CN112680504A - 一种外泌体内多种miRNA特异性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外泌体内多种miRNA特异性检测方法，包括如下步骤：构建非天然核酸框架探针结构；将所述非天然核酸框架探针结构与外泌体样品共孵育，通过荧光分析检测多种miRNA。该结构可以实现对外泌体内多种miRNA的特异性检测：将非天然核酸框架探针与外泌体共孵育，前者进入外泌体后可对多种miRNA进行检测。在无目标miRNA的环境中，纳米夹子保持关闭，无荧光信号；当检测到目标miRNA时，夹子打开并产生荧光信号。本方法可以有效地原位检测外泌体内miRNA，避免对外泌体结构的破坏；可以同时检测多种miRNA，提高检测的效率；并具有抗酶降解等特性，可应用于临床外泌体诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种多种miRNA特异性检测方法，尤其涉及一种外泌体内多种miRNA特异性检测方法。
背景技术
外泌体(exosomes)是大小在30至150nm之间的纳米级脂质囊泡，在细胞分泌后包含特定的蛋白质和RNA。循环外泌体通过将外泌体货物分子从供体转移到受体而在各种生理病理学过程中发挥核心作用。外泌体可以包裹与癌症相关的microRNA(参与基因表达调控的约22个核苷酸的小非编码RNA)，并在血液中稳定循环，从而促进癌症的发展和进展。因此，外泌体微RNA(miRNA)已被评估为早期无创检测癌症的可靠生物标志物，比外周血中的miRNA具有更好的诊断价值。然而，由于外泌体miRNA含量低，以及外泌体脂质双层对miRNA的保护，直接检测外泌体内的miRNA仍然是一项艰巨的挑战。
发明内容
发明目的：本发明的目的为提供一种实现对外泌体中多种miRNA的特异性检测的外泌体内多种miRNA特异性检测方法。
技术方案：本发明的外泌体内多种miRNA特异性检测方法，包括如下步骤：
(1)构建非天然核酸框架探针结构；
(2)将非天然核酸框架探针结构与外泌体样品共孵育，通过荧光分析检测多种miRNA。
进一步地，由于核酸纳米结构可以实现多种结构，并且具有修饰位点的可寻址性，非天然核酸框架探针结构包括不同形状的框架探针结构。
由于非天然核酸具有更高的酶稳定性、热稳定性等特性，可以实现在生物样品中的稳定检测。步骤(2)中，对外泌体内miRNA的检测为原位检测。非天然核酸框架探针结构进入外泌体中进行检测。非天然核酸框架探针结构对多种miRNA的同时检测。
优选的，非天然核酸框架探针结构结合多种纳米夹子，通过改变纳米夹子的序列，实现对不同目标miRNA分子的特异性结合。
步骤(1)中，不同非天然核酸框架探针结构的制备，基于核酸纳米结构的可塑性和可寻址性，可以选择任意形状的结构；基于荧光分子的多样性，选择任意荧光分子修饰于非天然核酸框架探针结构。基于非天然核酸分子的碱基配对能力，选择任意非天然核酸分子进行结构组装。
步骤(2)中，当体系中存在目标miRNA时，会与非天然核酸夹子进行碱基互补配对，使荧光基团与淬灭基团分开，从而使非天然核酸框架探针发出荧光；而当体系中不存在目标miRNA时，非天然核酸框架探针不会发出荧光，从而保证了检测的特异性。
步骤(1)具体包括：设计合成非天然核酸单链形成的框架结构与夹子结构。框架结构顶点处伸出捕获单链与夹子结构互补配对。夹子结构的一条单链修饰有荧光淬灭基团和荧光基团，另外两条单链具有与目标miRNA互补的粘性末端。可以针对检测目标的种类和环境，更改框架结构上连接的纳米夹子的数量和种类。
步骤(2)具体包括：将步骤(1)中构建的非天然核酸框架探针结构与待测外泌体共孵育，前者进入外泌体内与目标miRNA结合后，纳米夹子上的淬灭基团与荧光基团分离，通过荧光检测平台观察荧光的变化。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)可检测多种目标miRNA序列，我们可以通过改变非天然核酸单链的碱基序列，从而构建各种不同序列的纳米镊子，来实现对多种目标miRNA的检测；
(2)高稳定性，非天然核酸具有抗酶切、耐酸、耐热等优势；
