ES2788948T3 - Preparación de muestras para la amplificación de ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

Un método para preparar una muestra para la amplificación de bibliotecas y la amplificación posterior que comprende las siguientes etapas: (a) en una muestra celular proporcionada que contiene ácido nucleico; (b) lisar las células de la muestra con un reactivo de lisis para liberar el ácido nucleico del interior de las células de la muestra celular, formando así un lisado; y (c) amplificar el ácido nucleico de las muestras lisadas para formar ácidos nucleicos amplificados; (d) exponer los ácidos nucleicos amplificados a una superficie sólida con cebadores de amplificación inmovilizados, inmovilizando así los ácidos nucleicos amplificados en la superficie sólida; y (e) amplificar clonalmente los ácidos nucleicos amplificados inmovilizados en la superficie sólida para generar grupos; en donde no hay purificación del ácido nucleico del lisado antes de comenzar la etapa de amplificación (c); y en donde la amplificación del ácido nucleico en la etapa (c) comprende tagmentación.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación de muestras para la amplificación de ácidos nucleicos

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a métodos para preparar muestras para la posterior amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN), métodos que son más simples de realizar que los métodos existentes. En particular, la presente invención se refiere a métodos en los que no se requiere purificar el ácido nucleico (por ejemplo, ADN) de una muestra antes de la amplificación.

Antecedentes de la invención

Los métodos tradicionales de amplificación de ADN requieren típicamente que se obtenga el ADN purificado antes de las etapas de amplificación. El procedimiento de purificación típicamente requiere la digestión enzimática o la lisis de las células en una muestra celular, seguido de una o más etapas de separación para separar el ADN de los restos celulares, que pueden incluir una o más etapas de lavado y la elución final del ADN purificado en un tubo listo para usar en un procedimiento de amplificación (tal como PCR). El procedimiento a menudo dura más de 30 minutos, típicamente 40 minutos o más.

Recientemente, Sigma ha desarrollado el llamado "Kit para PCR de sangre Extract-N-Amp™", que contiene los reactivos necesarios para extraer el ADN genómico del hospedante de la sangre completa y amplificar los objetivos de interés por PCR. Este sistema de extracción reduce la necesidad de purificación, extracción orgánica, centrifugación, calentamiento, filtración o precipitación con alcohol. El kit también incluye una mezcla PCR Ready, especialmente formulada para la amplificación directamente del extracto. Esta formulación utiliza un arranque en caliente basado en anticuerpos, para la amplificación específica. El ADN genómico se extrae de 10 pl de sangre completa simplemente añadiendo la Solución de extracción (que parece que es hidróxido de potasio) e incubando durante 5 minutos a temperatura ambiente. La solución de neutralización se añade al extracto para contrarrestar las sustancias inhibidoras antes de la PCR. Luego se añade una porción del extracto de ADN a la mezcla de PCR especialmente formulada.

El documento WO 2013/131962 A1 describe un método para usar transposición para mejorar los métodos de secuenciación de moléculas de ARN. Se describe un método para marcar dúplex de ácidos nucleicos, tal como dúplex de ADN:ARN o dúplex de ADN:ADN. El método incluye los etapas de proporcionar una transposasa y una composición de transposones, proporcionar uno o más dúplex de ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte y poner en contacto la transposasa y la composición de transposones con el uno o más dúplex de ácidos nucleicos en condiciones en las que el uno o más dúplex de ácidos nucleicos y la composición de transposones experimentan una reacción de transposición para producir uno o más dúplex de ácidos nucleicos marcados, en donde la composición de transposones comprende una molécula de ácido nucleico bicatenario que comprende una cadena transferida y una cadena no transferida.

Es un objeto de la presente invención proporcionar métodos de preparación de muestras que no requieren purificación de ADN antes de la amplificación. Preferiblemente, esos métodos requieren solo reactivos simples, lo que reduce el tiempo y la carga de costes para las personas que realizan las preparaciones.

Sumario de la invención

En una realización de la presente invención, se proporciona un método para preparar una muestra para la amplificación de bibliotecas y la amplificación posterior que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar una muestra celular que contiene ácido nucleico;

(b) lisar las células de la muestra con un reactivo de lisis para liberar el ácido nucleico del interior de las células de la muestra celular, formando así un lisado; y

(c) amplificar el ácido nucleico de las muestras lisadas para formar ácidos nucleicos amplificados;

(d) exponer los ácidos nucleicos amplificados a una superficie sólida con cebadores de amplificación inmovilizados, inmovilizando así los ácidos nucleicos amplificados en la superficie sólida; y

(e) amplificar clonalmente los ácidos nucleicos amplificados inmovilizados en la superficie sólida para generar grupos;

en donde no hay purificación del ácido nucleico del lisado antes de comenzar la etapa de amplificación (c); y

en donde la amplificación del ácido nucleico en la etapa (c) comprende la tagmentación.

Preferiblemente el ácido nucleico es ADN.

La muestra puede ser una muestra clínica o no clínica.

Preferiblemente, la muestra es una muestra de sangre.

Preferiblemente, la muestra de sangre es una muestra de sangre completa o una muestra de sangre seca.

En un método descrito en el presente documento, la muestra se toma de un cultivo. En otro método descrito en el presente documento, la muestra se toma de un cultivo microbiológico (p. ej., un hemocultivo).

La muestra puede ser una muestra no sanguínea, tal como una muestra de tejido (p. ej., tumor, biopsia), un aspirado, etc.

Preferiblemente, el reactivo de lisis es agua, preferiblemente agua purificada/destilada.

Preferiblemente el reactivo de lisis no es agua. Los ejemplos pueden incluir detergentes, un detergente lítico no desnaturalizante, ácidos, bases, enzimas.

La muestra y el reactivo de lisis se pueden mezclar entre sí para lograr una distribución más uniforme.

Opcionalmente, se añade además una enzima al lisado con el fin de alterar la estructura del ADN. Preferiblemente la enzima es proteinasa K.

Opcionalmente, hay una etapa de neutralización después de la lisis de las células con el reactivo de lisis para inactivar el reactivo de lisis si es necesario. Preferiblemente, esta etapa de neutralización es anterior a la etapa de amplificación (c). En algunos aspectos, la etapa de neutralización puede considerarse como parte de un período de incubación. También se puede llevar a cabo la misma etapa de neutralización o una adicional con el fin de neutralizar cualquier otro agente en el lisado que pueda interferir con los etapas de amplificación subsiguientes, tales como la proteinasa K cuando la tagmentación se va a llevar a cabo como parte del procedimiento de amplificación.

Opcionalmente, hay un período de incubación después de combinar la muestra y el reactivo de lisis. El período de incubación debería ser suficiente para permitir la lisis de una parte, preferiblemente la mayoría o sustancialmente todas o todas las células en la muestra, incluyendo sus membranas celulares (y preferiblemente incluyendo membranas nucleares), de modo que el ácido nucleico (p. ej., ADN) de la célula se vuelve accesible para una amplificación adecuada. Si bien la incubación puede ocurrir a temperaturas superiores a la temperatura ambiente, la incubación no implica necesariamente que se use una temperatura elevada. La incubación puede ocurrir a temperatura ambiente o alrededor de esta, o a menos de la temperatura ambiente. Los tiempos de incubación pueden variar desde un par de segundos, p. ej. aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 segundos, a una cantidad de minutos, p. ej. aproximadamente 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10 minutos. Pueden requerirse períodos de incubación más largos dependiendo de la muestra y/o reactivo de lisis, tales como aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 minutos. También se permiten intervalos de tiempos de incubación, que implican una combinación de cualquiera de los tiempos mencionados anteriormente como límites inferior y superior, respectivamente (p. ej., aproximadamente 0.5-10 minutos, aproximadamente 1-5 minutos, aproximadamente 2-5 minutos, aproximadamente 1-8 minutos, etc.).

En los métodos descritos en el presente documento, las etapas de lisis de la muestra y amplificación del ácido nucleico contenido en la misma, se llevan a cabo en una reacción en un solo recipiente.

El lisado formado a partir de la lisis de las células puede comprender todos los contenidos y fragmentos de las membranas celulares, etc., producidos cuando la célula se lisa, tales como p. ej. el citoplasma y sus componentes. En el contexto de la presente descripción, el lisado también puede considerarse como que es el contenido de la célula lisada, excluyendo elementos tales como fragmentos de membrana celular y restos celulares más grandes (tales como orgánulos, etc. (que, p. ej., han escapado de la lisis durante la etapa de lisis)). En otras palabras, el lisado puede comprender el citosol de la célula, junto con lípidos, proteínas y ácidos nucleicos.

Por la expresión "no hay purificación del ácido nucleico del lisado antes de comenzar la etapa de amplificación (c)" se entiende que el ácido nucleico (p. ej., ADN) no se aísla o separa del lisado antes de iniciar el procedimiento de amplificación (por supuesto, el procedimiento de amplificación en sí mismo puede comprender etapas de purificación del ácido nucleico como parte del procedimiento de amplificación). Sin embargo, no se pretenden limitar las etapas adicionales que se llevan a cabo para alterar o modificar el ácido nucleico (p. ej., el ADN) o su estructura terciaria después de la lisis y antes de la amplificación con el fin de que el procedimiento de amplificación pueda llevarse a cabo con éxito.

En los métodos descritos en la presente memoria, la cuantificación de la cantidad de ADN en el lisado se realiza antes de la etapa de amplificación.

En realizaciones adicionales de la presente invención, se secuencia el ADN amplificado para determinar su secuencia. Esto puede hacerse por cualquier método conocido en la técnica. Preferiblemente, se secuencia por secuenciación de alto rendimiento, tal como una secuencia por protocolo de síntesis.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de método de preparación de una muestra de sangre completa para la amplificación de ADN dirigida;

La Figura 2 muestra un gráfico de grupos que pasan el filtro para amplicones generados por amplificación de ADN dirigida de una muestra de sangre completa preparada de acuerdo con el método de la Figura 1;

Las Figuras 3A y 3B muestran un gráfico del tamaño del amplicón y un gráfico del porcentaje de contenido de GC, respectivamente, de un ensayo de amplificación de ADN dirigida realizado en una muestra de sangre completa preparada por dilución con agua;

La Figura 4 muestra una tabla de datos de las mediciones de secuenciación para el ensayo de amplificación de ADN dirigida de las Figuras 3A y 3B;

La Figura 5 muestra paneles de grupos generados a partir de amplicones generados directamente a partir de una muestra de sangre completa por amplificación de ADN dirigida;

La Figura 6 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método para preparar una muestra de sangre completa para la construcción de una biblioteca de ADN tagmentado (Nextera);

Las Figuras 7A y 7B muestran un gráfico de barras de la profundidad de secuenciación por cromosoma y un gráfico de la distribución de tamaños, respectivamente, de una biblioteca de ADN tagmentado preparada según el método de la Figura 6;

La Figura 8 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método de preparación de una muestra FFPE para amplificación dirigida y secuenciación posterior;

La figura 9A muestra un gráfico de barras de la medición de la puntuación Q y una tabla de datos de mediciones de secuenciación para amplicones generados a partir de ADN preparado a partir de una muestra FFPE de tumor de colon según el método de la figura 8;

La Figura 9B muestra un gráfico de barras de la medición de la puntuación Q y una tabla de datos de mediciones de secuenciación para amplicones generados a partir de ADN preparado a partir de una muestra FFPE de tumor de colon usando un kit de purificación de ADN QiaAmp;

Las Figuras 10A y 10B muestran una tabla de datos de mediciones de secuenciación y un gráfico de grupos de amplicones para el ADN preparado por QiaAmp y el ADN preparado por QuickExtract de las Figuras 9A y 9B; y Las Figuras 11A y 11B muestran un gráfico del tamaño de amplicones y un gráfico del porcentaje de contenido de GC, respectivamente, a partir de la amplificación dirigida directa de un corte de FFPE (sin incubación); y

La Figura 12 ilustra un ejemplo de un método de secuenciación a partir de manchas de sangre seca;

Las Figuras 13A (una tabla de datos de mediciones de secuenciación) y 13B (un gráfico del tamaño de amplicones y un gráfico del porcentaje de contenido de GC) muestran los resultados de la secuenciación de la Figura 12; y La Figura 14 ilustra un ejemplo de un método de tagmentación y secuenciación de manchas de sangre incluyendo el panel superior una etapa de lavado en agua y omitiendo el panel inferior la etapa de lavado en agua; y

Las Figuras 15A (una tabla de datos de mediciones de secuenciación) y 15B (gráficos que muestran el tamaño de insertos de la biblioteca (arriba) y la cobertura por cromosoma (abajo) muestran los resultados de la secuenciación de la Figura 14.

