CN105765080A - 用于检测核酸相邻性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于确定样品中的两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域是否由于直接的或间接的物理相互作用而彼此紧邻的方法。

Description

用于检测核酸相邻性的方法

对相关专利申请的交叉引用

本申请要求2013年11月26日提交的美国临时专利申请号61/909,283的优先权的利益，所述申请通过引用完整地结合。

发明背景

核酸分子之间和核酸分子的区域之间的相互作用，无论是核酸之间的直接的物理相互作用还是通过与其他分子的复合物的间接相互作用，均涉及细胞过程的调节。例如，DNA成环(looping)涉及许多细胞过程，包括转录、复制和重组。此外，RNA与基因组DNA的相互作用能够影响和调节DNA的转录。

发明简述

本发明提供确定样品中的两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域是否由于直接的或间接的物理相互作用而彼此紧邻的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：

提供核酸的混合物；

将所述混合物区室化到足够数目的区室中以致能够将核酸分子或核酸分子的区域由于紧邻所致的在区室中的共定位与随机共定位相区别；以及

检测在相同的区室中两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域的存在；由此确定所述样品中的所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域彼此紧邻。

在一些实施方案中，所述提供步骤包括在这样的条件下提供所述核酸的混合物以致蛋白质保持与所述混合物中的所述核酸分子或所述核酸分子的区域结合。

在一些实施方案中，检测两个以上的核酸分子。在一些实施方案中，检测一个核酸分子的两个以上的区域。

在一些实施方案中，所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域由于直接相互作用而彼此紧邻。在一些实施方案中，所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域由于分子的复合物中的间接相互作用而彼此紧邻。在一些实施方案中，所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域由于核酸-蛋白质复合物中的间接相互作用而彼此紧邻。

在一些实施方案中，所述核酸是双链的。在一些实施方案中，所述核酸是单链的。在一些实施方案中，所述核酸是DNA。在一些实施方案中，所述核酸是RNA。

在一些实施方案中，所述方法包括分析各区室是否存在所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域。

在一些实施方案中，所述检测步骤包括扩增所述核酸分子或所述核酸分子的所述区域。在一些实施方案中，所述扩增步骤包括PCR、定量PCR或实时PCR。

在一些实施方案中，所述检测步骤包括对所述核酸分子或所述核酸分子的所述区域进行核苷酸测序。

在一些实施方案中，所述检测步骤包括检测一种或多种试剂，所述一种或多种试剂与所述核酸分子或所述核酸分子的所述区域杂交。在一些实施方案中，所述一种或多种试剂是荧光团。

在一些实施方案中，所述方法包括：

将所述核酸与至少两种试剂接触，其中第一试剂与第一核酸分子或核酸分子的第一区域杂交并且其中第二试剂与第二核酸分子或核酸分子的第二区域杂交；以及

检测所述第一试剂和所述第二试剂的存在；由此确定所述样品中的所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域彼此紧邻。

在一些实施方案中，所述第一试剂和所述第二试剂联合产生在不存在所述第一试剂、不存在所述第二试剂或两者都不存在的情况下不产生的信号。

在一些实施方案中，所述提供步骤包括从所述样品分离所述核酸，并且其中所述分离基本上不破坏所述样品中的核酸分子之间或核酸分子的区域之间的直接的或间接的相互作用。在一些实施方案中，所分离的核酸被重悬在溶液中。在一些实施方案中，所分离的核酸被重悬在溶液中，所述溶液包含一种或多种用于检测所述核酸分子或所述核酸分子的所述区域的试剂。在一些实施方案中，所述一种或多种试剂是寡核苷酸探针。

在一些实施方案中，所述样品是来自动物、植物、细菌或病毒来源的提取物。在一些实施方案中，所述样品包含一种或多种细胞。在一些实施方案中，所述样品包含分离的细胞核。

在一些实施方案中，所述提供步骤包括破坏或溶解一种或多种细胞的细胞膜。在一些实施方案中，所述提供步骤包括对一种或多种细胞的细胞膜进行渗透化处理。

在一些实施方案中，所述提供步骤包括所述核酸的核酸剪切或核酸酶消化。在一些实施方案中，所述提供步骤包括从所述样品中的其他组分中纯化所述核酸。

在一些实施方案中，所述区室化步骤包括稀释所述混合物。在一些实施方案中，所述稀释包括依次稀释所述混合物以产生多种稀释液并且将所述多种稀释液中的每种区室化到多个区室中。在一些实施方案中，小滴被不可混溶的载体液包围。在一些实施方案中，所述区室化步骤包括将所述混合物分配到微胶囊中。

定义

除非另外限定，本文中使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。参见，例如，Lackie,DICTIONARYOFCELLANDMOLECULARBIOLOGY,Elsevier(第4版.2007)；Sambrook等,MOLECULARCLONING,ALABORATORYMANUAL,ColdSpringHarborLabPress(ColdSpringHarbor,NY1989)。术语"一个"或"一种"意在表示"一或多"。术语"包含(comprise)"及其变体如"包含(comprises)"和"包含(comprising)"当在步骤或元素的列举之前时，意在表示添加另外的步骤或元素是任选的并且是未被排除的。与本文中所述的那些类似或等效的任何方法、设备和材料都可以用于实施本发明。提供以下定义以帮助理解本文中频繁使用的某些术语并且其不意在限制本公开的范围。

术语"紧邻"或"紧邻的"当关于两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域使用时，是指彼此直接或间接在物理上相关联的两个以上的核酸分子或核酸分子的区域。在一些实施方案中，彼此紧邻的两个以上的核酸分子或核酸分子的区域彼此直接在物理上相关联，例如但不限于，通过碱基配对(例如，经典的沃森-克里克碱基配对)，三螺旋状结构中的核酸结合，成氢键，其他共价或非共价相互作用，或化学相互作用。在一些实施方案中，彼此紧邻的两个以上的核酸分子或核酸分子的区域彼此间接在物理上相关联，例如但不限于，通过经由可以包含一种或多种蛋白质和/或其他非核酸分子的较大的分子复合物而结合。在一些实施方案中，两个以上的核酸分子或核酸分子的区域由于核酸-蛋白质复合物中的间接相互作用而彼此紧邻。

术语"核酸区域"是指核酸分子内的序列区段。在一些实施方案中，核酸区域是用于与核酸分子内的另一个核酸区段发生特异性杂交或用于结合复合物中的非核酸组分(例如，蛋白质)的具有足够长度的区域。例如，在一些实施方案中，核酸区域为约10-100bp、约20-500bp、约50-500bp、约100-10,000bp、约100-1000bp或约1000-5000bp，例如，约10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000bp)。在一些实施方案中，核酸区域中的核酸的长度为长度足以在PCR反应中被扩增的区域。例如，标准PCR反应通常能够扩增约35至5000个碱基对。

在一些实施方案中，核酸区域被核酸的插入序列"隔开"。在一些实施方案中，隔开核酸区域的插入序列的长度为至少50、100、200、500、1000、5000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、40,000、50,000或更多个碱基对。

术语"核酸"和"多核苷酸"可互换地指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。该术语包括包含已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，所述核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接是合成的、自然存在的和非自然存在的，其具有与参比核酸类似的结合性质，并且其以与参比核苷酸类似的方式被代谢。此种类似物的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性-磷酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。在某些应用中，核酸可以是聚合物，所述聚合物包含多种单体类型，例如，RNA和DNA亚基两者。

术语"区室化(compartmentalizing)"当关于样品或混合物使用时，是指将样品或混合物分到多个部分或"区室(compartment)"中。区室可以是固体或液体。在一些实施方案中，区室是固体区室，例如，微通道。在一些实施方案中，区室是流体区室，例如，小滴。在一些实施方案中，流体区室(例如，小滴)是含水小滴，其被不可混溶的载体液(例如，油)包围。

术语"试剂(agent)"和"可检测试剂"可互换地指可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的组合物。例如，有用的试剂包括荧光染料、发光试剂、放射性同位素(例如，³²P、³H)、电子致密试剂、酶、生物素、洋地黄毒苷或半抗原和蛋白质、核酸或可以使其可检测的其他实体，例如，通过将放射性标记整合到与靶核酸分子或核酸区域结合的寡核苷酸中。