(3)原位检测，无需破坏外泌体的结构，无需进行miRNA的提取操作。
附图说明
图1为非天然核酸框架探针结构检测外泌体内多种目标miRNA示意图；
图2为非天然核酸框架探针结构的设计；
图3为非天然核酸框架探针结构识别检测目标miRNA的原理；
图4为非天然核酸框架探针结构检测外泌体内多种目标miRNA；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
如图1所示，本发明所述对外泌体内miRNA的检测示意图，由单链DNA组成的非天然框架核酸探针与人体来源的外泌体共孵育后，通过观察外泌体的荧光信号来验证对目标miRNA的特异性检测。
实施例2
关于本发明中设计的非天然核酸框架探针的设计与合成，以四面体框架结构为例，其具体操作为：
如图2所示，将非天然核酸四面体框架结构的单链以1:1:1:1的摩尔比混合，并且加入10×TAE-Mg2+的缓冲液，所述缓冲液的镁离子浓度为12.5mol/L，震荡均匀。
将非天然核酸纳米夹子的单链以1:1:1的摩尔比混合，并且加入10×TAE-Mg2+的缓冲液，所述缓冲液的镁离子浓度为12.5mol/L，震荡均匀。
将二者以1:4的摩尔比混合。将混合溶液置于PCR仪中，在95℃的条件下加热两分钟，然后直接降温到4℃，放置待用。
实施例3
关于本发明所述的非天然核酸框架探针用于检测多种miRNA，以四面体框架结构检测miRNA-21与miRNA-155为例，其具体操作步骤为：
如图3所示，非天然核酸纳米夹子在检测识别到目标miRNA后，夹子会由闭合状态变为打开状态，荧光淬灭基团与荧光基团分离，夹子结构产生荧光。当两种不同序列的纳米夹子分别检测到miRNA-21与miRNA-155后，夹子结构产生两种荧光。
实施例4
关于本发明所述的非天然核酸框架探针用于检测外泌体内多种miRNA，以四面体框架结构检测人肝细胞癌来源的外泌体内miRNA-221与miRNA-222为例，其具体操作步骤为：
如图4所示，非天然核酸框架探针在进入外泌体后检测识别到目标miRNA后，非天然核酸纳米夹子打开，荧光淬灭基团与荧光基团分离，非天然核酸框架探针在外泌体内部产生荧光。当同时检测到miRNA-221和miRNA-222后，非天然核酸探针在外泌体内部发出两种荧光。
Claims (9)
1.一种外泌体内多种miRNA特异性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建非天然核酸框架探针结构；
(2)将所述非天然核酸框架探针结构与外泌体样品共孵育，通过荧光分析检测多种miRNA。
2.根据权利要求1所述的外泌体内多种miRNA特异性检测方法，其特征在于：所述非天然核酸框架探针结构包括不同形状的框架探针结构。
3.根据权利要求1所述的外泌体内多种miRNA特异性检测方法，其特征在于：步骤(2)中，对外泌体内miRNA的检测为原位检测。
4.根据权利要求3所述的外泌体内多种miRNA特异性检测方法，其特征在于：所述非天然核酸框架探针结构进入外泌体中进行检测。
5.根据权利要求1所述的外泌体内多种miRNA特异性检测方法，其特征在于：步骤(2)中，非天然核酸框架探针结构对多种miRNA的同时检测。
6.根据权利要求5所述的外泌体内多种miRNA特异性检测方法，其特征在于：非天然核酸框架探针结构结合多种纳米夹子，通过改变纳米夹子的序列，实现对不同目标miRNA分子的特异性结合。
7.根据权利要求1所述的外泌体内多种miRNA特异性检测方法，其特征在于：步骤(1)中，选择任意荧光分子修饰于非天然核酸框架探针结构。
8.根据权利要求1所述的外泌体内多种miRNA特异性检测方法，其特征在于：步骤(1)中，选择任意非天然核酸分子进行结构组装。
9.根据权利要求1所述的外泌体内多种miRNA特异性检测方法，其特征在于：步骤(2)中，当体系中存在目标miRNA时，会与非天然核酸夹子进行碱基互补配对，使荧光基团与淬灭基团分开，从而使非天然核酸框架探针发出荧光；而当体系中不存在目标miRNA时，非天然核酸框架探针不会发出荧光。
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