La Figura 16 muestra una tabla de datos de mediciones de secuenciación (arriba) y un gráfico que muestra la profundidad de secuenciación por cromosoma (abajo) para un método de preparación de muestra, método para preparar una muestra de sangre completa para la construcción de una biblioteca de ADN tagmentado (Nextera) llevada a cabo de acuerdo con el flujo de trabajo ilustrado en la Figura 6.

La Figura 17 muestra una tabla de datos de mediciones de secuenciación (arriba) y un gráfico que muestra la profundidad de secuenciación por cromosoma (abajo) para un método de preparación de muestra, método para preparar una muestra de sangre completa para la construcción de una biblioteca de ADN tagmentado (Nextera) llevado a cabo de acuerdo con el flujo de trabajo ilustrado en la Figura 6, pero usando la tagmentación basada en perlas para la etapa de tagmentación.

La Figura 18 muestra una tabla de datos de mediciones de secuenciación (arriba) y un gráfico que muestra la profundidad de secuenciación por cromosoma (abajo) para un método de preparación de muestra, método para preparar una biblioteca de ADN tagmentado (Nextera) llevado a cabo enjuagando una mancha de sangre seca en agua, seguido de tagmentación (Nextera).

La Figura 19 muestra una tabla de datos de mediciones de secuenciación para tres muestras de BBN (BBN1,2, 3) en comparación con las mediciones de secuenciación de los controles de ADNg purificados.

La Figura 20 es un gráfico que muestra la cobertura para paneles de genes de interés de los Trastornos genéticos comunes y la red de pruebas genéticas del Reino Unido (UKGTN) para muestras de sangre secuenciadas usando BBN, manchas de sangre seca y ADNg de control. Se muestran los valores medianos (dos paneles superiores) y la desviación estándar (panel inferior).

La Figura 21 es un gráfico que compara la precisión y la exhaustividad para la concordancia de SNP para muestras de sangre secuenciadas usando BBN, manchas de sangre seca y ADNg de control.

La Figura 22 muestra flujos de trabajo de preparación de muestras para preparar una biblioteca de ADN a partir de una muestra de sangre completa utilizando el método TruSeq Nano estándar o modificaciones del mismo.

La Figura 23 es un gráfico que muestra el perfil de sesgo de GC de las bibliotecas preparadas de acuerdo con los flujos de trabajo ilustrados en la Figura 22.

La Figura 24 muestra gráficos que comparan la diversidad de bibliotecas (panel izquierdo) y la eficiencia de secuenciación (panel derecho) de bibliotecas preparadas de acuerdo con los flujos de trabajo ilustrados en la Figura 22. La Figura 25 muestra los flujos de trabajo de preparación de muestras para preparar una biblioteca de ADN a partir de una muestra FFPE utilizando modificaciones del flujo de trabajo expuesto en la Figura 8.

La Figura 26 es una tabla de datos que compara la uniformidad de cobertura obtenida para las bibliotecas de secuenciación obtenidas usando 4 flujos de trabajo diferentes de 3 muestras FFPE diferentes.

La Figura 27 muestra gráficos de grupos que pasan el filtro para amplicones generados por amplificación de ADN dirigida de muestras FFPE preparadas de acuerdo con dos métodos de la Figura 25.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona métodos para preparar muestras para la amplificación de ácido nucleico. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN. En una realización, la invención proporciona métodos para preparar una muestra de sangre para la amplificación de ácido nucleico, preferiblemente en donde la muestra de sangre es una muestra de sangre completa.

En otra realización, la invención proporciona métodos para preparar muestras no sanguíneas, tales como muestras de tejido (p. ej., muestras embebidas en parafina fijadas en formalina (FFPE)) para la amplificación de ADN. Dichas muestras de tejido pueden ser muestras tumorales. Otras muestras pueden ser biopsias o aspirados, etc.

La amplificación de ADN puede realizarse de acuerdo con los métodos descritos en la publicación WO2010/038042, la publicación WO2011/025477, la solicitud PCT/US2014/071263, presentada el 18 de diciembre de 2014 y/o la solicitud PCT/EP2014/079145, presentada el 23 de diciembre de 2014. La amplificación de ADN dirigida puede usarse para enriquecer las secuencias objetivo para la posterior generación y secuenciación de grupos.

Los métodos de la invención usan preferiblemente muestras de sangre (completa) o no sanguíneas de tejido (p. ej., FFPE) como entrada de muestra. Los métodos de la invención evitan la necesidad de purificación del ácido nucleico (p. ej., ADN) antes de la amplificación.

También se describe en el presente documento un método para la tagmentación (p. ej., usando el procedimiento Nextera™ (Illumina, Inc.)) de ácido nucleico (p. ej., ADN) en una muestra, tal como una muestra de sangre completa. En términos simples, el método descrito en el presente documento proporciona las etapas de:

(a) proporcionar una muestra celular que contiene ácido nucleico;

(b) lisar las células de la muestra para liberar el ácido nucleico de dentro de las células de la muestra celular, formando así un lisado; y

(c) amplificar el ácido nucleico de las muestras lisadas;

en donde no hay purificación del ácido nucleico de la muestra lisada antes de comenzar la etapa de amplificación (c). La Figura 1 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo del método 100 de preparación de una muestra de sangre completa para la amplificación de ADN dirigida. Por ejemplo, la amplificación de ADN dirigida puede realizarse de acuerdo con los métodos descritos en la publicación WO2010/038042, la publicación WO2011/025477, solicitud PCT/US2014/071263, presentada el 18 de diciembre de 2014 y/o la solicitud PCT/EP2014/079145, presentada el 23 de diciembre de 2014. El método 100 incluye, pero no se limita a las siguientes etapas.

En una etapa 110, se obtiene o proporciona una muestra que contiene ácido nucleico. Esta puede ser una muestra de sangre o una muestra no sanguínea, tal como una muestra de tejido, biopsia, aspirado, etc. Un ejemplo de una muestra de tejido podría ser, p. ej. una muestra tumoral. Si la muestra es una muestra de sangre, entonces preferiblemente es una muestra de sangre completa.

La cantidad de muestra proporcionada dependerá de la muestra y del procedimiento posterior que se llevará a cabo en la muestra. Típicamente, las cantidades de muestra para muestras líquidas pueden estar en la región de aprox. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 pl. Dichas cantidades son adecuadas para muestras de sangre que se someterán a un procedimiento de amplificación por PCR. En algunos aspectos, la cantidad de muestra de sangre será de aprox. 10 pl. En otros aspectos, la cantidad de muestra de sangre será de aprox. 2 pl.

Cuando se proporciona una muestra sólida, se debe usar una cantidad suficiente de muestra que libere suficiente ácido nucleico. La persona experta sabrá cómo preparar una cantidad adecuada de muestra.

En una etapa 115, las células en la muestra (p. ej., sangre completa, tejido) se lisan. Por ejemplo, una parte alícuota (p. ej., 10 pl) de la muestra de sangre completa se mezcla con una cantidad de un reactivo de lisis. El reactivo de lisis puede ser cualquier reactivo adecuado para romper y/o solubilizar la membrana celular.

Una solución de lisis es una que es capaz de lisar células (p.ej., solubilizando membranas celulares eucariotas). Preferiblemente, la solución de lisis es aquella que deja el ácido nucleico intacto (es decir, que no desnaturaliza una cadena de ácido nucleico en la medida en que la cadena se rompe en ácidos nucleicos individuales). La solución de lisis puede comprender uno o más detergentes, una o más enzimas, o una combinación de uno o más detergentes y una o más enzimas, y puede incluir además agentes adicionales. El detergente puede ser un detergente lítico no desnaturalizante, tal como Triton® X-100 Triton® X-100-R, Triton® X-114, NP-40, Genapol® C-100, Genapol® X-100, Igepal® CA 630, Arlasolve™ 200, Brij® 96/97, CHAPS, octil p-D-glucopiranósido, saponina y éter monododecílico del nonaetilenglicol (C12E9, polidocenol). Opcionalmente, también se pueden incluir solubilizantes, tales como Brij® 98, Brij® 58, Brij® 35, Tween® 80, Tween® 20, Pluronic® L64, Pluronic® P84, sulfobetaínas no detergentes (NDSB 201), Amphipols (PMAL-C8) y metil-p-ciclodextrina. Típicamente, los detergentes no desnaturalizantes y los solubilizantes se usan en concentraciones superiores a su concentración micelar crítica (CMC), mientras que los detergentes desnaturalizantes se pueden añadir en concentraciones inferiores a sus CMC. Por ejemplo, los detergentes líticos no desnaturalizantes pueden usarse en una concentración de aproximadamente 0.010% a aproximadamente 10%, p.ej., de aproximadamente 0.015% a aproximadamente 1.0%, p.ej., de aproximadamente 0.05% a aproximadamente 0.5%, p. ej., de aproximadamente 0.10% a aproximadamente 0.30% (concentración final después de dilución con la muestra). Se pueden preferir detergentes tipo detergente polioxietilénico. El detergente polioxietilénico puede comprender la estructura C^12-18/E^9-10, en donde C12-18 indica una longitud de cadena de carbonos de 12 a 18 átomos de carbono y E9-10 indica de 9 a 10 grupos de cabeza hidrófilos de oxietileno. Por ejemplo, el detergente polioxietilénico se puede seleccionar del grupo que consiste en Brij® 97, Brij® 96V, Genapol® C-100, Genapol® X-100, éter monododecílico del nononaetilenglicol (polidocanol), o una combinación de los mismos.

Las enzimas que se pueden usar en soluciones de lisis incluyen, sin limitación, enzimas que se consideran materiales de residuos de membrana (p. ej., proteinasa XXIII, neuraminidasa, polisacaridasa, Glucanex® y Pectinex®). Otros aditivos que se pueden usar incluyen, sin limitación, agentes reductores tales como 2-mercaptoetanol (2-Me) o ditiotreitol (DTT) y agentes estabilizantes tales como magnesio, piruvato y humectantes.

La solución de lisis se puede tamponar a cualquier pH que sea adecuado para lisar las células deseadas, y dependerá de múltiples factores, que incluyen, sin limitación el tipo de muestra, las células que se van a lisar y el detergente utilizado. En algunos métodos, el pH puede estar en un intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 13, p.ej., de aproximadamente 6 a aproximadamente 13, p.ej., de aproximadamente 8 a aproximadamente 13, p. ej., de aproximadamente 10 a aproximadamente 13. Los tampones de pH adecuados incluyen cualquier tampón capaz de mantener un pH en el intervalo deseado, p. ej., CAPS de aproximadamente 0.05 M a aproximadamente 1.0 M.

En un ejemplo, el reactivo de lisis es el reactivo de lisis de un kit para PCR de sangre "Extract-N-Amp" (disponible de Sigma).

Un volumen adecuado de un reactivo de lisis es p. ej. de 10 pl a 200 pl, dependiendo del reactivo. Los volúmenes pueden seleccionarse de aprox. 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 pl, y dependerá de la cantidad de muestra que se va a lisar.

En un método, un reactivo de lisis (p. ej. reactivo de lisis de un kit para PCR de sangre "Extract-N-Amp" (disponible en Sigma), p. ej. hidróxido de potasio, podría usarse en aproximadamente 20 pl, cuando se usan 10 pl p. ej. de sangre.

Preferiblemente, el reactivo de lisis es agua, preferiblemente agua destilada. En un método, el agua se usa preferiblemente en una cantidad de 90 pl, cuando se proporciona una muestra de 10 pl p. ej. de sangre. La persona experta podrá variar la cantidad de agua utilizada dependiendo del tamaño de la muestra de acuerdo con sus conocimientos generales y las prácticas de laboratorio habituales. Por ejemplo, se puede mezclar un volumen de 12 pl de agua con una parte alícuota de 2 pl de sangre completa.

Después de que el reactivo de lisis (p. ej., agua) se haya añadido a la muestra celular (p. ej., muestra de sangre), la mezcla se puede mezclar opcionalmente (p. ej., mediante un mezclador vorticial o agitando manualmente). La mezcla permite que el reactivo de lisis y la muestra se distribuyan uniformemente, de modo que la muestra se lise lo más igualmente posible. La mezcla se puede producir durante unos pocos a varios segundos (p. ej., 5 s a 60 s).

Debe apreciarse que se puede añadir el reactivo de lisis a la muestra, o la muestra se puede añadir al reactivo de lisis.

Después de que el reactivo de lisis y la muestra se hayan combinado y opcionalmente mezclado, hay un período de incubación. Esto permite que el reactivo de lisis tenga tiempo suficiente para lisar las células en la muestra. La etapa de mezcla opcional también puede formar parte del tiempo del período de incubación.

