CN115916972A - 用于被固定样品的组合物和方法 - Google Patents

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CN115916972A CN202180042807.XA CN202180042807A CN115916972A CN 115916972 A CN115916972 A CN 115916972A CN 202180042807 A CN202180042807 A CN 202180042807A CN 115916972 A CN115916972 A CN 115916972A
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Abstract

公开了用于改善被固定生物颗粒、被固定膜结合颗粒、被固定细胞、核和/或被固定细胞或核的生物分子(例如，核酸、RNA)的去固定或去交联的组合物、试剂、方法、试剂盒和系统。公开了核酸的加工和对核酸加条形码。公开了用于增加来自被固定细胞或核的去固定生物分子(例如，核酸、RNA)的量和质量的方法。聚合物比如聚乙二醇(PEG)增加从去固定细胞或核获得的核糖核酸(RNA)的量和质量。公开了用于在各种测定中使用去固定细胞/核和来自去固定细胞/核的生物分子的方法。聚合物比如PEG增加去固定剂存在下核酸聚合酶反应(例如，DNA聚合酶、逆转录酶)的效率。在一些实例中，当反应中包括PEG时，PEG增加蛋白酶存在下的逆转录酶活性。

Description

用于被固定样品的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月16日提交的美国临时申请第63/010,768号和2020年12月30日提交的美国临时申请第63/132,278号的优先权，所述美国临时申请中的每一个在此整体并入，包括所有表、图和权利要求。
序列表
序列表的正式副本以ASCII格式的文本文件经由EFS-Web与说明书同时提交，文件名为″10416-039WO1_SeqListing″，创建日期为2021年4月16日，大小为2千字节。经由EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分并通过引用整体并入本文。
背景技术
被固定生物样品中的分析物在处理样品中的生物颗粒(例如，细胞或核)以逆转固定对颗粒内的生物分子的影响(即，去固定或去交联)之后的检测和定量是一个活跃的研发领域。目标是获得可用于检测和定量颗粒中或来自颗粒的各种分析物/生物分子的测定的去固定生物颗粒。理想地，其中，固定、去固定和去固定颗粒中分析物的后续检测的过程适应于快速、高通量系统，如分隔的单细胞系统。因此，不仅寻求改进各个固定、去固定和检测步骤的结局。而且，同样令人感兴趣的是快速地将已经经受一个步骤(例如，去固定或去交联)的样品推进到后续步骤(例如，用于检测分析物的酶法测定)，并产生成功的结果。至少在一些实例中，用于固定、去固定和/或检测的当前系统和方法具有相对低的通量。因此，对生物颗粒去固定、使来自去固定颗粒的可用酶底物和/或模板最大化的更好方法以及在这些底物和模板上使用酶的条件将是有用的。
发明内容
生物颗粒或膜结合颗粒(例如，细胞、核等)的基于隔室的分析经常遇到样品稳定性挑战。一旦从相对活力状态移除(例如，从组织样品移除或解离细胞或核)，样品降解的风险就会增加。固定剂的使用可解决样品降解问题，但接着通常需要逆转固定状态以便接近细胞分析物(例如，来自单个细胞或核的核糖核酸(RNA)分子)以在隔室中加工(例如，在乳液中的液滴中或在孔中的单个细胞或核)。本公开涉及这种固定状态在隔室中的逆转以使得细胞分析物在相同隔室中被用于加工的试剂所接近。公开了用于对已被固定的生物颗粒(例如，细胞)去固定以使在颗粒内检测到的分析物(本文中也称细胞分析物)的数量和质量最大化的组合物、试剂、方法、试剂盒和系统。还公开了用于检测和定量来自去固定细胞或核的分析物的组合物、试剂、方法和试剂盒。在一个方面，公开了用于加工来自被固定样品的核酸分析物的方法。在一些实施方案中，被固定样品含有被固定细胞或核。在一些实施方案中，所述方法包括提供包含以下的隔室：(i)含有具有核苷酸序列的核酸分子的被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒，和(ii)核酸条形码分子。在一些实施方案中，所述隔室还包含去固定、去交联或切割剂。在一些实施方案中，切割剂为蛋白酶。蛋白酶可以包括例如蛋白质酶K、枯草杆菌蛋白酶A和/或冷活性蛋白酶。在一些实施方案中，去固定、去交联或切割剂为催化剂。在其他实施方案中，去固定/去交联/切割剂包括蛋白酶和催化剂两者。在一些实施方案中，去固定/去交联/切割剂破坏由固定剂生成的键。
在一个其他的实施方案中，核酸条形码分子包含配置为退火至所述被固定生物颗粒或所述被固定膜结合颗粒的核酸分子的捕获序列。在另一个实施方案中，捕获序列为poly-T序列。在一个另外的实施方案中，核酸条形码分子包含独特的分子标识符序列(UMI)或配置为允许附着到流动池的序列。
在另一个实施方案中，方法包括分隔包含有包含核酸序列的核酸分子的被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒和(ii)核酸条形码分子。在一个实施方案中，方法包括使所述隔室经受足以生成与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的核酸分子的条件。在其他实施方案中，核酸分子为交联的核酸分子。在一个其他的实施方案中，所述交联的核酸分子包含核糖核酸(RNA)分子，其可为信使RNA(mRNA)分子。在一个实施方案中，所述隔室的经受包括(i)从所述交联的核酸分子生成未连接的核酸分子，和(ii)让所述未连接的核酸分子与所述核酸条形码分子联接。
在其他实施方案中，所述隔室的经受包括加热所述隔室。所述隔室的加热可以包括加热至约53℃的温度达约45分钟并然后任选地在约70℃的温度下加热约15分钟。在另一个实施方案中，加热还包括使所述隔室经受约90℃的温度达约10分钟。在一个另外的实施方案中，在所述隔室的所述经受足以生成与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的核酸分子的条件之后将隔室冷却或让隔室冷却。在一个实施方案中，所述冷却或让冷却包括使隔室达到约25℃的温度。
在另一个实施方案中，方法包括从所述隔室释放与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的所述核酸分子以生成与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的释放的核酸分子。在一个其他的实施方案中，隔室为液滴或孔。在另一个实施方案中，释放包括破坏所述液滴。在一个另外的实施方案中，在所述释放步骤之前将隔室冷却或让隔室冷却。在一个实施方案中，所述冷却或让冷却包括使隔室达到约25℃的温度。
在其他实施方案中，方法包括使与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的所述释放的核酸分子经受足以发生核酸延伸反应的条件。在一个其他的实施方案中，核酸延伸反应包括使用所述核酸序列作为模板来延伸所述核酸条形码分子以生成加有条形码的核酸分子。在一个实施方案中，所述延伸为所述核酸条形码分子的3’末端的延伸。
在一个其他的实施方案中，使所述释放的核酸分子经受足以发生核酸延伸反应的条件的步骤i)在蛋白酶抑制剂的存在下进行，或ii)包括使用逆转录酶来延伸所述核酸分子条形码分子。逆转录酶可以包含RNA酶活性。在一个实施方案中，所述延伸为所述核酸条形码分子的3’末端的延伸。
在其他实施方案中，方法还包括将另外的序列附加到所述加有条形码的核酸分子。在一个实施方案中，所述另外的序列为poly-C序列。所述附加可以通过可为逆转录酶的连接酶或聚合酶进行。在其他实施方案中，所述附加包括使用夹板(splint)核酸分子。在其他实施方案中，所述附加包括使用引物来退火至所述加有条形码的核酸分子。
在一个另外的实施方案中，所述隔室还包含模板转换寡核苷酸(TSO)。在一个其他的实施方案中，方法还包括i)使所述隔室经受足以使所述TSO与所述另外的序列杂交的条件，或ii)延伸所述加有条形码的核酸分子以生成包含与所述TSO互补的序列的经延伸的加有条形码的核酸分子。在一个实施方案中，TSO包含测序引物序列或其补体。在其他实施方案中，核酸条形码分子联接到支持物，所述支持物可为珠。在一个实施方案中，所述珠为凝胶珠。在其他实施方案中，核酸条形码分子通过不稳定部分与所述支持物联接。
在一个其他的实施方案中，方法还包括对所述加有条形码的核酸分子或其扩增产物测序。在一个实施方案中，方法还包括提供多个隔室。在一个另外的实施方案中，方法包括在提供一个隔室或多个隔室之前将多个被固定生物颗粒或多个被固定膜结合颗粒中的一个或多个分隔到多个隔室中。在一个实施方案中，在所述使所述隔室经受足以生成与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的核酸分子的条件之后和/或在从所述隔室释放与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的所述核酸分子之前，所述多个隔室包含与核酸条形码分子联接的多个核酸分子。在其他实施方案中，方法包括在释放所述核酸分子之前从所述多个隔室合并与所述核酸条形码分子联接的所述多个核酸分子。在另外的实施方案中，方法还包括在提供隔室(或分隔)之前固定生物颗粒或膜结合颗粒以生成所述被固定生物颗粒或所述被固定膜结合颗粒。固定可以包括使用固定剂，固定剂可以包含多聚甲醛。在另一个实施方案中，所述被固定生物颗粒或所述被固定膜结合颗粒包含细胞、病毒或核。
还公开了聚合物比如聚乙二醇(PEG)增加从去固定细胞或核回收的高质量RNA分析物的量的发现。在各种实例中，PEG增加从细胞或核获得的RNA的量，其中去固定剂包括蛋白酶和/或其他物质。另外，发现这样的聚合物，比如PEG，增加使用去固定细胞、核和/或从去固定细胞或核获得的生物分子进行的酶反应的活性。在一些实例中，逆转录酶(RT)的各种活性在蛋白酶的存在下增加，所述蛋白酶可以从去固定反应保留下来。所描述的方法和反应可以在可以含有单个细胞或核的隔室(包括离散液滴)中使用，或者所述方法/反应可以以较大的规模(例如，批量)使用。
公开了含有逆转录酶(RT)、蛋白酶和聚乙二醇(PEG)的组合物。所述组合物可以另外包含能够被RT用来合成互补DNA链的核酸模板、能够被RT用来启动互补DNA链的第一链合成的第一引物、模板转换寡核苷酸和能够被RT用来启动第二链DNA合成的第二引物。在一些实例中，能够被RT使用的核酸模板包括RNA，其可以来自去固定细胞或核，在一些实例中来自其中已经使用蛋白酶去固定剂的去固定细胞或核。
公开了用于在包含逆转录酶(RT)、核酸模板、蛋白酶和聚乙二醇(PEG)的组合物中合成互补单链DNA的方法。所述方法可以使用还包含能够被RT用来合成互补DNA链的核酸模板、能够被RT用来启动互补DNA链的第一链合成的第一引物、模板转换寡核苷酸和能够被RT用来启动第二链DNA合成的第二引物的组合物。在一些实例中，能够被RT使用的核酸模板包括RNA，其可以来自去固定细胞或核，在一些实例中来自其中已经使用蛋白酶去固定剂的去固定细胞或核。
公开了包括以下的方法：(a)使用去固定剂对已经被固定的细胞或核去固定，和(b)在聚乙二醇(PEG)的存在下使用来自去固定细胞或核的核酸模板和逆转录酶(RT)合成互补单链DNA。去固定剂可以具有蛋白酶活性。合成步骤可以在蛋白酶活性的存在下进行。可以在去固定步骤中与去固定剂一起引入PEG。
公开了用于对已经用固定剂固定的细胞、核或组织去固定的方法，其中所述去固定在聚乙二醇(PEG)的存在下使用去固定剂。去固定剂可以具有蛋白酶活性。去固定细胞/核/组织或者来自去固定细胞、核或组织的生物分子可以在各种测定中用作酶促反应的底物或模板。
公开了用于以下的方法：(a)用固定剂固定细胞或核以交联细胞或核中的生物分子，和(b)在PEG的存在下用去固定剂对被固定细胞或核去固定以从生物分子去除交联。去固定剂可以具有蛋白酶活性。在步骤(c)中，可以从去固定细胞或核分离出核酸(例如，RNA)。
在一些实例中，任何本文公开的方法可以以具有被固定细胞或核在隔室(例如，乳液中的液滴或孔，如微孔)中高通量加工的优点为特征。如本文进一步描述的，本公开的方法允许在含有各个细胞或核的各个隔室中在单个细胞/核水平上分析数千至数万至数十万个被固定细胞或核。例如，可生成或以其他方式提供至少约1,000个隔室、至少约5,000个隔室、至少约10,000个隔室、至少约50,000个隔室、至少约100,000个隔室、至少约500,000个隔室、至少约1,000,000个隔室、至少约5,000,000个隔室、至少约10,000,000个隔室、至少约50,000,000个隔室、至少约100,000,000个隔室、至少约500,000,000个隔室、至少约1,000,000,000个隔室或更多个隔室。
本公开的另一个方面提供了一种包括机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实现上文或本文中别处的任何方法。
本公开的另一个方面提供了一种系统，其包括一个或多个计算机处理器和与其联接的计算机存储器。计算机存储器包括机器可执行代码，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实现上文或本文中别处的任何方法。
通过以下详细描述，本公开的另外的方面和优点将对本领域技术人员变得显而易见，以下详细描述中仅示出和描述了本公开的说明性实施方案。如应认识到的，本公开能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些修改均不背离本公开。因此，附图和描述应视为本质上说明性的而非限制性的。
以引用的方式并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，其程度与每个个别出版物、专利或专利申请特异性地且个别地指示以引用的方式并入相同。在以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相矛盾的范围内，说明书预期取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
下述美国专利和美国公开专利申请各自以引用的方式整体并入本申请内：
于2017年5月9日颁发，且名称为“Partitioning And Processing Of AnalytesAnd Other Species”的美国专利号9,644,204(序列号14/175,935)；
于2018年5月22日颁发，且名称为“Instrument Systems For Integrated SampleProcessing”的美国专利号9,975,122(序列号14/934,044)；
于2018年7月3日颁发，且名称为“Methods and Systems For ProcessingPolynucleotides”的美国专利号10,011,872(序列号15/720,085)；
于2018年8月21日颁发，且名称为“Capsule Array Devices And Methods OfUse”的美国专利号10,053,723(序列号15/719,459)；
于2018年9月11日颁发，且名称为“Fluidic Devices，Systems，And Methods ForEncapsulating And Partitioning Reagents，And Applications Of S ame”的美国专利号10,071,377(序列号15/687,856)；和
于2020年3月17日颁发、且名称为“Compositions，Methods，and Systems ForBead Formation Using Improved Polymers”的美国专利号10,590,244(序列号16/178,430)。
以引用的方式并入的其他参考文献可以在申请各处列出。
附图说明
在并入说明书中且构成说明书的部分的附图中，示出了本发明的实施方案。应理解，附图中示意的实施方案是出于说明的目的而非为了限制示出的。应理解，可以在不背离如下文所公开的本发明的精神和范围的情况下对附图中示意的实施方案作改变、修改和偏离。
图1示意了用于本文提供的方法的工作流的实例。
图2A-2D示出了用于加工核酸的示例示意图。
图3示出了用于分隔各个生物颗粒的微流体通道结构的实例。
图4示出了用于将携带条形码的珠递送到液滴的微流体通道结构的实例。
图5示出了用于共分隔生物颗粒和试剂的微流体通道结构的实例。
图6示出了用于将珠受控分隔到离散液滴中的微流体通道结构的实例。
图7示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的实例。
图8示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的另一个实例。
图9为示意附着到支持物的捕获探针的实例的示意图(侧视图)。
图10示意了携带条形码的珠的实例。
图11示意了携带条形码的珠的另一个实例。
图12示出了示例性微孔阵列示意图。
图13示出了用于加工核酸的示例性微孔阵列工作流。
图14示出了编程为或以其他方式配置为实现本文提供的方法的计算机系统。
图15A-15C示意了从由新鲜细胞和由在各种条件下去固定的被固定细胞制备的单细胞基因表达文库获得的示例数据。
图16A-16C示意了从由新鲜细胞和由在各种条件下去固定的被固定细胞制备的单细胞基因表达文库获得的示例数据。
图17示意了由示例逆转录反应产生的产物的分离的跟踪。标记的区域(沿x-轴的1、2、3、4)用于计算转录效率和TSO效率，如实施例4中所述。
图18示意了使用输入模板和引物获得的逆转录酶反应产物以及通过毛细管电泳分离的反应产物的示例结果(小图A)。小图B示意了当向反应中添加蛋白质酶K时的结果。小图C示出了当向反应中添加蛋白质酶K和聚乙二醇(PEG)6000(最终浓度8％)时的结果。在小图中，峰从左到右代表残余输入引物(标记为“引物”)、第一链cDNA(标记为“全长)和添加了模板转换序列的第一链cDNA(标记为“TSO”)。
图19示意了使用输入模板和引物获得的逆转录酶反应产物以及通过毛细管电泳分离的反应产物的量的示例结果。对于每组条件，如实施例4中所述计算转录效率(左条)和TSO效率(右条)。所有反应均含有模板、引物和逆转录酶，并且进行45或90分钟。每个样品的其他添加物和条件如下：
(A)无添加物，45分钟；
(B)枯草杆菌蛋白酶A，45分钟；
(C)枯草杆菌蛋白酶A和PEG 6000(最终浓度8％)；45分钟；
(D)枯草杆菌蛋白酶A、PEG 6000(最终浓度8％)和蛋白酶抑制剂；45分钟；
(E)无添加物，90分钟；
(F)蛋白质酶K；45分钟；
(G)蛋白质酶K；90分钟；
(H)蛋白质酶K和蛋白酶抑制剂；90分钟；
(I)蛋白质酶K和PEG 6000(最终浓度8％)；45分钟；
(J)蛋白质酶K、PEG 6000(最终浓度8％)和蛋白酶抑制剂；90分钟；和
(K)蛋白质酶K和PEG 6000(最终浓度4％)；45分钟。
图20示意了在各种去交联/去固定条件之后从被多聚甲醛固定的细胞分离出的RNA的量的示例结果。样品(A)为来自新鲜、未固定的细胞沉淀物(阳性对照)的RNA。所有去交联反应在53℃下进行45分钟。对于去交联的样品(B至L)，在细胞被去交联并离心之后从上清液获得的RNA的量在一些条中示出在黑线上方(样品B、C、G、H、I、J、K和L)。对于这些样品，从细胞沉淀物获得的RNA的量示出在黑线下方。对于一些样品(D、E和F)，上清液中RNA的量可忽略不计，故仅示出了来自细胞沉淀物的RNA。向每个反应的添加物如下：
(A)来自新鲜细胞的RNA(阳性对照)；
(B)0.1mg蛋白质酶K(PK)/ml；
(C)0.1mg PK/ml和2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂；
(D)0.1mg PK/ml和(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂；
(E)0.1mg PK/ml、(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂和PEG 6000(最终浓度4％)；
(F)0.1mg PK/ml、(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂和PEG 6000(最终浓度8％)；
(G)0.1mg PK/ml、2-氨基-5-甲基苯甲酸和(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂；
(H)0.1mg PK/ml、2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂、(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂和PEG 6000(最终浓度4％)；
(I)0.1mg PK/ml、2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂、(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂和PEG 6000(最终浓度8％)；
(J)0.2mg PK/ml、2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂和(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂；
(K)0.2mg PK/ml、2-氨基-5-甲基苯甲酸1去固定剂、(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂和PEG 6000(最终浓度4％)；和
(L)0.2mg PK/ml、2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂、(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂和PEG 6000(最终浓度8％)。
具体实施方式
本文提供了用于分析来自已经被固定或经受细胞/核固定物或细胞/核固定剂的生物颗粒的核酸分子的组合物、试剂、方法、试剂盒和系统。所述组合物、试剂、方法、试剂盒和系统可以用于对来自生物颗粒的核酸分子(例如，mRNA)加条形码。所述组合物、试剂、方法、试剂盒和系统可以能够从核酸分子去除任何交联使得可从生物颗粒(例如，细胞或核)提取核酸分子并使其经受下游反应，如加条形码或测序。例如，可以使来自被固定细胞或核的mRNA经受反应以允许mRNA加条形码和测序。被固定细胞或核的核酸分子可以与其他大分子交联并且可能比新鲜或者非固定细胞或核的核酸分子更难以接近。由于与新鲜或非固定细胞/核相比，被固定细胞或核中核酸分子的可接近性较低，故可能更难以从被固定细胞或核分析核酸分子。可以使用核酸分子的加条形码来将核酸分子鉴定为源自特定生物颗粒。所述组合物、系统和方法可以用于分析多个生物颗粒(例如，多个细胞或核)并允许将来自多个生物颗粒的核酸分子鉴定为源自特定生物颗粒。
本文提供了一种用于加工核酸分子的方法，其包括：a)提供隔室，所述隔室包含：(i)包含有包含核酸序列的核酸分子的被固定生物颗粒和(ii)核酸条形码分子；b)使所述隔室经受足以生成与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的核酸分子的条件；c)从所述隔室释放与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的所述核酸分子以生成与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的释放的核酸分子；以及d)使与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的所述释放的核酸分子经受足以使用所述核酸序列作为模板延伸所述核酸条形码分子以生成加有条形码的核酸分子的条件。在一个实施方案中，足以的条件为足以延伸所述核酸条形码分子的3’末端的条件。在一个实施方案中，被固定生物颗粒包含膜或为被固定膜结合生物颗粒。被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒可以是被固定细胞或核。
在一些实例中，聚合物比如聚乙二醇(PEG)可以增加从已经被去固定的被固定细胞或核回收的核酸的量和/或质量。在一些实例中，聚合物可以在使用去固定细胞或核进行的各种反应中增加酶的活性。所描述的方法和反应可以在可以含有单个细胞或核的隔室(包括离散液滴)中使用，或者所述方法/反应可以以较大的规模(例如，批量)使用。
定义
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，术语“一个”、“一种”和“该”一般指单数和复数指代。
在本文中，“不存在”意指没有。
在本文中，通常在描述酶时，“活性”意指酶催化反应的量或程度。
术语“衔接分子(adaptor)”、“衔接子(adapter)”和“标签”可以同义使用。衔接分子或标签可通过任何方法联接至待“加标签”的多核苷酸序列，包括连接、杂交或其他方法。
在本文中，“剂”意指特定活性可归因于其的物质。
在本文中，“扩增产物”是指得自另一种分子的复制或拷贝的分子。一般地，拷贝或复制的分子是核酸分子，具体是DNA或RNA分子。在一些例子中，复制或拷贝的分子可以用作所产生分子的模板。在一些例子中，由寡核苷酸的捕获结构域捕获的分析物可以用作模板以产生扩增产物。在一些例子中，由寡核苷酸的捕获结构域捕获的mRNA可以用作模板以产生cDNA扩增产物。各种酶(例如逆转录酶)可以用于该过程。cDNA扩增产物转而又可以充当扩增的模板，其也可以称为扩增产物。各种酶(例如，Taq聚合酶)可以用于该过程。
在本文中，“分析物”是指其化学组成成分待鉴定和/或测量的物质。通常，这种应用是指来自细胞或核和/或由细胞或核产生的分析物。来自细胞或核或者由细胞或核产生的任何或所有分子或物质在本文中可以被称为分析物。化学上，细胞分析物可以包括蛋白质、多肽、肽、糖、多糖、脂质、核酸和其他生物分子。
任何时候当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于该系列数值中的每一个数值。例如，大于或等于1、2或3等同于大于或等于1、大于或等于2或者大于或等于3。
在本文中，“平均”是指平均数。
在本文中，“条形码”一般指标记或标识符，其传达或能够传达关于分析物的信息。条形码可以是分析物的部分。条形码可以独立于分析物。条形码可以是附着到分析物(例如，核酸分子)的标签，或者是标签加上分析物的内源特性(例如，分析物的大小或端部序列)的组合。条形码可以是独特的。条形码可以具有各种不同的形式。例如，条形码可包括多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；和合成核酸和/或氨基酸序列。条形码可以以可逆或不可逆的方式附着到分析物。条形码可以在样品测序之前、期间和/或之后加入例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许各个测序读段的鉴定和/或定量。
在本文中，“加有条形码的核酸分子”一般指得自例如用核酸序列(例如，与由核酸条形码分子涵盖的核酸引物序列互补的核酸序列)对核酸条形码分子加工的核酸分子。核酸序列可以是靶向序列(例如，由引物序列靶向)或非靶向序列。例如，在本文描述的方法、组合物、试剂盒和系统中，细胞或核的核酸分子(例如，信使RNA(mRNA)分子)与核酸条形码分子(例如，含有条形码序列以及与mRNA分子的核酸序列互补的核酸引物序列的核酸条形码分子)的杂交和逆转录得到具有对应于mRNA的核酸序列和条形码序列(或其反向补体)的序列的加有条形码的核酸分子。加有条形码的核酸分子可以是核酸产物。加有条形码的核酸分子可以充当模板，例如模板多核苷酸，其可以进行进一步加工(例如，扩增)且测序，以获得靶核酸序列。例如，在本文描述的方法和系统中，加有条形码的核酸分子可以进行进一步加工(例如，扩增)且测序，以获得mRNA的核酸序列。
在本文中，“碱基配对”一般指其中两种互补核酸在不同链的互补核苷酸之间已形成氢键的情形。两条此类核酸链可以被称为彼此杂交。
如本文使用的，术语“珠”一般指颗粒。珠可以是固体或半固体颗粒。珠可以是凝胶珠。凝胶珠可以包括聚合物基质(例如，通过聚合或交联形成的基质)。聚合物基质可以包括一种或多种聚合物(例如，具有不同官能团或重复单元的聚合物)。聚合物基质中的聚合物可以是随机排列的，例如在随机共聚物中，和/或具有有序结构，例如在嵌段共聚物中。交联可以是经由共价、离子或感应、相互作用或物理缠结。珠可以是大分子。珠可以由结合在一起的核酸分子形成。珠可以经由分子(例如，大分子)例如单体或聚合物的共价或非共价组装形成。此类聚合物或单体可以是天然的或合成的。此类聚合物或单体可以是或包括例如核酸分子(例如DNA或RNA)。珠可以由聚合材料形成。珠可以是磁性的或非磁性的。珠可以是刚性的。珠可以是柔性的和/或可压缩的。珠可以是可破坏的或可溶解的。珠可以是覆盖有包含一种或多种聚合物的涂层的固体颗粒(例如，基于金属的颗粒，包括但不限于氧化铁、金或银)。此类涂层可以是可破坏的或可溶解的。
如本文使用的，术语“生物颗粒”一般指衍生自生物样品的离散生物系统。生物颗粒可以是大分子。生物颗粒可以是小分子。生物颗粒可以是病毒。生物颗粒可以是细胞、核或细胞的衍生物。生物颗粒可以是细胞器。生物颗粒可以是来自细胞的细胞器。来自细胞的细胞器的实例包括但不限于核、内质网、核糖体、高尔基体、内质网、叶绿体、胞吞小泡、胞泌小泡、液泡和溶酶体。生物颗粒可以是来自细胞群的稀有细胞。生物颗粒可以是任何类型的细胞，包括但不限于原核细胞、真核细胞、细菌、真菌、植物、哺乳动物或其他动物细胞类型、支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞或任何其他细胞类型，无论衍生自单细胞还是多细胞生物。生物颗粒可以是细胞的组成成分。生物颗粒可以是或可以包括DNA、RNA、细胞器、蛋白质或其任何组合。生物颗粒可以是或可以包括基质(例如，凝胶或聚合物基质)，所述基质包含细胞或来自细胞的一种或多种组成成分(例如，细胞珠)，如来自细胞的DNA、RNA、细胞器、蛋白质或其任何组合。生物颗粒可以从受试者的组织获得。生物颗粒可以是硬化细胞。此类硬化细胞可以包括或可以不包括细胞壁或细胞膜。生物颗粒可以包括细胞的一种或多种组成成分，但可以不包括细胞的其他组成成分。此类组成成分的实例是核或细胞器。细胞可以是活细胞。活细胞可以能够被培养，例如，当封装在凝胶或聚合物基质中时被培养，或者当包含凝胶或聚合物基质时被培养。
在本文中，“生物分子(biomolecule/biological molecule)”一般指由细胞或核产生的物质。生物分子的示例组包括蛋白质、核酸、碳水化合物和脂质。
在本文中，“能够”意指具有做某事的能力或品质。
在本文中，“捕获”一般指第一物质与第二物质相互作用和/或结合的能力，其中例如，第二物质是其他物质群体的部分。可以捕获分析物。在一些例子中，捕获指通过靶核酸与捕获探针的杂交，和/或使用例如聚合酶链反应(PCR)，靶核酸分子或与其杂交的核酸探针(例如，RNA或与RNA杂交的探针)的扩增，和/或使用例如逆转录反应，靶核酸分子或与其杂交的捕获探针的核酸延伸，来鉴定靶核酸分子(例如，RNA)。
在本文中，“捕获探针”是指含有捕获结构域的分子(例如，寡核苷酸)。
在本文中，“捕获结构域”或“捕获序列”意指能够结合或捕获物质的分子的部分。分析物捕获结构域可能能够捕获分析物，其可以包括蛋白质、多肽、肽、糖、多糖、脂质、核酸和其他生物分子。在一些实例中，分析物捕获结构域可以是能够与含有互补核苷酸序列的分析物杂交的核苷酸序列。在本文中，“核苷酸捕获序列”是指能够捕获(例如，通过杂交)第二核苷酸序列的第一核苷酸序列。在一些实例中，分析物捕获结构域可以含有修饰的核苷酸。
在本文中，“催化剂”是指增加反应速率的物质，通常其本身不发生变化。在本文中，“催化剂”可以指使核酸分子去固定/去交联的物质。示例催化剂在本文表1中示出。
在本文中，“切割剂”与去固定和去交联剂相同(参见“去固定”的定义)。
