JP2022534146A - Ｒｎａ分子における２’－ｏ－メチル化修飾を同定する方法およびその応用 - Google Patents
Ｒｎａ分子における２’－ｏ－メチル化修飾を同定する方法およびその応用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、（１）前記ＲＮＡ分子をリボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒと接触させること、および（２）前記ＲＮＡ分子が分解されるかどうか、または分解後に加水分解が終了される位置を検出することを含む、ＲＮＡ分子がヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル化修飾を有するかどうかを同定する方法を提供する。ここで、前記ＲＮＡ分子が分解される場合、前記ＲＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル化修飾を有さないことを示し、ランダムに中断された複数の断片がすべて同じ部位で加水分解を停止する場合、前記ＲＮＡ分子の停止部位の直前の部位のヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル化修飾を有することを示す。本発明は、当該方法を使用して疾患診断標的をスクリーニングすること、および被験者が２’－Ｏ－メチル化修飾に関連する疾患を有するかどうかを確認することにおける応用をさらに提供する。【選択図】図１
Description
本発明は、ＲＮＡ分子に２’－Ｏ－メチル化修飾を有するかどうかを同定する方法および２’－Ｏ－メチル化修飾部位を決定する方法に関し、さらに、これらの方法が、疾患診断標的を決定すること、および被験者に２’－Ｏ－メチル化修飾関連疾患を有するかどうかを決定することにおける応用に関する。
５０年以上前に最初のシュードウリジンが発見されて以来今まで、生物界ではすでに１００種類を超える異なるＲＮＡ修飾を同定し、これらの修飾は、主に新しく生成された前駆体ＲＮＡの四つのヌクレオバスで発生し、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡおよび様々な低分子ＲＮＡ等の様々なＲＮＡ分子に広く存在する。多くの研究によると、植物の低分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）にもウリジン化およびメチル化等の様々な修飾が存在し、ｍｉＲＮＡの生成および安定性等の調節に関与することを示した。最近の研究によると、昆虫や哺乳動物の体内における様々な低分子ＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｈｃ－ｓｉＲＮＡ、ｔａ－ｓｉＲＮＡ、ｎａｔ－ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ等にも、３’末端メチル化が存在することを示した。これらの低分子ＲＮＡの３’末端メチル化は、細胞内の核酸３’末端のヒドロキシル基に作用することができるエキソヌクレアーゼ、リガーゼ、ターミナルトランスフェラーゼおよびポリメラーゼ等の様々な酵素から攻撃を受けないことにより、低分子ＲＮＡの安定を維持する。
既存の研究によると、多くの植物のｍｉＲＮＡは、形成過程においてＨＥＮ１酵素のメチル化による調節を受け、これは、ウリジン化から保護するメカニズムである。インビトロ活性試験によると、再構築されたシロイヌナズナＨｅｎ１タンパク質が２１～２４ｎｔのｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ二量体に作用し、各鎖の３’末端ヌクレオチドの２’－ＯＨ部位に一つのメチル基（２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ）を付加することができることを示した。さらに、ｄｓＲＮＡ基質の３末端の二つの塩基の突出および３’末端ヌクレオチドの２’－ＯＨおよび３’－ＯＨは、シロイヌナズナＨｅｎ１タンパク質作用基質の二つの非常に重要な特徴であることが分かった。基質ＲＮＡにおける３’末端ヌクレオチドの２’－ＯＨおよび３’－ＯＨは、Ｈｅｎ１タンパク質のメチル化活性に対して非常に重要であり、この二つの部位は、基質を識別する過程で重要な役割を果たす可能性がある。シロイヌナズナＨｅｎ１タンパク質の結晶構造に関する研究によると、Ｈｅｎ１タンパク質がモノマーの形でｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ二量体基質に結合することを示した。当該基質は、その三次構造にＡ－フォールディングコンフォメーションを形成し、各鎖の末端は、Ｈｅｎ１タンパク質によって特異的に識別される。Ｈｅｎｍｔ１に関するさらなる研究によると、試験管実験において、哺乳動物においてＨｅｎ１相同タンパク質であるＨｅｎｍｔ１は、２１～２４ｎｔの一本鎖低分子ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を基質として、アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）をメチル供与体として低分子ＲＮＡをメチル化修飾することができる。
研究によると、ｍｉＲＮＡには様々な修飾が存在し、様々な修飾存在量は、腫瘍サンプルで増加していることを示した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果によると、ｍｉＲＮＡサンプルで合計１２種のメチル化修飾を発見し、ここで、３’末端２’－Ｏ－メチルアデノシン（Ａｍ），２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ），２’－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ），２’－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）を含み、さらに興味深いのは、３’末端２’－Ｏ－メチル化修飾存在量は、腫瘍サンプルで著しく増加することを発見した。これらの結果は、哺乳動物ｍｉＲＮＡには様々な修飾が存在し、これらの修飾は、腫瘍等の疾患の発生および進行に関与する可能性が高いことを示唆した。これらの修飾は、腫瘍診断のマーカーとなる可能性があるかもしれない。
現在、様々な方法が２’－Ｏ－メチル化の検出に応用される。Ｘｕｅｍｅｉ Ｃｈｅｎの研究グループは、ヒドロキシル基に対するｍｉＲＮＡ末端２’－Ｏ－メチル化の保護作用、過ヨウ素酸ナトリウムの酸化、β脱離およびＲＮＡ精製等の一連の操作を使用して、メチル化および非メチル化のｍｉＲＮＡを検出した。Ｚｈｉｗｅｉ Ｄｏｎｇらは、特別に設計された逆転写プライマーにより、メチル化部位を識別し、低濃度ｄＮＴＰの状況下で２’－Ｏ－メチル化修飾が伴う場合、ＲＮＡの逆転写ができないが、非メチル化部位は、健常に逆転写することができた。この方法は、ヒトと酵母のリボソームＲＮＡ、およびマウスのｐｉＲＮＡで検証された。植物のｍｉＲＮＡのメチル化が存在するため、植物ｍｉＲＮＡを検出する場合に、テールリング法よりもネックリング法の方が、効率的であることが報告された。同時に、Ａｎｄｒｅａｓ Ｍａｒｘらは、メチル化部位を非特異的に増幅できる逆転写酵素を設計し、メチル化に敏感しない酵素と比較して、異なる検出方法の違いを介してメチル化の検出に使用された。Ｘｉａｎｇｄｏｎｇ Ｗａｎｇは、３’末端２’－Ｏ－メチル化された植物ｍｉＲＮＡをより高感度に検出するように、三つの等温プライマー反応様式を設計した。ＪＯＡＮ Ａ．ＳＴＥＩＴＺらは、より高感度の方法でメチル化部位を検出することを開発した。彼らは、ＲＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡ配列の単一ヌクレオチドをメチル化部位が認識されるように設計し、ＲＮＡｓｅ Ｈの分解が識別された部位を誘導し、部位にメチル化保護がある場合、ＲＮＡｓｅ Ｈによって分解されないようにすることで、メチル化と非メチル化を敏感に区別できた。同時に、いくつかの研究によると、ＲＮＡｓｅＨの供給源が異なれば、切断部位の識別も異なることが分かった。ただし、以上のｍｉＲＮＡのメチル化を検出する様々な方法は、依然として感度が低く、サンプルに対する要求量が大きいという欠点がある。
