CN110511978A - Ffpe样本dna文库及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种FFPE样本DNA文库及其构建方法。该构建方法包括对FFPE样本DNA进行变性处理，得到单链DNA；采用随机引物对单链DNA进行随机扩增延伸，得到双链DNA，随机引物按5’端到3’端的方向依次包含第一端接头序列及随机序列；对双链DNA进行第二端接头的连接，得到连接产物；对连接产物进行PCR富集，得到FFPE样本DNA文库。上述方法中第一端接头的连接通过PCR扩增的方式引入，因而接头连接体系与PCR富集体系兼容性强，便于省掉接头连接后磁珠纯化过程以降低模板的损失，既简化操作流程，又提高建库成功率，有效解决了降解严重的FFPE样本建库困难及DNA模板利用率低的问题。

Description

FFPE样本DNA文库及其构建方法
技术领域
本发明涉及文库构建领域，具体而言，涉及一种FFPE样本DNA文库及其构建方法。
背景技术
FFPE(Formalin-Fixed and Parrffin Embedded)，即福尔马林固定石蜡包埋样本。由于这种处理方法能够较长时间地保存组织或制备检验所需的组织标本，所以在临床病理检验、肿瘤基因检测中应用广泛。
在福尔马林中保存的DNA样品材料，一般而言，该条件下DNA会呈现高度片段化，并且与蛋白质交联存在。尽管通过加热处理可以部分消除这些交联存在的结构，但是加热过程同样也会使DNA链变性，从而影响DNA文库的构建效率。因此FFPE样本特殊的制作方法和保存过程都会对核酸分子造成多方面的影响。组织医学样本在离体后即开始发生降解，福尔马林的固定使组织中的核酸与核酸或核酸与蛋白之间交联，石蜡的渗入过程进一步加速核酸的降解，保存时间及环境对样品中的核酸也有极大的影响。所以FFPE样本中的核酸质量往往质量很差，DNA部分碱基的损失，影响建库过程中接头连接效率，进而影响文库构建的产量以及均一性，严重的可能导致建库失败。
目前针对illumina测序平台的双链DNA建库方法为FFPE样本的主流建库方法。双链文库构建的核心流程大致相同：末端修复、接头连接、片段选择、PCR扩增以及文库纯化。也有文献报道用单链DNA建库的方法用于FFPE或类似质量较差的样本。单链DNA分子文库构建过程中首先利用热变性原理使DNA双链分子解链形成DNA单链分子，然后单链分子两端连接单链接头之后在酶的作用下完成PCR扩增复制。
双链DNA所需建库样本量较大，如穿刺组织的FFPE样本，5～10年的FFPE样本等存在提前DNA量不能后续建库需求；由于在建库过程中需要多步纯化过程，因此某些较短的或者超短的DNA，单链的DNA，严重损伤的DNA均被损失。在DNA双链文库的建立过程中，两条链出现不同程度损伤的DNA分子通常会被舍弃；双链分子中一条链的末端修饰可能完全地抑制接头的连接，双链文库的构建方法不适用于所有的FFPE样本，特别是保存时间久，质量较差，提取量少的样本。
文献中单链模板加单链接头的方法，单链接头是一条短的核酸序列，在该核酸序列的5′端存在1个磷酸基团，在3′端存在1个生物素化的间隔臂(3′-Biotinylated spacerarm)。在CircLigaseⅡssDNA Ligase连接酶的作用下，单链接头分子的5′端磷酸基团与DNA分子3′端-OH基团连接。加入含有链霉亲和素分子的磁珠后，利用生物素与链霉亲和素之间的作用，与单链接头连接的DNA分子以及过量的接头分子都可连接到磁珠上。使CircLigaseⅡssDNA Ligase连接酶，连接效率较低，反应时间长，需要生物素标记的磁珠，步骤繁琐，成本高。
因此，如何从FFPE样本中获得DNA建立合格的文库已成为当前测序研究领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种FFPE样本DNA文库及其构建方法，以解决现有技术中FFPE样本难以构建文库，或者所构建的文库中目的DNA利用效率低的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种FFPE样本DNA文库的构建方法，构建方法包括：对FFPE样本DNA进行变性处理，得到单链DNA；采用随机引物对单链DNA进行随机扩增延伸，得到双链DNA，随机引物按5’端到3’端的方向依次包含第一端接头序列及随机序列；对双链DNA进行第二端接头的连接，得到连接产物；对连接产物进行PCR富集，得到FFPE样本DNA文库。
进一步地，在对DNA进行变性处理前，构建方法还包括对DNA进行片段化处理，得到片段化的DNA。
进一步地，第二端接头的3’端带有磷酸化修饰或反向dT修饰。