在本文中，“冷活性蛋白酶”或“CAP”是指在低于约37℃的温度下具有蛋白酶活性的蛋白酶。在一些实例中，CAP在低于约25℃的温度下具有蛋白酶活性。在一些实例中，CAP可以在约15-25℃或约5-15℃的温度下具有蛋白酶活性。在一些实例中，CAP可以是ArcticZymes蛋白酶(ArcticZymes Technologies ASA，
Figure BDA0004001092240000141
Norway)、alcalase、碱性蛋白质酶、杆菌肽酶A、杆菌肽酶B、bioprase、colistinase、esperase、genenase、kazusase、maxatase、蛋白质酶K、蛋白酶S、savinase、沙雷氏菌肽酶(即，衍生自沙雷氏菌的肽酶)、枯草杆菌蛋白酶A、枯草杆菌蛋白酶B、枯草杆菌蛋白酶BL、枯草杆菌蛋白酶E、枯草杆菌蛋白酶J、枯草杆菌蛋白酶S、枯草杆菌蛋白酶S41、thermoase、胰蛋白酶及其组合。另外的CAP组合物、方法和试剂盒在PCT/US202 1/026592中有公开，其通过引用整体并入本文。
在本文中，在一个核酸序列与另一个序列互补的上下文中，“互补”是指两条链沿着其全长在两条链之间形成氢键的能力。一般使用模板核酸链来制备互补核酸链。
在本文中，在描述引起某活性或结果的物质时，“促成”一般指有多少活性或结果可归因于该特定物质。
在本文中，“联接”意指接合或连接。在本文中，“杂交”是一种类型的联接。
在本文中，“交联”意指将两种或更多种分开的物质彼此连接或附着。连接或附着是由于交联的形成。在一些实例中，交联是指在分子或不同分子中的两个或更多个原子之间的化学键形成。在一些实例中，核酸分子可以是交联的。未交联的核酸分子可以说是“未连接的”。
在本文中，“脱氧核糖核酸”或“DNA”是指由脱氧核糖核苷酸的聚合形成的核酸。
在本文中，“脱氧核糖核苷酸”或“dNTP”意指含有脱氧核糖并且是DNA的组成成分的核苷酸。
在本文中，在描述衍生自第一物质或分子的第二物质或分子时，“衍生自”是指不同于第一物质但与第一物质有关的第二物质。在其中第一酶的氨基酸序列通过用另一个氨基酸置换一个氨基酸以产生第二酶而改变的实例中，该第二酶可以说是衍生自该第一酶。
在本文中，“DNA聚合酶”是指从脱氧核糖核苷酸合成DNA的酶。
在本文中，“液滴”是指液体的一小部分，通常为圆形或梨形。
在本文中，“酶”是指催化生物化学反应的分子，通常是蛋白质。
在本文中，“等同”意指与......相同。
在本文中，“延伸”一般指通过延伸引物和使用模板来合成核酸链。延伸也可以指例如使用逆转录酶的末端转移酶活性来延伸核酸链。
在本文中，“第一链合成”是指使用核酸模板(通常为RNA模板)通过逆转录酶制备的互补DNA链。
在本文中，“最终浓度”一般指物质在其中将不再添加另外的组分的混合物中的浓度。
在本文中，“固定”是指在生物分子之间或在分子内形成共价键，如交联。固定例如细胞或核的过程被称为“固定”。引起固定的剂一般被称为“固定物”或“固定剂”。“被固定细胞”或“被固定组织”或“被固定核”是指已在足以允许或导致在生物样品中的生物分子之间形成分子内和分子间共价交联的条件下与固定物接触的细胞、核或组织。
在本文中，“流动池”是指含有流体通道的载玻片，通常是玻璃载玻片。在一些实例中，术语“流动池”是指
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流动池或等同物。
在本文中，“凝胶”意指分散在液体中的固体的半固体胶体悬浮液。凝胶是一种类型的介质。凝胶的类型可以包括琼脂、琼脂糖、水凝胶、聚丙烯酰胺等。
如本文所用，术语“基因组”一般指来自受试者的基因组信息，其可以是例如受试者的遗传信息的至少一部分或全部。基因组可在DNA或RNA中编码。基因组可包含编码区(例如，编码蛋白质的)以及非编码区。基因组可包括生物体中所有染色体一起的序列。例如，人类基因组通常具有总共46条染色体。所有这些的序列一起可以构成人类基因组。
本文中，“杂交”指单链核酸分子的核苷酸序列与具有互补核苷酸序列的核酸分子形成复合物。一般地，复合物通过分开的核酸分子中的互补核苷酸碱基之间的氢键合形成。“退火”是关于杂交的另一个术语。
在本文中，“杂交核苷酸序列”指例如寡核苷酸内的核苷酸序列，其能够与来自组织样品的细胞上或其内的靶核酸分子(例如，细胞RNA)中的互补核苷酸序列杂交。当杂交核苷酸序列具有这样的长度，使得它与靶核酸分子(例如，细胞RNA或RNA家族)所特有的完全或部分互补的核苷酸序列杂交时，杂交核苷酸序列可以被说成与相同的靶核酸分子(例如，相同的RNA)杂交。
在本文中，“启动(initiate/initiation)”是指开始。
在本文中，“连接酶”是指接合DNA的磷酸二酯主链中的断裂的酶和/或活性。连接酶通常形成磷酸二酯键。
在本文中，在描述比第二核酸分子长的第一核酸分子时，“比......长”意指第一核酸含有比第二核酸多的核苷酸。
如本文所用，术语“大分子组成成分”一般指含在生物颗粒内或来自生物颗粒的大分子。大分子组成成分可以包含核酸。在一些情况下，生物颗粒可以是大分子。大分子组成成分可以包含DNA。大分子组成成分可以包含RNA。RNA可以是编码的或非编码的。RNA可以是例如信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转移RNA(tRNA)。RNA可以是转录物。RNA可以是长度小于200个核酸碱基的小RNA，或长度大于200个核酸碱基的大RNA。小RNA可以包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、tRNA衍生小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。大分子组成成分可以包含蛋白质。大分子组成成分可以包含肽。大分子组成成分可以包含多肽。
在本文中，“膜结合颗粒”可以指细胞、核、细胞的细胞器或非细胞膜结合颗粒(例如，脂质体)。
在本文中，“混合物”是指未彼此反应的多种化学物质的组合。
在本文中，“分子量”是指分子中原子的原子质量的总和。
如本文所用，术语“分子标签”一般指能够与大分子组成成分结合的分子。分子标签可以以高亲和力与大分子组成成分结合。分子标签可以以高特异性与大分子组成成分结合。分子标签可以包含核苷酸序列。分子标签可以包含核酸序列。核酸序列可以是分子标签的至少一部分或全部。分子标签可以是核酸分子或可以是核酸分子的一部分。分子标签可以是寡核苷酸或多肽。分子标签可以包含DNA适体。分子标签可以是或包含引物。分子标签可以是或包含蛋白质。分子标签可以包含多肽。分子标签可以是条形码。
任何时候当术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前，术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”适用于该系列数值中的每一个数值。例如，小于或等于3、2或1等同于小于或等于3、小于或等于2或者小于或等于1。
在本文中，“核酸”是指由称为核苷酸的单元的聚合形成的线型大分子。
在本文中，“核酸产物”是指使用靶核酸分子(例如，RNA)作为模板产生的核酸及其衍生物。在一些实例中，核酸探针(例如，RNA捕获探针)可以充当核酸延伸反应(例如，逆转录反应或聚合酶链反应)的引物，所述反应延伸(或扩增)靶核酸分子的核苷酸序列，从而生成基于靶核酸分子或核酸探针的核酸产物。
在本文中，“核苷酸序列”或“核酸序列”是指核酸分子(例如，寡核苷酸)内的核苷酸碱基的线型连续(progression)。
在本文中，“寡聚物”是指具有相对少的重复单元的聚合物。
在本文中，“寡核苷酸”意指核苷酸(在一些实例中2′-脱氧核糖核苷酸)的线型聚合物。寡核苷酸是单链的。寡核苷酸可以具有各种长度。寡核苷酸可以包括如本领域已知的修饰的核苷酸。
在本文中，“部分”意指少于全部或少于完全。
如本文所用，术语“隔室”一般指可适合容纳一种或多种物质或者进行一种或多种反应的空间或体积。隔室可以是物理区室，如液滴或孔(例如，微孔)。隔室可以将空间或体积与另一个空间或体积分离。液滴可以是与第一相不混溶的第二相(例如油)中的第一相(例如水相)。液滴可以是不与第一相相分离的第二相中的第一相，例如水相中的胶囊或脂质体。隔室可以包括一个或多个其他(内部)隔室。在一些情况下，隔室可以是虚拟区室，其可以由跨越多个和/或远程物理区室的索引(例如，索引文库)定义且鉴定。例如，物理区室可以包括多个虚拟区室。
在本文中，“PEG化物”或“聚乙二醇化物”意指聚乙二醇(PEG)和/或其合并物(amalgamation)共价或非共价地附着到别的物质，例如生物分子。“PEG化”是指PEG通过其附着的过程。在本文中，例如向含有逆转录酶的反应溶液中加入PEG的溶液不是该逆转录酶的PEG化(即，PEG不附着到逆转录酶)。然而，本申请中公开的方法包括其中向酶促反应中加入PEG的溶液并且该溶液不附着的情况，以及其中PEG在反应中附着到酶的情况。
在本文中，“聚乙二醇”是指具有化学式H-(O-CH2-CH2)n-OH的聚醚化合物。
在本文中，“进行”意指执行或完成。
在本文中，“聚合物”是指具有许多重复单元的物质。
在本文中，“聚合酶”一般指催化从前体物质形成核酸的酶和/或活性。
在本文中，“......的存在”一般指在同一区域或空间中。在一个实例中，当酶被陈述为在另一种物质“的存在”下催化反应时，酶和该物质将是同一溶液的一部分，并且通常彼此接触。
在本文中，“引物”意指对于DNA合成提供起点的单链核酸序列。一般地，引物具有与模板互补的核苷酸序列，并且具有可用的3′-羟基，转录酶或聚合酶可以向其添加与模板中的相应核苷酸互补的另外核苷酸，以在3′到5′方向上合成核酸链。
在本文中，“蛋白酶”是指可通过水解分解蛋白质(通常分解成肽和/或氨基酸)的分子(通常为酶)和/或活性。
在本文中，“蛋白质酶K”是指一种特定的蛋白酶。
如本文所用，术语“实时”可指小于约1秒、十分之一秒、百分之一秒、毫秒或更短的响应时间。响应时间可以大于1秒。在一些情况下，实时可指同时或基本上同时的加工、检测或鉴定。
在本文中，“释放”意指放开或逃脱。
在本文中，“逆转录酶”是指可使用RNA模板合成单链DNA的酶和/或活性。
在本文中，“核糖核酸”或“RNA”是指由核糖核苷酸的聚合形成的核酸。
在本文中，“核糖核酸酶”或“RNA酶”是指催化RNA降解成较小组分的酶和/或活性。
在本文中，“RNA聚合酶”是指可使用DNA模板合成单链RNA的酶和/或活性。
术语“样品”或“生物样品”一般指受试者的生物样品。生物样品可以包含任何数量的大分子，例如细胞大分子。样品可以是细胞或核样品。样品可以是细胞系或细胞培养样品。样品可包括一种或多种细胞/核。样品可包括一种或多种微生物。生物样品可以是核酸样品或蛋白质样品。生物样品也可以是碳水化合物样品或脂质样品。生物样品可以衍生自另一种样品。样品可以是组织样品，例如活组织检查、核心活组织检查、针抽吸物或细针抽吸物。样品可以是流体样品，例如血液样品、尿样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品。样品可以是颊拭子。样品可以是血浆或血清样品。样品可以是无细胞的或无细胞样品。无细胞样品可以包括细胞外多核苷酸。细胞外多核苷酸可以从身体样品中分离，所述身体样品可以选自血液、血浆、血清、尿、唾液、粘膜排泄物、痰、粪便和泪。在一些实例中，生物样品可以是细胞或核的悬浮液以及悬浮细胞或核的内容物。
在本文中，“第二链合成”是指使用通过第一链合成制备的DNA链作为模板制备的互补DNA链。
如本文所用，术语“测序”一般指用于确定一种或多种多核苷酸中核苷酸碱基的序列的方法和技术。多核苷酸可为例如核酸分子如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，包括其变体或衍生物(例如，单链DNA)。测序可由目前可用的各种系统进行，如但不限于
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Pacific Biosciences
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Oxford
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或LifeTechnologies(Ion
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)的测序系统。或者或另外，可以使用核酸扩增、聚合酶链反应(PCR)(例如，数字PCR、定量PCR或实时PCR)或等温扩增进行测序。这样的系统可以提供与受试者(例如，人)的遗传信息相对应的多个原始遗传数据，如由系统从受试者提供的样品所生成。在一些实例中，这样的系统提供测序读段(本文中也称为“读段”)。读段可以包括与已测序的核酸分子的序列相对应的一串核酸碱基。在一些情况下，本文提供的系统和方法可以与蛋白质组信息一起使用。
在本文中，“链”一般指核酸。通常，“链”用于“单链”核酸或“双链”核酸的上下文中。两条核酸链可以互补也可以不互补。
如本文所用，术语“受试者”一般指动物，如哺乳动物(例如，人)或禽类(例如，鸟)或其他生物，如植物。例如，受试者可为脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如，小鼠)、灵长类动物、猿或人。动物可以包括但不限于农场动物、运动动物和宠物。受试者可以是健康或无症状的个体、患有或怀疑患有疾病(例如，癌症)或对疾病有易感性的个体和/或需要治疗或怀疑需要治疗的个体。受试者可以是患者。受试者可以是微生物体或微生物(例如，细菌、真菌、古细菌、病毒)。
在本文中，“......之后”意指在......之后。
在本文中，“底物”是指酶作用于其上的分子。
在本文中，当用作名词时，“支持物”是指充当例如另一物的基础的某物。在一些实例中，支持物可以比被支持的物更大、更容易使用或者更容易跟踪或可视化。支持物可以是固体支持物。在一些情况下，支持物可以是可溶解的、可破坏的和/或可降解的。在一些情况下，支持物可能不是可降解的。支持物可以包括玻璃、塑料、金属和/或其他物质。在一些情况下，支持物可以是刚性的。在其他情况下，支持物可以是柔性的和/或可压缩的。在一些实例中，支持物可以被称为“基底”。
在本文中，“表面”意指某物的外部部分或上层。在本文中，阵列的“表面”一般指附着有寡核苷酸的支持物或基底的表面。
在本文中，“合成”一般指以化学方式制造某物。
在本文中，“枯草杆菌蛋白酶”是指特定的一组蛋白酶。在一些实例中，枯草杆菌蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶A。
在本文中，“模板”指充当用于合成另一种互补单链核酸的“模板”的一种单链核酸。例如，RNA可以充当用于使用逆转录酶合成互补DNA链的模板。单链DNA可以充当最经常通过DNA聚合酶用于合成互补DNA链的模板。
在本文中，“模板转换”或“TS”是指利用一些逆转录酶的活性的过程，当在第一链DNA合成过程中达到RNA模板的末端(5’末端)时，逆转录酶使用逆转录酶的末端转移酶活性(即，不使用模板)向第一链DNA的3’末端添加多个核苷酸(通常为脱氧胞苷)。通过向反应添加在其3’末端具有一段核糖鸟苷的DNA寡聚物或引物(称为模板转换寡核苷酸、TS寡核苷酸或TSO)，核糖鸟苷将与为第一链DNA的3’末端的一部分的脱氧胞苷段碱基配对。使用TS寡核苷酸作为模板，第一链DNA的合成然后可由逆转录酶延伸到TS寡核苷酸的5’末端，该TS寡核苷酸正在充当逆转录酶的模板。在此延伸中，逆转录酶“转换”模板，从最初的RNA模板转换到TS寡核苷酸。然后，第二链合成可以在TS寡核苷酸的核糖鸟苷段的5’末端处启动。
在本文中，“末端转移酶”是指以独立于模板的方式向DNA分子的3’羟基末端添加脱氧核苷酸的酶活性。
在本文中，“模板转换寡核苷酸”、“TS寡核苷酸”或“TSO”一般指在其3’末端具有一段核糖鸟苷的DNA寡聚物。TSO可以用于逆转录反应中以延长在第一链合成过程中制备的单链DNA的长度。通常，与不使用TSO时相比，使用TSO时的第二链合成产物也更长。
在本文中，“去固定”或“去交联”是指破坏或逆转由固定物形成的生物分子中的共价键形成。“去固定剂”(或“去交联剂”)是指引起去固定的物质。在一些实例中，当使用可逆固定剂时，以及当由这些剂引起的固定被逆转时，可能发生去固定或去交联。
如本文所用，术语“去固定剂”、“去交联剂”或“切割剂”是指使固定逆转和/或去除样品中由先前使用固定试剂引起的生物分子内或生物分子之间的交联的化合物或组合物。在一些实施方案中，这些剂是在去除被固定样品中的交联中以催化方式起作用的化合物。在本文中，去固定/去交联剂可以是蛋白酶。在本文中，去固定/去交联剂可以是催化剂。可以使用其他类型的去固定/去交联剂。
在本文中，“去固定”是指细胞或核、多个细胞/核、组织样品或任何其他生物样品特征在于先前的固定状态跟着先前的固定状态的逆转的经加工状况。例如，去固定的细胞或核也可以被称为“先前固定的”细胞或核。在一个实施方案中，去固定的细胞或核的特征在于细胞、核或样品的生物分子中断裂或逆转的共价键，其中这样的共价键是先前通过用固定剂(例如，多聚甲醛或PFA)处理而形成的。
在本文中，“独特的分子标识符”或“UMI”一般指由捕获探针捕获的特定分析物的标识符。
在本文中，“未连接的”一般指不再交联的交联分子。
在本文中，“变体”一般指与亲本或起始蛋白质相比被修饰(例如，通过氨基酸置换、缺失、插入等)的蛋白质。
在本文中，“孔”一般指可容纳液体并且可以用于各种测定的凹陷，例如在多孔培养皿中。
固定
生物样品是不稳定的。当生物样品从其可存活的生态位或环境中移出时，物理分解会立即开始。分解的程度由许多因素决定，包括时间、溶液缓冲条件、温度、来源(例如，某些组织和细胞/核具有较高水平的内源性RNA酶活性)、生物应激(例如，酶促组织解离可激活应激反应基因)和物理操作(例如，移液、离心)。降解包括核酸分子(例如，RNA)、蛋白质以及分子复合物、整个细胞、组织、器官和生物体的高级3D结构。生物样品的不稳定性是其用于多种测定中的显著障碍，包括基于液滴的基因组测定。样品降解将大大限制对广泛的可用生物样品准确且可重复地使用此类测定的能力。
用于保持生物样品完整性和限制分解的示例方法包括低温保存、脱水(例如，甲醇)、高盐储存(例如，使用RNAssist或
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)和用化学固定剂处理。化学固定剂通常在样品的生物分子中产生共价交联(例如，多聚甲醛)。这些用于稳定生物样品的技术可单独使用或组合使用，并且每种技术可使用各种去固定处理在不同程度上逆转。
如本文所用，关于生物样品以及样品中所含的组织、细胞、核和分子的术语“被固定”是指被保存免于腐烂和/或降解的状态。“固定”是指产生被固定样品的过程，并可包括使生物样品内的生物分子与固定物(或固定剂)接触一定量的时间，由此固定物在样品中的生物分子之间和生物分子内产生共价结合相互作用如交联。“被固定生物样品”是指已与固定试剂接触的生物样品。例如，被甲醛固定的生物样品已与固定剂甲醛接触。
由于固定而在生物分子(例如，蛋白质、RNA、DNA)中形成交联将大大降低在标准测定方法中检测(例如，结合、扩增、测序、杂交)生物分子的能力。去除由固定试剂引起的交联的常见技术(例如，热、酸)可对生物分子造成进一步的损害(例如，碱基丢失、链水解、切割、变性等)。对固定组织样品的后果和去除加合物和/或交联的益处的进一步描述在美国专利号8,288,122中描述，该专利通过引用整体并入本文。例如，广泛使用的固定剂多聚甲醛或PFA通过催化蛋白质中的碱性氨基酸如赖氨酸和谷氨酰胺之间的交联形成来固定组织样品。分子内和分子间交联都可在蛋白质中形成。这些交联可保留蛋白质二级结构并消除保存的组织样品中蛋白质的酶活性。
本发明提供了用于处理被固定生物样品以加工细胞分析物的方法、组合物、试剂盒和系统。细胞分析物可能受到固定过程的影响。可使用去固定来制备用于加工的分析物。适用于本发明的细胞分析物包括但不限于细胞内和细胞外分析物。细胞分析物可以是蛋白质、代谢物、代谢副产物、抗体或抗体片段、酶、抗原、碳水化合物、脂质、大分子或其组合(例如，蛋白聚糖)或另一种生物分子。细胞分析物可以是核酸分子。细胞分析物可以是脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。DNA分子可以是基因组DNA分子。细胞分析物可以包含编码或非编码RNA。RNA可以是例如信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转移RNA(tRNA)。RNA可以是转录物。RNA可以是长度小于200个核酸碱基的小RNA，或长度大于200个核酸碱基的大RNA。小RNA可以包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、tRNA衍生小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。
在一些情况下，细胞分析物与中间实体相关联，其中分析中间实体以提供关于细胞分析物和/或中间实体本身的信息。例如，中间实体(例如，抗体)可以与细胞外分析物(例如，细胞表面受体)结合，其中加工中间实体以提供关于中间实体、细胞外分析物或两者的信息。在一个实施方案中，中间实体包含如本文进一步描述的可用于生成条形码分子(例如，基于液滴的加条形码)的标识符(例如，条形码分子)。
在一些实例中，核酸分子(和生物颗粒或膜结合颗粒)可由一种或多种固定试剂交联。交联可以将生物颗粒内的多个分子连接起来。多个生物颗粒可以经受交联反应以生成多个被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒。例如，核酸分子可以衍生自被固定样品或被固定组织。生物颗粒、膜结合颗粒、细胞组成成分或包含多个细胞的组织的固定可以包括施加化学物质或化学刺激，如固定剂。固定剂可以包含多聚甲醛。在一些情况下，固定剂可以选自多聚甲醛、戊二醛、二琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、福尔马林和己二酰亚胺酸二甲酯(DMA)、二硫代双(-琥珀酰亚胺丙酸酯)(DSP)、二琥珀酰亚胺酒石酸酯(DST)和乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(EGS)。可使用其他试剂和方法来固定生物样品(例如，细胞或核)，包括但不限于PCT/US2020/066705中描述的固定剂，其通过引用整体并入本文。
固定也可以影响细胞、核或细胞组成成分的其他特征。例如，固定可以导致膜(细胞或核)或细胞的壁的孔隙率变化；细胞或核的组分的重组；细胞/核流动性或刚性的变化；或其他变化。细胞、核或细胞组成成分的特性或特性集合的变化(例如，在与一种或多种固定剂相互作用时发生)可以是至少部分可逆的(例如，经由再水化或去交联)。或者，细胞或细胞组成成分的特性或特性集合的变化(例如，在与一种或多种固定剂相互作用时发生)可以是基本上不可逆的。
通常，生物样品(例如，细胞或核)与固定剂(例如，多聚甲醛或PFA)在适宜条件下的接触导致在生物样品中的生物分子之间形成分子内和分子间共价交联。在一些情况下，固定试剂甲醛已知会导致RNA、DNA和/或蛋白质分子中的共价缩醛胺(aminal)交联。固定剂的实例包括但不限于醛固定物(例如，甲醛，通常也称为“多聚甲醛”、“PFA”和“福尔马林”；戊二醛等)、亚氨酸酯、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯等。
在一些实施方案中，可用于本公开的方法中的固定物或固定剂为甲醛。当在固定物的上下文中使用时，术语“甲醛”还可以指“多聚甲醛”(或“PFA”)和“福尔马林”，两者都是具有与甲醛组合物相关的特定含义的术语(例如，福尔马林为甲醛与甲醇的混合物)。因此，被甲醛固定的生物样品也可以被称为被福尔马林固定或被PFA固定。使用甲醛作为固定试剂来制备被固定生物样品的方案和方法是本领域熟知的并且可用于本公开的方法和组合物中。例如，用于制备被固定生物样品的甲醛浓度的合适范围为0.1至10％、1-8％、1-4％、1-2％、3-5％或3.5-4.5％。在本公开的一些实施方案中，生物样品使用1％甲醛、4％甲醛或10％甲醛的最终浓度固定。通常，甲醛从更浓缩的储备溶液——例如35％、25％、15％、10％、5％的PFA储备溶液稀释。
生物样品与固定物接触以提供被固定生物样品的时间量取决于温度、样品的性质和所使用的固定物。例如，生物样品可以被固定剂接触72小时或更短时间(例如，48小时或更短时间、24小时或更短时间、18小时或更短时间、12小时或更短时间、8小时或更短时间、6小时或更短时间、4小时或更短时间、2小时或更短时间、60分钟或更短时间、45分钟或更短时间、30分钟或更短时间、25分钟或更短时间、20分钟或更短时间、15分钟或更短时间、10分钟或更短时间、5分钟或更短时间、或2分钟或更短时间)。在固定过程中可以使用各种温度。
预期在制备被固定生物样品时可以组合使用多于一种固定试剂。例如，在一些情况下，使生物分子(例如，生物样品如组织样本)与含有甲醛和戊二醛两者的固定剂接触，并因此，被接触的生物分子可包括由甲醛诱导的固定和戊二醛诱导的固定两者产生的固定交联。通常，用作固定试剂的戊二醛的合适浓度为0.1至1％。
在一些实例中，可以使用可逆固定剂。在一些实例中，这样的固定剂可以是基于双咪唑羧酸盐的化合物。
生物颗粒、膜结合颗粒或核酸分子可以在任何有用的时间点经受固定过程。例如，样品的细胞、核和/或细胞组成成分可以在开始任何后续加工(如以便储存)之前经受涉及一种或多种固定剂(例如，如本文所述)的固定过程。可以将在储存之前经受了固定过程的细胞、核和/或细胞组成成分如组织样品的细胞/核和/或细胞组成成分储存在水溶液中，任选地与一种或多种配置为保持细胞、核和/或细胞组分的形态、大小或其他特征的保存剂组合。被固定细胞或核和/或细胞组成成分可以储存在室温以下，如在冰箱中。或者，样品的细胞或核和/或细胞组成成分可以在一个或多个其他过程如过滤、离心、搅动、选择性沉淀、纯化、透化、分离、加热等之后经受涉及一种或多种固定剂的固定过程。例如，来自样品的给定类型的细胞或核和/或细胞组成成分可以在分离和/或富集程序(例如，如本文所述)之后经受固定过程。在一个实例中，包含多个细胞或核(包括给定类型的多个细胞或核)的样品可以经受正分离过程以提供给定类型的多个细胞或核富集的样品。富集的样品可以然后经受涉及一种或多种固定剂(例如，如本文所述)的固定过程以提供包含多个被固定细胞或核的富集样品。固定过程可以在本体溶液中进行。在一些情况下，可以将被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒(例如，被固定细胞、核和/或细胞组成成分)分隔在多个隔室(例如，液滴或孔)中并使之经受如本文中别处描述的加工。在一些情况下，被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒可以在分隔和任何后续加工之前经历另外的加工，如通过例如再水化或去交联来部分或完全逆转固定过程。在一些情况下，被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒可以在多个隔室内经历固定过程的部分或完全逆转(例如，在本文中别处描述的另外的加工之前或同时)。
去固定/去交联
在包括基于隔室的基因组测定在内的各种测定中使用被固定生物样品的能力需要样品的快速且高效去固定以在样品发生降解之前获得相关的基因组测定信息。理想地，从去固定的生物样品获得的基因组测定数据应与从未经固定的新鲜样品获得的基因组测定数据相同，或尽可能接近地类似于从其自然环境获得的样品。
用于逆转固定生物样品的影响的条件是本领域已知的，然而，这些条件往往是严苛的。参见例如WO2001/46402、US2005/0014203A1和US2009/0202998A1，其每一个通过引用整体并入本文。例如，对经PFA处理的组织样品的去固定处理包括在Tris缓冲液中加热至60-70℃达数小时，但通常导致仅一部分固定物诱导交联的去除。此外，严苛的去固定处理条件可对样品中的生物分子、特别是核酸造成永久性损伤。最近，已经提出了不太严苛的去固定技术和条件，其利用能够化学逆转由固定产生的交联的化合物。参见例如Karmakar等人，“Organocatalytic removal of formaldehyde adducts from RNA and DNA bases，”Nature Chemistry，7：752-758(2015)；US 2017/0283860A1；和US 2019/0135774A1，其每一个通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“去固定剂”(或“去交联剂”或“切割剂”)是指使固定逆转和/或去除样品中由先前使用固定试剂引起的生物分子内或生物分子之间的交联的化合物或组合物。在一些实施方案中，去固定剂为以催化方式起作用来去除或破坏被固定样品中的交联的化合物。
在本文描述的各种方面，使来自被固定生物颗粒(例如，被固定膜结合颗粒)的核酸分子经受生成加有条形码的核酸分子的反应。核酸分子可以包含DNA。核酸分子可以衍生自基因组DNA或包含基因组DNA。核酸分子可以包含RNA。例如，核酸分子可以是mRNA分子。核酸分子可以是交联的核酸分子。生物颗粒或膜结合颗粒可以是细胞、核、病毒或核。
可以使核酸分子经受去除交联或切割大分子的反应，使得可从被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒提取核酸分子。反应可以包括切割剂。例如，切割剂可以是切割键的酶。例如，酶可以是蛋白酶。蛋白酶可以是蛋白质酶K、枯草杆菌蛋白酶A、冷活性蛋白酶等。蛋白酶可以在特定的氨基酸残基处切割。蛋白酶可以无差别地切割被固定膜颗粒中的蛋白质。
切割剂可以是催化剂(例如，表1)。例如，催化剂可以催化键切割事件，使得可以能够从被固定膜结合颗粒提取核酸。切割剂可以切割由固定剂生成的键。例如，固定剂可以形成特定的键并生成被固定颗粒，而切割剂可以切割由固定剂生成的同一键。或者，切割剂可以切割不是由固定剂生成的另一个键。例如，固定剂可以将核酸与多肽交联，而切割剂可以切割多肽中的键如肽键。
在一些实例中，去固定剂为蛋白酶。可以使用各种蛋白酶。本公开中使用的蛋白酶可以包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬酰胺肽裂解酶等。本文公开的组合物、方法、试剂和试剂盒中使用的蛋白酶可以来自许多不同的生物体。蛋白酶可以是其他蛋白酶的变体或衍生自其他蛋白酶。
在一些实例中，蛋白酶为蛋白质酶K。在一些实例中，蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶。在一些实例中，蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶A。在一些实例中，蛋白酶可以是冷活性蛋白酶。可以使用蛋白酶的组合。
在一些实例中，去固定剂可以包括物质如2-氨基-5-甲基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、(2-氨基-5-甲基苯基)膦酸、2-氨基-5-甲基苯磺酸、2，5-二氨基苯磺酸、2-氨基-3，5-二甲基苯磺酸、(2-氨基-5-硝基苯基)膦酸、(4-氨基吡啶-3-基)膦酸和(2-氨基-5-{[2-(2-聚-乙氧基)乙基]氨基甲酰基}苯基)膦酸。在一些实施方案中，去固定剂为在去除被固定样品中的交联中以催化方式起作用的化合物。
在一些实例中，去固定剂可以包括具有以下化学式的物质：
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化合物(1)-(6)、(12)和(14)是可商购获得的。化合物(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(13)和(15)可使用本领域熟知的标准化学合成技术由可商购获得的试剂制备。参见例如Crisalli等人，“Importance of ortho Proton Donors in Catalysis of HydrazoneFormation，”Org.Lett.2013，15，7，1646-1649。
化合物(8)和(11)可分别通过2-步和4-步合成制备，如实施例1中所述。简言之，在制备化合物(8)时，根据Guilard，R.等人，Synthesis，2008，10，1575-1579中描述的程序制备化合物(4-氨基吡啶-3-基)膦酸二乙酯。然后，通过(4-氨基吡啶-3-基)膦酸二乙酯的前体化合物的酸水解来制备目标化合物(8)(4-氨基吡啶-3-基)膦酸)。化合物(9)和(10)可由类似的简单程序制备。
