.1(-)Neoとライゲーションして、f1-1/GFP/pcDNA3.1、f1-2/GFP/pcDNA3.1、f2/GFP/pcDNA3.1、f3/GFP/pcDNA3.1を作製した。
１０．リバーストランスフェクション
mCherry/pcDNA3.1(-) ３２０ｎｇ／ウェルと、各ＧＦＰ融合ペプチド発現プラスミドまたはempty pcDNA3.1 (-)Neo（mock） ３２０ｎｇ／ウェルとの混合物にOPTI-MEM（登録商標）（インビトロジェン）１００μＬ／ウェル、およびPlus Reagent（インビトロジェン）０．５μＬ／ウェルを混合し、Lipofectamin LTX（インビトロジェン）１．６μＬ／ウェルを加え２９３ＦＴ細胞３．５×１０５細胞／ウェルとともに２４ウェルプレートに播種した。播種から２４時間後、ＧＦＰ由来の緑色蛍光およびmCherry由来の赤色蛍光をOlympus Fluoview ver2.3（オリンパス、東京）を用いて観察した。結果を図８に示す。ここで、図８において、緑色はＧＦＰ由来の蛍光であり、赤色はトランスフェクションコントロールであるmCherry由来の蛍光である。また、両蛍光の重ね合わせをMergeとして示し、微分干渉像をPhaseとして示す。なお、解析に用いたレーザー強度・照射時間は全て等しくした。
mCherry/pcDNA3.1(-) ３２０ｎｇ／ウェルと、各ＧＦＰ融合ペプチド発現プラスミドまたはempty pcDNA3.1 (-)Neo（mock） ３２０ｎｇ／ウェルとの混合物にOPTI-MEM（登録商標）（インビトロジェン）１００μＬ／ウェル、およびPlus Reagent（インビトロジェン）０．５μＬ／ウェルを混合し、Lipofectamin LTX（インビトロジェン）１．６μＬ／ウェルを加え２９３ＦＴ細胞３．５×１０５細胞／ウェルとともに２４ウェルプレートに播種した。播種から２４時間後、ＧＦＰ由来の緑色蛍光およびmCherry由来の赤色蛍光をOlympus Fluoview ver2.3（オリンパス、東京）を用いて観察した。結果を図８に示す。ここで、図８において、緑色はＧＦＰ由来の蛍光であり、赤色はトランスフェクションコントロールであるmCherry由来の蛍光である。また、両蛍光の重ね合わせをMergeとして示し、微分干渉像をPhaseとして示す。なお、解析に用いたレーザー強度・照射時間は全て等しくした。
図８に示すように、トランスフェクションした２９３ＦＴ細胞においてｆ１−１／ＧＦＰおよびｆ３／ＧＦＰ由来と考えられる強い蛍光が認められた（図８（ｂ）および（ｅ））。また、ｆ２／ＧＦＰ（図８（ｄ））由来の蛍光も認められた。一方、ｆ１−２／ＧＦＰについては、非常に弱い蛍光が認められた（図８（ｃ））。また、同時におこなったｍｏｃｋを用いた実験では緑色蛍光は認められなかった（図８（ａ））。なお、いずれの実験においてもmCherry由来の赤色蛍光は同等の発色レベルを示した。
〔配列番号：１〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：２〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：３〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：４〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−１（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：５〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−１によりコードされるペプチド（ｆ１−１）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：６〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−２（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：７〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−２によりコードされるペプチド（ｆ１−２）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：８〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム２（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：９〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム２によりコードされるポリペプチド（ｆ２）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１０〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム３（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：１１〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム３によりコードされるペプチド（ｆ３）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１２〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１３〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１４〕
ＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥのTouch-down PCRに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１５〕
ＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥのNested-PCRに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１６〕
ＲＴ−ＰＣＲおよびＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングに用いたフォワード
プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１７〕
ＲＴ−ＰＣＲに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１８〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１９〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡクローニングに用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２０〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡクローニングに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２１〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの検出に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２２〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの検出に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２３〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの検出に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２４〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの検出に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２５〕
f1-1/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：５のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２６〕
f1-1/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：５のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２７〕
f1-2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：７のアミノ酸配列からなるペプチドの発現、f2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：９のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現、およびf3/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：１１のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２８〕
f1-2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：７のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２９〕
