CN101538613A - 与疾病相关的分子探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与疾病相关的分子探针及其制备方法。本发明的筛选与疾病相关的核酸适体的方法包括如下步骤:用离体的靶疾病细胞对核酸文库进行筛选,得到与靶疾病相关的核酸适体;所述核酸文库为单链的随机核苷酸序列的文库。本发明方法,在预先不知道疾病细胞表面与疾病相关的分子变化的情况下,也能筛选出与疾病相关的核酸适体,而且,可同时获得多种与疾病相关的核酸适体。因此,本发明方法更实用,应用范围更广。实验证明,本发明方法一次能筛选得到3-20个识别细胞表面不同分子的核酸适体,经过修饰改造后,核酸适体与疾病细胞的特异性结合力更强,在生物环境中的稳定性更高。
Description
技术领域
本发明涉及与疾病相关的分子探针及其制备方法。
背景技术
疾病的发生、发展均导致细胞内分子的种类和数量发生变化,因此从分子水平上检测和跟踪这些变化是理解疾病发生机理、提高诊断准确性、提前诊断窗口期、制定合理治疗方案以及监测治疗效果的一个非常有效途径。但是目前由于缺少行之有效的特定疾病的分子探针,从分子水平上了解和诊断疾病仍然是一个巨大的挑战(Espina V,Geho D,Mehta AI,Petricoin EF 3rd,Liotta LA,& Rosenblatt KP.Pathology of the future:molecular profiling for targeted therapy.CancerInvest 2005;23:36-46)。大部分疾病(如肿瘤)的诊断依然主要是依靠传统的组织和细胞形态学标准,辅助少量分子诊断的结果,但依据这些标准难以实现疾病的早期诊断和理解疾病本身复杂的分子变化(Luo,J.,Isaacs,W.B.,Trent,J.M.and Duggan,D.J.Looking beyond morphology:cancer gene expression profilingusing DNA microarrays.Cancer Invest.21,937-949(2003))。目前所用的少量的分子诊断试剂主要是利用抗体作为特异性的识别分子。抗体来源于动物或融合的单克隆细胞,是自然的产物,其在诊断领域的应用始于上世纪五十年代早期,在七十年代就得到了广泛的应用。1975年单克隆抗体技术出现后,抗体在分析中的应用更是受到了世界各地研究者的普遍欢迎,以至抗体已成为目前临床检验中不可或缺的诊断试剂(Jayasena S D,Clin Chem,45,1628-1650(1999))。但是抗体制备繁琐、稳定性差、分子量大以、难以进行化学修饰和改造,这些原因严重的影响了抗体分子的应用。另外筛选针对疾病标志物分子的抗体分子工作量大、周期长,因此目前可用的疾病标志物的抗体也不多。因此有必要发展新型识别分子,建立高效的疾病特异性识别分子的筛选与制备方法。
近年来一类新型的识别分子——核酸适体(Aptamer,适配体,适配子)以其优越识别特性逐渐得到人们的重视。核酸适体是一段单链的寡核苷酸分子(包括DNA、RNA或经过修饰的核酸序列)。它们通过分子内碱基堆积、疏水相互作用、氢键和静电相互作用折叠形成独特的三维空间结构,从而与靶分子特异性结合(Breaker RR,Nature 2004,432:838-845)。其与靶分子的亲和力非常强完全可以与抗体分子相似,甚至比抗体亲和力更强。与抗体相比,适体具有较低的分子量(15-50bases;4-15kD)、快速组织通透性、没有免疫源性和毒性。核酸适体一旦筛选出来,知道序列后就可以通过自动化的固相化学合成来制备,而不像抗体,还需经过免疫动物或细胞培养的过程以及后续的繁琐的分离纯化过程,价格大大降低。适体很容易进行结构改造并标记上各种信号分子,如放射性元素、荧光染料、生物素和胆固醇等,因此很容易构建成特异的分子探针(Nutiu R & Li Y,Angew Chem Int Ed Engl 2005,44:1061-1065;Liu,J.W.& Lu,Y.Angew Chem Int Ed Engl 2006,45:90-94)。核酸适体稳定性高,可以可逆的变性与复性,可在常温下保存和运输。适体的这些优点使其有望取代抗体,成为新一代的诊断试剂和治疗剂在疾病的诊断和治疗中起重要的作用,也可以构建为各种分子探针用于重要生理活性分子的检测与研究中。
