JP2002523059A

JP2002523059A - 基質置換での酵素活性スクリーン

Info

Publication number: JP2002523059A
Application number: JP2000566463A
Authority: JP
Inventors: ペデルセン，ヘンリク; ヘールダー，スベン; ケムス，ヨルゲン; カトリネルン，メッテ
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1998-08-19
Filing date: 1999-08-17
Publication date: 2002-07-30
Also published as: US6642014B1; WO2000011211A1; CA2333490A1; CN1319141A; EP1105521A1

Abstract

(57)【要約】ライブラリー内の残りの触媒分子と比べて、問題の相対的により効率的な特異的触媒活性を有する関心の触媒分子の、触媒分子からの試験管内選択のための方法であって、それが最終的に収集される前に、問題の触媒分子による多重触媒活性ターンオーバー（即ち基質から産物への触媒活性ターンオーバー）を許容することを特徴とする試験管内選択法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は、交換可能なリンカー対：Ｘ及びＹにより基質に結合した関心の触媒
のライブラリー、並びに該ライブラリー中の触媒のうちより活性なものを単離す
るために多重触媒ターンオーバーイベントを用いる選択方法に関する。

【０００２】発明の背景過去に、新しいバイオポリマー（即ちＤＮＡ，ＲＮＡ又はポリペプチド）ベー
スの触媒がいくつかの異なる方法で形成されている。以下のパラグラフはこれら
の選択スキームのいくつかを記述する。（１）遷移状態アナログへの結合触媒であるＲＮＡ，ＤＮＡ及びタンパク質（特に抗体）は、このアプローチに
よって単離されている。それは、遷移状態アナログ（ＴＳＡ）でのマウスの免疫
化による触媒性抗体の単離に適用されており、またファージ上に提示される抗体
並びにＲＮＡ及びＤＮＡライブラリーもＴＳＡで攻撃されている。そのアイデア
は、所定のＴＳＡに結合する分子（タンパク質、ＲＮＡ又はＤＮＡ）は基質に結
合するらしく、その遷移状態の幾何的配置及び／又はエネルギーを安定化させる
というものである。これは、触媒を引きおこし得る。

【０００３】その方法は、触媒活性自体について選択するのではなく、遷移状態アナログ（
ＴＳＡ）に結合することについて選択する。しかしながら、それは、新規触媒を
単離するために現在最も用いられている方法の１つであるので、ここに含まれて
いる。このアプローチで直面する問題は、ｉ）標的反応の詳細な機械学の知識が
（好適なＴＳＡをデザインするために）必要とされること；ii）多くの場合、遷
移状態に適切に類似するＴＳＡは、その反応座標の構造的及び電気的動力学に擬
態することができないことを含む。

【０００４】結果として、このアプローチによりより限定されたセットの反応型しか上手く
標的にされていない。ほとんどの場合、その単離された触媒は乏しいターンオー
バー数しかない。（２）活性触媒の機能的タッギングこの選択スキームは、タンパク質及び核酸に適用されている。その基質は、反
応産物が反応の間に形成されるようにデザインされる（基質は“自殺基質”又は
“インヒビターアナログ”と呼ばれる）。反応性産物は、それを生産する触媒と
反応して共有結合を形成するようである。結果として、活性触媒は、結合したラ
ベルにより不活性なものから分離することができる。ファージ上に提示される触
媒性抗体がこの方法により分離されており、触媒的に活性な及び不活性なタンパ
ク質はこのアプローチを用いて分離することができることがモデルシステムにお
いて示された。この方法により、まれな触媒を単離することができる。

【０００５】このアプローチでの重要な限定は、ｉ）多くの反応のために、好適な自殺基質
をデザインすることが可能でないことがある。ii）成功する触媒は、典型的には
分のオーダーである、選択的プロセス／ラウンドの間に１回のターンオーバーの
みを行う必要がある。従って、有効な触媒についての選択的な利点はない。（３）連続的展開（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（ＲＮＡ）ＲＮＡライブラリーを、同じ分子内に基質及び潜在的な触媒ドメインの両方を
含むようデザインする。要求される反応（典型的には連結）を行うことができる
ＲＮＡは、増幅（逆転写の後のＲＮＡポリメラーゼ転写）のためにそれ自体を“
活性化する”であろう。ヌクレオチド前駆体の適切な希釈及び添加により、この
連続的選択は数時間にわたって維持され、後に分析され得る。

【０００６】その方法は、２つの重要な限定を有する：ｉ）基質及び触媒の両方が核酸でな
ければならない；ii）触媒される反応及び成功した酵素の増幅が分離されないの
で、選択ステップの時間は、標的反応のターンオーバー時間及び“活性化された
”分子の増幅の時間の合計である。これにより、増幅は秒のオーダーであるので
、有効な触媒のための選択的利点はない。

【０００７】４．基質−酵素−連結化選択（ＳＥＬＳ）現在、標的反応の基質の、その結合した基質に対して潜在的な触媒活性を有す
るタンパク質への結合に関する方法が記載されている（Pedersen et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., US, 1998, vol. 95, pp. 10523-10528 ; Jestin et al., 1
999, Angew. Chem. Int. Ed., vol. 38, pp. 1124-1127 ; Demartis et al., 19
99, JMB, vol. 286, pp. 617-633 ; Neri et al., 1997, WO 97/40141）。基質
の分子内変換により、活性触媒は結合した産物を用いて単離することができる。

【０００８】このスキームは極めて一般的である。しかしながら、成功する触媒は、典型的
には分のオーダーである、選択的プロセス１ラウンドの間に１回のターンオーバ
ーだけを行うことが要求されるので、同じ理由のため、おそらく、この選択スキ
ームで少し異なる比活性を有する酵素を区別することは可能でない。発明の概要本発明により触媒すべき問題は、触媒分子のライブラリーから、該ライブラリ
ー内の触媒分子の残りのものと比べて、相対的により有効な関心の特定の触媒活
性を有する関心の触媒分子を試験管内で選択するための方法であって、該試験管
内選択法が、最終的に収集される前に、前記関心の触媒分子による多重触媒活性
ターンオーバー（即ち基質から産物への触媒活性ターンオーバー）を許容するこ
とを特徴とする方法を供することである。

【０００９】その解決法は、前記試験管内選択法においていくつかの個々のユニットを含む
新規サンプルを用いることに基づく。前記新規サンプルの特徴の要約をすぐ以下に示す。前記新規サンプルは、個々のユニットの形態で供される触媒分子のライブラリ
ーを含み、ここでその個々のユニットは、次の一般構造：Ｃ−ＸＹ−Ｓ（式中、Ｃは触媒分子であり、ＸＹは交換対であり、そしてＳは前記触媒分子
のライブラリー内に含まれる少くとも１の触媒により産物に触媒され得る基質で
ある）を有する第１の型の個々のユニットを含み、それにより、一般構造：Ｃ−ＸＹ−Ｐ（式中、Ｃ及びＸＹは先に定義した意味を有し、そしてＰは第１の型の個々の
ユニットの基質Ｓの触媒変換から生ずる産物分子である）を含む第２の型の個々
のユニットを得る可能性を供する。このような個々のユニットの好適な例の図で
の説明については図１を参照のこと。

【００１０】次に、前記新規サンプルは、以下の機能的に定義された特徴を含むことを特徴
とする：特徴１：基質Ｓは前記個々のユニット内で触媒と基質との間の触媒反応を許容するコン
フィグレーションで触媒に結合し；そして前記基質及び触媒の結合の性質は、その産物の特徴を用いて、反応基質分子を
産物分子に触媒することができる触媒分子のあいまいでない同定を許容する情報
を含む存在物を単離する可能性を供する。

【００１１】説明のため、図１を引用すること、ここには上述の特徴１を含むこのような個
々のユニットの好適な例が示される。特徴２：前記いくつかの個々のユニットを含み、かつ上述の特徴１を含むサンプルは、
前記ＸＹ交換対がＹ−成分の別のＹ−成分との非対称（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）
交換（即ちＹはＸでなくＹと交換する）を許容することを特徴とし；それにより
、前記ＸＹ交換対は、次に、ユニット構造：触媒−ＸＹ交換対−産物及び“Ｙ−基質”成分の間の交換反応を許容し、それによりユニット構造：触媒−ＸＹ交換対−基質を形成する。

【００１２】説明のため、図２を引用する。ここでは、上述の特徴２を含む、このような個
々のユニットの好適な例を示す。次に、本明細書に記載（後述）される試験管内選択法においてこのような新規
サンプルを用いることは、関心の触媒分子により形成された産物分子の特徴に本
質的に基づくだけで、関心の触媒分子を選択する可能性を供し（特徴１がこれを
許容する；説明については図１を参照のこと）；そして、それは更に、前記ライブラリー内の触媒分子の残りのものと比べて、
相対的により有効な関心の特定の触媒活性を有する関心の触媒分子を選択する可
能性を供し、ここで前記選択は、前記関心の触媒分子が多重触媒活性ターンオー
バー（即ち基質から産物への触媒活性ターンオーバー）を行うことを許容した後
に最初に最終的に収集されることを特徴とする。