术语"特异性结合"或"特异性相关联"当关于与同核酸在物理上相关联的复合物的组分结合或相关联的试剂使用时，是指以与非复合的组分相比高至少2倍(例如，至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、或100倍或更高)的亲和力与复合物中的组分结合的试剂。

附图简述

图1.检测区室中核酸相邻性的示意图。图示了用于确定两个核酸区域(例如，DNA)是否彼此紧邻的方法。在样品1中，DNA区域A和B彼此不相邻并且其之间没有相互作用。在样品2中，DNA区域A和B由于与区域A和B相关联的蛋白质直接相互作用而彼此紧邻。所述样品(样品1或样品2)被区室化到多个区室中(例如，大于A和B分子的数目的区室数目)，并且对所述区室检测A和/或B的存在。对于样品1，DNA区域A和B大都在分开的区室中被检测到，表示在样品1中DNA区域A和B不相互作用。对于样品2，DNA区域A和B大都在相同的区室中被检测到，表示在样品2中DNA区域A和B紧密结合。

发明详述

I.导言

提供用于确定样品中的两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域是否彼此紧邻的方法和试剂盒。不限于特定的理论，据信，当样品(例如，液体样品)被区室化时，在所述样品(例如，液体样品)中，由于物理相互作用(例如，直接的或间接的物理结合)而紧邻的核酸将一起隔离。因此，与彼此不紧邻的核酸相比，彼此紧邻的核酸将更经常地在相同的区室中被发现。通过将样品(例如，液体样品)区室化到一定数目的区室中并且分析所述区室的核酸的存在，可以提供关于复杂核酸结构和相互作用的有价值的信息。例如，本文所述的方法、组合物和试剂盒可以用于鉴定与其他RNA、DNA或染色质分子相互作用的RNA、DNA或染色质分子和/或用于鉴定分子内相互作用(即，成环)中彼此相互作用的RNA、DNA或染色质区域。

II.检测核酸相邻性

在一方面，提供确定样品中的两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域是否由于直接的或间接的物理相互作用而彼此紧邻的方法。在一些实施方案中，提供确定样品中的两个以上的单独的核酸分子是否由于直接的或间接的物理相互作用而紧邻的方法。在一些实施方案中，提供确定样品中的单个核酸分子的两个以上的隔开的区域是否由于直接的或间接的物理相互作用而紧邻的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：

提供核酸的混合物；

将所述混合物区室化到足够数目的区室中以致能够将核酸分子由于紧邻所致的在区室中的共定位与随机共定位相区别；以及

检测在相同的区室中两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域的存在；由此确定所述样品中的所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域彼此紧邻。

在一些实施方案中，所述方法包括分析各区室是否存在所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域并且量化对于所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域中每种的存在为阳性的区室的数目。在一些实施方案中，所述方法包括确定对于所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域中每种的存在为阳性的区室的数目是否超过由于所述核酸分子或所述核酸分子的区域的随机共定位而将预期的阳性区室的数目。

在一些实施方案中，检测由于直接的物理相互作用所致的紧邻。核酸之间的直接相互作用包括，例如，物理相互作用如碱基配对(例如，经典的沃森-克里克碱基配对)，三螺旋状结构中的核酸结合，氢键键合，其他共价或非共价相互作用，或化学相互作用。

在一些实施方案中，检测由于间接物理相互作用所致的紧邻。在核酸之间的间接相互作用中，两个以上的核酸分子或核酸分子的区域是可以包含蛋白质和/或其他非核酸分子的较大分子复合物的部分。核酸分子或核酸分子的区域可以彼此物理接触也可以彼此不物理接触。间接物理相互作用包括，例如，核酸-蛋白质复合物。在一些实施方案中，所述核酸-蛋白质复合物是参与调节核酸转录、复制、修复、重组或加工的复合物(例如，转录起始复合物、mRNA剪切复合物或RNA诱导的沉默复合物)。在一些实施方案中，其中核酸由于经由核酸-蛋白质复合物的相互作用而紧邻，所述蛋白质是通过DNA结合结构域或RNA结合结构域而与核酸相互作用的蛋白质(例如，在特定位点修饰核酸的转录因子或酶)。在一些实施方案中，所述蛋白质不是组蛋白。在一些实施方案中，核酸-蛋白质复合物包括染色质。

在一些实施方案中，检测彼此紧邻的双链核酸。在一些实施方案中，检测彼此紧邻的单链核酸。在一些实施方案中，检测彼此紧邻的双链核酸和单链核酸两者。在一些实施方案中，检测由于直接的物理相互作用或间接的物理相互作用(例如，复合物中的两个以上的DNA分子与蛋白质的相互作用)而彼此紧邻的两个以上的DNA分子(例如，基因组DNA或cDNA)或一个DNA分子(例如，基因组DNA或cDNA)的两个以上的隔开的区域。在一些实施方案中，检测由于直接的物理相互作用或间接的物理相互作用(例如，复合物中的两个以上的RNA分子与蛋白质的相互作用)而彼此紧邻的两个以上的RNA分子(例如，编码RNA(mRNA)或非编码RNA，例如，微RNA(microRNA,miRNA)、小干扰RNA(siRNA)或长的非编码RNA)或一个RNA分子(例如，编码RNA或非编码RNA)的两个以上的隔开的区域。在一些实施方案中，检测由于直接的物理相互作用或间接的物理相互作用(例如，复合物中的DNA和RNA分子与蛋白质的相互作用)而彼此紧邻的DNA(例如，基因组DNA)和RNA(例如，mRNA)。在一些实施方案中，两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域的序列不是相同或基本相同的。

样品

本文所述的方法可以用于检测任何类型的样品中的由于直接的或间接的物理相互作用所致的核酸相邻性。在一些实施方案中，所述样品是生物样品。生物样品可以获自任何生物体，例如，动物、植物、真菌、细菌或任何其他生物体。在一些实施方案中，生物样品来自动物，例如，哺乳动物(例如，人或非人灵长类动物、牛、马、猪、羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(例如，鸡)或鱼。在一些实施方案中，可以进行核酸相互作用检测的样品来自动物、植物、细菌或病毒来源。

生物样品可以是获得自生物体的任何组织或体液，例如，血液、血液级分或血液制品(例如，血清、血浆、血小板、红细胞等)、痰或唾液、组织(例如，肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)、培养的细胞、粪便、尿液等。在一些实施方案中，所述样品包含一种或多种细胞。在一些实施方案中，所述细胞是动物细胞，包括但不限于，人或非人哺乳动物细胞。非人哺乳动物细胞包括但不限于，灵长类动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、猪细胞和牛细胞。在一些实施方案中，所述细胞是植物或真菌(包括但不限于酵母)细胞。细胞可以是，例如，培养的原代细胞、永生培养细胞或来自活检或组织样品的细胞，其在测定前任选地被培养和刺激从而分裂。

在一些实施方案中，所述样品包含分离的细胞核。用于分离细胞核的方法是本领域中已知的。参见，例如，Marzluff,W.F.,和Huang,R.C.C.,"TranscriptionofRNAinIsolatedNuclei(分离的细胞核中的RNA的转录)"inTranscriptionandTranslation:APracticalApproach(转录和翻译：实用方法),HamesB.D.和Higgens,S.J.(编辑)pp89-129(IRLPress,Oxford,UK,1984)；Greenberg,M.E.,和Bender,T.P.,IdentificationofNewlyTranscribedRNA(鉴定新转录的RNA),inCurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物学当前实验方案),Ausubel,F.M.,等(编辑)pp.4.10.1-4.10.11(JohnWileyandSons,NewYork,1997)；和Farrell,Jr.,R.E.,AnalysisofNuclearRNA(细胞核RNA分析),inRNAMethodologies:ALaboratoryGuideforIsolationandCharacterization(RNA方法学：分离和表征的实验室指南),Farrell,Jr.,R.E.(编辑)pp.406-437(AcademicPress,SanDiego,1998)。