虽然适体分子具有很多抗体无法比拟的优越性,理应象抗体分子一样得到广泛的应用。但是,目前可用于检测的核酸适体分子很少,不能象种类繁多的抗体被研究者广泛应用。造成这种情况的原因是多方面的,其中之一是目前的筛选效率不高,筛选出的适体分子还不多;另一个原因核酸适体需要用纯的靶分子进行筛选,而目前可获得的与疾病相关的纯的生物分子非常少。因此难以通过常规的方法得到大量用于诊断的核酸适体分子,需要有新的筛选疾病相关核酸适体的方法,以制备与疾病相关的分子探针。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种筛选与疾病相关的核酸适体的方法。
本发明所提供的筛选与疾病相关的核酸适体的方法,包括如下步骤:用离体的靶疾病细胞对核酸文库进行筛选,得到与靶疾病相关的核酸适体;所述核酸文库为单链的随机核苷酸序列的文库。
所述核酸文库具体可为单链DNA文库、单链RNA文库、或修饰的单链核酸文库。所述随机核苷酸序列的长度可为25-60个碱基,优选为52个碱基。
所述核酸文库具体可以为如下的文库:两端为15-25个碱基的固定核苷酸序列,中间为25-60个碱基的随机核苷酸序列,如5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-52-nt-AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3’。其中,两端固定序列可以用于设计引物,以便于扩增筛选出的文库。
所述筛选的方法可以包括如下步骤:
(1)以所述核酸文库为起始核酸文库;
(2)将所述起始核酸文库的溶液与所述离体的靶疾病细胞孵育,得到所述靶疾病细胞与起始核酸文库中部分核酸分子的复合体,分离复合体,得到与所述离体的靶疾病细胞结合的核酸文库;
(3)将所述与所述离体的靶疾病细胞结合的核酸文库的溶液与离体的非靶疾病细胞孵育,分离去除与所述离体的非靶疾病细胞结合的核酸分子,剩余没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子;
(4)得到与靶疾病相关的核酸适体。
其中,所述步骤(2)中,在所述得到与所述离体的靶疾病细胞结合的核酸文库后,还可包括如下步骤:PCR扩增所述与离体的靶疾病细胞结合的核酸文库,并制备成单链。
所述步骤(3)中,在所述剩余没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子后,还可包括如下步骤:PCR扩增所述没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子,并制备成单链。
在所述步骤(3)之后、步骤(4)之前,还可包括至少1次以下操作:以所述没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子为起始核酸文库,重复步骤(2)和(3),每次操作均以前一次操作中得到的没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子为起始核酸文库。
所述疾病具体可为白血病、淋巴瘤、肝癌等。所述靶疾病细胞具体可为肿瘤细胞、被感染细胞或炎症细胞等病变细胞。
本发明的另一个目的是提供一种制备与疾病相关的分子探针的方法。
本发明所提供的制备与疾病相关的分子探针的方法包括如下步骤:按照上述任一所述方法筛选得到与疾病相关的核酸适体,将所述核酸适体标记信号分子,得到与靶疾病相关的分子探针。
所述制备方法中,在所述标记前,还可包括对所述核酸适体进行修饰的步骤;所述修饰的方法为对所述核酸适体进行剪切、对所述核酸适体中的核苷酸单元进行替换、对所述核酸适体中的碱基、核糖或磷酸骨架进行修饰。
所述制备方法中,所述与疾病相关的分子探针具体可为与白血病相关的分子探针。
由上述任一所述方法制备得到的与疾病相关的分子(如筛选得到的核酸适体或制备得到的分子探针)也属于本发明的保护范围。
所述与疾病相关的分子具体可为与白血病相关的分子,具体可如下述中的任一种或将下述任一种分子进行延长、剪切或部分替换后得到的且与白血病相关的分子:
1)序列表中序列3所示的DNA分子;
2)序列表中序列4所示的DNA分子;
3)序列表中序列5所示的DNA分子;
4)序列表中序列6所示的DNA分子;
5)序列表中序列7所示的DNA分子;
6)序列表中序列8所示的DNA分子;
7)ALTLCLTLAACTGCTGCGCCGCCGGGpegGTACGGTTALGLAL,其分子结构式如下:
,其中n为1至5中的任一自然整数,AL,TL,CL,GL为锁核酸单元。
其中所述延长、剪切和替换可以在所述分子的两端或中间等任意位置进行,只要保证最后得到的分子还是与白血病相关的。