【００１３】従って、本発明の第１の態様は、試験管内選択システムに用いるために適した
複数の個々のユニットを含むサンプルであって、該試験管内選択システムの目的
が、触媒分子のライブラリーから、該ライブラリー内の触媒分子の残りのものと
比べて、相対的により有効な関心の特定の触媒活性を有する関心の触媒分子を選
択することであり、そして前記試験管内選択システムが、最終的に収集される前
に、前記関心の触媒分子による複数の触媒活性ターンオーバー（即ち基質から産
物への触媒活性ターンオーバー）を許容することを特徴とし、そして前記サンプ
ルが、（ｉ）個々のユニットの形態で供される触媒分子のライブラリーであって、該
個々のユニットが、一般構造式：Ｃ−ＸＹ−Ｓ（式中、Ｃは触媒分子であり、ＸＹはＸＹ交換対であり、そしてＳは前記触媒分
子のライブラリー内に含まれる少くとも１の触媒により産物に触媒され得る基質
である）を有する第１の型の個々のユニットを含み、それにより一般構造式：Ｃ−ＸＹ−Ｐ（式中、Ｃ及びＸＹは先に定義した意味を有し、そしてＰは前記第１の型の個々
のユニットの基質Ｓの触媒交換から生ずる産物分子である）を含む第２の型の個
々のユニットを得る可能性を与えるライブラリーを含み；そして（ａ）前記基質Ｓは、前記個々のユニット内での前記触媒と前記基質との間の触媒反応を許容するコンフィグレーションで前記触媒に結合し；（ｂ）前記基質及び触媒の結合の性質は、前記産物の特徴を用いて、反応基質
分子を産物分子に触媒することができる触媒分子の明白な同定を許容する情報を
含む存在物を単離する可能性を与え；（ｃ）前記複数の個々のユニットを含むサンプルは、前記ＸＹ交換対がＹ成分
の別のＹ成分との非対称交換（即ちＹがＸとではなくＹと交換する）を許容し、
それにより前記ＸＹ交換対が、次に、ユニット構造：触媒−ＸＹ交換対−産物と、 “Ｙ−基質”成分と、の間の交換反応を許容し、それによりユニット構造：触媒−ＸＹ交換対−基質を形成することを特徴とするサンプルに関する。

【００１４】上述の第１の態様によるサンプル内に含まれる“個々のユニット”との用語は
、本発明の第１の態様においてポイント（ｉ）下に特定される一般構造；本発明
の第１の態様においてポイント（ａ）及び（ｂ）下に特定される触媒分子に結合
した基質分子；並びに本発明の第１の態様においてポイント（ｃ）下に特定され
るＸＹ交換対を含む個々のユニットをいう。このような個々のユニットの好適な
例について図１及び２を参照のこと。

【００１５】用語“一般構造：触媒−ＸＹ交換対−基質；又は触媒−ＸＹ交換対−産物を含む個々のユニット ”とは、前記個々のユニットが、前記存在物の各々の少くとも
１分子、即ち少くとも１の触媒分子、少くとも１のＸＹ交換対分子、及び少くと
も１の基質分子又は少くとも１の産物分子を含むことをいう。従って、前記個々
のユニットは、例えば同一の触媒分子の１を超えるコピーを含んでもよく、又は
いくつかの異なる触媒分子を含んでもよい。

【００１６】更に、前記個々のユニット内の個々の存在物間にある“−”との語は、前記個
々のユニット内の前記個々の存在物間に物理的接続があることをいい、即ち触媒
−ＸＹ交換対−基質又は触媒−ＸＹ交換対−産物間に物理的接続が存在すること
をいう。更に、本明細書に記載される“個々のユニット”は、分離した個々のユニット
を単離するために、前記サンプル内で、前記個々のユニットを他の異なる個々の
ユニットから物理的に分離することが可能である個々のユニットをいう。

【００１７】用語“異なる個々のユニット”とは、異なる触媒分子を各々独立して含む異な
る個々のユニットをいい、即ち２つの異なる個々のユニットの例は、（１）触媒分子¹ −ＸＹ交換対−基質；及び（２）触媒分子² −ＸＹ交換対−基質であり、ここで触媒分子¹ 及び触媒分子² は、２つの異なる触媒分子をいう。

【００１８】用語“複数の異なる個々のユニットを含むサンプル”とは、少くとも２の異な
る個々のユニット、好ましくは少くとも１００の異なる個々のユニット、より好
ましくは少くとも１０，０００の異なる個々のユニット、より好ましくは少くと
も１０⁶ の異なる個々のユニット、より好ましくは少くとも１０⁸ の異なる個々
のユニット、より好ましくは少くとも１０¹⁰の異なる個々のユニット、更に好ま
しくは少くとも１０¹²の異なる個々のユニット、そして最も好ましくは少くとも
１０¹⁴の異なる個々のユニット、を含むサンプルをいう。基本的に、異なる個々
のユニットの実際の数は触媒分子のライブラリーの実際のサイズに相当する。

【００１９】用語“複数の個々のユニットを含むサンプル”及び用語“複数の異なる個々の
ユニットを含むサンプル”は、本明細書において交換可能に用いることができる
。用語“触媒分子のライブラリー”とは、少くとも２の異なる触媒分子、好まし
くは少くとも１００の異なる触媒分子、より好ましくは少くとも１０，０００の
異なる触媒分子、より好ましくは少くとも１０⁶ の異なる触媒分子、より好まし
くは少くとも１０⁸ の異なる触媒分子、より好ましくは少くとも１０¹⁰の異なる
触媒分子、更に好ましくは少くとも１０¹²の異なる触媒分子、そして最も好まし
くは少くとも１０¹⁴の異なる触媒分子、を含むライブラリーをいう。

【００２０】用語“前記触媒分子のライブラリー内に含まれる少くとも１の触媒分子により産物分子に触媒され得る基質 ”は、基本的に、いずれかの好適な基質分子をいう
。本質的に、前記基質分子は、選択することが要求される特定の触媒活性に従っ
て選択される。例えば、要求される触媒活性がプロテアーゼであるなら、好適な
基質はペプチド分子であり得、その産物は分解されたペプチドであろう。用語“
基質”及び“基質分子”は交換可能に用いることができる。

【００２１】用語“産物”とは、本明細書で特定される触媒により基質から産物への触媒反
応によって得られる産物をいう、用語“産物”及び“産物分子”は、交換可能に
用いることができる。用語“触媒”とは、要求される触媒活性を有するいずれかの触媒分子、例えば
有機及び無機分子、タンパク質、酵素、ペプチド、核酸、バイオポリマー及び非
生物学的ポリマー、小有機又は無機分子をいう。用語“触媒”及び“触媒分子”
は、交換可能に用いることができる。

【００２２】用語“基質が前記個々のユニット内で触媒及び基質の間の触媒反応を許容するコンフィグレーションで触媒に結合する ”とは、基質と触媒との間の、個々のユ
ニットの各々の中での直接的又は間接的物理的接続をいう。この接続は、好まし
くは、異なる個々のユニットでの触媒及び基質の相互作用を最小にしながら、個
々のユニット内での触媒及び基質の生産性相互作用を最大にするべきである。

【００２３】本発明の第１の態様のポイント（ｂ）に従う“前記基質及び触媒の結合の性質が、産物の特徴を用いて、反応基質分子を産物分子に複数回、触媒することができる触媒分子の明白な同定を許容する情報を含む存在物を単離する可能性を供する ”との用語は、前記存在物が産物の１又は複数の特徴を用いて単離されること
をいう。

【００２４】産物の好適な特徴の一例は、該産物が、マトリックスに結合し、基質がマトリ
ックスに結合しないことである。この場合、好適な選択プロトコルは、個々のユ
ニットが触媒−ＸＹ交換対−基質−マトリックスの形態で固体支持体に結合し、
そしてそれが触媒−ＸＹ交換対−産物の形態である時に遊離されることであり得
る。このようなシステムの一例の詳細な記載については本明細書の研究例（後述
）が引用される。

【００２５】産物の好適な特徴の別の例は、該産物が図１に示すようにレセプターに結合す
ることであり得る。本発明の第１の態様におけるポイント（ｂ）に従う用語“反応基質分子を産物分子に触媒することができる触媒分子の明白な同定を許容する情報を含む存在物
”は、前記情報が触媒分子自体の中に保有されている存在物、又は触媒を明白に
同定する可能性を供する他の種類の情報を含む存在物のいずれかをいう。このよ
うな他の種類の情報は、例えば、関心の触媒分子がペプチド又はポリペプチドで
ある場合、ペプチド又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む存在物であ
り得る。この詳細は、単離された存在物がファージの表面上に結合した関心のポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む繊維状ファージである場合であり得る
。

【００２６】先に特定される個々のユニット内に含まれる“ＸＹ交換対”との用語は、触媒
がＸＹ交換成分を介して基質に結合している、即ち個々のユニットが次の一般構
造：触媒−ＸＹ交換対−基質を有し、そして前記ＸＹ交換対が本発明の第１に態
様におけるポイント（ｃ）に従う基準を満たしていることをいう。好ましくは、ＸＹ成分は、遊離Ｙの欠如下で安定であるが、遊離ＹのＸに結合
したＹとの迅速かつ特異的な交換（遊離ＹのＸとの交換ではない）を許容する。
この交換反応は、個々のユニット：触媒−ＸＹ交換対−産物がＹ−基質化合物と
接触するなら産物を基質で置きかえることができる。

【００２７】ＸＹ交換対は、例えば以下の特徴を有し得る。ｉ）Ｘ及びＹは共有結合でも非共有結合でもよく；そして ii）ＸＹ交換対は、小有機（例えばＥＤＴＡ）及び無機（例えば金属、ホスフ
ェート）分子並びに高分子（例えば核酸、ペプチド）を含むいずれの種類の分子
からなってもよい。