En un método, la muestra y la solución de lisis se mezclan y luego se incuban durante un tiempo suficiente para que se produzca la lisis y la solubilización de las membranas celulares, p. ej., aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o 60 segundos, o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 minutos o más, p. ej., de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 20 minutos, de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 5 minutos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 2 minutos. También pueden ser necesarios tiempos de incubación más largos dependiendo de la muestra y/o reactivo de lisis. Por ejemplo, aprox. 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 minutos. El tiempo de incubación dependerá de la fuerza de la solución de lisis, p. ej., la concentración del detergente y/o enzimas. La lisis puede tener lugar a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 45°C, p.ej., de aproximadamente 15°C a aproximadamente 40°C, p.ej., de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, temperatura ambiente, etc. En un método, la solución de lisis se puede cargar en una jeringa y después la muestra se puede aspirar dentro de la jeringa de manera que la mezcla y la incubación ocurren dentro de la jeringa. En un método, la solución de lisis se puede cargar en una jeringa y después la muestra se puede aspirar dentro de la jeringa de manera que la mezcla y la incubación ocurren dentro de la jeringa.

En un método de la presente descripción, particularmente donde el reactivo de lisis no es agua, el tiempo de incubación es de aprox. 5 minutos a temperatura ambiente.

En un método particularmente preferido donde el reactivo de lisis es agua (es decir, sin ningún otro reactivo de lisis (por ejemplo, detergente)), el tiempo de incubación (temperatura ambiente) es de aprox. 2 minutos. Esto representa un ahorro de tiempo significativo en comparación con el uso de reactivos de lisis detergentes que no son agua.

En una etapa 120, hay una etapa opcional de neutralización. Esto puede ser necesario si se requiere que el reactivo de lisis sea neutralizado antes de la etapa de amplificación, debido a la interferencia del reactivo de lisis con el procedimiento de amplificación que de otro modo ocurriría.

En los métodos preferidos de la presente descripción, el reactivo de lisis se selecciona de modo que no se requiera una etapa de neutralización. El uso de agua como reactivo de lisis no requiere una etapa de neutralización posterior antes de la amplificación.

Cuando se requiere una etapa de neutralización, la persona experta será consciente de la cantidad de agente neutralizante requerida para neutralizar el reactivo de lisis. Por ejemplo, la reacción de lisis puede neutralizarse mediante la adición de un reactivo de neutralización del kit para PCR de sangre "Extract-N-Amp". Una cantidad adecuada de dicho reactivo puede ser de aprox. 180 pl.

En una etapa 125, una parte alícuota de la muestra de sangre lisada (y opcionalmente neutralizada) se amplifica mediante amplificación de ADN dirigida. Se puede usar cualquier método de amplificación adecuado, y típicamente se empleará PCR. Los presentes métodos no están necesariamente limitados por un procedimiento de amplificación particular, aunque en la invención reivindicada se usa la tagmentación. Dependiendo del tipo de método de amplificación empleado, la cantidad de muestra lisada requerida para el procedimiento de amplificación variará en consecuencia. Por ejemplo, una cantidad de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 pl puede ser adecuada para el procedimiento de amplificación. Por ejemplo, 2 o 4 pl.

Amplificación y agrupamiento de ácidos nucleicos.

En algunos métodos, los fragmentos de ADN inmovilizados se amplifican usando metodologías de amplificación en grupos como se ilustra en las descripciones de patentes de EE.UU. N° 7,985,565 y 7,115,400. Las patentes de EE.UU. N° 7,985,565 y 7,115,400 describen métodos de amplificación de ácido nucleico en fase sólida que permiten que los productos de amplificación sean inmovilizados sobre un soporte sólido con el fin de formar matrices compuestas de grupos o "colonias" de moléculas de ácido nucleico inmovilizadas. Cada grupo o colonia en dicha matriz se forma a partir de una pluralidad de cadenas polinucleotídicas inmovilizadas idénticas y una pluralidad de cadenas polinucleotídicas complementarias inmovilizadas idénticas. Las matrices así formadas se denominan generalmente en el presente documento "matrices agrupadas". Los productos de las reacciones de amplificación en fase sólida tales como los descritos en las patentes de EE.UU. N° 7,985,565 y 7,115,400 son los denominados estructuras "de puente" formados por reasociación de pares de cadenas de polinucleótidos inmovilizadas y cadenas complementarias inmovilizadas, estando ambas cadenas inmovilizadas en el soporte sólido en el extremo 5', preferiblemente a través de una unión covalente. Las metodologías de amplificación en grupos son ejemplos de métodos en donde se usa un molde de ácido nucleico inmovilizado para producir amplicones inmovilizados. También se pueden usar otras metodologías adecuadas para producir amplicones inmovilizados a partir de fragmentos de ADN inmovilizados producidos de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, uno o más grupos o colonias pueden formarse mediante PCR en fase sólida, ya sea que uno o ambos cebadores de cada par de cebadores de amplificación estén inmovilizados.

En otros métodos, los fragmentos de ADN inmovilizados se amplifican en solución. Por ejemplo, en algunos métodos, los fragmentos de ADN inmovilizados se escinden o se liberan de otro modo del soporte sólido y después los cebadores de amplificación se hibridan en solución con las moléculas liberadas. En otros métodos, los cebadores de amplificación se hibridan con los fragmentos de ADN inmovilizados durante uno o más etapas de amplificación iniciales, seguidas por etapas de amplificación posteriores en solución. Por lo tanto, en algunos métodos se puede usar un molde de ácido nucleico inmovilizado para producir amplicones en fase de solución.

Se apreciará que se puede usar cualquiera de las metodologías de amplificación descritas en el presente documento o generalmente conocidas en la técnica con cebadores universales o específicos del objetivo para amplificar fragmentos de ADN inmovilizados. Los métodos adecuados para la amplificación incluyen, pero no se limitan a, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), la amplificación mediada por transcripción (TMA) y la amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), como se describe en la patente de EE.UU. N° 8,003,354. Los métodos de amplificación anteriores pueden emplearse para amplificar uno o más ácidos nucleicos de interés. Por ejemplo, la PCR, que incluye PCR multiplexada, SDA, TMA, NASBA y similares, puede utilizarse para amplificar fragmentos de ADN inmovilizados. En algunos métodos, se incluyen los cebadores dirigidos específicamente al ácido nucleico de interés en la reacción de amplificación.

Otros métodos adecuados para la amplificación de ácidos nucleicos pueden incluir tecnologías de extensión y ligadura de oligonucleótidos, amplificación por círculo rodante (RCA) (Lizardi et al., Nat. Genet. 19: 225-232 (1998)) y el ensayo de ligadura de oligonucleótidos (OLA) (Véase en general las patentes de EE.UU. N° 7,582,420, 5,185,243, 5,679,524 y 5,573,907; EP 0320308 B1; EP 0336731 B1; EP 0439182 B1; WO 90/01069; WO 89/12696; y WO 89/09835). Se apreciará que estas metodologías de amplificación pueden diseñarse para amplificar fragmentos de ADN inmovilizados. Por ejemplo, en algunos métodos, el método de amplificación puede incluir amplificación de sonda de ligadura o reacciones de ensayo de ligadura de oligonucleótidos (OLA) que contienen cebadores dirigidos específicamente al ácido nucleico de interés. En algunos métodos, el método de amplificación puede incluir una reacción de extensión-ligadura de cebadores que contiene cebadores dirigidos específicamente al ácido nucleico de interés. Como un ejemplo no limitante de extensión de cebadores y cebadores de ligadura que pueden diseñarse específicamente para amplificar un ácido nucleico de interés, la amplificación puede incluir cebadores usados para el ensayo GoldenGate (Illumina, Inc., San Diego, CA) como se ilustra en la patente de EE.UU. N° 7,582,420 y 7,611,869.

Los ejemplos de métodos de amplificación isotérmica que se pueden usar en un método de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) como se ilustra, por ejemplo, en Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 5261-66 (2002) o amplificación de ácido nucleico por desplazamiento de cadena isotérmica ilustrada, por ejemplo, por la patente de EE.UU. N° 6,214,587. Otros métodos no basados en PCR que pueden usarse en la presente descripción incluyen, por ejemplo, amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) que se describe, por ejemplo, en Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995; patentes de EE.Uu . N° 5,455,166 y 5,130,238 y Walker et al., Nucl. Acids Res. 20: 1691-96 (1992) o amplificación por desplazamiento de cadena hiperramificada que se describe, por ejemplo, en Lage et al., Genome Research 13: 294­ 307 (2003). Los métodos de amplificación isotérmica se pueden utilizar con la polimerasa Phi 29 de desplazamiento de cadena o con el fragmento grande de la ADN polimerasa Bst, 5'-> 3' exo- para la amplificación aleatoria de cebadores de ADN genómico. El uso de estas polimerasas aprovecha su alta procesividad y actividad de desplazamiento de cadena. La alta procesividad permite que las polimerasas produzcan fragmentos de 10-20 kb de longitud. Como se ha expuesto anteriormente, se pueden producir fragmentos más pequeños en condiciones isotérmicas usando polimerasas que tienen baja procesividad y actividad de desplazamiento de cadena tales como la polimerasa Klenow. La descripción adicional de las reacciones de amplificación, condiciones y componentes se detallan en la descripción de la patente de EE.UU. N° 7,670,810.

Otro método de amplificación de ácido nucleico que es útil en la presente descripción es la PCR marcada que usa una población de cebadores de dos dominios que tienen una región 5' constante seguida de una región 3' aleatoria como se describe, por ejemplo, en Grothues et al. Nucleic Acids Res. 21 (5): 1321-2 (1993). Las primeras rondas de amplificación se llevan a cabo para permitir una multitud de inicios en el ADN desnaturalizado por calor basados en la hibridación individual de la región 3' sintetizada aleatoriamente. Debido a la naturaleza de la región 3', se contempla que los sitios de inicio sean aleatorios en todo el genoma. Posteriormente, los cebadores no unidos pueden eliminarse y puede tener lugar una replicación adicional usando cebadores complementarios de la región 5' constante.

Como se puede ver en la presente descripción, el ahorro de tiempo usando el método simplificado de preparación de ácido nucleico (p. ej., aproximadamente 2 - 5 minutos) donde no se lleva a cabo la purificación de ADN con respecto a las técnicas tradicionales de purificación de ADN (p. ej., durante 20 minutos, típicamente 30 - 120 minutos) es significativo.

La Figura 2 muestra un gráfico 200 de grupos que pasan el filtro para amplicones generados por amplificación de ADN dirigida de una muestra de sangre completa preparada según el método 100 de la Figura 1. En particular, 10 pl de sangre completa, 20 pl de reactivo de lisis (kit para PCR de sangre "Extract-N Amp", Sigma), 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, 180 pl de reactivo neutralizante (kit para PCR de sangre " Extract-N-Amp", Sigma), 4 pl de lisado para PCR. Cuando se analizan los grupos, los datos menos fiables (a menudo derivados de grupos que se superponen) se eliminan de los resultados del análisis. Por lo tanto, los datos sin procesar se filtran para eliminar cualquier lectura que no cumpla con la calidad general medida por un filtro de pureza. La pureza de una detección de base se calcula como la relación de la intensidad más brillante dividida entre la suma de las intensidades más brillante y segunda más brillante. Por ejemplo, los grupos "pasan el filtro (PF)" si como máximo una detección de base en los primeros 25 ciclos tiene una pureza de <0.6. Cuando las lecturas de secuenciación se alinean con el genoma de referencia, por ejemplo, el genoma humano, las primeras 32 bases de la lectura se corresponden con una posición en el genoma humano y se hace una alineación siempre que no haya más de 2 apareamientos erróneos dentro de las 32 bases sembradas. Las lecturas que podrían alinearse en más de una posición en el genoma todavía se clasifican como alineadas, pero se alinean con una puntuación de alineación baja. Las bases se puntúan según la calidad en función de una combinación de mediciones, que incluyen su puntuación de pureza, si siguen una secuencia difícil conocida y dónde caen en la lectura de la secuenciación. Por ejemplo, se puede dar el porcentaje de bases con una puntuación Q de 30 o más, lo que significa que hay una probabilidad de 1 en 1000 de que esta detección de base sea incorrecta. La medición de cobertura dada indica el número de veces que una región particular del genoma ha sido cubierta mediante lecturas de secuenciación. La medición de diversidad dada es un número estimado de fragmentos únicos presentes en la biblioteca de secuenciación original. Las mediciones de desfase de AT y GC se refieren a la diferencia en el contenido de AT o GC en las lecturas frente a la referencia.