上述方法获得的核酸适体或分子探针在疾病细胞检测中的应用也属于本发明的保护范围。
现有技术中,是以疾病相关分子为靶向进行核酸适体筛选的,这种方法是以分离获得疾病相关分子为前提的,受到疾病相关分子的限制,因为如果疾病相关分子没有被先分离制备出来,那么就无法进行下步的核酸适体筛选;而本发明的筛选与疾病相关的核酸适体的方法,是以疾病细胞为靶进行筛选,摆脱了疾病相关分子的限制,在预先不知道疾病细胞表面与疾病相关的分子变化的情况下,也能筛选出与疾病相关的核酸适体,而且,可同时获得多种与疾病相关的核酸适体。因此,本发明方法更实用,应用范围更广。实验证明,本发明方法一次能筛选得到3-20个识别细胞表面不同分子的核酸适体,经过修饰改造后,核酸适体与疾病细胞的特异性结合力更强,在生物环境中的稳定性更高。由本发明方法得到的核酸适体或分子探针可以用于疾病诊断和疾病细胞分型,也可用于生物技术和生物医学研究中。
附图说明
图1为与疾病相关核酸适体的筛选过程。
图2为与疾病相关核酸适体的修饰与改造。
图3为白血病核酸适体用于白血病细胞的检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、制备与白血病相关的分子探针
一、筛选与白血病相关的核酸适体
(一)随机核酸文库的合成
按照文献(Jayasena S D.Aptamers:an emerging class of molecules thatrival antibodies in diagnostics.Clin.Chem.1999,45:1628-1650)中所述,设计合成如下随机单链DNA文库:5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-52-nt-AGA TAGTAA GTG CAA TCT-3’。
(二)筛选与白血病相关的核酸适体
结合缓冲液:含4.5g/L葡萄糖,5mM MgCl2,1mM CaCl2,2.67mM KCl,1.47mM磷酸二氢钾,137.93mM氯化钠,8.06mM磷酸氢二钠,0.1mg/mL tRNA(R8759 Sigma,Ribonucleic acid,transfer from baker’s yeast(S.cerevisiae))和1mg/mL牛血清白蛋白(Fisher),pH值7.4。
CCRF-CEM细胞(人T淋巴细胞急性淋巴细胞白血病)(CCL-119)、Ramos细胞(CRL-1596)均购于ATCC(American Type Culture collection)。
筛选过程如图1所示(cell A为靶细胞,cellB为反筛细胞,1表示随机的DNA文库,2表示洗脱步骤,3表示PCR步骤,4表示富集的文库,5表示克隆和测序,6表示进入下一轮筛选,7表示流式细胞分析步骤),具体如下:
1、第1次筛选
取10nmol的核酸文库溶于1mL的结合缓冲液中与1×106个离体的CCRF-CEM细胞在冰上孵育30分钟,离心去除上清液,洗涤,得到结合有核酸分子的CCRF-CEM细胞;
将结合有核酸分子的CCRF-CEM细胞悬浮于300μL结合缓冲液中,加热至95℃,离心除去沉淀,得到核酸序列文库I;将洗脱的核酸序列文库I经PCR扩增放大(所用的引物序列为荧光素标记的ATA CCA GCT TAT TCA ATT(序列1)、生物素标记的AGA TTG CAC TTA CTA TCT(序列2)),用链亲和素包被的琼脂糖微球(购于GE公司)吸附,经0.15M的氢氧化钠溶液洗脱得到放大的单链核酸序列文库I,用于第二轮的筛选。
2、第二轮筛选
取200pmol步骤1得到的放大的单链核酸序列文库I溶于300μL结合缓冲液中与1×106个离体的CCRF-CEM细胞在冰上孵育30分钟,离心去除上清液,洗涤,得到结合有核酸分子的细胞;将结合有核酸分子的细胞悬浮于300μL结合缓冲液中,加热至95℃,洗脱结合于细胞表面的核酸分子,离心去除疾病细胞,得到核酸序列文库II;将所述核酸序列文库II与5×106个离体的淋巴瘤细胞Ramos(反筛细胞)于冰上孵育30分钟,离心除去Ramos细胞及其结合的序列,上清液脱盐,得到核酸序列文库III;
将核酸序列文库III进行PCR扩增放大(所用的引物序列为荧光素标记的ATACCA GCT TAT TCA ATT(序列1)、生物素标记的AGA TTG CAC TTA CTA TCT)(序列2)后,用链亲和素包被的琼脂糖微球(购于GE公司)吸附,经0.15M的氢氧化钠溶液洗脱得到放大的单链核酸序列文库III,用于下一轮的筛选。
3、重复筛选