在一些实施方案中，核酸分子或核酸分子的区域，或包含靶核酸分子或核酸分子的区域的亚级分(sub-fraction)，提取或分离自样品(例如，生物样品)。在一些实施方案中，核酸(例如，核酸分子或核酸分子的区域)的所述提取或分离基本上不破坏样品中核酸分子之间或核酸分子的区域之间的直接的或间接的相互作用(例如，经由与蛋白质复合)。当在本文中使用时，术语"基本上不破坏核酸分子之间或核酸分子的区域之间的直接的或间接的相互作用"是指在自样品的提取或分离后，相对于自样品的提取或分离前的核酸分子或核酸区域的物理结合，目标核酸分子之间或目标核酸分子区域(例如，要根据本文所述的方法检测的核酸分子或核酸区域)之间至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％以上的物理结合保持不变。在一些实施方案中，提取或分离破坏样品的直接或间接相互作用的程度可以通过将交联的对照样品与非交联的样品比较来测量和/或量化。化学交联方法是本领域中已知的。参见，例如，Steen和Jensen,"Analysisofprotein-nucleicacidinteractionsbyphotochemicalcross-linkingandmassspectrometry(通过光化学交联和质谱的蛋白-核酸相互作用的分析)"MassSpectromRev.(2002)21:163-82；Verdine和Normal,"Covalenttrappingofprotein-DNAcomplexes(蛋白-DNA复合物的共价捕获)"AnnuRevBiochem(2003)72:337-66；和ChemistryofProteinandNucleicAcidCross-LinkingandConjugation(蛋白和核酸交联和缀合的化学),第二版,Wong和Jameson,编辑,CRCPress(2011)。

在一些实施方案中，可以制备样品以促进或改善直接的或间接的物理相互作用的检测。例如，在一些实施方案中，所述样品可以被破碎、分馏、匀浆化或超声处理。样品可以按需要被破碎、分馏、匀浆化或超声处理。示例方法描述于Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物学当前实验方案)(1994)；Sambrook和Russell,"FragmentationofDNAbysonication(通过超声处理破碎DNA)"ColdSpringHarborProtocols(2006)；和Burden,"GuidetotheHomogenizationofBiologicalSamples(生物样品的匀浆化指南)"RandomPrimers(2008),1-14页。

在一些实施方案中，所述样品包含复合物中的核酸分子或核酸分子的区域以及一种或多种其他组分，例如，蛋白质，并且提供核酸的混合物的步骤包括在这样的条件下提供核酸的混合物以使得在所述混合物中蛋白质保持与所述核酸分子或所述核酸分子的区域结合。在一些实施方案中，在支持复合物中蛋白质与核酸结合的浓度下的盐(例如，NaCl或KCl)的存在下提取或分离核酸。在一些实施方案中，在不存在使蛋白质变性的试剂的情况下(例如，在不存在苯酚、硫氰酸胍或阴离子去污剂的情况下)提取或分离核酸。

在一些实施方案中，核酸分子或核酸分子的区域，或包含靶核酸分子或核酸分子的区域的亚级分，通过破坏或溶解细胞的细胞膜而提取或分离自包含一种或多种细胞的样品。术语"破坏"细胞膜，当在本文中使用时，是指降低细胞膜的完整性以使得细胞结构不保持完整。例如，将细胞膜与非离子去污剂接触将除去和/或溶解细胞膜。细胞膜可以按需要被破坏或溶解。作为非限制性实例，可以使用一种或多种非离子去污剂破坏细胞膜。示例性非离子去污剂包括，但不限于，NP40、Tween20和TritonX-100。

在一些实施方案中，在核酸的提取或分离前，对包含一种或多种细胞的样品进行渗透化处理。当在本文中使用时，术语"渗透化处理"是指降低细胞膜的完整性以允许核酸切割或修饰剂(例如，酶)进入细胞中。具有经渗透化处理的细胞膜的细胞通常将保持细胞膜以使得细胞的结构保持基本上完整。例如，可以在处理或操作细胞内部的核酸(例如，利用酶)前对细胞进行渗透化处理。细胞膜可以按需要被渗透化处理。作为非限制性实例，细胞膜可以使用一种或多种溶血性脂质(lysolipid)来渗透化处理。示例性的溶血性脂质包括，但不限于，溶血磷脂酰胆碱(在本领域中也被称为溶血卵磷脂)或单棕榈酰磷脂酰胆碱。多种溶血性脂质也被描述于，例如，WO2003/052095。备选地，电穿孔或基因枪(biolistic)方法可以用于渗透化处理细胞膜。多种电穿孔方法是本领域中公知的，包括，但不限于，描述于WO2000/062855中的那些。基因枪方法包括但不限于描述于美国专利号5,179,022中的那些.

在一些实施方案中，提供核酸还包括消化、切割或剪切核酸。在一些实施方案中，所述样品(例如，包含一种或多种细胞的样品)被渗透化处理，之后消化、切割或剪切核酸。核酸消化、切割或剪切可以按需要进行。作为非限制性实例，可以使用消化或切割核酸分子的酶。在一些实施方案中，所述酶是核糖核酸内切酶，或"RNA酶"。合适的RNA酶的实例包括，但不限于，RNA酶H(即，RNA酶H、RNA酶H1和RNA酶H2)和RNA酶A。使用的RNA酶可以包括自然存在的RNA酶、重组的RNA酶和修饰的RNA酶(例如，包含突变、插入或缺失的RNA酶)。在一些实施方案中，所述酶是核酶，即能够催化RNA的特异性切割的酶性RNA分子。合适的核酶包括自然存在的核酶和合成的核酶。参见，例如，Heidenreich等,NucleicAcidsRes.,23:2223-2228(1995)。在一些实施方案中，所述酶是切割或消化DNA的酶，或"DNA酶"。合适的DNA酶的实例包括，但不限于，微球菌核酸酶、S1核酸酶、P1核酸酶、绿豆核酸酶、DNA酶I和Bal31核酸酶。作为另一个非限制性实例，可以使用来超声处理仪(例如，超声处理设备，Diagenode，Denville，NJ)来剪切核酸(例如，DNA或RNA)。在一些实施方案中，利用切割或消化核酸分子的酶(例如，核酸酶)以非序列特异性的方式处理样品。在一些实施方案中，不用序列特异性限制性酶处理样品。在一些实施方案中，不用甲基化敏感性酶和/或不用甲基化试剂(例如，DNA甲基转移酶)处理样品。

在一些实施方案中，在不进行在前的操作或处理核酸(例如，消化、切割或剪切核酸)的步骤的情况下提取或分离来自样品的核酸。在一些实施方案中，随后操作或处理已经从样品中提取或分离的核酸，例如，通过消化、切割或剪切核酸，以促进核酸的检测。

在一些实施方案中，所述核酸纯化自样品中的其他组分。纯化程序可以用于分离包含核酸的样品的所需部分或用于将非所需部分从样品中除去。作为非限制性实例，包含增加比例的所需蛋白质(例如，与目标核酸形成复合物的蛋白质)、核酸或核酸-蛋白质复合物的样品可以从粗细胞中分离。在一些方面，例如，可以进行利用适当抗体的免疫沉淀以增加所需蛋白质的比例。可以例如使用与靶序列形成复合物的互补核酸序列来富集核酸序列，并且将其他序列与富集的靶序列分离。

基本上可以使用任何核酸纯化程序，只要其产生具有对于随后的检测步骤来说可接受的的纯度的核酸分子即可。例如，可以使用标准细胞溶解试剂来溶解细胞。任选地，可以使用蛋白酶(包括但不限于蛋白酶K)。核酸可以按需要从样品中分离。在一些实施方案中，使用苯酚/氯仿提取并且核酸随后被沉淀(例如，通过乙醇)和纯化。备选地，核酸可以在核酸结合柱上分离。

在一些实施方案中，在区室化步骤之前，将提取或分离的核酸重悬在溶液中。在一些实施方案中，要被区室化的混合物或溶液还包含一种或多种用于检测所述核酸分子或所述核酸分子的所述区域的试剂(例如，寡核苷酸探针、标记的寡核苷酸探针或其他本文所述的可检测试剂)、一种或多种缓冲剂(例如，含水缓冲剂)和/或一种或多种添加剂(例如，封闭剂或生物防腐剂)。