一態様において、本発明は、ＲＮＡ分子が３’末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル化修飾を有するかどうかを同定する方法であって、
（１）前記ＲＮＡ分子をリボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒと接触させること、および
（２）前記ＲＮＡ分子が分解されるかどうかを検出すること
を含み、前記ＲＮＡ分子が分解される場合、前記ＲＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドには２’－Ｏ－メチル化修飾を有さないことを示す、方法を提供する。
（１）前記ＲＮＡ分子をリボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒと接触させること、および
（２）前記ＲＮＡ分子が分解されるかどうかを検出すること
を含み、前記ＲＮＡ分子が分解される場合、前記ＲＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドには２’－Ｏ－メチル化修飾を有さないことを示す、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するか、または、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列と比較して、前記リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、一つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失および付加を有するか、または少なくとも９５％の配列同一性を有し、エキソリボヌクレアーゼ活性を有する。
いくつかの実施形態において、段階（２）は、ゲル電気泳動またはＲＴ－ＰＣＲを使用して、前記検出を実行することを含む。
いくつかの実施形態において、前記ＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡである。
別の態様において、本発明は、疾患の診断標的として使用されることができるｍｉＲＮＡをスクリーニングする方法であって、
（１）前記疾患に罹患している患者および健常者からそれぞれ前記ｍｉＲＮＡを取得すること、および
（２）前述の方法で前記ｍｉＲＮＡが３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有するかどうかを同定すること
を含み、前記患者に３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有し、健常者に３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有さないｍｉＲＮＡを、前記疾患の診断標的として使用する、方法を提供する。
（１）前記疾患に罹患している患者および健常者からそれぞれ前記ｍｉＲＮＡを取得すること、および
（２）前述の方法で前記ｍｉＲＮＡが３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有するかどうかを同定すること
を含み、前記患者に３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有し、健常者に３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有さないｍｉＲＮＡを、前記疾患の診断標的として使用する、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記疾患は、癌、遺伝性疾患、または発達障害である。好ましくは、前記疾患は、肺腺がんである。
別の態様において、本発明は、被験者においてｍｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾に関連する疾患を決定する方法であって、
（１）前記被験者の生体サンプルから前記ｍｉＲＮＡを取得すること、および
（２）前記方法で、前記ｍｉＲＮＡが３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有するかどうかを同定すること
を含み、もし前記ｍｉＲＮＡが３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有し、健常者の前記ｍｉＲＮＡが３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有さない場合、前記被験者が前記ｍｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾に関連する疾患を有すると見なす、方法を提供する。
（１）前記被験者の生体サンプルから前記ｍｉＲＮＡを取得すること、および
（２）前記方法で、前記ｍｉＲＮＡが３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有するかどうかを同定すること
を含み、もし前記ｍｉＲＮＡが３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有し、健常者の前記ｍｉＲＮＡが３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有さない場合、前記被験者が前記ｍｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾に関連する疾患を有すると見なす、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡは、前記被験者の血清から抽出される。
いくつかの実施形態において、前記疾患は、癌、遺伝性疾患、または発達障害である。好ましくは、前記疾患は、肺腺がんである。
別の態様において、本発明は、表２にリストされたｍｉＲＮＡを疾患診断の標的として使用される応用を提供する。
いくつかの実施形態において、前記疾患は、肺腺がんである。
別の態様において、本発明は、リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒを含む、被験者のｍｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾に関連する疾患を検出するキットを提供する。
いくつかの実施形態において、前記リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するか、または、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列と比較して、前記リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、一つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失および付加を有するか、または少なくとも９５％の配列同一性を有し、エキソリボヌクレアーゼ活性を有する。