按照步骤2的方法,重复筛选10次,每次都用上一次筛选得到的文库作起始文库,最后得到含特异性结合于CCRF-CEM细胞的核酸文库;经TA克隆、测序。在每一次重复步骤2的过程中用流式细胞仪和荧光显微镜监测与细胞结合的核酸序列的量,以判断文库中与细胞特异性结合的序列的量以及结合的强度(富集的程度)。
4、核酸适体分子的表征
根据测序结果,合成核酸适体序列,标记荧光分子制成分子探针,分别取0.5、1、2、4、10、40、200、500nM的分子探针溶液,与5×105个离体的CCRF-CEM细胞于冰上孵育20分钟,用结合缓冲液洗涤两遍后用流式细胞仪测定细胞表面荧光强度,以荧光强度对探针浓度作图,用公式Y=BmaxX/(Kd+X)计算平衡解离常数Kd。
实验设3次重复。
选取平衡解离常数小于1×10-4mol/L的核酸适体备用。
其中的3种与白血病相关的核酸适体的核苷酸序列如下:
核酸适体A(平衡解离常数为0.8nM):
ATACCAGCTTATTCAATTAGTCACACTTAGAGTTCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGATAGTAAGTGCAATCT(序列3)
核酸适体B:
ATACCAGCTTATTCAATTCCTGTGGGAAGGCTATAGAGGGGCCAGTCTATGAATAAGATGGCGGACTAATGTGTAAGATAGTAAGTGCAATCT(序列4)
核酸适体C:
ATACCAGCTTATTCAATTCGAGTGCGGATGCAAACGCCAGACAGGGGGACAGGAGATAAGAATAGCGTGATGAGATAGTAAGTGCAATCT(序列5)
二、制备分子探针
(一)核酸适体的优化与改造
经筛选得到的核酸适体分子核酸链较长,经结构分析后,设计并合成一系列经截短的核酸序列,用与实验一中步骤4相同的方法,以流式细胞仪表征序列的特异性与亲和力。挑选最优化的结合序列用于进一步的应用,优化后的序列的长度可减少至原序列的三分之一。用修饰的核苷酸单体(如硫代磷酸酯骨架、肽核酸、糖环2’-F和2’-NH2修饰等)或其他连接分子(如六聚乙二醇1-1磷酸)替换或修饰优化后的序列,进一步改造识别分子。修饰后的识别分子可抵抗核酸酶的降解,延长在生物体或生物样本中的半衰期。
具体的修饰改造方法如下:
1、核酸适体A序列的优化:合成逐步截短的核酸适体A序列,按实验一中步骤4对序列进行表征,以平衡解离常数最低的序列为最优化的序列,得到如下序列pA(解离常数为0.78nM):(ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA)(序列6)
修饰:将优化的序列pA(序列6)两端的7个核苷酸单元替换为相应的LNA(锁核酸)单元(AL、CL、TL、GL,Locked Nucleic Acid(LNATM)Phosphoramidites,Glen Research),将其中序列AAAATACT替换为两个六聚乙二醇-1-磷酸连接分子(DNA合成用的单体为:Spacer Phosphoramidite 18,
18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite,10-1918-02,Glen Research),用DNA合成仪合成如下修饰的序列ppA(解离常数为1.53nM):
ALTLCLTLAACTGCTGCGCCGCCGGGpegGTACGGTTALGLAL,其分子结构式如下:
,其中n为2,AL,TL,CL,GL为锁核酸单元。
核酸适体在血浆中的半衰期检测:将2nmol荧光素标记的所述核酸适体加入1mL血浆中于37℃孵育,分别在不同时间取40μL上述孵育样品加入5μL 200mMEDTA后于95℃加热5分钟以终止反应。所有取出样品以3%琼脂糖凝胶电泳分离。测量未降解的核酸适体的荧光强度。检测结果如图2所示(1表示核酸适体A,2表示截短后得到的分子pA,3表示修饰后得到的分子ppA;I表示核酸适体pA,II表示修饰后得到的分子ppA)。显示,核酸适体pA在血浆中的半衰期为1.5小时,修饰后得到的分子ppA在血浆中的半衰期为8小时,表明修饰后得到的分子在血浆中作用的时间更长。
2、核酸适体B序列的优化:合成逐步截短的核酸适体B序列,按步骤4对序列进行表征,以平衡解离常数最低的序列为最优化的序列,得到如下序列pB:(ACTTATTCAATTCCTGTGGGAAGGCTATAGAGGGGCCAGTCTATGAATAAG)(序列7),优化得到的分子pB由93个碱基缩到51个碱基,平衡解离常数由1.97nM降低到0.43nM,说明亲和力增强。