进一步地，在对双链DNA进行第二端接头的连接步骤之前，构建方法还包括形成第二端接头的步骤；优选形成第二端接头的步骤包括：将接头1和接头2等质量混合，得到混合接头；对混合接头进行退火，得到第二端接头。
进一步地，随机引物中的随机序列的长度为1～10bp，优选为2～6bp；更优选地，随机引物为SEQ ID NO:1：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT NNNN-3’，其中NNNN为随机序列；进一步优选地，随机引物的退火温度为40～50℃，最优选为45～48℃；延伸温度为60～68℃，最优选为63～66℃。
进一步地，第二端接头中，接头1的序列为SEQ ID NO:2：5'-GACGCTCTTCCGATCT[Phos]-3’；接头2的序列为SEQ ID NO:3：5'-[Phos]GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT[Phos]-3’。
进一步地，第二端接头的连接温度为16～20℃。
进一步地，采用P5引物和P7引物对连接产物进行PCR富集，得到FFPE样本DNA文库；优选地，P5引物的序列为SEQ ID NO:4：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’，P7引物的序列为SEQ ID NO:5：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATN NNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，其中NNNNNN为标签序列。
进一步地，在对连接产物进行PCR富集之后，以及得到FFPE样本DNA文库之前，构建方法还包括对PCR富集后的产物进行纯化的步骤，优选采用磁珠进行纯化；更优选地，采用等体积的磁珠进行纯化。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种FFPE样本DNA文库，FFPE样本DNA文库采用上述任一种构建方法构建而成。
应用本发明的技术方案，该方法通过以单链DNA为模板，使得每一条单链DNA分子在文库的建立过程中都有独立的机会被获取，能够获得更多遗传信息，即有效保留了FFPE样本中的单链DNA信息。采用含有第一端接头序列的随机引物对单链DNA进行第二链的扩增，使得每一条单链DNA都能够作为模板进行随机引物合成第二链，不会出现连接单链接头的方法中一条单链因为末端改变不能连接上接头分子的情况，从而提高了模板DNA的利用率。然后再采用双链接头进行第二端接头的连接以及对接头连接产物进行PCR富集。本申请上述方法中，第一端接头的连接也是通过PCR扩增的方式引入的，因而接头连接体系与PCR富集体系兼容性强，因而便于省掉接头连接后的磁珠纯化过程以降低模板的损失，不仅简化操作流程，而且提高建库成功率，有效解决了降解严重的FFPE样本建库困难及FFPE样本DNA模板利用率低的问题。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1a至图1c分别示出了采用现有技术中的双链建库方法、单链建库方法及本申请改进方法进行文库构建的流程图；
图2a至图2c分别示出了采用现有技术中的双链建库方法、单链建库方法及本申请改进方法对样本AM105所构建的文库片段大小的检测结果；
图3a至图3c分别示出了采用现有技术中的双链建库方法、单链建库方法及本申请改进方法对样本AW455所构建的文库片段大小的检测结果；
图4a至图4c分别示出了采用现有技术中的双链建库方法、单链建库方法及本申请改进方法对样本AT070所构建的文库片段大小的检测结果。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，福尔马林的固定容易使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，石蜡的高温渗入过程进一步加速核酸的降解，保存的时间及环境对样品中的核酸也有巨大的影响，DNA降解严重，部分以单链的形式存在，穿刺样本受样本量限制，提取DNA量较少，为后续建库带来重重困难，从石蜡切片中提取出DNA，构建出信息完整、无偏好、可用于后续各类组学研究的文库，则是“大大”的难题。普通的双链建库方法，会丢失掉所用的单链DNA的模板，严重降低了模板的有效利用率，双链建库的成功率大打折扣。