f2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：９のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３０〕
F3/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：１１のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３１〕
F1-1/GFP/pcDNA3.1、f1-2/GFP/pcDNA3.1、f2/GFP/pcDNA3.1、およびf3/GFP/pcDNA3.1からのＧＦＰタンパク質の発現に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３２〕
F1-1/GFP/pcDNA3.1、f1-2/GFP/pcDNA3.1、f2/GFP/pcDNA3.1、およびf3/GFP/pcDNA3.1からのＧＦＰタンパク質の発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：２〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：３〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：４〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−１（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：５〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−１によりコードされるペプチド（ｆ１−１）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：６〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−２（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：７〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−２によりコードされるペプチド（ｆ１−２）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：８〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム２（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：９〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム２によりコードされるポリペプチド（ｆ２）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１０〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム３（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：１１〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム３によりコードされるペプチド（ｆ３）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１２〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１３〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１４〕
ＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥのTouch-down PCRに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１５〕
ＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥのNested-PCRに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１６〕
ＲＴ−ＰＣＲおよびＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングに用いたフォワード
プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１７〕
ＲＴ−ＰＣＲに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１８〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１９〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡクローニングに用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２０〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡクローニングに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２１〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの検出に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２２〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの検出に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２３〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの検出に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２４〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの検出に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２５〕
f1-1/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：５のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２６〕
f1-1/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：５のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２７〕
f1-2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：７のアミノ酸配列からなるペプチドの発現、f2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：９のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現、およびf3/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：１１のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２８〕
f1-2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：７のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２９〕
f2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：９のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３０〕
F3/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：１１のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３１〕
F1-1/GFP/pcDNA3.1、f1-2/GFP/pcDNA3.1、f2/GFP/pcDNA3.1、およびf3/GFP/pcDNA3.1からのＧＦＰタンパク質の発現に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３２〕
F1-1/GFP/pcDNA3.1、f1-2/GFP/pcDNA3.1、f2/GFP/pcDNA3.1、およびf3/GFP/pcDNA3.1からのＧＦＰタンパク質の発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
Claims (11)
- 生体から分離した被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３（Organic Anion Transporting Polypeptide 1B3）ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定方法であって、
