CN106498040B

CN106498040B - 一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法

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Publication number: CN106498040B
Application number: CN201610890076.5A
Authority: CN
Inventors: 郭国骥; 赖淑静; 叶昉
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-10-12
Filing date: 2016-10-12
Publication date: 2018-10-23
Anticipated expiration: 2036-10-12
Also published as: CN106498040A

Abstract

本发明公开了一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法。一种用于高通量单细胞测序的分子标记微珠，包括微珠本体和偶联的作为分子标记的寡核苷酸链，所述寡核苷酸链包括：通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；多聚T尾，与mRNA的poly A序列结合；分子标签序列，标识结合的mRNA；细胞标签序列，标识mRNA取自的细胞。本发明分子标记微珠的分子标记序列分为4个功能区，分别为通用引物序列、细胞标签序列、分子标签序列和多聚T尾，基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法能够一次性获得上万个单细胞的特异性转录组信息，且整套实验成本低、时间短、通量高，具有很好的应用价值。

Description

一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法。

背景技术

传统的流式细胞分析能快速对成千上万个细胞进行多参数的定量分析。流式荧光分选是通过表面抗原或者荧光标记对需要分选的大量细胞进行预处理，可以灵活的根据需要的参数分选出需要的细胞亚群。经过改造的流式荧光分选系统，将细胞密度稀释控制的话还能完成单细胞分析。不过流式仪器的仪器，各类抗原成本较高，功能虽然强大，但主要还是进行大量细胞定量分群分析。

某些珍贵的样品则很难达到流式分析细胞数量要求，比如早期的胚胎干细胞，来自病人肿瘤组织的样本或特殊的血样，细胞数目可能并没有那么多，单细胞测序分析的实验技术思路也逐步为人们接受，扩增单个细胞中转录组，基因组的方法逐渐成熟。进行单细胞测序更加方便，另一方面，细胞间的异质性表明每一个细胞都是完全不相同的，包括干细胞，肿瘤细胞等等，不同组织中干细胞类群的定义也不明晰，比如造血系统干细胞和间充质干细胞。异质性在这些组织中是相当明显但并未被完全解释的。

没有两个细胞的基因组，转录组水平上市完全类似的，因此对大量细胞的平均组学表达分析会平均掉本来在单个细胞中相当显著的表达特征，相应的，大量细胞的群体分析很有可能是我们丧失了发现一些罕见的细胞亚群的机会，因此单细胞测序这一工具在胚胎，肿瘤，各类干细胞研究中都具有无法比拟的优势。随着单细胞测序技术的不断突破和测序仪器的广泛使用，使单细胞测序分析越来越多的应用到各类前沿生物医学研究中。

以往进行的传统单细胞测序分析是靠手工挑取单细胞，受限于人力分析的细胞数量是有限的，提高分析的细胞数量就能从大量数据中发掘更多有效信息，目前国内尚无通量较高的单细胞测序分析平台与相关技术，而国外2015年发表文章提到用微孔板分离细胞PCR后检测少量基因表达，使用这个技术仅能同时检测81个基因的表达情况，通量极低，并且成本高，应用不广。国外有基于微流控技术，使用微流体制造的连续不断的液滴在微通道中包裹单细胞进行单细胞分离，能达到较高的通量，同时使用带有标记的微珠结合单个细胞内的mRNA加以标记，代表性的有哈佛大学医学院发表在《Cell》期刊中的Drop-seq与InDrop技术，两者均是基于微流体技术的单细胞分离方法，能达到比较高的通量。除此以外，其他手工挑取，机器与流式技术改造的单细胞分选都达不到高通量单细胞测序分析的要求。

发明内容

本发明提供了一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法，该高通量单细胞测序方法能够一次性获得上万个单细胞的特异性转录组信息。