为了改善上述缺陷，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种FFPE样本DNA文库的建库方法，该构建方法包括：对FFPE样本DNA进行变性处理，得到单链DNA；采用随机引物对单链DNA进行随机扩增延伸，得到双链DNA，随机引物按5’端到3’端的方向依次包含第一端接头序列及随机序列；对双链DNA进行第二端接头的连接，得到连接产物；对连接产物进行PCR富集，得到FFPE样本DNA文库。
该方法通过以单链DNA为模板，使得每一条单链DNA分子在文库的建立过程中都有独立的机会被获取，能够获得更多遗传信息，即有效保留了FFPE样本中的单链DNA信息。采用含有第一端接头序列的随机引物对单链DNA进行第二链的扩增，使得每一条单链DNA都能够作为模板进行随机引物合成第二链，不会出现连接单链接头的方法中一条单链因为末端改变不能连接上接头分子的情况，从而提高了模板DNA的利用率。然后再采用双链接头进行第二端接头的连接以及对接头连接产物进行PCR富集。本申请上述方法中，第一端接头的连接也是通过PCR扩增的方式引入的，因而接头连接体系与PCR富集体系兼容性强，因而便于省掉接头连接后的磁珠纯化过程以降低模板的损失，不仅简化操作流程，而且提高建库成功率，有效解决了降解严重的FFPE样本建库困难及FFPE样本DNA模板利用率低的问题。
需要说明的是，现有技术中在采用单链接头进行文库构建时，在热变性解开双链DNA之前，用热敏碱性磷酸酶(FastAP)除去DNA链中的5’端和3’端的磷酸基团。因为DNA分子中磷酸基团的存在提供了自连的可能性，会妨碍接头分子与DNA单链的连接，因而在连接单链接头之前还需要将其除去。
上述构建方法中，所处理的FFPE样本DNA降解很严重时即可省略对DNA进行打断的步骤。而当降解不太严重时，则在变性处理之前对样本DNA进行打断处理。因此，在一种优选的实施例中，在对DNA进行变性处理前，上述构建方法还包括对DNA进行片段化处理，得到片段化的DNA。
上述构建方法中，采用双链接头进行第二端接头的连接能够在一定程度上降低接头的自连，为了进一步降低接头自连，在一种优选的实施例中，第二端接头的3’端带有磷酸化修饰或者反向dT(去-OH)。
在一种优选的实施例中，在对双链DNA进行第二端接头的连接步骤之前，构建方法还包括形成第二端接头的步骤；优选形成第二端接头的步骤包括接头1和接头2等质量混合，得到混合接头；对混合接头进行退火，得到第二端接头。通过先将两个单链接头退火形成双链接头能够减少单链接头之间形成接头二聚体或者接头自连的概率。
上述包含第一端接头的随机引物中的第一端接头与第二端接头的具体序列可以根据待构建文库的测序平台所用到的接头序列进行合理改进设计。随机引物中的随机序列的随机性越强越好，因而在设计时，不对碱基类型进行限定，即最好采用N，以使得A、T、C和G四种碱基类型均能进行有效扩增。随机序列的具体长度可以根据实际需要进行优化选择，比如可以是1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp或者更长。在一种优选的实施例中，随机序列的长度为1～10bp，优选为2～6bp，更优选为3～5bp。根据具体的第一端接头序列及随机序列的不同，其随机扩增延伸的具体温度条件也有所不同，可以根据实际序列进行优化选择。
在一种优选的实施例中，随机引物为SEQ ID NO:1：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTNNNN-3’，其中NNNN为随机序列。进一步优选地，随机引物的退火温度为40～50℃，最优选为45～48℃；延伸温度为60～68℃，最优选为63～66℃。在上述温度范围内进行随机扩增延伸，扩增效率相对较高。
第二端接头的序列与第一端接头的序列是配套使用的，因而根据测序平台的不同而不同。在选定了测序平台的情况下，第二端接头的序列根据第一端接头序列进行合理确定。在一种优选的实施例中，接头1的序列为SEQ ID NO:2：5'-GACGCTCTTCCGATCT[Phos]-3’；接头2的序列为SEQ ID NO:3：5'-[Phos]GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT[Phos]-3’。采用上述接头1和接头2退火而成的双端接头具有提高连接效率，降低接头自连的有益效果。在接头1的3’进行磷酸化修饰，在接头2的3’进行磷酸化修饰，有效减少了接头自连，而在接头2的5'进行磷酸化修饰，更利于接头和目的片段的连接，连接效率提高。
接头1的3’端和接头2的5'端序列互补，接头1的3’端多出一个T，与目的片段通过TA连接。
根据上述第二接头的序列及连接酶具体种类的不同，连接条件略有差异。在实际应用中，可以根据实际情况进行优化选择。在一种优选的实施例中，第二端接头的连接温度为16～20℃。该温度条件适用于大多数的连接酶，比如Kapa连接酶等。