【００２８】更なる詳細については以下を、図での説明については図２，３及び４を参照の
こと。第２の態様において、本発明は、触媒分子のライブラリーから、該ライブラリ
ー内の触媒分子の残りのものと比べて、相対的により有効な関心の特定の触媒活
性を有する関心の触媒分子を試験管内選択のための方法であって、該試験管内選
択法が、最終的に収集される前に、前記関心の触媒分子による複数の触媒活性ターンオーバー（即ち基質から産物への触媒活性ターンオーバー）を許容すること
を特徴とし、そして前記方法が、（ｉ）本発明による複数の個々のユニットを含むサンプルを、関心の触媒分子
が関心の触媒活性を行う好適な条件下に、そして更に前記個々のユニットがＹ− 基質化合物に接触する条件下におき；（ii）前記産物分子を含む１又は複数の個々のユニットについて選択すること
により関心の触媒について選択し、（iii）前記産物の特徴を用いて、前記反応基質を産物に複数回、触媒するこ
とができる関心の触媒分子の明白な同定を許容する情報を含む存在物を単離し；
そして任意に、（iv）ステップ（iii）の前記存在物に含まれる情報を用いて前記関心の触媒
分子を形成して該形成された関心の触媒分子を含む個々のユニットを作製し、そ
して次にこの個々のユニットを繰り返しステップにおける出発材料として用いる
ことにより、ステップ（ｉ）〜（iii）を１又は複数回、繰り返すことを含む方法に関する。

【００２９】本発明の第２の態様のステップ（ｉ）による用語“関心の触媒分子が関心の触媒活性を行う好適な条件下 ”とは、関心の触媒分子が関心の触媒活性を行ういず
れかの好適な条件をいう。このような好適な条件は、選択の目的がアルカリpHで活性を有する関心の触媒
を同定することである。

【００３０】本発明の第２の態様におけるポイント（ｉ）に従う用語“前記個々のユニットをＹ−基質化合物に接触させる ”とは、個々のユニット及びＹ−基質化合物が、
本発明の第１の態様におけるポイント（ｃ）で特定した交換反応が可能であるよ
うに適切に近いことをいう。前記接触は、例えば、個々のユニット及びＹ−基質
化合物が一緒に拡散して、それにより互いに接触し得る緩衝液中であり得る。図
での説明について図２を参照のこと。

【００３１】本発明の第２の態様のステップ（iii）に従う用語“反応基質を産物に複数回
、触媒することができる関心の触媒分子”は、前記関心の触媒分子が基質から産
物への触媒反応を少くとも２回、より好ましくは少くとも１００回、より好まし
くは少くとも１０，０００回、更により好ましくは少くとも１０⁶ 回、そして最
も好ましくは少くとも１０¹⁰回、行うことをいう。

【００３２】用語“関心の触媒分子の明白な同定を許容する情報を含む存在物”とは、前記
情報が触媒分子自体に保有されている存在物、又は触媒を明白に同定する可能性
を供する他の種類の情報を含む存在物のいずれかをいう。このような他の種類の
情報は、例えば、関心の触媒分子がペプチド又はポリペプチドである場合、ＤＮ
Ａ配列を含む存在物であり得る。これは、本発明の第１の態様のポイント（ｂ）
に関連して同じ用語について先に記載されるのと同じ定義である（前掲）。

【００３３】本発明の第２の態様におけるポイント（iv）に従う用語“ステップ（iii）の
前記存在物に含まれる情報を用いて前記関心の触媒分子を形成して該形成された関心の触媒分子を含む個々のユニットを作製し、そして次に該個々のユニットを繰り返しステップにおける出発材料として用いることにより、ステップ（ｉ）〜（iii）を１又は複数回、繰り返す ”とは、前記繰り返しが、１回、より好まし
くは２回、より好ましくは５回超、更により好ましくは１０回超、そして最も好
ましくは２５回超であり得ることをいう。

【００３４】上述の試験管内選択のための方法の利点は、それが、触媒分子が１選択ラウン
ドの間（即ち関心の触媒分子が最終的に収集される前）に基質から産物への多重
ターンオーバーを行うのを許容することである。これは、基質のターンオーバーがないか（上述の“背景”の＃１を参照のこと
）又は基質の１回のターンオーバーがある（上述の＃２及び３）、標的の遷移状
態アナログへの結合に関連する先行技術に記載される選択プロトコルと根本的に
異なる。

【００３５】これは、本発明の方法を用いて可能な選択スキームに従うことにより説明する
ことができる２つの利点を与え得る：ａ）本発明の第２の態様の方法のポイント（ｉ）に従って、関心の触媒分子が
その関心の触媒活性を示す好適な条件下で、そして更に前記個々のユニットがＹ
−基質分子と、産物に特異的に結合するレセプターが産物結合カラムのマトリックスに結合している産物結合カラムの一端（出発端）で、産物−カラム緩衝液内の好適な量のＹ−基質で、接触する条件下に、いくつかの個々のユニットを含む
サンプルを配置し；ｂ）本発明の第２の態様の方法のポイント（ii）に従って、カラムの反対の端（収集端）に最後に到達した個々のユニットを収集することにより、産物分子を
含む１又は複数の個々のユニットについて選択することにより関心の触媒分子に
ついて選択する。

【００３６】この選択スキームでは、とりわけ以下のことが産物−カラム内でおこる：１）関心の潜在的な触媒分子を含む個々のユニットが、結合した基質を産物に
変換し；２）現在、産物を含む個々のユニットが、産物カラムの出発端近くにあるレセ
プターに拡散して結合し；３）産物−カラム、緩衝液中のＹ−基質分子が、触媒分子−ＸＹ交換対−産物
とＹ−基質分子との交換反応を媒介して、それによりユニット構造：触媒分子−
ＸＹ交換対−基質を形成し、それにより上述のステップ（２）の結合した個々の
ユニットの放出を媒介し；４）上述のステップ（３）の放出された個々のユニットは、基質及び関心の潜
在的な触媒分子を現在、含み、それは基質から産物への１回の触媒変換が行われ
、ポイント１の個々のユニットのもとの形態で再生される。従って、前記ユニッ
トは、もう１回、反応（１）を行うことができ；産物カラムの収集端に相対的に
近いレセプターに結合する等。

【００３７】関心の最も有効な特定の触媒活性を有する関心の触媒分子は、所定の時間間隔
で最も基質から変物への変換を行うであろうし結果として、産物−結合レセプタ
ーに固定されたより多くの時間を費すであろう。それゆえ、前記最も有効な触媒
分子を含む個々のユニットは前記カラムの収集端に最後に到達するであろう。本発明の第２の態様の方法のこの例を用いて、当該技術に優る利点は次の通り
であり得る：ｉ）可能性ある“選択可能な”触媒活性は先行技術の選択プロトコルについて
のものよりかなり高くなり得る。選択ステップは、標的反応、産物の産物−結合
カラムへの拡散及び結合、並びにＸＹ−変換反応による産物及び基質の最終的な
変換を行うことに関する。拡散は一般に迅速な過程であるので、選択ストリンジ
ェンシーは、単にカラム上のレセプターに結合する産物の量又は産物−カラム緩
衝液中のＹ−Ｓ成分の型／量により調節され得；更に、例えばより活性に触媒を
単離する手段として電気泳動を用いるなら、レセプターへの拡散は制限因子であ
り得ず、そのため選択ストラテジーはこのシステムで更により高くなり得る。

【００３８】 ii）活性の小さな差を区別することができ；選択ステップは、触媒がカラムを
介して流れることを何回もくり返すので、触媒活性のごく小さな差でさえカラム
上での保持に差を生じ、これにより区別的な富化を引きおこすであろう。最後の態様において、本発明は、関心の触媒分子を生産するための方法であっ
て、本発明による試験管内選択のための方法、及び更に次のステップ：（ａ）関心の単離された触媒分子を、好適な生産法により関心の好適な量で生
産することを行うことを含む方法に関する。

【００３９】本発明の実施形態を以下に例として記載する。発明の詳細な記載本発明の第１の態様に従う複数の個々のユニットを含むサンプルＸＹ交換対：先に記載したように、個々のユニット内で、触媒はＸＹ対を介して基質に物理
的接続する。これにより、個々のユニットは、一般構造：触媒−ＸＹ交換対−基
質を有している。

【００４０】更に、上述の通り、先に特定される個々のユニットに含まれる“ＸＹ交換対”
との用語は、触媒がＸＹ交換成分を介して基質に結合していること、即ち個々の
ユニットが次の一般構造：触媒−ＸＹ交換対−基質を有し、そのＸＹ交換対が本
発明の第１の態様におけるポイント（ｃ）に従う基準を満たすことをいう。更に、その交換対は、好ましくは、ユニット：触媒−ＸＹ交換対−基質が別の
Ｙ−基質成分の欠如下で接続し続けているであろうという意味で安定であり、こ
れは、そのアッセイの条件下でＹ成分が理想的にはいずれかの所定の時間で、基
質が充填されるべきである。これは、Ｙ−基質濃度が、用いる条件下でのＸＹ相
互作用の触媒定数Ｋｄよりかなり高い場合であり得る。ほとんどの場合、最大の
Ｙ−基質濃度は１mM又はそれ未満のオーダーのものであろう。それゆえ、触媒定
数Ｋｄは、好ましくは１０^-4Ｍ未満であるべきである。触媒定数はＫｄ＝ｋ_off
／ｋ_onで与えられる。オン・レートｋ_onは一般に、約１０⁶ 〜１０⁹ Ｍ^-1sec^-1
の会合についての秒オーダーレート定数で拡散により限定される。それゆえ、優
れた交換率（秒当り１を超える交換）を得るために、オフ・レートｋ_off は、好
ましくは少くとも１sec^-1であるべきであり、それゆえこの場合のＫｄは１０^-9
Ｍ未満でないべきである。それゆえ、１sec^-1を超える交換率が要求されるほと
んどの場合において、解離定数は１０^-4〜１０^-9Ｍの範囲であるべきである。