前記被検試料中の、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡを、配列番号：２で表される塩基配列を含むｍＲＮＡと識別して測定することを含む、測定方法。 - 配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶの存在を指標として、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡを測定する、請求項１に記載の測定方法。
- 前記エキソンＳＶを含む領域に設定したプライマーを一方のプライマーとして用いる核酸増幅法により、配列表の配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡの部分領域を特異的に増幅し、増幅産物を測定することを含む、請求項２に記載の測定方法。
- 前記プライマーの塩基数が１５〜３５である、請求項３に記載の測定方法。
- 前記核酸増幅法がＲＴ−ＰＣＲ法である、請求項３または４に記載の測定方法。
- 以下の条件を満足する核酸：
（１）配列番号：１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする；
（２）配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸が共存する場合に、ストリンジェントな条件下で、当該核酸とハイブリダイズしないか、または、当該核酸とハイブリダイズした場合であってもその３’末端がミスマッチとなる；
（３）塩基数が１５〜３５である。 - 配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶを含む領域とハイブリダイズする、請求項６に記載の核酸。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法により、生体から分離した被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定することを含む、結腸がん、大腸がんまたは膵臓がんの検出方法。
- 配列番号：１で表される塩基配列を含むＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定する、請求項８に記載の検出方法。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法により、結腸がん、大腸がんまたは膵臓がんの細胞を被検物質の存在下で培養して得られる培養細胞中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定する工程と、
得られた測定結果を、前記被検物質の非存在下における場合と比較および／または評価する工程と、
を含む、結腸がん、大腸がんまたは膵臓がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法。 - 配列番号：１で表される塩基配列を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３（Organic Anion Transporting Polypeptide 1B3）ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアント。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011032501A JP5901046B2 (ja) | 2010-02-19 | 2011-02-17 | ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント |
| US13/030,485 US9404158B2 (en) | 2010-02-19 | 2011-02-18 | Alternative splicing variant of OATP1B3 mRNA |
| US13/759,101 US9115405B2 (en) | 2010-02-19 | 2013-02-05 | Alternative splicing variant of OATP1B3 mRNA |
| US15/226,278 US10011881B2 (en) | 2010-02-19 | 2016-08-02 | Alternative splicing variant of OATP1B3 mRNA |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010035166 | 2010-02-19 | ||
| JP2010035166 | 2010-02-19 | ||
| JP2011032501A JP5901046B2 (ja) | 2010-02-19 | 2011-02-17 | ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011188853A JP2011188853A (ja) | 2011-09-29 |
| JP2011188853A5 JP2011188853A5 (ja) | 2014-04-03 |
| JP5901046B2 true JP5901046B2 (ja) | 2016-04-06 |
Family
ID=44794450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011032501A Expired - Fee Related JP5901046B2 (ja) | 2010-02-19 | 2011-02-17 | ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9404158B2 (ja) |
| JP (1) | JP5901046B2 (ja) |
Families Citing this family (96)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100022414A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-01-28 | Raindance Technologies, Inc. | Droplet Libraries |
| JP2010506136A (ja) | 2006-05-11 | 2010-02-25 | レインダンス テクノロジーズ， インコーポレイテッド | 微小流体デバイス |
| WO2008097559A2 (en) | 2007-02-06 | 2008-08-14 | Brandeis University | Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems |
| US8592221B2 (en) | 2007-04-19 | 2013-11-26 | Brandeis University | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems |
| CA2735250A1 (en) * | 2008-07-30 | 2010-02-04 | Nippon Steel Kankyo Engineering Co., Ltd. | Universal nucleic acid probe set and method for utilization thereof |
| JP2012513252A (ja) | 2008-12-22 | 2012-06-14 | ザ メディカル カレッジ オブ ウィスコンシン インク | 眼の長さの成長を制限するための方法および装置 |
| US8835358B2 (en) | 2009-12-15 | 2014-09-16 | Cellular Research, Inc. | Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels |
| EP3392349A1 (en) | 2010-02-12 | 2018-10-24 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
| US9399797B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-07-26 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
| EP2614160B1 (en) | 2010-09-10 | 2016-04-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detection of rna-interacting regions in dna |
| WO2012112606A1 (en) | 2011-02-15 | 2012-08-23 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detecting methylati0n in a subpopulation of genomic dna |
| WO2012112804A1 (en) | 2011-02-18 | 2012-08-23 | Raindance Technoligies, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
| EP3709018A1 (en) | 2011-06-02 | 2020-09-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Microfluidic apparatus for identifying components of a chemical reaction |
| US8658430B2 (en) | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