いくつかの実施形態において、前記キットが標準品として３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有さない前記ｍｉＲＮＡをさらに含む。
別の態様において、本発明は、
（１）前記ＲＮＡ分子を複数の低分子ＲＮＡに断片化すること、
（２）リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒを使用して前記低分子ＲＮＡを分解し、前記低分子ＲＮＡに２’－Ｏ－メチル化修飾部位を有する場合、濃縮された分解停止部位を形成すること、
（３）段階（２）で処理されて得られた消化生成物に対してハイスループットシーケンシングを実行すること、および
（４）シーケンシング結果を比較し、前記濃縮された消化停止部位の直前のヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化修飾部位として決定すること
を含む、ＲＮＡ分子に２’－Ｏ－メチル化修飾部位を決定する方法を提供する。
（１）前記ＲＮＡ分子を複数の低分子ＲＮＡに断片化すること、
（２）リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒを使用して前記低分子ＲＮＡを分解し、前記低分子ＲＮＡに２’－Ｏ－メチル化修飾部位を有する場合、濃縮された分解停止部位を形成すること、
（３）段階（２）で処理されて得られた消化生成物に対してハイスループットシーケンシングを実行すること、および
（４）シーケンシング結果を比較し、前記濃縮された消化停止部位の直前のヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化修飾部位として決定すること
を含む、ＲＮＡ分子に２’－Ｏ－メチル化修飾部位を決定する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、段階（１）で生成された前記低分子ＲＮＡの長さは、６０～２００ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するか、または、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列と比較して、前記リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、一つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失および付加を有するか、または少なくとも９５％の配列同一性を有し、エキソリボヌクレアーゼ活性を有する。
いくつかの実施形態において、前記ＲＮＡ分子は、ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡ分子である。
本発明で提供されるこれらの方法は、特定のＲＮＡ配列に依存せず、一般的な適用性を有し、感度が高く、反応条件が穏やかで、操作が簡単である。
特に明記しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
本明細書において、「リボヌクレアーゼ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｒｎａｓｅ）」は、ＲＮＡの単一ヌクレオチドまたは小さな断片への加水分解を触媒することができるヌクレアーゼを指し、主にエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの二つのカテゴリーに分類される。
リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、当技術分野でよく知られた意味を有し、多くのファミリーマートメンバーを含むリボエキソヌクレアーゼを指す。ＲＮａｓｅ Ｒファミリーメンバーは、広く分布され、種類が多く、ＲＮａｓｅ ＩＩファミリーとの類似性が最も高く、通常、３’末端から５’末端までＲＮＡ分子を分解するエキソヌクレアーゼである。従来の研究によると、ＲＮａｓｅ Ｒファミリーメンバーが特定の条件下で外来ＲＮＡ断片の分解に関与するか、または特定の条件下で自身ＲＮＡの転写後修飾に関与する可能性があることを示唆した。
特に好ましい実施形態において、Ｒｎａｓｅ Ｒは、マイコプラスマ ジェニタリウム（マイコプラズマ ジェニタリウム）から単離されたエキソリボヌクレアーゼ（略して「ＭｇＲ」と呼ばれることができる）である。マイコプラスマ ジェニタリウムは、非常に小さいゲノムを有し、当該リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒも、現在、その中で同定された唯一のエキソリボヌクレアーゼである。本発明者らは、当該リボヌクレアーゼＭｇＲの活性は、他の多くのＲＮａｓｅ Ｒファミリーメンバーとは異なり、基質一本鎖ＲＮＡの３’末端ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル化修飾を有する場合、そのＲＮＡ酵素の加水分解活性を発揮することができなく、基質一本鎖ＲＮＡの３’末端ヌクレオチドが修飾を有さない場合、他の多くのＲＮａｓｅ Ｒファミリーメンバーと同様に基質を分解することができることを発見した（図１を参照）。当該Ｒｎａｓｅ ＲのＲＮＡエキソヌクレアーゼ活性は、ＲＮＡ自体の配列や二次構造に限られず、一般的な適用性を有し、反応条件は、穏やかで簡単であり、反応速度は、非常に速い。
本明細書において、リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、その天然の突然変異体またはほかの種における相同体をさらに含むことができる。さらに、当業者は、酵素学活性を基本的に保持しながら、例えば、一つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失および付加などの、酵素のアミノ酸配列にいくつかの保存的な変更または修飾を行うことができ、これらの変更または修飾も、本発明の範囲に含まれることを知っている。
例えば、本発明者らは、リボヌクレアーゼＭｇＲのアミノ末端から最大８１個のアミノ酸を除去しても、当該酵素のエキソヌクレアーゼ活性に影響を及ぼさないことを見出した。従って、本明細書において、リボヌクレアーゼＲＮａｓｅ Ｒ（またはＭｇＲ）への言及には、当該酵素のこれらのトランケート形（トランケート体酵素とも呼ばれる）も含む。
本発明者らは、２’－Ｏ－メチル化修飾がＲＮＡ分子に位置する状況に対して、リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒによる当該ＲＮＡ分子の分解が当該２’－Ｏ－メチル化修飾部位の次のヌクレオチド（即ち、３’方向に隣接されるヌクレオチド）部位（分解停止部位）で停止することを見出した。当該ＲＮＡ分子が多数（例えば、１００個、１０００個、または１００００個のコピー以上）である場合、リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒによって分解されると、かなりの量の断片が当該２’－Ｏ－メチル化修飾部位の次のヌクレオチド部位で停止することが分かり、従って、本明細書では、当該部位を「濃縮された分解停止部位」とも呼ばれる。前記ＲＮＡ分子に複数の２’－Ｏ－メチル化修飾を有する場合、まず、前記ＲＮＡ分子が、例えば、６０～２００ヌクレオチドの断片に断片化された後、リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒによって分解されると、複数の濃縮された分解停止部位が相応的に生成される。
「ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）」とは、小さな非コードＲＮＡを指し、一般に、約２０～２５ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子である。その前駆体ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（ヘアピン状）は、細胞核で転写し生成された後、細胞質でＤｉｃｅｒ酵素によって切割されてｍｉＲＮＡを形成する。ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と複合体を形成した後、塩基対を介して標的ｍＲＮＡに結合して、ｍＲＮＡの翻訳を阻止することにより、遺伝子発現への調節に関与することができる。既存の研究によると、ｍｉＲＮＡの３’末端２’－Ｏ－メチル化修飾は、腫瘍等の疾患の発生および進展に関連されることを示した。
疾患に言及する場合、本明細書で使用される「被験者」とは、特定の疾患に罹患しているか、または罹患している疑いのある個体（好ましくは、ヒト）を指し、当該個体は、健康な個体でもあり得る。当該用語は、一般に「患者」、「検出対象」、「治療対象」と交換的に使用されることができる。
以下、具体的な実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。具体的な実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の保護範囲を制限するために使用されないことを理解されたい。実施例で使用される器具、機器、試薬および方法等を特に明記しない限り、すべては、当技術分野で一般的に使用される器具、機器、試薬および方法である。
実施例１．組換えタンパク質の発現および精製
インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）会社に委託して、Ｒｎａｓｅ Ｒ遺伝子配列および最初の８１アミノ酸を除去したトランケート体の遺伝子配列（配列番号１および配列番号２）を合成し、遺伝子断片の５’末端にＮｃｏ Ｉエンドヌクレアーゼ部位を導入し、３’末端にＨｉｎｄ ＩＩＩエンドヌクレアーゼ部位を導入した。合成した遺伝子断片およびｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターを、それぞれＮｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで二重酵素切断し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、遺伝子断片とベクター断片とをライゲーションし、ＤＨ５αコンピテントセル（Ｔｉａｎｇｅｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を一般に形質転換した。カナマイシン耐性に基づいて、陽性クローンをスクリーニングし、プラスミドを抽出した。組換えプラスミドは、Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで二重酵素切断され、アガロースゲル電気泳動によって同定され、インビトロジェン会社に組換えプラスミドの配列シーケンシングを委託し、ＢｉｏＥｄｉｔソフトウェアを使用して、シーケンシング結果を分析し、結果は、設計された配列と同じであり、組換え菌が健常に構築されたことを説明した。
インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）会社に委託して、Ｒｎａｓｅ Ｒ遺伝子配列および最初の８１アミノ酸を除去したトランケート体の遺伝子配列（配列番号１および配列番号２）を合成し、遺伝子断片の５’末端にＮｃｏ Ｉエンドヌクレアーゼ部位を導入し、３’末端にＨｉｎｄ ＩＩＩエンドヌクレアーゼ部位を導入した。合成した遺伝子断片およびｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターを、それぞれＮｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで二重酵素切断し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、遺伝子断片とベクター断片とをライゲーションし、ＤＨ５αコンピテントセル（Ｔｉａｎｇｅｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を一般に形質転換した。カナマイシン耐性に基づいて、陽性クローンをスクリーニングし、プラスミドを抽出した。組換えプラスミドは、Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで二重酵素切断され、アガロースゲル電気泳動によって同定され、インビトロジェン会社に組換えプラスミドの配列シーケンシングを委託し、ＢｉｏＥｄｉｔソフトウェアを使用して、シーケンシング結果を分析し、結果は、設計された配列と同じであり、組換え菌が健常に構築されたことを説明した。
得られた陽性クローンプラスミドをＥ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｔｉａｎｇｅｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃で一晩培養した後、１Ｌの同じＬＢ培地に移し、約ＯＤ＝０．６になるまで３７℃で培養した。次に、培地を４℃に冷却し、０．５ｍＭのＩＰＴＧを加えて、約１６時間の発現を誘導する。菌体を４０００ｇ遠心分離によって収集し、溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ＝７．０、１ＭのＮａＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭのＴＣＥＰ）で再懸濁した。菌体を超音波法で溶解し（６Ｗ出力８分間、２０秒オン、２０秒オフ）、２５０００ｇで上清液を遠心分離した。上清液およびニッケル樹脂（Ｎｉｃｋｅｌ ｒｅｓｉｎ、サーモフィッシャー）を４℃で１時間共同に置いた後、重力カラムを通じて、４０ｍＬの溶解緩衝液で洗浄した。２００ｍＭのイミダゾールを含む溶解緩衝液で組換えタンパク質を溶出し、０．１ＭのＮａＣｌに希釈し、遠心チューブで２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。組換えタンパク質の品質および濃度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定された。
組換えタンパク質の配列は、それぞれ配列番号３および配列番号４に示される（６ｈｉｓタグは示されない）。特に明記しない限り、以下の実施例は、すべて６ｈｉｓタグ付きの完全長Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素を使用して実行される。
実施例２．低分子ＲＮＡ基質の調製
インビトロジェン会社に、それぞれ同じ配列の一本鎖低分子ＲＮＡ（ｍｉＲ－２１）（配列番号５）の合成を委託し、一つは、任意のさらなる修飾（ｍｉＲ－２１）を追加せず、もう一つは、３’末端に２’－Ｏ－メチル化修飾（ｍｉＲ－２１－ｃｈ３）を有する。それらを１００ｎｍｏｌに希釈し、－２０℃で遮光保存した。