【００４１】この好ましい実施形態は、ＸＹ交換反応がユニット：Ｃ−ＸＹ−Ｓ又はＣ−Ｘ
Ｙ−ＰがＹ−Ｓ化合物に接触しておかれない場合には安定であるという意味で会
合的置換反応と呼ぶことができるシステムを供する。ＸＹ交換対は、少くとも１のＸ成分及び少くとも１のＹ成分を含む。しかしな
がら、それは、Ｘ−及びＹ−成分の両方の１超のコピー及び／又は型も含み得る
。

【００４２】更に、Ｘ及びＹ成分は同一分子であってもよい。このような交換対は、本明細
書において、“ＸＹ交換対”と呼ぶことができる。好ましくは、Ｘ及びＹ成分は異なる分子である。限定的でない例として説明すると、ＸＹ成分は、好ましくは遊離Ｙの欠如下で
安定であるが、遊離Ｙの、Ｘに結合したＹとの迅速かつ特異的な交換（遊離Ｙの
Ｘとの交換ではない）を許容する。この交換反応は、個々のユニットが、上述の
ように、Ｙ−基質化合物と接触するなら、産物を基質で置換するであろう。

【００４３】ＸＹ交換対は、以下の特徴を有し得る：ｉ）Ｘ及びＹは共有結合又は非共有結合で結合することができる。ＸＹ交換対は、小有機（例えばＥＤＴＡ）及び無機（例えば金属、ホスフェー
ト）分子並びに高分子（例えば核酸、ペプチド）を含むいずれかの種類の分子か
らなり得る。

【００４４】 ii）ＸＹ交換反応は、好ましくは活性な置換反応として記載される。 iii）ＸＹユニットは、好ましくは、別のＹの欠如下で安定である。 iv）ＸＹユニットは、好ましくは非対称であり、即ちＹはＸでなくＹを置換す
るだけてあろう。ｖ）ＹのＹによる交換は、好ましくは極めて迅速である。

【００４５】 vi）Ｘ及びＹの会合は、好ましくは極めて迅速なプロセスである。 vii）交換ユニットは、対称であってもよい（即ちＸＹ交換対）。ＸＹ交換対の好適な例を以下に示す。更に、この例の図を図３及び４に示す。ｉ）金属リガンド。好ましくは、Ｘ成分は、基本的に極めて安定なリガンド−金属ユニットを作る
、ゆっくりとした解離速度により記述される強力な相互作用において、リガンド
及び金属イオンからなる。他方、Ｙ−成分は、同じ金属イオンを、高いアフィニ
ティーであるが、迅速な解離及び会合速度で配位するリガンドである。更に、１
つのＹ成分の別のＹ成分との交換は、好ましくは、例えばＹ成分は多重歯状（ｍ
ｕｌｔｉ−ｄｅｎｔａｔｅ）であるので、置換反応である。特定例：ａ）Ｘ：ＥＤＤＡ′−Ｃａ⁺⁺（ＥＤＤＡ、エチレンジアミンジアセテートは窒
素原子の１つに結合した２つの酢酸が除去されているＥＤＴＡに相当する。これ
により、ＥＤＤＡはＣａ⁺⁺に対して４つの配位を作る。

【００４６】Ｙ：Ｒ−Ｎ（ＣＨ₂ ＣＯＯ^- ）₂ 、二歯状（ｂｉｄｅｎｔａｔｅ）リガンド、
又はＹ：Ｒ−Ｎ（ＣＨ₂ ＣＯＯ^- ）（ＣＨ₂ ）₂ Ｎ（ＣＨ₂ ＣＯＯ^- ）₂ 、三歯状
（ｔｒｉｄｅｎｔａｔｅ）リガンド（Ｃａ⁺⁺は特定のリガンドに対して９つの配
位を作り出すことができる）。

【００４７】ｂ）Ｘ：Ｈｉｓ₆ −Ｎｉ⁺⁺、おそらく４つの配位。ヒスチジンタグは組換えタ
ンパク質精製のために用いられ、６つのヒスチジンをタンパク質のＮ−又はＣ−
末端に、又はタンパク質の表面上の露出したループに挿入することができる。Ｃ
ｕ，Ｎｉ，Ｚｎ，Ｆｅ，Ｃｄ，Ｃｏ，Ｍｇ及び他の金属を、好ましくは迅速な交
換速度で、ペプチドベースのキレートと共に用いることができる。金属を配位す
る他のペプチド、例えば２又はそれ超のヒスチジンを含むペプチド（Schmidt et
al., 1996, Current Biology, vol. 3, pp. 645-653 ; Kotrba et al., 1999,
Applied and Environmental Microbiology, vol. 65, pp. 1092-1098）、又はＣ
ｕ結合ペプチドジグリシルＬ−ヒスチジン（Lau et al., 1974, The Journal of
Biological Chemistry, vol. 249, pp. 5878-5884）をそれに応じて用いること
ができる。

【００４８】Ｙ：Ｒ−Ｎ（ＣＨ₂ ＣＯＯ^- ）₂ 、二歯状リガンドｃ）Ｘ：Ｈｉｓ６−Ｃａ⁺⁺（Ｃａ⁺⁺はほとんどのリガンドと迅速な交換特性を
有する）Ｙ：Ｒ−Ｎ（ＣＨ₂ ＣＯＯ^- ）₂ 、二歯状リガンド、又はＲ−Ｎ（ＣＨ₂ ＣＯ
Ｏ^- ）（ＣＨ₂ ）₂ Ｎ（ＣＨ₂ ＣＯＯ^- ）₂ 、三歯状リガンド ii）高分子交換成分（核酸）Ｙ成分は、ポリヌクレオチドであるＸ成分上の重複部位に結合する２つのポリ
ヌクレオチドＹ１及びＹ２からなり得る。好ましくは、オリゴの長さ及び配列は
、ＸのＹ１との相互作用がＹ２の欠如下で安定であるが、Ｙ２がＹ１−に活性状
態で置きかわるか又はその逆になるように調節される。

【００４９】相互作用のオーバーラッピング領域の原理は、一般に、他の化学物質、例えば
タンパク質、ポリマー、有機又は無機分子の交換ユニットに適用できるはずであ
る。その原理をポリヌクレオチドについて説明する。ａ）Ｘ：ＤＮＡポリヌクレオチド 5'-GGGGTTGTTCCCC-3' Ｙ：ＤＮＡポリヌクレオチドＹ１：3'-CCCCAACAA-5'及びＹ２：3'-AACAAGGG
G-5'の等モル混合物ｂ）Ｘ：ＤＮＡポリヌクレオチド 5'-GGAAGGGATGGTCAC-3 Ｙ：ポリヌクレオチドＹ１：3'-CCTACTACCA-5'及びＹ２：3'-TCCCTAAGTG-3'
の等モル混合物 iii）共有結合共有結合の形成及び分断は、むしろ迅速なプロセスであり得る。特定の場合、
これは、問題の結合の固有の特徴である。他の場合、触媒は、結合が形成され及
び破壊される速度を上げることができる（例えば以下の酵素的トランスエステル
化）。特定の例を以下に示す；“Ｒ”は、個々のユニットの結合の部位（触媒）
、又は基質を表す。

【００５０】ａ）Ｘ：ホウ酸、Ｒ−Ｂ（ＯＨ）₂ Ｙ：糖、又は他のビシナルジオール相互作用の“二歯状（ｂｉｄｅｎｔａｔｅ）”性質（２つの結合の共同した形
成及び分断）は、１つの糖分子の、別のものでの活性な置換を引きおこす。ｂ）Ｘ：Ｒ₁ −ＣＯＯＲ₂ （エステル）Ｙ：ＨＯ−Ｒ₂ （対応するアルコール）これにより、ＸＹは、この場合、Ｘと同一である。交換速度を上げるために、
緩衝液にエステラーゼを加えることができる。同様に、トランスアミナーゼ−、
トランスアミラーゼ−及び他のトランスフェラーゼ−反応を、Ｘ及びＹの交換の
ために研究することができる。これらの反応の多くについて、交換反応をスピー
ド・アップするために関連するトランスフェラーゼ酵素を用いることができる。

【００５１】ｃ）Ｘ：Ｒ₁ −ＳＨＹ：２つの型の分子を含む、Ｙ１：Ｒ₂ −ＳＨ（遊離チオール）及びＹ２：Ｒ ₂ −ＳＳ−Ｒ₂ （ジスルフィド）。その基質結合形態において、触媒はジスルフィド結合を介して基質結合する。
タンパク質−ジスルフィドイソメラーゼを、交換の速度を上げるために緩衝液に
加えることができる。

【００５２】ｄ）Ｘ：ビシナルジチオール、又は対になったチオール（例えば、位置ｉ及び
ｉ＋１にシステインを有するα−ヘリックスペプチド）Ｙ：三価ヒ素含有化合物この型のビシナルジチオール−三価ヒ素相互作用は、チオール含有タンパク質
のクロマトグラフィー精製のために（Gitlerら、1997, Analytical Biochemistr
y, vol. 252, pp. 48-55）、又は位置ｉ，ｉ＋１，ｉ＋４、及びｉ＋５にシステ
インを含むα−ヘリックスペプチドとの二ヒ素リガンドの強力なアフィニティー
相互作用のために（Griffinら、1998, Science, vol. 281, pp. 269-271）用い
られている。その交換反応は、ＤＴＴ又は２−メルカプトエタノールのような還
元剤を含めることにより加速させることができる。