| EP2761032B1 (en) * | 2011-09-29 | 2017-07-19 | Luminex Corporation | Hydrolysis probes |
| EP2787027A4 (en) * | 2011-12-02 | 2015-07-22 | Toray Industries | POLYESTER FOIL, SOLAR CELL BACK PAPER AND SOLAR CELL |
| EP2823303A4 (en) * | 2012-02-10 | 2015-09-30 | Raindance Technologies Inc | MOLECULAR DIAGNOSTIC SCREEN TYPE ASSAY |
| AU2013226081B2 (en) | 2012-02-27 | 2018-06-14 | Becton, Dickinson And Company | Compositions and kits for molecular counting |
| CA2865541C (en) * | 2012-02-27 | 2019-11-05 | Toray Industries, Inc. | Nucleic acid detection method |
| US10323279B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10273541B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-04-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10221442B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
| US9951386B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10752949B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-08-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US11591637B2 (en) | 2012-08-14 | 2023-02-28 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
| US9388465B2 (en) | 2013-02-08 | 2016-07-12 | 10X Genomics, Inc. | Polynucleotide barcode generation |
| US10584381B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-03-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US9701998B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-07-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| CN114891871A (zh) | 2012-08-14 | 2022-08-12 | 10X基因组学有限公司 | 微胶囊组合物及方法 |
| US10533221B2 (en) | 2012-12-14 | 2020-01-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| EP3567116A1 (en) | 2012-12-14 | 2019-11-13 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US20140272959A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of Hybridizing Probes to Genomic DNA |
| KR102402446B1 (ko) | 2013-08-28 | 2022-05-30 | 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 | 대량의 동시 단일 세포 분석 |
| US11901041B2 (en) | 2013-10-04 | 2024-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analysis of nucleic acid modification |
| US9582877B2 (en) | 2013-10-07 | 2017-02-28 | Cellular Research, Inc. | Methods and systems for digitally counting features on arrays |
| CN105765080A (zh) * | 2013-11-26 | 2016-07-13 | 伯乐实验室公司 | 用于检测核酸相邻性的方法 |
| US9944977B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-04-17 | Raindance Technologies, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
| WO2015147370A1 (en) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | Seegene, Inc. | Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures |
| US20150284786A1 (en) * | 2014-04-04 | 2015-10-08 | Affymetrix, Inc. | Compositions and Methods for Molecular Inversion Probe Assays |
| US9694361B2 (en) | 2014-04-10 | 2017-07-04 | 10X Genomics, Inc. | Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same |
| CN113249435A (zh) | 2014-06-26 | 2021-08-13 | 10X基因组学有限公司 | 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法 |
| GB201413718D0 (en) * | 2014-08-01 | 2014-09-17 | Olink Ab | Method for selecting a target nucleic acid sequence |
| US9975122B2 (en) | 2014-11-05 | 2018-05-22 | 10X Genomics, Inc. | Instrument systems for integrated sample processing |
| US10697004B2 (en) * | 2014-11-06 | 2020-06-30 | Osaka City University | Clamping probe |
| AU2016207023B2 (en) | 2015-01-12 | 2019-12-05 | 10X Genomics, Inc. | Processes and systems for preparing nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same |
| ES2891085T3 (es) * | 2015-01-30 | 2022-01-26 | Harvard College | Obtención de imágenes sin microscopio |
| WO2016134078A1 (en) | 2015-02-19 | 2016-08-25 | Becton, Dickinson And Company | High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information |
| WO2016137973A1 (en) | 2015-02-24 | 2016-09-01 | 10X Genomics Inc | Partition processing methods and systems |
| EP3262192B1 (en) | 2015-02-27 | 2020-09-16 | Becton, Dickinson and Company | Spatially addressable molecular barcoding |
| SG10202102575SA (en) * | 2015-02-27 | 2021-04-29 | Univ Washington | Methods and reagents for predicting predisposition to refractive error |
| WO2016160844A2 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Cellular Research, Inc. | Methods and compositions for combinatorial barcoding |
| US20160299129A1 (en) * | 2015-04-07 | 2016-10-13 | Xiaolei Qiu | Ultra Sensitive and Specific Multiplex Biosensor System Based on Multiple Cooperative Interactions |