根据测序平台的不同，可以在PCR富集步骤引入相应的测序引物序列。在一种优选的实施例中，采用P5引物和P7引物对连接产物进行PCR富集，得到FFPE样本DNA文库。P5引物和P7引物为illumina测序平台的通用PCR富集引物，根据单端测序或双端测序等测序策略的不同，可以在P7引物上或者在P5和P7两条引物上分别引入单端测序引物或双端测序引物。
在一种优选的实施例中，在对连接产物进行PCR富集之后，以及得到FFPE样本DNA文库之前，构建方法还包括对PCR富集后的产物进行纯化的步骤，优选采用磁珠进行纯化；更优选地，采用等体积的磁珠进行纯化。
本申请的上述第一端接头的连接是通过PCR延伸扩增的方式进入的，因而本申请中的接头连接体系与PCR富集体系兼容性强，因而也可以省掉接头连接后的磁珠纯化过程，降低了模板的损失，简化操作流程，整个建库过程中只需在PCR富集后进行一步XP磁珠纯化(如需纯化)，建库成功率高，有效解决了降解严重的FFPE样本建库困难的问题。
在第二种典型的实施方式中，提供了一种FFPE样本DNA文库，该FFPE样本DNA文库采用上述任一种构建方法构建而成。上述建库方法，操作步骤相对简单，整个建库过程中仅进行一步XP磁珠纯化即可，减少了模板损失，建库成功率高，解决了FFPE建库困难的问题。而且，所构建的文库中FFPE样本DNA的有效数据量高。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
实施例1
本发明选取3例临床FFPE样本，提取DNA，经过片段化(200bp左右)、然后再通过新型的建库方法得到DNA文库。
具体流程如下：
一、采用试剂盒提取FFPE样本的基因组DNA(NuClean Magbead FFPE DNA Kit，新型磁珠法固定组织DNA提取试剂盒，康为，CW2558S)。
1.用手术刀将组织块中多余的石蜡修剪掉，露出组织后切成5-10μm的薄片。
2.取约1×1cm2的切片(共约3-8片切片)置于离心管(自备)中，加入160μL脱蜡液(Buffer DS)，涡旋震荡10秒。短暂离心将样本收集到管底，56℃孵育3分钟，水浴锅中取出后静置，降至室温后进行下一步操作。注意：如果样品表面暴露在空气中，最初的2-3片弃掉不用。
3.向上述管中加入180μL裂解液(Buffer GTL)，涡旋震荡混匀，12,000rpm离心1分钟，溶液分为两层。取20μl蛋白酶K(Proteinase K)加入到下层溶液中，用移液器小心吹吸混匀。
4.56℃孵育1小时(可延长56℃的孵育时间直至样品完全溶解)。然后90℃孵育1小时(90℃孵育是为了解除福尔马林与核酸交联，修复变性的核酸；温度过高或者孵育时间过长会导致DNA断裂进而损害DNA完整性；温度较低或者孵育时间过短会导致DNA与福尔马林解交联不彻底，影响DNA得率)。样品室温静置30秒后25℃、12,000rpm离心1分钟，使用200μl枪头沿管壁小心吸取下层的水相(Lysate)于新的离心管中，尽量避免吸入蜡液或者沉淀。
注意：56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到90℃后再把样品置于90℃孵育。
5.可选步骤，如果少量RNA的存在会对下游实验造成影响，建议向水相(Lysate)中加入2μL浓度为100mg/mL的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置2min。
6.向离心管中加入200μL盐离子缓冲液(Buffer GL)并涡旋震荡混匀。
7.向离心管中加入200μL异丙醇与10μL磁珠后涡旋震荡混匀5秒钟，之后将离心管固定于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡结合10分钟。
8.将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液。
9.向离心管中加入750μL漂洗液(Buffer GW1)(使用前请检查是否已加入无水乙醇)，涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟。
10.将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液。
11.重复步骤9-10。
12.向离心管中加入750μL漂洗液(Buffer GW2)(使用前请检查是否已加入无水乙醇)，涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟。
13.将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液。