区室化

将包含要检测的核酸的混合物区室化到多个区室中。区室可以包括任何多种类型的区室，包括固体区室(例如，孔、管、微通道等)和液体区室(例如，油相内的小水滴)。在一些实施方案中，所述区室是小滴。在一些实施方案中，所述区室是微通道。用于区室化样品的方法和组合物被描述于例如公开的专利申请WO2010/036352、US2010/0173394、US2011/0092373和US2011/0092376中，所述申请中每个的全部内容通过引用结合于此。

在一些实施方案中，所述区室的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL、约50nL、约60nL、约70nL、约80nL、约90nL、0.1μl、约0.5μl、约1μl、约2μl、约3μl、约4μl、约5μl、约6μl、约7μl、约8μl、约9μl、约10μl、约15μl、约20μl、约25μl、约30μl、约40μl、约50μl、约60μl、约70μl、约80μl、约90μl、约100μl、约150μl、约200μl、约250μl、约300μl、约350μl、约400μl、约450μl或约500μl。在一些实施方案中，所述区室的平均体积为约0.1nl至约10nl、约0.5nl至约5nl、约1nl至约10nl、约1nl至约50nl、约5nl至约50nl、约10nl至约50nl、约10nl至约100nl、约50nl至约500nl、约0.1μl至约5μl、约0.5μl至约5μl、约0.5μl至约10μl、约1μl至约5μl、约1μl至约50μl、约10μl至约50μl、约10μl至约100μl、约50μl至约100μl、约50μl至约250μl、约100μl至约250μl、约100μl至约500μl或约250μl至约500μl。

在一些实施方案中，将包含核酸的混合物区室化到足够数目的区室中以使得能够将核酸由于紧邻所致的共定位与随机共定位相区别。在一些实施方案中，将包含核酸的混合物区室化到至少500个区室、至少1000个区室、至少2000个区室、至少3000个区室、至少4000个区室、至少5000个区室、至少6000个区室、至少7000个区室、至少8000个区室、至少10,000个区室、至少15,000个区室、至少20,000个区室、至少30,000个区室、至少40,000个区室、至少50,000个区室、至少60,000个区室、至少70,000个区室、至少80,000个区室、至少90,000个区室、至少100,000个区室、至少200,000个区室、至少300,000个区室、至少400,000个区室、至少500,000个区室、至少600,000个区室、至少700,000个区室、至少800,000个区室、至少900,000个区室、至少1,000,000个区室、至少2,000,000个区室、至少3,000,000个区室、至少4,000,000个区室、至少5,000,000个区室、至少10,000,000个区室、至少20,000,000个区室、至少30,000,000个区室、至少40,000,000个区室、至少50,000,000个区室、至少60,000,000个区室、至少70,000,000个区室、至少80,000,000个区室、至少90,000,000个区室、至少100,000,000个区室、至少150,000,000个区室或至少200,000,000个区室中。

在一些实施方案中，包含核酸的混合物通过将所述混合物等分到多个区室中而被区室化。在一些实施方案中，所述混合物被等分至多孔板(例如，48孔板、96孔板或384孔板)上的区室中。作为非限制性实例，所述混合物可以使用自动化系统如Freedom液体处理系统(TecanSystems,Inc.,SanJose,CA)来等分。

在一些实施方案中，包含核酸的混合物通过稀释被区室化。稀释可以通过对样品进行不同程度的物理稀释或通过改变各区室中的测定体积的虚拟稀释(virtualdilution)来实现。在一些实施方案中，产生两种以上尺寸的区室。例如，可以使用将所述混合物区室化成两种以上区室尺寸的设备，如产生至少两种不同尺寸的单分散小滴的小滴生成器、产生多分散小滴的乳液或具有用于区室化样品的至少两种体积的平板。

在一些实施方案中，足以将核酸由于紧邻所致的共定位与随机共定位相区别的区室的数目可以通过连续稀释确定。例如，在一些实施方案中，所述混合物被再分，一些再分后部分随后被进一步稀释，由此提供用于区别特异性共定位与随机共定位的机制。如果特定的再分后部分被稀释成更大数目的再分后部分，则由于核酸紧邻所致的共定位的数目应当保持相同而随机共定位的数目应当以由稀释因子和区室数目可预测的量下降。虽然由于核酸紧邻所致的共定位的频率也应当下降，由于核酸紧邻所致的共定位的频率仅以由稀释因子可预测的方式下降并且绝对量不下降，但是随机共定位将以更高的因子减少并且因此充当用于将核酸相互作用与随机共定位区别的机制。

在一些实施方案中，包含核酸的混合物使用有限稀释来区室化。使用有限稀释和PCR分析来量化核酸靶标的方法被描述于，例如，Sykes等,Biotechniques13:444-449(1992)中。简言之，在有限稀释中，对样品(例如，包含核酸的混合物)进行一系列连续稀释以产生稀释液系列。例如，可以在溶液(例如，含水缓冲液)中稀释包含核酸的混合物以形成第一稀释液，然后将第一稀释液稀释以形成第二稀释液，然后将第二稀释液稀释以形成第三稀释液，等等。如本文所述，将稀释液系列中的各稀释液区室化到多个区室中。然后对区室进行测定以确定不大可能随机发生区室中两个以上的无相互作用的分子的共定位的稀释水平。因此，在所述稀释水平检测核酸的共定位将指示核酸之间的紧邻(例如，直接的或间接的物理相互作用)。

小滴

在一些实施方案中，所述混合物通过小滴形成而被区室化到多个小滴中。在一些实施方案中，小滴包括乳液组合物，即，不可混溶的液体(例如，水和油)的混合物。在一些实施方案中，小滴是被不可混溶的载体液(例如，油)包围的小水滴。在一些实施方案中，小滴是被不可混溶的载体液(例如，水溶液)包围的小油滴。在一些实施方案中，本文所述的小滴相对稳定并且在两个以上小滴之间具有最小聚结(coalescence)。在一些实施方案中，小于0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的由样品产生的小滴与其他小滴聚结。乳液也可以具有有限的絮凝(分散相以薄片形式从悬浮液中出来的过程)。

在一些实施方案中，产生的小滴的体积基本上是均匀的。例如，在一些实施方案中，产生的小滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL、约50nL、约60nL、约70nL、约80nL、约90nL、约100nL、约0.2μL、约0.3μL、约0.4μL、约0.5μL、约0.6μL、约0.7μL、约0.8μL、约0.9μL、约1μL、约1.5μL、约2μL、约2.5μL、约3μL、约3.5μL、约4μL、约4.5μL、约5μL、约5.5μL、约6μL、约6.5μL、约7μL、约7.5μL、约8μL、约8.5μL、约9μL、约9.5μL、约10μL、约11μL、约12μL、约13μL、约14μL、约15μL、约16μL、约17μL、约18μL、约19μL、约20μL、约25μL、约30μL、约35μL、约40μL、约μL、约50μL、约60μL、约70μL、约80μL、约90μL、约100μL、约150μL、约200μL、约250μL、约300μL、约350μL、约400μL、约450μL或约500μL。

在一些实施方案中，所述小滴通过使油相流动通过包含要检测的核酸的含水样品而形成。在一些实施方案中，包含要检测的核酸的含水样品还包含缓冲溶液和一种或多种用于检测所述核酸的试剂(例如，用于扩增所述核酸的试剂，如寡核苷酸探针或标记的寡核苷酸探针或如本文所述的其他可检测试剂)。

油相可以包含氟化的底油(baseoil)，所述氟化的底油可以另外地通过与氟化的表面活性剂如全氟化聚醚结合而被稳定化。在一些实施方案中，所述底油包括HFE7500、FC-40、FC-43、FC-70中的一种或多种或另外的常见的氟化油。在一些实施方案中，油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方案中，阴离子含氟表面活性剂是AmmoniumKrytox(Krytox-AS)(KrytoxFSH的铵盐)或KrytoxFSH的吗啉基衍生物。Krytox-AS可以以约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)的浓度存在。在一些实施方案中，Krytox-AS的浓度为约1.8％。在一些实施方案中，Krytox-AS的浓度为约1.62％。KrytoxFSH的吗啉基衍生物可以以约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)的浓度存在。在一些实施方案中，KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度为约1.8％。在一些实施方案中，KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度为约1.62％。