インビトロジェン会社に、それぞれ同じ配列の一本鎖低分子ＲＮＡ（ｍｉＲ－２１）（配列番号５）の合成を委託し、一つは、任意のさらなる修飾（ｍｉＲ－２１）を追加せず、もう一つは、３’末端に２’－Ｏ－メチル化修飾（ｍｉＲ－２１－ｃｈ３）を有する。それらを１００ｎｍｏｌに希釈し、－２０℃で遮光保存した。
実施例３．Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素分解反応および電気泳動検出
実施例１で得られた組換え融合タンパク質１０μｇ、５μｇ、または２．５μｇを、実施例２で得られた希釈ＲＮＡ基質７μＬと混合し、適切な量の緩衝液および水を、最終容量が１０μＬ（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ８．５、１００ｍＭのＫＣｌ、０．０１ｍＭのＺｎＣｌ２）になるまで加え、３７℃で１時間反応した後、８５℃で５分間処理して酵素を失活させた。次に、生成物を１０％ＴＢＥ－尿素ガムで単離すした。
実施例１で得られた組換え融合タンパク質１０μｇ、５μｇ、または２．５μｇを、実施例２で得られた希釈ＲＮＡ基質７μＬと混合し、適切な量の緩衝液および水を、最終容量が１０μＬ（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ８．５、１００ｍＭのＫＣｌ、０．０１ｍＭのＺｎＣｌ２）になるまで加え、３７℃で１時間反応した後、８５℃で５分間処理して酵素を失活させた。次に、生成物を１０％ＴＢＥ－尿素ガムで単離すした。
結果は、図２に示される。酵素緩衝液を使用した対照グループにおいて、３’末端が修飾されるかどうかに関係なく、すべてのＲＮＡ基質がゲル上にはっきり表示された。三つの異なる濃度のＲｎａｓｅ Ｒ酵素と反応した後、３’末端に２’－Ｏ－メチル化修飾されたＲＮＡ基質にも、ゲル上にはっきり表示された。三つの異なる濃度のＲｎａｓｅ Ｒ酵素と反応した後、３’末端に修飾されないＲＮＡ基質は、完全に分解された。
実施例４．Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素反応およびｑＲＴ－ＰＣＲ同定
実施例３の酵素反応の段階と同様に、実施例１で得られた組換え融合タンパク質１０μｇ、５μｇ、または２．５μｇを、実施例２で得られたＲＮＡ基質７μＬの１００倍希釈液（１ｎｍｏｌ）と混合し、適切な量の緩衝液および水を、最終容量が１０μＬ（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ８．５、１００ｍＭのＫＣｌ、０．０１ｍＭのＺｎＣｌ２）になるまで加え、３７℃で１時間反応した後、８５℃で５分間処理して酵素を失活させた。
実施例３の酵素反応の段階と同様に、実施例１で得られた組換え融合タンパク質１０μｇ、５μｇ、または２．５μｇを、実施例２で得られたＲＮＡ基質７μＬの１００倍希釈液（１ｎｍｏｌ）と混合し、適切な量の緩衝液および水を、最終容量が１０μＬ（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ８．５、１００ｍＭのＫＣｌ、０．０１ｍＭのＺｎＣｌ２）になるまで加え、３７℃で１時間反応した後、８５℃で５分間処理して酵素を失活させた。
サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にｍｉＲ－２１配列用のｑＲＴ－ＰＣＲ ＴａｑＭａｎプローブキットを注文し、キットの操作マニュアルに従って逆転写およびＰＣＲプロセスを完了した。表1の結果から明らかなように、Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素によって処理された後、３’末端に２’－Ｏ－メチル化修飾がないＲＮＡ基質（ｍｉＲ－２１）が増幅するＣＴ値は、三つの異なる酵素濃度ですべて約２７であり、酵素に代わりにＲｎａｓｅ Ｒ酵素の緩衝液を使用するその対照グループの反応ＣＴ値は、約１８であり、両者の間には、非常に有意な差があり、Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素によって処理された後、３’末端に２’－Ｏ－メチル化修飾があるＲＮＡ基質（ｍｉＲ－２１－ｃｈ３）が増幅するＣＴ値は、三つの異なる酵素濃度下ですべて約１９であり、酵素の代わりにＲｎａｓｅ Ｒ酵素の緩衝液を使用するその対照グループの反応ＣＴ値は、約１９であり、両者の間には、有意な差はない。従って、Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素は、３’末端に２’－Ｏ－メチル化修飾がないＲＮＡを選択的に加水分解することができるが、３’末端に２’－Ｏ－メチル化修飾があるＲＮＡを加水分解しないことが分かる。ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、ゲル電気泳動法より１００倍低いｎｍｏｌレベルの濃度下で、ターゲットＲＮＡに３’末端２’－Ｏ－メチル化修飾を有するかどうかを同定するすることができる。
実施例５．肺がんの診断におけるｍｉＲＮＡの３’末端２’－Ｏ－メチル化修飾の応用
肺腺がんの一期患者及び健常者各４人の血液を一人当たり５ｍＬ採取し、肺がんグループおよび健常者グループの血液サンプルをそれぞれ２０ｍＬになるように混合し、クエン酸ナトリウムを加えて抗凝固を行った。１５０ｇの回転数で２０分間、室温で遠心分離し、上清を吸引し、引き続き１００００ｇの回転数で２０分間、室温で遠心分離して、約１０ｍＬの上清血漿を吸引した。１０ｍＬの血漿に２０ｍＬのＴｒｉｚｏｌを加え、均等に振とうする。また４ｍＬのクロロホルムを加え、均等に振とうした。１６０００ｇで２０分間、室温で遠心分離した。遠心分離終了後、下層は、有機溶媒であり、中層は、タンパク質であり、上層は、水溶性物質である、三つの層の溶液が見えた。上層の水溶性物質層を新しい遠心チューブに移し、等量のイソプロパノールを加え、十分に均等で混合した後、－２０℃で一晩置いた。翌日、１６０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、完了後、上清液を除去した。１ｍＬの７５％エタノールを加えて、チューブの底と壁の沈殿を洗浄し、新しい１．５ｍＬの遠心チューブに移した。１６０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、完了後、上清液を除去した。４０μＬのＤＥＰＣ処理水でＲＮＡ沈殿を溶解し、１０分間置いた。
肺腺がんの一期患者及び健常者各４人の血液を一人当たり５ｍＬ採取し、肺がんグループおよび健常者グループの血液サンプルをそれぞれ２０ｍＬになるように混合し、クエン酸ナトリウムを加えて抗凝固を行った。１５０ｇの回転数で２０分間、室温で遠心分離し、上清を吸引し、引き続き１００００ｇの回転数で２０分間、室温で遠心分離して、約１０ｍＬの上清血漿を吸引した。１０ｍＬの血漿に２０ｍＬのＴｒｉｚｏｌを加え、均等に振とうする。また４ｍＬのクロロホルムを加え、均等に振とうした。１６０００ｇで２０分間、室温で遠心分離した。遠心分離終了後、下層は、有機溶媒であり、中層は、タンパク質であり、上層は、水溶性物質である、三つの層の溶液が見えた。上層の水溶性物質層を新しい遠心チューブに移し、等量のイソプロパノールを加え、十分に均等で混合した後、－２０℃で一晩置いた。翌日、１６０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、完了後、上清液を除去した。１ｍＬの７５％エタノールを加えて、チューブの底と壁の沈殿を洗浄し、新しい１．５ｍＬの遠心チューブに移した。１６０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、完了後、上清液を除去した。４０μＬのＤＥＰＣ処理水でＲＮＡ沈殿を溶解し、１０分間置いた。