En este experimento, se cargó una parte alícuota del producto de amplificación de ADN en una celda de flujo con sondas de captura para amplificación clonal (generación de grupos) y secuenciación (MiSeq). Cada punto en el gráfico 200 representa un amplicón y muestra el porcentaje de contenido de GC del amplicón en función de los grupos por amplicón. En el ensayo de amplificación dirigida, por ejemplo, se puede mencionar un valor de uniformidad. Esta medición da el porcentaje de amplicones que están cubiertos dentro de 0.2 x cobertura media, es decir, no incluiría amplicones secuenciados con una frecuencia de menos de 20% de la cobertura media de todos los amplicones. Los datos de medición de la secuenciación se muestran en la Tabla 1. Los datos muestran que todos los amplicones están cubiertos. En este ejemplo de secuenciación, la densidad de grupos es de 1626000 grupos por mm2 de superficie de la celda de flujo, 80.54% de los grupos pasan el filtro, 99.4% de los grupos que pasan el filtro se alinean con el genoma humano y 94.7% de los grupos que pasan el filtro tienen una calidad mayor o igual a Q30.

Las Figuras 3A y 3B muestran los resultados de un método simplificado para preparar una muestra de sangre completa para la amplificación de ADN dirigida, donde una parte alícuota (10 pl) de una muestra de sangre completa se mezcla con agua (90 pl) antes de la amplificación (se usan 2 pl de lisado para el procedimiento de amplificación por PCR, el mismo procedimiento que para la Figura 2). Por ejemplo, la amplificación de ADN dirigida se puede llevar a cabo según los métodos descritos en la publicación WO2010/038042, la publicación WO2011/025477, solicitud PCT/US2014/071263, presentada el 18 de diciembre de 2014 y/o solicitud PCT/EP2014/079145, presentada el 23 de diciembre de 2014. Aquí, el tiempo de incubación era de solo aprox. 2 min, que efectivamente era el tiempo necesario para mezclar entre sí la muestra de sangre y el agua y luego preparar la etapa de amplificación.

Las Figuras 3A y 3B muestran un gráfico 300 del tamaño de amplicones y un gráfico 350 del porcentaje de contenido de GC, respectivamente, de un ensayo de amplificación de ADN dirigida realizado en una muestra de sangre completa preparada por dilución con agua. En este ejemplo, se mezclaron 10 pl de una muestra de sangre completa con 90 pl de agua. En este protocolo de preparación de muestra, el agua actúa como agente de lisis. Una parte alícuota de 2 pl de la muestra (lisado) se amplificó por amplificación de ADN dirigida. Se cargó una parte alícuota del producto de amplificación de ADN en una celda de flujo con sondas de captura para amplificación clonal (generación de grupos) y secuenciación (MiSeq). Cada punto en los gráficos 300 y 350 representa un amplicón.

Estos resultados muestran que la preparación de ADN con agua sola como el reactivo de lisis da resultados comparables a la preparación de ADN usando un reactivo de lisis que no es agua (p. ej., reactivo de lisis del kit para PCR de sangre "Extract-N-Amp", Sigma).

La Figura 4 muestra una tabla de datos 400 de las mediciones de secuenciación para el ensayo de amplificación de ADN dirigida de las Figuras 3A y 3B. Los datos de las Figuras 3A, 3B y 4 muestran que la dilución de la muestra de sangre completa en agua es suficiente para preparar una muestra de sangre para la amplificación de ADN dirigida y la posterior generación de grupos y secuenciación.

En otro método más de la presente descripción, se usa una muestra de sangre completa directamente para la amplificación de ADN dirigida. Por ejemplo, la amplificación de ADN dirigida se puede llevar a cabo según los métodos descritos en la publicación WO2010/038042, la publicación WO2011/025477, la solicitud PCT de EE.UU. PCT/2014/071263, presentada el 18 de diciembre de 2014 y/o la solicitud PCT/EP2014/079145, presentada el 23 de diciembre de 2014.

En este método, se usa una enzima para la lisis de las células (p. ej., células sanguíneas) directamente, como parte del procedimiento de amplificación.

Una enzima particularmente preferida es la ADN polimerasa Phusion (New England Biolabs, Thermo Scientific®), una ADN polimerasa de alta fidelidad. Las ADN polimerasas de alta fidelidad son importantes para aplicaciones en las que la secuencia de ADN debe corregirse después de la amplificación. La ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion ofrece tanto rendimiento robusto como alta fidelidad, y por lo tanto puede usarse para todas las aplicaciones de PCR. Su estructura, una nueva enzima similar a Pyrococcus fusionada con un dominio que mejora la procesividad, aumenta la fidelidad y la velocidad. La ADN polimerasa Phusion se usa para la clonación y se puede usar para amplicones largos o difíciles. Con una tasa de error supuestamente >50 veces menor que la de la ADN polimerasa Taq y 6 veces menor que la de la ADN polimerasa Pyrococcus furiosus, Phusion es una de las polimerasas termoestables supuestamente más precisas disponibles. La a Dn polimerasa Phusion posee actividad de polimerasa 5 '^ 3', actividad de exonucleasa 3 '^ 5' y generará productos de extremos romos.

La Figura 5 muestra paneles de grupos generados a partir de amplicones generados directamente a partir de una muestra de sangre completa mediante amplificación de ADN dirigida. En este ejemplo, se mezclan 2 gl de sangre completa directamente con 48 gl de mezcla de PCR que contiene enzima Phusion (50 gl de volumen de reacción). La generación de grupos se realizó utilizando 10, 1, 0.1,0.01 y 0.001 gl de productos de PCR amplificados. Se utilizaron PhiX (5 pM) y controles positivos de secuencias objetivo como controles positivos.

La Figura 6 ilustra un diagrama de flujo de otro aspecto de la presente invención, en este caso un método 600 para preparar una muestra (p. ej., sangre completa) para la construcción de una biblioteca de ADN tagmentado (p. ej., mediante Nextera™, Illumina, Inc.). El método 600 incluye, entre otros, las siguientes etapas.

En una etapa 610, se obtiene o proporciona una muestra (p. ej., sangre completa).

En una etapa 615, se mezcla una parte alícuota (p. ej., 2 gl) de sangre completa con agua (p. ej., 12 gl).

En una etapa 620, como una etapa específica cuando el procedimiento de amplificación implica tagmentación, se añade proteinasa K a la muestra de sangre para alterar la cromatina. Si no se añade proteinasa K, entonces el ADN no se despliega completamente (es decir, permanece asociado con histonas) y al final quedan tagmentadas secuencias más grandes de ADN. En un ejemplo, se añade 1 gl de proteinasa K a los 14 gl de muestra de sangre agua y se incuba a aprox. 56°C durante 20 minutos. La proteinasa K se inactiva posteriormente calentando la muestra a 70°C durante 10 minutos.

Esta reacción se lleva a cabo ventajosamente como una reacción en un solo recipiente, que de nuevo no requiere ninguna purificación del ADN antes de las etapas de tagmentación.

En la etapa 625, la muestra se tagmenta usando una reacción de Nextera modificada para generar una biblioteca de ADN tagmentado. En un ejemplo, un protocolo de tagmentación se basa en un protocolo de lisis rápida, el kit Nextera n° 1502811 y un kit indexado n° 15028216. Brevemente, se añaden 25 gl de tampón de tagmentación de ADN (TD) y 10 gl de enzima de tagmentación de ADN (TDE1) a una muestra de lisis rápida y se incuban durante 5 minutos a 55°C. Después la muestra se enfría en hielo. La muestra se purifica usando una columna de purificación Zymo y se eluye a 25 gl. Una parte alícuota de 20 gl de la muestra purificada se amplifica por PCR usando 5 gl de ambos cebadores de índice (p. ej., índices N702 y N507), 15 gl de mezcla maestra de PCR Nextera (NPM) y 5 gl de cóctel de cebadores de PCR (PPC). La amplificación térmica se realiza de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El volumen de la muestra se ajusta (si es necesario) a 30 gl con tampón de resuspensión (RSB) y se purifica usando perlas SPRI. La biblioteca purificada se eluye de las perlas SPRI con 32.5 gL de RSB. Se determina la distribución de tamaños de fragmentos en la biblioteca y la concentración de ADN.

Las Figuras 7A y 7B muestran un gráfico de barras 700 de la profundidad de secuenciación por cromosoma y un gráfico 750 de la distribución de tamaños, respectivamente, de una biblioteca de ADN tagmentado preparada según el método 600 de la Figura 6. Se cargó una parte alícuota de la biblioteca de ADN tagmentado en un celda de flujo para amplificación clonal (generación de grupos) y secuenciación (MiSeq). Los datos de medición de secuenciación se muestran en la Tabla 2. En este ejemplo de secuenciación, la densidad de grupos es de 424000 grupos por mm2 de superficie de la celda de flujo, 96.65% de los grupos pasan el filtro, 93.45% de los grupos que pasan el filtro se alinean con el genoma humano y 98.2% de los grupos que pasan el filtro tienen una calidad mayor o igual a Q30. La diversidad de la biblioteca es de 4.63 mil millones y la profundidad de cobertura del genoma humano es de 0.15x. El desfase de GC y AT es 0.35 y 16.31 respectivamente.

Como se usa en el presente documento, el término "tagmentación" se refiere a la modificación del ADN por un complejo de transposoma que comprende la enzima transposasa complejada con adaptadores que comprenden la secuencia terminal de transposón. La tagmentación da como resultado la fragmentación simultánea del ADN y la ligadura de los adaptadores a los extremos 5' de ambas cadenas de fragmentos dúplex. Después de una etapa de purificación para eliminar la enzima transposasa, se pueden añadir secuencias adicionales a los extremos de los fragmentos adaptados, por ejemplo, mediante PCR, ligadura o cualquier otra metodología adecuada conocida por los expertos en la materia.

Los métodos descritos en el presente documento pueden usar cualquier transposasa que pueda aceptar una secuencia terminal de transposasa y fragmentar un ácido nucleico objetivo, uniendo un extremo transferido, pero no un extremo no transferido. Un "transposoma" está compuesto por al menos una enzima transposasa y un sitio de reconocimiento de transposasa. En algunos de estos sistemas, denominados "transposomas", la transposasa puede formar un complejo funcional con un sitio de reconocimiento de transposones que es capaz de catalizar una reacción de transposición. La transposasa o integrasa puede unirse al sitio de reconocimiento de transposasa e insertar el sitio de reconocimiento de transposasa en un ácido nucleico objetivo en un proceso que a veces se denomina "tagmentación". En algunos de estos sucesos de inserción, una cadena del sitio de reconocimiento de transposasa puede ser transferida al ácido nucleico objetivo.

En los métodos convencionales de preparación de muestras, cada molde contiene un adaptador en cada extremo del inserto y, a menudo, se requieren varias etapas tanto para modificar el ADN o el ARN como para purificar los productos deseados de las reacciones de modificación. Estas etapas se llevan a cabo en solución antes de la adición de los fragmentos adaptados a una celda de flujo donde se acoplan a la superficie mediante una reacción de extensión del cebador que copia el fragmento hibridado en el extremo de un cebador unido covalentemente a la superficie. Estos moldes de "siembra" dan lugar entonces a grupos monoclonales de moldes copiados a través de varios ciclos de amplificación.

El número de etapas necesarias para transformar el ADN en moldes modificados por el adaptador en solución listos para la formación de grupos y secuenciación puede minimizarse mediante el uso de tagmentación mediada por transposasa y marcaje.

En algunos métodos, la tecnología basada en transposones se puede utilizar para fragmentar el ADN, por ejemplo, como se ilustra en el flujo de trabajo para los kits de preparación de muestras de ADN Nextera™ (Illumina, Inc.) en donde el ADN genómico puede fragmentarse mediante un transposoma genéticamente modificado que fragmenta y marca simultáneamente el ADN de entrada ("tagmentación") creando así una población de moléculas de ácido nucleico fragmentadas que comprenden secuencias adaptadoras únicas en los extremos de los fragmentos.

Algunos métodos pueden incluir el uso de una transposasa Tn5 hiperactiva y un sitio de reconocimiento de transposasa de tipo Tn5 (Goryshin y Reznikoff, J. Biol. Chem, 273: 7367 (1998)), o transposasa MuA y un sitio de reconocimiento de transposasa Mu que comprende secuencias terminales R1 y R2 (Mizuuchi, K., Cell, 35: 785, 1983; Savilahti, H, et al., EMBO J., 14: 4893, 1995). Un sitio de reconocimiento de transposasa ilustrativo que forma un complejo con una transposasa Tn5 hiperactiva (p. ej., EZ-Tn5™ Transposase, Epicenter Biotechnologies, Madison, Wisconsin).