在一些实施方案中，油相还包含用于调节油性质如蒸汽压、粘度或表面张力的添加剂。非限制性实例包括全氟辛醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸醇。在一些实施方案中，添加的1H,1H,2H,2H-全氟癸醇的浓度为约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)。在一些实施方案中，添加的1H,1H,2H,2H-全氟癸醇的浓度为约0.18％(w/w)。

在一些实施方案中，所述乳液被配制成产生具有液体状界面薄膜的高度单分散小滴，所述小滴可以通过加热而被转化为具有固体状界面薄膜的微胶囊；此种微胶囊可以充当能够保持其内容物通过温育期的生物反应器。向微胶囊形式的转化可以在加热时发生。例如，此种转化可以在大于约40°、50°、60°、70°、80°、90°或95℃的温度发生。在加热过程期间，液体或矿物油覆盖物可以用于防止蒸发。在加热前可以也可以不除去过量的连续相油。该生物相容性胶囊可以在宽范围的热和机械加工过程中不发生聚结和/或絮凝。

在转化后，微胶囊可以在约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40℃存储。在一些实施方案中，这些胶囊可用于生物医药应用，如大分子尤其是包含靶分子如核酸、蛋白质或两者的混合物的含水生物液体的稳定的、数字化封装；药物和疫苗递送；生物分子文库；临床成像应用；等等。

微胶囊区室可以抗聚结，尤其是在高温时。因此，所述胶囊可以以非常高的密度(例如，区室数目/单位体积)温育。在一些实施方案中，每mL可以温育多于100,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、2,500,000、5,000,000或10,000,000个区室。在一些实施方案中，所述微胶囊还包含其他组分如应用扩增核酸的试剂(例如，寡核苷酸探针或标记的寡核苷酸探针)。

检测

可以使用多种方法来检测和/或量化样品中核酸彼此紧邻的程度。在一些实施方案中，检测在相同的区室中两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域的存在包括扩增所述核酸分子或所述核酸分子的区域。在一些实施方案中，检测在相同的区室中两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域的存在包括对所述核酸分子或所述核酸分子的区域进行核苷酸测序。在一些实施方案中，检测在相同的区室中两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域的存在包括检测一种或多种与所述核酸分子或所述核酸分子的所述区域杂交或与所述核酸分子或所述核酸分子的区域特异性结合(例如，通过特异性结合至包含核酸的复合物(如蛋白质-核酸复合物)的组分)的试剂。

扩增

在一些实施方案中，所述检测步骤包括扩增所述核酸分子或所述核酸分子的区域。在一些实施方案中，扩增所述核酸分子或所述核酸分子的区域包括聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR或实时PCR。

如以下讨论的，定量扩增(包括，但不限于，实时PCR)方法允许确定在区室中共定位的核酸分子或核酸分子的区域的量，并且可以与多种对照一起使用以确定目标样品中核酸分子或核酸分子的区域的共定位的相对量，由此指示样品中的核酸是否彼此紧邻或彼此紧邻的程度。

定量扩增方法(例如，定量PCR或定量线性扩增)包括扩增核酸模板，直接地或间接地(例如，确定Ct值)确定扩增的DNA的量，然后基于扩增的循环的数目计算初始模板的量。使用反应的DNA基因座的扩增是公知的(参见美国专利号4,683,195和4,683,202；PCRPROTOCOLS:AGUIDETOMETHODSANDAPPLICATIONS(PCR实验方案：方法和应用指南)(Innis等编辑，1990))。典型地，使用PCR来扩增DNA模板。然而，备选的扩增方法已经被描述并且也可以被使用。定量扩增的方法被公开在，例如，美国专利号6,180,349；6,033,854；和5,972,602中，以及在，例如，Gibson等,GenomeResearch6:995-1001(1996)；DeGraves,等,Biotechniques34(1):106-10,112-5(2003)；DeimanB,等,MolBiotechnol.20(2):163-79(2002)中。扩增可以被"实时"监测。

在一些实施方案中，定量扩增是基于监测代表扩增(例如，PCR)反应的循环中的模板的拷贝的信号(例如，探针的荧光)。在PCR的最初的循环中，观察到非常低的信号，因为形成的扩增子的量不支持来自测定的可测的信号输出。在最初的循环后，当形成的扩增子的量增加时，信号强度增加至可测量水平并且在稍后的循环中当PCR进入非对数期时达到稳定水平。通过将信号强度对循环次数作图，由PCR反应获得可测信号的具体循环可以被推断出并且可以用于向回推算开始PCR前的靶标的量。由该方法确定的具体循环的数目典型地被称为循环阈值(Ct)。关于水解探针的示例性的方法被描述于，例如，Heid等GenomeMethods6:986-94(1996)。

一种用于检测扩增产物的方法是5'-3'核酸外切酶"水解"PCR测定(也被称为TaqMan^TM测定)(美国专利号5,210,015和5,487,972；Holland等,PNASUSA88:7276-7280(1991)；Lee等,NucleicAcidsRes.21:3761-3766(1993))。该测定通过扩增反应期间双标记的荧光探针(TaqMan^TM探针)的杂交和切割来检测特定PCR产物的积累。所述荧光探针由标记有荧光报告染料和猝灭染料两者的寡核苷酸组成。在PCR期间，当(并且仅当)该探针与被扩增的片段杂交时，其被DNA聚合酶的5'-核酸外切酶活性切割。探针的切割导致报告染料荧光强度的增加。

另一种依赖于使用能量转移的检测扩增产物的方法是由Tyagi和Kramer,NatureBiotech.14:303-309(1996)描述的"信标探针(beaconprobe)"方法，其也是美国专利号5,119,801和5,312,728的主题。该方法采用可以形成发夹结构的寡核苷酸杂交探针。在杂交探针的一端(5'端或3'端)上，存在供体荧光团，并且在另一端上存在受体部分。在Tyagi和Kramer方法的情况下，该受体部分是猝灭剂，即，受体吸收由供体释放的能量，但是本身不发荧光。因此，当信标处于开放构象时，供体荧光团的荧光是可检测的，而当信标处于发夹(闭合)构象时，供体荧光团的荧光被猝灭。当用于PCR时，与PCR产物的一条链杂交的分子信标探针处于开放构象并且检测到荧光，而未杂交的那些不发荧光(Tyagi和Kramer,NatureBiotechnol.14:303-306(1996))。作为结果，荧光的量将随着PCR产物量的增加而增加，并且因此可以用作PCR过程的量度。本领域技术人员将明白其他定量扩增方法也是可用的。

用于进行核酸的定量扩增的多种其他技术也是已知的。例如，一些方法采用一种或多种探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸的结构使得当所述一种或多种寡核苷酸与靶核酸杂交时产生荧光的变化。例如，一种这样的方法涉及是双荧光团法，其利用荧光共振能量转移(FRET)，例如，LightCycler^TM杂交探针，其中两个寡聚探针退火成扩增子。所述寡核苷酸被设计成以头-至-尾(head-to-tail)取向与间隔以与有效能量转移相容的一段距离的荧光团杂交。具有在与核酸结合或被整合到延伸产物中时发出信号的结构的标记的寡核苷酸的其他实例包括：Scorpions^TM探针(例如，Whitcombe等,NatureBiotechnology17:804-807,1999,和美国专利号6,326,145)、Sunrise^TM(或Amplifluor^TM)探针(例如，Nazarenko等,Nuc.AcidsRes.25:2516-2521,1997,和美国专利号6,117,635)，以及在没有猝灭剂的情况下形成产生减弱的信号的二级结构并且当与靶杂交时发出增强的信号的探针(例如，Lux探针^TM)。