3、核酸适体C序列的优化:合成逐步截短的核酸适体C序列,按步骤4对序列进行表征,以平衡解离常数最低的序列为最优化的序列,得到如下序列pC:(ATCACTTATAACGAGTGCGGATGCAAACGCCAGACAGGGGGACAGGAGATAAGTGA)(序列8)
优化得到的分子pC由90个碱基缩到56个碱基,平衡解离常数由26.6nM降低到9.3nM,说明亲和力增强。
(二)信号标记
用荧光素分别标记上述分子ppA、pB、pC,制成分子探针。
实施例2、分子探针用于白血病细胞的检测
将实施例1得到的三种探针ppA、pB、pC分别用于检测白血病细胞。取1μM的分子探针与离体的白血病细胞和知情者的临床骨髓样本孵育30分钟,离心,洗涤细胞2次,用流式细胞仪检测细胞。
实验设3次重复,结果一致。
ppA分子探针的检测结果如图3所示(其中1表示白血病细胞CCRF-CEM的检测结果,其余为骨髓中的正常细胞(对照细胞)的检测结果)。pB、pC分子探针具有相似的效果。表明,本发明的分子探针能够有效的识别白血病细胞,并能与其特异性结合,本发明的分子探针可以用于诊断白血病。
实施例3、分子探针用于疾病细胞分型研究
按照实施例1中所述方法制备与淋巴瘤相关的分子探针序列,方法中不同的是取淋巴瘤细胞作为靶疾病细胞,取其中的2条进行荧光素标记,作为与淋巴瘤相关的分子探针。
各取1μM的与淋巴瘤相关的分子探针及上述ppA,pB,pC分子探针,与白血病细胞和淋巴瘤细胞共同孵育30分钟,离心,洗涤细胞2次,用流式细胞仪检测不同分子探针与不同细胞结合的表型特征。
实验设3次重复,结果一致。结果表明,淋巴瘤细胞与不同分子探针的结合谱相似,白血病细胞与不同分子探针的结合谱相似;表明用本发明的方法得到的探针可以用于细胞分型或分类。
序列表
<110>谭蔚泓
<120>与疾病相关的分子探针及其制备方法
<130>CGGNAC92240
<160>8
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
ataccagctt attcaatt 18
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
agattgcacttac tatct 15
<210>3
<211>88
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
ataccagctt attcaattag tcacacttag agttctaact gctgcgccgc cgggaaaata 60
ctgtacggtt agatagtaag tgcaatct 88
<210>4
<211>93
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
ataccagctt attcaattcc tgtgggaagg ctatagaggg gccagtctat gaataagatg 60
gcggactaat gtgtaagata gtaagtgcaa tct 93
<210>5
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
ataccagctt attcaattcg agtgcggatg caaacgccag acagggggac aggagataag 60
aatagcgtga tgagatagta agtgcaatct 90
<210>6
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41
<210>7
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
acttattcaa ttcctgtggg aaggctatag aggggccagt ctatgaataa g 51
<210>8
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
atcacttata acgagtgcgg atgcaaacgc cagacagggg gacaggagat aagtga 56
Claims (10)
1、一种筛选与疾病相关的核酸适体的方法,包括如下步骤:用离体的靶疾病细胞对核酸文库进行筛选,得到与靶疾病相关的核酸适体;所述核酸文库为单链的随机核苷酸序列的文库。
2、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述筛选的方法包括如下步骤:
(1)以所述核酸文库为起始核酸文库;
(2)将所述起始核酸文库的溶液与所述离体的靶疾病细胞孵育,得到所述靶疾病细胞与起始核酸文库中部分核酸分子的复合体,分离复合体,得到与所述离体的靶疾病细胞结合的核酸文库;
(3)将所述与所述离体的靶疾病细胞结合的核酸文库的溶液与离体的非靶疾病细胞孵育,分离去除与所述离体的非靶疾病细胞结合的核酸分子,剩余没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子;
(4)得到与靶疾病相关的核酸适体。
3、根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述步骤(2)中,在所述得到与所述离体的靶疾病细胞结合的核酸文库后,包括如下步骤:PCR扩增所述与离体的靶疾病细胞结合的核酸文库,并制备成单链;所述步骤(3)中,在所述剩余没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子后,包括如下步骤:PCR扩增所述没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子,并制备成单链。
4、根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于:所述筛选的方法中,在所述步骤(3)之后、步骤(4)之前,包括至少1次以下操作:以所述没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子为起始核酸文库,重复步骤(2)和(3),每次操作均以前一次操作中得到的没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子为起始核酸文库。
5、根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于:所述疾病为白血病。
6、一种制备与疾病相关的分子探针的方法,包括如下步骤:按照权利要求1-5中任一所述方法筛选得到与疾病相关的核酸适体,将所述核酸适体标记信号分子,得到与靶疾病相关的分子探针。
7、根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述方法中,在所述标记前,包括对所述核酸适体进行修饰的步骤;所述修饰的方法为对所述核酸适体进行剪切、对所述核酸适体中的核苷酸单元进行替换、对所述核酸适体中的碱基、核糖或磷酸骨架进行修饰。
8、由权利要求1-7中任一所述方法得到的与疾病相关的分子。
10、权利要求8或9所述的与疾病相关的分子在疾病细胞检测中的应用。
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Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101812528A (zh) * | 2010-04-26 | 2010-08-25 | 湖南大学 | 开关式核酸适体探针及其在肿瘤活细胞及活体检测中的应用 |
CN101825597A (zh) * | 2010-04-20 | 2010-09-08 | 上海大学 | Dna适体修饰的生物电化学传感器及其制备方法 |
CN102229932A (zh) * | 2011-06-03 | 2011-11-02 | 湖南大学 | 可识别hcv e1e2蛋白的核酸适体、核酸适体的衍生物及其筛选方法和应用 |
CN102757968A (zh) * | 2012-06-01 | 2012-10-31 | 中国检验检疫科学研究院 | 瓜类果斑病菌检测用核酸适体及其检测方法 |
CN104988154A (zh) * | 2015-06-24 | 2015-10-21 | 中国科学院化学研究所 | 核酸适配体在识别并结合整合素α4中的应用 |
CN105044322A (zh) * | 2015-06-24 | 2015-11-11 | 中国科学院化学研究所 | 核酸适配体在识别并结合l选择素中的应用 |
CN107208313A (zh) * | 2014-12-02 | 2017-09-26 | 特里比奥迪卡有限责任公司 | 用于治疗诊断应用的方法和试剂盒 |
CN109517824A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-03-26 | 湖南大学 | 一种识别靶标蛋白cd71的方法及核酸适体的应用 |