在一些实例中，去固定程序中可以单独使用蛋白酶。在一些实例中，去固定程序中可以单独使用催化剂。在一些实例中，去固定程序中可以与一种或多种催化剂组合地使用一种或多种蛋白酶。在一些实例中，去固定程序中可以同时使用去固定剂的组合。在一些实例中，去固定程序中可以连续地使用不同的去固定剂。在一个实例中，蛋白酶(例如，蛋白质酶K)可以与化合物1和/或化合物8组合使用)。在另一个实例中，冷活性蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶A)可以与化合物1和/或化合物8组合使用)。
可使用其他试剂和方法来逆转多聚甲醛固定，包括但不限于PCT/US2020/066701中描述的去固定剂和方法，其通过引用整体并入本文。另外，可使用用于逆转其他类型的非多聚甲醛固定的试剂和方法，如PCT/US2020/066705中描述的那些，其通过引用整体并入本文。
在一些实例中，可以如下对被固定细胞进行去固定反应。将未附着的细胞在4℃下用4％PFA固定24小时并用在PBS中的10％胎牛血清(“FBS”)淬灭。去固定剂在中性pH的缓冲液中制备。可以滴定去固定剂的浓度以获得所需结果。用去固定剂溶液处理被固定细胞，例如，在40℃下处理2小时。反应还可以含有一种或多种RNA酶抑制剂。在处理之后，可以将反应体积离心以沉淀细胞。可以使用标准方法从离心的细胞沉淀物和/或上清液收集生物分子(例如，RNA)并定量。去固定的成功，至少当其涉及RNA去固定时，可以通过回收的RNA的量和回收的RNA在各种酶促反应中充当底物或模板的能力两者来衡量。在一些实例中，可以确定回收的RNA用作产生合适的序列文库的模板的能力，并且其用作从去固定反应获得的结果的指标。
被固定膜结合颗粒的加工
可以将被固定生物颗粒分配到隔室中。隔室可以包含被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒。可以将多个被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒分隔到多个隔室中。隔室可以是如本文中别处所述的隔室，例如液滴或孔。分隔可以如本文中别处所述进行。隔室可以包含另外的试剂如切割剂或条形码核酸分子。条形码核酸分子可以是如本文中别处所述的加有条形码的分子，并且可以附着到支持物如珠或本文中别处描述的其他固体支持物。条形码核酸分子可以包含捕获序列或能够退火至来自被固定膜结合颗粒的核酸的其他序列。例如，条形码核酸分子可以包含poly-T序列并且可以能够退火至mRNA。条形码核酸分子可以包含独特的分子标识符(UMI)序列或测序引物序列。例如，条形码序列可以包含读段1序列。
可以使隔室经受特定的环境。环境可以允许反应进行或降低反应发生的可能性。例如，可以将隔室加热。可以加热隔室以允许切割剂切割键或可以增加切割剂的速率、效率或功效。还可以将隔室冷却或让隔室冷却以允许反应发生。例如，隔室可以在允许第一核酸分子退火至另一核酸分子的温度下。例如，隔室可以在25℃、53℃、70℃或90℃下。例如，可以使隔室经受至少5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃或更高的温度。可以使隔室经受不高于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃或更低的温度。可以使隔室经受特定的环境达一定量的时间。例如，可以使隔室经受特定的环境达10分钟、15分钟或45分钟。可以使隔室经受特定的环境达至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分钟或更长时间。可以使隔室经受特定的环境达不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分钟或更短时间。可以使隔室无限期地经受特定的环境或启动新的条件。
在各个方面，来自隔室的核酸分子可以从隔室释放并且可以经受另外的反应。在隔室外或隔室内进行反应可能是有利的。例如，隔室可以允许分子相互作用而不受其他分子的干扰。隔室可以使得特定的试剂具有更高的有效浓度，这对于特定的反应可能有利或不利。在一些情况下，用于反应的试剂可以防止或降低第二反应的功效。例如，蛋白酶可以用于隔室中的切割反应但可以抑制或阻碍同一隔室中的加条形码反应(例如，酶促加条形码反应)。因此，可以进行经由破坏隔室或本文中别处描述的其他方法的从隔室释放分子以便进行另外的反应(例如，酶促加条形码反应)。在从隔室释放核酸分子后进行的反应可以包括延伸反应、扩增反应或连接反应。该反应可以在蛋白酶抑制剂的存在下进行。
在一些方面，反应可以由酶进行或促进。例如，酶可以是逆转录酶。逆转录酶可以用于延伸核酸分子(例如，核酸分子的3’末端)以生成核酸条形码分子。逆转录酶可以包含RNA酶活性。逆转录酶可以向核酸分子附加另外的序列。例如，逆转录酶可以附加poly-C序列。所述另外的序列可以允许另一个序列如模板转换寡核苷酸的退火。酶可以是连接酶或聚合酶。连接酶可以用于将另外的序列与另一个核酸连接。连接酶可以用于进行平端连接或夹板连接。夹板可以与连接酶结合使用以连接两个分子。
在各个方面，可以从源自被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒的核酸分子生成加有条形码的核酸分子。衍生自或源自被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒的核酸可以与核酸条形码分子相互作用，并且可以通过使分子经受反应如延伸反应来生成加有条形码的核酸分子。在一些情况下，可以使用模板转换寡核苷酸，并且可以将模板转换寡核苷酸的序列附加或以其他方式并入到加有条形码的核酸分子中。例如，模板转换逆转录酶可以与模板转换寡核苷酸结合使用。模板转换寡核苷酸可以允许酶继续延伸核酸分子，使得与模板转换寡核苷酸的序列的至少一部分一道生成全长的核酸分子。另外，模板转换寡核苷酸或其他序列可以经由连接反应，例如基于RNA连接酶(例如，基于App连接酶)的连接或夹板连接，加到加有条形码的核酸。另外，聚合酶和引物可以用于扩增加有条形码的核酸分子。可以向加有条形码的核酸分子添加用于附着到测序仪的流动池的附加序列或其他功能序列。可以使加有条形码的核酸经受另外的反应如测序反应，或用于生成适合在特定测序平台上测序的构建体的其他反应。
图1示出了用于加工交联生物颗粒或交联膜结合颗粒的一种示例工作流。生物颗粒或膜结合颗粒可以是如本文中别处所述交联的并且可以衍生自组织或其他样品。可以添加一种或多种切割剂如蛋白酶、一种或多种还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)和/或一种或多种催化剂，并且可以将生物颗粒或膜结合颗粒和一种或多种切割剂重悬浮于反应混合物(master mix)中。可以添加核酸条形码分子(如本文中别处描述的那些)并且可以生成隔室，使得核酸条形码分子、交联(或被固定)生物颗粒或膜结合颗粒和切割剂共分隔。可以使隔室经受温度或其他环境条件，使得切割剂可以被活化。所述一种或多种切割剂可以切割键(例如，去交联)并允许衍生自交联(或被固定)生物颗粒或膜结合颗粒的核酸分子与核酸条形码分子相互作用。可以改变环境，使得衍生自交联(或被固定)生物颗粒或膜结合颗粒的核酸分子和核酸条形码分子退火至彼此并且非共价结合。然后可以从隔室释放核酸分子，例如经由隔室的破坏，并且衍生自交联(或被固定)生物颗粒或膜结合颗粒的核酸和核酸条形码分子保持退火至彼此。可以使核酸分子经受延伸反应使得从衍生自交联(或被固定)生物颗粒或膜结合颗粒的核酸分子和核酸条形码分子生成新的加有条形码的核酸。延伸反应可以在蛋白酶抑制剂的存在下进行，这可以抑制用于去交联的蛋白酶的活性。核酸分子从隔室的释放也可以降低蛋白酶的有效浓度并允许酶进行延伸反应，而没有蛋白酶的潜在有害活性。在一些实例中，核酸分子可以不从隔室释放。在一些实例中，延伸反应可以在隔室内进行。
图2A-D示出了用于生成加有条形码的核酸分子的另外的示例示意图。交联核酸分子可以存在于被固定膜结合颗粒中。图2A示出了从交联核酸生成加有条形码的核酸分子。交联核酸分子201可以包含核酸序列210和可捕获序列205。例如，核酸分子201可以是mRNA，而可捕获序列205可以是poly-A序列。交联核酸分子可能不太可接近从而与核酸条形码分子如核酸条形码分子220相互作用。交联核酸分子可以由切割剂215去交联。切割剂包括蛋白酶、催化剂或环境中的变化，例如加热隔室。去交联的核酸分子可以能够与核酸条形码分子220相互作用。核酸条形码分子220可以包含多个功能序列222、224、226和222。228可以是测序引物序列，226可以是条形码序列，而224可以是UMI序列。序列222可以是捕获序列或能够退火至衍生自被固定膜结合颗粒的核酸膜的序列。序列222可以与去交联的核酸分子的序列205互补。在将核酸条形码分子220退火至201后，可以降低隔室的温度，使得核酸条形码分子220和核酸分子201保持退火。然后可以从隔室释放核酸分子，例如经由隔室的破坏，并且核酸分子可以在本体溶液中保持退火。可以使核酸复合物经受延伸反应。核酸条形码分子220可以使用具有模板转换活性的逆转录酶进行延伸。可以与逆转录酶一起使用模板转换寡核苷酸235。逆转录酶可以延伸核酸条形码分子220，使得生成衍生自被固定膜颗粒的核酸分子的序列210的互补序列以生成序列230。另外，逆转录酶可以模板转换到模板转换寡核苷酸并生成与模板转换寡核苷酸序列相对应的序列235或其补体以生成核酸分子240。可以使核酸分子240经受下游过程如测序以鉴定核酸分子的序列。在一些实例中，核酸分子可以不从隔室释放。在一些实例中，延伸反应可以在隔室内进行。在一些实例中，逆转录酶反应可以在隔室内进行。
图2B示出了对去交联的核酸分子加条形码的另一个示例方案。如图2B中所示，去交联的核酸分子201可以与核酸条形码分子220相互作用。然后可以从隔室释放去交联的核酸分子201和核酸条形码分子220。可以使核酸复合物经受延伸反应。核酸条形码分子220可以使用逆转录酶进行延伸。逆转录酶可以包含RNA酶活性，使得模板可以被消化。逆转录酶可以延伸核酸条形码分子以添加与核酸分子201互补的序列230并生成核酸分子240。可以向核酸分子240连接另外的序列。另外的序列可以是功能序列，如测序引物序列或用于将核酸分子附着到流动池的序列。可以在核酸分子240上进行连接反应。可以将包含功能序列的核酸分子235与核酸分子240连接以生成核酸分子250。可以通过连接酶来促进反应。连接酶和核酸分子235可以是特异性的，使得连接反应具有一定的特异性。例如，连接酶可以是App连接酶，而核酸235可以包含5’腺苷酸化序列。可以使核酸分子250经受下游过程如测序以鉴定核酸的序列。
图2C示出了对去交联的核酸分子加条形码的另一个示例方案。如图2C中所示，去交联的核酸分子201可以与核酸条形码分子220相互作用。然后可以从隔室释放去交联的核酸分子201和核酸条形码分子220。可以使核酸复合物经受延伸反应。核酸条形码分子220可以使用逆转录酶进行延伸。逆转录酶可以包含RNA酶活性，使得模板可以被消化。逆转录酶可以延伸核酸条形码分子以添加与核酸分子201互补的序列230并生成核酸分子240。可以向核酸分子240连接另外的序列。另外的序列可以是功能序列，如测序引物序列或用于将核酸分子附着到流动池的序列。可以在核酸分子240上进行连接反应。可以将包含功能序列的核酸分子235与核酸分子240连接以生成核酸250。可以通过夹板核酸分子237和连接酶来促进反应。夹板可以包含与序列230互补的序列和与核酸235互补的序列。夹板核酸分子可以允许连接是特异性的并且将核酸分子240与核酸分子235连接并生成核酸分子250。可以使核酸分子250经受下游过程如测序以鉴定核酸的序列。
图2D示出了对去交联的核酸分子加条形码的另一个示例方案。如图2D中所示，去交联的核酸分子201可以与核酸条形码分子220相互作用。然后可以从隔室释放去交联的核酸分子201和核酸条形码分子220。可以使核酸复合物经受延伸反应。核酸条形码分子220可以使用逆转录酶进行延伸。逆转录酶可以包含RNA酶活性，使得模板可以被消化。逆转录酶可以延伸核酸条形码分子以添加与核酸分子201互补的序列230并生成核酸分子240。可以向核酸分子240附加另外的序列。另外的序列可以是功能序列，如测序引物序列或用于将核酸分子附着到流动池的序列。可以在核酸分子240上进行延伸反应。可以将包含功能序列的核酸分子235用作引物并退火至核酸分子240以生成核酸分子250。可以通过聚合酶来促进反应。引物可以包含与序列230互补的序列。引物可以包含随机n-聚体或包含可以退火至核酸分子240的随机序列。可以使核酸分子250经受下游过程如测序以鉴定核酸的序列。
用于样品区室化(分隔)的系统和方法
在一个方面，本文描述的系统和方法提供了将一种或多种颗粒(例如，生物颗粒、生物颗粒的大分子组成成分、珠、试剂等)区室化、沉积或分隔到离散的区室或隔室(在本文中可互换地称为隔室)中，其中每个隔室保持其本身内容物与其他隔室的内容物的分离。隔室可为乳液中的液滴。隔室可以包含一个或多个其他隔室。
隔室可以包含一个或多个颗粒。隔室可以包含一种或多种类型的颗粒。例如，本公开的隔室可以包含一种或多种生物颗粒和/或其大分子组成成分。隔室可以包含一个或多个凝胶珠。隔室可以包含一个或多个细胞珠。隔室可以包含单个凝胶珠、单个细胞珠或单个细胞珠和单个凝胶珠两者。隔室可以包含一种或多种试剂。或者，隔室可以未被占据。例如，隔室可以不包含珠。细胞珠可为如经由含有生物颗粒和能够聚合或胶凝的前体的液滴的聚合，被包封在凝胶或聚合物基质内的生物颗粒和/或其大分子组成成分中的一种或多种。独特的标识符，如条形码，可以在液滴生成之前、之后或与液滴生成同时注入到液滴中，如经由支持物(例如，珠)，如本文中别处所述。可利用微流体通道网络(例如，在芯片上)来生成如本文所述的隔室。也可以在各个生物颗粒的分隔中采用替代的机制，包括多孔膜，细胞的水性混合物将通过多孔膜被挤出到非水性流体中。
隔室可在流体流内可流动。隔室可以包括例如具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微囊泡。在一些情况下，隔室可以包括能够在其基质内夹带和/或保留材料的多孔基质。隔室可为第二相内第一相的液滴，其中所述第一和第二相不可混溶。例如，隔室可为非水性连续相(例如，油相)内水性流体的液滴。在另一个实例中，隔室可为水相内非水性流体的液滴。在一些实例中，隔室可以在油包水乳液或水包油乳液中提供。例如，美国专利申请公开号2014/0155295中描述了各种不同的容器，该专利申请出于所有目的通过引用完全并入本文。例如，美国专利申请公开号2010/0105112中描述了用于在非水性或油连续相中产生稳定液滴的乳液系统，该专利申请出于所有目的通过引用完全并入本文。
在一些情况下，通过混合或搅动不可混溶的相来产生乳液而形成液滴。混合或搅动可以包括各种搅动技术，如涡旋、移液、轻弹管或其他搅动技术。在一些情况下，可以在不使用微流体装置的情况下进行混合或搅动。在一些实例中，可以通过将混合物暴露于超声波或声波处理来形成液滴。例如，为了将内容物分隔到液滴中，可使包含第一流体、第二流体、任选地表面活性剂和所述内容物的混合物经受这样的搅动技术以生成包含所述内容物或其子集的多个液滴(第二流体包第一流体或第一流体包第二流体)。在一个实例中，混合物包含珠。在搅动时，混合物中的珠可以限制液滴破碎成小于珠的尺寸的液滴，并且可以产生包含珠的基本上单分散的液滴群。
在乳液中的液滴的情况下，在一个非限制性实例中，可以通过向非水性流体的流动流或储库中引入颗粒在水性流体中的流动流使得在两个流的会合点处生成液滴，来实现将各个颗粒分配到离散的隔室中(一般参见例如图3和6)。可以调节流体性质(例如，流体流速、流体粘度等)、颗粒性质(例如，体积分数、粒度、颗粒浓度等)、微流体架构(例如，通道几何形状等)和其他参数来控制所得隔室的占据率(例如，每个隔室的生物颗粒数、每个隔室的珠数等)。例如，可通过提供一定浓度和/或颗粒流速的水性流来控制隔室占据率。为了生成单个生物颗粒的隔室，可选择不可混溶流体的相对流速使得隔室可以平均含有每个隔室少于一个生物颗粒以确保被占据的那些隔室主要被单独占据。在一些情况下，在多个隔室中，隔室可以含有至多一个生物颗粒(例如，珠、DNA、细胞、核或细胞材料)。在一些实施方案中，可以选择或调节各种参数(例如，流体性质、颗粒性质、微流体架构等)使得大多数隔室被占据，例如，允许仅小百分比的隔室未被占据。可控制流动和通道架构以确保给定数量的被单独占据的隔室、少于一定水平的未被占据隔室和/或少于一定水平的被多重占据的隔室。
图3示出了用于分隔各个生物颗粒的微流体通道结构300的实例。通道结构300可包括在通道会合点310处连通的通道区段302、304、306和308。在操作中，包含悬浮生物颗粒(或细胞或核)314的第一水性流体312可以沿着通道区段302输送到会合点310中，而与水性流体312不可混溶的第二流体316从通道区段304和306各自递送到会合点310，以产生第一水性流体312的离散液滴318、320，其流入通道区段308中并流离会合点310。通道区段308可以流体联接到出口储库，离散液滴可在这里贮存和/或收获。所生成的离散液滴可以包含一个单独的生物颗粒314(如液滴318)。所生成的离散液滴可以包含多于一个单独的生物颗粒314(图3中未示出)。离散液滴可以不合生物颗粒314(如液滴320)。每个离散的隔室可以保持其本身内容物(例如，单独的生物颗粒314)与其他隔室的内容物的分离。
第二流体316可包含油，如氟化油，其包括用于稳定所得液滴、例如抑制所得液滴318、320的后续聚结的含氟表面活性剂。例如，美国专利申请公开号2010/0105112中描述了特别有用的分隔流体和含氟表面活性剂的实例，该专利申请出于所有目的通过引用完全并入本文。
如应理解，本文描述的通道区段可以联接到各种不同流体源或接收部件中的任一种，包括储库、管道、歧管或其他系统的流体部件。如应理解，微流体通道结构300可以具有其他几何形状。例如，微流体通道结构可具有多于一个通道会合点。例如，微流体通道结构可具有2、3、4或5个通道区段，其各自携带将在通道会合点处相遇的颗粒(例如，生物颗粒、细胞珠和/或凝胶珠)。流体可以被引导经由一个或多个流体流动单元以沿着一个或多个通道或储库流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等等，以控制流体的流动。流体还可以或以其他方式经由施加的压差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流动等进行控制。
生成的液滴可以包括两个液滴子集：(1)含有一个或多个生物颗粒314的被占据液滴318，和(2)不合任何生物颗粒314的未被占据液滴320。被占据液滴318可以包括被单独占据的液滴(具有一个生物颗粒)和被多重占据的液滴(具有多于一个生物颗粒)。如本文中别处所述，在一些情况下，大多数被占据隔室可包含每个被占据隔室不超过一个生物颗粒而一些所生成的隔室可未被(任何生物颗粒)占据。然而，在一些情况下，一些被占据隔室可以包含多于一个生物颗粒。在一些情况下，可以控制分隔过程使得少于约25％的被占据隔室含有多于一个生物颗粒，并且在许多情况下，少于约20％的被占据隔室具有多于一个生物颗粒，而在一些情况下，少于约10％或甚至少于约5％的被占据隔室包含每个隔室多于一个生物颗粒。
在一些情况下，可能希望将过多数量的空隔室的产生最小化，以降低成本和/或提高效率。虽然这种最小化可以通过在分隔会合点310处提供足够数量的生物颗粒(例如，生物颗粒314)以确保至少一个生物颗粒被包封在隔室中来实现，但泊松分布可以预期会增加包含多个生物颗粒的隔室的数量。因此，在要获得被单独占据的隔室时，所生成的隔室中至多约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少可未被占据。
在一些情况下，可控制一个或多个生物颗粒(例如，在通道区段302中)或被引导至分隔会合点(例如，在通道区段304、306中)的其他流体的流动，使得在许多情况下，所生成的隔室中不超过约50％、所生成的隔室中不超过约25％或所生成的隔室中不超过约10％未被占据。可控制这些流动以呈现被单独占据的隔室的非泊松分布，同时提供较低水平的未被占据隔室。可实现上述范围的未被占据隔室，同时仍提供任何上述单独占据率。例如，在许多情况下，本文描述的系统和方法的使用可产生多重占据率小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％并且在许多情况下小于约5％、同时未被占据隔室少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％或更少的所得隔室。
如应理解，上述占据率也适用于包含生物颗粒和另外的试剂两者的隔室，另外的试剂包括但不限于携带加有条形码的核酸分子(例如，寡核苷酸)的支持物或珠(例如，凝胶珠)(结合图3和6描述)。被占据隔室(例如，被占据隔室中的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)可包含包含有加有条形码的核酸分子的支持物(例如，珠)和生物颗粒两者。
如上所述，在至少一个实施方案中，方法包括生成包封生物样品的离散液滴。在至少一个实施方案中，方法还包括生成包封被固定生物样品和一种或多种去固定剂的离散液滴。
在其中方法包括生成离散液滴的至少一个实施方案中，离散液滴还包含测定试剂；任选地，其中所述测定试剂包含在珠中。在至少一个实施方案中，离散液滴还包含条形码；任选地，其中所述条形码包含在珠中。
在一些情况下，在所形成的多个离散液滴中，液滴含有至多一个颗粒(例如，一个珠、一个细胞、一个核)。也可控制流动和微流体通道架构以确保给定数量的被单独占据的液滴、少于一定水平的未被占据液滴和/或少于一定水平的被多重占据的液滴。
在本公开的另一个方面，可以然后将被固定细胞或核、蛋白酶组合物和任选的去固定剂组合物与用于如本文所述的一种或多种分析物的加工的其他试剂一起分隔(例如，在液滴或孔中)。在一个实施方案中，可以将被固定细胞或核、蛋白酶组合物和任选的去固定剂组合物与包含适合于一种或多种分析物的加条形码的核酸分子的支持物(例如，珠)一起分隔。在另一个实施方案中，核酸分子可以包括提供鉴定信息的核酸序列，例如条形码序列。
条形码连同生物样品一起包括在离散液滴中提供了独特的标识符，其允许区分且个别地分析来自生物样品的数据。条形码可在离散液滴中的生物样品之前、之后或同时递送。例如，条形码可以在液滴生成之前、之后或同时注入到液滴中。可用于本公开的方法中的条形码通常包含核酸分子(例如，寡核苷酸)。核酸条形码分子通常经由支持物如珠递送到隔室。在一些情况下，条形码核酸分子在离散液滴生成时最初与珠结合，然后在对液滴施加刺激时从珠中释放。可用于本公开的方法中的携带条形码的珠将在本文中别处进一步详细地描述。
图4示出了一种用于生成离散液滴的示例性微流体通道结构400，该液滴将携带条形码的珠414与生物样品颗粒416一起包封。通道结构400包括在通道会合点410处流体连通的通道区段401、402、404、406和408。在操作中，通道区段401将可包括多个珠414(例如，携带条形码寡核苷酸的凝胶珠)的水性流体412沿着通道区段401输送到会合点410中。多个珠414可以来源于珠的悬浮液。例如，通道区段401可连接到包含珠414的水性悬浮液的储库。通道区段402将包括多个生物样品颗粒416的水性流体412沿着通道区段402输送到会合点410中。多个生物样品颗粒416可以来源于生物样品颗粒的悬浮液。例如，通道区段402可以连接到包含生物样品颗粒416的水性悬浮液的储库。在一些情况下，第一通道区段401或第二通道区段402或两个区段中的水性流体412可包括一种或多种试剂，如本文中别处进一步描述的。例如，在本公开的其中生物样品颗粒为被固定生物样品颗粒的一些实施方案中，分别递送生物样品和珠的第一和/或第二通道区段中的水性流体可包括去固定剂。与水性流体412不可混溶的第二流体418从通道区段404和406各自递送到会合点410。在来自通道区段401和402各自的水性流体412与来自通道区段404和406各自的第二流体418(例如，氟化油)在通道会合点410处相遇时，水性流体412被分隔到在第二流体418中的离散液滴420中并沿着通道区段408从会合点410流走。然后，通道区段408可将包封生物样品颗粒和携带条形码的珠的离散液滴递送到与通道区段408流体联接的出口储库，在这里可对它们进行收集。
作为替代方案，通道区段401和402可以在会合点410上游的另一个会合点处相遇。在这样的会合点处，珠和生物颗粒可以形成混合物，该混合物沿着另一个通道被引导至会合点410以产生液滴420。混合物可以以交替方式提供珠和生物颗粒，使得例如液滴包含单个珠和单个生物颗粒。
使用如图4中所例示的此类通道系统，可生成包封生物样品的单独颗粒和一个珠的离散液滴420，其中所述珠可携带条形码和/或另一种试剂。还考虑了，在一些情况下，可以使用图4的通道系统生成离散液滴，其中液滴包括多于一个的单独生物样品颗粒或不包括生物样品。类似地，在一些实施方案中，离散液滴可以包括多于一个珠或不包括珠。离散液滴也可能完全未被占据(例如，没有珠或生物样品)。
在一些实施方案中，期望珠、生物样品颗粒以及所生成的离散液滴以基本上规律的流速沿着通道流动，其生成含有单个珠和单个生物样品颗粒的离散液滴。规律流速和可以用于提供此类规律流速的装置是本领域已知的，参见例如美国专利公开号2015/0292988，其在此通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，设定流速以提供含有单个珠和生物样品颗粒的离散液滴，其产率大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
可携带条形码和/或可用于本公开的方法的其他试剂的珠可包括多孔、无孔、固体、半固体、半流体、流体和/或其组合的珠。在一些实施方案中，珠可由可溶解、可破坏和/或可降解的材料制成，如包含水凝胶的凝胶珠。或者，在一些实施方案中，珠是不可降解的。
尽管图3和图4已在提供基本上被单独占据的离散液滴方面进行了描述，但在某些实施方案中还考虑了需要提供被多重占据的离散液滴，例如，含有两个、三个、四个或更多个来自生物样品的细胞或核和/或多个不同的支持物如携带条形码核酸分子的珠和/或携带试剂如去固定剂或测定试剂的珠的单个液滴。因此，如本文中别处所指出的，可控制生物颗粒和/或珠的流动特性以提供这样的被多重占据的液滴。特别地，可以控制通道结构中使用的液体的流动参数以提供大于约50％、大于约75％并且在一些情况下大于约80％、90％、95％或更高的给定液滴占据率。
在一些实施方案中，可用于本公开的方法中的珠为能够将试剂(例如，去固定剂和/或测定试剂)递送到所生成的含有生物样品颗粒的离散液滴中的支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，可从不同的源向通往共同的液滴生成会合点(例如，会合点410)的不同入口中引入不同的珠(例如，含有不同的试剂)。在这样的情况下，可以控制不同的珠进入到通道或会合点中的流动和频率以从各个源提供一定比率的支持物(例如，珠)，同时确保这样的珠与给定数量的生物颗粒以给定的配对或组合进入到隔室中(例如，每个隔室一个生物颗粒和一个珠)。
本文描述的离散液滴通常包含小体积，例如小于约10微升(μL)、5μL、1μL、900皮升(pL)、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL、500纳升(nL)、100nL、50nL或更小。在一些实施方案中，所生成的包封生物样品颗粒的离散液滴具有小于约1000pL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL或更小的总体体积。应理解，液滴内的样品流体体积，例如包括共分隔的生物颗粒和/或珠，可以小于上述体积的约90％，小于上述体积的约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。
生成可用于本公开的方法的离散液滴的方法导致生成含有生物样品颗粒(例如，被固定生物样品)和其他试剂(例如，去固定剂)的离散液滴的群或多个离散液滴。通常，容易控制这些方法以提供任何合适数量的液滴。例如，可生成或以其他方式提供至少约1,000个离散液滴、至少约5,000个离散液滴、至少约10,000个离散液滴、至少约50,000个离散液滴、至少约100,000个离散液滴、至少约500,000个离散液滴、至少约1,000,000个离散液滴、至少约5,000,000个离散液滴、至少约10,000,000个离散液滴或更多个离散液滴。此外，所述多个离散液滴可以包括未被占据和被占据的液滴。
如本文中别处所述，在本公开的方法的一些实施方案中，所生成的包封生物样品颗粒和任选地一种或多种不同的珠的离散液滴还含有其他试剂。在一些实施方案中，包封在液滴中的其他试剂包括裂解和/或去固定剂，所述裂解和/或去固定剂作用于释放和/或去固定液滴内生物样品颗粒的生物分子内容物。在一些实施方案中，可与向微流体系统的液滴生成会合点(例如，会合点410)中引入生物样品颗粒同时或在临向微流体系统的液滴生成会合点中引入生物样品颗粒之前使裂解和/或去固定剂与生物样品悬浮液接触。在一些实施方案中，所述剂通过通道会合点上游的另外一个或多个通道引入。
在一些实施方案中，生物样品颗粒可与其他试剂一起共分隔。图5示出了用于共分隔生物样品颗粒和其他试剂的微流体通道结构500的实例，所述其他试剂包括裂解和/或去固定剂。通道结构500可包括通道区段501、502、504、506和508。通道区段501和502在第一通道会合点509处连通。通道区段502、504、506和508在第二通道会合点510处连通。在示例性共分隔操作中，通道区段501可以将包含多个生物样品颗粒514(例如，被固定生物样品)的水性流体512沿着通道区段501输送到第二会合点510中。作为替代或另外，通道区段501可以输送珠(例如，携带条形码的珠)。例如，通道区段501可以连接到包含生物样品颗粒514的水性悬浮液的储库。在第二会合点510的上游并在临到达该第二会合点之前，通道区段501可以在第一会合点509处与通道区段502相遇。通道区段502可将水性流体512中的多种试剂515(例如，裂解或去固定剂)沿着通道区段502输送到第一会合点509中。例如，通道区段502可以连接到包含试剂515的储库。在第一会合点509后，通道区段501中的水性流体512可携带生物样品颗粒514和试剂515两者朝向第二会合点510。在一些情况下，通道区段501中的水性流体512可包括一种或多种试剂，其可以是与试剂515相同或不同的试剂。与水性流体512不可混溶的第二流体516(例如，氟化油)可从通道区段504和506各自递送到第二会合点510。在来自通道区段501的水性流体512与来自通道区段504和506各自的第二流体516在第二通道会合点510处相遇时，水性流体512被分隔为在第二流体516中的离散液滴518并沿着通道区段508从第二会合点510流走。通道区段508可以将离散液滴518递送到与通道区段508流体联接的出口储库，在这里它们可以被收集以供进一步分析。
取决于通道区段502中包括何种试剂，所生成的离散液滴可包括单独的生物样品颗粒514和/或一种或多种试剂515。在一些情况下，所生成的离散液滴还可以包括携带条形码的珠(未示出)，如可经由本文中别处描述的其他通道结构添加。在一些情况下，离散液滴可能是未被占据的(例如，无试剂、无生物颗粒)。通常，本文描述的通道区段可以联接到各种不同流体源或接收部件中的任一种，包括储库、管道、歧管或其他系统的流体部件。如应理解，微流体通道结构500可以具有其他几何形状。例如，微流体通道结构可具有多于两个通道会合点。例如，微流体通道结构可以具有2、3、4、5个或更多个通道区段，其各自携带在通道会合点处相遇的相同或不同类型的珠、试剂和/或生物样品颗粒。可以控制每个通道区段中的流体流动，以控制不同要素向液滴中的分隔。流体可以被引导经由一个或多个流体流动单元沿着一个或多个通道或储库流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等等，以控制流体的流动。流体还可以或以其他方式经由施加的压差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流动等进行控制。