14.重复步骤12-13。
15.离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，之后开盖室温放置5-10分钟使乙醇充分挥发。
16.向离心管中加入50-200μL Buffer EB洗脱液后涡旋震荡使磁珠充分悬浮于洗脱液中，之后将离心管固定于56℃、1600rpm的恒温混匀上震荡洗脱10分钟。
17.将离心管固定于磁力架上静置2分钟，之后将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
二.文库构建：
3个样本采用本申请的方法进行文库构建(流程如图1c所示)，同时采用对照双链建库方法和现有单链建库方法作为对照。
双链建库方法按图1a所示流程进行操作，简述如下：末端修复、加A、接头连接、磁珠纯化、PCR扩增以及文库纯化，一般需要4个小时完成建库。
单链建库方法按图1b所示操作流程进行建库。简述如下：在对片段化DNA进行高温变性处理(从双链DNA转变成单链DNA)之前，对双链DNA进行去磷酸化处理，去掉双链DNA末端可能残留的磷酸基团，这样可以避免接头连接反应过程中单链环化。接下来将一个5'端磷酸化，3'端生物素化的接头进行连接反应，使得所有的单链DNA的3'端连上接头，通过链霉亲和素磁珠进行吸附，固定在链霉亲和素磁珠上。然后利用一段延伸引物去扩增，形成双链结构，在双链的另一端加上双链接头，如此引入测序引物的Index Read 1和Index Read2，接下来通过PCR反应将整个测序引物引入目标片段，以备上机使用。操作步骤较繁琐，需要16-17个小时完成建库。
本申请的建库流程如图1c所示，简述如下：1)FFPE样本DNA的提取；2)DNA片段化处理：确定提取的FFPE DNA样本的降解程度，根据降解程度决定是否打断；3)DNA变性；4)带有第一端接头序列和随机序列的随机引物进行扩增延伸反应，合成二链；5)利用T-A连接对第二端的双链接头进行添加；6)PCR扩增，引入barcode：使用带barcode的引物序列，靶向富集DNA分子；7)磁珠纯化PCR扩增产物。整个建库过程只需要3.5个小时。
本实施例中采用本申请方法的具体操作步骤如下：
DNA Covaris打断成150-200bp，以50ng-100ng起始量建库；
(一)、Covaris剪切(提前四十分钟开机)
1.设置covaris：
a)在covaris水缸中加入去离子水，水位达到刻度左“15”；
b)检查水位是否能没过管子的玻璃部分；
c)将冷却温度设为2-5℃，冷却至5℃；
d)可选。加入乙二醇(ethylene glycol)至总体积的20％，防止结冰。
e)按下控制板上的“Degas”按钮。使用之前Degas至少30min。
2.在1.5ml EP管中，用1X Low TE缓冲液分别将50ng DNA稀释到130μl。
3.将Covaris microTube装到covaris上。
4.用锥形枪头小心地吸取130μl DNA样本，加入到Covaris microTube管中。(小心操作，不要使管子底部出现气泡)
5.按照下表1设置Covaris参数，进行DNA破碎。破碎产物的主峰在150-200bp。
处理时间根据FFPE样本的降解程度进行调整。
表1：
6.用锥形枪头小心地将破碎后的DNA样本吸到一个新的1.5mLEP管中。
(二)、浓缩
2000rpm，45゜C，27-30min，缩到小于15μL。
(三)、变性处理
95℃，2min，将原来双链DNA变性为单链DNA。反应结束后立即置于冰上。
(四)、合成双链
1.链延伸反应：3’端通过延伸引物经过一次延伸反应形成双链DNA，按如下体系配置反应体系：
随机引物：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT NNN N-3’(SEQ ID NO:1)
2.轻柔混匀，瞬时离心，PCR仪上按照如下程序进行反应：
3.反应结束后立刻放置冰上，立即进入下一步双链接头连接反应。
(五)、第二端接头的连接
接头1和接头2等质量混合后，退火形成用于连接的接头。
(1)反应体系：
接头1：5'-GACGCTCTTCCGATCT[Phos]-3’(SEQ ID NO:2)；
接头2：5'-[Phos]GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT[Phos]-3’(SEQ ID NO:3)。
(2)轻柔混匀，瞬时离心，PCR仪上按照如下程序进行反应：20℃反应15min.。
(六)、PCR富集
(1)在上述产物中加入：
P5引物：
5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQID NO:4)；
P7 index引物：
5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO:6)。
(2)轻柔混匀，PCR仪上进行反应：
(七)、PCR产物纯化(等体积纯化一次)
(1)涡旋混匀AMPure XP磁珠。
(2)按样品数准备好干净的1.5ml离心管，加入50μL(等体积)重悬好的AMPure XP磁珠，并将对应的编号写好。将上一步PCR产物加入准备好的XP磁珠内，并用枪头混匀。室温孵育5min。
(3)置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。
(4)加入200μL 80％乙醇漂洗，置于磁力架上，静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。
(5)重复步骤4一次。最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。
(6)敞开盖子X min让乙醇尽量挥发干净，至磁珠干燥。
(7)加入22.5μL无RNA酶H2O，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用10μL枪头枪头小心吸取21μl上清至干净的离心管内。
(8)取1μl进行Qubit定量。记下文库浓度，写上文库编号。
(八)文库质检。
(1)文库浓度测定
Qubit进行文库浓度测定，新型建库方法得到的文库出库量显著高于普通双链建库方法和文献单链建库方法。
(2)文库插入片段大小检测
用lab chip对文库进行插入片段大小的检测，检测结果见表2及图2a、2b、2c，图3a、3b、3c至图4a、4b和4c。从表2及图2a至图4c可以看出，本申请的文库构建方法所构建的文库插入片段峰型单一，为合格文库，对照双链建库的文库有接头污染和大片段非特异的扩增，质量较差；对照单链建库的文库峰型单一，存在少量非特异的大片段。
表2：文库信息表
此外，发明人还对文库构建的其他条件进行了实验，结果发现，在本申请改进的文库构建步骤，采用表3所列条件，均能获得成功建库。
表3：
从以上的描述中，可以看出，本申请通过以单链DNA为模板，使得每一条单链DNA分子在文库的建立过程中都有独立的机会被获取，能够获得更多遗传信息，即有效保留了FFPE样本中的单链DNA信息。采用含有第一端接头序列的随机引物对单链DNA进行第二链的扩增，使得每一条单链DNA都能够作为模板进行随机引物合成第二链，不会出现连接单链接头的方法中一条单链因为末端改变不能连接上接头分子的情况，从而提高了模板DNA的利用率。然后再采用双链接头进行第二端接头的连接以及对接头连接产物进行PCR富集。本申请上述方法中，第一端接头的连接也是通过PCR扩增的方式引入的，因而接头连接体系与PCR富集体系兼容性强，因而便于省掉接头连接后的磁珠纯化过程以降低模板的损失，不仅简化操作流程，而且提高建库成功率，有效解决了降解严重的FFPE样本建库困难及FFPE样本DNA模板利用率低的问题。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京优迅医学检验实验室有限公司
<120> FFPE样本DNA文库及其构建方法
<130> PN114647YXYX
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(28)
<223> 随机引物中的随机扩增碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 随机引物中的第一端接头序列
<400> 1
gtgactggag ttcagacgtg tgctnnnn 28
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 第二端引物中的接头1,5'端带有磷酸化修饰
<400> 2
gacgctcttc cgatct 16
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223> 第二端接头序列中的接头2,5'和3'端均带有磷酸化修饰
<400> 3
gatcggaaga gcgtcgtgta gggaaagagt gt 32
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(58)
<223> P5引物序列
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(64)
<223> p7引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(30)
<223> 标签序列
<400> 5
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64
<210> 6
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(64)
<223> P7引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(30)
<223> 标签序列
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agatacatcg gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64

Claims (10)

1.一种FFPE样本DNA文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
对FFPE样本DNA进行变性处理，得到单链DNA；
采用随机引物对所述单链DNA进行随机扩增延伸，得到双链DNA，所述随机引物按5’端到3’端的方向依次包含第一端接头序列及随机序列；
对所述双链DNA进行第二端接头的连接，得到连接产物；
对所述连接产物进行PCR富集，得到所述FFPE样本DNA文库。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在对所述DNA进行变性处理前，所述构建方法还包括对所述DNA进行片段化处理，得到片段化的DNA。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述第二端接头的3’端带有磷酸化修饰或反向dT修饰。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，在对所述双链DNA进行第二端接头的连接步骤之前，所述构建方法还包括形成所述第二端接头的步骤；
优选形成所述第二端接头的步骤包括：
将接头1和接头2等质量混合，得到混合接头；
对所述混合接头进行退火，得到所述第二端接头。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述随机引物中的所述随机序列的长度为1～10bp，优选为2～6bp；
更优选地，所述随机引物为SEQ ID NO:1：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTNNNN-3’，其中NNNN为所述随机序列；
进一步优选地，所述随机引物的退火温度为40～50℃，最优选为45～48℃；延伸温度为60～68℃，最优选为63～66℃。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述第二端接头中，
所述接头1的序列为SEQ ID NO:2：5'-GACGCTCTTCCGATCT[Phos]-3’；
所述接头2的序列为SEQ ID NO:3：
5'-[Phos]GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT[Phos]-3’。
7.根据权利要求6述的构建方法，其特征在于，所述第二端接头的连接温度为16～20℃。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用P5引物和P7引物对所述连接产物进行PCR富集，得到所述FFPE样本DNA文库；
优选地，所述P5引物的序列为SEQ ID NO:4：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’，
所述P7引物的序列为SEQ ID NO:5：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，其中NNNNNN为标签序列。
9.根据权利要求1或8所述的构建方法，其特征在于，在对所述连接产物进行PCR富集之后，以及得到所述FFPE样本DNA文库之前，所述构建方法还包括对所述PCR富集后的产物进行纯化的步骤，优选采用磁珠进行所述纯化；更优选地，采用等体积的磁珠进行所述纯化。
10.一种FFPE样本DNA文库，其特征在于，所述FFPE样本DNA文库采用权利要求1至9中任一项所述的构建方法构建而成。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111005075A (zh) * 2019-12-20 2020-04-14 北京科迅生物技术有限公司 用于双样本共建测序文库的y型接头和双样本共建测序文库的方法
CN111455469A (zh) * 2020-04-07 2020-07-28 深圳易倍科华生物科技有限公司 一种单链快速建库方法及建库仪器
CN112176420A (zh) * 2020-09-15 2021-01-05 上海英基生物科技有限公司 一种dna和rna共建库的方法及试剂盒
CN112280861A (zh) * 2020-11-02 2021-01-29 魏尔啸实验室科技(杭州)有限公司 一种检测同源重组基因突变HRRm的检测系统
EP4202058A4 (en) * 2021-11-09 2024-05-01 Nanodigmbio (Nanjing) Biotechnology Co., Ltd BANK BUILDING ELEMENT COMPATIBLE WITH DOUBLE SEQUENCING PLATFORMS, BANK BUILDING KIT AND METHOD

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160265027A1 (en) * 2013-10-17 2016-09-15 Illumina, Inc. Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries
CN106574287A (zh) * 2014-06-09 2017-04-19 伊鲁米纳剑桥有限公司 用于核酸扩增的样品制备
CN107916288A (zh) * 2017-12-16 2018-04-17 普瑞基准科技（北京）有限公司 一种ffpe组织样本的超低频建库方法
CN108251503A (zh) * 2018-01-17 2018-07-06 湖南大地同年生物科技有限公司 一种快速构建链特异性rna高通量测序文库的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160265027A1 (en) * 2013-10-17 2016-09-15 Illumina, Inc. Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries
CN106574287A (zh) * 2014-06-09 2017-04-19 伊鲁米纳剑桥有限公司 用于核酸扩增的样品制备
CN107916288A (zh) * 2017-12-16 2018-04-17 普瑞基准科技（北京）有限公司 一种ffpe组织样本的超低频建库方法
CN108251503A (zh) * 2018-01-17 2018-07-06 湖南大地同年生物科技有限公司 一种快速构建链特异性rna高通量测序文库的方法

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111005075A (zh) * 2019-12-20 2020-04-14 北京科迅生物技术有限公司 用于双样本共建测序文库的y型接头和双样本共建测序文库的方法
CN111005075B (zh) * 2019-12-20 2023-04-21 北京科迅生物技术有限公司 用于双样本共建测序文库的y型接头和双样本共建测序文库的方法
CN111455469A (zh) * 2020-04-07 2020-07-28 深圳易倍科华生物科技有限公司 一种单链快速建库方法及建库仪器
CN111455469B (zh) * 2020-04-07 2023-08-18 深圳易倍科华生物科技有限公司 一种单链快速建库方法及建库仪器
CN112176420A (zh) * 2020-09-15 2021-01-05 上海英基生物科技有限公司 一种dna和rna共建库的方法及试剂盒
CN112280861A (zh) * 2020-11-02 2021-01-29 魏尔啸实验室科技(杭州)有限公司 一种检测同源重组基因突变HRRm的检测系统
EP4202058A4 (en) * 2021-11-09 2024-05-01 Nanodigmbio (Nanjing) Biotechnology Co., Ltd BANK BUILDING ELEMENT COMPATIBLE WITH DOUBLE SEQUENCING PLATFORMS, BANK BUILDING KIT AND METHOD

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