【００５３】 iv）触媒−基質対触媒（例えば酵素）と基質との間の相互作用は、２つの定数ｋcat （ターンオ
ーバー数）及びＫｍによりしばしば記述される。ｋcat は、広くは、生産物触媒
／基質−複合体の寿命を定義するということができる。それゆえ、例えば所定の
基質について異なるｋcat'を有する異なる酵素変異体を用いることにより、種々
の交換速度（安定性）のＸＹユニットを得ることができる（酵素がＸであり、基
質がＹである場合）（図３及び４）。一度に１超の基質と相互作用する触媒がＸ
Ｙ交換ユニットとして特に役立ち得る。

【００５４】ｖ）ＸＹ相互作用は基質から産物への反応により改変される。特定の場合、ＸＹ−基質成分は、リローディングプロセスが個々のユニットの
触媒の活性により加速されるようにデザインすることができる。例えば、Ｘ又は
Ｙが両方とも開裂反応のための交換ユニット及び基質であるなら、開裂はＸＹの
解離を引きおこすようであり、それゆえ、リローディングプロセスはより迅速に
おこるようである。以下の例８において、Ｘ及びＹは両方とも核酸構造である。
Ｙは交換ユニット及び要求される反応の基質の両方である（リボジヌクレオチド
の開裂）。Ｙの開裂に基づいて、ＸＹユニットは解離し、Ｘの別のＹ−基質ユニ
ットとの会合をスピード・アップするはずである。

【００５５】この原理はより一般的に適用することができる。例えば、例８におけるＹの中
心部分（開裂標的）は、別の要求される反応の基質と交換することができる（図
３Ａを参照のこと）。また、Ｘ及びＹ_left−基質−Ｙ_right の会合が強力である
が、Ｘ及びＹ_left−産物１、又はＸ及び産物２−Ｙ_right の相互作用が弱いよう
に条件を選択することができる。それゆえ、基質の開裂の直後に、Ｘ及びＹはば
らばらになる。それは、基質リローディングプロセスをスピード・アップさせる
。

【００５６】基質は、このイベントがおこるためのＸ又はＹの部分である必要はない。例え
ば、基質から産物への反応により誘導されるコンホメーション変化は、産物から
Ｙに伝達され、このコンホメーション変化はＸＹを解離させ、これは、リローデ
ィングプロセスをスピード・アップさせるであろう。図３Ｂに例を示す。 vi）カラム緩衝液中の酵素及び他の物質は他の方法で交換反応をスピード・ア
ップすることができる。

【００５７】例えば、基質から産物への反応は、Ｘ及びＹを解離させる（カラム緩衝液中の
物質により解離される）別の反応を開始することができる。例えば、個々のユニ
ットの触媒が核酸を開裂するなら、これは、遊離３’−又は５’−端を露出させ
てエキソヌクレアーゼにアクセス可能にすることができる。核酸が標的物質及び
Ｙユニットの両方であるなら、Ｙユニットはヌクレアーゼにより分解され得、そ
れゆえＸＹ複合体は解離する。あるいは、ＸＹ複合体（但し非複合化Ｘ又はＹで
はない）は、カラム緩衝液中の物質のための標的となり得；その物質がより迅速
に解離するように、その物質がＸＹ複合体においてＸ又はＹを改変するなら、そ
の物質の存在は交換速度を上げるであろう。例えばＸ及びＹが相補的ＤＮＡ及び
ＲＮＡオリゴであるなら、ＲＮａｓｅＨを緩衝液に含めることができる。ＲＮａ
ｓｅＨは二本鎖複合体中のＲＮＡを開裂し；それゆえＲＮＡ（Ｙ）は、それがＤ
ＮＡ（Ｘ）と会合して二本鎖を形成するまで、開裂されないであろう。ＲＮａｓ
ｅＨはＲＮＡを開裂するがＤＮＡを傷つけずに残すであろう。それゆえ、ＲＮａ
ｓｅＨはＸＹの解離を加速するが、個々のユニット−リンカー−Ｘユニットは完
全のまま残し、別のＹと相互作用する用意ができている。

【００５８】好適なＸＹ交換対の詳細な例を本明細書の研究例に更に記載する（下述）。複数の異なる個々のユニットを含むサンプル：上述のように、サンプルは、少くとも２の異なる個々のユニット及び多数に至
るまでの異なる個々のユニットを含み得る。異なる個々のユニットの実際の数は、一般に、触媒分子のライブラリーの実際
のサイズに相当する。

【００５９】前記特定した異なる個々のユニットの他に、前記サンプルは原則として、いず
れかの他の好適な材料も含み得る。更に、前記サンプル内に含まれる前記異なる個々のユニットは、いずれかの他
の好適な材料も含み得る。更に、前記サンプル内に含まれる前記異なる個々のユニットは、いずれかの好
適な緩衝液、例えば水に溶かすことができる。

【００６０】なお更に、前記サンプルは、本発明の第２の態様の方法のステップ（ｉ）に従
って、異なる個々のユニットに接触されるＹ−基質化合物も含み得る。異なる個々のユニット：上述のように、個々のユニットは、一般構造：触媒−ＸＹ交換対−基質；又は基質が産物に変換されているなら、一般構造：触媒−ＸＹ交換対−産物を含む。

【００６１】更に、用語“異なる個々のユニット”は、異なる触媒分子を各々独立して含む
異なる個々のユニットをいい、即ち２つの異なる個々のユニットの例は、（１）触媒分子¹ −ＸＹ交換対−基質；及び（２）触媒分子² −ＸＹ交換対−基質であり得る。ここで、触媒分子¹ 及び触媒分子² は、２つの異なる触媒分子をい
う。

【００６２】更に、本明細書に記載される“個々のユニット”は、分離した個々のユニット
を単離することができるために、サンプル内で、前記個々のユニットを他の異な
る個々のユニットから物理的に分離することができる個々のユニットをいう。生物学的に増幅可能な個々のユニット：本発明の一実施形態は、本発明による複数の個々のユニットを含むサンプルで
あって本発明の第１の態様に従うポイント（ｉ）の個々のユニットが生物学的に
増幅可能な個々のユニットであるサンプルに関する。

【００６３】本発明の別の実施形態は、本発明による複数の個々のユニットを含むサンプル
であって、本発明の第１の態様によるポイント（ｉ）の個々のユニットが生物学
的に増幅可能な個々のユニットであり、前記基質及び前記触媒の両方が前記生物
学的に増幅可能な個々のユニットの表面上に結合するサンプルに関する。用語“生物学的に増幅可能な個々のユニット”とは、前記個々のユニット内で
、（ｉ）関心の触媒分子が生物学的に増幅可能な分子であるから又は（ii）関心の触媒分子が、その触媒分子の明白な同定を許容する存在物内に含
まれる情報により生物学的にコードされることのいずれかをいい、前記触媒分子の多重コピーを得るために関心の触媒分子を
増幅する可能性を与える。

【００６４】上述のポイント（ii）における用語“生物学的にコードされる”とは、その情
報が遺伝コードの形態でＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含まれることをいう。上述のポイント（ｉ）に関連した生物学的に増幅可能な個々のユニットの一例
は、関心の触媒分子がＤＮＡ又はＲＮＡ分子である個々のユニットである。なぜ
なら、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子が容易に増幅できることは公知だからである。

【００６５】上述のポイント（ii）に関連した生物学的に増幅可能な個々のユニットの例は
、関心の触媒分子がペプチド又はポリペプチドであり、触媒分子の明白な同定を
許容する情報を含む存在物が前記ペプチド又はポリペプチドをコードするＤＮＡ
分子である個々のユニットである。上述の第２の例に関連して、ＤＮＡを、それをコードするペプチドと共に単離
するために、ペプチドとそれをコードするＤＮＡとの間に物理的結合がなければ
ならない。その結合は、直接的、即ちペプチドがそれをコードする核酸に直接、
結合しているか、又は間接的、即ちペプチドが例えば細胞の表面に結合している
か、又は細胞から分泌されて他所よりその分泌細胞のすぐ近くでかなり豊富であ
る場合であり得る。このような細胞は、本明細書において“キャリアーシステム
”と呼ばれ、以下に更に議論される。

【００６６】フレキシブルリンカー：本発明の一実施形態は、本発明の第１の態様に従う複数の異なる個々のユニッ
トを含むサンプルであって、ポイント（ｉ）の個々のユニットが次の構造：触媒
分子−フレキシブル（ＸＹ交換対）リンカー−基質を含むものに関する。好ましくは、フレキシブルリンカーは、ＸＹ交換対を含んでいる。

【００６７】用語“フレキシブルリンカー”は、本明細書において、触媒を基質につなげる
全体としての分子をいう。例えば、基質がフレキシブル分子を介してビーズに結
合しており、触媒もフレキシブル分子を介してビーズに結合しているなら、“フ
レキシブルリンカー”は、“フレキシブル分子−ビーズ−フレキシブル分子”と
呼べるであろうし、そのフレキシブルリンカーの特徴は、２つのフレキシブル分
子の個々の特徴及びその２つに接続するビーズの部分を反映するであろう。フレ
キシブルリンカーは、例えば、フレキシブルポリペプチド、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）、及び他の合理的なフレキシビリティーのポリマーからなり得る
。