核苷酸测序

在一些实施方案中，所述检测步骤包括对所述核酸分子或所述核酸分子的区域进行核苷酸测序。核苷酸测序的非限制性实例包括Sanger测序、毛细管阵列测序、热循环测序(Sears等,Biotechniques13:626-633(1992))、固相测序(Zimmerman等,MethodsMol.CellBiol.3:39-42(1992))、利用质谱如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS；Fu等,NatureBiotech.16:381-384(1998))的测序以及通过杂交的测序(Chee等,Science274:610-614(1996)；Drmanac等,Science260:1649-1652(1993)；Drmanac等,NatureBiotech.16:54-58(1998))。在一些实施方案中，可以使用"下一代测序"方法，例如但不限于，通过合成的测序(例如，HiSeq^TM、MiSeq^TM或GenomeAnalyzer，均可获自Illumina)、通过连接的测序(例如，SOLiD^TM，LifeTechnologies)、离子半导体测序(例如，IonTorrent^TM，LifeTechnologies)和焦磷酸测序(例如，454^TM测序，RocheDiagnostics)。在一些实施方案中，核苷酸测序包括高通量测序。在高通量测序中，使用多个模板和多个引物的平行测序反应允许快速测序基因组或大部分基因组。参见，例如，WO03/004690、WO03/054142、WO2004/069849、WO2004/070005、WO2004/070007、WO2005/003375、WO2000/006770、WO2000/027521、WO2000/058507、WO2001/023610、WO2001/057248、WO2001/057249、WO2002/061127、WO2003/016565、WO2003/048387、WO2004/018497、WO2004/018493、WO2004/050915、WO2004/076692、WO2005/021786、WO2005/047301、WO2005/065814、WO2005/068656、WO2005/068089、WO2005/078130，以及Seo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2004)101:5488-5493。

在一些实施方案中，核苷酸测序包括单分子实时(SMRT)测序。SMRT测序是这样一种方法，通过所述方法可以在单一DNA聚合酶分子催化与模板核酸链互补的荧光标记的核苷酸的整合的同时对其进行实时观察。SMRT测序方法是本领域中已知的并且最初由Flusberg等,NatureMethods,7:461-465(2010)描述，所述文献通过引用完整地结合于此。简言之，在SMRT测序中，检测核苷酸的整合，其为荧光脉冲，荧光的颜色确定所述核苷酸。当在聚合酶移位至DNA模板中的下一个碱基前与核苷酸的末端磷酸相连的荧光团被聚合酶切割时，脉冲结束。荧光脉冲表征为发射谱以及脉冲持续时间("脉冲宽度")和相继的脉冲间的间隔("脉冲间持续时间"或"IPD")。脉冲宽度是核苷酸结合后并且直至荧光团释放的所有动力学步骤的函数，而IPD是核苷酸结合和聚合酶移位的动力学的函数。因此，在SMRT测序中可以通过测量荧光脉冲来监测DNA聚合酶动力学。

除了测量各荧光标记的核苷酸(即，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶)的特征性荧光脉冲的差异以外，还可以测量未甲基化的碱基相对于甲基化碱基的差异。例如，与其未甲基化的对应物相比(例如，甲基化的腺苷与未甲基化的腺苷相比)，甲基化碱基的存在改变了甲基化碱基的IPD。此外，与其未甲基化的对应物相比(例如，甲基化的胞嘧啶与未甲基化的胞嘧啶相比)，甲基化碱基的存在改变了甲基化碱基的脉冲宽度，并且更进一步，不同的修饰具有不同的脉冲宽度(例如，与5-甲基胞嘧啶相比，5-羟甲基胞嘧啶具有更显著的偏移)。因此，在给定的语境中，各类型的未修饰的碱基和修饰的碱基具有基于其IPD与脉冲宽度的组合的独特的识别标志。SMRT测序的灵敏度可以通过优化溶液条件、聚合酶突变和利用核苷酸的动力学识别标志的算法以及帮助解析相邻的甲基胞嘧啶碱基的去卷积技术被进一步增强。

在一些实施方案中，核苷酸测序包括纳米孔测序。纳米孔测序是这样一种方法，通过所述方法多核苷酸或核酸片段在施加的电势下通过孔(如蛋白质孔)同时记录通过所述孔的离子电流的调节。纳米孔测序方法是本领域中已知的；参见，例如，Clarke等,NatureNanotechnology4:265-270(2009)，所述文献通过引用完整地结合于此。简言之，在纳米孔测序中，当单链DNA分子通过蛋白质孔时，通过由各碱基阻断所述孔的程度导致的电流振幅的特征性减小来登记序列中的各碱基。可以在静止链上并且通过充分减缓DNA移动的速率(例如，通过使用酶)或提高孔捕获DNA的比率(例如，通过突变蛋白质孔内的关键残基)来鉴定个体核碱基，也可以在移动的同时鉴定个体核碱基。

在一些实施方案中，纳米孔测序包括使用核酸外切酶来将个体核苷酸从DNA的一条链上释放，其中以释放的次序来鉴定碱基，并且使用与所述孔共价相连的接合体分子以便在DNA分子移动通过所述孔时允许连续的碱基检测。当核苷酸通过所述孔时，其表征为标志性残基电流和标志性接合体内停留时间，这使得可以在未甲基化的核苷酸之间进行区分。此外，在甲基化的核苷酸和相应的未甲基化的核苷酸之间观察到不同的停留时间(例如，与dCMP相比，5-甲基-dCMP具有更长的停留时间)，因此使得可以同时确定核苷酸序列和被测序的核苷酸是否被修饰。纳米孔测序的灵敏度可以通过优化盐浓度，调节施加的电势、pH和温度，或使核酸外切酶突变以改变其加工速率进一步被提高。

用于检测核酸的试剂

在一些实施方案中，所述检测步骤包括检测一种或多种与所述核酸分子或所述核酸分子的所述区域杂交或特异性结合与所述核酸分子或所述核酸分子的区域复合的组分的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是可检测试剂。

在一些实施方案中，所述方法包括将核酸与1、2、3、4、5或更多种试剂接触，其中各试剂与不同的核酸分子或核酸分子的区域杂交，以及检测所述1、2、3、4、5或更多种试剂的存在；由此检测样品中的核酸分子之间或核酸分子的区域之间的相互作用。在一些实施方案中，所述方法包括将核酸与至少两种试剂接触，其中第一试剂与第一核酸分子或核酸分子的第一区域杂交并且其中第二试剂与第二核酸分子或核酸分子的第二区域杂交；以及检测所述第一试剂和所述第二试剂的存在；由此检测样品中所述两个以上的所述核酸分子之间或核酸分子的两个以上的区域之间的相互作用。在一些实施方案中，所述第一试剂和所述第二试剂联合产生在不存在所述第一试剂和/或所述第二试剂的情况下不产生的信号。

在一些实施方案中，通过检测一种或多种特异性结合复合物中与核酸分子或核酸分子的区域特异性相关联的蛋白质的试剂来检测核酸。在一些实施方案中，所述试剂是特异性结合蛋白质的抗体。

在一些实施方案中，所述试剂包括可光学检测的试剂如荧光试剂、磷光试剂、化学发光试剂等。多种试剂(例如，染料、探针或指示剂)是本领域中已知的并且可以用于本发明。(参见，例如，Invitrogen,TheHandbook—AGuidetoFluorescentProbesandLabelingTechnologies(手册—荧光探针和标记技术指南),第十版(2005))。荧光试剂可以包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是荧光团。文献中报道了多种荧光团并且因此其是本领域技术人员已知的，并且许多可以容易地获得自生物技术工业的商业供应商。荧光团的文献来源包括Cardullo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8790-8794(1988)；Dexter,D.L.,J.ofChemicalPhysics21:836-850(1953)；Hochstrasser等,BiophysicalChemistry45:133-141(1992)；Selvin,P.,MethodsinEnzymology246:300-334(1995)；Steinberg,I.Ann.Rev.Biochem.,40:83-114(1971)；Stryer,L.Ann.Rev.Biochem.,47:819-846(1978)；Wang等,TetrahedronLetters31:6493-6496(1990)；Wang等,Anal.Chem.67:1197-1203(1995)。荧光团的非限制性实例包括青色素、荧光素(例如，5'-羧基荧光素(FAM)、OregonGreen和Alexa488)，罗丹明(例如，N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC))、曙红、香豆素、芘、四吡咯、芳甲烷(arylmethine)、嗪、聚合物点和量子点。