Más ejemplos de sistemas de transposición que pueden usarse con ciertos métodos proporcionados en el presente documento incluyen Staphylococcus aureus Tn552 (Colegio et al., J. Bacteriol., 183:2384-8, 2001; Kirby C et al., Mol. Microbio., 43:173-86, 2002), Ty1 (Devine y Boeke, Nucleic Acids Res., 22:3765-72, 1994 y publicación internacional WO 95/23875), Transposón Tn7 (Craig, N L, Science. 271:1512, 1996; Craig, N L, Revisión en: Curr Top Microbiol Immunol., 204:27-48, 1996), Tn/O e IS10 (Kleckner N, et al., Curr Top Microbiol Immunol., 204:49-82, 1996), Transposasa Mariner (Lampe D J, et al., e Mb O J., 15: 5470-9, 1996), Tc1 (Plasterk R H, Curr. Toopis Microbiol. Immunol., 204:125-43, 1996), Elemento P (Gloor, G B, Methods Mol. Biol., 260:97-114, 2004), Tn3 (Ichikawa y Ohtsubo, J Biol. Chem 265: 18829-32, 1990), secuencias de inserción bacteriana (Ohtsubo y Sekine, Curr. Top. Microbiol Immunol 204:1-26, 1996), retrovirus (Brown, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 2525-9, 1989) y retrotransposón de levadura (Boeke y Corces, Annu Rev Microbiol. 43:403-34, 1989). Más ejemplos incluyen IS5, Tn10, Tn903, IS911 y versiones genéticamente modificadas de enzimas de la familia transposasa (Zhang et al., (2009) PLoS Genet. 5:e1000689. Epub 16 de octubre de 2009; Wilson C. et al. (2007) J. Microbio!. Methods 71: 332-5).

Secuenciación directa a partir de FFPE

También se presentan en el presente documento métodos para preparar una biblioteca de secuenciación directamente a partir de una muestra FFPE. En algunos métodos, el método comprende la amplificación de ácido nucleico de la muestra FFPE sin realizar una etapa de desparafinado con xileno. En algunos métodos, el método comprende la amplificación de ácido nucleico de la muestra FFPE sin realizar una etapa de extracción separada. En algunos métodos, la amplificación se realiza directamente en un recipiente que comprende la muestra FFPE.

La Figura 8 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método 800 de preparación de una muestra de tejido (p. ej., muestra FFPE) para la amplificación de ADN dirigida y la secuenciación posterior. La amplificación de ADN dirigida se puede llevar a cabo, por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos en la publicación WO2010/038042, la publicación WO2011/025477, solicitud PCT/US2014/071263, presentada el 18 de diciembre de 2014 y/o la solicitud PCT/EP2014/079145, presentada el 23 de diciembre de 2014. El método 800 incluye, pero no se limita a las siguientes etapas.

En la etapa 810, se obtiene una muestra de tejido (p. ej., un corte de una muestra FFPE). En un ejemplo, la muestra FFPE es una muestra de cultivo celular embebido en parafina. En otro ejemplo, la muestra FFPE es una muestra de tumor o una muestra de tejido normal.

En una etapa 815, se extrae el ADN de la muestra. En un ejemplo, se usa el tampón QuickExtract (disponible en EpiCentre) para extraer ADN de la muestra FFPE. En este ejemplo, se añaden 100 pl de tampón QuickExtract a la muestra FFPE en un tubo de microcentrífuga, el tubo se agita con vórtice y se incuba durante 1 hora a 56°C, seguido de una incubación de 2 minutos a 98°C.

En una etapa 820, se cuantifica el ADN en la muestra. El experto en la técnica conoce varios métodos para cuantificar la concentración promedio de ADN presente en la mezcla, incluida la cuantificación espectrofotométrica y la fluorescencia UV en presencia de un colorante.

En la etapa 825, la amplificación de ADN dirigida se lleva a cabo en la muestra de ADN extraída. En un ejemplo, la amplificación de ADN dirigida se lleva a cabo utilizando 10 ng de ADN extraído.

Preferiblemente, por "ADN extraído" se entiende el ADN que se ha vuelto accesible mediante la lisis de la muestra celular. Por lo tanto, 10 ng de ADN extraído pueden requerir de hecho que se proporcione un mayor volumen de lisado.

En la etapa 830, el ADN amplificado se diluye (p. ej., 1/20) y se carga en una celda de flujo preparada con sondas de captura para la generación de grupos y secuenciación (MiSeq).

En un ejemplo, el método 800 de la Figura 8 se usa para preparar una muestra FFPE de tumor de colon para la amplificación dirigida.

La figura 9A muestra un gráfico de barras 900 de la medición de la puntuación Q y una tabla de datos 920 de las mediciones de secuenciación para amplicones generados a partir de ADN preparado a partir de una muestra FFPE de tumor de colon según el método 800 de la figura 8. La figura 9B muestra un gráfico de barras 940 de la medición de la puntuación Q y una tabla de datos 960 de mediciones de secuenciación para amplicones generados a partir de ADN preparado a partir de una muestra FFPE de tumor de colon usando un kit de purificación de ADN QiaAmp tradicional.

Las Figuras 10A y 10B muestran una tabla de datos 1000 de mediciones de secuenciación y un gráfico 1050 de grupos de amplicones para el ADN preparado por QiaAmp y el ADN preparado por QuickExtract de las Figuras 9A y 9B. En este ejemplo de secuenciación del método de extracción rápida, la densidad de grupos es de 305000 grupos por mm2 de superficie de la celda de flujo, 97% de los grupos pasan el filtro, 97.9% de los grupos que pasan el filtro se alinean con el genoma humano y 98.7% de los grupos que pasan el filtro tienen una calidad mayor o igual a Q30.

Como se puede ver en las Figuras 9 y 10, de acuerdo con los métodos de la presente invención que no emplean la purificación de ADN antes de la amplificación, los resultados son muy comparables al método más clásico de purificación de ADN antes de la amplificación. Por lo tanto, parece que los métodos de la presente invención son beneficiosos para proporcionar resultados comparables en un tiempo más rápido y un coste menor que los métodos de purificación tradicionales.

En otro ejemplo, la extracción de ADN de una muestra FFPE y la amplificación dirigida se pueden combinar en un solo tubo de reacción. Por ejemplo, siguiendo el método descrito anteriormente en relación con la Figura 8, la proteinasa K en el tampón QuickExtract se inactiva primero con calor y luego se combina con la mezcla de amplificación de ADN dirigida en una proporción 40:60. Se añade un corte de FFPE Horizon a este tampón y se incuba durante 1 hora a 56°C seguido de 2 minutos a 98°C. Después la muestra se amplifica por termociclado. Los datos se muestran en la Tabla 3. En este ejemplo de secuenciación, la densidad de grupos es de 941 000 grupos por mm2 de superficie de la celda de flujo, 93.6% de los grupos pasan el filtro, 99.5% de los grupos que pasan el filtro se alinean con el genoma humano y 97.8% de los grupos que pasan el filtro tienen una calidad mayor o igual a Q30.

En otro ejemplo, se añade un corte FFPE Horizon a la mezcla de PCR de amplificación de ADN dirigida seguido directamente por termociclado (opcionalmente sin incubación). Los datos se muestran en la Tabla 4. En este ejemplo de secuenciación, la densidad de grupos es de 772000 grupos por mm2 de superficie de la celda de flujo, 94.4% de los grupos pasan el filtro, 99.4% de los que pasan el filtro se alinean con el genoma humano y 98% de los grupos que pasan el filtro tienen una calidad mayor o igual a Q30.

Las Figuras 11A y 11B muestran un gráfico 1100 del tamaño de amplicones y un gráfico de 1150 del porcentaje de contenido de GC, respectivamente, a partir de la amplificación dirigida directa de un corte de FFPE (sin incubación). Cada punto en los gráficos 1100 y 1150 representa un amplicón.

Estos resultados son nuevamente comparables a los métodos más tradicionales que implican la purificación de ADN.

Opcionalmente, la presente invención también puede incluir la etapa de secuenciar la secuencia de ADN después de la amplificación. Esto se realiza preferiblemente mediante métodos de secuenciación de alto rendimiento.

En algunos métodos, como se ilustra en la Figura 25, se puede preparar una biblioteca de secuenciación directamente a partir de una muestra FFPE. La Figura 25 muestra los flujos de trabajo de preparación de muestras para preparar una biblioteca de ADN a partir de una muestra FFPE utilizando modificaciones del flujo de trabajo expuesto en la Figura 8. Los métodos típicos que utilizan herramientas QIAamp se basan en una etapa de desparafinado con xileno, seguido de incubación con proteinasa K y calentamiento para eliminar la reticulación. En las Figuras 26-27, dichos métodos se denominan "purificación de Qiagen". Los métodos típicos que utilizan desparafinado con xileno y lisis de proteinasa K pueden requerir cerca de 3 horas de procesamiento, como se indica en las Figuras 25-27 ("2 h 45 m").

Los métodos presentados en el presente documento proporcionan bibliotecas listas para secuenciar con un manejo mínimo, lo que reduce el tiempo de procesamiento y elimina las posibilidades de error del usuario y pérdida de muestra.

En algunas realizaciones, se prepara una biblioteca de secuenciación incubando una muestra FFPE con un tampón de extracción, tal como, por ejemplo, tampón QuickExtract (Epicentre) u otro tampón de extracción adecuado. Un tampón adecuado se expone en la Tabla 5 a continuación.

Tabla 5

En algunos métodos, como se indica en la Figura 25, una muestra de FFPE se incuba en un tampón de extracción, tal como un tampón que comprende los componentes de la Tabla 5. En algunos métodos, después de una etapa de extracción, se cuantifica el ADN total y una porción del ADN extraído se utiliza como entrada para una reacción de amplificación dirigida, tal como la amplificación por PCR como se describe en lo que antecede. En las Figuras 26-27, dichos métodos se denominan "flujo de trabajo de 1 h 20 min".

Por lo tanto, en los métodos presentados en el presente documento, el ADN obtenido de FFPE se somete a una amplificación dirigida, y los amplicones generados se secuencian, por ejemplo, por la metodología SBS. En algunos de estos métodos, dado que el ADN obtenido de FFPE no se purifica antes de colocarlo en un instrumento de secuenciación, el aparato de secuenciación (celdas de flujo y similares) comprenderá componentes de la muestra FFPE además del ADN. Los ejemplos de componentes de FFPE incluyen, por ejemplo, formalina, parafina, componentes celulares, proteínas, componentes de la matriz extracelular, colágeno, restos de tejido y similares.

Por lo tanto, se presenta en el presente documento un método para realizar una reacción de agrupamiento en una superficie sólida, en donde la reacción de agrupación se realiza en presencia de uno o más de formalina, parafina, componentes celulares, proteínas, componentes de la matriz extracelular, colágeno y restos de tejido. En algunos métodos, la reacción de agrupamiento se realiza en presencia de al menos 0.001 pg de parafina. En algunos métodos, la reacción de agrupamiento se realiza en presencia de al menos 0.01 pg, 0.1 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 pg 10 pg 100 pg o al menos 1 mg de parafina.

Se presenta en el presente documento una celda de flujo que comprende cebadores de amplificación inmovilizados y uno o más de formalina, parafina, componentes celulares, proteínas, componentes de la matriz extracelular, colágeno y restos de tejido. En algunos métodos, la celda de flujo comprende al menos 0.001 pg de parafina. En algunos métodos, la celda de flujo comprende al menos 0.01 pg, 0.1 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 pg, 10 pg, 100 pg, o al menos 1 mg de parafina.

Por lo tanto, se presenta en el presente documento un método para realizar una reacción de agrupamiento en una superficie sólida, en donde la reacción de agrupamiento se realiza en presencia de proteinasa K. En algunos métodos, la reacción de agrupamiento se realiza en presencia de al menos 0.001 pg de proteinasa K. En algunos métodos, la reacción de agrupamiento se realiza en presencia de al menos 0.01 pg, 0.1 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 pg, 10 pg, 100 pg, o en al menos 1 mg de proteinasa K.

Se presenta en el presente documento una celda de flujo que comprende cebadores de amplificación inmovilizados y proteinasa K. En algunos métodos, la celda de flujo comprende al menos 0.001 pg de proteinasa K. En algunos métodos, la celda de flujo comprende al menos 0.01 pg, 0.1 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 pg 10 pg 100 pg o al menos 1 mg de proteinasa K.

En algunos métodos, como se indica en la Figura 25, la amplificación por PCR se lleva a cabo sin realizar la cuantificación del ADN. En las Figuras 26-27, dichos métodos se denominan "flujo de trabajo de 1 h 2 min".

En todos los métodos representados en la Figura 25, se colocó una parte alícuota de la reacción de amplificación directamente en una celda de flujo MiSeq y se llevó a cabo el agrupamiento, seguido de secuenciación SBS, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En disposiciones típicas, un corte de FFPE tiene un espesor de aproximadamente 10 pm. En algunas disposiciones, un corte de FFPE puede ser tan fino como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más de 9 pm de espesor. Por lo tanto, en un corte de FFPE de 10 pm de espesor, la parafina puede estar presente en el intervalo de 0.1,0.5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más de 20 mg de parafina. Del mismo modo, en un corte de FFPE de 10 pm de espesor, el tejido puede estar presente en el intervalo de 0.1,0.5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más de 20 mg de tejido. Estos componentes se transfieren a una celda de flujo de secuenciación en los métodos presentados en el presente documento. En algunos métodos, un corte de tejido se pone en contacto con 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más de 100 pl de un tampón de extracción que comprende una proteinasa, tal como la proteinasa K. En la extracción típica el tampón se ha expuesto antes en la Tabla 5.

En algunos métodos, como se indica en la Figura 25, una muestra de FFPE se coloca directamente en una reacción de amplificación, tal como el tampón de amplificación por PCR, sin realizar primero una etapa de extracción por separado. En las Figuras 26-27, dichos métodos se denominan "flujo de trabajo de 2 min".

La Figura 26 es una tabla de datos que compara la uniformidad de cobertura obtenida para las bibliotecas de secuenciación obtenidas usando 4 flujos de trabajo diferentes de 3 muestras FFPE diferentes. Sorprendentemente, el agrupamiento y la secuenciación realizados en presencia de una o más de proteinasa K, formalina, parafina, componentes celulares, proteínas, componentes de la matriz extracelular, colágeno y restos de tejido dieron como resultado una uniformidad de cobertura de secuenciación que es comparable a las obtenidas usando ADN purificado.

La Figura 27 muestra gráficos de grupos que pasan el filtro para amplicones generados por amplificación de ADN dirigida de muestras FFPE preparadas de acuerdo con dos métodos de la Figura 25. Sorprendentemente, el agrupamiento y la secuenciación llevados a cabo en presencia de uno o más de proteinasa K, formalina, parafina, componentes celulares, proteínas, componentes de la matriz extracelular, colágeno y restos de tejido dieron como resultado una uniformidad de cobertura de secuenciación que es comparable a las obtenidas usando ADN purificado.

Secuenciación directamente de manchas de sangre seca

Los autores de la invención también han mostrado que la secuenciación de amplicones se puede llevar a cabo directamente a partir de manchas de sangre seca. En este experimento, que se muestra en la Figura 12, las manchas de sangre seca se proporcionaron en papel de filtro Whatman 903 con -50-70 ul de sangre por mancha. Esto es equivalente a las manchas de sangre seca que se encuentran en las tarjetas Guthrie utilizadas para las pruebas de punción del talón del recién nacido. En este experimento, la sangre se secó sobre el papel durante 1-6 días.

Se cortó una porción de 3 mm2 de la mancha de sangre y se colocó en un tubo. La porción se enjuaga con agua que elimina los inhibidores de proteínas contenidos en la sangre. El ADN permanece unido al papel de filtro. En este ejemplo, se llevaron a cabo 2x lavados con 100 ul de 5 min. El papel de filtro enjuagado se colocó en el tubo con mezcla de PCR. Potencialmente, esto podría hacerse como una reacción en un solo recipiente. Después se llevan a cabo la PCR, agrupamiento y secuenciación. Los resultados se pueden ver en las Figuras 13A y 13B.

También se llevaron a cabo experimentos para mostrar que la secuenciación del genoma completo basada en la tagmentación se puede llevar a cabo en manchas de sangre seca. La Figura 14 muestra el experimento llevado a cabo tanto con una etapa de lavado con agua (arriba) como sin él (abajo). De nuevo se cortaron porciones de 3 mm2 de la mancha de sangre y se colocaron en un tubo. En el panel superior, la porción se lava dos veces con agua y se incuba durante 5 minutos. En el panel inferior no se produce ninguna etapa de lavado. En ambos casos, la tagmentación, la PCR (con y sin filtro) y la secuenciación se producen entonces con los resultados que se muestran en las Figuras 15A y 15B.

Nextera basada en perlas (BBN)

Los métodos para realizar la tagmentación basada en perlas, también denominada en el presente documento Nextera™ basada en perlas (BBN), se describen en los materiales de la solicitud de EE.UU. N° de serie 62/167463, presentada el 28 de mayo de 2015. Brevemente, como se realiza en algunos métodos presentados en el presente documento, BBN se puede realizar de la siguiente manera. Se mezclan 20 gl de muestra de sangre con 20 gl de perlas magnéticas (TSM 100 nM) y 10 ul de tampón de tagmentación (TD) y se incuban durante 15 minutos a 55°C. Se añaden 12.5 gl de tampón Nt a la muestra y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. La muestra se coloca en un imán, se separa el líquido sobrenadante. Las perlas se lavaron tres veces con 100 gl de tampón HT2 para cada etapa de lavado. La muestra se amplifica por PCR utilizando 5 gl de ambos cebadores de índice (p. ej., índices N702 y N507), 15 gl de mezcla maestra de PCR Nextera (NPM) y 5 gl de cóctel de cebadores de PCR (PpC). La amplificación térmica se realiza de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (p. ej., 5 ciclos de PCR). El tubo que contiene las perlas y la muestra se coloca en un imán y el líquido sobrenadante se purifica usando columnas ZYMO (Zymo Research) y perlas SPRI.

Se realizó una comparación de Nextera basado en perlas con otros métodos de preparación de biblioteca de sangre completa. Las Figuras 16, 17 y 18 muestran mediciones de secuenciación y profundidad de secuenciación por cromosoma de una biblioteca de ADN tagmentado preparada de acuerdo con tres métodos diferentes. Para los datos mostrados en la Figura 16, se preparó una biblioteca a partir de sangre completa en general según el método 600 de la Figura 6. En particular, se mezclaron 2 gl de sangre completa con 12 gl de agua y después se incubaron con proteinasa K a 56°C durante 10 minutos. Después los reactivos de tagmentación se añadieron al lisado y la tagmentación se realizó como se ha descrito anteriormente. Una parte alícuota de la biblioteca de ADN tagmentado se cargó en una celda de flujo para la amplificación clonal (generación de grupos) y la secuenciación (MiSeq). Para los datos mostrados en la Figura 17, se realizó una modificación del protocolo anterior. Específicamente, los restos celulares se sedimentaron después de la lisis con agua, y antes de la incubación con proteinasa K. Después de la incubación de proteinasa K, la muestra se centrifugó para eliminar los restos sólidos, y luego se realizó Nextera basada en perlas como se ha descrito anteriormente. Para los datos que se muestran en la Figura 18, un trozo de papel de filtro de 3 mm2 que tenía una mancha de sangre seca se enjuagó con agua durante 15 minutos, y se eliminó el ADN solubilizado y se realizó la tagmentación como se ha descrito anteriormente.

Las mediciones de secuenciación se muestran en las Tablas para los 3 métodos, respectivamente, en las Figuras 16, 17 y 18. En este ejemplo de secuenciación, las densidades de grupos son 4.11 mil millones, 2.25 mil millones y 0.85 mil millones de grupos por mm2 de superficie de la celda de flujo para los tres flujos de trabajo, respectivamente. El desfase de GC y AT también se proporciona en las tablas para los tres métodos, respectivamente.

La Figura 19 muestra una comparación de las mediciones de secuenciación para tres muestras de BBN (BBN1,2, 3) en comparación con las mediciones de secuenciación de controles de ADNg purificado y manchas de sangre seca, preparadas como se ha descrito anteriormente. En este ejemplo de secuenciación, la densidad de grupos, el % de los grupos que pasan los filtros, el % de los grupos que pasan los filtros que se alinean con el genoma humano y el % de los grupos que pasan los filtros que tienen una calidad mayor o igual a Q30 son comparables para muestras de BBN, sangre seca y muestras de ADNg purificadas. Las Figuras 20 y 21 muestran comparaciones adicionales de la cobertura de los paneles de genes de interés (Figura 20) y la precisión y exhaustividad del genotipo relacionadas con la concordancia de SNP (Figura 21), lo que indica que la salida de datos para los tres métodos es comparable.

Bibliotecas no tagmentadas

En algunos métodos presentados en el presente documento, un método para la preparación de bibliotecas a partir de sangre completa puede implicar la ligadura de adaptadores, evitando así la necesidad de reactivos de tagmentación. Como se muestra en la Figura 22, un método de preparación de biblioteca estándar, designado como "TruSeq Nano" incluye extracción de ADN, cizalladura (Covaris), limpieza y selección de tamaño (SPRI), seguido de reparación de extremos, adición de cola A y ligadura de adaptadores. Sorprendentemente, se descubrió que las modificaciones de este flujo de trabajo pueden mejorar en gran medida la preparación de la biblioteca a partir de muestras de sangre completa, como lo demuestran varias mediciones.

En un método, se describe la preparación de la biblioteca directamente a partir de sangre usando modificaciones del kit de Illumina TruSeq Nano. Brevemente, como se ilustra por WF-2 en la Figura 22, se mezclaron 16 gl de sangre con 36 gl de agua y 8 gl de proteinasa K y se incubaron a 56°C durante 10 minutos seguido de 70°C durante 10 minutos. Las muestras se centrifugaron a 10000 g durante 1 minuto seguido de cizalladura utilizando sonicación Covaris. Luego, la muestra se purificó usando perlas SPRI y le siguió la reparación de extremos, adición de cola A, ligadura y amplificación por PCR de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para TruSeq Nano (Illumina, Inc). En otro método, ilustrado en la Figura 22 como flujo de trabajo (WF-4), se mezclan 16 gl de sangre con 104 gl de RSB (10 mM Tris pH 7.0) seguido de cizalladura en COVARIS. Se añadieron 8 gl de proteinasa K a la muestra de sangre cizallada y se incubó a 56°C durante 10 minutos seguido de 70°C durante 10 minutos. Las muestras se centrifugaron a 10000 g durante 1 min. La muestra se purificó usando perlas SPRI y seguido de la reparación de extremos, adición de cola A, ligadura y amplificación por PCR según las recomendaciones del fabricante para TruSeq Nano (Illumina, Inc).

La Figura 23 muestra los perfiles de sesgo de GC de las bibliotecas preparadas a partir de los tres flujos de trabajo TrueSeq Nano descritos anteriormente para sangre completa. Como se muestra en la Figura 23, WF2 presentaba un mejor perfil de sesgo de GC, lo que representa un hallazgo inesperado y una mejora significativa sobre la preparación de la muestra de ADN de control.

La Figura 24 muestra que la diversidad de WF-2 y WF-4 es mayor que la de la muestra de control.

En resumen, los flujos de trabajo 2 y 4 (WF-2, WF-4) dieron como resultado una mejor cobertura y recuperabilidad en general. Ambos flujos de trabajo evitan la necesidad de extracción de ADN, ofreciendo ahorros significativos en coste y tiempo.

Métodos de secuenciación

En principio, la secuenciación de próxima generación (NGS) es similar a la secuenciación basada en Sanger o CE. Las bases de un pequeño fragmento de ADN se identifican secuencialmente a partir de señales emitidas a medida que cada fragmento se vuelve a sintetizar a partir de una cadena molde de ADN. La NGS extiende este proceso a lo largo de millones de reacciones en forma masiva paralela, en lugar de limitarse a uno o algunos fragmentos de ADN. Este avance permite la secuenciación rápida de tramos grandes de ADN, con los últimos instrumentos capaces de producir cientos de gigabases de datos en un solo experimento de secuenciación. Para ilustrar cómo funciona este proceso, considere una sola muestra de ADN genómico (ADNg). El ADNg se fragmenta primero en una biblioteca de segmentos pequeños y se secuencian. Las cadenas de bases recién identificadas, llamadas lecturas, entonces se vuelven a ensamblar usando un genoma de referencia conocido como andamio (resecuenciación), o se ensamblan entre sí usando técnicas computacionales avanzadas si no hay genoma de referencia disponible (secuenciación de novo). El conjunto completo de lecturas alineadas pone de manifiesto la secuencia genómica completa de la muestra. Una vez que la biblioteca de muestras está preparada, todas las etapas de secuenciación a través del análisis de datos se pueden realizar en un solo instrumento, lo que facilita un tiempo de respuesta rápido con un tiempo práctico mínimo.

Con la NGS, los investigadores pueden comenzar directamente a partir de una biblioteca de ADNg o ADNc. Luego, los fragmentos de ADN se ligan a adaptadores de oligonucleótidos específicos necesarios para realizar la bioquímica de la secuenciación, que requiere tan solo 90 minutos con la tecnología Nextera® de Illumina. En contraste, la secuenciación de Sanger basada en CE requiere que el ADN genómico sea fragmentado primero y clonado en cromosomas artificiales bacterianos (BAC) o cromosomas artificiales de levadura (YAC). Luego, cada BAC/YAC se debe subclonar adicionalmente en un vector de secuenciación y transformar en el hospedante microbiano apropiado. Después el ADN molde se purifica de colonias o placas individuales antes de la secuenciación. Este procedimiento puede tardar días o incluso semanas en completarse.

Tecnología de secuenciación por síntesis (SBS)

Los instrumentos y reactivos de secuenciación de Illumina son compatibles con la secuenciación masiva paralela utilizando un método patentado que detecta bases individuales a medida que se incorporan en cadenas de ADN en crecimiento.

Química de la SBS

Se crea una imagen de un terminador reversible marcado con fluorescencia a medida que se añade cada dNTP, y luego se escinde para permitir la incorporación de la siguiente base. Dado que los cuatro dNTP unidos al terminador reversible están presentes durante cada ciclo de secuenciación, la competencia natural minimiza el sesgo de incorporación. El resultado final es una verdadera secuencia de base a base que posibilita los datos más precisos de la industria para una amplia gama de aplicaciones.

Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse junto con una variedad de técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos. Las técnicas particularmente aplicables son aquellas en las que los ácidos nucleicos se unen en ubicaciones fijas en una matriz de manera que sus posiciones relativas no cambian y en donde se crean imágenes de la matriz repetidamente. Los métodos en los que se obtienen imágenes en diferentes canales de color, por ejemplo, coincidiendo con diferentes marcadores utilizados para distinguir un tipo de base de nucleótidos de otro, son particularmente aplicables. En algunos métodos, el procedimiento para determinar la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo puede ser un proceso automatizado. Los métodos preferidos incluyen técnicas de secuenciación por síntesis ("SBS").

Las técnicas de SBS generalmente implican la extensión enzimática de una cadena de ácido nucleico naciente a través de la adición iterativa de nucleótidos contra una cadena de molde. En los métodos tradicionales de SBS, se puede proporcionar un monómero nucleótido único a un nucleótido objetivo en presencia de una polimerasa en cada suministro. Sin embargo, en los métodos descritos en la presente memoria, se puede proporcionar más de un tipo de monómero nucleótido a un ácido nucleico objetivo en presencia de una polimerasa en un suministro.

La SBS puede utilizar monómeros nucleótidos que tienen un resto terminador o aquellos que carecen de cualquier resto terminador. Los métodos que utilizan monómeros nucleótidos que carecen de terminadores incluyen, por ejemplo, pirosecuenciación y secuenciación usando nucleótidos marcados con Y -fosfato, como se expone con más detalle a continuación. En los métodos que usan monómeros nucleótidos que carecen de terminadores, el número de nucleótidos añadidos en cada ciclo generalmente es variable y depende de la secuencia del molde y el modo de suministro de nucleótidos. Para las técnicas de SBS que utilizan monómeros nucleótidos que tienen un resto terminador, el terminador puede ser efectivamente irreversible en las condiciones de secuenciación utilizadas, como es el caso de la secuenciación de Sanger tradicional que utiliza didesoxinucleótidos, o el terminador puede ser reversible, como es el caso de los métodos de secuenciación desarrollados por Solexa (ahora Illumina, Inc.).

Las técnicas de SBS pueden utilizar monómeros nucleótidos que tienen un resto marcador o aquellos que carecen de un resto marcador. En consecuencia, los sucesos de incorporación se pueden detectar en función de una característica del marcador, tal como la fluorescencia del marcador; una característica del monómero nucleótido tal como el peso molecular o carga; un subproducto de la incorporación del nucleótido, tal como la liberación de pirofosfato; o similares. En los métodos, donde están presentes dos o más nucleótidos diferentes en un reactivo de secuenciación, los diferentes nucleótidos pueden distinguirse entre sí, o alternativamente, los dos o más marcadores diferentes pueden ser indistinguibles con las técnicas de detección que se utilizan. Por ejemplo, los diferentes nucleótidos presentes en un reactivo de secuenciación pueden tener diferentes marcadores y pueden distinguirse usando técnicas ópticas apropiadas como se ilustra mediante los métodos de secuenciación desarrollados por Solexa (ahora Illumina, Inc.).

Los métodos preferidos incluyen técnicas de pirosecuenciación. La pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi) a medida que se incorporan nucleótidos particulares en la cadena naciente (Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. y Nyren, P. (1996) "Real-Time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release". Analytical Biochemistry 242 (1), 84-9; Ronaghi, M. (2001) "Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing". Genome Res. 11 (1), 3-11; Ronaghi, M., Uhlen, M. y Nyren, P. (1998) "A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363; Patente de EE.UU. N° 6,210,891; Patente de EE.UU. N° 6,258,568 y Patente de EE.UU. N° 6,274,320). En la pirosecuenciación, el PPi liberado puede detectarse al convertirse inmediatamente en trifosfato de adenosina (ATP) por la ATP sulfurilasa, y el nivel de ATP generado se detecta a través de los fotones producidos por la luciferasa. Los ácidos nucleicos que se van a secuenciar se pueden unir a características de una matriz y se puede obtener una imagen de la matriz para capturar las señales quimioluminiscentes que se producen debido a la incorporación de nucleótidos en las características de la matriz. Se puede obtener una imagen después de que la matriz sea tratada con un tipo de nucleótido particular (p. ej., A, T, C o G). Las imágenes obtenidas después de la adición de cada tipo de nucleótido diferirán con respecto a qué características de la matriz se detectan. Estas diferencias en la imagen reflejan el contenido de secuencia diferente de las características en la matriz. Sin embargo, las ubicaciones relativas de cada característica permanecerán sin cambios en las imágenes. Las imágenes se pueden almacenar, procesar y analizar utilizando los métodos expuestos en el presente documento. Por ejemplo, las imágenes obtenidas después del tratamiento de la matriz con cada tipo de nucleótido diferente se pueden manejar de la misma manera que se ilustra en el presente documento para imágenes obtenidas de diferentes canales de detección para métodos de secuenciación basados en terminadores reversibles.

En otro tipo de SBS de ejemplo, la secuenciación cíclica se lleva a cabo mediante la adición gradual de nucleótidos terminadores reversibles que contienen, por ejemplo, un marcador de colorante escindible o fotoblanqueable como se describe, por ejemplo, en el documento WO 04/018497 y Patente de EE.UU. N° 7,057,026. Este enfoque está siendo comercializado por Solexa (ahora Illumina Inc.), y también se describe en los documentos WO 91/06678 y WO 07/123,744. La disponibilidad de terminadores marcados con fluorescencia en los que se puede tanto invertir la terminación como escindir el marcador fluorescente, facilita la secuenciación eficiente de terminación reversible cíclica (CRT). Las polimerasas también se pueden modificar genéticamente conjuntamente para incorporar y extenderse eficientemente a partir de estos nucleótidos modificados.

Preferiblemente en los métodos de secuenciación basados en terminadores reversibles, los marcadores no inhiben sustancialmente la extensión en las condiciones de reacción de SBS. Sin embargo, los marcadores de detección pueden ser eliminables, por ejemplo, por escisión o degradación. Las imágenes se pueden capturar después de la incorporación de marcadores en características de ácido nucleico en matrices. En métodos particulares, cada ciclo implica el suministro simultáneo de cuatro tipos diferentes de nucleótidos a la matriz y cada tipo de nucleótido tiene un marcador espectralmente distinto. Entonces se pueden obtener cuatro imágenes, usando cada una un canal de detección que es selectivo para uno de los cuatro marcadores diferentes. Alternativamente, se pueden añadir diferentes tipos de nucleótidos secuencialmente y se puede obtener una imagen de la matriz entre cada etapa de adición. En dichos métodos, cada imagen mostrará características de ácido nucleico que han incorporado nucleótidos de un tipo particular. Diferentes características estarán presentes o ausentes en las diferentes imágenes debido al diferente contenido en la secuencia de cada característica. Sin embargo, la posición relativa de las características permanecerá sin cambios en las imágenes. Las imágenes obtenidas de dichos métodos de terminador reversible-SBS se pueden almacenar, procesar y analizar como se expone en el presente documento. Después de la etapa de captura de imágenes, se pueden eliminar los marcadores y se pueden eliminar los restos terminadores reversibles para los ciclos posteriores de adición y detección de nucleótidos. La eliminación de los marcadores después de que se hayan detectado en un ciclo particular y antes de un ciclo posterior puede proporcionar la ventaja de reducir la señal de fondo y la interferencia entre ciclos. A continuación, se exponen ejemplos de marcadores útiles y métodos de eliminación.

En métodos particulares, algunos o todos los monómeros nucleótidos pueden incluir terminadores reversibles. En dichos métodos, los terminadores reversibles/flúor escindibles pueden incluir flúor unido al resto ribosa por un enlace éster 3' (Metzker, Genome Res. 15: 1767-1776 (2005)). Otros planteamientos han separado la química del terminador de la escisión del marcador de fluorescencia (Ruparel et al., Proc Natl Acad Sci USA 102: 5932-7 (2005)). Ruparel et al. describieron el desarrollo de terminadores reversibles que usaban un pequeño grupo 3' alilo para bloquear la extensión, pero que podían desbloquearse fácilmente mediante un tratamiento corto con un catalizador de paladio. El fluoróforo se unía a la base a través de un conector fotoescindible que podría ser escindido fácilmente por una exposición de 30 segundos a luz UV de longitud de onda larga. Por lo tanto, se puede usar la reducción de disulfuro o la fotoescisión como un conector escindible. Otro planteamiento para la terminación reversible es el uso de terminación natural que se produce después de la colocación de un colorante voluminoso en un dNTP. La presencia de un colorante voluminoso cargado en el dNTP puede actuar como un terminador efectivo por impedimento estérico y/o electrostático. La presencia de un suceso de incorporación evita nuevas incorporaciones a menos que se elimine el colorante. La escisión del colorante elimina el flúor e invierte efectivamente la terminación. También se describen ejemplos de nucleótidos modificados en la patente de EE.UU. N° 7,427,673 y la patente de EE.UU. N° 7,057,026.

Los sistemas y métodos de SBS de ejemplo adicionales que se pueden utilizar con los métodos y sistemas descritos en el presente documento se describen en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2007/0166705, publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2006/0188901, patente de EE.UU. N° 7,057,026, publicación de solicitud de patente de EE.Uu . N° 2006/0240439, publicación de solicitud de patente de EE.UU. No. 2006/0281109, publicación PCT N° WO 05/065814, publicación de solicitud de patente de EE.Uu . N° 2005/0100900, publicación PCT N° WO 06/064199, publicación PCT N° WO 07/010,251, publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2012/0270305 y publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2013/0260372.

Algunos métodos pueden utilizar la detección de cuatro nucleótidos diferentes utilizando menos de cuatro marcadores diferentes. Por ejemplo, la SBS se puede realizar utilizando los métodos y sistemas descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2013/0079232. Como primer ejemplo, se puede detectar un par de tipos de nucleótidos a la misma longitud de onda, pero distinguirlos en función de una diferencia de intensidad para un miembro del par en comparación con el otro, o en función de un cambio en un miembro del par (p. ej., mediante modificación química, modificación fotoquímica o modificación física) que hace que la señal aparente aparezca o desaparezca en comparación con la señal detectada para el otro miembro del par. Como un segundo ejemplo, se pueden detectar tres de cuatro tipos diferentes de nucleótidos en condiciones particulares, mientras que un cuarto tipo de nucleótido carece de un marcador que sea detectable en esas condiciones, o se detecta mínimamente en esas condiciones (p. ej., detección mínima debido a fluorescencia de fondo, etc.). La incorporación de los primeros tres tipos de nucleótidos en un ácido nucleico puede determinarse en función de la presencia de sus respectivas señales y la incorporación del cuarto tipo de nucleótido en el ácido nucleico puede determinarse basándose en la ausencia o detección mínima de cualquier señal. Como un tercer ejemplo, un tipo de nucleótido puede incluir marcador(es) que se detecta(n) en dos canales diferentes, mientras que otros tipos de nucleótidos se detectan en no más de uno de los canales. Las tres configuraciones de ejemplo mencionadas anteriormente no se consideran mutuamente excluyentes y pueden usarse en varias combinaciones. Un método de ejemplo que combina los tres ejemplos es un método de SBS basado en fluorescencia que utiliza un primer tipo de nucleótido que se detecta en un primer canal (p. ej., dATP que tiene un marcador que se detecta en el primer canal cuando es excitado por una primera longitud de onda de excitación), un segundo tipo de nucleótido que se detecta en un segundo canal (p. ej., dCTP que tiene un marcador que se detecta en el segundo canal cuando es excitado por una segunda longitud de onda de excitación), un tercer tipo de nucleótido que se detecta tanto en el primer como en el segundo canal (p. ej., dTTP que tiene al menos un marcador que se detecta en ambos canales cuando es excitado por la primera y/o la segunda longitud de onda de excitación) y un cuarto tipo de nucleótido que carece de un marcador que no se detecta, o se detecta mínimamente, en ninguno de los canales (p. ej., dGTP que no tiene marcador).