【００６８】更に、フレキシブルリンカーは、触媒分子及び担体システムとも接続してもよ
い（以下を参照のこと）。キャリアーシステム本発明の一実施形態は、本発明による複数の個々のユニットを含むサンプルで
あって、本発明の第１の態様におけるポイント（ｉ）の個々のユニットが、次の
構造：触媒分子−キャリアーシステム−ＸＹ交換対−基質、又はより好ましくは
構造：触媒分子−キャリアーシステム−フレキシブル（ＸＹ交換対）リンカー−
基質を含むものに関する。

【００６９】用語“キャリアーシステム”は、触媒分子もしくは基質に物理的に結合してい
るか、又は触媒分子の明白な同定を許容する情報を有するシステム／存在物をい
い、そのキャリアーシステムは、触媒分子により触媒される基質から産物への触
媒反応に直接的に関与しない。このようなキャリアーシステムは、本明細書において、更に、生物学的に増幅
可能なキャリアーシステムと生物学的に増幅不能なキャリアーシステムとに分け
られる。

【００７０】生物学的に増幅可能なキャリアーシステムには（キャリアーシステム−触媒分
子）、ファージ−ポリペプチド（Boublik et al., 1995, Biotechnol (NY), vol
. 13, pp. 1079-1084）、繊維状ファージ−ペプチド（Kay, Winter and McCaffe
rty, 1996,“Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual
”, Academic Press）、レトロウイルス−ポリペプチド（Buchholz et al., 199
8, Nature Biotechnology, vol. 16, pp. 951-954）、プラスミド−ペプチド（S
chatz et al., 1996, Meth. Enzym., vol. 267, pp. 171-191）、ポリソーム−
ペプチド（Mattheakis et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91,
pp. 9022-9026 ; He and Taussig, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25, p
p. 5132-5134）、細菌−ペプチド（Brown, 1997, Nature Biotechnology, vol.
15, pp. 269-272）及びｍＲＮＡ−ペプチド（Roberts and Szostak, 1997, Proc
. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, pp. 12297-12302）、ｃＤＮＡ−ペプチド（
ｍＲＮＡ−タンパク質融合ディスプレイに対するアナログ、但しそれをコードす
るｍＲＮＡ自体でなく、そのｍＲＮＡのｃＤＮＡにタンパク質が結合しているこ
とを除く）、ペプチド分泌細胞−ペプチド（Kinsella and Cantwell, 1991, Yea
st, vol. 7, pp. 445-454）、ペプチド分泌性人工ミクロスフィアー−ペプチド
（ミクロスフィアー内に含まれる遺伝子から発現されるタンパク質を含む人工ミ
クロスフィアー、Tawfik and Griffiths, 1998, Nature Biotechnology, vol. 1
6, pp. 652-656）がある。

【００７１】生物学的に増幅可能なキャリアーシステムの例には（キャリアーシステム−触
媒分子）、ビーズ−有機分子又はビーズ−ペプチド（Brenner and Lerner, 1992
, Proc. Natl. Acad. USA, vol. 89, pp. 5381-5383）、ピン（ｐｉｎ）−無機
分子及びビーズ−ＤＮＡ配列（Geysen et al., 1996, Chemistry and Biology,
vol. 3, pp. 679-688）がある。

【００７２】ビーズ−ＤＮＡ配列構造を含む個々のユニットはここでは生物学的に増幅可能
なユニット（上述）であるが、キャリアーシステム自体（ビーズ）は生物学的に
増幅不能なキャリアーシステムである。触媒及び触媒分子のライブラリー：上述の通り、用語“触媒”とは、要求される触媒活性を有するいずれかの触媒
分子、例えば、有機及び無機分子、タンパク質、酵素、ペプチド、核酸、バイオ
ポリマー及び非生物学的ポリマー、小有機又は無機分子をいう。更に、用語“触
媒”及び“触媒分子”は、交換可能に用いることができる。

【００７３】従って、本発明の更なる実施形態は、（ｉ）本発明による複数の異なる個々のユニットを含むサンプルであって、前
記触媒分子のライブラリーが天然又は非天然ペプチド又はポリペプチドのライブ
ラリー、好ましくは酵素のライブラリーであるもの；（ii）上述の実施形態（ｉ）に従う複数の個々のユニットを含むサンプルであ
って、前記ライブラリーが、複数の異なる酵素活性を有するポリペプチドを含む
ライブラリーであるもの；又は（iii）上述の実施形態（ｉ）に従う複数の個々のユニットを含むサンプルで
あって、前記ライブラリーが、１又は複数の前駆体ポリペプチド由来のポリペプ
チド変異体を含むライブラリーであり、前記前駆体ポリペプチドが密接に関連し
た酵素活性を示すものに関する。

【００７４】用語“複数の異なる酵素活性を有するポリペプチドを含むライブラリー”とは
、好ましくは、前記異なる酵素活性が実質的に異なる活性、例えばプロテアーゼ
、アミラーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ活性であるライブラリーをいう。この
ようなライブラリーの利点は、関心の比活性に従って基質を変えることにより、
前記ライブラリーを用いて関心のいくつかのポリペプチドを同定することができ
ることであり得る。例えば最初の関心のプロテアーゼが例えば基質としてペプチ
ドを用いることにより本明細書に記載される試験管内選択のための方法によって
単離されるなら、アミラーゼは、その後、基質を例えばデンプン分子に変えるこ
とにより単離することができる。

【００７５】用語“天然又は非天然ペプチド又はポリペプチド”は、ペプチド又はポリペプ
チドが、ブロックを構築する２０の天然のアミノ酸のいずれか、他の側鎖を有す
るいずれかの非天然アミノ酸、又は２つのペプチドを一緒に結合することができ
るブロックを構築するいずれかの非アミノ酸から構築することができる。前記ラ
イブラリーは、このようなライブラリーを作製するための知られている多数の標
準的方法のいずれかに従って作製することができる。

【００７６】従って、本発明の更なる実施形態は、上述の本発明の実施形態による複数の異
なる個々のユニットを含むサンプルであって、前記ライブラリーがシャッフル化
／組換え化／ドープ化ポリペプチドを含むライブラリーであるものに関する。本発明の好ましい実施形態は、（ｉ）本発明による複数の異なる個々のユニットを含むサンプルであって、前
記触媒分子のライブラリーが天然又は非天然核酸のライブラリーであるもの；（ii）上述の実施形態（ｉ）に従う複数の個々のユニットを含むサンプルであ
って、前記ライブラリーが、複数の異なる触媒活性を有する核酸を含むライブラ
リーであるもの；又は（iii）上述の実施形態（ｉ）に従う複数の個々のユニットを含むサンプルで
あって、前記ライブラリーが、１又は複数の前駆体核酸由来の核酸変異体を含む
ライブラリーであり、前記前駆体核酸が密接に関連した触媒活性を示すものに関する。

【００７７】用語“複数の異なる触媒活性を有する核酸を含むライブラリー”は、好ましく
は、前記異なる触媒活性が実質的に異なる活性、例えばヌクレアーゼ、リガーゼ
、イソメラーゼ、ホスホリラーゼであるライブラリーをいう。このようなライブ
ラリーの利点は、関心の比活性に従って基質を変化させることにより、前記ライ
ブラリーを用いて関心の複数の核酸を同定することができることであり得る。例
えば最初の関心のＤＮＡリガーゼが、例えば基質として２つのＤＮＡオリゴヌク
レオチドを用いることにより、本明細書に記載される試験管内選択のための方法
によって単離されるなら、リボヌクレアーゼは、その後、基質を例えばＲＮＡオ
リゴヌクレオチドに変えることにより単離することができる。

【００７８】前記ライブラリーは、このようなライブラリーを作る多数の標準的な知られた
方法のいずれかに従って作ることができる。従って、本発明の更なる実施形態は、上述の本発明の実施形態に従う複数の個
々のユニットを含むサンプルであって、前記核酸のライブラリーがシャッフル化
／組換え化／ドープ化核酸を含むライブラリーであるものに関する。

【００７９】用語“天然又は非天然核酸”とは、核酸が、５つの天然の塩基（Ａ，Ｔ，Ｇ，
Ｃ，Ｕ）のいずれか又はいずれかの非天然塩基もしくは骨格構造を含み得ること
をいう。本発明の更なる実施形態は、（ｉ）本発明による複数の異なる個々のユニットを含むサンプルであって、前
記触媒分子のライブラリーが、天然ポリマー分子、非天然ポリマー分子、小有機
分子、もしくは小無機分子、又はそれら分子の混合物であるもの；又は（ii）上述の実施形態に従う複数の異なる個々のユニットを含むサンプルであ
って、前記ライブラリーがコンビナトリアル化学により作られるものに関する。

【００８０】好ましくは、サンプルは、各々の潜在的な触媒が１超のサブユニットから作ら
れ、可逆的な共有又は非共有結合相互作用により一緒に保持されており、そして
そのサブユニットが多重ターンオーバーアッセイの間、数回、会合及び解離する
という意味でバーチャルコンビナトリアルライブラリー（ｖｉｒｔｕａｌｃｏ
ｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｉｂｒａｒｙ）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 19
97, vol. 94, pp. 2106-2110）を含み得る。

【００８１】バーチャルコンビナトリアルライブラリーの文脈において、本明細書全体を通
して用いられる“明白な同定”とは、回収された存在物の明白な（あいまいでな
い）同定に関して理解されるべきであり、個々の触媒の組成に関してではない。
このようなバーチャルコンビナトリアルライブラリーから単離された触媒は、（
例えば低サブユニット−サブユニットアフィニティーを特徴とするタンパク質サ
ブユニット会合として）弱い相互作用により一緒に維持されるか、可逆的共有ジ
スルフィド結合により一緒に維持されるいくつかのポリペプチド鎖から作られた
触媒であり得る。その交換比はレドックス緩衝液（例えば酸化型及び還元型グル
タチオン）の添加により加速されており、それゆえ連続的に会合し及び解離する
。

【００８２】用語“天然ポリマー分子、又は非天然ポリマー分子”とは、そのポリマーが、
自然に見い出される種類のもの、又は人間により人工的に製造された種類のもの
をいう。あるいは、そのライブラリーメンバーは、ジスルフィド結合により一緒に保持
された小有機分子のアセンブリーであり得；またバーチャルコンビナトリアルラ
イブラリーの動力学は、レドックス緩衝液を含めることによりスピード・アップ
することができる。

【００８３】なお更なる実施形態において、本発明は、本発明による複数の個々のユニット
を含むサンプルであって、触媒分子及び産物に触媒され得る基質（第１の態様の
ポイント（ｉ））が異なる化学物質のものであるものに関する。用語“触媒分子及び産物に触媒され得る基質（第１の態様のポイント（ｉ））
が異なる化学物質のものである”とは、前記触媒分子及び基質分子が実質的に異
なる化学物質のものであることをいう。

【００８４】従って、この好ましい実施形態において、触媒分子及び基質分子が両方ともＤ
ＮＡ又はＲＮＡ分子である状態は、本明細書において、触媒分子及び基質分子が
異なる化学物質のものでない状態をいう。本発明の第２の態様に従う、多重触媒活性ターンオーバー試験管内選択のための方法：用語“選択”とは、好ましくは、本発明の第２の態様のステップ（ii）による
選択が、好ましくは当業者の干渉なく、サンプル内に含まれる１超、好ましくは
１００超、好ましくは１０，０００超、より好ましくは１，０００，０００超、
更により好ましくは１０⁸ 超、そして最も好ましくは１０¹⁰超の個々のユニット
で行われる。

【００８５】用語“カラム”は、本明細書において、全ての種類の固体支持体をいう。例と
しては、カラム、Ｂｉａｃｏｒｅ^TM装置を含む表面がある。特定の場合、例えば
分離が電場内のマイグレーションに基づく場合、固体支持体は必要ない。本発明の第２の態様の方法によるＹ−基質化合物、及び関心の触媒の単離：上述の通り、本発明の第２の態様のポイント（ｉ）に従う用語“前記個々のユ
ニットをＹ−基質化合物に接触させる”とは、個々のユニット及びＹ−基質化合
物が、交換反応が可能であるように適切に近接することをいう。前記接触は、例
えば、個々のユニット及びＹ−基質化合物が一緒に拡散して、それにより互いに
接触する緩衝液中であり得る。

【００８６】本発明による多重触媒活性ターンオーバー試験管内選択のための方法、従って
行われる選択ラウンドの間、後の選択ラウンドより低いストリンジェンシーで最
初の選択ラウンドを行うのが有利であり得る。これは、例えば低濃度のＹ−基質
、及び／又は低濃度の産物結合レセプターを用いることにより、容易に行うこと
ができ、特定の場合、最初のラウンドでＹ−基質を用いないことが要求され得る
。更に、より効率的でないＹ−基質化合物を用いることができる。次に、より後
の選択ラウンドにおいて、濃度を増加させる。特定の実験セット・アップについ
てこれは実現可能でないことがある。例えば、極めて活性な酵素からなるライブ
ラリーを用いて、触媒を単離する方法が産物結合カラムへの固定化に基づく場合
、Ｙ−基質の高い出発濃度は高濃度のＹ−産物を生じ得る。産物結合カラムの能
力に依存して、これは、産物結合レセプターを産物で飽和させ、これによりより
低い選択ストリンジェンシーを導く。しかしながら、この問題は、例えば（開裂
反応の場合）触媒をカラムに基質を含むリンカーを介して結合させる（図８を参
照のこと）ことにより、解決することができる。選択のストリンジェンシーを更
に増加させるために、過剰な基質Ｓ（Ｙに結合していないもの）をカラム緩衝液
に加えることができる（これは、“競合基質”として機能するであろう。選択ス
トリンジェンシーを改変する別の方法には、酵素及び基質に結合するリンカーの
長さの変化、基質もしくは酵素についてアフィニティーを有する因子のカラム緩
衝液への添加、又は基質−酵素相互作用に作用する因子（例えば酵素の活性部位
に結合するレセプター／抗体、酵素インヒビター、基質に対してアフィニティー
を有するレセプター／抗体）の添加がある。

【００８７】基質ターンオーバーのための触媒に利用できる時間を限定するために、選択の
間に、例えば電圧又は光のパルスを適用することができる。適切に分離されたパ
ルスは、例えば、触媒により行われる基質から産物への反応を開始するであろう
一時的なpH−又はイオン勾配を作り出すことができる。そのパルスは、パルスが
次の反応を開始する前に、溶液中の触媒がレセプター上に固定されるための十分
な時間を許容する。この方法において、カラム形態で行われる選択のデッドタイ
ム（ｄｅａｄｔｉｍｅ）（即ち触媒が１つのレセプターから次のものに拡散す
るのに費す時間）は、劇的に減少し、極めて高いストリンジェンシーを得ること
ができる。

【００８８】一般的に言うと、特定の実験的セット・アップを最適化することは当業者の一
般的な知識の範囲内である。本発明の第２の態様のステップ（ｉ）の前での富化ステップの実行特定のタンパク質は繊維状ファージ上に提示するのが困難である。特に、大き
なタンパク質、又は大腸菌に対して毒性又は成長阻害効果を有するタンパク質は
、しばしば低いディスプレイ効率しか有さず、即ち形成されるファージ粒子の大
部分は、表面上に提示されたタンパク質を有さない。関心のタンパク質を提示す
る１０００のファージのうちの１つぐらい低いディスプレイ効率が報告されてい
る（Jestinら、1999, Anger. Chemi, Int. Ed., vol. 38, pp. 1124-1127 ; Dem
artis et al, 1999, JMB, vol. 286, pp. 617-633）。これらの場合、関心のタ
ンパク質をコードするＤＮＡを有するが、表面上に前記タンパク質を提示しない
ファージ粒子が極めて過剰であるため、高い非特異的バックグラウンドが予想さ
れる。この潜在的な問題を克服するために、アフィニティータグを関心のタンパ
ク質のＣ末端に結合させて、全長のタグされたタンパク質を提示するファージの
カラムクロマトグラフィーによる精製を行うことができる。

【００８９】この方法に用いることができるアフィニティータグの非限定的例は、ヒスチジ
ンタグ（実施例８を参照のこと）、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）−キチン結合ド
メイン融合体（Chongら、1997, Gene, vol. 192, pp 271-281）、ＦＬＡＧペプ
チド（Slootstra et al., 1997, Molecular Diversity, vol. 2, pp. 156-164）
、及びマハトース結合タンパク質（Pryor and Leiting, 1997, Protein express
ion and Purification, vol. 10, pp. 309-319）である。

【００９０】従って、本発明の実施形態は、（ｉ）本発明の第２の態様による試験管内選択のための方法であって、関心の
触媒分子が、アフィニティータグに結合しており、ステップ（ｉ）の前に任意的
ステップが行われ、その任意的ステップが、酵素又はタンパク質を提示するユニ
ットをアフィニティータグを用いて単離する精製を介しての、（全長の）酵素又
はタンパク質を提示する個々のユニットについての富化を含む方法、（ii）本発明の第２の態様による試験管内選択のための方法であって、（全長
の）酵素又はタンパク質を提示する個々のユニットを、そのタグ化酵素又はタン
パク質を提示するユニットをそのタグを用いて単離する抗アフィニティータグ抗
体カラムを用いて精製する方法、（iii）本発明の第２の態様による試験管内選択のための方法であって、アフ
ィニティータグが関心の酵素又はタンパク質のＣ末端に結合した６のヒスチジン
残基を含み、（全長の）酵素又はタンパク質を提示する個々のユニットを、タグ
化酵素又はタンパク質を提示するユニットをそのタグを用いて単離するＮｉ−Ｎ
ＴＡカラム、又は抗ヒスチジン抗体カラムで精製する方法に関する。

【００９１】本発明の方法による関心の活性触媒を単離する手段活性な及びより活性の少い触媒の分離は、その触媒される反応が触媒の、それ
に結合したリンカー−基質を介しての放出又は結合のいずれかを導く。カラムセットアップを用いる場合、不活性触媒から活性なものを分離するため
に少くとも４つの手段がある。ｉ）活性な触媒は、産物結合カラムへの産物の固
定化により（又はより一般的には結合した産物を用いて）単離することができる
。ii）不活性触媒は、基質結合カラムへの固定化によって除去することができる
。iii）標的反応の前に、触媒は、支持体に結合させることができ；開裂反応が
おこる場合、触媒は支持体から放出され、収集され得る。iv）活性な触媒は、（
触媒に結合した）基質１と（支持体に結合した）基質２との反応に基づいてそれ
ら自体を固体支持体に結合させることができる。図については図７及び８を参照
のこと。