ＲＮＡの総量を測定した後、１０倍量の実施例１で得られたＲｎａｓｅ Ｒ酵素（酵素自体の緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、２５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）、５μＬの１０ＸＲｎａｓｅ Ｒ緩衝液（２００ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ ８．５）、１０００ｍＭのＫＣｌおよび０．１ｍＭのＺｎＣｌ２）を加え、最終容量をＤＥＰＣ処理水で５０ｍＬにした。３７℃で３０分間反応させた後、８５℃で１０分間処理して、Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素を不活性化させた。
１ｍＬのＴｒｉｚｏｌを加え、均等に振とうした。また、２００μＬのクロロホルムを加え、均等に振とうした。１６０００ｇで２０分間、室温で遠心分離し、完了後、下層は、有機溶媒であり、中層は、タンパク質であり、上層は、水溶性物質である、三つの層の溶液が見えた。上層の水溶性物質層を新しい遠心チューブに移し、等量のイソプロパノールを加え、十分に均等で混合した後、－２０℃で１時間置いた。次に、１６０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、完了後、上清液を除去した。１ｍＬの７５％エタノールを加えて、チューブの底および壁の沈殿を洗浄し、新しい１．５ｍＬの遠心チューブに移した。１６０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、完了後、上清液を除去した。２５μＬのＤＥＰＣ処理水でＲＮＡ沈殿を溶解し、１０分間置いた。このサンプルは、シーケンシングに直接使用されることができる。
肺腺がんおよび健常者のサンプルは、ｍｉＲＮＡ低密度チップシーケンシング（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のためにＢＧＩに送られた。当該チップは、サンプル中の比較的良く見られるmiRNAとあまり見られないmiRNAを各々384個ずつ、合計768個検出し、その原理は、７６８グループのｑＲＴ－ＰＣＲを同時に実行することと同等である。その結果の分析は、一般的なｑＲＴ－ＰＣＲと類似であり、ＣＴ値が小さいほど、含有量が多く、３０以上のＣＴ値は、基本的に存在しないと見なすことができる。従って、私たちが注目しているのは、肺腺がんのサンプルにおけるＣＴ値が３０未満、同時に健常者におけるＣＴ値が３０以上のｍｉＲＮＡであり、即ち、肺腺がん患者の血液サンプルにおいて、３’末端に２’－Ｏ－メチル化修飾が存在するが、健常者には同じ修飾がないｍｉＲＮＡであり、一部の結果は、以下の表２に示される。
表２に示されるように、これらのｍｉＲＮＡは、すべて肺腺がん患者の血液サンプルで３’末端２’－Ｏ－メチル化修飾（ＣＴ＜３０）を示すが、健常者の血液サンプルでは、Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素によって完全に加水分解される（ＣＴ＞３０）。これらのｍｉＲＮＡの３’末端の２’－Ｏ－メチル化修飾は、すべて肺腺がんの潜在的な診断標的になる可能性がある。
実施例６．１８ｓ ｒＲＮＡの２’－Ｏ－メチル化部位の同定におけるＲｎａｓｅ Ｒ酵素処理の応用
原理：図３に示されるように、全体的な流れは、ＲＮＡの取得、ＲＮＡの断片化、Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素処理、断片のテーリングおよびハイスループットシーケンシング、シーケンシング結果の比較および修飾部位の還元のいくつかのプロセスに大別される。具体的に、試験するＲＮＡを長さが約６０～２００ｎｔである断片に断片化した後、生成物をエキソヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒで処理することができる。本発明者らは、２’－Ｏ－メチル化修飾を有さないＲＮＡ断片が分解されるが、２’－Ｏ－メチル化修飾を有する部位（Ｎｍ）がＲｎａｓｅ Ｒ酵素によって識別され、分解がＮｍ＋１部位で停止することを見出した。続いて、分解されたＲＮＡサンプルを精製し、ライブラリーを構築し、シーケンシングした。Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素は、各２’－Ｏ－メチル化修飾部位の下流のヌクレオチドの部位（Ｎｍ＋１部位）に濃縮分解停止部位を生成するため、シーケンシング配列をゲノムと比較分析することにより、２’－Ｏ－メチル化部位を同定するすることができる。
原理：図３に示されるように、全体的な流れは、ＲＮＡの取得、ＲＮＡの断片化、Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素処理、断片のテーリングおよびハイスループットシーケンシング、シーケンシング結果の比較および修飾部位の還元のいくつかのプロセスに大別される。具体的に、試験するＲＮＡを長さが約６０～２００ｎｔである断片に断片化した後、生成物をエキソヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒで処理することができる。本発明者らは、２’－Ｏ－メチル化修飾を有さないＲＮＡ断片が分解されるが、２’－Ｏ－メチル化修飾を有する部位（Ｎｍ）がＲｎａｓｅ Ｒ酵素によって識別され、分解がＮｍ＋１部位で停止することを見出した。続いて、分解されたＲＮＡサンプルを精製し、ライブラリーを構築し、シーケンシングした。Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素は、各２’－Ｏ－メチル化修飾部位の下流のヌクレオチドの部位（Ｎｍ＋１部位）に濃縮分解停止部位を生成するため、シーケンシング配列をゲノムと比較分析することにより、２’－Ｏ－メチル化部位を同定するすることができる。
操作：トータルＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、Ｈｅｌａ細胞株からトータルＲＮＡを抽出した。１００μＬのＤＥＰＣ処理水を使用して、得られたトータルＲＮＡを溶解した。１％アガロースゲルを作成し、ＤＥＰＣ処理水を使用して１ＸＴＡＥ電気泳動緩衝液を調製した。得られたトータルＲＮＡを電気泳動で検出し、１８Ｓ ｒＲＮＡバンドをゲル状に切断し、ＲＮＡアガロース回収キット（ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して回収した。１００μＬのＤＥＰＣ処理水を使用してＲＮＡを溶解し、５０μＬの１８Ｓ ＲＮＡを取得した。Ａ２６０：２８０＝１．９９を測定し、比較的に純粋な１８Ｓ生成物であることが証明された。サンプルの一部を取り、１％アガロースゲル電気泳動を使用して、１８Ｓの完全性を検出することができる。
前の段階で得られた１８Ｓ ｒＲＮＡ（４５μＬ）１．５μｇを４５μＬの１００ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ ９．０）と混合し、９５℃のウォーターバスで１０分間処理した。次に、１０μＬの３ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ－ｏＡＣ（ｐＨ５．２）を加えて、反応を停止させた。システムに２４μＬの５μｇ／μＬグリコーゲンを加え、均等に混合した。システムに３７２μＬの９６％エタノールを加え、均等に混合し、液体窒素に入れた。１２０００ｇ、４℃の条件下で、２０分間遠心分離した。得られた遠心分離物から上清液を捨て、１ｍＬの８０％エタノールを加えて沈殿されたＲＮＡを洗浄し、再び１２０００ｇ、４℃の条件下で、２０分間遠心分離した。得られた遠心分離物から上清液を捨て、残りのエタノールをクリーンベンチで完全に発揮させ、２５μＬのＤＥＰＣ処理水を加えて残りのＲＮＡを溶解した。