Además, como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2013/0079232, los datos de secuenciación se pueden obtener utilizando un solo canal. En los llamados planteamientos de secuenciación de un colorante, el primer tipo de nucleótido se marca, pero el marcador se elimina después de que se genera la primera imagen, y el segundo tipo de nucleótido se marca solo después de que se genera una primera imagen. El tercer tipo de nucleótido conserva su marcador tanto en la primera como en la segunda imagen, y el cuarto tipo de nucleótido permanece sin marcar en ambas imágenes.

Algunos métodos pueden utilizar la secuenciación por técnicas de ligadura. Dichas técnicas utilizan ADN ligasa para incorporar oligonucleótidos e identificar la incorporación de dichos oligonucleótidos. Los oligonucleótidos típicamente tienen diferentes marcadores que se correlacionan con la identidad de un nucleótido particular en una secuencia con la cual los oligonucleótidos hibridan. Al igual que con otros métodos de SBS, se pueden obtener imágenes después del tratamiento de una matriz de características de ácidos nucleicos con los reactivos de secuenciación marcados. Cada imagen mostrará características de ácidos nucleicos que han incorporado marcadores de un tipo particular. Las diferentes características estarán presentes o ausentes en las diferentes imágenes debido al contenido diferente en la secuencia de cada característica, pero la posición relativa de las características permanecerá sin cambios en las imágenes. Las imágenes obtenidas de los métodos de secuenciación basados en ligadura se pueden almacenar, procesar y analizar como se expone en el presente documento. Los sistemas y métodos de SBS de ejemplo que se pueden utilizar con los métodos y sistemas descritos en el presente documento se describen en la patente de EE.UU. N26.969.488, patente de EE.UU. N26,172,218 y patente de EE.UU. N26,306,597.

Algunos métodos pueden utilizar la secuenciación de nanoporos (Deamer, D. W. y Akeson, M. "Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing". Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer, D. y D. Branton, "Characterization of nucleic acids by nanopore analysis". Acc. Chem Res. 35: 817-825 (2002); Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin y J. A. Golovchenko, "DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope" Nat. Mater. 2: 611-615 (2003)). En dichos métodos, el ácido nucleico objetivo pasa a través de un nanoporo. El nanoporo puede ser un poro sintético o una proteína de membrana biológica, tal como la a-hemolisina. A medida que el ácido nucleico objetivo pasa a través del nanoporo, se puede identificar cada par de bases midiendo las fluctuaciones en la conductancia eléctrica del poro. (Patente de EE.Uu . N° 7,001,792; Soni, G. V. y Meller, "A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores". Clin. Chem 53, 1996-2001 (2007); Healy, K. "Nanopore-based singlemolecule DNA analysis". Nanomed 2, 459-481 (2007); Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. y Ghadiri, M. R. "A singlemolecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution" J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)). Los datos obtenidos de la secuenciación de nanoporos se pueden almacenar, procesar y analizar como se expone en el presente documento. En particular, los datos pueden tratarse como una imagen de acuerdo con el tratamiento de ejemplo de imágenes ópticas y otras imágenes que se exponen en el presente documento.

Algunos métodos pueden utilizar métodos que implican el seguimiento en tiempo real de la actividad de la ADN polimerasa. Las incorporaciones de nucleótidos se pueden detectar mediante interacciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre una polimerasa que contiene fluoróforo y nucleótidos marcados con Y-fosfato como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.Uu . N° 7,329,492 y la patente de EE.UU. N° 7,211,414 o las incorporaciones de nucleótidos se pueden detectar con guías de onda de modo cero como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 7,315,019 y el uso de análogos de nucleótidos fluorescentes y polimerasas genéticamente modificadas como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 7,405,281 y la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2008/0108082. La iluminación se puede restringir a un volumen a escala de zeptolitros alrededor de una polimerasa fijada a la superficie de manera que se pueda observar la incorporación de nucleótidos marcados con fluorescencia con nivel de fondo bajo (Levene, M. J. y col. "Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations". Science 299, 682-686 (2003); Lundquist, P. M. et al. "Parallel confocal detection of single molecules in real time". Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach, J. et al. "Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008). Las imágenes obtenidas de dichos métodos se pueden almacenar, procesar y analizar como se expone en el presente documento.

Algunos métodos de SBS incluyen la detección de un protón liberado tras la incorporación de un nucleótido en un producto de extensión. Por ejemplo, la secuenciación basada en la detección de protones liberados puede usar un detector eléctrico y técnicas asociadas que están disponibles en el mercado en Ion Torrent (Guilford, CT, una subsidiaria de Life Technologies) o los métodos y sistemas de secuenciación descritos en los documentos US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; o US 2010/0282617 A1. Los métodos expuestos en el presente documento para amplificar ácidos nucleicos objetivo que usan exclusión cinética se pueden aplicar fácilmente a sustratos utilizados para detectar protones. Más específicamente, los métodos expuestos en el presente documento pueden usarse para producir poblaciones clonales de amplicones que se usan para detectar protones.

Los métodos de SBS anteriores se pueden llevar a cabo ventajosamente en formatos multiplexados de manera que múltiples ácidos nucleicos objetivo diferentes se manipulan simultáneamente. En métodos particulares, se pueden tratar diferentes ácidos nucleicos objetivo en un recipiente de reacción común o en una superficie de un sustrato particular. Esto permite el suministro conveniente de reactivos de secuenciación, la eliminación de reactivos sin reaccionar y la detección de sucesos de incorporación de una manera multiplexada. En los métodos que utilizan ácidos nucleicos objetivo unidos a la superficie, los ácidos nucleicos objetivo pueden estar en un formato de matriz. En un formato de matriz, los ácidos nucleicos objetivo pueden unirse típicamente a una superficie de una manera espacialmente distinguible. Los ácidos nucleicos objetivo pueden unirse por unión covalente directa, unión a una perla u otra partícula o unión a una polimerasa u otra molécula que está unida a la superficie. La matriz puede incluir una copia única de un ácido nucleico objetivo en cada sitio (también denominado característica) o pueden estar presentes múltiples copias que tienen la misma secuencia en cada sitio o característica. Se pueden producir copias múltiples por métodos de amplificación tales como amplificación en puente o PCR en emulsión como se describe con más detalle a continuación.

Los métodos expuestos en el presente documento pueden usar matrices que tienen características en cualquiera de una variedad de densidades que incluyen, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 características/cm2, 100 características/cm2, 500 características/cm2, 1000 características/cm2, 5000 características/cm2, 10000 características/cm2, 50000 características/cm2, 100000 características/cm2, 1000000 características/cm2, 5000000 características/cm2, o mayor.

Una ventaja de los métodos expuestos en el presente documento es que proporcionan una detección rápida y eficiente de una pluralidad de ácidos nucleicos objetivo en paralelo. Por consiguiente, la presente descripción proporciona sistemas integrados capaces de preparar y detectar ácidos nucleicos usando técnicas conocidas en la técnica tales como las ilustradas anteriormente. Por lo tanto, un sistema integrado de la presente descripción puede incluir componentes fluídicos capaces de suministrar reactivos de amplificación y/o reactivos de secuenciación a uno o más fragmentos de ADN inmovilizados, comprendiendo el sistema componentes tales como bombas, válvulas, depósitos, conductos fluídicos y similares. Una celda de flujo puede configurarse y/o usarse en un sistema integrado para la detección de ácidos nucleicos objetivo. Las celdas de flujo de ejemplo se describen, por ejemplo, en los documentos US 2010/0111768 A1 y N° de serie de EE.UU. 13/273,666. Como se ilustra para las celdas de flujo, se pueden usar uno o más de los componentes fluídicos de un sistema integrado para un método de amplificación y para un método de detección. Tomando una realización de secuenciación de ácido nucleico como ejemplo, uno o más de los componentes fluídicos de un sistema integrado se pueden usar para un método de amplificación expuesto en el presente documento y para el suministro de reactivos de secuenciación en un método de secuenciación como los ilustrados anteriormente. Alternativamente, un sistema integrado puede incluir sistemas fluídicos separados para llevar a cabo métodos de amplificación y llevar a cabo métodos de detección. Los ejemplos de sistemas de secuenciación integrados que son capaces de crear ácidos nucleicos amplificados y también determinar la secuencia de los ácidos nucleicos incluyen, sin limitación, la plataforma MiSeq™ (Illumina, Inc., San Diego, CA) y los dispositivos descritos en el documento N° de serie de EE.UU. 13/273,666.

La descripción detallada anterior de los métodos se refiere a los dibujos adjuntos, que ilustran métodos específicos de la presente descripción. Otros métodos que tienen estructuras y operaciones diferentes no se apartan del alcance de la presente descripción. Esta memoria descriptiva se divide en secciones para conveniencia del lector solamente. Los encabezados no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención, que en su lugar se define por las reivindicaciones adjuntas. Además, la descripción anterior tiene solo fines ilustrativos y no fines de limitación.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una muestra para la amplificación de bibliotecas y la amplificación posterior que comprende las siguientes etapas:

(a) en una muestra celular proporcionada que contiene ácido nucleico;

(b) lisar las células de la muestra con un reactivo de lisis para liberar el ácido nucleico del interior de las células de la muestra celular, formando así un lisado; y

(c) amplificar el ácido nucleico de las muestras lisadas para formar ácidos nucleicos amplificados;

(d) exponer los ácidos nucleicos amplificados a una superficie sólida con cebadores de amplificación inmovilizados, inmovilizando así los ácidos nucleicos amplificados en la superficie sólida; y

(e) amplificar clonalmente los ácidos nucleicos amplificados inmovilizados en la superficie sólida para generar grupos;

en donde no hay purificación del ácido nucleico del lisado antes de comenzar la etapa de amplificación (c); y en donde la amplificación del ácido nucleico en la etapa (c) comprende tagmentación.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico es ADN.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la muestra es una muestra de sangre, una muestra de sangre completa o una muestra de sangre seca.

4. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde el reactivo de lisis es agua o agua purificada/destilada.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el reactivo de lisis es un detergente, un detergente lítico no desnaturalizante, una base, un ácido y/o una enzima.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el reactivo de lisis comprende un agente reductor, un agente estabilizante, 2-mercaptoetanol o ditiotreitol.

7. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde la etapa (b) comprende tratar las células de la muestra o el lisado con una enzima que altera la estructura del ADN.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la enzima que altera la estructura del ADN es la proteinasa K.

9. El método de cualquier reivindicación precedente, que comprende además neutralizar el reactivo de lisis y/o la enzima que altera la estructura del ADN antes de la etapa de amplificación (c) para inactivar el reactivo de lisis y/o la enzima que altera la estructura del ADN.

10. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde las etapas de lisar la muestra y amplificar el ácido nucleico contenido en el lisado se llevan a cabo en una reacción en un solo recipiente.

11. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde los ácidos nucleicos amplificados inmovilizados se secuencian mediante secuenciación de alto rendimiento o mediante un protocolo de secuenciación por síntesis para determinar sus secuencias.

12. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde la muestra celular que contiene ácido nucleico es una muestra FFPE (embebida en parafina fijada en formalina).

13. El método de la reivindicación 12, en donde la amplificación clonal de los ácidos nucleicos amplificados inmovilizados en la superficie sólida para generar grupos se realiza en presencia de al menos 0.001 pg de parafina.

14. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde la amplificación clonal de los ácidos nucleicos amplificados inmovilizados en la superficie sólida para generar grupos se realiza en presencia de (a) proteinasa K y/o (b) uno o más de formalina, parafina, componentes celulares, proteínas, componentes de la matriz extracelular, colágeno y restos de tejido.

15. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde la tagmentación se realiza usando tagmentación basada en perlas.