| EP3286326A1 (en) * | 2015-04-23 | 2018-02-28 | Cellular Research, Inc. | Methods and compositions for whole transcriptome amplification |
| US11124823B2 (en) | 2015-06-01 | 2021-09-21 | Becton, Dickinson And Company | Methods for RNA quantification |
| JP6823320B2 (ja) * | 2015-06-02 | 2021-02-03 | 国立大学法人大阪大学 | 癌型ｓｌｃｏ１ｂ３を標的とする核酸医薬 |
| EP3347465B1 (en) | 2015-09-11 | 2019-06-26 | Cellular Research, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid library normalization |
| US11371094B2 (en) | 2015-11-19 | 2022-06-28 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides |
| SG11201803983UA (en) * | 2015-11-19 | 2018-06-28 | 10X Genomics Inc | Transformable tagging compositions, methods, and processes incorporating same |
| EP3384048B1 (en) | 2015-12-04 | 2021-03-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid analysis |
| ES2956757T3 (es) | 2016-05-02 | 2023-12-27 | Becton Dickinson Co | Codificación con códigos de barras moleculares precisa |
| WO2017197338A1 (en) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | 10X Genomics, Inc. | Microfluidic systems and methods of use |
| US10301677B2 (en) | 2016-05-25 | 2019-05-28 | Cellular Research, Inc. | Normalization of nucleic acid libraries |
| WO2017205691A1 (en) | 2016-05-26 | 2017-11-30 | Cellular Research, Inc. | Molecular label counting adjustment methods |
| US10640763B2 (en) | 2016-05-31 | 2020-05-05 | Cellular Research, Inc. | Molecular indexing of internal sequences |
| US10202641B2 (en) | 2016-05-31 | 2019-02-12 | Cellular Research, Inc. | Error correction in amplification of samples |
| CN115185103A (zh) | 2016-08-01 | 2022-10-14 | 华盛顿大学 | 用于治疗近视的眼科镜片 |
| US11359229B2 (en) | 2016-09-20 | 2022-06-14 | President And Fellows Of Harvard College | Molecular verification systems |
| CA3034924A1 (en) | 2016-09-26 | 2018-03-29 | Cellular Research, Inc. | Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences |
| US10550429B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-02-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10815525B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-10-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| EP3568234B1 (en) | 2017-01-13 | 2023-09-06 | Cellular Research, Inc. | Hydrophilic coating of fluidic channels |
| CN117512066A (zh) | 2017-01-30 | 2024-02-06 | 10X基因组学有限公司 | 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统 |
| WO2018144240A1 (en) | 2017-02-01 | 2018-08-09 | Cellular Research, Inc. | Selective amplification using blocking oligonucleotides |
| US11718052B2 (en) | 2017-05-08 | 2023-08-08 | Sightglass Vision, Inc. | Contact lenses for reducing myopia and methods for making the same |
| CN109526228B (zh) | 2017-05-26 | 2022-11-25 | 10X基因组学有限公司 | 转座酶可接近性染色质的单细胞分析 |
| US10400235B2 (en) | 2017-05-26 | 2019-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
| US10676779B2 (en) | 2017-06-05 | 2020-06-09 | Becton, Dickinson And Company | Sample indexing for single cells |
| SG11201913654QA (en) | 2017-11-15 | 2020-01-30 | 10X Genomics Inc | Functionalized gel beads |
| US10829815B2 (en) | 2017-11-17 | 2020-11-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles |
| WO2019126209A1 (en) | 2017-12-19 | 2019-06-27 | Cellular Research, Inc. | Particles associated with oligonucleotides |
| US10884264B2 (en) | 2018-01-30 | 2021-01-05 | Sightglass Vision, Inc. | Ophthalmic lenses with light scattering for treating myopia |
| EP3775271A1 (en) | 2018-04-06 | 2021-02-17 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for quality control in single cell processing |
| EP3788170A1 (en) | 2018-05-03 | 2021-03-10 | Becton, Dickinson and Company | Molecular barcoding on opposite transcript ends |
| ES2945191T3 (es) | 2018-05-03 | 2023-06-29 | Becton Dickinson Co | Análisis de muestras multiómicas de alto rendimiento |
| CN112805389A (zh) | 2018-10-01 | 2021-05-14 | 贝克顿迪金森公司 | 确定5’转录物序列 |
| EP3877520A1 (en) | 2018-11-08 | 2021-09-15 | Becton Dickinson and Company | Whole transcriptome analysis of single cells using random priming |
| US11492660B2 (en) | 2018-12-13 | 2022-11-08 | Becton, Dickinson And Company | Selective extension in single cell whole transcriptome analysis |
| WO2020150356A1 (en) | 2019-01-16 | 2020-07-23 | Becton, Dickinson And Company | Polymerase chain reaction normalization through primer titration |