US11186839B2 (en) | 2016-11-21 | 2021-11-30 | Tribiotica Llc | Methods for preventing titration of bimolecular templated assembly reactions by structurally-determined differential hybridizations |
US11253536B2 (en) | 2016-11-21 | 2022-02-22 | Tribiotica Llc | Methods for directed folding assembly or dimerization of proteins by templated assembly reactions |
-
2009
- 2009-04-28 CN CN2009100830730A patent/CN101538613B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101825597A (zh) * | 2010-04-20 | 2010-09-08 | 上海大学 | Dna适体修饰的生物电化学传感器及其制备方法 |
CN101812528A (zh) * | 2010-04-26 | 2010-08-25 | 湖南大学 | 开关式核酸适体探针及其在肿瘤活细胞及活体检测中的应用 |
CN101812528B (zh) * | 2010-04-26 | 2012-07-04 | 湖南大学 | 开关式核酸适体探针及其在肿瘤活细胞及活体检测中的应用 |
CN102229932A (zh) * | 2011-06-03 | 2011-11-02 | 湖南大学 | 可识别hcv e1e2蛋白的核酸适体、核酸适体的衍生物及其筛选方法和应用 |
CN102757968A (zh) * | 2012-06-01 | 2012-10-31 | 中国检验检疫科学研究院 | 瓜类果斑病菌检测用核酸适体及其检测方法 |
CN102757968B (zh) * | 2012-06-01 | 2013-10-23 | 中国检验检疫科学研究院 | 瓜类果斑病菌检测用核酸适体及其检测方法 |
CN107208313A (zh) * | 2014-12-02 | 2017-09-26 | 特里比奥迪卡有限责任公司 | 用于治疗诊断应用的方法和试剂盒 |
CN107208313B (zh) * | 2014-12-02 | 2022-01-07 | 特里比奥迪卡有限责任公司 | 用于治疗诊断应用的方法和试剂盒 |
CN105044322A (zh) * | 2015-06-24 | 2015-11-11 | 中国科学院化学研究所 | 核酸适配体在识别并结合l选择素中的应用 |
CN105044322B (zh) * | 2015-06-24 | 2016-09-07 | 中国科学院化学研究所 | 核酸适配体在识别并结合l选择素中的应用 |
CN104988154A (zh) * | 2015-06-24 | 2015-10-21 | 中国科学院化学研究所 | 核酸适配体在识别并结合整合素α4中的应用 |
CN104988154B (zh) * | 2015-06-24 | 2017-12-08 | 中国科学院化学研究所 | 核酸适配体在识别并结合整合素α4中的应用 |
US11186839B2 (en) | 2016-11-21 | 2021-11-30 | Tribiotica Llc | Methods for preventing titration of bimolecular templated assembly reactions by structurally-determined differential hybridizations |
US11253536B2 (en) | 2016-11-21 | 2022-02-22 | Tribiotica Llc | Methods for directed folding assembly or dimerization of proteins by templated assembly reactions |
CN109517824A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-03-26 | 湖南大学 | 一种识别靶标蛋白cd71的方法及核酸适体的应用 |
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