在一些实施方案中，所述试剂是嵌入剂。嵌剂在被嵌入到双链核酸中时产生信号。示例性的试剂包括SYBRGREEN^TM、SYBRGOLD^TM和EVAGREEN^TM。

在一些实施方案中，所述试剂是分子信标寡核苷酸探针。如上所述，"信标探针"法依赖于使用能量转移。该方法采用可以形成发夹结构的寡核苷酸杂交探针。在杂交探针的一端(5'端或3'端)上，存在供体荧光团，并且在另一端上存在受体部分。在Tyagi和Kramer方法的情况下，该受体部分是猝灭剂，即，受体吸收由供体释放的能量，但是本身不发荧光。因此，当信标处于开放构象时，供体荧光团的荧光是可检测的，而当信标处于发夹(闭合)构象时，供体荧光团的荧光被猝灭。

在一些实施方案中，所述试剂是放射性同位素。放射性同位素包括发出γ射线、正电子、β和α粒子以及X射线的放射性核素。合适的放射性核素包括但不限于²²⁵Ac、⁷²As、²¹¹At、¹¹B、¹²⁸Ba、²¹²Bi、⁷⁵Br、⁷⁷Br、¹⁴C、¹⁰⁹Cd、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、¹⁸F、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、³H、¹⁶⁶Ho、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³⁰I、¹³¹I、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹³N、¹⁵O、³²P、³³P、²¹²Pb、¹⁰³Pd、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁴⁷Sc、¹⁵³Sm、⁸⁹Sr、⁹⁹mTc、⁸⁸Y和⁹⁰Y。

在一些实施方案中，所述试剂是酶，并且所述试剂与核酸的杂交或特异性结合通过检测由所述酶产生的产物来检测。合适的酶的实例包括，但不限于，脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。例如，辣根-过氧化物酶检测系统可以与发色底物四甲基联苯胺(TMB)一起使用，四甲基联苯胺在过氧化氢存在下产生可在450nm检测的可溶产物。碱性磷酸酶检测系统可以与发色底物磷酸对硝基苯酯一起使用，磷酸对硝基苯酯产生可容易地在405nm检测的可溶产物。β-半乳糖苷酶检测系统可以与发色底物邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)一起使用，邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷产生在410nm可检测的可溶产物。脲酶检测系统可以与底物如脲-溴甲酚紫(SigmaImmunochemicals；St.Louis,MO)一起使用。

在一些实施方案中，所述试剂是标记有可检测试剂(例如，如本文所述的光学试剂或放射性同位素)的寡核苷酸。所述寡核苷酸与目标核酸分子或核酸分子区域杂交。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述寡核苷酸的长度为至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个核苷酸。

可检测试剂可以使用多种检测设备中的任一种来检测。示例性的检测方法包括放射性检测、吸光度检测(例如，荧光或化学发光)或质谱检测。作为非限制性实例，荧光试剂可以使用配备有产生可由荧光剂吸收的激发光的模块以及检测由荧光剂发出的光的模块的检测设备来检测。

在一些实施方案中，区室化的样品中的可检测试剂可以被大量检测。例如，区室化的样品(例如，小滴)可以被区室化到平板如96孔板或384孔板的一个或多个孔中，并且信号(例如，荧光信号)可以使用平板读数器来检测。

在一些实施方案中，检测仪还包括针对区室化的样品(例如，小滴)的处理能力，其中个体区室化样品进入所述检测仪，进行检测，然后离开所述检测仪。在一些实施方案中，区室化的样品(例如，小滴)可以在区室化的样品流动的同时被连续检测。在一些实施方案中，区室化的样品(例如，小滴)被排布在表面上并且检测仪相对于所述表面移动，从而检测在包含单个区室的各位置处的一个或多个信号。检测仪的实例提供在WO2010/036352中，其内容通过引用结合于此。在一些实施方案中，区室化的样品中的可检测试剂可以在不使区室化的样品流动的情况下被连续检测(例如，使用腔室载玻片(chamberslide))。

在获得荧光检测数据后，通用计算机系统(在本文中被称为"主机")可以用于存储和处理所述数据。计算机可执行逻辑可以用于执行功能如背景信号减除、靶和/或参比序列的分配以及数据量化。主机可用于显示、存储、找回或计算来自分子概况分析(molecularprofiling)的诊断结果；存储、找回或计算来自表达分析的原始数据；或显示、存储、找回或计算可用于本发明的方法的任何样品或患者信息。

主机可以配置有许多不同的硬件组件并且可以被制成多种尺寸和样式(例如，桌面PC、膝上型电脑、平板PC、手持式计算机、服务器、工作站、大型机)。可以包括标准组件如监视器、键盘、磁盘驱动器、CD和/或DVD驱动器等。当主机与网络相连时，连接可以经由任何合适的运输介质(例如，有线的、光学的和/或无线的介质)和任何合适的通信协议(例如，TCP/IP)提供；主机可以包括合适的联网硬件(例如，调制解调器、Ethernet卡、WiFi卡)。主机可以运行多种操作系统中的任一种，包括UNIX、Linux、MicrosoftWindows、MacOS或任何其他操作系统。

用于执行本发明的方面的计算机代码可以多种语言写成，所述语言包括PERL、C、C++、Java、JavaScript、VBScript、AWK或任何其他可以在主机上执行或可以被编译成在主机上执行的脚本或编程语言。代码也可以低级语言(如汇编语言或机器语言)写成或分配。

主机系统有利地提供界面，用户经由所述界面可以控制工具的操作。在本文所述的实例中，软件工具作为脚本被执行(例如，使用PERL)，脚本的执行可以由用户从操作系统如Linux或UNIX的标准命令行界面启动。本领域技术人员将理解当适当时可以使命令适应于操作系统。在其他实施方案中，可以提供图形用户界面，这允许用户使用指向设备来控制操作。因此，本发明不限于任何特定的用户界面。

结合本发明的多种特征的脚本或程序可以被编码在多种计算机可读介质上用于存储和/或传输。合适介质的实例包括磁盘或磁带、光学存储介质如压缩光盘(CD)或DVD(数字通用盘)、闪存和适应于经由遵守多种协议(包括Internet)的有线、光学和/或无线网络传输的载体信号。

数字分析

在一些实施方案中，通过区室化包含核酸的混合物并鉴定包含共定位的核酸的区室，可以使用数字读出测定，例如，数字分析，来量化样品中的核酸紧邻的程度。通常，数字分析的过程包括对于样品的各区室确定对于要被检测的核酸分子或核酸分子的区域的存在来说区室是阳性的还是阴性的。如果在区室中检测到各核酸分子或核酸分子的区域，则所述区室是"阳性的"。在一些实施方案中，通过检测来自核酸分子或核酸分子的区域的扩增产物的存在(例如，通过检测与扩增反应或产物相关联的荧光信号)，或通过检测与核酸分子或核酸分子的区域杂交的试剂或在复合物中与核酸分子或核酸分子的区域结合的试剂的存在来在区室中检测各核酸分子或核酸分子的区域。如果在区室中没有检测到核酸分子或核酸分子的区域中的至少一个，则区室是"阴性的"。

在一些实施方案中，使用能够检测一种或多种信号的检测器来分析各区室是否存在核酸分子或核酸分子的区域。例如，在一些实施方案中，使用双色读数器(荧光检测器)。阳性计数的区室的分数可以使确定核酸分子或核酸分子的区域的共定位的绝对量成为可能。

在对样品的各区室确定了二元"是-否"结果后，使用基于泊松统计(Poissonstatistics)的算法来分析区室的数据以量化样品中核酸分子或核酸分子的区域的共定位的量。用于量化核酸的浓度或量的统计方法描述于，例如，WO2010/036352中，其通过引用完整地结合于此。