実施例１で得られたＲｎａｓｅ Ｒ酵素（酵素自体の緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、２５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰである）および６．１μＬの１０Ｘ Ｒｎａｓｅ Ｒ緩衝液（２００ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ ８．５）、１０００ｍＭのＫＣｌおよび０．１ｍＭのＺｎＣｌ２）を、前の段階で得られた断片化された１８ｓ ｒＲＮＡ ２５μＬに加えた。３７℃で３０分間反応させた後、８５℃で１０分間処理して、Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素を不活性化した。再びトータルＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、反応後のＲＮＡ断片を精製した。
テーリング／リバーサルキット（ｓａｎｇｏｎ ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、処理後の生成物０．１μｇをｃＤＮＡライブラリーに生成し、ハイスループットシーケンシングを使用して断片の配列情報を取得した。ハイスループットシーケンシングで得られた断片を１８ｓ ｒＲＮＡの配列情報と比較することにより、ほとんどの断片が特定の一部の部位で（図４）停止し、これらの部位の直前の部位のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル化が発生する部位であることを発現した。図４において、横軸は、ヌクレオチド部位を表し、縦軸は、３’末端の対応するアミノ酸部位における断片の相対的な含有量を表す。例えば、８５０番目のヌクレオチドの近くの停止点の統計は、断片の約７０％が８６８番目のヌクレオチドで停止することを示し、１８ｓ ＲＮＡ分子のほとんどが８６７番目のヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル化修飾を有することを示す。ほかのいくつかの断片が停止した部位８９４、９１５、９４１および９８８は、ランダムに中断された後の酵素加水分解が不完全な生成物または修飾比率が高くない２’－Ｏ－メチル化部位の加水分解後の少量の生成物である可能性がある。
本実施例の方法をしようして、一本鎖ＲＮＡ上のすべての２’－Ｏ－メチル化部位を同定することができ、これらの部位は、動物において癌、遺伝性疾患、発達障害等の疾患に関連され、従って、当該方法は、これらの疾患のインビトロ診断に使用されることができる。
実施例７．１８ｓ ｒＲＮＡ、２８ｓ ｒＲＮＡおよびｍＲＮＡの２’－Ｏ－メチル化部位の同定におけるＲｎａｓｅ Ｒ酵素処理の応用
同様に、Ｈｅｌａ細胞株を例にすると、原理および操作は、実施例６と同じである。シーケンシング結果を取得した後、各部位で停止する断片の数と直前の部位で停止する断片の数の比率を介して、実施例６で説明した原理に基づいて、２’－Ｏ－メチル化部位であるかどうかを判断することができる。図５は、１８ｓ ｒＲＮＡを例として、各部位での比率状況を示す。
同様に、Ｈｅｌａ細胞株を例にすると、原理および操作は、実施例６と同じである。シーケンシング結果を取得した後、各部位で停止する断片の数と直前の部位で停止する断片の数の比率を介して、実施例６で説明した原理に基づいて、２’－Ｏ－メチル化部位であるかどうかを判断することができる。図５は、１８ｓ ｒＲＮＡを例として、各部位での比率状況を示す。
高い比率から低い比率へのランキングをする場合、比率が最も高い上位１９個の点（＞２０）のうち１８個の点が、２’－Ｏ－メチル化修飾を有することが他の文献によって報告されたが、報告されてない部位も、質量分析よって２’－Ｏ－メチル化修が確実に存在することを確認され、私たちの方法を正確さを完全に示した。
表３及び表４は、１８ｓ ｒＲＮＡ及び２８ｓ ｒＲＮＡにおける、より高い比率の一部の部位の分布状況を示す。
類似的に、染色体上の対応する部位に対応する、比率がより高いｍＲＮＡの部位のｍＲＮＡにおけるの分布状況を得ることができ、以下の表５は、結果の一部である。
完全なＲｎａｓｅ Ｒ酵素の代わりにトランケート体酵素を使用して、前記実施例の操作を実行して、類似な結果を得ることができる。例えば、実施例３と類似な操作を使用して、ｍｉＲ－２１およびｍｉＲ－２１－ｃｈ３をトランケート体酵素で処理し、結果は、図６にしめされるように、ｍｉＲ－２１は分解され、ｍｉＲ－２１－ｃｈ３は、分解されなかった。これは、Ｒｎａｓｅ Ｒ酵素の最初（アミノ末端）の８１アミノ酸を除去しても、そのＲＮＡエキソヌクレアーゼ活性に影響を与えず、当該エキソヌクレアーゼ活性が２’－Ｏ－メチル化によって阻害されることを示す。
以上の実施例は、本発明の技術的解決策を説明するためにのみ使用され、本発明を制限するものではなく、当業者は、前述の各実施例に記載された技術的解決策を修正することができるか、または技術的特徴の一部またはすべてを同等に置換することができ、これらの修正または置換は、対応する技術的解決策の本質が本発明の各実施例の技術的解決策範囲から逸脱することなく、それらはすべて本発明の明細書の範囲にく踏まれるべきであることを理解すべきである。
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５．Ａｓｃｈｅｎｂｒｅｎｎｅｒ Ｊ ＆ Ｍａｒｘ Ａ，Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４：８，３４９５－３５０２（２０１６）．
６．Ａｄｈｉｋａｒｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｈａｉｒｐｉｎ ｐｒｉｍｉｎｇ ｉｓ ｂｅｔｔｅｒ ｓｕｉｔｅｄ ｔｈａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｍｉＲＮＡ ｑＰＣＲ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ ６：１，２２９－２３１（２０１３）．
７．Ｙｕ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｃｒｕｃｉａｌ ｓｔｅｐ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０７，９３２－９３５（２００５）．
８．Ｋａｌａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３：６１－８（２０１３）．
９．Ｄｏｎｇ ＺＷ，ｅｔ ａｌ．ＲＴＬ－Ｐ：ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ２－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０：２０，ｅ１５７（２０１２）．
１０．Ｚｈａｎｇ ＸＤ，ｅｔ ａｌ．Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：ｉｎｔｅｇｒａｌ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２２：１２，１０２５－１０３４（２０１６）．