| EP4242322A3 (en) | 2019-01-23 | 2023-09-20 | Becton, Dickinson and Company | Oligonucleotides associated with antibodies |
| US11939622B2 (en) | 2019-07-22 | 2024-03-26 | Becton, Dickinson And Company | Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay |
| US11287422B2 (en) | 2019-09-23 | 2022-03-29 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| US11773436B2 (en) | 2019-11-08 | 2023-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Using random priming to obtain full-length V(D)J information for immune repertoire sequencing |
| US11649497B2 (en) | 2020-01-13 | 2023-05-16 | Becton, Dickinson And Company | Methods and compositions for quantitation of proteins and RNA |
| US11661625B2 (en) | 2020-05-14 | 2023-05-30 | Becton, Dickinson And Company | Primers for immune repertoire profiling |
| US11932901B2 (en) | 2020-07-13 | 2024-03-19 | Becton, Dickinson And Company | Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq |
| US11739443B2 (en) | 2020-11-20 | 2023-08-29 | Becton, Dickinson And Company | Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6582908B2 (en) * | 1990-12-06 | 2003-06-24 | Affymetrix, Inc. | Oligonucleotides |
| US6964868B1 (en) * | 1998-01-28 | 2005-11-15 | Nuvelo, Inc. | Human genes and gene expression products II |
| US20040142325A1 (en) * | 2001-09-14 | 2004-07-22 | Liat Mintz | Methods and systems for annotating biomolecular sequences |
| US7250496B2 (en) * | 2002-11-14 | 2007-07-31 | Rosetta Genomics Ltd. | Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof |
| JP2007119390A (ja) | 2005-10-27 | 2007-05-17 | Tohoku Univ | 大腸癌患者の予後を予測する方法 |
-
2011
- 2011-02-17 JP JP2011032501A patent/JP5901046B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-02-18 US US13/030,485 patent/US9404158B2/en active Active
-
2013
- 2013-02-05 US US13/759,101 patent/US9115405B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-08-02 US US15/226,278 patent/US10011881B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20130203064A1 (en) | 2013-08-08 |
| US9404158B2 (en) | 2016-08-02 |
| US20120014977A1 (en) | 2012-01-19 |
| US20160333426A1 (en) | 2016-11-17 |
| US10011881B2 (en) | 2018-07-03 |
| JP2011188853A (ja) | 2011-09-29 |
| US9115405B2 (en) | 2015-08-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5901046B2 (ja) | ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント | |
| JP6430560B2 (ja) | 前立腺癌マーカーとしてのホスホジエステラーゼ４ｄ７ | |
| US10894986B2 (en) | Compositions and methods for treating or preventing prostate cancer and for detecting androgen receptor variants | |
| WO2014017491A1 (ja) | Ｃｅｐ５５遺伝子とｒｅｔ遺伝子との融合遺伝子 | |
| WO2013018882A1 (ja) | Ｋｉｆ５ｂ遺伝子とｒｅｔ遺伝子との融合遺伝子、並びに該融合遺伝子を標的としたがん治療の有効性を判定する方法 | |
| PT1994410E (pt) | Métodos e estojos para detecção precoce de cancro ou de predisposição a este | |
| EP3090067B1 (en) | Genomic rearrangements associated with prostate cancer and methods of using the same | |
| KR20180109811A (ko) | 항암 치료 내성 판단 방법 및 상기 방법에 사용되는 조성물 | |
| JP6387001B2 (ja) | Ｃｄｋ阻害剤と関連するバイオマーカー | |
| KR102025005B1 (ko) | 전암성 병변에서 조기 간암을 진단 및 예측할 수 있는 바이오 마커 및 이의용도 | |
| JP5316749B2 (ja) | シスプラチン耐性遺伝子診断方法及びシスプラチン治療効果遺伝子診断キット | |
| JP6312861B2 (ja) | がん発症の予測、早期診断、及び治療剤としてのｎｋｘ６．３の用途 | |
| JP2017135985A (ja) | Ｂ前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病新規キメラ遺伝子 | |
| KR102202120B1 (ko) | 알츠하이머 질환의 진단 또는 치료를 위한 Ｕｂｅ２ｈ의 용도 | |
| JP2008169132A (ja) | Ｌｉｎ７ｃの癌の転移診断への応用 | |
| KR102042332B1 (ko) | 간암의 재발 및 예후 예측용 tcirg1 마커 및 이의 용도 | |
| KR20230120908A (ko) | 신경교종의 악성도 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도 | |
| JP5622156B2 (ja) | シスプラチン耐性遺伝子診断方法及びシスプラチン治療効果遺伝子診断キット | |
| JP2010057371A (ja) | 成人ｔ細胞白血病の発症危険性を検出する方法及びその診断薬 | |
| Nitz | The Characterization and Role of RREB1 in Human Bladder Cancer | |
| BG67180B1 (bg) | Метод и кит за откриване на онкофузионен протеин |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140217 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140217 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150421 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150622 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151013 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151214 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160209 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160307 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5901046 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |