CN102373212A - 一组糜蛋白酶核酸适配子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一组糜蛋白酶核酸适配子及其制备方法和应用，还提供了一种糜蛋白酶反应器及其制备方法，属于生物技术领域。针对现有技术中尚无糜蛋白酶核酸适配子的缺陷，提供了一组糜蛋白酶核酸适配子，其核苷酸序列选自序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27；是通过SELEX技术结合表面修饰的磁珠对原始随机寡核苷酸文库进行筛选、扩增、测序制备得到；可用于检测、分离、纯化以及固定化糜蛋白酶，制备生物感应器，分析检测目标物质和制备用于临床诊断试剂和疾病治疗药物，还可用于制备糜蛋白酶反应器。所述核酸适配子分子量小，可以化学合成，成本低；亲和性和特异性强；便于标记；重复性和稳定性好，易于保存。
Description
技术领域
本发明涉及一组糜蛋白酶核酸适配子及其制备方法和应用，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术，即系统进化指数富集技术，制备一组与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的核酸适配子及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
糜蛋白酶是一种胰腺分泌的蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质，其作用、用途与胰蛋白酶相似，但比胰蛋白酶分解能力强、毒性低、不良反应小。糜蛋白酶具有酶切位点专一性强的特点，它能优先水解酪氨酸和苯丙氨酸的羧基所形成的肽键。酶作用最优pH值为8.0～9.0。糜蛋白酶是特异性较强的蛋白酶，已经成为一种测定蛋白质氨基酸序列不可或缺的工具。基于以上糜蛋白酶的特性，在蛋白质组学的研究中，糜蛋白酶受到越来越多的重视，并已经得到广泛的应用。
SELEX技术，即系统进化指数富集技术，是上世纪90年代由Tuerk和Ellington等人发明的一种新的组合化学技术。它利用分子生物学技术，构建人工合成的随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度一般在20～40nt左右，两端引物序列一般在20nt左右，文库容量大约在1014～1015范围内。由于单链寡核苷酸随机序列，尤其是RNA序列容易形成凸环、发卡、假节、G-四聚体等二级结构，故能与蛋白质、肽段、药物、氨基酸、有机化学物，甚至是金属离子相结合，形成具有很强结合力的复合体。
SELEX技术具有经济、简便、快速等特点。与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸随机文库中筛选出的核酸适配子具有很多优势：(1)寡核苷酸本身分子量较小，易于合成，便于后续试验；(2)某些核酸适配子具有强于抗体的亲和性和特异性，无免疫原性；(3)核苷酸的化学结构和性质提供了易于标记的特性；(4)稳定性好，易于保存和运输，对高温和剧烈环境不敏感。因此，寡核苷酸适配子在生物感应器的制备、目标物质的分析检测，以及临床诊断和疾病治疗中都具有良好的应用前景。
目前，尚无有关与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法和应用的研究报道。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的不足，提供一组糜蛋白酶核酸适配子，所述核酸适配子与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力。
本发明的第二个目的是提供一组糜蛋白酶核酸适配子的制备方法，所述方法利用分子生物学技术中的SELEX技术，即系统进化指数富集技术为手段，结合表面修饰的顺磁性磁珠的使用，对糜蛋白酶的核酸适配子进行筛选、扩增和测序，最终获得与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的一组核酸适配子。
本发明的第三个目的是提供一组糜蛋白酶核酸适配子的应用，所述核酸适配子与糜蛋白酶相结合，与相结合的糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力，可用于对糜蛋白酶进行检测、分离、纯化以及固定化，应用于生物感应器的制备、目标物质的分析检测，以及制备用于临床诊断的试剂和疾病治疗的药物。
本发明的第四个目的是提供一种糜蛋白酶反应器及其制备方法，所述糜蛋白酶反应器是以所述的一组糜蛋白酶核酸适配子之一为基础制备得到的。
本发明所述的一组糜蛋白酶核酸适配子在蛋白质组学新技术新方法关键技术的研究及应用中具有很强的适用性、经济性。
本发明的技术方案如下：
一组糜蛋白酶核酸适配子，所述糜蛋白酶核酸适配子的核苷酸序列选自核苷酸序列表中数字标识符<210>所表示的序列标识符1～27所述的核苷酸序列，即核苷酸序列表中SEQ IDNo.1～SEQ ID No.27。
所述SEQ ID No.1所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.2所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.3所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.4所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.5所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.6所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.7所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.8所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.9所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.10所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.11所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.12所