１１．Ｇａｒｚｏｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ：ｒａｔｉｏｎａｌｅ，ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．９：１０，７７５－７８９（２０１０）．
Claims (20)
- ＲＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル化修飾を有するかどうかを同定する方法であって、
（１）前記ＲＮＡ分子をリボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒと接触させること、および
（２）前記ＲＮＡ分子が分解されるかどうかを検出すること
を含み、前記ＲＮＡ分子が分解される場合、前記ＲＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドには２’－Ｏ－メチル化修飾を有さないことを示す、方法。 - 前記リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するか、または、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列と比較して、前記リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、一つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失および付加を有するか、または少なくとも９５％の配列同一性を有し、エキソリボヌクレアーゼ活性を有する、請求項１に記載の方法。
- 段階（２）は、ゲル電気泳動または逆転写ＰＣＲを使用して、前記検出を実行することを含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記ＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
- 疾患の診断標的として使用されることができるｍｉＲＮＡをスクリーニングする方法であって、
（１）前記疾患に罹患している患者および健常者からそれぞれ前記ｍｉＲＮＡを取得すること、および
（２）請求項１～４のいずれか一項に記載の方法で、前記ｍｉＲＮＡが３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有するかどうかを同定すること
を含み、前記患者に３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有し、健常者に３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有さないｍｉＲＮＡを、前記疾患の診断標的として使用する、方法。 - 前記疾患は、癌である、請求項５に記載の方法。
- 段階（１）は、前記患者および健常者の血清から前記ｍｉＲＮＡを抽出することを含む、請求項５に記載の方法。
- 被験者においてｍｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾に関連する疾患を決定する方法であって、
（１）前記被験者からｍｉＲＮＡを取得すること、および
（２）請求項１～４のいずれか一項に記載の方法で、前記ｍｉＲＮＡが３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有するかどうかを同定すること
を含み、もし前記ｍｉＲＮＡが３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有し、健常者の前記ｍｉＲＮＡが３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有さない場合、前記被験者が前記ｍｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾に関連する疾患を有すると見なす、方法。 - 前記疾患は、癌である、請求項８に記載の方法。
- 前記疾患は、肺腺がんである、請求項９に記載の方法。
- 段階（１）は、前記被験者の血清から前記ｍｉＲＮＡを抽出することを含む、請求項８に記載の方法。
- 表２にリストされたｍｉＲＮＡを疾患診断標的として使用される応用。
- 前記疾患は、肺腺がんである、請求項１２に記載の応用。
- 被験者においてｍｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾に関連する疾患を検出するためのキットであって、
リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒを含む、キット。 - 前記リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するか、または、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列と比較して、前記リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、一つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失および付加を有するか、または少なくとも９５％の配列同一性を有し、エキソリボヌクレアーゼ活性を有する、請求項１４に記載のキット。
- 標準品として３’末端ヌクレオチド２’－Ｏ－メチル化修飾を有さない前記ｍｉＲＮＡをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
- ＲＮＡ分子に２’－Ｏ－メチル化修飾部位を決定する方法であって、
（１）前記ＲＮＡ分子を複数の低分子ＲＮＡに断片化すること、
（２）リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒを使用して前記低分子ＲＮＡを分解し、前記低分子ＲＮＡに２’－Ｏ－メチル化修飾部位を有する場合、濃縮された分解停止部位を形成すること、
（３）段階（２）で処理されて得られた消化生成に対してハイスループットシーケンシングを実行すること、および
（４）シーケンシング結果を比較し、前記濃縮された消化停止部位の直前のヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化修飾部位として決定すること
を含む、方法。 - 段階（１）で生成された前記低分子ＲＮＡの長さは、６０～２００ヌクレオチドである、請求項１７に記載の方法。
- 前記リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するか、または、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列と比較して、前記リボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｒは、一つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失および付加を有するか、または少なくとも９５％の配列同一性を有し、エキソリボヌクレアーゼ活性を有する、請求項１７に記載の方法。
- 前記ＲＮＡ分子は、ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡ分子である、請求項１７に記載の方法。
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