CN113106086A - 一种带有dna标签的磁珠制备方式 - Google Patents

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
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Abstract

本发明提供一种带有DNA标签的磁珠制备方式，具体包括：将磁珠加入活化剂中，震荡活化，磁分离，弃上清液；用保存缓冲液清洗磁珠，得到活化的磁珠悬浮液；加入DNA片段溶液，得到磁珠混合液；加入缩合剂，形成混合溶液进行反应，反应结束后，使用保存缓冲液对每管磁珠都进行清洗，获得溶液A；加入DNA片段溶液和DNA聚合酶，获得磁珠混合液B；进行高温解链，解链后充分冷却，再用保存缓冲液清洗数次，即可获得带有DNA标签的磁珠混合液C；加入DNA片段溶液和DNA聚合酶，获得磁珠混合液D；将磁珠混合液D进行高温解链，即可获得带有DNA标签的磁珠。本带有DNA标签的磁珠可以在测序时可以大幅度提高序列质量。

Description

一种带有DNA标签的磁珠制备方式
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体为一种带有DNA标签的磁珠制备方式。
背景技术
单细胞转录组测序(single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq)是近几年兴起的新技术，能够从单个细胞水平获得全转录组表达谱、扩增后进行高通量测序，从而高效地检测单个细胞内的基因表达水平，在干细胞的发育与分化、肿瘤的诊断与治疗、靶向药物的设计等领域具有重要的应用价值。
单细胞转录组测序之所以可以同时对成百数千个细胞进行测序，是因为每个细胞都贴有不同的标签，为了区别每个细胞中的每条mRNA，每条mRNA同样被赋予一个唯一的分子标签。目前单细胞测序的微流控平台，主要是将单个细胞与带有分子标签的单个微珠或者磁珠置于一个微孔环境，细胞裂解后，不同的细胞可携带特异的细胞标签，经反转录同一个细胞的不同mRNA又被不同分子标签所标记。这种方法可追踪每个基因的细胞来源，而且可以对mRNA进行定量，显著提高了测序通量、降低测序成本并且减轻扩增偏好的影响。但是现有带有标签的磁珠在进行测序时，序列质量有待提高。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种带有DNA标签的磁珠制备方式，以解决上述背景技术中的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现一种带有DNA标签的磁珠制备方式，具体包括以下步骤：
步骤1、将磁珠加入相同体积的活化剂中，室温条件下避光，震荡活化0.5～5h，磁分离，弃上清液；
步骤2、用保存缓冲液清洗活化后的磁珠数次，然后将活化后的磁珠拆分到若干试管中，得到若干试管的活化的磁珠悬浮液；
步骤3、在每个试管中加入一种DNA片段溶液，得到磁珠混合液；
步骤4、将步骤3中所得的磁珠混合物中加入缩合剂，在缩合剂的作用下发生羧氨反应脱水缩合进行连接，形成若干试管的混合溶液，反应结束后，使用保存缓冲液对每管磁珠都进行清洗，获得溶液A；
步骤5、将所有溶液A混合至一个试管内并混匀，然后重新拆分至若干试管，每个试管加入DNA片段溶液和DNA聚合酶，并进行DNA聚合反应，将反应后的溶液使用保存缓冲液清洗，获得磁珠混合液B；
步骤6、对磁珠悬浮液B进行高温解链，解链后充分冷却，再用保存缓冲液清洗数次，即可获得带有DNA标签的磁珠混合液C；
步骤7、将磁珠混合液C混合至一个试管内并混匀，然后重新拆分为若干管，每个试管加入DNA片段溶液和DNA聚合酶，并进行DNA聚合反应，反应后用保存缓冲液清洗对溶液清洗，获得磁珠混合液D；
步骤8、将磁珠混合液D进行高温解链，解链后充分冷却，再用保存缓冲液清洗数次，即可获得带有DNA标签的磁珠，最后将所有试管的磁珠合并至同一试管即可。
优选地，所述步骤1中的活化剂为体积百分比浓度为50％～60％的1，4－丁二醇－双缩水甘油醚。
优选地，所述步骤2、步骤4、步骤5、步骤7和步骤8中的保存缓冲液为pH值＝8.6、含体积百分比浓度0.01％硫柳汞钠和5％蛋白保护剂的1×PBS缓冲液。
优选地，所述缩合剂为缩合剂DCC，DIC，EDC或EDCI中的一种。
优选地，所述DNA聚合酶为Bst 2.0DNA聚合酶、Bst 2.0WarmStartTM DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、硫化叶菌DNA聚合酶IV、Taq DNA聚合酶、9°NTMm DNA聚合酶、Deep VentRTM(exo-)DNA聚合酶、Deep VentRTM DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Q5TM高保真度DNA聚合酶、有酶切活性的Klenow酶、无酶切活性的Klenow酶、Thermina torT MγDNA聚合酶中的一种。
优选地，所述步骤1-步骤8均在无菌环境下进行操作，步骤3-步骤5均在室温下进行。
与已公开技术相比，本发明存在以下优点：本带有DNA标签的磁珠可以做到linker1和linker2的序列有2-3种不同的序列，在测序时可以大幅度提高序列质量。
附图说明
图1为本发明的磁珠与DNA片段反应连接示意图。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示，一种带有DNA标签的磁珠制备方式，具体包括以下步骤：
步骤1、将磁珠加入相同体积的活化剂中，室温条件下避光，震荡活化0.5～5h，磁分离，弃上清液；
步骤2、用保存缓冲液清洗活化后的磁珠数次，然后将活化后的磁珠拆分到若干试管中，得到若干试管的活化的磁珠悬浮液；
步骤3、在每个试管中加入一种DNA片段溶液，得到磁珠混合液；
步骤4、将步骤3中所得的磁珠混合物中加入缩合剂，在缩合剂的作用下发生羧氨反应脱水缩合进行连接，形成若干试管的混合溶液，反应结束后，使用保存缓冲液对每管磁珠都进行清洗，获得溶液A；
步骤5、将所有溶液A混合至一个试管内并混匀，然后重新拆分至若干试管，每个试管加入DNA片段溶液和DNA聚合酶，并进行DNA聚合反应，将反应后的溶液使用保存缓冲液清洗，获得磁珠混合液B；
步骤6、对磁珠悬浮液B进行高温解链，解链后充分冷却，再用保存缓冲液清洗数次，即可获得带有DNA标签的磁珠混合液C；
步骤7、将磁珠混合液C混合至一个试管内并混匀，然后重新拆分为若干管，每个试管加入DNA片段溶液和DNA聚合酶，并进行DNA聚合反应，反应后用保存缓冲液清洗对溶液清洗，获得磁珠混合液D；
步骤8、将磁珠混合液D进行高温解链，解链后充分冷却，再用保存缓冲液清洗数次，即可获得带有DNA标签的磁珠，最后将所有试管的磁珠合并至同一试管即可。
实施例2
如图1所示，一种带有DNA标签的磁珠制备方式，具体包括以下步骤：
步骤1、将磁珠加入相同体积的活化剂中，室温条件下避光，震荡活化0.5～5h，磁分离，弃上清液；
步骤2、用保存缓冲液清洗活化后的磁珠数次，然后将活化后的磁珠拆分到若干试管中，得到若干试管的活化的磁珠悬浮液；
步骤3、在每个试管中加入一种DNA片段溶液，得到磁珠混合液；
步骤4、将步骤3中所得的磁珠混合物中加入缩合剂，在缩合剂的作用下发生羧氨反应脱水缩合进行连接，形成若干试管的混合溶液，反应结束后，使用保存缓冲液对每管磁珠都进行清洗，获得溶液A；
步骤5、将所有溶液A混合至一个试管内并混匀，然后重新拆分至若干试管，每个试管加入DNA片段溶液和DNA聚合酶，并进行DNA聚合反应，将反应后的溶液使用保存缓冲液清洗，获得磁珠混合液B；
步骤6、对磁珠悬浮液B进行高温解链，解链后充分冷却，再用保存缓冲液清洗数次，即可获得带有DNA标签的磁珠混合液C；
步骤7、将磁珠混合液C混合至一个试管内并混匀，然后重新拆分为若干管，每个试管加入DNA片段溶液和DNA聚合酶，并进行DNA聚合反应，反应后用保存缓冲液清洗对溶液清洗，获得磁珠混合液D；
步骤8、将磁珠混合液D进行高温解链，解链后充分冷却，再用保存缓冲液清洗数次，即可获得带有DNA标签的磁珠，最后将所有试管的磁珠合并至同一试管即可。
优选地，所述步骤1中的活化剂为体积百分比浓度为50％～60％的1，4－丁二醇－双缩水甘油醚。
优选地，所述步骤2、步骤4、步骤5、步骤7和步骤8中的保存缓冲液为pH值＝8.6、含体积百分比浓度0.01％硫柳汞钠和5％蛋白保护剂的1×PBS缓冲液。
优选地，所述缩合剂为缩合剂DCC，DIC，EDC或EDCI中的一种。
优选地，所述DNA聚合酶为Bst 2.0DNA聚合酶、Bst 2.0WarmStartTM DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、硫化叶菌DNA聚合酶IV、Taq DNA聚合酶、9°NTMm DNA聚合酶、Deep VentRTM(exo-)DNA聚合酶、Deep VentRTM DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Q5TM高保真度DNA聚合酶、有酶切活性的Klenow酶、无酶切活性的Klenow酶、Thermina torT MγDNA聚合酶中的一种。
优选地，所述步骤1-步骤8均在无菌环境下进行操作，步骤3-步骤5均在室温下进行。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种带有DNA标签的磁珠制备方式，其特征在于：具体包括以下步骤，
步骤1、将磁珠加入相同体积的活化剂中，室温条件下避光，震荡活化0.5～5h，磁分离，弃上清液；
步骤2、用保存缓冲液清洗活化后的磁珠数次，然后将活化后的磁珠拆分到若干试管中，得到若干试管的活化的磁珠悬浮液；
步骤3、在每个试管中加入一种DNA片段溶液，得到磁珠混合液；
步骤4、将步骤3中所得的磁珠混合物中加入缩合剂，在缩合剂的作用下发生羧氨反应脱水缩合进行连接，形成若干试管的混合溶液，反应结束后，使用保存缓冲液对每管磁珠都进行清洗，获得溶液A；
步骤5、将所有溶液A混合至一个试管内并混匀，然后重新拆分至若干试管，每个试管加入DNA片段溶液和DNA聚合酶，并进行DNA聚合反应，将反应后的溶液使用保存缓冲液清洗，获得磁珠混合液B；
步骤6、对磁珠悬浮液B进行高温解链，解链后充分冷却，再用保存缓冲液清洗数次，即可获得带有DNA标签的磁珠混合液C；
步骤7、将磁珠混合液C混合至一个试管内并混匀，然后重新拆分为若干管，每个试管加入DNA片段溶液和DNA聚合酶，并进行DNA聚合反应，反应后用保存缓冲液清洗对溶液清洗，获得磁珠混合液D；
步骤8、将磁珠混合液D进行高温解链，解链后充分冷却，再用保存缓冲液清洗数次，即可获得带有DNA标签的磁珠，最后将所有试管的磁珠合并至同一试管即可。
2.根据权利要求1所述的一种带有DNA标签的磁珠制备方式，其特征在于：所述步骤1中的活化剂为体积百分比浓度为50％～60％的1，4－丁二醇－双缩水甘油醚。
3.根据权利要求1所述的一种带有DNA标签的磁珠制备方式，其特征在于：所述步骤2、步骤4、步骤5、步骤7和步骤8中的保存缓冲液为pH值＝8.6、含体积百分比浓度0.01％硫柳汞钠和5％蛋白保护剂的1×PBS缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种带有DNA标签的磁珠制备方式，其特征在于：所述缩合剂为缩合剂DCC，DIC，EDC或EDCI中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种带有DNA标签的磁珠制备方式，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst 2.0DNA聚合酶、Bst 2.0WarmStartTM DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、硫化叶菌DNA聚合酶IV、Taq DNA聚合酶、9°NTMm DNA聚合酶、Deep VentRTM(exo-)DNA聚合酶、DeepVentRTM DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Q5TM高保真度DNA聚合酶、有酶切活性的Klenow酶、无酶切活性的Klenow酶、Thermina torT MγDNA聚合酶中的一种。
6.根据权利要求5所述的一种带有DNA标签的磁珠制备方式，其特征在于：所述步骤1-步骤8均在无菌环境下进行操作，步骤3-步骤5均在室温下进行。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106498040A (zh) * 2016-10-12 2017-03-15 浙江大学 一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法
CN111378728A (zh) * 2018-12-31 2020-07-07 新格元(南京)生物科技有限公司 一种带分子标签引物序列的磁珠及其制备方法
CN112251504A (zh) * 2020-09-09 2021-01-22 新格元(南京)生物科技有限公司 一种具有分子标签序列的磁性微球及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106498040A (zh) * 2016-10-12 2017-03-15 浙江大学 一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法
CN111378728A (zh) * 2018-12-31 2020-07-07 新格元(南京)生物科技有限公司 一种带分子标签引物序列的磁珠及其制备方法
CN112251504A (zh) * 2020-09-09 2021-01-22 新格元(南京)生物科技有限公司 一种具有分子标签序列的磁性微球及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
生吉萍等: "《食品基因工程导论》", 28 February 2017 *

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