JP2005245254A - アプタマーのスクリーニング方法、及びアプタマー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 下記選別工程(A)及び選別工程(B):(A)前記標的部位の配列又はその一部に相当する配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;(B)高分子材料の全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;の一方を一次選別工程とし、他方を二次選別工程とし、ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリを用いて一次選別工程を行った後、一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて二次選別工程を行う。
【選択図】 図2
Description
特定の生理活性部位に特異的なアプタマーを探し出して医療分野、薬理分野、バイオインダストリー等の広範な分野において研究的及び実用的に利用することが期待されている。従来、特異的アプタマーを探し出す方法としては、SELEX法(試験管内人工進化法 Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)が知られている。この方法によると、標的とする生理活性部位を有する生体高分子材料に対し、ランダムな配列をもつ多数のオリゴヌクレオチドの混合物であるオリゴヌクレオチドライブラリを作用させることにより、親和性の高いオリゴヌクレオチドを選び出し、選び出されたオリゴヌクレオチドを増幅生産して、標的とする生理活性部位に対し特異的に結合するかどうかを確認する。
(A) 前記標的部位の配列又はその一部に相当する配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;
(B) 高分子材料の全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;
の一方を一次選別工程とし、他方を二次選別工程とし、
ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリを用いて前記一次選別工程を行った後、一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて前記二次選別工程を行うことを特徴とする。
また、本発明において提供されるフィブロネクチンのインテグリン結合部位に特異的なアプタマーをスクリーニングする方法は、下記選別工程(C)及び選別工程(D):
(C) 前記インテグリン結合部位の配列又は少なくともArg−Gly−Asp配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;
(D) フィブロネクチンの全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;
の一方を一次選別工程とし、他方を二次選別工程とし、
ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリを用いて前記一次選別工程を行った後、一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて前記二次選別工程を行うことを特徴とする。
本発明において提供されるバイオチップは、上記本発明に係るアプタマーを担体に担持してなることを特徴とするバイオチップである。
(A) ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記標的部位の配列又はその一部に相当する配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段;
(B) ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記高分子材料の全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段;
を有することを特徴とする。
(C) ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記インテグリン結合部位の配列又は少なくともArg−Gly−Asp配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段;
(D) ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記フィブロネクチンの全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段;
を有することを特徴とする。
特に、上記選別工程(C)及び選別工程(D)を有する方法により得られた特異的アプタマーは、比較的強いRGD阻害効果を有している。
特に、フィブロネクチンに特異的なアプタマーをスクリーニングするために、前記選別工程(C)を実施する手段と、前記選別工程(D)を実施する手段を組み合わせてスクリーニングキットを構成し、利用者に提供してもよい。
5’−ATAGGAGTCGACCGACCAGAA−N40−TATGTGCGTCTACATCTAGACTCAT−3’
任意に取り出してクローン化された7つのアプタマーのうち、5つのアプタマー(両端のプライマー配列の間に中間配列N40として配列番号1から5の塩基配列を有する各アプタマー)が未変性フィブロネクチンのインテグリン結合部位に明確に結合した。特にアプタマー1(配列番号1の塩基配列を含むもの)と、アプタマー2(配列番号2の塩基配列を含むもの)は、互いに1塩基のみ異なる配列を有しており、最も強い結合を示した。なお、上記5つのアプタマーの全配列を配列番号6から10に示す。具体的には、配列番号1の塩基配列を含むもの(アプタマー1)の全配列は配列番号6、配列番号2の塩基配列を含むもの(アプタマー2)の全配列は配列番号7、配列番号3の塩基配列を含むものの全配列は配列番号8、配列番号4の塩基配列を含むものの全配列は配列番号9、そして配列番号5の塩基配列を含むものの全配列は配列番号10に示す。
また、上記実験により得られた特異的アプタマー1及び2の比較的強いRGD阻害効果は、潜在的な薬理学活性を示唆しており、医療分野、製薬分野、試薬分野等の広範な分野での利用を期待することができる。
(C) 前記インテグリン結合部位の配列又は少なくともArg−Gly−Asp配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;
を行った後、この一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて下記選別工程(D):
(D) フィブロネクチンの全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;
を行うことを基本的手順とするが、本発明の目的を逸脱しない限り様々な改変を行うことができる。
例えば、前記選別工程(D)を一次選別工程として先に行い、その後、前記選別工程(C)を二次選別工程として行っても、スクリーニングの確立を上げることが可能である。
(A) 前記標的部位の配列又はその一部に相当する配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;
(B) 高分子材料の全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;
の一方を一次選別工程とし、他方を二次選別工程とし、
ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリを用いて一次選別工程を行った後、一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて二次選別工程を行うことによって、当該標的部位に特異的なアプタマーを選別する。
また、高分子材料の分子構造内に存在する標的部位は、生理活性部位に限られず、何らかの目的を持って決定した部位であればよく、例えば、反応性試薬を結合させることを意図して特定された本来は生理活性に関与していない部位なども標的部位とすることができる。
また、実用上又は研究上の利便性を高める目的で、オリゴヌクレオチドであるアプタマーに修飾を行って酵素耐性など何らかの特性を付与してもよく、そのような修飾オリゴヌクレオチドからなるアプタマーも、本発明により得られるアプタマーに包含される。
Claims (38)
- 生体起源の高分子材料の分子構造内に存在する標的部位に特異的なアプタマーをスクリーニングする方法であって、下記選別工程(A)及び選別工程(B):
(A) 前記標的部位の配列又はその一部に相当する配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;
(B) 前記高分子材料の全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;
の一方を一次選別工程とし、他方を二次選別工程とし、
ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリを用いて前記一次選別工程を行った後、一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて前記二次選別工程を行うことを特徴とする、アプタマーのスクリーニング方法。 - 前記選別工程(A)を一次選別工程とし、前記選別工程(B)を二次選別工程とする請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 前記一次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅後、二次選別工程を行う請求項1又は2に記載のスクリーニング方法。
- ランダムな配列の両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群をライブラリとして用い、前記一次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群をPCR法により増幅後、二次選別工程を行う請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群をクローニングしてモノクローナルアプタマーを得る請求項1乃至4いずれかに記載のスクリーニング方法。
- 二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群をプラスミド法によりクローニングする請求項5に記載のスクリーニング方法。
- 二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅した後、クローニングする請求項5又は6に記載のスクリーニング方法。
- ランダムな配列の両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群をライブラリとして用い、前記一次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群をPCR法により増幅した後で二次選別工程を行い、前記二次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群をPCR法により増幅した後でクローニングを行う請求項7に記載のスクリーニング方法。
- 前記高分子材料が蛋白質である請求項1乃至8いずれかに記載のスクリーニング方法。
- フィブロネクチンのインテグリン結合部位に特異的なアプタマーをスクリーニングする方法であって、下記選別工程(C)及び選別工程(D):
(C) 前記インテグリン結合部位の配列又は少なくともArg−Gly−Asp配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;
(D) 前記フィブロネクチンの全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程;
の一方を一次選別工程とし、他方を二次選別工程とし、
ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリを用いて前記一次選別工程を行った後、一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて前記二次選別工程を行うことを特徴とする、アプタマーのスクリーニング方法。 - 前記選別工程(C)を一次選別工程とし、前記選別工程(D)を二次選別工程とする請求項10に記載のスクリーニング方法。
- 前記一次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅後、二次選別工程を行う請求項10又は11に記載のスクリーニング方法。
- ランダムな配列の両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群をライブラリとして用い、前記一次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群をPCR法により増幅後、二次選別工程を行う請求項12に記載のスクリーニング方法。
- 二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群をクローニングしてモノクローナルアプタマーを得る請求項10乃至13いずれかに記載のスクリーニング方法。
- 二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群をプラスミド法によりクローニングする請求項14に記載のスクリーニング方法。
- 二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅した後、クローニングする請求項14又は15に記載のスクリーニング方法。
- ランダムな配列の両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群をライブラリとして用い、前記一次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群をPCR法により増幅した後で二次選別工程を行い、前記二次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群をPCR法により増幅した後でクローニングを行う請求項16に記載のスクリーニング方法。
- 前記請求項1乃至9いずれかに記載のスクリーニング方法を用いて特定された塩基配列、又は、当該配列中の一部の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列、又は、前記いずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを修飾した修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列を含むことを特徴とするアプタマー。
- 前記請求項10乃至17いずれかに記載のスクリーニング方法を用いて特定された塩基配列、又は、当該配列中の一部の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列、又は、前記いずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを修飾した修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列を含むことを特徴とする、フィブロネクチンのインテグリン結合部位に特異的なアプタマー。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4又は配列番号5のいずれかに記載の塩基配列、又は、当該配列中の一部の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列、又は、前記いずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを修飾した修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列を含むことを特徴とする、フィブロネクチンのインテグリン結合部位に特異的なアプタマー。
- 請求項1乃至17いずれかに記載のスクリーニング方法を用いて特定された塩基配列、又は、当該配列中の一部の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列、又は、前記いずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを修飾した修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列を含むアプタマーを担体に担持してなることを特徴とするバイオチップ。
- 生体起源の高分子材料の分子構造内に存在する標的部位に特異的なアプタマーをスクリーニングするシステムであって、一方が一次選別に用いられ他方が二次選別に用いられる下記選別手段(A)及び(B):
(A) ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記標的部位の配列又はその一部に相当する配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段;
(B) ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記高分子材料の全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段;
を有することを特徴とするスクリーニングシステム。 - 前記選別手段(A)を用いてランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリの一次選別を行った後、前記選別手段(B)を用いて前記一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を二次選別する請求項22に記載のスクリーニングシステム。
- 前記一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅する手段をさらに有する、請求項22又は23に記載のスクリーニングシステム。
- 前記一次選別後の増幅手段は、両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群を増幅するPCR法を実施する手段である、請求項24に記載のスクリーニングシステム。
- 前記二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群をクローニングする手段をさらに有する、請求項22乃至25いずれかに記載のスクリーニングシステム。
- 前記二次選別後のクローニング手段は、プラスミド法を実施する手段である、請求項26に記載のスクリーニングシステム。
- 二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅する手段をさらに有する、請求項26又は27に記載のスクリーニングシステム。
- 前記二次選別後の増幅手段は、両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群を増幅するPCR法を実施する手段である、請求項28に記載のスクリーニング方法。
- 前記高分子材料が蛋白質である請求項22乃至29いずれかに記載のスクリーニングシステム。
- フィブロネクチンのインテグリン結合部位に特異的なアプタマーをスクリーニングするシステムであって、一方が一次選別に用いられ他方が二次選別に用いられる下記選別手段(C)及び選別手段(D):
(C) ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記インテグリン結合部位の配列又は少なくともArg−Gly−Asp配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段;
(D) ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記フィブロネクチンの全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段;
を有することを特徴とするスクリーニングシステム。 - 前記選別手段(C)を用いてランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリの一次選別を行った後、前記選別手段(D)を用いて前記一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を二次選別する請求項31に記載のスクリーニングシステム。
- 前記一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅する手段をさらに有する、請求項31又は32に記載のスクリーニングシステム。
- 前記一次選別後の増幅手段は、両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群を増幅するPCR法を実施する手段である、請求項33に記載のスクリーニングシステム。
- 前記二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群をクローニングする手段をさらに有する、請求項31乃至34いずれかに記載のスクリーニングシステム。
- 前記二次選別後のクローニング手段は、プラスミド法を実施する手段である、請求項35に記載のスクリーニングシステム。
- 二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅する手段をさらに有する、請求項35又は36に記載のスクリーニングシステム。
- 前記二次選別後の増幅手段は、両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群を増幅するPCR法を実施する手段である、請求項37に記載のスクリーニング方法。
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2004
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