在一些实施方案中，将已经分析了各区室是否存在所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域的目标样品与对照进行比较以确定来自目标样品的阳性区室的数目是否大于来自对照样品的阳性区室的数目。在一些实施方案中，对照样品是这样的样品，其已被处理从而从所述样品中除去了蛋白质或破坏了所述样品中蛋白质-核酸相互作用(例如，通过使用缓冲剂、酶或热失活)。例如，在一些实施方案中，对照样品是这样的样品，其中核酸已被提取或分离到高盐缓冲液中从而破坏了核酸-蛋白质相互作用。在一些实施方案中，当样品的阳性区室的数目相对于已被处理从而除去了样品中的蛋白质或破坏了样品中的蛋白质-核酸相互作用的对照样品所获得的阳性区室的数目高至少两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍以上时，确定所述样品中的所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域由于间接相互作用(例如，经由与蛋白质复合)而彼此紧邻。

III.试剂盒

在另一方面，提供用于确定样品中的两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域是否彼此紧邻的试剂盒。本发明的试剂盒可以包括，例如，如本文中所述的用于检测核酸相邻性的试剂(例如，一种或多种用于对核酸进行测序的试剂，一种或多种用于在数量上扩增核酸的试剂，或一种或多种与核酸杂交或特异性结合与核酸形成复合物的组分的可检测试剂，例如，寡核苷酸探针，标记的寡核苷酸探针，或本文所述的其他可检测试剂)。所述试剂盒可以任选地包括书面说明或电子说明(例如，在CD-ROM或DVD上)。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于破坏、溶解或渗透化处理细胞膜的试剂(例如，溶血性脂质或非离子去污剂)。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于消化、切割或剪切核酸的试剂(例如，酶如RNA酶或DNA酶)。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于提取和/或纯化核酸的试剂和/或材料(例如，细胞溶解试剂或核酸结合柱)。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于区室化包含核酸的混合物的试剂和/或材料。

所述试剂盒还可以包含一种或多种对照样品。示例性的对照样品包括，例如，已知对于直接的或间接的核酸物理相互作用为阳性的样品，或已知对于直接的或间接的核酸物理相互作用为阴性的样品。

IV.实施例

提供以下实施例用以说明而非限定所要求保护的发明。

实施例1：检测核酸区域之间的相互作用

该实施例提供用于确定两个核酸区域(例如，DNA)是否直接或间接地在物理上彼此相互作用的方法。描绘该实施例的示意图提供在图1中。在样品1中，DNA区域A和B彼此不相邻并且其之间没有相互作用。在样品2中，DNA区域A和B通过与其结合的蛋白质而间接地相互作用；因此，在样品2中，DNA区域A和B是将作为一体分离的较大的蛋白质:DNA复合物的组分。

如果样品被区室化以使得(a)区室的数目远大于A和BDNA分子的数目并且(b)单个区室的物理尺寸远大于包含A和BDNA分子的蛋白质:DNA复合物，则在样品1中，在大部分情况下，DNA区域A和B将被分入不同的区室中。相比之下，因为在样品2中分子A和B是同一蛋白质:DNA复合物的部分，所以在大部分情况下，DNA区域A和B将被分在相同的区室中。

如果之后检测个体区室以确定其是否含有DNA区域A和/或B，则来自样品1的结果将显示DNA区域A和B大多在分开的区室中被发现，而对于样品2，DNA区域A和B将大多在相同的区室中被发现。由该数据，可以推断在样品1中DNA区域A和B在物理上彼此不相关联，而在样品2中DNA区域A和B紧密结合。这些结果可以提供关于复杂核酸结构和相互作用的有价值的信息。

可以理解的是，本文中所述的实施例和实施方案仅用于说明目的并且在其基础上本领域技术人员将获得多种改进或改变的启示并且所述改进或改变将包括在本申请的精神和范围和所附权利要求的范围内。本文中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用完整地结合于此。

Claims (36)

1.一种确定样品中的两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域是否彼此紧邻的方法，所述方法包括：

提供核酸的混合物；

将所述混合物区室化到足够数目的区室中以致能够将核酸分子由于紧邻所致的在区室中的共定位与随机共定位相区别；以及

检测在相同的区室中两个以上的核酸分子或一个核酸分子的两个以上的区域的存在；由此确定所述样品中的所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域彼此紧邻。

2.权利要求1所述的方法，其中检测两个以上的核酸分子。

3.权利要求1所述的方法，其中检测一个核酸分子的两个以上的区域。

4.权利要求1所述的方法，其中所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域由于直接相互作用而彼此紧邻。

5.权利要求1所述的方法，其中所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域由于分子的复合物中的间接相互作用而彼此紧邻。

6.权利要求5所述的方法，其中所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域由于核酸-蛋白质复合物中的间接相互作用而彼此紧邻。

7.权利要求1所述的方法，其中所述核酸是双链的。

8.权利要求1所述的方法，其中所述核酸是单链的。

9.权利要求1所述的方法，其中所述核酸是DNA。

10.权利要求1所述的方法，其中所述核酸是RNA。

11.权利要求1所述的方法，其中所述方法包括分析各区室是否存在所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域。

12.权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤包括扩增所述核酸分子或所述核酸分子的所述区域。

13.权利要求12所述的方法，其中所述扩增步骤包括PCR、定量PCR或实时PCR。

14.权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤包括对所述核酸分子或所述核酸分子的所述区域进行核苷酸测序。

15.权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤包括检测与所述核酸分子或所述核酸分子的所述区域杂交的一种或多种试剂。

16.权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种试剂是荧光团。

17.权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：

将所述核酸与至少两种试剂接触，其中第一试剂与第一核酸分子或核酸分子的第一区域杂交并且其中第二试剂与第二核酸分子或核酸分子的第二区域杂交；以及

检测所述第一试剂和所述第二试剂的存在；由此确定所述样品中的所述两个以上的核酸分子或所述核酸分子的两个以上的区域彼此紧邻。

18.权利要求17所述的方法，其中所述第一试剂和所述第二试剂联合产生在不存在所述第一试剂、不存在所述第二试剂或两者都不存在的情况下不产生的信号。

19.权利要求1所述的方法，其中所述提供步骤包括从所述样品分离所述核酸。

20.权利要求19所述的方法，其中所述分离基本上不破坏所述样品中的核酸分子之间或核酸分子的区域之间的直接的或间接的相互作用。

21.权利要求19所述的方法，其中所分离的核酸被重悬在溶液中。

22.权利要求21所述的方法，其中所分离的核酸被重悬在溶液中，所述溶液包含一种或多种用于检测所述核酸分子或所述核酸分子的所述区域的试剂。

23.权利要求22所述的方法，其中所述一种或多种试剂是寡核苷酸探针。

24.权利要求1所述的方法，其中所述样品是来自动物、植物、细菌或病毒来源的提取物。

25.权利要求1所述的方法，其中所述样品包含一种或多种细胞。

26.权利要求25所述的方法，其中所述提供步骤包括破坏或溶解所述一种或多种细胞的细胞膜。

27.权利要求25所述的方法，其中所述提供步骤包括对所述一种或多种细胞的细胞膜进行渗透化处理。

28.权利要求1所述的方法，其中所述样品包含分离的细胞核。

29.权利要求1所述的方法，其中所述提供步骤包括所述核酸的核酸剪切或核酸酶消化。

30.权利要求1所述的方法，其中所述提供步骤包括从所述样品中的其他组分中纯化所述核酸。

31.权利要求1所述的方法，其中所述区室化步骤包括稀释所述混合物。

32.权利要求31所述的方法，其中所述稀释包括依次稀释所述混合物以产生多种稀释液并且将所述多种稀释液中的每种区室化到多个区室中。

33.权利要求1所述的方法，其中所述区室化步骤包括将所述混合物分配到小滴中。

34.权利要求33所述的方法，其中所述小滴被不可混溶的载体液包围。

35.权利要求1所述的方法，其中所述区室化步骤包括将所述混合物分配到微胶囊中。

36.权利要求1所述的方法，其中所述提供步骤包括在这样的条件下提供所述核酸的混合物以致蛋白质保持与所述混合物中的所述核酸分子或所述核酸分子的区域结合。