一种用于高通量单细胞测序的分子标记微珠，包括微珠本体和偶联的作为分子标记的寡核苷酸链，其特征在于，所述寡核苷酸链包括：

通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；

多聚T尾，与mRNA的poly A序列结合；

分子标签序列，标识结合的mRNA；

细胞标签序列，标识mRNA取自的细胞。

每个分子标记微珠上均结合有大量的作为分子标记的寡核苷酸链。

优选的，所述微珠本体为磁珠。一般如果是普通的微珠而不是磁珠的话，在纯化和洗涤时，需要通过重力方式来对分子标记微珠进行分离，比如自然沉降或者离心。而使用磁珠的话，可以直接使用磁力架进行分离，比较方便，且速度更快。

优选的，所述微珠本体的直径为15～25μm。使用时，需要一个微珠与一个细胞进行结合，所以微珠的大小与所检测的细胞大小接近为宜。

优选的，所述微珠与分子标记偶联方式为：分子标记5’端的核苷酸的C6位上使用胺基取代羟基，微珠表面修饰有羧基，羧基与所述胺基缩合。由于分子标记为单链寡核苷酸，其5’端的第一个核苷酸上的羟基用胺基取代，微珠表面修饰羧基，通过胺基与羧基的反应，将分子标记偶联到微珠上。

优选的，所述分子标签序列至少部分为随机合成。

优选的，所述细胞标签序列由多个特异性片段串接组成，不同位置的特异性片段选自相同的或不同的特异性片段库，所述细胞标签序列利用所述特异性片段的排列组合方式不同标识细胞。

优选的，所述分子标记微珠的制备方法，包括以下步骤：

(1)合成通用引物序列，所述通用引物序列3’端连接细胞标签序列的其中一个特异性片段；

(2)将通用引物序列与微珠本体偶联，获得偶联物；

(3)通过PCR延伸在偶联物3’端串接细胞标签序列的其余特异性片段，组装形成细胞标签序列；

(4)在细胞标签序列3’端依次连接分子标签序列和多聚T尾。

本发明又提供了一种高通量单细胞测序方法，所述步骤为：

(1)将细胞加入到微孔板中，然后加入所述的分子标记微珠，其中微孔板上的微孔直径大小为刚好容纳一个细胞和一个分子标记微珠；

(2)加入裂解液，孵育；

(3)收集分子标记微珠-mRNA复合物，进行逆转录PCR，获得带有所述分子标记的cDNA；

(4)构建测序文库，进行高通量测序。

分子标记微珠的细胞标签序列，单个分子标记微珠上的所有分子标记均具有相同细胞标签序列，而不同分子标记微珠间的分子标记的细胞标签序列均不同，所以可以在最后得到的测序数据中区分哪些序列是来自于同一个细胞，哪些序列来自于不同的细胞。

分子标签序列，单个分子标记微珠上的所有分子标记均具有不同分子标签序列，分子标签序列只负责单个分子标记微珠上的所有分子标签序列不同，而不管不同细胞之间的分子标签序列，合成时是由若干个随机合成的核苷酸组成，对于单个细胞来说，可以使得每一条mRNA结合的分子标签序列可以由分子标签序列来区分，对于最后得到的测序数据来说，可以在用细胞标签序列区分了不同细胞后，再根据分子标签序列的差异区分哪些是真实的细胞内表达差异造成的mRNA拷贝数存在差异，而哪些是由同一条mRNA经过PCR扩增得来，由PCR扩增造成的拷贝数差异需要在数据处理时，进行矫正。

为了保证获得单个的细胞，优选的，细胞加入微孔板中的落孔率控制在8％～12％。落孔率过大不利于获得一个孔中只有一个细胞。

而为了尽量使所有细胞都能够结合一个分子标记微珠，优选的，分子标记微珠加入微孔板中的落孔率大于99％。如果分子标记微珠的落孔率太小，则容易造成部分细胞结合不到分子标记微珠，相当于最终结果中缺少部分细胞的数据，这样不利于反映待检测细胞整体的情况。