图6示出了用于将珠受控分隔到离散液滴中的微流体通道结构的实例。通道结构600可包括通道区段602，其在通道会合点606(或交叉点)处与储库604连通。储库604可为腔室。如本文所用，对“储库”的任何提及也可指“腔室”。在操作中，包括悬浮珠612的水性流体608可以沿着通道区段602输送到会合点606中以在储库604中和与水性流体608不可混溶的第二流体610相遇而产生流动到储库604中的水性流体608的液滴616、618。在其中水性流体608和第二流体610相遇的会合点606处，液滴可基于因素如在会合点606处的流体动力、两种流体608、610的流速、流体性质和通道结构600的某些几何参数(例如，w、h0、α等)而形成。通过从通道区段602连续地注入水性流体608通过会合点606，可在储库604中收集多个液滴。
图7示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的实例。微流体通道结构700可包括多个通道区段702和储库704。多个通道区段702各自可以与储库704流体连通。通道结构700可包括在多个通道区段702与储库704之间的多个通道会合点706。每个通道会合点均可为液滴生成点。来自图6中的通道结构600的通道区段602以及对其部件的任何描述可以对应于通道结构700中的多个通道区段702中的给定通道区段以及对其相应部件的任何描述。来自通道结构600的储库604以及对其部件的任何描述可以对应于来自通道结构700的储库704以及对其相应部件的任何描述。
图8示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的另一个实例。微流体通道结构800可以包括多个通道区段802，其一般围绕储库804的周边呈圆形排列。多个通道区段802各自可以与储库804流体连通。通道结构800可包括在多个通道区段802与储库804之间的多个通道会合点806。每个通道会合点均可为液滴生成点。来自图6中的通道结构600的通道区段602以及对其部件的任何描述可以对应于通道结构800中的多个通道区段802中的给定通道区段以及对其相应部件的任何描述。来自通道结构600的储库604以及对其部件的任何描述可以对应于来自通道结构800的储库804以及对其相应部件的任何描述。图6、7和8中描绘的微流体结构的另外方面，包括实现其的系统和方法，在美国公开专利申请号20190323088中提供，所述美国公开专利申请通过引用整体并入本文。
在将裂解和/或去固定剂与被固定生物样品颗粒共分隔在液滴中时，这些试剂可促进液滴内生物样品颗粒的生物分子内容物的释放和去固定。如本文中别处所述，液滴中释放的去固定生物分子内容物与其他液滴的内容物保持离散，从而允许存在于该不同生物样品中的感兴趣的生物分子分析物的检测和定量。如本文进一步描述的，隔室中也可以使用裂解剂。
除了与生物样品颗粒共分隔到离散液滴中的裂解和/或去固定剂之外，还设想其他测定试剂也可被共分隔于液滴中。例如，DNA酶和RNA酶失活剂或抑制剂，如蛋白质酶K、螯合剂如EDTA、蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶A以及用于去除或以其他方式降低不同细胞裂解物组分对核酸的后续加工的负面活性或影响的其他试剂。
在一些实施方案中，将与其他试剂一起包封在离散液滴中的生物样品颗粒暴露于适当的刺激以释放样品颗粒的生物分子内容物和/或共分隔的支持物(例如，珠)的内容物。例如，在一些实施方案中，可以将化学刺激与生物样品颗粒和珠(例如，凝胶珠)一起共分隔在液滴中以允许珠的降解和其内容物向液滴中的释放。在一些实施方案中，可以用被固定生物样品颗粒和去固定剂生成离散液滴，其中去固定剂包含在可通过热刺激降解的支持物(例如，珠)中。在这样的实施方案中，将液滴暴露于热刺激，由此使珠降解并释放去固定剂。在另一个实施方案中，设想了包封被固定生物样品颗粒和两个不同的珠(例如，携带去固定剂的一个珠和携带测定试剂的一个珠)的液滴，其中两个不同的珠的内容物通过不重叠的刺激(例如，化学刺激和热刺激)释放。这样的实施方案可允许不同的试剂在不同的时间释放到同一离散液滴中。例如，第一珠在热刺激触发下向液滴中释放去固定剂，然后在设定的时间后，第二珠在化学刺激触发下释放检测去固定生物样品颗粒的分析物的测定试剂。
另外的测定试剂也可以与生物样品共分隔到离散液滴中，如用于片段化生物样品的DNA的内切酶、DNA聚合酶和用于扩增生物样品的核酸片段并向扩增的片段附着条形码分子标签的dNTP。可以共分隔其他酶，包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白质酶K、DNA酶、枯草杆菌蛋白酶A等。另外的测定试剂还可以包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸，以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(在本文中也称为“转换寡核苷酸(switch oligos)”或“模板转换寡核苷酸”)。
在一些实施方案中，可使用模板转换来增加测定中生成的cDNA的长度。在一些实施方案中，可使用模板转换来向cDNA附加预定义的核酸序列。在模板转换的实例中，可从模板例如细胞mRNA的逆转录生成cDNA，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以独立于模板的方式向cDNA添加另外的核苷酸，例如polyC。
一旦将生物样品细胞或核的内容物释放到离散液滴中，就可以在液滴内进一步加工其中包含的生物分子组分(例如，生物样品的大分子组成成分，如RNA、DNA或蛋白质)。根据本文描述的方法和系统，各个生物样品的生物分子内容物可被提供以独特的条形码标识符，并且在表征生物分子组分时(例如，在测序测定中)，它们可被归为衍生自同一生物样品。通过向单独的生物样品或生物样品组独有地分配核酸条形码序列，将提供将特性归于各个生物样品或生物样品组的能力。
在一些方面，独特的标识符条形码以核酸分子(例如，寡核苷酸)的形式提供，所述核酸分子包含可附着到单独生物样品的核酸内容物、或生物样品的其他组分、特别是这些核酸的片段或者以其他方式与前述关联的序列。在一些实施方案中，仅一个核酸条形码序列与给定的离散液滴相关联，但在一些情况下，可以存在两个或更多个不同的条形码序列。核酸条形码序列可包括核酸分子(例如，寡核苷酸)的序列内约6至约20个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以是约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至多约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即，在相邻核苷酸的单段中，或者它们可以分成由1个或多个核苷酸分开的两个或更多个单独的子序列。在一些情况下，分开的条形码子序列的长度可为约4至约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以是约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至多约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。
在一些实施方案中，核酸条形码分子也可包含可用于液滴中来自生物样品的核酸的加工中的其他功能序列。这些功能序列可包括例如靶向或随机/通用扩增引物序列(用于扩增隔室内来自各个生物样品的核酸分子，同时使相关联的条形码序列附着)、测序引物或引物识别位点、杂交或探测序列(例如，用于鉴定序列的存在或用于拉下(pulling down)加有条形码的核酸分子)或许多其他潜在功能序列中的任何一个。
珠和条形码分子
核酸条形码分子可以经由支持物(例如，固体支持物)或载体(例如，珠)递送到隔室(例如，液滴或孔)。在一些情况下，核酸条形码分子最初与支持物相关联并然后在施加刺激后从支持物释放，所述刺激允许核酸条形码分子从支持物解离或释放。在具体的实例中，核酸条形码分子最初与支持物(例如，珠)相关联并然后在施加生物刺激、化学刺激、热刺激、电刺激、磁刺激和/或光刺激后从支持物释放。
核酸条形码分子可以含有条形码序列和功能序列，如核酸引物序列或模板转换寡核苷酸(TSO)序列。
支持物可以是珠。支持物如固体支持物，例如珠，可以是多孔的、无孔的、中空的、固体的、半固体的和/或其组合。珠可以是固体的、半固体的、半流体的、流体的和/或其组合。在一些情况下，支持物(例如，珠)可以是可溶解的、可破坏的和/或可降解的。在一些情况下，支持物(例如，珠)可能是不可降解的。在一些情况下，支持物(例如，珠)可以是凝胶珠。凝胶珠可以是水凝胶珠。凝胶珠可以由分子前体如聚合或单体物质形成。半固体支持物(例如，珠)可以是脂质体珠。支持物(例如，珠)可以包含金属，包括氧化铁、金和银。在一些情况下，固体支持物(例如，珠)可以是二氧化硅珠。在一些情况下，支持物(例如，珠)可以是刚性的。在其他情况下，支持物(例如，珠)可以是柔性的和/或可压缩的。
隔室可以包含一个或多个独特的标识符，如条形码。条形码可以在先前、随后或同时递送到容纳被区室化或被分隔的生物颗粒的隔室。例如，条形码可以在液滴生成之前、之后或同时注入到液滴中。向特定的隔室递送条形码允许之后将单独生物颗粒的特性归于该隔室。条形码可以例如经由任何合适的机制在核酸分子(例如，寡核苷酸)上递送至隔室。本文将更详细地描述珠。
在一些情况下，加有条形码的核酸分子可最初与珠相关联并然后从珠释放。加有条形码的核酸分子的释放可以是无源的(例如，通过从珠扩散出)。另外或替代地，可在施加刺激后从珠释放，所述刺激允许加有条形码的核酸分子从珠解离或释放。这样的刺激可以破坏珠、将加有条形码的核酸分子联接到珠或珠内的相互作用或两者。这样的刺激可包括例如热刺激、光刺激、化学刺激(例如，pH的变化或者一种或多种还原剂的使用)、机械刺激、辐射刺激；生物刺激(例如，酶)，或其任何组合。
在一些实例中，珠、生物颗粒(或膜结合颗粒)和液滴可以以基本上规律的流动特性(例如，以规律的流速)沿着通道流动。这样的规律流动特性可以允许液滴包括进单个珠和单个生物颗粒。这样的规律流动特性可以允许液滴具有大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的占据率(例如，具有珠和生物颗粒的液滴)。例如，美国专利公开号2015/0292988中提供了这样的规律流动特性和可用于提供这样的规律流动特性的装置，所述专利公开通过引用完全并入本文。
有益地，分隔生物颗粒和携带条形码的珠的离散液滴可以有效地允许将条形码归于隔室内生物颗粒的大分子组成成分。隔室的内容物可以与其他隔室的内容物保持离散。
珠可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的、半流体的、流体的和/或其组合。在一些情况下，珠可以是可溶解的、可破坏的和/或可降解的。在一些情况下，珠可能不是可降解的。在一些情况下，珠可以是凝胶珠。凝胶珠可以是水凝胶珠。凝胶珠可以由分子前体如聚合或单体物质形成。半固体珠可以是脂质体珠。固体珠可以包含金属，包括氧化铁、金和银。在一些情况下，珠可以是二氧化硅珠。在一些情况下，珠可以是刚性的。在其他情况下，珠可以是柔性的和/或可压缩的。
珠可以具有任何合适的形状。珠形状的实例包括但不限于球形、非球形、卵形、椭圆形、无定形、圆形、圆柱形及其变化型式。
珠可以具有均匀的尺寸或不均匀的尺寸。在一些情况下，珠的直径可为至少约10纳米(nm)、100nm、500nm、1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大。在一些情况下，珠可以具有小于约10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更小的直径。在一些情况下，珠可以具有在约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm或20-500μm的范围内的直径。
在某些方面，珠可作为具有相对单分散尺寸分布的珠的群或多个珠提供。在可能希望在隔室内提供相对一致的试剂量的情况下，保持相对一致的珠特性如尺寸可促成整体一致性。特别地，本文描述的珠可以具有其横截面尺寸的变异系数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％并且在一些情况下小于15％、小于10％、小于5％或更小的尺寸分布。
珠可以包含天然和/或合成材料。例如，珠可包含天然聚合物、合成聚合物或天然聚合物和合成聚合物两者。天然聚合物的实例包括蛋白质和糖如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如，直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、丝、聚羟基烷酸酯、壳聚糖、右旋糖酐、胶原蛋白、角叉菜胶、洋车前子、阿拉伯树胶、琼脂、明胶、虫胶、刺梧桐树胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、卡那亚胶、琼脂糖、褐藻酸、藻酸盐或其天然聚合物。合成聚合物的实例包括丙烯酸树脂、尼龙、有机硅、氨纶、粘胶法人造丝、聚羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(氯三氟乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(氧亚甲基)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)和/或其组合(例如，共聚物)。珠也可以由非聚合物的材料形成，包括脂质、胶束、陶瓷、玻璃-陶瓷、材料复合物、金属、其他无机材料等。
在一些情况下，珠可以含有分子前体(例如，单体或聚合物)，其可以经由分子前体的聚合形成聚合物网络。在一些情况下，前体可以是能够经由例如化学交联进行进一步聚合的已经聚合的物质。在一些情况下，前体可包含丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、低聚物或聚合物中的一种或多种。在一些情况下，珠可以包含预聚物，其为能够进一步聚合的低聚物。例如，可以使用预聚物制备聚氨酯珠。在一些情况下，珠可以含有可以进一步聚合在一起的各个聚合物。在一些情况下，珠可以经由不同前体的聚合生成，使得它们包含混合聚合物、共聚物和/或嵌段共聚物。在一些情况下，珠可以包含聚合前体(例如，单体、低聚物、线型聚合物)、核酸分子(例如，寡核苷酸)、引物和其他实体之间的共价键或离子键。在一些情况下，共价键可为碳-碳键、硫醚键或碳-杂原子键。
取决于所使用的特定交联剂，交联可以是永久的或可逆的。可逆交联可以允许聚合物在适当的条件下线形化或解离。在一些情况下，可逆交联还可以允许结合到珠表面的材料的可逆附着。在一些情况下，交联剂可以形成二硫键联(disulfide linkage)。在一些情况下，形成二硫键联的化学交联剂可以是胱胺或改性胱胺。
在一些情况下，二硫键联可在分子前体单元(例如，单体、低聚物或线型聚合物)或并入到珠中的前体与核酸分子(例如，寡核苷酸)之间形成。例如，胱胺(包括改性胱胺)是一种包含二硫键的有机剂，其可以用作珠的各个单体或聚合前体之间的交联剂。聚丙烯酰胺可以在胱胺或包含胱胺的物质(例如，改性胱胺)的存在下聚合生成包含二硫键联的聚丙烯酰胺凝胶珠(例如，包含化学可还原交联剂的化学可降解珠)。二硫键联可以允许珠在珠暴露于还原剂时降解(或溶解)。
在一些情况下，壳聚糖(一种线型多糖聚合物)可以经由亲水链与戊二醛交联形成珠。壳聚糖聚合物的交联可以通过由热、压力、pH的变化和/或辐射引发的化学反应来实现。
在一些情况下，珠可以包含acrydite部分，在某些方面，其可以用于将一种或多种核酸分子(例如，条形码序列、加有条形码的核酸分子、加有条形码的寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)附着到珠。在一些情况下，acrydite部分可指由acrydite与一种或多种物质的反应生成的acrydite类似物，如聚合反应期间acrydite与其他单体和交联剂的反应。acrydite部分可以经修饰以与待附着的物质如核酸分子(例如，条形码序列、加有条形码的核酸分子、加有条形码的寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)形成化学键。acrydite部分可以用能够形成二硫键的硫醇基团修饰或可以用已经包含二硫键的基团修饰。硫醇或二硫化物(经由二硫化物交换)可以用作待附着物质的锚点，或者acrydite部分的另一部分可以用于附着。在一些情况下，附着可以是可逆的，使得当二硫键断裂时(例如，在还原剂的存在下)，附着的物质从珠释放。在其他情况下，acrydite部分可包含可以用于附着的反应性羟基基团。
用于附着核酸分子(例如，寡核苷酸)的珠的官能化可以通过广泛的不同方法来实现，包括聚合物内化学基团的活化、聚合物结构中活性或可活化官能团的并入、或在珠产生中的预聚物或单体阶段的附着。
例如，聚合形成珠的前体(例如，单体、交联剂)可以包含acrydite部分，使得在生成珠时，珠也包含acrydite部分。acrydite部分可附着到核酸分子(例如，寡核苷酸)，所述核酸分子包含一个或多个功能序列如TSO序列或引物序列(例如，poly T序列、或与靶核酸序列互补和/或用于扩增靶核酸序列的核酸引物序列、随机引物、或用于信使RNA的引物序列)其可用于并入到珠中等)和/或一个或多个条形码序列。所述一个或多个条形码序列可以包括对于联接到给定珠的所有核酸分子相同的序列和/或对于联接到给定珠的所有核酸分子不同的序列。核酸分子可以被并入到珠中。
在一些情况下，核酸分子可包含一个或多个功能序列。例如，功能序列可包括用于附着到测序流动池的序列，例如用于
Figure BDA0004001092240000551
测序的P5序列。在一些情况下，核酸分子或其衍生物(例如，从核酸分子生成的寡核苷酸或多核苷酸)可包含另一个功能序列，例如，用于附着到用于Illumina测序的测序流动池的P7序列。在一些情况下，功能序列可包含一个条形码序列或多个条形码序列。在一些情况下，功能序列可包含独特的分子标识符(UMI)。在一些情况下，功能序列可包含引物序列(例如，用于Illumina测序的R1引物序列、用于Illumina测序的R2引物序列等)。在一些情况下，功能序列可包含部分序列，如部分条形码序列、部分锚定序列、部分测序引物序列(例如，部分R1序列、部分R2序列等)、配置为附着到测序仪的流动池的部分序列(例如，部分P5序列、部分P7序列等)或本文中别处描述的任何其他类型序列的部分序列。例如，部分序列可以含有完整序列的邻接或连续部分或区段，但不是全部。在一些情况下，下游程序可以延伸部分序列或其衍生物，以实现部分序列或其衍生物的完整序列。可以用于本公开的组合物、装置、方法和系统的此类核酸分子(例如，寡核苷酸、多核苷酸等)及其用途的实例在美国专利公开号2014/0378345和2015/0376609中有提供，所述专利公开中的每一个通过引用完全并入本文。
图9中示出了由这些方法中使用的珠携带的一种示例的加有条形码的寡核苷酸。在图9中，加有条形码的寡核苷酸或捕获探针910包含与寡核苷酸附着于的支持物904上的位置相对应的条形码序列922(如本实例中所示意，寡核苷酸910经由能够附着到支持物904的修饰或化学部分940附着到支持物904)。所示意的寡核苷酸910还包含与来自生物颗粒(例如，细胞或核)的分析物(例如，mRNA分子)960的序列互补的序列923(即，分析物捕获序列或捕获结构域)。在一些情况下，序列923包含对mRNA分子特异的序列。在一些情况下，序列923包含poly(dT)序列。在一些情况下，序列923包含限定的核苷酸序列、半随机核苷酸序列或随机核苷酸序列。序列923与mRNA分子960杂交(即，mRNA被923序列捕获)并经由核酸反应延伸(例如，在逆转录反应中生成cDNA分子970)，从而生成包含条形码序列922(例如，空间条形码序列或其反向补体)和延伸核酸(例如，cDNA 970)(或其部分)的序列的互补寡核苷酸。功能序列924，如用于扩增的引物结合位点和/或测序相关引物结合位点(例如，用于测序反应的序列)等，也包括在加有条形码的寡核苷酸或捕获探针中。在一些实例中，加有条形码的核酸分子然后可任选地如本文中别处所述进行加工，例如以扩增分子和/或向片段附加测序平台特异性序列。然后可在合适的测序平台上对加有条形码的核酸分子或由此生成的衍生物进行测序。核酸条形码分子910可以任选地经由可释放的键联(linkage)940(例如，包含不稳定键)附着到支持物904，如WO2020/047007A2(申请号PCT/US2019/048430)、WO2020/047010A2(申请号PCT/US2019/048434)、WO2020/047004A3(申请号PCT/US2019/048427)和WO2020/047005A1(PCT/US2019/048428)中描述的那些，其各自通过引用整体并入本文。
图10示意了携带条形码的珠的实例。核酸分子1002，如寡核苷酸，可通过可释放的键联1006例如二硫化物接头联接到珠1004。同一个珠1004可以(例如，经由可释放的键联)联接到一个或多个其他核酸分子1018、1020。核酸分子1002可以是或包含条形码。如本文中别处所述，条形码的结构可以包括若干序列元件。核酸分子1002可以包含可用于后续加工中的功能序列1008。例如，功能序列1008可以包括测序仪特异性流动池附着序列(例如，用于
Figure BDA0004001092240000561
测序系统的P5序列)和测序引物序列(例如，用于
Figure BDA0004001092240000562
测序系统的R1引物)中的一个或多个，或其部分序列。核酸分子1002可以包含用于对样品(例如，DNA、RNA、蛋白质等)加条形码的条形码序列1010。在一些情况下，条形码序列1010可以是珠特异性的，使得条形码序列1010对于与同一珠1004联接的所有核酸分子(例如，包括核酸分子1002)是共有的。或者或另外，条形码序列1010可以是隔室特异性的，使得条形码序列1010对于联接到被分隔到同一隔室中的一个或多个珠的所有核酸分子是共有的。核酸分子1002可以包含特异性引发序列1012，例如mRNA特异性引发序列(例如，poly-T序列)、靶向引发序列和/或随机引发序列。核酸分子1002可以包含锚定序列1014，以确保特异性引发序列1012在(例如，mRNA的)序列末端处杂交。例如，锚定序列1014可包括核苷酸的随机短序列，如1-聚体、2-聚体、3-聚体或更长的序列，其可确保poly-T区段更可能在mRNA的poly-A尾的序列末端处杂交。
核酸分子1002可以包含独特的分子标识序列1016(例如，独特的分子标识符(UMI))。在一些情况下，独特的分子标识序列1016可以包含约5至约3个核苷酸。或者，独特的分子标识序列1016可以包含少于约5个或多于约8个核苷酸。独特的分子标识序列1016可以是在联接到单个珠(例如，珠1004)的各个核酸分子(例如，1002、1018、1020等)之间变化的独特序列。在一些情况下，独特的分子标识序列1016可以是随机序列(例如，随机N-聚体序列)。例如，UMI可以提供捕获的起始mRNA分子的独特标识符，以允许定量原始表达的RNA的数量。如应理解，尽管图10示出了联接到珠1004的表面的三个核酸分子1002、1018、1020，但单独的珠可以联接到任何数量的各个核酸分子，例如一至数十至数十万个或甚至数百万个各个核酸分子。各个核酸分子的各自的条形码可包含共有序列区段或相对共有序列区段(例如，1008、1010、1012等)和在联接到同一个珠的不同各个核酸分子之间可变或独特的序列区段(例如，1016)两者。
在操作中，生物颗粒(例如，细胞、核、DNA、RNA等)可与装载条形码的珠1004一起共分隔。加有条形码的核酸分子1002、1018、1020可在隔室中从珠1004释放。举例来说，在分析样品RNA的情况下，释放的核酸分子中之一(例如，1002)的poly-T区段(例如，1012)可与mRNA分子的poly-A尾杂交。逆转录可以产生mRNA的cDNA转录物，但所述转录物包括核酸分子1002的序列区段1008、1010、1016中的每一个。因为核酸分子1002包含锚定序列1014，所以其将更可能与mRNA的poly-A尾的序列末端杂交并在mRNA的poly-A尾的序列末端处引发逆转录。在任何给定的隔室内，各个mRNA分子的所有cDNA转录物可以包括一个共有的条形码序列区段1010。然而，由给定隔室内的不同mRNA分子制备的转录物在独特的分子标识序列1012区段(例如，UMI区段)处可能会有所不同。有益地，即使在给定隔室的内容物的任何后续扩增之后，不同UMI的数量也可指示源自给定隔室并因此源自生物颗粒(例如，细胞或核)的mRNA的量。如上所述，可对转录物进行扩增、清理和测序，以鉴定mRNA的cDNA转录物的序列以及对条形码区段和UMI区段进行测序。虽然描述的是poly-T引物序列，但其他靶向或随机引发序列也可以用于引发逆转录反应中。同样，尽管描述为将加有条形码的寡核苷酸释放到隔室中，但在一些情况下，可以使用与珠(例如，凝胶珠)结合的核酸分子来杂交和捕获珠的固相上的mRNA，例如以促进RNA与其他细胞或核内容物的分离。
在一些情况下，珠可以包含配置为与相应捕获序列或结合序列结合的捕获序列或结合序列。在一些情况下，珠可以包含多个不同的捕获序列或结合序列，这些不同的捕获序列或结合序列配置为与不同的各自的相应捕获序列或结合序列结合。例如，珠可以包含一个或多个各自配置为与第一相应捕获序列结合的捕获序列的第一子集、一个或多个各自配置为与第二相应捕获序列结合的捕获序列的第二子集、一个或多个各自配置为与第三相应捕获序列结合的捕获序列的第三子集等。珠可以包含任何数量的不同捕获序列。在一些情况下，珠可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同的捕获序列或结合序列，这些不同的捕获序列或结合序列配置为分别与不同的各自的捕获序列或结合序列结合。或者或另外，珠可以包含至多约10、9、8、7、6、5、4、3或2个不同的捕获序列或结合序列，这些不同的捕获序列或结合序列配置为与不同的各自的捕获序列或结合序列结合。在一些情况下，不同的捕获序列或结合序列可以配置为便于相同类型的分析物的分析。在一些情况下，不同的捕获序列或结合序列可以配置为便于不同类型的分析物(具有相同的珠)的分析。捕获序列可以设计为附着到相应捕获序列。有益地，可以向生物颗粒(例如，细胞、核、细胞珠等)中引入或以其他方式在生物颗粒(例如，细胞、核、细胞珠等)中诱导此类相应捕获序列用于以各种形式(例如，包含相应捕获序列的加有条形码的抗体、包含相应捕获序列的加有条形码的MHC dextramer、包含相应捕获序列的加有条形码的向导RNA分子等)进行不同的测定，使得相应捕获序列可以之后与和珠相关联的捕获序列相互作用。在一些情况下，联接到珠(或其他支持物)的捕获序列可以配置为附着到接头分子，如夹板分子，其中所述接头分子配置为通过接头分子将珠(或其他支持物)联接到其他分子，如联接到一个或多个分析物或者一个或多个其他接头分子。
图11示意了携带条形码的珠的另一个实例。核酸分子1105，如寡核苷酸，可通过可释放的键联1106例如二硫化物接头联接到珠1104。核酸分子1105可以包含第一捕获序列1160。同一个珠1104可以(例如，经由可释放的键联)联接到包含其他捕获序列的一个或多个其他核酸分子1103、1107。核酸分子1105可以是或包含条形码。如本文中别处所述，条形码的结构可以包括许多序列元件，如功能序列1108(例如，流动池附着序列、测序引物序列等)、条形码序列1110(例如，珠共有的珠特异性序列、隔室共有的隔室特异性序列等)和独特的分子标识符1112(例如，附着到珠的不同分子内的独特序列)或其部分序列。捕获序列1160可以配置为附着到相应捕获序列1165。在一些情况下，相应捕获序列1165可以联接到另一分子，该另一分子可以是分析物或中间载体。例如，如图11中所示意，相应捕获序列1165联接到包含靶序列1164的向导RNA分子1162，其中靶序列1164配置为附着到分析物。附着到珠1104的另一寡核苷酸分子1107包含第二捕获序列1180，该第二捕获序列配置为附着到第二相应捕获序列1185。如图11中所示意，第二相应捕获序列1185联接到抗体1182。在一些情况下，抗体1182可以对分析物(例如，表面蛋白)具有结合特异性。或者，抗体1182可以不具有结合特异性。附着到珠1104的另一寡核苷酸分子1103包含第三捕获序列1170，该第三捕获序列配置为附着到第二相应捕获序列1175。如图11中所示意，第三相应捕获序列1175联接到分子1172。分子1172可以或可以不配置为靶向分析物。其他寡核苷酸分子1103、1107可以包含关于寡核苷酸分子1105描述的其他序列(例如，功能序列、条形码序列、UMI等)。虽然图11中示意了包含每个捕获序列的单个寡核苷酸分子，但应理解，对于每个捕获序列，珠可以包含一组一个或多个各自包含捕获序列的寡核苷酸分子。例如，珠可以包含任何数量的组的一个或多个不同捕获序列。或者或另外，珠1104可以包含其他捕获序列。或者或另外，珠1104可以包含较少类型的捕获序列(例如，两个捕获序列)。或者或另外，珠1104可以包含包含有引发序列如特异性引发序列如mRNA特异性引发序列(例如，poly-T序列)、靶向引发序列和/或随机引发序列的寡核苷酸分子，例如以便于基因表达的测定。
在操作中，加有条形码的寡核苷酸可以被释放(例如，在隔室中)，如本文中别处所述。或者，可以使用与珠(例如，凝胶珠)结合的核酸分子来杂交和捕获珠的固相上的分析物(例如，一种或多种类型的分析物)。
在一些情况下，可以使包含反应性的或能够被活化使得其变得反应性的官能团的前体与其他前体聚合以生成包含活化的或可活化的官能团的凝胶珠。然后可以使用该官能团来将另外的物质(例如，二硫化物接头、引物、其他寡核苷酸等)附着到凝胶珠。例如，包含羧酸(COOH)基团的一些前体可与其他前体共聚以形成也包含COOH官能团的凝胶珠。在一些情况下，丙烯酸(包含游离COOH基团的物质)、丙烯酰胺和双(丙烯酰基)胱胺可共聚在一起以生成包含游离COOH基团的凝胶珠。凝胶珠的COOH基团可被活化(例如，经由1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM))使得它们是反应性的(例如，使用EDC/NHS或DMTMM进行活化时，对胺官能团是反应性的)。活化的COOH基团然后可与适当的物质(例如，在羧酸基团被活化为可与胺官能团反应时，为包含胺官能团的物质)反应，所述物质包含待连接至珠的部分。
在其聚合网络中包含二硫键联的珠可以经由将一些二硫键联还原为游离硫醇而用另外的物质官能化。二硫键联可以经由例如还原剂(例如，DTT、TCEP等)的作用被还原以生成游离硫醇基团，而不使珠溶解。珠的游离硫醇可然后与物质的游离硫醇或包含另一个二硫键的物质反应(例如，经由硫醇-二硫化物交换)，使得该物质可被连接至珠(例如，经由生成的二硫键)。在一些情况下，珠的游离硫醇可以与任何其他合适的基团反应。例如，珠的游离硫醇可以与包含acrydite部分的物质反应。珠的游离硫醇基团可经由Michael加成化学与acrydite反应，使得包含acrydite的物质被连接至珠。在一些情况下，可通过引入硫醇封端剂如N-乙基马来酰亚胺或碘乙酸盐来防止不受控制的反应。
可控制珠内二硫键联的活化，使得仅少量二硫键联被活化。控制可以例如通过控制用于生成游离硫醇基团的还原剂的浓度和/或用于在珠聚合中形成二硫键的试剂的浓度来施加。在一些情况下，可以使用低浓度(例如，还原剂分子∶凝胶珠的比率小于或等于约1∶100,000,000,000、小于或等于约1∶10,000,000,000、小于或等于约1∶1,000,000,000、小于或等于约1∶100,000,000、小于或等于约1∶10,000,000、小于或等于约1∶1,000,000、小于或等于约1∶100,000、小于或等于约1∶10,000)的还原剂来进行还原。控制被还原为游离硫醇的二硫键联的数量可用于确保官能化期间珠的结构完整性。在一些情况下，光学活性剂如荧光染料可以经由珠的游离硫醇基团联接到珠并用于定量珠中存在的游离硫醇的数量和/或跟踪珠。
在一些情况下，在凝胶珠形成之后向凝胶珠添加部分可能是有利的。例如，在凝胶珠形成之后添加寡核苷酸(例如，加有条形码的寡核苷酸)可以避免在聚合过程中会发生的链转移终止过程中物质的损失。此外，可以使用较小的前体(例如，不包含侧链基团和被连接部分的单体或交联剂)进行聚合并由于粘性效应该较小的前体可极少受阻而不能使链末端增长。在一些情况下，凝胶珠合成后的官能化可最大限度地减少待装载的物质(例如，寡核苷酸)与潜在损伤剂(例如，自由基)和/或化学环境的接触。在一些情况下，所生成的凝胶可以具有上限临界溶解温度(UCST)，该温度可允许珠的温度驱动膨胀和塌缩。在随后用寡核苷酸对珠的官能化期间，这样的官能可以有助于寡核苷酸(例如，引物)向珠中的渗入。生产后官能化也可以用于控制珠中物质的装载比率，使得例如装载比率的变异性最小化。物质装载也可以在批量过程中进行，使得可在单个批次中用物质官能化多个珠。