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.13所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.14所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.15所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.16所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.17所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.18所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.19所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.20所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.21所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.22所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.23所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.24所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.25所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.26所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.27所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列结构是以SEQ ID No.1～SEQ IDNo.27所述的核苷酸序列为基础，通过Internet-tool Mfold在线软件生成，所述软件网址为：http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/dna-forml.cgi。
所述核酸适配子是与核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列之一序列一致性为60％以上，并且具有相同功能的核苷酸序列。
所述核酸适配子是能够与核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列之一杂交，并且具有相同功能的寡核苷酸序列。
所述核酸适配子是核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列之一转录的RNA序列。
所述核酸适配子是核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列之一的不少于一个位置的A或T或C或G被稀有碱基甲基化嘌呤或二氢尿嘧啶或次黄嘌呤置换所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
所述核酸适配子是核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列之一的任何位置删除或增加部分寡核苷酸残基所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
所述核酸适配子是核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列之一的不少于一个位置进行磷酸化或甲基化或氨基化或巯基化或同位素化或结合生物素或结合地高辛或结合荧光物质或结合纳米发光材料或酶标记修饰所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法，包括以下步骤：
(1)用作筛选的ssDNA(单链DNA)的制备：使用上游引物和生物素修饰的下游引物对原始随机寡核苷酸库进行PCR扩增，扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳纯化并回收，得到回收的产物，将回收的产物与表面具有链霉亲和素修饰的顺磁性磁珠反应，再利用碱变性，磁力分离去除磁珠，得到ssDNA溶液，将所述ssDNA溶液用酸中和后，得到作为筛选的ssDNA随机文库；
(2)PCR扩增与糜蛋白酶特异结合的ssDNA，之后进入下一轮筛选；
(3)进行不少于10轮循环的筛选，获得目的核酸适配子扩增后高拷贝数的PCR产物；其中，每隔3轮循环的筛选，进行1次反筛选，即利用未结合糜蛋白酶的固载基质为目标，进行ssDNA的孵育筛选，并去除反筛选后的固载基质，这样，与固载基质特异性结合的非目的ssDNA便被排除掉；
(4)将最后一轮筛选获得的ssDNA经PCR扩增的产物克隆至菌株中，在合适的条件下培养，得到菌落后挑菌、测序，得到本发明所述的一组糜蛋白酶核酸适配子的核苷酸序列。
一组糜蛋白酶核酸适配子的应用，所述核酸适配子可用于对糜蛋白酶进行检测、分离、纯化以及固定化，应用于生物感应器的制备、目标物质的分析检测，以及制备用于临床诊断的试剂和疾病治疗的药物；特别是应用于酶反应器制备过程中糜蛋白酶的固定化，以及固定化后的糜蛋白酶反应器的研究与应用。
一种糜蛋白酶反应器，所述糜蛋白酶反应器是以核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ IDNo.27所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子为基础制备得到。
一种糜蛋白酶反应器的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
(1)表面氨基修饰的硅胶颗粒与戊二醛进行反应，而后加入5’端氨基修饰的核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子，持续磁力搅拌，最终得到表面接枝有所述5’端氨基修饰的糜蛋白酶核酸适配子的硅胶颗粒；
(2)使用动态混匀器将所述硅胶颗粒装填至聚醚醚酮色谱微柱中；
(3)填充结实后，用Tris-HCl缓冲液平衡所述聚醚醚酮色谱微柱系统，然后将糜蛋白酶溶解到Tris-HCl缓冲液中，以流动相方式进样，使糜蛋白酶流经所述聚醚醚酮色谱微柱并进行动态固定化，得到糜蛋白酶反应器；
(4)制备好的糜蛋白酶反应器，作为蛋白质类样品的在线酶解反应器进行蛋白质类样品的酶解反应，用于蛋白质和蛋白质组学的研究；
(5)所述酶解反应结束后，使用乙腈水溶液作为流动相冲洗，可将固载到核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子上的糜蛋白酶洗脱，洗脱后的糜蛋白酶溶液置于≤-20℃条件下保存，再次使用前将其解冻，重复所述步骤(3)将其重新固载，糜蛋白酶反应器即可恢复功能，达到循环使用、可再生的目的。
其中，步骤(5)所述的乙腈水溶液优选为60％的乙腈水溶液；所述洗脱后的糜蛋白酶溶液的保存条件优选为-20℃。
有益效果
1.本发明采用的技术可以高通量地筛选与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的核酸适配子；
2.核酸适配子具有抗体不具备的一些优势，如体外筛选、合成、易于修饰和稳定性高等特点；
3.筛选出的与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的核酸适配子，可以特异性的结合糜蛋白酶，成为糜蛋白酶固定化的固载辅助材料。
附图说明
图1为本发明所涉及的一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法中，第1～9轮SELEX筛选后得到的ssDNA通过PCR得到的产物经3％琼脂糖凝胶电泳后得到的电泳图。
图2为本发明所涉及的一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法中，第10轮SELEX筛选后得到的ssDNA通过PCR扩增后得到的产物经3％琼脂糖凝胶电泳后得到的电泳图。
图3为本发明所涉及的一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法中，第1～10轮SELEX筛选出的ssDNA与糜蛋白酶结合力测定的变化图。
图4为本发明所涉及的一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法中，第10轮SELEX筛选的PCR产物经pEASY-T1克隆试剂盒克隆到Tran1-T1载体后，于含有卡那霉素的LB固体培养基上培养12小时后的菌斑生长情况。
具体实施方式
为了充分说明本发明的特性以及实施本发明的方式，下面给出实施例。
实施例1
一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征是具有核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列之一。
核苷酸序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag gagaggtcgt gtcaccgcgg gcaaggttta ctgcttagca 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag caaaccatac gttgcaccga gcggggttgg ttgaaggtcg 60
aagttatcgc ggatccgcg 79
核苷酸序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag ctgcagattg cttaactgtt atggctaact gtaggtttta 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.4所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag ggatcctcag ccacgctgaa cgtgggcagc gcatcaaggt 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag gtgacttcgt aaggggatag tggaaagcgt cgtaaccccg 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.6所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag tgtacagccc atattacctg catagaggta aagctgcgcc 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.7所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag gaactggacc gatcagtggt gaatgagagt cggctcaccc 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.8所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag gcgtggtaga ggttcgcatc taagttggac gtgacatgac 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.9所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag gcagcaagca ttcagatgtc ggagggtcat gatctggtcg 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.10所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag gggatgtgcg taactaagga agcatgcgag cgaggggcag 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.11所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag ggaggtccag cactaagagg aagctctcaa gggatgcacg 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.12所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag tatgatcgat tgcgttgggt agcaattggg taatagttag 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.13所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag gataagtatc tacggcaata ctgaatgggc actactctta 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.14所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag ggcacggaaa gatatccaga agtatggacg cgcattagcg 60
aagttatcgc ggatccgcg 79
核苷酸序列表中SEQ ID No.15所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag gggccaaagc gtaaaagatg taatgttata tgacttgatc 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.16所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag gtcacgcgcg ttaaacggag aggctattaa agctttgtgg 60
aagttatcgc ggatccgcg 79
核苷酸序列表中SEQ ID No.17所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag cactgagaga agattgggtc taacataagg tcttagcagg 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.18所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag cccagggggg aaactcatct ggttcagtag gagccctgcg 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.19所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag gacaagcttg tcccaggcgg aacgggccgc attagtgttc 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.20所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag atttcctagg ctgggccaga ggggcacagc cactcccatt 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.21所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag cttaggtcac accagtcggg gggggcgttg gtaaaacatg 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.22所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag gttgataggt gtaaccgcgc gtttgtaagg gaatgcaaac 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.23所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag cagccgagtt actgttgatg gatagatcgt ccacgagccg 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.24所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag gacaagcttg tcccaggcgg aacgggccgc attagtgttc 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.25所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag atttcctagg ctgggccaga ggggcacagc cactcccatt 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
核苷酸序列表中SEQ ID No.26所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag actgatagaa atccggaact atcccaactt agtcttcctg 60
aagttatcgc ggatccgcg 79
核苷酸序列表中SEQ ID No.27所述的核苷酸序列：
cccaagcttg ggtatgagag tgtctgctgg agcactcaga ctgtggaggc gacaagaaag 60
gaagttatcg cggatccgcg 80
实施例2
一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法，包括以下步骤：
(1)首先对原始随机寡核苷酸库进行全库扩增，以增加其拷贝数，便于筛选的进行。以上游引物和生物素修饰的下游引物对原始随机寡核苷酸库进行PCR扩增，使用购于Promega公司PCR试剂盒。反应体系如下：
上游引物 100pmol(5’CCCAAGCTTGGGTATGAGAG 3’)
下游引物 100pmol(5’-biotin-C6-CGCGGATCCGCGATAACTTC 3’)
模板DNA 5μg(5’CCCAAGCTTGGGTATGAGAG-40N-
GAAGTTATCGCGGATCCGCG 3’)
其中，所述下游引物是生物素修饰的下游引物。
PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，热循环共20次，热循环条件为94℃变性1分钟，55℃复性50秒，72℃延伸50秒，最后72℃延伸10分钟。
得到PCR扩增的产物，将所述产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行胶回收，以去除聚合酶和未反应的引物。使用EppendorfBioPhotometer Plus对回收的DNA进行定量，并根据DNA的量决定表面具有链霉亲和素修饰的顺磁性磁珠加入量，所述DNA与磁珠的摩尔比为1∶3。将DNA与磁珠孵育30分钟后，用PBS-T缓冲液清洗磁珠2遍，然后用200μL100mM的NaOH使dsDNA(双链DNA)变性，磁力分离，去除磁珠，得到ssDNA溶液，将所述ssDNA溶液用酸中和后，得到用作筛选的ssDNA随机文库。
(2)甲苯磺酰基修饰的磁珠购于北京思尔成公司，按磁珠的使用说明书将糜蛋白酶以共价结合形式固定在所述甲苯磺酰基修饰的磁珠上，得到共价结合糜蛋白酶的甲苯磺酰基修饰的磁珠，以所述共价结合糜蛋白酶的甲苯磺酰基修饰的磁珠为靶目标进行糜蛋白酶核酸适配子的第1轮SELEX筛选：将所述共价结合糜蛋白酶的甲苯磺酰基修饰的磁珠与步骤(1)中所述用作筛选的ssDNA随机文库在37℃下孵育2小时，之后进行磁力分离，并用PBS缓冲液清洗磁珠2遍，加入100μL PBS缓冲液，在94℃水浴锅中静置10分钟，之后行磁力分离磁珠，获得100μL含有ssDNA的PBS溶液，将所述含有ssDNA的PBS溶液为模板，以上游引物(5’CCCAAGCTTGGGTATGAGAG 3’)和生物素修饰的下游引物(5’-biotin-C6-CGCGGATCCGCGATAACTTC 3’)进行PCR，并进行电泳检测，得到80bp的目标条带后切胶回收，再次进行ssDNA的制备，所述ssDNA的制备方法同步骤(1)中对目标条带进行胶回收之后的操作方法，得到第1轮SELEX筛选出的ssDNA文库；以所述第1轮SELEX筛选出的ssDNA文库为模板进行第2轮SELEX筛选。
(3)之后每一轮SELEX筛选均按照所述步骤(2)中第1轮SELEX筛选的方法进行，不同的是随着筛选的进行，PCR中引物的用量和热循环次数逐渐减少，具体的为：第1轮～第3轮引物用量100pmol，热循环25次；第4轮～第7轮引物用量80pmol，热循环20次；第8轮～第10轮引物用量60pmol，热循环15次。其中，每隔3轮SELEX筛选，要进行1次反筛选，即使用未固定糜蛋白酶的甲苯磺酰基磁珠为靶目标，与前一轮SELEX筛选得到的ssDNA文库进行孵育，2小时后磁力分离去除磁珠，这样便可将与磁珠特异性结合的ssDNA除去，避免磁珠对筛选的影响。如图1所示，ladder(分子量阶梯)为10bp，左侧的是阴性对照，ladder右侧从左到右的依次是第1轮到第9轮的PCR产物，所有PCR产物的条带都显示在80bp处，阴性对照条带集中在20bp处，是引物的指示带。
经过10轮的SELEX的筛选，将每1轮制备出的ssDNA与等摩尔质量的糜蛋白酶进行酶联免疫吸附实验，对各轮ssDNA对糜蛋白酶的结合量和结合能力进行表征。如图3所示，图3中左侧纵坐标表示吸光度(absorbency)，横坐标1～10分别表示第1～10轮SELEX的筛选制备出的ssDNA与等摩尔质量的糜蛋白酶进行酶联免疫吸附实验后的样品，横坐标11和12为空白对照样品。可以看到，通过10轮的筛选，糜蛋白酶与ssDNA的结合力不再升高，达到饱和状态，所以在第10轮筛选之后，终止SELEX筛选。
(4)在得到第10轮SELEX筛选出的ssDNA之后，对所述第10轮SELEX筛选出的ssDNA进行PCR扩增，使用的引物是无修饰的上游引物(5’CCCAAGCTTGGGTATGAGAG 3’)50pmol和无修饰的下游引物(5’CGCGGATCCGCGATAACTTC 3’)50pmol，热循环次数为15次，扩增结束后电泳检测，结果如图2所示，10bp的ladder两侧均为第10轮PCR扩增的产物，所有产物的条带都显示在80bp处，产物条带明亮清晰。使用pEASY-T1克隆试剂盒将第10轮SELEX筛选出的ssDNA经PCR扩增的产物克隆至Tran1-T1感受态细胞中，经过热激、孵育后，均匀的将其涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时，菌株生长出，如图4所示，菌株菌落呈白色圆斑状，清晰明显，挑选其中的单个菌落，置于LB液体培养基中，37℃培育4小时，然后进行测序，最终得到本发明所述的一组糜蛋白酶核酸适配子的核苷酸序列，所述核苷酸序列为核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述核苷酸序列之一，所述核酸适配子与糜蛋白具有高特异性和高亲和力。
本实施例中用于SELEX筛选的原始随机寡核苷酸库由TaKaRa公司合成，引物序列由Invitrogen公司合成，其中原始随机核苷酸文库中有40个碱基为随机产生，序列为5’CCCAAGCTTGGGTATGAGAG-40N-GAAGTTATCGCGGATCCGCG 3’，库容量为1015，上游引物序列为：5’CCCAAGCTTGGGTATGAGAG 3’，下游引物序列为：5’CGCGGATCCGCGATAACTTC 3’，生物素修饰的下游引物序列为：5’-biotin-C6-CGCGGATCCGCGATAACTTC 3’，甲苯磺酰基修饰的磁珠和链霉亲和素修饰的磁珠购于北京思尔成公司，PCR试剂盒购于Promega公司，Tran1-T1载体和pEASY-T1克隆试剂盒购于北京全式金公司，糜蛋白酶购于Sigma公司。
实施例3
以核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子为基础的糜蛋白酶反应器的制备与应用。
将实施例2中获得的糜蛋白酶核酸适配子(核苷酸序列表中SEQ ID No.1)、表面氨基修饰的硅胶颗粒、戊二醛和聚醚醚酮(PEEKsil)色谱微柱等作为实验材料，对糜蛋白酶进行动态固定化，步骤如下：
(1)称取40mg表面氨基修饰的硅胶颗粒，室温下与戊二醛持续磁力搅拌反应2小时，反应后用NaCO3/NaHCO3(20mM，pH＝9.2)缓冲液清洗3次，再用三蒸水清洗3次，之后加入5’端氨基修饰的糜蛋白酶核酸适配子(核苷酸序列表中SEQ ID No.1)，持续磁力搅拌反应3小时后，用NaCO3/NaHCO3缓冲液清洗3次、三蒸水清洗3次，最终得到表面接枝有所述5’端氨基修饰的糜蛋白酶核酸适配子的硅胶颗粒；
(2)将所述硅胶颗粒装入到动态混匀器的磁力搅拌腔中，将聚醚醚酮色谱微柱的一端安装柱前过滤器，前过滤器筛板孔径为2μm，以防止填充颗粒的流失，将聚醚醚酮色谱微柱的另一端接到动态混匀器的四通阀上，将动态混匀器中的磁力搅拌器与微流泵相连，准备填充；
(3)首先用0.1mL min-1流速的色谱级纯乙腈填充动态混匀器的磁力搅拌腔5分钟。之后将所述乙腈的流速调整至0.01mL min-1，直到聚醚醚酮色谱微柱末端有乙腈流出，打开磁力搅拌器的开关开始装填聚醚醚酮色谱微柱，关泵，压力降为零后将聚醚醚酮色谱微柱卸下，并在聚醚醚酮色谱微柱的另一端安装柱前过滤器，得到制备好的聚醚醚酮色谱微柱；将制备好的聚醚醚酮色谱微柱接到微流液相系统中，用0.1mL min-1流速的三蒸水冲洗平衡；
(4)平衡后，用10mM Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液平衡聚醚醚酮色谱微柱系统30分钟，流速设定为5μL min-1，然后将糜蛋白酶溶解到所述Tris-HCl缓冲液中，以流动相方式进样，让所述含有糜蛋白酶的Tris-HCl缓冲液流经聚醚醚酮色谱微柱并在聚醚醚酮色谱微柱内部进行动态固定化，在273nm波长处检测糜蛋白吸收峰，30分钟后固定化过程结束，继续用色谱级的纯乙腈冲洗聚醚醚酮色谱微柱，平衡30分钟，得到糜蛋白酶聚醚醚酮反应器，即固定化后的糜蛋白酶反应器；
(5)将所述制备好的糜蛋白酶反应器，以5μL min-1的流速分别酶解100μL 1mg mL-1的牛血清白蛋白、肌红蛋白、细胞色素C 3种蛋白，以及所述3种蛋白的混合物，1小时后收集酶解后的样品，冷冻干燥，用色谱流动相(含0.1％甲酸的水溶液)溶解后进HPLC-ESI-Trap系统，检测；
(6)经过酶解后的3种蛋白以及3种蛋白的混合物，通过质谱检测，分别酶解的3种蛋白的肽段覆盖率分别为：牛血清白蛋白23％、肌红蛋白43％、细胞色素C 58％，3种蛋白的混合物酶解后肽段覆盖率分别为：牛血清白蛋白22％、肌红蛋白41％、细胞色素C 53％，连续三天进行平行实验，结果相差不明显，说明聚醚醚酮色谱微柱中的糜蛋白酶活力保持较好；
(7)实验结束后，使用60％的乙腈水溶液作为流动相冲洗，可将固载到所述核酸适配子上的糜蛋白酶洗脱，洗脱后的糜蛋白酶溶液置于-20℃保存，再次使用前将其解冻，利用动态固定化方法，即步骤(4)将其重新固载，所述糜蛋白酶反应器即可恢复功能；
(8)用所述恢复功能后的糜蛋白酶反应器对细胞色素C进行了3次重复酶解，肽段覆盖率分别为52％、50％、51％，这样，利用所述糜蛋白酶核酸适配子为基础的糜蛋白酶反应器，达到了酶解的高效率，并实现了糜蛋白酶的回收和再生，节约了实验成本。
本发明所述具有核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列的一组共27条糜蛋白酶核酸适配子是在SELEX筛选10轮后得到的混合物，经过转染、克隆、测序得到的，SELEX技术本身指的就是指数富集进化，在最后一轮即第10轮得到的产物，无论是27条还是270条甚至更多，其对配体(糜蛋白酶)的结合能力和专一性是一致的，因为结合能力弱和专一性差的序列在之前的筛选过程中已经被淘汰掉，指数富集的意义就在于新一轮筛选产物的亲和力和专一性都要比上一轮产物的亲和力和专一性得到了指数级别的提升，随着一轮一轮筛选的进行，在亲和力不再提升的第10轮产物中，所述27条糜蛋白酶核酸适配子每一条表现出的亲和力和特异性是一致的，至少处于同一个数量级上，所以，实施例2中得到的核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的27条糜蛋白酶核酸适配子中任何一条都具有代表性。实施例3的数据虽然只是应用核苷酸序列表中SEQ ID No.1所述的糜蛋白酶核酸适配子得到的，但具有科学的代表性，可以证明SEQ ID No.2～SEQ ID No.27所述的糜蛋白酶核酸适配子均具有同样的功能。
本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于：所述核酸适配子的核苷酸序列选自序列表中的SEQ ID No.1～SEQ ID No.27。
2.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于：所述SEQ ID No.1所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.2所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.3所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.4所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.5所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.6所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.7所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.8所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.9所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.10所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.11所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.12所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.13所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.14所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.15所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.16所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.17所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.18所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.19所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.20所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.21所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.22所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.23所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.24所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.25所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.26所述的核苷酸序列具有下述结构：
所述SEQ ID No.27所述的核苷酸序列具有下述结构：
3.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于：所述核酸适配子是与核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列之一序列一致性为60％以上，并且具有相同功能的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于：所述核酸适配子是能够与核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列之一杂交，并且具有相同功能的寡核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于：所述核酸适配子是核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列之一转录的RNA序列。
6.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于：所述核酸适配子是核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列之一的不少于一个位置的A或T或C或G被稀有碱基甲基化嘌呤或二氢尿嘧啶或次黄嘌呤置换所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于：所述核酸适配子是核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列之一的任何位置删除或增加部分寡核苷酸残基所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
8.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于：所述核酸适配子是核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述的核苷酸序列之一的不少于一个位置进行磷酸化或甲基化或氨基化或巯基化或同位素化或结合生物素或结合地高辛或结合荧光物质或结合纳米发光材料或酶标记修饰所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
9.一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
(1)用作筛选的ssDNA的制备：使用上游引物和生物素修饰的下游引物对原始随机寡核苷酸库进行PCR扩增，扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳纯化并回收，得到回收的产物，将回收的产物与表面具有链霉亲和素修饰的顺磁性磁珠反应，再利用碱变性，磁力分离去除磁珠，得到ssDNA溶液，将所述ssDNA溶液用酸中和后，得到用作筛选的ssDNA随机文库；
(2)PCR扩增与糜蛋白酶特异结合的ssDNA，之后进入下一轮筛选；
(3)进行不少于10轮循环的筛选，获得目的核酸适配子扩增后高拷贝数的PCR产物；其中，每隔3轮循环的筛选，进行1次反筛选，即利用未结合糜蛋白酶的固载基质为目标，进行ssDNA的孵育筛选，并去除反筛选后的固载基质；
(4)将最后一轮筛选获得的ssDNA经PCR扩增的产物克隆至菌株中，在合适的条件下培养，得到菌落后挑菌、测序，得到本发明所述的一组糜蛋白酶核酸适配子的核苷酸序列。
10.根据权利要求1～8任一项所述的一组糜蛋白酶核酸适配子的应用，其特征在于：用于对糜蛋白酶进行检测、分离、纯化以及固定化，应用于生物感应器的制备、目标物质的分析检测，以及制备用于临床诊断的试剂和疾病治疗的药物。
11.根据权利要求10所述的一组糜蛋白酶核酸适配子的应用，其特征在于：将所述核酸适配子用于糜蛋白酶的固定化，以及固定化后的糜蛋白酶反应器的研究与应用。
12.一种糜蛋白酶反应器，其特征在于：所述糜蛋白酶反应器是以核苷酸序列表中SEQ IDNo.1～SEQ ID No.27所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子为基础制备得到。
13.根据权利要求12所述的一种糜蛋白酶反应器的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
(1)表面氨基修饰的硅胶颗粒与戊二醛进行反应，而后加入5’端氨基修饰的核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子，持续磁力搅拌，最终得到表面接枝有所述5’端氨基修饰的糜蛋白酶核酸适配子的硅胶颗粒；
(2)使用动态混匀器将所述硅胶颗粒装填至聚醚醚酮色谱微柱中；
(3)填充结实后，用Tris-HCl缓冲液平衡所述聚醚醚酮色谱微柱系统，然后将糜蛋白酶溶解到Tris-HCl缓冲液中，以流动相方式进样，使糜蛋白酶流经所述聚醚醚酮色谱微柱并进行动态固定化，得到糜蛋白酶反应器；
(4)制备好的糜蛋白酶反应器，作为蛋白质类样品的在线酶解反应器进行蛋白质类样品的酶解反应，用于蛋白质和蛋白质组学的研究；
(5)所述酶解反应结束后，使用乙腈水溶液作为流动相冲洗，可将固载到核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子上的糜蛋白酶洗脱，洗脱后的糜蛋白酶溶液置于≤-20℃条件下保存，再次使用前将其解冻，重复所述步骤(3)将其重新固载，糜蛋白酶反应器即可恢复功能，达到循环使用、可再生的目的。
14.根据权利要求13所述的一种糜蛋白酶反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)所述的乙腈水溶液优选为60％的乙腈水溶液；所述洗脱后的糜蛋白酶溶液的保存条件优选为-20℃。
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