优选的，所述微孔板制备方法为：

(1)在硅片上刻蚀出微孔作为初始模具，微孔直径20～50μm；

(2)在初始模具上浇注聚二甲基硅氧烷(PDMS)，成型后取下成为带有微柱的反向模具；

(3)在反向模具上浇注加热融化的浓度为4％～6％的琼脂糖，冷却成型后，取下即为微孔板。

本发明分子标记微珠的分子标记序列分为4个功能区，分别为通用引物序列、细胞标签序列、分子标签序列和多聚T尾，基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法能够一次性获得上万个单细胞的特异性转录组信息，且整套实验成本低、时间短、通量高，具有很好的应用价值。

附图说明

图1为微孔板示意图；

图2为分子标记磁珠制备流程图；

图3为分子标记微珠性能检测结果图，其中图A为单个分子标记微珠上分子标记数检测结果图，图B为分子标记微珠均一性检测结果图，共检测6个分子标记微珠；

图4为分子标记微珠结合mRNA能力检测时的凝胶电泳图；

图5为制备的cDNA测序文库片段大小分布图；

图6为实施例2中人鼠混合细胞分群对比图；

图7为实施例3中CD34⁺细胞基因表达差异热图

图8为实施例3中CD34⁺细胞tSNE分析结果图；

图9为实施例4中CD34^-细胞基因表达差异热图。

具体实施方式

实施例1

1)1ng起始DNA片段化

使用Vazyme公司TD513试剂盒。

a.于室温解冻5×TTBL(TruePrep Tagment Buffer L)，上下颠倒混匀后备用。确认5×TS(Terminate Solution，反应终止液)处于室温，并轻弹管壁确认有无沉淀。如有沉淀，可于37℃加热并剧烈震荡充分混匀沉淀即会溶解。

b.在灭菌PCR管中依次添加各反应组分：

5×TTBL 4μl

DNA 1ng

TTE Mix V1 5μl

ddH₂O补足至20μl

c.使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。

d.将PCR管置于PCR仪中，设置如下反应程序：

55℃10min；10℃保温。

e.立即向反应产物中加入5μl 5×TS，使用移液器轻轻吹打充分混匀。置于室温放置5min。

2)PCR富集

a.将灭菌PCR管置于冰浴中，依次添加各反应组分：

使用试剂盒为：TruePrep^TM Index Kit V2for(Vazyme#TD202)，具体实验步骤参照试剂盒使用说明。

b.使用移液器轻轻吹打充分混匀，将PCR管置于PCR仪中进行如下反应：

72℃3min，98℃预变性30sec；98℃变性15sec，60℃退火30sec；72℃延伸3min，共15个循环；4℃保存。

3)扩增产物长度分选、纯化

使用AMPure XP磁珠进行长度分选和纯化。起始PCR产物体积应为50μl。因PCR过程中样品挥发会导致产物体积不足50μl，进行下面操作之前必须使用灭菌蒸馏水将体积补齐至50μl，否则分选长度会与预期不一致。分选过程中，两轮磁珠使用量(R1和R2)参见下表：

第一轮AMPure XP磁珠用量R1＝30.0μl(0.60×)第二轮AMPure XP磁珠用量R2＝7.5μl(0.15×)

其中，“×”数均根据PCR产物体积计算而得，如“0.60×”表示0.60×50μl＝30.0μl。

a.涡旋震荡混匀AMPure XP磁珠并吸取R1体积至50μl PCR产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。室温孵育5分钟。

b.将反应管短暂离心并置于磁力架中分离AMPure XP磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟)小心转移上清至干净EP管中，丢弃磁珠。

c.涡旋震荡混匀AMPure XP磁珠并吸取R2体积至上清中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。室温孵育5分钟。

d.将反应管短暂离心并置于磁力架中分离AMPure XP磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟)小心移除上清。

e.保持EP管始终处于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗AMPure XP磁珠。室温孵育30秒后小心移除上清。

f.重复步骤5，总计漂洗两次。

g.保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥AMPure XP磁珠10分钟。

h.将EP管从磁力架中取出，加入22μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。将反应管短暂离心并置于磁力架中分离AMPure XP磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟)小心吸取20μl上清至灭菌EP管中，于-20℃保存。

此外，如需获得长度分布更集中的文库，扩增产物可使用胶回收试剂盒进行片段长度分选和纯化。如对文库长度分布范围无特殊要求，扩增产物也可以不进行长度分选直接使用AMPure XP磁珠或柱纯化试剂盒进行纯化。

实施例2

1、微孔板制备

根据实验规模(人293T细胞和鼠3T3细胞各1万个)设计微孔板大小(孔板大小为1cm×1cm)，并在硅片上蚀刻出微孔作为初始模具，微孔深度30μm和微孔大小30μm，孔间距30μm。

接下来在硅片上浇注聚二甲基硅氧烷(PDMS)，成型后拿下PDMS成为板上有微柱的第二次模具，最终实验使用的的微孔板是浓度为5％的琼脂糖(用无酶水配制)，热融后浇注在PDMS微柱板上冷凝成型，此时的琼脂糖板揭下来后就是具有一定厚度的微孔板(图1)。保存时加上对细胞无害的DPBS-EDTA混合液，加盖保存在4度冰箱中，即做即用能保证微孔板良好的工作状态。

2、分子标记磁珠制备

磁珠购自KBS公司(货号MC20000)，表面羧基包被，直径20μm。

分子标记磁珠制备过程如图2所示。

(1)设计分子标记序列，将分子标记序列分成三段，相邻两段之间设置有用于将相邻两段通过PCR连接起来的接头序列，其中5’开始的第一段包括通用引物序列和部分细胞标签序列，最后一段含有部分细胞标签序列及整个分子标签序列、多聚T尾，除第一段外，其余序列均为相应序列的互补序列。

各段序列如下所示：

其中，6×n为细胞标签序列的核心序列，对应每个磁珠的这个核心序列均不同，且对应同一磁珠的三段序列中的6×n序列也不同，由于每个位点有A/T/C/G4种选择，所以6×n的序列可以有4⁶种选择。N表示A/T/C/G中的任一种，为随机合成。

(2)分别合成所有序列，其中所有序列中属于细胞标签序列部分均设计96种序列，每种独立放置，而最后一段的分子标签序列6×N为随机合成；第一段序列5’端的核苷酸的C6位上使用胺基取代羟基。

(3)将等量的磁珠分别与96种第一段序列偶联，然后收集获得96种带修饰的磁珠，混合均匀后，再均分为96等分，与96种第二段序列混合后进行PCR序列延伸，然后再均分为96等分，与96种第三段序列混合后进行PCR序列延伸，然后变性解链获得具有96×96×96种单链寡核苷酸修饰的磁珠。

完成后，分子标记的序列如下：

5’-TTTAGGGATAACAGGGTAATAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGTnnnnnnCGACTCACTACAGGGnnnnnnTCGGTGACACGATCGnnnnnnNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。

3、单个分子标记磁珠上连接分子标记序列数目检测

采用荧光定量PCR(qPCR)检验分子标记磁珠上连接上分子标记序列数目。具体操作：挑取单个分子标记磁珠作为起始反应物，加入针对分子标记序设计的引物，qPCR检验分子标记磁珠上序列的个数及微珠的均一性。结果见图3，可见分子标记磁珠均一性好，CT值均在8左右，单个分子标记磁珠连接约10^6～7条分子标记序列。

4、分子标记磁珠结合mRNA能力检验

在EP管中直接加入1000个微珠与1000个细胞量左右的RNA(10ng)，充分孵育10min后，加入逆转录试剂混合液60μl(SuperScript II逆转录酶100U，RNAse抑制剂10U，Superscript II第一链缓冲液1×，DTT 5mM，Betaine 1M，MgCl₂ 6mM，TSO 1mM，dNTP 10mM)42℃90min，然后70℃15min完成逆转录。把分子标记磁珠在磁力架上清洗一次，吸弃上清，加入EXON I试剂混合液200μl(EXON I Buffer 1×，EXON I 1×)37℃45min，清洗两次分子标记磁珠随后加入PCR试剂混合液(KAPA HiFiHotStartReadyMix 1×，TSO-PCR primers0.1μM)。PCR程序：98℃预变性3min；98℃变性20s，67℃退火15s，72℃延伸6min，重复14次；72℃延伸5min，4℃保温。最后通过凝胶电泳和Qubit仪(Life公司，型号Qubit 3.0)辅助验证实际微珠的工作结合效率，cDNA浓度为8ng/ul，完全符合构建高通量测序文库的浓度要求，凝胶电泳结果如图4所示。

5、人293T、鼠3T3混合细胞测试

1万个小鼠胚胎干细胞(ESC)3T3和1万个人胚肾细胞(293T)两种细胞的混合，加入到微孔板中，达到约10％落孔率，使用DPBS溶液(Gibco公司，货号14190-144)洗去多余细胞。把25万个分子标记磁珠加入到微孔板中，达到99％以上落孔率，使用DPBS溶液洗去多余分子标记磁珠。加入400μl裂解液(0.2％(vol/vol)Triton X-100和2U/μl RNaseinhibitor)，然后充分孵育10min，收集分子标记磁珠-mRNA复合物，加入逆转录试剂混合液60μl(SuperScript II逆转录酶100U，RNAse抑制剂10U，Superscript II第一链缓冲液1×，DTT 5mM，Betaine 1M，MgCl₂ 6mM，TSO 1μM)42℃90min，然后70℃15min完成逆转录。把分子标记磁珠在磁力架上清洗一次，吸弃上清，加入EXON I试剂混合液200μl(EXON I缓冲液1×，EXON I 1×)37℃45min，清洗两次分子标记磁珠随后加入PCR试剂混合液(KAPA HiFiHot Start Ready Mix1×，TSO-PCR primers 0.1μM)。PCR程序：98℃预变性3min；98℃变性20s，67℃退火15s，72℃延伸6min，重复14次；72℃延伸5min，4℃保温。PCR后即得到大量标记cDNA。

使用AMpure bead(Beckman Coulter，货号A63881)纯化PCR产物。使用前将AMPureXP磁珠震荡混匀并置于室温至少30分钟，纯化步骤如下：

1)加25μl AMPure XP磁珠到上述PCR反应体系中，使用移液器混匀10次以上保证整个体系均匀。

2)室温孵育8分钟。

3)将PCR管置于磁力架上5分钟以上以保证AMPure XP磁珠完全吸附。

4)保持PCR管在磁力架上，小心弃去上清，注意不要扰动到AMPure XP磁珠。

5)加入200μl新鲜配制的80％乙醇，注意加入乙醇时不要扰动AMPure XP磁珠，孵育30秒并弃掉上清。

6)重复步骤5一次。

7)短暂离心收集液体，将PCR管置于磁力架上30秒，弃去所有残留的乙醇。

8)开盖，空气中干燥3分钟。

9)加入17μl洗脱缓冲液(Elution Buffer)到PCR管中覆盖AMPure XP磁珠，将PCR管从磁力架上取下并重悬AMPure XP磁珠。

10)室温孵育2分钟。

11)短暂离心收集液体到管底，并将PCR管置于磁力架上保持1分钟以上以保证溶液澄清。

12)将含cDNA文库的上清转移到新的EP管中，如果需要保存则于-20℃保存。

取1μl扩增的cDNA文库使用Agilent 2100Bioanalyzer和High Sensitivity DNAChip验证。正常情况下，无模板阴性对照无产物，成功的反应根据使用的起始模板不同产出2-20ng分布于400-10000bp的cDNA文库，文库的峰值(peak)位于2000bp左右。结果见图5。

以实施例1中方法构建基因测序文库，基因测序文库构建好后送至诺禾致源公司进行测序。测序返回的数据经过拆分筛选比对，得到基因表达谱。将这个矩阵文件导入R语言分析，就能将矩阵数据转换为可视化的图。由图6可知，存在极少量双细胞污染，可以达到单细胞高通量测序水平。

实施例3

把5万个CD34⁺细胞加入到3cm×3cm微孔板中，达到约10％落孔率，洗去多余细胞。把分子标记磁珠加入到微孔板中，达到99％以上落孔率，洗去多余微孔标记磁珠。

其余步骤同实施例2。

基因测序文库构建好后送至诺禾致源公司进行测序，采用HiSeq 4000PE125测序策略。用Microwell-seq高通量测序平台构建四次CD34⁺文库作为重复，经过经过拆分筛选比对，得到基因表达谱。将这个矩阵文件导入R语言分析，就能将矩阵数据转换为可视化的图。图7为CD34⁺细胞基因表达差异热图，可知人CD34⁺细胞根据基因表达差异可以分成7个亚群。图8为CD34⁺细胞tSNE分析结果，同样显示人CD34⁺细胞可分为7个亚群。

实施例4

把2万个人CD34^-细胞加入到1cm×1cm微孔板中，达到约10％落孔率，洗去多余细胞。把分子标记磁珠加入到微孔板中，达到99％以上落孔率，洗去多余微孔标记磁珠。

其余步骤同实施例2。

基因测序文库构建好后送至诺禾致源公司进行测序，采用HiSeq2500PE125测序策略。对测序返还结果进行分析，得到CD34^-细胞基因表达差异热图，可知CD34^-细胞根据基因表达差异可以分成7个亚群(图9)。

Claims

1.一种高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述步骤为：

（1）将细胞加入到微孔板中，然后加入分子标记微珠，所述分子标记微珠包括微珠本体和偶联的作为分子标记的寡核苷酸链，所述寡核苷酸链包括：

通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；

多聚T尾，与mRNA的poly A序列结合；

分子标签序列，标识结合的mRNA；和

细胞标签序列，标识mRNA取自的细胞，

其中微孔板上的微孔直径大小为刚好容纳一个细胞和一个分子标记微珠；

并且所述的分子标记的序列如下：

5’-TTTAGGGATAACAGGGTAATAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGTnnnnnnCGA

CTCACTACAGGGnnnnnnTCGGTGACACGATCGnnnnnnNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’；

所述微珠本体为磁珠；

并且，单个分子标记磁珠上连接10^6~7条所述的分子标记序列；

（2）加入裂解液，孵育；

（3）收集分子标记微珠-mRNA复合物，进行逆转录PCR，获得带有所述分子标记的cDNA；

（4）构建测序文库，进行高通量测序，其中所述的高通量测序是一次性获得上万个单细胞的特异性转录组信息；

其中，所述微珠本体的直径为15~25μm；所述细胞加入微孔板中的落孔率控制在8%~12%；并且所述分子标记微珠加入微孔板中的落孔率大于99%。

2.如权利要求1所述的高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述微珠与分子标记偶联方式为：分子标记5’端的核苷酸的C6位上使用胺基取代羟基，微珠表面修饰有羧基，羧基与所述胺基缩合。

3.如权利要求1所述的高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述分子标签序列至少部分为随机合成。

4.如权利要求1所述的高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述细胞标签序列由多个特异性片段串接组成，不同位置的特异性片段选自相同的或不同的特异性片段库，所述细胞标签序列利用所述特异性片段的排列组合方式不同标识细胞。

5.如权利要求4所述的高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述分子标记微珠的制备方法包括以下步骤：

（1）合成通用引物序列，所述通用引物序列3’端连接细胞标签序列的其中一个特异性片段；

（2）将通用引物序列与微珠本体偶联，获得偶联物；

（3）通过PCR延伸在偶联物3’端串接细胞标签序列的其余特异性片段，组装形成细胞标签序列；

（4）在细胞标签序列3’端依次连接分子标签序列和多聚T尾。

6.如权利要求1所述的高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述微孔板制备方法为：

（1）在硅片上刻蚀出微孔作为初始模具，微孔直径20~50μm；

（2）在初始模具上浇注聚二甲基硅氧烷，成型后取下成为带有微柱的反向模具；

（3）在反向模具上浇注加热融化的浓度为4%~6%的琼脂糖，冷却成型后，取下即为微孔板。