注入或以其他方式引入到隔室中的珠可以包含可释放地、可切割地或可逆地附着的条形码。注入或以其他方式引入到隔室中的珠可以包含可激活条形码。注入或以其他方式引入到隔室中的珠可以是可降解的、可破坏的或可溶解的珠。
条形码可以可释放地、可切割地或可逆地附着到珠，使得条形码可通过条形码分子与珠之间的键联的切割而释放或可释放，或通过下面的珠本身的降解而释放，从而允许条形码被其他试剂接近或可被其他试剂接近或两者。在非限制性实例中，可以通过二硫键的还原、限制性酶的使用、光活化切割或经由其他类型的刺激(例如，化学、热、pH、酶促等)切割和/或反应来实现切割，如本文中别处所述。可释放条形码有时可被称为可活化的，因为它们一旦被释放就可用于反应。因此，例如，可以通过从珠(或本文描述的其他合适类型的隔室)释放条形码来活化可活化条形码。在所描述的方法和系统的上下文中还设想了其他可活化的配置。
除了珠与相关联的分子如含有条形码的核酸分子(例如，加有条形码的寡核苷酸)之间的可切割键联之外或作为所述可切割键联的替代方案，珠可以是自发地或在暴露于一种或多种刺激(例如，温度变化、pH变化、暴露于特定化学物质或相、暴露于光、还原剂等)后可降解的、可破坏的或可溶解的。在一些情况下，珠可以是可溶解的，使得珠的材料组分在暴露于特定化学物质或环境变化如温度变化或pH变化时溶解。在一些情况下，凝胶珠可在升高的温度和/或在碱性条件下降解或溶解。在一些情况下，珠可以是可热降解的，使得当珠暴露于适当的温度变化(例如，热)时，珠降解。与物质(例如，核酸分子，例如加有条形码的寡核苷酸)结合的珠的降解或溶解可以导致物质从珠的释放。
如从以上公开内容应理解的，珠的降解可以指结合或夹带的物质从珠的解离，其中物理珠本身发生或不发生结构降解。例如，珠的降解可以涉及可切割键联经由本文中别处描述的一种或多种物质和/或方法的切割。在另一个实例中，夹带的物质可以通过渗透压差从珠释放，例如由于化学环境的改变。举例来说，通常可发生由于渗透压差导致的珠孔隙尺寸的改变而没有珠本身的结构降解。在一些情况下，由于珠的渗透膨胀导致的孔隙尺寸的增加可允许珠内夹带物质的释放。在其他情况下，珠的渗透收缩可以由于孔隙尺寸收缩而使珠更好地保持夹带的物质。
可以向隔室如乳液的液滴或孔中引入可降解珠，使得当施加适当的刺激时，珠在隔室内降解并且任何相关联的物质(例如，寡核苷酸)在液滴内释放。游离物质(例如，寡核苷酸、核酸分子)可以与隔室中所含的其他试剂相互作用。例如，可以使包含胱胺并经由二硫键与条形码序列相连接的聚丙烯酰胺珠在油包水乳液的液滴内与还原剂组合。在液滴内，还原剂可破坏各种二硫键，导致珠降解和条形码序列向液滴的水性内部环境中的释放。在另一个实例中，在碱性溶液中包含珠结合条形码序列的液滴的加热也可以导致珠降解和附着的条形码序列向液滴的水性内部环境中的释放。
任何合适数量的分子标签分子(例如，引物、加有条形码的寡核苷酸)可与珠相关联，使得在从珠释放时，分子标签分子(例如，引物，例如，加有条形码的寡核苷酸)以预定义浓度存在于隔室中。可以选择这样的预定义浓度以促进用于在隔室内生成测序文库的某些反应，例如扩增。在一些情况下，引物的预定义浓度可受产生装载核酸分子(例如，寡核苷酸)的珠的过程的限制。
在一些情况下，珠可非共价地装载有一种或多种试剂。珠可通过例如使珠经受足以使珠膨胀的条件、让试剂有足够的时间扩散到珠的内部和使珠经受足以使珠去膨胀的条件来被非共价地装载。珠的膨胀可以例如通过将珠置于热力学上有利的溶剂中、使珠经受较高或较低的温度、使珠经受较高或较低的离子浓度和/或使珠经受电场来实现。珠的膨胀可以通过各种膨胀方法来实现。珠的去膨胀可以例如通过将珠转移到热力学上不利的溶剂中、使珠经受较低或较高的温度、使珠经受较低或较高的离子浓度和/或移除电场来实现。珠的去膨胀可以通过各种去膨胀方法来实现。转移珠可能引起珠中的孔隙收缩。此收缩然后可以阻碍珠内的试剂扩散出珠的内部。该阻碍可能是由于试剂与珠的内部之间的空间相互作用。转移可以微流体方式完成。例如，可以通过将珠从一个并流溶剂流移动到不同的并流溶剂流来实现转移。可以通过改变珠的聚合物组成来调节珠的膨胀性和/或孔隙尺寸。
在一些情况下，与前体连接的acrydite部分、与前体连接的另一种物质或前体本身可包含不稳定键，如化学、热或光敏感键，例如二硫键、UV敏感键等。一旦包含不稳定键的acrydite部分或其他部分被并入到珠中，该珠也可包含所述不稳定键。不稳定键可以例如用于将物质(例如，条形码、引物等)可逆地连接(例如，共价连接)到珠。在一些情况下，热不稳定键可以包括基于核酸杂交的附着，例如，其中寡核苷酸与附着到珠的互补序列杂交，使得杂交体的热熔融从支持物(例如，珠)释放寡核苷酸，例如含有条形码的序列。
向凝胶珠添加多种类型的不稳定键可以导致能够响应于各种刺激的珠的生成。每种类型的不稳定键可能对相关的刺激(例如，化学刺激、光、温度、酶促等)敏感，使得可以通过施加适当的刺激来控制经由每个不稳定键附着到珠的物质的释放。这样的官能可以用于从凝胶珠受控地释放物质。在一些情况下，包含不稳定键的另一物质可以在凝胶珠形成之后经由例如如上所述凝胶珠的活化官能团连接至凝胶珠。如应理解，可释放地、可切割地或可逆地附着到本文描述的珠的条形码包括通过条形码分子与珠之间的键联的切割而释放或可释放、或通过下面的珠本身的降解而释放的条形码，从而允许条形码被其他试剂接近或可被其他试剂接近或两者。
在一些情况下，附着到固体支持物(例如，珠)的物质(例如，包含条形码的寡核苷酸分子)可以包含允许物质从珠释放的U-切除元件。在一些情况下，U-切除元件可以包含含有至少一个尿嘧啶的单链DNA(ssDNA)序列。所述物质可以经由含有至少一个尿嘧啶的ssDNA序列附着到固体支持物。所述物质可以通过尿嘧啶-DNA糖基化酶(例如，以去除尿嘧啶)和内切酶(例如，以诱导ssDNA断裂)的组合来释放。如果内切酶从切割生成5’磷酸基团，则可以在下游加工中包括另外的酶处理以消除磷酸基团，例如在连接另外的测序手柄元件例如Illumina完整P5序列、部分P5序列、完整R1序列和/或部分R1序列之前。
如本文所述可释放的条形码有时可被称为可活化的，因为它们一旦被释放就可用于反应。因此，例如，可以通过从珠(或本文描述的其他合适类型的隔室)释放条形码来活化可活化条形码。在所描述的方法和系统的上下文中还设想了其他可活化的配置。
除了热可切割键、二硫键和UV敏感键之外，可以联接到前体或珠的不稳定键的其他非限制性实例包括酯键联(例如，可用酸、碱或羟胺切割)、邻位二醇键联(例如，可经由高碘酸钠切割)、Diels-Alder键联(例如，可经由热切割)、砜键联(例如，可经由碱切割)、甲硅烷基醚键联(例如，可经由酸切割)、糖苷键联(例如，可经由淀粉酶切割)、肽键联(例如，可经由蛋白酶切割)或磷酸二酯键联(例如，可经由核酸酶(例如，DNA酶)切割)。键可以是可经由其他核酸分子靶向酶如限制性酶(例如，限制性内切酶)切割的，如下文进一步描述的。
物质可以在珠生成期间(例如，在前体的聚合期间)包封在珠中。这样的物质可以或可以不参与聚合。这样的物质可以进入到聚合反应混合物中，使得在珠形成时生成的珠包含所述物质。在一些情况下，这样的物质可以在凝胶珠形成后添加到凝胶珠。这样的物质可以包括例如核酸分子(例如，寡核苷酸)、用于核酸扩增反应的试剂(例如，引物、聚合酶、dNTP、辅因子(例如，离子辅因子)、缓冲液)(包括本文描述的那些)、用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅因子、底物、缓冲液)、用于核酸修饰反应如聚合、连接或消化的试剂和/或用于针对一种或多种测序平台进行模板制备(例如，标签化)的试剂(例如，用于
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的
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)。这样的物质可以包括一种或多种本文描述的酶，包括但不限于聚合酶、逆转录酶、限制性酶(例如，内切酶)、转座酶、连接酶、蛋白质酶K、DNA酶等。这样的物质可以包括一种或多种本文中别处描述的试剂(例如，裂解剂、抑制剂、失活剂、螯合剂、刺激)。这样的物质的截留可以通过前体聚合期间生成的聚合物网络密度、凝胶珠内离子电荷的控制(例如，经由与聚合物质连接的离子物质)或通过其他物质的释放来控制。在珠降解后和/或通过施加能够从珠释放物质的刺激，包封的物质可以从珠释放。或者或另外，物质可以在隔室(例如，液滴)形成期间或之后分隔在隔室中。这样的物质可以包括但不限于也可包封在珠中的上述物质。
可降解珠可以包含一种或多种具有不稳定键的物质，使得当珠/物质暴露于适当的刺激时，键断裂并且珠降解。不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)，或者可以是另一类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极-偶极相互作用等)。在一些情况下，用于生成珠的交联剂可以包含不稳定键。在暴露于适当的条件后，不稳定键可被破坏并且珠降解。例如，在将包含胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠暴露于还原剂时，胱胺的二硫键可被破坏并且珠降解。
与不降解的珠相比，当向珠施加适当的刺激时，可降解珠可以用于更快地从珠释放附着的物质(例如，核酸分子、条形码序列、引物等)。例如，对于与多孔珠的内表面结合的物质或在被包封物质的情况下，该物质在珠降解时可以具有更高的迁移性和对于溶液中的其他物质更高的可接近性。在一些情况下，物质还可以经由可降解接头(例如，二硫化物接头)附着到可降解珠。可降解接头可以响应于与可降解珠相同的刺激，或者两种可降解物质可以响应于不同的刺激。例如，条形码序列可以经由二硫键附着到包含胱胺的聚丙烯酰胺珠。在加有条形码的珠暴露于还原剂后，珠降解，并且在条形码序列与珠之间的二硫键联和珠中的胱胺的二硫键联两者均断裂时释放条形码序列。
如从以上公开内容应理解的，虽然在如上所述的许多情况下被称为珠的降解，但降解可以指结合或夹带的物质从珠的解离，其中物理珠本身发生或不发生结构降解。例如，夹带的物质可以通过渗透压差从珠释放，例如由于化学环境的改变。举例来说，通常可发生由于渗透压差导致的珠孔隙尺寸的改变而没有珠本身的结构降解。在一些情况下，由于珠的渗透膨胀导致的孔隙尺寸的增加可允许珠内夹带物质的释放。在其他情况下，珠的渗透收缩可以由于孔隙尺寸收缩而使珠更好地保持夹带的物质。
在提供可降解珠的情况下，避免使这样的珠在给定时间之前暴露于引起这样的降解的一种或多种刺激可能是有益的，以便例如避免过早的珠降解和由这样的降解产生的问题，包括例如不良的流动特性和聚集。举例来说，在珠包含可还原交联基团如二硫化物基团的情况下，希望避免使这样的珠与还原剂例如DTT或其他二硫化物切割试剂接触。在这样的情况下，对本文所述的珠的处理在一些情况下将不使用还原剂如DTT而提供。由于还原剂常在商业酶制剂中提供，故在处理本文所述的珠时可能需要提供不合还原剂(或不合DTT)的酶制剂。这样的酶的实例包括例如聚合酶的酶制剂、逆转录酶的酶制剂、连接酶的酶制剂以及可以用于处理本文所述的珠的许多其他酶制剂。术语“不合还原剂的”或“不合DTT的”制剂可指具有在降解珠时使用的此类材料的小于约1/10、小于约1/50或甚至小于约1/100的较低范围的制剂。例如，对于DTT，无还原剂制剂可具有小于约0.01毫摩尔(mM)、0.005mM、0.001mM DTT、0.0005mM DTT或甚至小于约0.0001mM DTT。在许多情况下，DTT的量可能是不可检测的。
可以使用许多化学触发剂来触发珠的降解。这些化学变化的实例可以包括但不限于pH介导的珠内组分完整性的变化、珠的组分经由交联键的切割的降解和珠的组分的解聚。
在一些实施方案中，珠可以由包含可降解化学交联剂如BAC或胱胺的材料形成。这样的可降解交联剂的降解可以通过若干机制实现。在一些实例中，可以使珠与可以诱导氧化、还原或其他化学变化的化学降解剂接触。例如，化学降解剂可以是还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)。另外的还原剂实例可以包括β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1，4-二巯基丁烷(二硫丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可以降解在形成珠的凝胶前体之间形成的二硫键，并因此使珠降解。在其他情况下，溶液的pH的变化如pH的增加可以触发珠的降解。在其他情况下，暴露于水性溶液如水可以触发水解降解和因此珠的降解。在一些情况下，刺激的任何组合可以触发珠的降解。例如，pH的变化可以使得化学剂(例如，DTT)成为有效的还原剂。
也可以在施加热刺激时诱导珠释放其内容物。温度的变化可引起珠的多种变化。例如，热可导致固体珠液化。热的变化可以导致珠的熔融，使得珠的一部分降解。在其他情况下，热可以增加珠组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。热也可以作用于用作构建珠的材料的热敏感聚合物。
任何合适的剂都可以降解珠。在一些实施方案中，可以使用温度或pH的变化来降解珠内的热敏感或pH敏感键。在一些实施方案中，可以使用化学降解剂通过氧化、还原或其他化学变化来降解珠内的化学键。例如，化学降解剂可以是还原剂如DTT，其中DTT可以降解在交联剂与凝胶前体之间形成的二硫键，因此使珠降解。在一些实施方案中，可以添加还原剂来降解珠，这可以或可以不使珠释放其内容物。还原剂的实例可以包括二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1，4-二巯基丁烷(二硫丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可以约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM的浓度存在。还原剂可以至少约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM或大于10mM的浓度存在。还原剂可以至多约10mM、5mM、1mM、0.5mM、0.1mM或更低的浓度存在。
任何合适数量的分子标签分子(例如，引物、加有条形码的寡核苷酸)可与珠相关联，使得在从珠释放时，分子标签分子(例如，引物，例如，加有条形码的寡核苷酸)以预定义浓度存在于隔室中。可以选择这样的预定义浓度以促进用于在隔室内生成测序文库的某些反应，例如扩增。在一些情况下，引物的预定义浓度可受产生装载寡核苷酸的珠的过程的限制。
尽管图3和图6已就上文提供基本上被单独占据的隔室进行了描述，但在某些情况下，可能希望提供被多重占据的隔室，例如，在单个隔室中含有两个、三个、四个或更多个细胞或核和/或包含加有条形码的核酸分子(例如，寡核苷酸)的支持物(例如，珠)。因此，如上所述，可以控制含生物颗粒和/或珠的流体和分隔流体的流动特性以提供这样的被多重占据的隔室。特别地，可以控制流动参数以提供大于隔室的约50％、大于约75％并且在一些情况下大于约80％、90％、95％或更高的给定占据率。
在一些情况下，可使用另外的支持物(例如，珠)来向隔室递送另外的试剂。在这样的情况下，从不同的珠源(例如，含不同的相关试剂)通过进入共有通道或液滴生成会合点(例如，会合点310)的不同通道入口向这样的共有通道或液滴生成会合点中引入不同的珠可以是有利的。在这样的情况下，可以控制不同的珠进入到通道或会合点中的流动和频率以从各个源提供一定比率的珠，同时确保这样的珠与给定数量的生物颗粒以给定的配对或组合进入到隔室中(例如，每个隔室一个生物颗粒和一个珠)。
本文描述的隔室可包含小体积，例如小于约10微升(μL)、5μL、1μL、900皮升(pL)、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL、500纳升(nL)、100nL、50nL或更小。
例如，在基于液滴的隔室的情况下，液滴可以具有小于约1000pL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL或更小的总体体积。在与支持物(例如，珠)共分隔的情况下，应理解，隔室内的样品流体体积，例如包括共分隔的生物颗粒和/或珠，可以小于上述体积的约90％，小于上述体积的约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。
如本文中别处所述，分隔物质可以生成隔室的群或多个隔室。在这样的情况下，可生成或以其他方式提供任何合适数量的隔室。例如，可生成或以其他方式提供至少约1,000个隔室、至少约5,000个隔室、至少约10,000个隔室、至少约50,000个隔室、至少约100,000个隔室、至少约500,000个隔室、至少约1,000,000个隔室、至少约5,000,000个隔室、至少约10,000,000个隔室、至少约50,000,000个隔室、至少约100,000,000个隔室、至少约500,000,000个隔室、至少约1,000,000,000个隔室或更多个隔室。此外，所述多个隔室可以包括未被占据隔室(例如，空隔室)和被占据隔室两者。在一些实例中，任何本文公开的方法可以以具有被固定细胞在隔室(例如，乳液中的液滴或孔，如微孔)中高通量加工的优点为特征。如本文进一步描述的，本公开的方法允许在含有各个细胞或核的各个隔室中在单个细胞水平上分析数千至数万至数十万个被固定细胞或核。
试剂
根据某些方面，生物颗粒可以与裂解试剂一起分隔以在隔室内释放生物颗粒的内容物。在这样的情况下，可与向分隔会合点/液滴生成区(例如，图3中的会合点310)中引入生物颗粒同时或在临向该分隔会合点/液滴生成区中引入生物颗粒之前使裂解剂与生物颗粒悬浮液接触，如通过在通道会合点上游的另外一个或多个通道。根据其他方面，另外或替代地，生物颗粒可以与其他试剂一起分隔，如下文将进一步描述的。
有益地，当裂解试剂和生物颗粒被共分隔时，裂解试剂可促进隔室内生物颗粒的内容物的释放。在隔室中释放的内容物可以与其他隔室的内容物保持离散。
裂解剂的实例包括生物活性试剂，如用于裂解不同细胞类型的裂解酶，例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等，如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌酶、labiase、kitalase、溶壁酶和可得自例如Sigma-Aldrich，Inc.(密苏里州圣路易斯)的广泛的其他裂解酶以及其他可商购获得的裂解酶。其他裂解剂可以另外或替代地与生物颗粒共分隔以使生物颗粒的内容物释放到隔室中。例如，在一些情况下，可以使用基于表面活性剂的裂解溶液来裂解细胞，但这些对于基于乳液的系统可能不太理想，在这种系统中表面活性剂可干扰稳定的乳液。在一些情况下，裂解溶液可以包含非离子表面活性剂，例如TritonX-100和Tween 20。在一些情况下，裂解溶液可以包含离子表面活性剂，例如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。在某些情况下也可以使用电穿孔、热、声学或机械细胞破坏，例如，基于非乳液的分隔，如生物颗粒的包封，其可以补充或代替液滴分隔，其中包封物的任何孔隙尺寸足够小以在细胞破坏后保留给定大小的核酸片段。
作为与上述分析物载体共分隔的裂解剂的替代或除与上述分析物载体共分隔的裂解剂之外，其他试剂也可与分析物载体共分隔，包括例如DNA酶和RNA酶失活剂或抑制剂，如蛋白质酶K、螯合剂如EDTA以及用于去除或以其他方式降低不同细胞裂解物组分对核酸的后续加工的负面活性或影响的其他试剂。另外，在包封的分析物载体(例如，在聚合物基质中的细胞或核)的情况下，可以将分析物载体暴露于适当的刺激以从共分隔的支持物(例如，珠)释放分析物载体或其内容物。例如，在一些情况下，化学刺激可以与包封的分析物载体一起共分隔以允许支持物(例如，珠)的降解和细胞、核或其内容物向较大隔室中的释放。在一些情况下，这种刺激可以与本文中别处描述的用于从其各自的支持物(例如，珠)释放核酸分子(例如，寡核苷酸)的刺激相同。在替代的实例中，这可以是不同且非重叠的刺激，以允许包封的分析物载体在与核酸分子向隔室中的释放不同的时间释放到同一隔室中。关于用于包封细胞(也称为“细胞珠”)的方法、组合物和系统的描述，参见例如美国专利10,428,326和美国专利公开20190100632，其各自通过引用整体并入。
另外的试剂也可以与生物颗粒共分隔，如用于片段化生物颗粒的DNA的内切酶、DNA聚合酶和用于扩增生物颗粒的核酸片段并向扩增的片段附着条形码分子标签的dNTP。可以共分隔其他酶，包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白质酶K、DNA酶等。另外的试剂还可以包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸，以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(在本文中也称为“转换寡核苷酸(switch oligos)”或“模板转换寡核苷酸”)。在一些实例中，可使用模板转换来增加cDNA的长度。在一些情况下，可使用模板转换来向cDNA附加预定义的核酸序列。在模板转换的实例中，可从模板例如细胞mRNA的逆转录生成cDNA，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以独立于模板的方式向cDNA添加另外的核苷酸，例如polyC。转换寡核苷酸可包括与所述另外的核苷酸互补的序列，例如polyG。cDNA上的另外的核苷酸(例如，polyC)可与转换寡核苷酸上的另外的核苷酸(例如，polyG)杂交，由此转换寡核苷酸可被逆转录酶用作模板来进一步延伸cDNA。模板转换寡核苷酸可以包含杂交区和模板区。杂交区可包含能够与靶杂交的任何序列。在一些情况下，如先前所述，杂交区包含一系列G碱基以与cDNA分子的3’末端处的突出C碱基互补。所述一系列G碱基可以包含1个G碱基、2个G碱基、3个G碱基、4个G碱基、5个G碱基或多于5个G碱基。模板序列可包含待并入到cDNA中的任何序列。
在一些情况下，模板区包含至少1个(例如，至少2、3、4、5个或更多个)标签序列和/或功能序列。转换寡核苷酸可以包含脱氧核糖核酸；核糖核酸；经修饰的核酸，包括2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、倒置dT、5-甲基dC、2’-脱氧肌苷、Super T(5-羟基丁炔-2’-脱氧尿苷)、Super G(8-氮杂-7-脱氮鸟苷)、锁核酸(LNA)、解锁核酸(UNA，例如UNA-A、UNA-U、UNA-C、UNA-G)、Iso-dG、Iso-dC、2’氟碱基(例如，氟C、氟U、氟A和氟G)或任何组合。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以为至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸或更长。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以为至多约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸。
一旦细胞或核的内容物被释放到其各自的隔室中，就可以在隔室内进一步加工其中包含的大分子组分(例如，生物颗粒的大分子组成成分，如RNA、DNA或蛋白质)。根据本文描述的方法和系统，可向各个生物颗粒的大分子组分内容物提供独特的标识符，使得在表征这些大分子组分时可以将它们归为衍生自相同的一个或多个生物颗粒。通过向单独的生物颗粒或生物颗粒组独有地分配独特的标识符，将提供将特性归于各个生物颗粒或生物颗粒组的能力。例如呈核酸条形码形式的独特标识符可被分配给各个生物颗粒或生物颗粒的群或者可使例如呈核酸条形码形式的独特标识符与各个生物颗粒或生物颗粒的群相关联，以便用该独特标识符给生物颗粒的大分子组分(和因此其特性)加标签或标记生物颗粒的大分子组分(和因此其特性)。然后可使用这些独特标识符来将生物颗粒的组分和特性归于单独的生物颗粒或生物颗粒组。
在一些方面，这通过将单独的生物颗粒或生物颗粒组与独特标识符共分隔来进行，如上文所述(参考图3和6)。在一些方面，独特标识符以核酸分子(例如，寡核苷酸)的形式提供，所述核酸分子包含可附着到单独的生物颗粒的核酸内容物、或生物颗粒的其他组分、特别是这些核酸的片段或者以其他方式与之关联的核酸条形码序列。分隔核酸分子使得如在给定隔室中的核酸分子之间，其中包含的核酸条形码序列是相同的，但如在不同的隔室之间，核酸分子可以并且确实具有不同的条形码序列，或至少在给定分析中所有隔室间呈现大量的不同条形码序列。在一些方面，可仅一个核酸条形码序列与给定的隔室相关联，但在一些情况下，可以存在两个或更多个不同的条形码序列。
核酸条形码序列可包括核酸分子(例如，寡核苷酸)的序列内约6至约20个或更多个核苷酸。核酸条形码序列可包括约6至约20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以是约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至多约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即，在相邻核苷酸的单段中，或者它们可以分成由1个或多个核苷酸分开的两个或更多个单独的子序列。在一些情况下，分开的条形码子序列的长度可为约4至约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以是约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至多约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。
共分隔的核酸分子还可包含可用于来自共分隔的生物颗粒的核酸的加工中的其他功能序列。这些序列包括例如靶向或随机/通用扩增引物序列(用于扩增隔室内来自各个生物颗粒的核酸(例如，mRNA、基因组DNA)，同时使相关联的条形码序列附着)、测序引物或引物识别位点、杂交或探测序列(例如，用于鉴定序列的存在或用于拉下加有条形码的核酸)或许多其他潜在功能序列中的任何一个。还可以采用共分隔寡核苷酸的其他机制，包括例如两个或更多个液滴的聚结，其中一个液滴含有寡核苷酸，或将寡核苷酸(例如，附着到珠的)微分配到隔室中，例如微流体系统内的液滴。
在一个实例中，提供了支持物，如珠，其各自包括大量可释放地附着到珠的上述加有条形码的核酸分子(例如，加有条形码的寡核苷酸)，其中附着到特定珠的所有核酸分子都将包括相同的核酸条形码序列，但在使用的珠的群间呈现大量的多样化条形码序列。在一些实施方案中，使用例如包含聚丙烯酰胺聚合物基质的水凝胶珠作为核酸分子进入隔室的固体支持和递送媒介物，因为它们能够携带大量核酸分子，并且可以配置为在暴露于特定刺激后释放这些核酸分子，如本文中别处所述。在一些情况下，珠的群提供包括至少约1,000个不同条形码序列、至少约5,000个不同条形码序列、至少约10,000个不同条形码序列、至少约50,000个不同条形码序列、至少约100,000个不同条形码序列、至少约1,000,000个不同条形码序列、至少约5,000,000个不同条形码序列、或至少约10,000,000个不同条形码序列或更多的多样化条形码序列文库。另外，每个珠可提供有附着的大量核酸(例如，寡核苷酸)分子。特别地，单独的珠上包含条形码序列的核酸分子的分子数量可为至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸分子、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子并且在一些情况下至少约10亿个核酸分子或更多。给定珠的核酸分子可包括相同(或共有)条形码序列、不同条形码序列或两者的组合。给定珠的核酸分子可包括多组核酸分子。给定组的核酸分子可包括相同的条形码序列。该相同的条形码序列可与另一组的核酸分子的条形码序列不同。
此外，在分隔珠的群时，所得隔室的群也可包括多样化条形码文库，其包括至少约1,000个不同条形码序列、至少约5,000个不同条形码序列、至少约10,000个不同条形码序列、至少至少约50,000个不同条形码序列、至少约100,000个不同条形码序列、至少约1,000,000个不同条形码序列、至少约5,000,000个不同条形码序列、或至少约10,000,000个不同条形码序列。另外，群的每个隔室可包含至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸分子、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子并且在一些情况下至少约10亿个核酸分子。
在一些情况下，可能期望将多个不同的条形码并入给定的隔室内，这些条形码附着到隔室内的单个或多个珠。例如，在一些情况下，混合但已知的一组条形码序列可以在后续加工中提供更高的鉴定保证，例如，通过提供条形码向给定隔室的更强的寻址或归属，作为来自给定隔室的输出的重复或独立确认。
在对珠施加特定的刺激时，核酸分子(例如，寡核苷酸)可从珠释放。在一些情况下，刺激可以是光刺激，例如通过将释放核酸分子的光不稳定键联的切割。在其他情况下，可以使用热刺激，其中珠环境的温度的升高将导致键联的切割或核酸分子从珠的其他释放。在还其他情况下，可使用化学刺激，其切割核酸分子与珠的键联，或以其他方式导致核酸分子从珠的释放。在一种情况下，这样的组合物包含上述用于包封生物颗粒的聚丙烯酰胺基质，并且可以通过暴露于还原剂如DTT而被降解以释放附着的核酸分子。
在一些方面，提供了用于受控分隔的系统和方法。可以通过调节通道架构(例如，微流体通道架构)中的某些几何特征来控制液滴尺寸。例如，可以调节通道的膨胀角度、宽度和/或长度以控制液滴尺寸。例如，关于图6，生成的离散液滴可以包括珠(例如，如在被占据液滴616中)。或者，生成的离散液滴可以包括多于一个珠。或者，生成的离散液滴可以不包括任何珠(例如，如在未被占据液滴618中)。在一些情况下，生成的离散液滴可以含有一个或多个生物颗粒，如本文中别处所述。在一些情况下，生成的离散液滴可以包含一种或多种试剂，如本文中别处所述。
在一些情况下，水性流体608可具有基本上均匀的浓度或频率的珠612。珠612可从单独的通道(图6中未示出)引入到通道区段602中。通道区段602中珠612的频率可以通过控制珠612被引入到通道区段602中的频率和/或通道区段602及单独的通道中流体的相对流速来控制。在一些情况下，珠可从多个不同的通道引入到通道区段602中，并相应地控制频率。
在一些情况下，通道区段602中的水性流体608可包含生物颗粒(例如，参考图3和6所描述)。在一些情况下，水性流体608可具有基本上均匀的浓度或频率的生物颗粒。与珠一样，生物颗粒可从单独的通道引入到通道区段602中。通道区段602中的水性流体608中生物颗粒的频率或浓度可以通过控制生物颗粒被引入到通道区段602中的频率和/或通道区段602及单独的通道中流体的相对流速来控制。在一些情况下，生物颗粒可从多个不同的通道引入到通道区段602中，并相应地控制频率。在一些情况下，第一单独通道可引入珠而第二单独通道可将生物颗粒引入到通道区段602中。引入珠的第一单独通道可以在引入生物颗粒的第二单独通道的上游或下游。
第二流体610可包含油，如氟化油，其包括用于稳定所得液滴、例如抑制所得液滴的后续聚结的含氟表面活性剂。
在一些情况下，第二流体610可以不经受和/或引导至流入或流出储库604的任何流动。例如，第二流体610可以在储库604中基本上静止。在一些情况下，第二流体610可以经受在储库604内的流动，但不经受流入或流出储库604的流动，如经由向储库604施加压力和/或如受会合点606处水性流体608的进入流的影响。或者，第二流体610可以经受和/或引导至流入或流出储库604的流动。例如，储库604可以是将第二流体610从上游引导至下游的通道，从而输送所生成的液滴。
在会合点606处或附近的通道结构600可以具有至少部分地决定由通道结构600形成的液滴的尺寸的某些几何特征。通道区段602可在会合点606处或附近具有高度h0和宽度w。举例来说，通道区段602可包括矩形横截面，该矩形横截面通向具有更宽横截面(如在宽度或直径上)的储库604。或者，通道区段602的横截面可以是其他形状，如圆形形状、梯形形状、多边形形状或任何其他形状。在会合点606处或附近，储库604的顶壁和底壁可以扩张角α倾斜。扩张角α允许舌部(在会合点606处离开通道区段602并在液滴形成之前进入储库604的水性流体608的部分)深度增加并促进中间形成的液滴的曲率的减小。液滴尺寸可能随扩张角的增大而减小。所得液滴半径Rd可以通过下式用前述几何参数h0、w和α预测：
Figure BDA0004001092240000771
举例来说，对于具有w＝21μm、h＝21μm和α＝3°的通道结构，预测液滴尺寸为121μm。在另一个实例中，对于具有w＝25μm、h＝25μm和α＝5°的通道结构，预测液滴尺寸为123μm。在另一个实例中，对于具有w＝28μm、h＝28μm和α＝7°的通道结构，预测液滴尺寸为124μm。
在一些情况下，扩张角α可以在约0.5°至约4°、约0.1°至约10°或约0°至约90°的范围之间。例如，扩张角可为至少约0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°或更大。在一些情况下，扩张角可为至多约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°或更小。在一些情况下，宽度w可在约100微米(μm)至约500μm的范围之间。在一些情况下，宽度w可在约10μm至约200μm的范围之间。或者，宽度可小于约10μm。或者，宽度可大于约500μm。在一些情况下，进入会合点606的水性流体608的流速可在约0.04微升(μL)/分钟(min)至约40μL/min之间。在一些情况下，进入会合点606的水性流体608的流速可在约0.01微升(μL)/分钟(min)至约100μL/min之间。或者，进入会合点606的水性流体608的流速可小于约0.01μL/min。或者，进入会合点606的水性流体608的流速可大于约40μL/min，如45μL/min、50μL/min、55μL/min、60μL/min、65μL/min、70μL/min、75μL/min、80μL/min、85μL/min、90μL/min、95μL/min、100μL/min、110μL/min、120μL/min、130μL/min、140μL/min、150μL/min或更大。在较低的流速下，如约小于或等于10微升/分钟的流速，液滴半径可以不取决于进入会合点606的水性流体608的流速。
在一些情况下，所生成的液滴中至少约50％可具有均匀的尺寸。在一些情况下，所生成的液滴中至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多可具有均匀的尺寸。或者，所生成的液滴中小于约50％可具有均匀的尺寸。
可通过增加生成点如增加水性流体608通道区段(例如，通道区段602)与储库604之间的会合点(例如，会合点606)的数量来增加液滴生成通量。或者或另外，可通过增加通道区段602中水性流体608的流速来增加液滴生成通量。
在一些情况下，所生成的液滴中至少约50％可具有均匀的尺寸。在一些情况下，所生成的液滴中至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多可具有均匀的尺寸。或者，所生成的液滴中小于约50％可具有均匀的尺寸。
通道网络，例如如上文或本文中别处所述，可流体联接到适当的流体部件。例如，入口通道区段流体联接到它们要递送至通道会合点的适当材料源。这些源可以包括多种不同的流体部件中的任何一种，从限定在微流体装置的主体结构中或连接到微流体装置的主体结构的简单储库到从装置外的源、歧管、流体流动单元(例如，致动器、泵、压缩机)递送流体的流体导管等。同样地，出口通道区段(例如，通道区段608、储库604等)可以流体联接到用于供后续加工的被分隔细胞或核的接收容器或导管。还同样，这可以是限定在微流体装置的主体中的储库，或者其可以是用于向后续过程操作、仪器或部件递送被分隔细胞或核的流体导管。
本文描述的方法和系统可以用于大大提高单细胞或核应用和/或接收基于液滴的输入的其他应用的效率。例如，在对被占据的细胞和/或适当大小的细胞进行分选之后，可进行的后续操作可包括扩增产物的生成、纯化(例如，经由固相可逆固定(SPRI))、进一步加工(例如，剪切、功能序列的连接和后续扩增(例如，经由PCR))。这些操作可以批量(inbulk)(例如，在隔室外)进行。在隔室为乳液中的液滴的情况下，乳液可被破坏，并且液滴的内容物可被合并用于另外的操作。另外的可以与装载条形码的珠一起共分隔的试剂可以包括用于阻断核糖体RNA(rRNA)的寡核苷酸和用于从细胞或核消化基因组DNA的核酸酶。或者，可以在另外的加工操作期间应用rRNA去除剂。通过这样的方法生成的构建体的配置可帮助最小化(或避免)对测序期间的poly-T序列和/或多核苷酸序列的5’末端的测序。扩增产物，例如第一扩增产物和/或第二扩增产物，可以经受测序以供序列分析。在一些情况下，可以使用测序用部分发夹扩增(PHASE)方法进行扩增。
多种应用需要评价生物颗粒的群内不同生物颗粒或生物体类型的存在和定量，包括例如微生物组分析和表征、环境测试、食品安全测试、流行病学分析(例如，在跟踪污染中)等。
酶、聚合酶和逆转录酶
在一些实例中，对去固定细胞、核和/或来自去固定细胞或核的生物分子进行各种测定。示例性测定可以包括单细胞转录分析、单细胞序列分析等。这些及其他测定可以使用用于将生物样品、凝胶珠、条形码和/或其他化合物/材料包封在液滴中的可用系统进行，如Chromium System(10x Genomics(美国加州普莱森顿))。
用于这些测定中的示例试剂可以包括多种酶，包括例如聚合酶，如DNA或RNA聚合酶。这些测定中使用的酶可以是分离的酶和/或纯化的酶。
示例测定试剂可以包括逆转录酶(RT)。RT是指可使用RNA模板合成单链DNA(例如，第一链合成)的酶。通常，RT酶还可以使用DNA模板合成单链DNA(例如，第二链合成)。
在一些实例中，RT可以具有末端转移酶活性。RT酶可以具有模板转换活性，其通常依赖于具有末端转移酶活性的RT向在第一链合成中合成的DNA链的3’末端添加非模板化脱氧核苷酸的能力。在存在可与添加到第一链的3’末端的非模板化序列杂交的模板转换寡核苷酸的情况下，模板转换逆转录酶可以从使用充当第一链合成的模板的RNA模板“转换”到使用模板转换寡核苷酸作为模板，以延长第一链合成产物的长度。
在一些实施方案中，可使用模板转换来增加测定中生成的cDNA的长度。在一些实施方案中，可使用模板转换来向cDNA附加预定义的核酸序列。在模板转换的实例中，可从模板例如细胞mRNA的逆转录生成cDNA，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以独立于模板的方式向cDNA添加另外的核苷酸，例如polyC。
在一些实例中，RT可以具有RNA酶H活性。
逆转录酶可以来自各种不同的系统。在一些实例中，逆转录酶可以来自禽成髓细胞瘤病毒(AMV)RT或莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)RT、可以衍生自禽成髓细胞瘤病毒(AMV)RT或莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)RT或者可以是禽成髓细胞瘤病毒(AMV)RT或莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)RT的变体。
另外的可以与RT酶一起使用的测定试剂可以包括RNA或DNA模板、用于第一链或第二链DNA合成的引物和模板转换寡核苷酸。逆转录酶通常需要包括脱氧核糖核苷酸(dNTP)。逆转录酶的活性可能需要镁离子(Mg2+)和/或锰离子(Mn2+)。
另外的可以用于使用去固定细胞或核和/或生物分子进行测定的示例测定试剂包括可用于进行包封在液滴中的一种或多种化学或生物化学操作的任何测定试剂。因此，可用于测定方法中的测定试剂包括可用于进行反应如核酸修饰(例如，连接、消化、甲基化、随机诱变、亚硫酸氢盐转换、尿嘧啶水解、核酸修复、盖帽或去帽)、核酸扩增(例如，等温扩增或PCR)、核酸插入或切割(例如，经由CRISPR/Cas9-介导或转座子介导的插入或切割)和/或逆转录的任何试剂。另外，有用的测定试剂可包括允许以比非靶序列特异性读段高的速率制备对感兴趣的大分子组成成分特异的靶序列或测序读段的那些试剂。
聚乙二醇(PEG)
在一些实例中，各种聚合物可以为被固定细胞或核的去固定提供益处。在一些实例中，我们已发现向各种去固定反应添加聚乙二醇(PEG)增加从去固定细胞或核回收的RNA的量和质量。RNA质量的提高可以包括回收的RNA的长度、回收的RNA在各种酶促反应中用作模板的能力、使用回收的RNA的群制备的DNA文库的序列复杂性等。
在一些实例中，各种聚合物可以为对或使用去固定细胞、核或自去固定细胞或核获得的生物分子进行的测定提供益处。在一些实例中，聚乙二醇(PEG)增加各种酶的活性。在一些实例中，PEG在第二酶或物质的存在下增加第一酶的活性，其中在不存在PEG的情况下，第二酶或物质将降低第一酶的活性。在一些实例中，我们已发现，向逆转录反应(其中所述反应也可以含有来自去固定反应的组分(例如，蛋白酶、其他去固定剂))添加PEG将增加逆转录酶的各种活性，其中在不存在PEG的情况下，来自去固定反应的组分会抑制或破坏逆转录酶活性。
在一些实例中，提供这些效果的有益聚合物包括聚乙二醇(PEG)，有时也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)。PEG是环氧乙烷的低聚物或聚合物。PEG通常是指具有化学式H-(O-CH2-CH2)n-OH的聚醚化合物。PEG通常通过环氧乙烷的聚合制备并且可以广泛的分子量获得。在一些实例中，PEG以300g/mol至10,000,000g/mol的不同分子量获得。可商购获得的PEG可以例如标记为PEG 6000或PEG 8000。这些标记名称通常意指聚合物分子的平均分子量分别为6000或8000。这些组合物通常是多分散的(即，它们具有分子量分布)。较低分子量的PEG可以作为纯低聚物获得，称为单分散、均匀或离散型。基于用于制备该物质的聚合中使用的引发剂，可获得不同形式的PEG。PEG还可以不同的几何形状获得，包括支化PEG、星形PEG和梳形PEG。在本文中，所有类型的PEG都可以用于本文公开的方法中。
在一些实例中，这里公开的方法中使用的PEG的平均分子量可以为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、10100、10200、10300、10400、10500、10600、10700、10800、10900、11000、11100、11200、11300、11400、11500、11600、11700、11800、11900、12000、12100、12200、12300、12400、12500、12600、12700、12800、12900、13000、13100、13200、13300、13400、13500、13600、13700、13800、13900、14000、14100、14200、14300、14400、14500、14600、14700、14800、14900、15000、15100、15200、15300、15400、15500、15600、15700、15800、15900、16000、16100、16200、16300、16400、16500、16600、16700、16800、16900、17000、17100、17200、17300、17400、17500、17600、17700、17800、17900、18000、18100、18200、18300、18400、18500、18600、18700、18800、18900、19000、19100、19200、19300、19400、19500、19600、19700、19800、19900、20000、20100、20200、20300、20400、20500、20600、20700、20800、20900、21000、21100、21200、21300、21400、21500、21600、21700、21800、21900、22000或更大。在一些实例中，在所公开的方法、组合物等中使用的PEG的平均分子量可以在上述数字中的任何两个之间的范围内。
在一些实例中，这里公开的方法中使用的PEG的平均最终浓度可以为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％、10％、10.1％、10.2％、10.3％、10.4％、10.5％、10.6％、10.7％、10.8％、10.9％、11％、11.1％、11.2％、11.3％、11.4％、11.5％、11.6％、11.7％、11.8％、11.9％、12％、12.1％、12.2％、12.3％、12.4％、12.5％、12.6％、12.7％、12.8％、12.9％、13％、13.1％、13.2％、13.3％、13.4％、13.5％、13.6％、13.7％、13.8％、13.9％、14％、14.1％、14.2％、14.3％、14.4％、14.5％、14.6％、14.7％、14.8％、14.9％、15％、15.1％、15.2％、15.3％、15.4％、15.5％、15.6％、15.7％、15.8％、15.9％、16％、16.1％、16.2％、16.3％、16.4％、16.5％、16.6％、16.7％、16.8％、16.9％、17％、17.1％、17.2％、17.3％、17.4％、17.5％、17.6％、17.7％、17.8％、17.9％、18％、18.1％、18.2％、18.3％、18.4％、18.5％、18.6％、18.7％、18.8％、18.9％、19％、19.1％、19.2％、19.3％、19.4％、19.5％、19.6％、19.7％、19.8％、19.9％、20％、20.1％、20.2％、20.3％、20.4％、20.5％、20.6％、20.7％、20.8％、20.9％、21％、21.1％、21.2％、21.3％、21.4％、21.5％、21.6％、21.7％、21.8％、21.9％、22％、22.1％、22.2％、22.3％、22.4％、22.5％、22.6％、22.7％、22.8％、22.9％、23％、23.1％、23.2％、23.3％、23.4％、23.5％、23.6％、23.7％、23.8％、23.9％、24％、24.1％、24.2％、24.3％、24.4％、24.5％、24.6％、24.7％、24.8％、24.9％、25％、25.1％、25.2％、25.3％、25.4％、25.5％、25.6％、25.7％、25.8％、25.9％、26％、26.1％、26.2％、26.3％、26.4％、26.5％、26.6％、26.7％、26.8％、26.9％、27％、27.1％、27.2％、27.3％、27.4％、27.5％、27.6％、27.7％、27.8％、27.9％、28％、28.1％、28.2％、28.3％、28.4％、28.5％、28.6％、28.7％、28.8％、28.9％、29％、29.1％、29.2％、29.3％、29.4％、29.5％、29.6％、29.7％、29.8％、29.9％、30％、30.1％、30.2％、30.3％、30.4％、30.5％、30.6％、30.7％、30.8％、30.9％、31％、31.1％、31.2％、31.3％、31.4％、31.5％、31.6％、31.7％、31.8％、31.9％、32％、32.1％、32.2％、32.3％、32.4％、32.5％、32.6％、32.7％、32.8％、32.9％、33％、33.1％、33.2％、33.3％、33.4％、33.5％、33.6％、33.7％、33.8％、33.9％、34％、34.1％、34.2％、34.3％、34.4％、34.5％、34.6％、34.7％、34.8％、34.9％、35％、35.1％、35.2％、35.3％、35.4％、35.5％、35.6％、35.7％、35.8％、35.9％、36％、36.1％、36.2％、36.3％、36.4％、36.5％、36.6％、36.7％、36.8％、36.9％、37％、37.1％、37.2％、37.3％、37.4％、37.5％、37.6％、37.7％、37.8％、37.9％、38％、38.1％、38.2％、38.3％、38.4％、38.5％、38.6％、38.7％、38.8％、38.9％、39％、39.1％、39.2％、39.3％、39.4％、39.5％、39.6％、39.7％、39.8％、39.9％、40％、40.1％、40.2％、40.3％、40.4％、40.5％、40.6％、40.7％、40.8％、40.9％、41％、41.1％、41.2％、41.3％、41.4％、41.5％、41.6％、41.7％、41.8％、41.9％、42％、42.1％、42.2％、42.3％、42.4％、42.5％、42.6％、42.7％、42.8％、42.9％、43％、43.1％、43.2％、43.3％、43.4％、43.5％、43.6％、43.7％、43.8％、43.9％、44％、44.1％、44.2％、44.3％、44.4％、44.5％、44.6％、44.7％、44.8％、44.9％、45％、45.1％、45.2％、45.3％、45.4％、45.5％、45.6％、45.7％、45.8％、45.9％、46％、46.1％、46.2％、46.3％、46.4％、46.5％、46.6％、46.7％、46.8％、46.9％、47％、47.1％、47.2％、47.3％、47.4％、47.5％、47.6％、47.7％、47.8％、47.9％、48％、48.1％、48.2％、48.3％、48.4％、48.5％、48.6％、48.7％、48.8％、48.9％、49％、49.1％、49.2％、49.3％、49.4％、49.5％、49.6％、49.7％、49.8％、49.9％、50％、50.1％、50.2％、50.3％、50.4％、50.5％、50.6％、50.7％、50.8％、50.9％、51％、51.1％、51.2％、51.3％、51.4％、51.5％、51.6％、51.7％、51.8％、51.9％、52％、52.1％、52.2％、52.3％、52.4％、52.5％、52.6％、52.7％、52.8％、52.9％、53％、53.1％、53.2％、53.3％、53.4％、53.5％、53.6％、53.7％、53.8％、53.9％、54％、54.1％、54.2％、54.3％、54.4％、54.5％、54.6％、54.7％、54.8％、54.9％、55％、55.1％、55.2％、55.3％、55.4％、55.5％、55.6％、55.7％、55.8％、55.9％、56％、56.1％、56.2％、56.3％、56.4％、56.5％、56.6％、56.7％、56.8％、56.9％、57％、57.1％、57.2％、57.3％、57.4％、57.5％、57.6％、57.7％、57.8％、57.9％、58％、58.1％、58.2％、58.3％、58.4％、58.5％、58.6％、58.7％、58.8％、58.9％、59％、59.1％、59.2％、59.3％、59.4％、59.5％、59.6％、59.7％、59.8％、59.9％、60％、60.1％、60.2％、60.3％、60.4％、60.5％、60.6％、60.7％、60.8％、60.9％、61％、61.1％、61.2％、61.3％、61.4％、61.5％、61.6％、61.7％、61.8％、61.9％、62％、62.1％、62.2％、62.3％、62.4％、62.5％、62.6％、62.7％、62.8％、62.9％、63％、63.1％、63.2％、63.3％、63.4％、63.5％、63.6％、63.7％、63.8％、63.9％、64％、64.1％、64.2％、64.3％、64.4％、64.5％、64.6％、64.7％、64.8％、64.9％或65％。在一些实例中，在所公开的方法、组合物等中，PEG的平均最终浓度可以在上述数字中的任何两个之间的范围内。
在一些实例中，将PEG溶解在水溶液中并添加到反应中以达到所需的最终浓度。取而代之，可以将PEG附着到蛋白质或酶，这一过程称为PEG化。这样的过程是本领域熟知的。例如，具有附着的PEG的逆转录酶(RT)可以称为PEG化RT。
基于微孔的分析
如本文所述，一个或多个过程可以在隔室中进行，所述隔室可以是孔。孔可以是基底的多个孔中的孔，例如微孔阵列或板的微孔，或者孔可以是包含基底的装置(例如，微流体装置)的微孔或微腔室。孔可以是孔阵列或板的孔，或者孔可以是装置(例如，流体装置)的孔或腔室。相应地，孔或微孔可以采取“开放”配置，其中孔或微孔暴露于环境(例如，含有开放表面)，并且在基底的一个平面表面上是可接近的，或者孔或微孔可以采取“关闭”或“密封”配置，其中微孔在基底的平面表面上是不可接近的。在一些情况下，孔或微孔可以配置为在“开放”和“关闭”配置之间切换。例如，一个“开放”微孔或一组微孔可以使用膜(例如，半透膜)、油(例如，覆盖水溶液的氟化油)或盖子进行“关闭”或“密封”，如本文中别处所述。孔或微孔最初可以以“关闭”或“密封”配置提供，其中如果没有外力，它们在基底的平面表面上是不可接近的。例如，“关闭”或“密封”配置可以包括基底例如密封膜或箔，其可通过移液管吸头刺穿或穿透。用于基底的合适材料包括但不限于聚酯、聚丙烯、聚乙烯、乙烯基和铝箔。
在一些实施方案中，孔可以具有小于1毫升(mL)的体积。例如，孔可以配置为容纳最多1000微升(μL)、最多100μL、最多10μL、最多1μL、最多100纳升(nL)、最多10nL、最多1nL、最多100皮升(pL)、最多10(pL)或更少的体积。孔可以配置为容纳约1000μL、约100μL、约10μL、约1μL、约100nL、约10nL、约1nL、约100pL、约10pL等的体积。孔可以配置为容纳至少10pL、至少100pL、至少1nL、至少10nL、至少100nL、至少1μL、至少10μL、至少100μL、至少1000μL或更多的体积。孔可以配置为容纳在本文中列出的体积范围内的体积，例如，约5nL至约20nL、约1nL至约100nL、约500pL至约100μL等。孔可以是具有不同体积的多个孔，并且可以配置为容纳适合容纳本文所述的任何隔室体积的体积。
在一些情况下，微孔阵列或板包括单一种类的微孔。在一些情况下，微孔阵列或板包括各种各样的微孔。例如，微孔阵列或板可以包括在单个微孔阵列或板内的一种或多种类型的微孔。微孔的类型可以具有不同的尺寸(例如，长度、宽度、直径、深度、横截面积等)、形状(例如，圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形等)、长宽比或其他物理特性。微孔阵列或板可以包括任何数量的不同类型的微孔。例如，微孔阵列或板可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000种或更多种不同类型的微孔。孔可以具有任何尺寸(例如，长度、宽度、直径、深度、横截面积、体积等)、形状(例如，圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形、其他多边形等)、长宽比或本文关于任何孔描述的其他物理特性。
在某些情况下，微孔阵列或板包括在阵列或板内彼此相邻定位的不同类型的微孔。例如，具有一组尺寸的微孔可以与具有一组不同尺寸的另一个微孔相邻并接触定位。类似地，不同几何形状的微孔可以彼此相邻或接触放置。相邻的微孔可以配置为容纳不同的物品；例如，一个微孔可用于容纳生物颗粒，如细胞、核或其他样品(例如，细胞组分、核酸分子等)，而相邻的微孔可用于容纳支持物(例如，珠，如凝胶珠)、液滴或其他试剂。在一些情况下，相邻的微孔可以配置为例如在施加刺激时或在接触每个微孔中的物品时自发地融合在其中容纳的内容物。
如本文中别处所述，在本文描述的系统、组合物和方法中可使用多个隔室。例如，可以生成或以其他方式提供任何合适数量的隔室(例如，孔或液滴)。例如，在使用孔时的情况下，可以生成或以其他方式提供至少约1,000个孔、至少约5,000个孔、至少约10,000个孔、至少约50,000个孔、至少约100,000个孔、至少约500,000个孔、至少约1,000,000个孔、至少约5,000,000个孔至少约10,000,000个孔、至少约50,000,000个孔、至少约100,000,000个孔、至少约500,000,000个孔、至少约1,000,000,000个孔或更多个孔。此外，多个孔可以包括未被占据的孔(例如，空孔)和占据的孔两者。
孔可以包括本文所述的任何试剂或其组合。这些试剂可以包括例如条形码分子、酶、衔接子及其组合。试剂可以与置于孔中的生物颗粒(例如，细胞、核或细胞组分，例如蛋白质、核酸分子等)在物理上分开。这种物理分开可以通过在支持物(例如珠，例如凝胶珠)内含有试剂或联接到支持物来完成，所述支持物置于孔内。物理分离也可以通过在孔中分配试剂并用层上覆试剂来完成，所述层在将多核苷酸样品引入孔内之前是例如可溶解的、可熔化的或可渗透的。该层可以是例如油、蜡、膜(例如半透膜)等等。孔可以在任何点进行密封，例如在添加支持物或珠后、在添加试剂后、或在添加这些组分中的任一种后。孔的密封可以用于各种目的，包括防止珠或装载的试剂从孔中逸出、允许某些试剂的选择递送(例如，经由半透膜的使用)、用于在进一步加工之前或之后孔的贮存等。
孔可以包括游离试剂和/或包封在支持物(例如珠)或液滴中或者以其他方式与之联接或结合的试剂。在一些实施方案中，本公开内容中描述的任何试剂可以包封在支持物(例如珠)或液滴中或者以其他方式与之联接，所述支持物或液滴具有适合于样品加工反应的任何化学品、颗粒和元素，所述样品加工反应涉及生物分子，例如但不限于核酸分子和蛋白质。例如，在用于DNA测序的样品制备反应中使用的珠或液滴可以包括下述试剂中的一种或多种：酶、限制性酶(例如，多重cutter)、连接酶、聚合酶、荧光团、寡核苷酸条形码、衔接子、缓冲液、核苷酸(例如，dNTP、ddNTP)等等。
试剂的另外实例包括但不限于：缓冲液、酸性溶液、碱性溶液、温度敏感酶、pH敏感酶、光敏酶、金属、金属离子、氯化镁、氯化钠、锰、水性缓冲液、温和缓冲液、离子缓冲液、抑制剂、酶、蛋白质、多核苷酸、抗体、糖、脂质、油、盐、离子、去污剂、离子型去污剂、非离子型去污剂、寡核苷酸、核苷酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、双脱氧核糖核苷酸三磷酸(ddNTP)、DNA、RNA、肽多核苷酸、互补DNA(cDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、质粒DNA、粘粒DNA、染色体DNA、基因组DNA、病毒DNA、细菌DNA、mtDNA(线粒体DNA)、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、微小RNA、dsRNA、核酶、核糖开关和病毒RNA、聚合酶、连接酶、限制性酶、蛋白酶、核酸酶、蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、螯合剂、还原剂、氧化剂、荧光团、探针、生色团、染料、有机物、乳化剂、表面活性剂、稳定剂、聚合物、水、小分子、药物、放射性分子、防腐剂、抗生素、适体和药学药物化合物。如本文所述，孔中的一种或多种试剂可以用于执行一种或多种反应，包括但不限于：生物颗粒(例如，细胞或核)加工，例如裂解、固定、渗透化、核酸反应例如核酸延伸反应、扩增、逆转录反应等。
本文公开的孔可以作为试剂盒的部分提供。例如，试剂盒可以包括使用说明书、微孔阵列或装置以及试剂(例如珠)。试剂盒可以包括用于执行本文所述的过程的任何有用的试剂，所述过程例如核酸反应、核酸分子的加条形码、样品加工(例如，用于生物颗粒裂解、固定和/或渗透化)。
在一些情况下，孔包括支持物(例如珠)或液滴，其包括具有相似属性的一组试剂，例如一组酶、一组矿物质、一组寡核苷酸、不同条形码分子的混合物、或等同条形码分子的混合物。在其他情况下，支持物(例如珠)或液滴包括试剂的异质混合物。在一些情况下，试剂的异质混合物可以包括执行反应所必需的所有组分。在一些情况下，此类混合物可以包括执行反应所必需的所有组分，除了执行反应所必需的1、2、3、4、5种或更多种组分之外。在一些情况下，此类另外的组分包含在不同的支持物(例如珠)或液滴内，或以其他方式与之联接，或在系统的隔室(例如微孔)内的溶液内。
图12示意性地示出了微孔阵列的一个实例。该阵列可以包含在基底1200内。基底1200包括多个孔1202。孔1202可以具有任何大小或形状，并且孔之间的间距、每个基底的孔数量以及基底1200上的孔密度可以根据应用进行修改。在一个这样的示例应用中，将可以包含细胞或核(例如，被固定细胞或核或去固定细胞/核)或细胞组分(例如，核酸分子)的样品分子1206与可以包含联接到其的核酸条形码分子的珠1204共分隔。可以使用重力或其他装载技术(例如，离心、液体处理器、声学装载、光电子等)来装载孔1202。在一些情况下，孔1202中的至少一个含有单个样品分子1206(例如，细胞或核)和单个珠1204。
试剂可以序贯地或同时地装载到孔中。在一些情况下，在特定操作之前或之后将试剂引入装置中。在一些情况下，序贯地引入试剂(在某些情况下，其可以在液滴或珠中提供)，使得不同的反应或操作在不同的步骤处发生。试剂(或液滴或珠)也可以在穿插有反应或操作步骤的操作处装载。例如，可以将包含用于使多核苷酸片段化的试剂(例如，限制性酶)和/或其他酶(例如，转座酶、连接酶、聚合酶等)的液滴或珠装载到孔或多个孔中，接着是包含用于将核酸条形码分子附着到样品核酸分子的试剂的液滴或珠的装载。试剂可以与样品如细胞或核(例如，被固定细胞/核或去固定细胞/核)或细胞组分(例如，细胞器、蛋白质、核酸分子、碳水化合物、脂质等)同时或序贯提供。因此，孔的使用在进行多步操作或反应中可能是有用的。
如本文中别处所述，核酸条形码分子和其他试剂可以包含在珠或液滴内。这些珠或液滴可以在细胞或核(例如，被固定细胞/核或去固定细胞/核)的装载之前、之后或同时装载到隔室(例如，微孔)中，使得每个细胞或核与不同的珠或液滴接触。这种技术可以用于向从每个细胞或核(例如，被固定细胞/核或去固定细胞/核)获得的核酸分子附着独特的核酸条形码分子。或者或另外，样品核酸分子可以附着到支持物。例如，隔室(例如，微孔)可以包含珠，其具有与之联接的多个核酸条形码分子。样品核酸分子或其衍生物可以联接或附着到支持物上的核酸条形码分子。然后可以将所得加有条形码的核酸分子从隔室取出，并且在一些情况下，合并并测序。在这样的情况下，核酸条形码序列可以用于跟踪样品核酸分子的起源。例如，具有相同条形码的多核苷酸可以确定为源自同一细胞/核或隔室，而具有不同条形码的多核苷酸可以确定为源自不同的细胞/核或隔室。
可以使用各种各样的方法将样品或试剂装载到孔或微孔中。可以使用外力例如重力、电力、磁力或使用将样品或试剂驱动到孔中的机制例如经由压力驱动的流动、离心、光电子学、声学装载、电动泵送、真空、毛细管流动等，来将样品(例如，细胞、核或细胞组分)或试剂(如本文所述)装载到孔或微孔中。在某些情况下，可以使用流体处理系统来将样品或试剂装载到孔中。样品或试剂的装载可以遵循泊松分布或非泊松分布，例如超泊松或亚泊松的。可以修改微孔的几何形状、孔之间的间距、密度和大小以适应有用的样品或试剂分布；例如，可以调节微孔的大小和间距，使得样品或试剂可以以超泊松方式分布。
在一个特别的非限制性实例中，微孔阵列或板包括微孔对，其中每对微孔配置为容纳液滴(例如，包含单个细胞或核，例如单个被固定细胞/核或单个去固定细胞/核)和单个珠(如本文描述的那些，在一些情况下，其也可以提供或包封在液滴中)。液滴和珠(或含有珠的液滴)可以同时或序贯装载，并且例如在液滴和珠接触时或在施加刺激(例如，外力、搅动、热、光、磁力或电力等)时，液滴和珠可以融合。在一些情况下，液滴和珠的装载是超泊松的。在微孔对的其他实例中，孔配置为容纳包含不同试剂和/或样品的两个液滴，其在接触时或在施加刺激时融合。在这样的情况下，该对中的一个微孔的液滴可包含可以与该对中的另一个微孔的液滴中的剂反应的试剂。例如，一个液滴可包含配置为释放位于相邻微孔中的另一个液滴中包含的珠的核酸条形码分子的试剂。在液滴融合时，核酸条形码分子可以从珠释放到隔室(例如，微孔或处于接触的微孔对)中，并且可以进行进一步加工(例如，加条形码、核酸反应等)。在将细胞或核(例如，被固定细胞/核或去固定细胞/核)装载到微孔中的情况下，液滴之一可以包含用于进一步加工的试剂，例如用于在液滴融合时裂解细胞或核的裂解试剂。
液滴可以被分隔到孔中。在装载到孔中之前，可以选择液滴或使其经受预加工。例如，液滴可以包含细胞或核，例如被固定细胞/核或去固定细胞/核，并且仅可以选择某些液滴，如含有单个细胞或核(或至少一个细胞/核)的那些，用于孔的装载中。这样的预选择过程可以用于单个细胞或核的高效装载，如以获得非泊松分布，或在孔中进一步分隔之前就所选特性预过滤细胞或核。另外，该技术可以用于在微孔的装载之前或期间获得或防止细胞/核二重体(doublet)或多重体(multiplet)形成。
在一些情况下，孔可包含附着到其的核酸条形码分子。核酸条形码分子可以附着到孔的表面(例如，孔的壁)。一个孔的核酸条形码分子(例如，隔室条形码序列)可以不同于另一个孔的核酸条形码分子，这可允许单个隔室或孔内所含内容物的鉴定。在一些情况下，核酸条形码分子可包含空间条形码序列，其可鉴定孔例如在孔阵列或孔板内的空间坐标。在一些情况下，核酸条形码分子可包含用于单独的分子鉴定的独特分子标识符。在一些情况下，核酸条形码分子可以配置为附着到或捕获分布在孔中的样品或细胞或核(例如，被固定细胞/核或去固定细胞/核)内的核酸分子。例如，核酸条形码分子可以包含捕获序列，其可以用于捕获样品内的核酸分子(例如，RNA、DNA)或者与样品内的核酸分子(例如，RNA、DNA)杂交。在一些情况下，核酸条形码分子可以从微孔释放。例如，核酸条形码分子可以包含化学交联剂，其可以在施加刺激(例如，光刺激、磁刺激、化学刺激、生物刺激)时被切割。可以与样品核酸分子杂交或配置为与样品核酸分子杂交的释放的核酸条形码分子可以被收集和合并用于进一步的加工，所述加工可包括核酸加工(例如，扩增、延伸、逆转录等)和/或表征(例如，测序)。在这样的情况下，可以使用独特的隔室条形码序列来鉴定核酸分子源自于的细胞/核或隔室。
可以进行孔内样品的表征。在非限制性实例中，这样的表征可包括样品(例如，细胞/核或细胞组分)或其衍生物的成像。表征技术如显微镜检查或成像可以用于测量固定空间位置中的样品轮廓。例如，当细胞或核(例如，被固定细胞/核或去固定细胞/核)任选地与珠被分隔时，每个微孔和其中所含内容物的成像可以提供关于以下的有用信息：细胞/核二重体形成(例如，频率、空间位置等)、细胞-珠对效率、细胞活力、细胞大小、细胞形态、生物标志物(例如，表面标志物、其中的荧光标记分子等)的表达水平、细胞/核或珠装载率、细胞-珠对的数量、细胞-细胞相互作用(当两个或更多个细胞/核被共分隔时)。或者或另外，可以使用成像来表征孔中扩增产物的量。
在操作中，孔可以被同时或序贯地装载以样品和试剂。在装载细胞或核(例如，被固定细胞/核或去固定细胞/核)时，可以使孔经受洗涤，例如以从孔、微孔阵列或板去除多余的细胞。类似地，可以进行洗涤以从孔、微孔阵列或板去除多余的珠或其他试剂。另外，可以在各个隔室中使细胞或核裂解以释放细胞内组分或细胞分析物。或者，可以在各个隔室中将细胞或核固定或透化。细胞内组分或细胞分析物可以与例如在微孔的表面上的支持物联接、在固体支持物(例如，珠)上联接或者它们可以被收集用于进一步的下游加工。例如，在细胞裂解后，可以将细胞内组分或细胞分析物转移到各个液滴或其他隔室以便加条形码。或者或另外，细胞内组分或细胞分析物(例如，核酸分子)可以与包含核酸条形码分子的珠联接；随后，可以收集珠并进一步加工，例如经受核酸反应如逆转录、扩增或延伸，并且可以例如经由测序来进一步表征其上的核酸分子。或者或另外，可以在孔中对细胞内组分或细胞分析物加条形码(例如，使用包含可释放的核酸条形码分子的珠或在包含核酸条形码分子的微孔的表面上)。加有条形码的核酸分子或分析物可以在孔中进一步加工，或者加有条形码的核酸分子或分析物可以从各个隔室收集并在隔室外经受进一步加工。进一步加工可以包括核酸加工(例如，执行扩增、延伸)或表征(例如，扩增分子的荧光监测、测序)。在任何方便或有用的步骤处，可以将孔(或微孔阵列或板)密封(例如，使用油、膜、蜡等)，这使得能够储存测定或选择性引入另外的试剂。
图13示意性地示出了用于加工样品内的核酸分子的示例工作流。可以提供包括多个微孔1302的基底1300。可以包含细胞或核(例如，被固定细胞/核或去固定细胞/核)、细胞组分或分析物(例如，蛋白质和/或核酸分子)的样品1306可在多个微孔1302中与包含核酸条形码分子的多个珠1304共分隔。在过程1310期间，样品1306可以在隔室内被加工。例如，可以使细胞或核经受足以裂解细胞或核(例如，被固定细胞/核或去固定细胞/核)并释放其中所含分析物的条件。在过程1320中，珠1304可以被进一步加工。举例来说，过程1320a和1320b示意性地示出了取决于珠1304的性质的不同工作流。
在1320a中，珠包含附着到其的核酸条形码分子，并且样品核酸分子(例如，RNA、DNA)可以例如经由杂交或连接附着到核酸条形码分子。这样的附着可以在珠上发生。在过程1330中，可以收集并合并来自多个孔1302的珠1304。可以在过程1340中进行进一步加工。例如，可以进行一种或多种核酸反应，如逆转录、核酸延伸、扩增、连接、转座等。在一些情况下，衔接子序列与核酸分子或其衍生物连接，如本文中别处所述。例如，测序引物序列可以附加到核酸分子的每一端。在过程1350中，可以进行进一步的表征如测序以生成测序读段。测序读段可以产生关于各个细胞或细胞群或核(例如，被固定细胞/核或去固定细胞/核)的信息，这些信息可以以视觉或图形方式呈现，例如在图1355中。
在1320b中，珠包含可释放地附着到其的核酸条形码分子，如下所述。珠可以降解或以其他方式将核酸条形码分子释放到孔1302中；然后可以使用核酸条形码分子来对孔1302内的核酸分子加条形码。可以在隔室内或隔室外进行进一步加工。例如，可以进行一种或多种核酸反应，如逆转录、核酸延伸、扩增、连接、转座等。在一些情况下，衔接子序列与核酸分子或其衍生物连接，如本文中别处所述。例如，测序引物序列可以附加到核酸分子的每一端。在过程1350中，可以进行进一步的表征如测序以生成测序读段。测序读段可以产生关于各个细胞或细胞群或核(例如，被固定细胞/核或去固定细胞/核)的信息，这些信息可以以视觉或图形方式呈现，例如在图1355中。
计算机系统
本公开提供了被编程以实施本公开的方法的计算机系统。图14示出了被编程或以其他方式配置为控制微流体系统(例如，流体流动)、生成隔室或执行测序应用的计算机系统1401。计算机系统1401可调节本公开的各个方面，例如调节微流体结构中一个或多个通道中的流体流速，或调节聚合应用单元。计算机系统1401可以是用户的电子设备或相对于电子设备位于远程的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。
计算机系统1401包括中央处理单元(CPU，在本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)1405，其可以是单核或多核处理器，或者用于并行处理的多个处理器。计算机系统1401还包括存储器或存储器位置1410(例如，随机存取存储器、只读存储器、快闪存储器)、电子存储单元1415(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1420(例如，网络适配器)和外围设备1425，如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1410、存储单元1415、接口1420和外围设备1425通过通信总线(实线)如主板与CPU1405通信。存储单元1415可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统1401可以在通信接口1420的帮助下可操作地联接到计算机网络(“网络”)1430。网络1430可以是互联网、内联网和/或外联网，或与互联网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络1430为电信和/或数据网络。网络1430可包括一个或多个计算机服务器，其可实现分布式计算，如云计算。在一些情况下，在计算机系统1401的帮助下，网络1430可实施点对点网络，其可以使得联接到计算机系统1401的设备能够充当客户端或服务器。
CPU 1405可执行一系列机器可读指令，这些指令可在程序或软件中体现。指令可被存储在存储器位置中，如存储器1410。指令可针对CPU 1405，其随后可编程或以其他方式配置CPU 1405以实施本公开的方法。由CPU 1405执行的操作的实例可包括提取、解码、执行和写回。
CPU 1405可以是电路如集成电路的一部分。系统1401的一个或多个其他部件可包括在电路中。在一些情况下，电路为专用集成电路(ASIC)。
存储单元1415可存储文件，如驱动程序、库和保存的程序。存储单元1415可存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统1401可包括位于计算机系统1401外部的一个或多个附加的数据存储单元，如位于通过内联网或互联网与计算机系统1401通信的远程服务器上。
计算机系统1401可通过网络1430与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1401可与用户(例如，操作者)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、板式或平板电脑(例如，
Figure BDA0004001092240000941
iPad、
Figure BDA0004001092240000942
GalaxyTab)、电话、智能电话(例如，
Figure BDA0004001092240000943
iPhone、支持Android的设备、
Figure BDA0004001092240000944
)或个人数字助理。用户可经由网络1430访问计算机系统1401。
如本文所述的方法可通过存储在计算机系统1401的电子存储位置上(例如，存储在存储器1410或电子存储单元1415上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实施。机器可执行或机器可读代码可以软件的形式提供。在使用期间，代码可由处理器1405执行。在一些情况下，可从存储单元1415检索代码并存储在存储器1410上以供处理器1405随时访问。在一些情况下，可排除电子存储单元1415，并且机器可执行指令存储在存储器1410上。
代码可预编译并配置为用于具有适于执行该代码的处理器的机器，或者可在运行时间期间编译。代码可以编程语言提供，编程语言可选择为使得代码能够以预编译或如所编译的方式执行。
本文提供的系统和方法的各方面，如计算机系统1401，可在编程中体现。这项技术的各个方面可以被认为是“产品”或“制造物品”，通常呈在一种类型的机器可读介质上携带或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关联数据的形式。机器可执行代码可存储在电子存储单元如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、快闪存储器)或硬盘上。“存储”型介质可包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关联模块，如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，它们可以在任何时候为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分有时可以通过互联网或各种其他电信网络通信。这样的通信例如可以使得能够将软件从一个计算机或处理器装载至另一个计算机或处理器，例如从管理服务器或主机装载至应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一类型介质包括光波、电波和电磁波，如通过有线和光学固定电话网络以及经各种空中链路跨越本地设备之间的物理接口使用的。携带此类波的物理元件，如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用，除非限于非暂时性有形“存储”介质，否则术语如计算机或机器“可读介质”是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，计算机可读介质如计算机可执行代码可以采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，如任何计算机等中的任何存储设备，如可用于实施附图中所示的数据库等的。易失性存储介质包括动态存储器，如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜丝和光纤，包括包含计算机系统内的总线的电线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号的形式，或者声波或光波的形式，如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储芯片或存储卡、载波输送数据或指令、输送这样的载波的电缆或链路、或计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。计算机可读介质的这些形式中的许多可以参与将一个或多个指令的一个或多个序列携带至处理器以供执行。
计算机系统1401可包括电子显示器1435或与其通信，该电子显示器包括用户界面(UI)1440，该用户界面用于提供例如测序分析的结果。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。
本公开的方法和系统可通过一种或多种算法实施。算法可在由中央处理单元1405执行后通过软件实施。算法可例如进行测序、分析序列读段或将序列读段确定为属于特定生物颗粒。
本公开的装置、系统、组合物和方法可以用于各种应用，例如加工来自单个细胞或核的单个分析物(例如，RNA、DNA或蛋白质)或多个分析物(例如，DNA和RNA、DNA和蛋白质、RNA和蛋白质、或RNA、DNA和蛋白质)。例如，将生物颗粒(例如，细胞、核或细胞珠)分隔在隔室(例如，液滴)中，并对来自生物颗粒的多个分析物进行加工以供后续加工。所述多个分析物可以来自单个细胞或核。这可以使得例如能够对细胞或核进行同时的蛋白质组学、转录组学和基因组学分析。
实施方案
在以下编号的段落中描述了本发明的实施方案，其并不意味着限制。
1.一种用于加工核酸分子的方法，所述方法包括：
a)提供隔室，所述隔室包含：(i)包含有包含核酸序列的核酸分子的被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒和(ii)核酸条形码分子；
b)使所述隔室经受足以生成与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的核酸分子的条件；
c)从所述隔室释放与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的所述核酸分子以生成与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的释放的核酸分子；以及
d)使与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的所述释放的核酸分子经受足以使用所述核酸序列作为模板延伸所述核酸条形码分子(例如，所述核酸条形码分子的3’末端)以生成加有条形码的核酸分子的条件。
2.段落1的方法，其中所述核酸分子为交联的核酸分子。
3.段落2的方法，其中b)包括(i)从所述交联的核酸分子生成未连接的核酸分子，和(ii)让所述未连接的核酸分子与所述核酸条形码分子联接。
4.段落1的方法，其中所述隔室还包含切割剂。
5.段落4的方法，其中所述切割剂为蛋白酶。
6.段落5的方法，其中所述蛋白酶选自蛋白质酶K和枯草杆菌蛋白酶A。
7.段落4的方法，其中所述切割剂为催化剂。
8.段落4的方法，其中所述切割剂破坏由固定剂生成的键。
9.段落1的方法，其中b)包括加热所述隔室。
10.段落9的方法，其中b)包括使所述隔室经受53℃的温度达45分钟并然后经受70℃的温度达15分钟。
11.段落10的方法，其中b)还包括使所述隔室经受90℃的温度达10分钟。
12.段落1的方法，其还包括在b)之后并在c)之前冷却所述隔室或让所述隔室冷却。
13.段落1的方法，其中d)在蛋白酶抑制剂的存在下进行。
14.段落1的方法，其中d)包括使用逆转录酶来延伸所述核酸条形码分子(例如，所述核酸分子条形码分子的3’末端)。
15.段落14的方法，其中所述逆转录酶包含RNA酶活性。
16.段落1的方法，其中所述核酸条形码分子包含配置为退火至所述被固定生物颗粒或所述被固定膜结合颗粒的核酸分子的捕获序列。
17.段落16的方法，其中所述捕获序列为poly-T序列。
18.段落1的方法，其中所述核酸条形码分子包含独特的分子标识符序列(UMI)或配置为允许附着到流动池的序列。
19.段落1的方法，其还包括将另外的序列附加到所述加有条形码的核酸分子。
20.段落19的方法，其中所述另外的序列为poly-C序列。
21.段落19的方法，其中所述附加通过连接酶或聚合酶进行。
22.段落21的方法，其中所述聚合酶为逆转录酶。
23.段落19的方法，其中所述附加包括使用夹板核酸分子。
24.段落19的方法，其中所述附加包括使用引物来退火至所述加有条形码的核酸分子。
25.段落19的方法，其中所述隔室还包含模板转换寡核苷酸(TSO)。
26.段落25的方法，其还包括使所述隔室经受足以使所述TSO与所述另外的序列杂交的条件。
27.段落25的方法，其还包括延伸所述加有条形码的核酸分子以生成包含与所述TSO互补的序列的延伸的加有条形码的核酸分子。
28.段落27的方法，其中所述TSO包含测序引物序列或其补体。
29.段落1的方法，其中所述核酸条形码分子联接到支持物。
30.段落29的方法，其中所述支持物为珠。
31.段落30的方法，其中所述珠为凝胶珠。
32.段落29的方法，其中所述核酸条形码分子通过不稳定部分联接到所述支持物。
33.段落1的方法，其中所述隔室为液滴或孔。
34.段落33的方法，其中所述释放包括破坏所述液滴。
35.段落2的方法，其中所述交联的核酸分子包含核糖核酸(RNA)分子。
36.段落35的方法，其中所述RNA分子为信使RNA(mRNA)分子。
37.段落1的方法，其还包括(e)对所述加有条形码的核酸分子或其扩增产物测序。
38.段落1的方法，其还包括提供多个隔室。
39.段落38的方法，其还包括在a)之前将多个被固定生物颗粒或多个被固定膜结合颗粒分隔到多个隔室中。
40.段落38的方法，其中在b)之后并在c)之前，所述多个隔室包含与核酸条形码分子联接的多个核酸分子。
41.段落40的方法，其还包括在c)之后从所述多个隔室合并与所述核酸条形码分子联接的所述多个核酸分子。
42.段落1的方法，其还包括在a)之前固定生物颗粒或膜结合颗粒以生成所述被固定生物颗粒或所述被固定膜结合颗粒。
43.段落42的方法，其中所述固定包括使用固定剂。
44.段落43的方法，其中所述固定剂包含多聚甲醛。
45.段落1的方法，其中所述被固定生物颗粒或所述被固定膜结合颗粒包含细胞、核、病毒或核。
46.一种组合物，所述组合物包含逆转录酶(RT)、蛋白酶和聚乙二醇(PEG)。
47.段落46的组合物，其包含能够被RT使用以合成互补DNA链的核酸模板。
48.段落47的组合物，其中所述核酸模板包括核糖核酸(RNA)。
49.段落48的组合物，其中所述核酸模板来自细胞或核。
50.段落49的组合物，其中所述细胞或核是被固定的并且至少部分被去固定。
51.段落50的组合物，其中所述蛋白酶能够对所述被固定细胞或核中的生物分子去固定或能够促成所述被固定细胞或核中的生物分子的去固定。
52.段落47-51中任一项的组合物，其包含能够被RT使用以启动互补DNA链的第一链合成的第一引物。
53.段落47-52中任一项的组合物，其包含脱氧核糖核苷酸(dNTP)和镁离子(Mg2+)或锰离子(Mn2+)。
54.段落53的组合物，其包含TS寡核苷酸(TSO)。
55.段落54的组合物，其中所述RT能够使用TSO作为模板来合成比在无TSO的情况下合成的互补DNA链长的DNA链。
56.段落46-55中任一项的组合物，其中所述RT为或衍生自禽成髓细胞瘤病毒(AMV)RT或莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)RT。
57.段落46-55中任一项的组合物，其中所述RT包括禽成髓细胞瘤病毒(AMV)RT或莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)RT的变体。
58.段落46-57中任一项的组合物，其中所述RT具有模板转换(TS)活性。
59.段落46-58中任一项的组合物，其中所述RT具有末端转移酶活性。
60.段落46-59中任一项的组合物，其中所述PEG包含平均分子量在约1,000-16,000g/mol；2,000-14,000g/mol；3,000-12,000g/mol；4,000-10,000g/mol；或5,000-9,000g/mol之间的低聚物或聚合物。
61.段落46-60中任一项的组合物，其中所述组合物中PEG的最终浓度在约1-12％、2-11％、3-10％或4-8％之间。
62.段落53或54中之一的组合物，其中所述组合物中由RT合成的DNA的量大于不包含PEG的等同组合物中由RT合成的DNA的量。
63.段落53或54中之一的组合物，其中所述组合物包含能够被RT使用以启动第二链DNA合成的第二引物。
64.段落46-63中任一项的组合物，其中所述PEG附着到RT。
65.一种方法，所述方法包括在包含逆转录酶(RT)、核酸模板、蛋白酶和聚乙二醇(PEG)的组合物中合成互补单链DNA。
66.段落65的方法，其中所述组合物另外还包含用于启动互补单链DNA的第一链合成的第一引物。
67.段落66的方法，其中所述组合物包含脱氧核糖核苷酸(dNTP)和镁离子(Mg2+)或锰离子(Mn2+)。
68.段落67的方法，其中所述RT具有模板转换(TS)活性。
69.段落68的方法，其中所述组合物另外还包含TS寡核苷酸(TSO)。
70.段落69的方法，其中合成的互补单链DNA中的至少一些比在不存在TSO的情况下合成的互补单链DNA长。
71.段落67-70中任一项的方法，其中所述组合物包含能够被RT使用以启动第二链DNA合成的第二引物。
72.段落67-71中任一项的方法，其中所述互补单链DNA合成和/或所述第二链DNA合成在离散液滴中进行，其中所述液滴任选地包含单个细胞、核和/或来自单个细胞或核的生物分子。
73.段落65-72中任一项的方法，其中所述核酸模板包括核糖核酸(RNA)。
74.段落73的方法，其中所述RNA来自已被去固定或部分去固定的被固定细胞或核或者是已被去固定或部分去固定的被固定细胞或核的一部分。
75.段落74的方法，其中所述蛋白酶能够对所述被固定细胞或核去固定或能够促成所述被固定细胞或核的去固定。
76.段落65-75中任一项的方法，其中所述PEG包含平均分子量在约1,000-16,000g/mol；2,000-14,000g/mol；3,000-12,000g/mol；4,000-10,000g/mol；或5,000-9,000g/mol之间的低聚物或聚合物。
77.段落65-76中任一项的方法，其中所述组合物中PEG的最终浓度在约1-12％、2-11％、3-10％或4-8％之间。
78.段落65-77中任一项的方法，其中所述PEG附着到RT。
79.一种方法，所述方法包括：
(a)使用去固定剂对被固定细胞、核或组织去固定或部分去固定；以及
(b)在聚乙二醇(PEG)的存在下使用来自去固定/部分去固定细胞、核或组织的核酸模板和逆转录酶(RT)合成互补单链DNA。
80.段落79的方法，其中所述去固定剂能够去除细胞或核中通过用醛(例如，多聚甲醛、戊二醛)、NHS酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合固定而在生物分子中形成的交联。
81.段落79的方法，其中所述去固定剂能够去除通过用多聚甲醛固定而在生物分子中形成的交联；任选地，用浓度为1％-4％PFA的PF溶液固定而在生物分子中形成的交联。
82.段落79-81中任一项的方法，其中所述去固定剂具有蛋白酶活性。
83.段落79-82中任一项的方法，其中所述去固定剂包括选自蛋白质酶K和枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶。
84.段落79-83中任一项的方法，其中所述PEG包含平均分子量在约1,000-16,000g/mol；2,000-14,000g/mol；3,000-12,000g/mol；4,000-10,000g/mol；或5,000-9,000g/mol之间的低聚物或聚合物。
85.段落79-84中任一项的方法，其中步骤(b)中PEG的最终浓度在约1-12％、2-11％、3-10％或4-8％之间。
86.段落79-85中任一项的方法，其中步骤(a)在聚乙二醇(PEG)的存在下进行。
87.段落86的方法，其中步骤(a)中所述PEG包含平均分子量在约1,000-16,000g/mol；2,000-14,000g/mol；3,000-12,000g/mol；4,000-10,000g/mol；或5,000-9,000g/mol之间的低聚物或聚合物。
88.段落86或87中之一的方法，其中步骤(a)中PEG的最终浓度在约1-12％、2-11％、3-10％或4-8％之间。
89.段落79-88中任一项的方法，其中步骤(b)在蛋白酶活性的存在下进行。
90.段落79-89中任一项的方法，其包括在步骤(a)之前用固定剂固定细胞或核。
91.段落90的方法，其中所述固定剂选自醛(例如，多聚甲醛、戊二醛)、NHS酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合。
92.段落90的方法，其中所述固定试剂包括多聚甲醛(“PFA”)；任选地，所述固定试剂是浓度为1％-4％PFA的PFA溶液。
93.段落79-92中任一项的方法，其包括在步骤(b)之后使用互补单链DNA作为模板来合成第二链DNA。
94.段落79-93中任一项的方法，其中在步骤(b)中所述PEG附着到RT。
95.一种试剂盒，所述试剂盒包含逆转录酶(RT)和聚乙二醇(PEG)。
96.段落95的试剂盒，其另外还包含去固定剂，所述去固定剂包括蛋白酶。
97.段落96的试剂盒，其另外还包含固定剂。
98.段落95-97中任一项的试剂盒，其中所述PEG附着到RT。
99.一种方法，所述方法包括对已经用固定剂固定的细胞、核或组织去固定，其中所述去固定在聚乙二醇(PEG)的存在下使用去固定剂进行。
100.段落99的方法，其中所述固定剂选自醛(例如，多聚甲醛、戊二醛)、NHS酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合。
101.段落99的方法，其中所述固定试剂包括多聚甲醛(“PFA”)；任选地，所述固定试剂是浓度为1％-4％PFA的PFA溶液。
102.段落99-101中任一项的方法，其中所述去固定剂能够去除细胞或核中通过用醛(例如，多聚甲醛、戊二醛)、NHS酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合固定而在生物分子中形成的交联。
103.段落99-101中任一项的方法，其中所述去固定剂能够去除通过用多聚甲醛固定而在生物分子中形成的交联；任选地，用浓度为1％-4％PFA的PF溶液固定而在生物分子中形成的交联。
104.段落99-103中任一项的方法，其中所述去固定剂具有蛋白酶活性。
105.段落99-104中任一项的方法，其中所述去固定剂包括蛋白质酶K和/或枯草杆菌蛋白酶。
106.段落99-105中任一项的方法，其包括使用来自去固定细胞或核的生物分子作为酶促反应中的底物或模板的附加步骤。
107.段落106的方法，其中使用来自去固定细胞或核的核酸作为DNA合成反应中的模板。
108.段落107的方法，其中所述核酸包括核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。
109.段落107-108中任一项的方法，其中在所述酶促反应中使用的酶包括DNA聚合酶、逆转录酶(RT)或RNA聚合酶。
110.段落99-105中任一项的方法，其包括从去固定细胞或核分离出核酸的附加步骤。
111.一种方法，所述方法包括：
(a)用固定剂固定细胞或核以交联所述细胞或核中的生物分子；和
(b)在聚乙二醇(PEG)的存在下用去固定剂对被固定细胞或核去固定以去除生物分子中的至少一些交联。
112.段落111的方法，其中所述固定剂选自醛(例如，多聚甲醛、戊二醛)、NHS酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合。
113.段落111的方法，其中所述固定试剂包括多聚甲醛(“PFA”)；任选地，所述固定试剂是浓度为1％-4％PFA的PFA溶液。
114.段落111-113中任一项的方法，其中所述去固定剂能够去除细胞或核中通过用醛(例如，多聚甲醛、戊二醛)、NHS酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合固定而在生物分子中形成的交联。
115.段落111-113中任一项的方法，其中所述去固定剂能够去除通过用多聚甲醛固定而在生物分子中形成的交联；任选地，用浓度为1％-4％PFA的PF溶液固定而在生物分子中形成的交联。
116.段落111-115中任一项的方法，其中所述去固定剂具有蛋白酶活性。
117.段落111-116中任一项的方法，其中所述去固定剂包括蛋白质酶K和/或枯草杆菌蛋白酶。
118.段落111-117中任一项的方法，其包括从去固定细胞或核分离出核酸的附加步骤(c)。
119.段落118的方法，其中所述核酸包括核糖核酸(RNA)。
120.段落119的方法，其中分离出的RNA的量大于其中在无PEG的情况下进行步骤(b)时从等同数量的被固定细胞或核分离出的RNA的量。
121.一种组合物，所述组合物包含多个隔室，其中所述多个隔室的隔室包含逆转录酶(RT)、蛋白酶和聚乙二醇(PEG)。
122.段落121的组合物，其中所述多个隔室为多个液滴或多个孔。
123.段落121的组合物，其中所述隔室还包含核酸模板分子。
124.段落123的组合物，其中所述核酸模板分子包含RNA。
125.段落123的组合物，其中所述核酸模板衍生自细胞或核。
126.段落125的组合物，其中所述细胞为被固定细胞或所述核为被固定核。
虽然本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员将显而易见的是这样的实施方案仅以举例的方式提供。本发明并不旨在受说明书内提供的具体实例的限制。虽然已参照前述说明书描述了本发明，但本文中实施方案的描述和说明并不意在在限制性意义上解释。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变型、改变和替换。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的具体描绘、配置或相对比例，其将取决于各种条件和变量。应理解，在实践本发明时可以采用对本文描述的本发明实施方案的各种替代方案。因此预期本发明还应涵盖任何这样的替代、修改、变型或等同物。附随的权利要求旨在限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物由此被涵盖。
实施例
以下实施例用于说明各种实施方案并且不应解释为限制。
实施例1：对衍生自被固定膜结合颗粒的核酸分子加条形码
使用膜结合颗粒，这里为新鲜(未固定)或被多聚甲醛固定(4％)的Jurkat细胞。
使用新鲜的Jurkat细胞作为阳性对照。使用10x Genomics 3’RNA-seq GeneExpression(3’v3 GEX)将新鲜的Jurkat细胞(在这些实施例中有时称为样品“SOP”)加工为在液滴中的单个细胞。
将被固定膜结合颗粒重悬浮在具有切割剂的反应混合物中。在各种实施例中，使用蛋白酶(例如，蛋白质酶K，或CAP，即枯草杆菌蛋白酶A)，使用催化剂，或使用蛋白酶和催化剂。将被固定膜结合颗粒、切割剂和附着到支持物(珠)的核酸条形码分子共分隔到隔室中。然后加热隔室，并且活化切割剂。将隔室加热至53℃达45分钟，然后加热至70℃达15分钟。
已经受切割剂的核酸分子被去交联，使得核酸分子可与核酸条形码分子退火。特别地，核酸条形码分子包含poly-T尾并可特异性地捕获细胞中的mRNA。核酸条形码分子包含读段1序列、条形码序列、UMI序列和用于捕获被固定膜结合颗粒的核酸分子的捕获序列(poly-T)。每个隔室中的条形码序列是不同的并用于将核酸分子鉴定为属于特定隔室。由所述方法生成的加有条形码的核酸分子包含指示单个细胞的条形码和衍生自mRNA的cDNA序列。当批量合并和测序时，可对属于特定隔室的cDNA序列分组并阐明单个被固定细胞的转录谱。
为了进行上述操作，将隔室冷却至25℃，使得退火的核酸分子保持退火。然后通过破坏隔室来从隔室释放核酸分子。
在核酸分子从隔室释放后，延伸核酸分子以生成加有条形码的核酸分子。
这里，对本体溶液中的核酸条形码分子进行延伸反应。延伸反应在模板转换寡核苷酸(TSO)的存在下用模板转换逆转录酶进行。该反应在53℃下进行45分钟，随后加热至85℃达15分钟。
在另一个可能的示例加工(未在本实施例中使用)中，使用包含RNA酶活性的逆转录酶并在无模板转换的情况下使来自隔室的释放的核酸分子经受逆转录反应。与和模板转换逆转录相结合使用TSO相反，可以使用连接反应。可以使用App连接酶和5′App TSO寡核苷酸来连接TSO序列，特异性由App连接酶对特定底物的特异性决定。该反应可以在65℃下进行18小时。或者，可以使用5’P TSO和5’反向补体TSO(rcTSO)-8N寡核苷酸夹板来进行使用连接酶(如T4连接酶)的夹板连接。夹板可以退火至TSO，而8N可以退火至感兴趣的核酸分子的序列。在于25℃温育1小时、随后于90℃温育10分钟后，可以将感兴趣的核酸分子与TSO连接于一起。
在使核酸条形码分子序列经受延伸反应之后，使用引物来延伸互补链。使用5’rcTSO-6N引物并于25℃温育45分钟，随后于90℃温育10分钟，以生成互补链。
然后使生成的加有条形码的核酸分子经受清理和扩增反应，并然后测序以生成序列读段。
在本实施例中进行的工作中，跨每个完整样品折叠单细胞UMI谱(UMI profile)以生成所检测的每个基因的拟混池谱(pseudo-bulk profile)。通过在x-轴上绘制一种条件并在y-轴上绘制另一种条件，将一种条件(即，新鲜细胞、使用不同切割剂去固定的被固定细胞)的拟混池谱与另一种条件进行比较。通过这些点绘制一条线并确定R2以关联通过两种比较方法获得的结果。从示例研究获得的R2值如下所示：
蛋白质酶K蛋白酶+催化剂对新鲜细胞，R2＝0.59；
CAP蛋白酶+催化剂对新鲜细胞，R2＝0.44；和
CAP蛋白酶+催化剂对蛋白质酶K+催化剂，R2＝0.966。
这些数据表明，使用本文公开的方法，可从去固定的单个细胞获得单细胞基因表达序列数据。在此实施例中，单个细胞在隔室中去固定，并批量进行延伸/扩增反应。
在另一分析中，比较了在上述各种条件下获得的单细胞文库。这些数据在图15A、15B和15C中示出。
图15A比较了在由新鲜细胞(示出为“SOP”)、使用蛋白质酶K蛋白酶+催化剂去固定的细胞以及使用冷活性蛋白酶(CAP)+催化剂去固定的细胞制备的文库中存在的有效条形码的相对数量。同样，图15B比较了在这些不同的文库中存在的可用读段的分数。图15C比较了细胞中读段的分数。尽管去固定细胞的这些文库质量度量指标低于由新鲜细胞制备的文库，但数据证实，使用这里公开的条件可从被固定并去固定的单个细胞获得读段。
在文库的另一分析中，在从去固定细胞获得的文库中基因和UMI的复杂性低于从新鲜细胞获得的文库的复杂性。然而，数据证实，可从去固定的单个细胞获得这样的数据。
实施例2：使用去固定剂的各种组合在GEM中加工的去固定细胞的分析
将被固定细胞去交联/去固定并然后使用Chromium Single Cell 3’v3方案和试剂(10x Genomics，Inc.)进行加工。如下表2中所汇总，测试了用于在GEM中逆转PFA固定的若干不同条件。使用Pearson相关系数，将在各种条件下的去固定数据与从未固定的新鲜细胞获得的数据相关联。
Figure BDA0004001092240001081
对于阴性对照，类似地加工新鲜的未固定的Jurkat细胞以逆转固定，如表2中。
将细胞(固定且去固定；未固定对照)、试剂、10x Genomics 3’凝胶珠(含有核酸条形码分子)共分隔到GEM中。然后加热GEM以活化用于逆转固定的试剂。将GEM加热至53℃达45分钟，然后加热至70℃达15分钟。将GEM冷却至25℃，使得退火的核酸分子可以保持退火。破坏乳液，并合并内容物以批量逆转录。分析所得文库。
基于单细胞UMI谱和作为样品之间基因表达计数的Pearson相关性(R2)计算的基因表达相关性，证实了在GEM中去交联然后进行批量逆转录的可行性。
另外，进行类似于实施例1中所述的研究以确定从单独由蛋白酶去固定的被固定细胞获得的单细胞文库的性质，与从由蛋白酶和催化剂的组合去固定的被固定细胞获得的文库相比。这些数据在图16A、16B和16C中示出。
图16A比较了在从由蛋白质酶K蛋白酶(PK)、PK与催化剂的组合、冷活性蛋白酶(CAP)或CAP与催化剂的组合去固定的细胞制备的文库中存在的有效条形码的相对数量。同样，图16B比较了在这些不同的文库中存在的可用读段的分数。图16C比较了细胞中读段的分数。数据显示，与从单独由蛋白酶去固定的细胞获得的文库相比，从由蛋白酶与催化剂的组合去固定的细胞获得的文库的至少一些参数得到改善。然而，数据显示，在所有条件(蛋白酶、蛋白酶+催化剂)下，都从在隔室中去固定的单个细胞获得了序列。
除了本研究之外，在查看来自单个基因GRCh38的读段时，当细胞分别用蛋白质酶K+催化剂或冷活性蛋白酶+催化剂去固定时，在从用蛋白质酶K或冷活性蛋白酶去固定的细胞获得的文库中确信映射到转录物的读段数显著增加。
实施例3：聚乙二醇增加蛋白酶存在下的逆转录酶活性
由于可以使用来自去固定细胞的RNA作为逆转录酶(RT)反应的模板，并由于在一些细胞去固定反应中使用蛋白酶，故测试了在两种不同的去固定蛋白酶的存在下的RT活性。通常，发现蛋白酶降低RT活性。测试了不同的物质逆转蛋白酶对RT活性的影响的能力。在已知的多聚腺苷酸化RNA模板、寡核苷酸dT引物和模板转换寡核苷酸(TSO)的存在下进行第一链RT反应。逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶变体42B(美国专利申请公开号2018/0312822，通过引用并入本文)。反应在既允许全长第一链DNA合成又允许通过使用TSO作为模板来延伸第一链的3’末端的长度以产生比全长第一链DNA合成产物长的DNA链的DNA合成的条件下进行。在反应进行45或90分钟之后，停止反应，通过毛细管电泳(CE)分离输入和反应产物并从峰确定产生的全长和全长+TSO(通常仅称为“TSO”)第一链的量(参见下一段之后的图)。
更详细地，反应在20μl反应体积中进行，其包含引物、模板、TSO、RT酶、水和GEM-U试剂，并在热循环仪上运行，起始温度25℃，53℃达45分钟，85℃达5分钟，然后保持在4℃下。将反应产物在含有1∶20 GS 120Liz Size Standard和18∶20HiDi甲酰胺的甲酰胺标准混合物中按1∶20稀释，然后加热以于95℃保持5分钟并于4℃保持2分钟，之后装载到Applied BiosystemsSeqStudioTM上并使用标准设置运行片段分析程序。图17中示出了一种示例输出。如图17中所示，将迹线中显示的峰下面积指定为1(不完整)、2(伸长加拖尾)、3(不完整的TSO)和4(完整的TSO)。
使用如上所述的面积，通过将全长和TSO峰产物的面积除以产物的总面积来计算转录效率。转录＝面积(2+3+4)/面积(1+2+3+4)。
通过将TSO峰面积除以总的产物面积来计算TSO效率。TSO效率＝面积4/面积(1+2+3+4)。
反应中使用的核苷酸序列如下：引物：/56-FAM/CGA CTC ACT GAC ACT CGC(SEQID NO：1)；模板，82bp，GC含量56.1％：rArCrG rArCrC rGrUrC rGrUrC rArUrG rUrArGrCrGrU rUrUrG rUrCrG rGrArG rArCrU rCrCrU rArGrA rUrCrA rGrArU rGrUrC rCrUrCrCrUrG rGrCrU rArCrU rGrCrA rCrGrC rGrArG rUrGrU rCrArG rUrGrA rGrUrC rG(SEQID NO 2)；TSO：AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CAT rGrGrG(SEQ ID NO：3)。
GEM-U试剂含有8％(v/v)的甘油、50mM的Tris pH 8.0、4.22mM的Tris pH 7.5、8.44mM的氯化钠、3mM的氯化镁、75mM的氯化钾、0.5％(w/v)的Synperonic F108、0.16mM的dNTP、399ug/mL的BSA、20.8mM的DTT、0.086x酶贮存缓冲液、0.008％(v/v)的Triton-X＝100、0.084mM的EDTA、0.11％(w/v)的DBDM和0.5％(w/v)的聚丙烯酰胺。
图18A、18B和18C示出了来自各种RT反应的示例CE迹线。示出了输入引物、全长第一链RT产物和TSO产物的分离的峰。每个峰的高度指示峰中每种物质的相对量。图18A示出了如上所述的标准逆转录酶反应的结果。图18B示出了如上所述的示例RT反应的结果，其中反应混合物另外还含有蛋白质酶K。数据显示，与图18A相比，蛋白质酶K的此添加显著抑制产物的RT合成，该RT合成使用TSO来产生延伸的第一链。图18C示出了一种示例RT反应，其中除蛋白质酶K外，在反应混合物中还添加了聚乙二醇(PEG)6000至8％的最终浓度。如与图18B相比，这些数据显示，与图18C中的全长产物相比，延伸长度的TSO产物的量增加。这些数据显示，蛋白质酶K降低TSO产物的RT合成，而PEG的添加部分地逆转对TSO产物的合成的抑制。
进行额外的研究以检查PEG和其他物质减少或防止在各种蛋白酶的存在下RT活性的降低的能力。进行RT反应以测试另外的蛋白酶枯草杆菌蛋白酶A对RT的影响并测试枯草杆菌蛋白酶A和蛋白质酶K对RT的有害影响是否可被PEG或被广谱蛋白酶抑制剂逆转。如上所述进行反应并通过CE分析。将每个反应的CE结果绘制在曲线图上，如图19中所示。全长第一链产物(在图19中表示为转录效率；对于图中的每个反应样品，左条)和延伸长度的TSO第一链产物(在图19中表示为TSO效率；对于图中的每个反应样品，右条)的相对量。所有反应进行45或90分钟。如上所述，所有反应都含有模板、引物和逆转录酶。向反应的其他添加物和反应的条件如下：
(A)无添加物，45分钟；
(B)枯草杆菌蛋白酶A，45分钟；
(C)枯草杆菌蛋白酶A和PEG 6000(最终浓度8％)；45分钟；
(D)枯草杆菌蛋白酶A、PEG 6000(最终浓度8％)和蛋白酶抑制剂；45分钟；
(E)无添加物，90分钟；
(F)蛋白质酶K；45分钟；
(G)蛋白质酶K；90分钟；
(H)蛋白质酶K和蛋白酶抑制剂；90分钟；
(I)蛋白质酶K和PEG 6000(最终浓度8％)；45分钟；
(J)蛋白质酶K、PEG 6000(最终浓度8％)和蛋白酶抑制剂；90分钟；和
(K)蛋白质酶K和PEG 6000(最终浓度4％)；45分钟。
图19的样品A、F和I分别示出了与图18A、18B和18C中示出的相似的数据。在对照反应中，RT产生全长第一链DNA和延伸长度的第一链TSO产物(样品A)。向反应中添加蛋白质酶K对全长第一链合成几乎没有影响，但显著减少延伸长度的第一链TSO产物的合成(样品F)。在反应中添加PEG 6000至8％的最终浓度拯救了一些TSO产物的合成(样品I)。添加PEG6000至4％的最终浓度拯救了TSO产物的合成至与8％PEG大致相同的程度(样品K)。
当用不同的蛋白酶-枯草杆菌蛋白酶A替换蛋白质酶K时，获得了另一个结果。这里，枯草杆菌蛋白酶A消除了RT产生延伸长度的第一链TSO产物的能力(比较样品B与样品A)，像蛋白质酶K(样品F)一样。但枯草杆菌蛋白酶A还降低了RT产生全长第一链产物的能力(样品B)。向反应中添加PEG拯救了RT产生全长产物的一些能力(样品C)，但PEG并未可检测地拯救在枯草杆菌蛋白酶A酶的存在下RT产生TSO产物的任何能力。向含有PEG的反应中添加广谱蛋白酶抑制剂(样品D)产生了与单独的PEG相同的结果。
上述反应均进行45分钟。在进行90分钟的反应中，蛋白质酶K降低了RT合成TSO产物的能力(比较样品G与样品E)。向含有蛋白质酶K的样品中添加广谱蛋白酶抑制剂(样品H)未挽救TSO活性。当向含有蛋白质酶K和蛋白酶抑制剂的反应中添加最终浓度8％的PEG6000时，RT产生TSO产物的一些能力被拯救。
使用这里描述的条件，通常约30％的全长产物被转化为TSO产物。在这些研究中，蛋白质酶K的添加将转化为TSO产物的全长产物的百分比降低到大约4％。向还含有蛋白质酶K的反应中添加PEG将转化为TSO产物的全长产物的百分比增加至大约7.5-8.0％，这在对于我们的系统足够的范围内。
实施例4：聚乙二醇增加从被固定细胞分离出的RNA的收率
由于在存在去固定蛋白酶的情况下RT反应将使用来自去固定细胞的模板RNA进行，故测试了用于最大化从被固定细胞回收RNA的各种条件。实验使用在4％的多聚甲醛中于4℃固定24小时的Jurkat细胞。24小时后，在10％的FBS-PBS中淬灭固定反应。然后使被固定细胞经受各种去固定/去交联条件(蛋白质酶K、2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂和/或(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂)并然后离心。确定离心的细胞沉淀物和来自离心的上清液中存在的RNA的量。来自这些实验的数据在图20的条形图中示出。每个样品的条的高度代表来自沉淀物和上清液的RNA的总和。在样品B、C、G、H、I、J、K和L中，在上清液中检测到RNA(来自沉淀物的“泄漏”)。对于这些样品，上清液中RNA的量示出在跨越这些条中的每一个画的线上方。在来自其中不可见跨越条的线的样品(样品D、E和F)的条中，上清液中RNA的量可忽略不计。所有去固定反应在53℃下进行45分钟。当在反应中使用单一去固定剂时，其浓度为50mM。当在反应中使用两种去固定剂时，每种的浓度为25mM。向反应中的添加物如下所示。
(A)来自新鲜细胞的RNA(阳性对照)；
(B)0.1mg蛋白质酶K(PK)/ml；
(C)0.1mg PK/ml和2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂；
(D)0.1mg PK/ml和(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂；
(E)0.1mg PK/ml、(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂和PEG 6000(最终浓度4％)；
(F)0.1mg PK/ml、(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂和PEG 6000(最终浓度8％)；
(G)0.1mg PK/ml、2-氨基-5-甲基苯甲酸和(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂；
(H)0.1mg PK/ml、2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂、(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂和PEG 6000(最终浓度4％)；
(I)0.1mg PK/ml、2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂、(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂和PEG 6000(最终浓度8％)；
(J)0.2mg PK/ml、2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂和(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂；
(K)0.2mg PK/ml、2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂、(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂和PEG 6000(最终浓度4％)；和
(L)0.2mg PK/ml、2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂、(4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂和PEG 6000(最终浓度8％)。
如样品B中所示，仅用蛋白质酶K来对细胞去固定就足以产生自等同数量的新鲜细胞所获得的60％的RNA(大部分在上清液中)(与样品A比较)。在其他实验中，先前已显示，从在不存在蛋白质酶K的情况下的去固定细胞未获得RNA。向蛋白质酶K添加2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂减少了回收的RNA的总量以及在沉淀物中回收的RNA的量(样品C)。向蛋白质酶K添加4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂增加了在离心细胞的沉淀物中回收的RNA的量(比较样品D与样品B和C)，但回收的RNA的总量较少。与单独使用蛋白质酶K和4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂相比，向蛋白质酶K和4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂添加4％(样品E)或8％(样品F)的PEG 6000既增加了回收的RNA的总量又增加了在沉淀物中回收的RNA的量(样品E和F)。
与蛋白质酶K加2-氨基-5-甲基苯甲酸(样品C)、蛋白质酶K加(4-氨基吡啶-3-基)膦酸(样品D)和在PEG的存在下蛋白质酶K加(4-氨基吡啶-3-基)膦酸(样品E和F)相比，蛋白质酶K、2-氨基-5-甲基苯甲酸和4-氨基吡啶-3-基)膦酸去固定剂的使用增加了在细胞沉淀物中回收的总RNA和RNA(样品G)。向含有蛋白质酶K、2-氨基-5-甲基苯甲酸和(4-氨基吡啶-3-基)膦酸的去固定反应中添加最终浓度4％的PEG 6000增加了总RNA和沉淀物RNA两者(样品H)。
在这种情况下最终浓度8％的PEG 6000甚至更多地增加了总RNA和沉淀物RNA两者(样品I)。
在2-氨基-5-甲基苯甲酸去固定剂和(4-氨基吡啶-3-基)膦酸两者的存在下将蛋白质酶K浓度从0.1％(样品G)增至0.2％(样品J)增加了总RNA回收率和沉淀物RNA回收率两者。但是，与不存在PEG相比，在0.2％的蛋白质酶K下，PEG 6000不增加回收率(样品K和L)。
另外的研究证实，如上所述，从细胞沉淀物和上清液获得的RNA用作使用逆转录酶合成cDNA的模板。
实施例5：在隔室(例如，含单个细胞的液滴或孔)中与被固定细胞一起使用聚乙二 醇(PEG)
在单细胞隔室(例如，液滴或孔)内的隔室中与被固定的单个细胞和去固定剂一起使用聚乙二醇以(i)增加来自单个细胞的mRNA的收率和/或质量，和/或(ii)改善去固定剂(例如，蛋白酶)的存在下的逆转录酶活性。
在一个实例中，用增加的浓度的PEG 600、PEG 1000、PEG 2000、PEG 6000和/或PEG10000(例如，0.5％、1％、2％w/v)配制含有待分隔到液滴中的成分的反应混合物。在隔室中进行去固定，并且在一个实例中，进行单细胞3’方案。在一个实例中，单细胞3’方案在无PEG(或无另外的PEG)的情况下批量进行。在一个实例中，单细胞3’方案在PEG的存在下(或在另外的PEG的存在下)批量进行。
通常，从该实验生成的数据将显示来自在液滴环境中存在PEG的情况下去固定的细胞的mRNA如与从来自在液滴中无PEG的情况下去固定的细胞的mRNA制备的文库相比质量和/或收率的任何改善。去固定可以使用蛋白酶(但任选地包括本文描述的催化剂，例如化合物1和/或化合物8)在液滴中进行。mRNA的质量和/或收率可以基于核酸文库的质量来评估，所述核酸文库基于通过与核酸条形码分子的液滴中杂交(例如，基于poly-T的杂交)所捕获的mRNA、然后是批量(即，液滴外)逆转录以生成cDNA分子而生成，所述cDNA分子可用于生成核酸文库以供测序。
在另一个实例中，用含有PEG、逆转录酶(RT)和蛋白酶(但任选地包括本文描述的催化剂，例如化合物1和/或化合物8)的液滴进行单细胞3’方案。通常，从该实验生成的数据将显示来自在液滴环境中存在PEG的情况下去固定的细胞的mRNA如与从来自在液滴中无PEG的情况下去固定的细胞的mRNA制备的文库相比质量和/或收率的任何改善。去固定可以使用蛋白酶(但任选地包括本文描述的催化剂，例如化合物1和/或化合物8)在液滴中进行。mRNA的质量和/或收率可以基于核酸文库的质量来评估，所述核酸文库基于通过与核酸条形码分子的液滴中杂交(例如，基于poly-T的杂交)所捕获的mRNA、然后是液滴中逆转录以生成cDNA分子而生成，所述cDNA分子可用于生成核酸文库以供测序。
序列表
<110> 10X基因组学有限公司
<120> 用于被固定样品的组合物和方法
<130> 10416-039WO1
<150> US 63/010,768
<151> 2020-04-16
<150> US 61/132,278
<151> 2020-12-30
<160> 3
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用SEQ ID NO:2作为模板进行逆转录的引物
<400> 1
cgactcactg acactcgc 18
<210> 2
<211> 82
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用SEQ ID NO:1作为引物进行逆转录的模板
<400> 2
acgaccgucg ucauguagcg uuugucggag acuccuagau cagauguccu ccuggcuacu 60
gcacgcgagu gucagugagu cg 82
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与使用SEQ ID NO:2作为模板和SEQ ID NO:1作为引物由逆转录酶合成的第一链
的末端杂交的TSO寡核苷酸；TSO寡核苷酸然后可充当第二链合成的引物
<400> 3
aagcagtggt atcaacgcag agtacatggg 30

Claims (62)

1.一种用于加工核酸分子的方法，所述方法包括：
a)提供隔室，所述隔室包含：(i)包含有包含核酸序列的核酸分子的被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒和(ii)核酸条形码分子；
b)使所述隔室经受足以生成与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的核酸分子的条件；
c)从所述隔室释放与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的所述核酸分子以生成与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的释放的核酸分子；以及
d)使与所述核酸条形码分子联接的包含所述核酸序列的所述释放的核酸分子经受足以使用所述核酸序列作为模板延伸所述核酸条形码分子以生成加有条形码的核酸分子的条件。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子为交联的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中b)包括：(i)从所述交联的核酸分子生成未连接的核酸分子，和(ii)让所述未连接的核酸分子与所述核酸条形码分子联接。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述隔室还包含切割剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述切割剂为蛋白酶并任选地还包含催化剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒为被固定的单个细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述被固定生物颗粒或被固定膜结合颗粒为被固定的单个核。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述隔室还包含聚乙二醇。
9.根据权利要求1所述的方法，其中b)包括加热所述隔室。
10.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在b)之后并在c)之前冷却所述隔室或让所述隔室冷却。
11.根据权利要求1所述的方法，其中d)在蛋白酶抑制剂的存在下进行。
12.根据权利要求1所述的方法，其中d)在聚乙二醇的存在下进行。
13.根据权利要求1所述的方法，其中d)包括使用逆转录酶来延伸所述核酸分子条形码分子。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述逆转录酶包含RNA酶活性。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸条形码分子包含配置为退火至所述被固定生物颗粒或所述被固定膜结合颗粒的核酸分子的捕获序列。
16.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将另外的序列附加到所述加有条形码的核酸分子。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述另外的序列为poly-C序列。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述附加通过连接酶或聚合酶进行。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述聚合酶为逆转录酶。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述附加包括使用夹板核酸分子。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述隔室还包含模板转换寡核苷酸(TSO)。
22.根据权利要求21所述的方法，所述方法还包括使所述隔室经受足以使所述TSO与所述另外的序列杂交的条件。
23.根据权利要求21所述的方法，所述方法还包括延伸所述加有条形码的核酸分子以生成包含与所述TSO互补的序列的延伸的加有条形码的核酸分子。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸条形码分子联接到支持物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述支持物为珠。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述核酸条形码分子通过不稳定部分联接到所述支持物。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述隔室为液滴或孔。
28.根据权利要求2所述的方法，其中所述交联的核酸分子包含核糖核酸(RNA)分子。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述RNA分子为信使RNA(mRNA)分子。
30.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括(e)对所述加有条形码的核酸分子或其扩增产物测序。
31.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括提供多个隔室。
32.根据权利要求31所述的方法，所述方法还包括在a)之前将多个被固定生物颗粒或多个被固定膜结合颗粒分隔到所述多个隔室中。
33.根据权利要求31所述的方法，其中在b)之后并在c)之前，所述多个隔室包含与核酸条形码分子联接的多个核酸分子。
34.根据权利要求33所述的方法，所述方法还包括在c)之后从所述多个隔室合并与所述核酸条形码分子联接的所述多个核酸分子。
35.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在a)之前固定生物颗粒或膜结合颗粒以生成所述被固定生物颗粒或所述被固定膜结合颗粒。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述固定包括使用固定剂。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述固定剂包含多聚甲醛。
38.根据权利要求1所述的方法，其中所述被固定生物颗粒或所述被固定膜结合颗粒包含细胞、核、病毒或核。
39.一种方法，所述方法包括在聚乙二醇(PEG)的存在下用去固定剂处理被固定细胞、核或组织以获得去固定细胞或核。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述被固定细胞、核或组织由以下物质固定：醛，包括多聚甲醛或戊二醛；NHS酯，包括N-羟基琥珀酰亚胺；亚氨酸酯；或其组合。
41.根据权利要求39或40中的一项所述的方法，其中所述去固定剂具有蛋白酶活性。
42.根据权利要求30或40中的一项所述的方法，其中所述去固定剂为催化剂。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述处理在隔室中发生。
44.根据权利要求39-43中任一项所述的方法，所述方法包括使用来自所述去固定细胞或核的核酸作为DNA合成反应中的模板的附加步骤。
45.一种方法，所述方法包括：
(a)使用去固定剂对被固定细胞、核或组织去固定或部分去固定；以及
(b)在聚乙二醇(PEG)的存在下使用来自去固定或部分去固定细胞、核或组织的核酸模板和逆转录酶(RT)合成互补单链DNA。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述去固定剂去除由以下物质形成的交联：醛，包括多聚甲醛和/或戊二醛；NHS酯，包括N-羟基琥珀酰亚胺；或亚氨酸酯，所述交联存在于所述被固定细胞或核中的生物分子中。
47.根据权利要求45或46中的一项所述的方法，其中所述去固定剂具有蛋白酶活性。
48.根据权利要求45或46中的一项所述的方法，其中所述去固定剂包括催化剂。
49.根据权利要求45或46中的一项所述的方法，其中步骤(a)使用具有蛋白酶活性的去固定剂和包括催化剂的去固定剂来进行。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，其中步骤(a)在聚乙二醇(PEG)的存在下进行。
51.根据权利要求45-51中任一项所述的方法，其中所述被固定细胞或核用多聚甲醛固定。
52.根据权利要求45-51中任一项所述的方法，其中步骤(a)在隔室中进行。
53.根据权利要求45-52中任一项所述的方法，所述方法包括从所述去固定细胞或核分离出核酸的附加步骤。
54.一种组合物，所述组合物包含逆转录酶、蛋白酶和聚乙二醇。
55.根据权利要求54所述的组合物，所述组合物包含能够被所述逆转录酶作为模板使用以合成互补DNA链的核酸。
56.根据权利要求55所述的组合物，所述组合物包含能够被所述逆转录酶使用以启动所述互补DNA链的第一链合成的引物。
57.根据权利要求54-56中任一项所述的组合物，其中所述逆转录酶具有末端转移酶活性。
58.根据权利要求54-57中任一项所述的组合物，所述组合物包含模板转换(TS)寡核苷酸。
59.根据权利要求54-58中任一项所述的组合物，其中所述逆转录酶具有模板转换活性。
60.根据权利要求54-59中任一项所述的组合物，其中所述组合物是隔室的一部分。
61.一种方法，所述方法包括在包含逆转录酶(RT)、核酸模板、引物、蛋白酶和聚乙二醇(PEG)的组合物中合成互补单链DNA。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述组合物包含在隔室中。
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