【００９２】産物及び基質特異的カラムは、産物及び基質について特異性を有するレセプタ
ー分子への結合を介して各々産物及びレセプター分子を固定化することができる
。あるいは、固定化は、カラム上の官能基と触媒に結合した産物又は基質との間
の産物特異的又は基質特異的反応により媒介され得る。産物又は基質（及びこれらと共に、活性又は不活性触媒各々）を単離する他の
手段には、異なる相の間の分画、質量分析、沈殿、電気又は電磁気分離等がある
。特に、様々な種類の電気泳動を、特に産物形成が個々のユニットの電荷を大き
く変化させる場合に行うことができる。電荷の有意な変化は、例えばその反応が
、反応前に一方が溶液中で荷電して遊離している２つの基質を連結する連結であ
る場合におこり得る。

【００９３】従って、本発明の実施形態は、（ｉ）本発明の第２の態様による試験管内選択のための方法であって、ステッ
プ（ii）における関心の触媒分子の選択が、前記産物分子を生ずる固定化により
行われる方法；（ii）本発明の第２の態様による試験管内選択のための方法であって、ステッ
プ（ii）における関心の触媒分子の選択が、次のストラテジー：（ａ）基質分子及び触媒分子を含む第２の態様のステップ（ｉ）における個々
のユニットの実質的に各々がマトリックスに結合しており、そのユニットが、基
質が産物に変換される場合に前記マトリックスから放出されるシステムを作製し
；そして（ｂ）前記マトリックスから放出されたユニットを選択することにより行われ
る方法；（iii）本発明の第２の態様による試験管内選択のための方法であって、関心
の触媒分子の選択（ステップ（ii））が、次のストラテジー：（ａ）産物に特異的に結合するレセプターが産物−カラムのマトリックスと共
に配置されている産物−カラムを作製し；そして（ｂ）個々のユニットのサンプルを産物−カラムの一端に加え、そのカラムの
反対の端に最後に到達した個々のユニットを単離することにより関心の触媒分子
について選択することにより行われる方法：（iv）本発明の第２の態様による試験管内選択のための方法であって、関心の
触媒分子の明白な同定を許容する情報を含む存在物の単離（ステップ（iii））
は、物理的又は化学的手順によって行われる方法；又は（ｖ）上述の試験管内選択のための方法であって物理的手順が電気泳動である
方法に関する。

【００９４】本発明の第２の態様のポイント（iv）に従うステップ（ｉ）〜（iii）の１又
は複数回の反復上述の通り、本発明の第２の態様のポイント（iv）に従う用語“ステップ（ii
i）の前記存在物に含まれる情報を用いて前記関心の触媒分子を形成して該形成
された関心の触媒分子を含む個々のユニットを作製し、そして次にこの個々のユ
ニットを繰返しステップにおける出発材料として用いることにより、ステップ（
ｉ）〜（iii）を１又は複数回、くり返すこと”とは、前記繰り返しか、１回、
より好ましくは２回、より好ましくは５回超、更により好ましくは１０回超、そ
して最も好ましくは２５回超であり得ることをいう。

【００９５】本発明の最後の態様に従う関心の触媒分子を生産するための方法上述の通り、最後の態様において、本発明は、関心の触媒分子を生産するため
の方法であって、本発明による試験管内選択のための方法、並びに更に次のステ
ップ：（ａ）前記関心の単離された触媒分子を、関心の好適な量で、好適な生産法に
より生産することを含む方法に関する。

【００９６】上述の通り、本発明の第２の態様に従う試験管内選択のための方法において、
ステップ（iii）は、 “（iii）産物の特徴を用いて、基質から産物への反応を複数回、触媒するこ
とができる関心の触媒分子の明白な同定を許容する情報を含む存在物を単離する
” ことである。

【００９７】従って、前記存在物に含まれる情報は、当業者に知られたいずれかの標準的生
産ストラテジーにより前記関心の触媒分子を生産する可能性を供する。前記関心の触媒分子が例えば関心のポリペプチドであるなら、前記標準的生産
ストラテジーは、前記関心のポリペプチドの組換え生産のための標準的プロトコ
ルであり得、又は前記関心の触媒分子が例えば関心の有機分子であるなら、前記標準的ストラテ
ジーは、このような有機分子の生産のための標準的プロトコルであり得る。

【００９８】実施例実施例１：ＸＹ交換対を除く、本発明の第１の態様の特徴を含む個々のユニットの例この実施例１において、関心の触媒はスタフィロコッカル（Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃａｌ）ＤＮａｓｅ（ＳＮａｓｅ）であり；基質は一本鎖の標準的オリゴ
ヌクレオチド（ｓｓＤＮＡ）であり；そして産物は関心のＳＮａｓｅにより開裂
されたｓｓＤＮＡである。

【００９９】更に、繊維状ファージをキャリアーシステムとして用い、酸／塩基リンカーを
フレキシブルリンカーとして用いる。従って、この例における個々のユニットは、以下の一本鎖構造を有する：ＳＮａｓｅ−ｆｉｌ．ファージ−酸／塩基リンカーｓｓＤＮＡ触媒−キャリアーシステム−フレキシブルリンカー−基質図については図１０を参照のこと。

【０１００】この例において、産物（即ち開裂したｓｓＤＮＡ）の“選択特徴”は、前記産
物がマトリックスに結合せず、基質（ｓｓＤＮＡ）がマトリックスに結合するこ
とである。従って、この例において、関心のＳＮａｓｅ分子は、前記マトリックスから遊
離した個々のユニットについて選択することにより単離される。図については図
１０を参照のこと。

【０１０１】材料及び方法化合物の合成Ｆｍｏｃ−Ｓ−（２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル）−Ｌ−システイ
ン１を、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（６）の方法の変形型により合成した。要約する
と、６０５mgのＬ−システイン（５mmol）を１００mLの脱気したエタノール／水
（２：１）に懸濁し、１．３９mLのトリエチルアミン（１０mmol）及び１．３９
ｇの１−（ブロモエチル）−２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンゼン（５mmol
）を加えた。その混合物を１０時間、２３℃で暗所で窒素下で撹拌してろ過した
。そのフィルターケーキをエタノールで洗い、エタノール／水から再結晶化して
０．９５ｇのＳ−（２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル）−Ｌ−システイ
ン（３mmol）を供した。その再結晶化した産物（０．８ｇ）を２０mLの水に懸濁
し；０．５３mLのトリエチルアミン（３．８mmol）を加え、次に１２mLのアセト
ニトリル中０．９ｇの９−フルオレニルメトキシカルボニルスクシネートエステ
ル（２．７mmol）の溶液を加え、その混合物を１０時間、２５℃で窒素下で撹拌
した。その産物を１ＭのＨＣｌでpH２〜３に酸性化することにより沈殿させ、ア
セトニトリルを蒸発させた。その沈殿をフリット上に収集し、水及び酢酸エチル
で洗って過剰なＨＣｌ及び試薬を除去した。得られた粗産物１（１．１３ｇ）を
更に真空下で乾燥させ、塩基−リンカーペプチド：C(GGS)₄ AQLKKKLQALKKKNAQLKW KLQALKK -KLAQGGc（塩基配列を下線で、リン酸化システインを、小文字のｃはリ
ン酸化システインを示す）の合成に直接、用いた。化合物２，３及び４を、３’
−ビオチン基（ＢｉｏｔｉｎＴＥＧＣＰＧ，ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）
及び５’−チオール（５’−Ｔｈｉｏｌ−ＭｏｄｉｆｉｅｒＣ６，Ｇｌｅｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に１mmole スケールでＡＢＩＤＮＡシンセサイザーで合
成し、樹脂から除去した後、逆相ＨＰＬＣにより精製し（ＲａｉｎｉｎＭｉｃ
ｒｏｓｏｒｂＣ１８カラム、流速１mL／分；溶媒Ａ：５０mMトリエチルアンモ
ニウムアセテート（ＴＥＡＡ）、pH７、溶媒Ｂ：アセトニトリル、４０分にわた
る、５から５０％への溶媒Ｂの直接勾配）；そのチオール上のトリチル保護基を
ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈのプロトコルに従って除去した。その産物を凍結乾
燥し、水に溶かした（１．０mM最終濃度）。２の、塩基−リンカーペプチドとの
コンジュゲートを、次の通り調節した：２mg（４１５nmole ）塩基−リンカーペ
プチドを、２０倍モル過剰なＮ，Ｎ’−ビス（３−マレイミドプロピオニル）−
２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジアミン（３．２mg）と、１mLの５０mMリン
酸ナトリウム緩衝液、pH５．５中で、１０時間、窒素下で４℃で反応させた。化
合物５を、その反応混合物から、逆相ＨＰＬＣ（ＶｙｄａｃＲＰ−１８カラム
、流速２mL／分；溶媒Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル中０．
１％ＴＦＡ；３５分にわたる。１０から５５％への直接勾配）、その産物画分を
約０．３mL（ＯＤ₂₈₀ ＝６、化合物５は乾燥するまで濃縮すべきでない）に濃縮
した。この溶液１００mL（１３８nmole ）に、７５μＬの水、７５mLの１Ｍリン
酸ナトリウム水溶液pH７，３０mLの５ＭＮａＣｌ水溶液、及び２２mL（２２nm
ole ）の化合物２を加え、その反応を１０時間、窒素下で２３℃でインキュベー
トした（沈殿を避けるため、試薬はこのオーダーで加えるべきである）。その産
物をアニオン交換ＦＰＬＣにより精製し（ＭｏｎｏＱＨＲ５／５カラム（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、流速０．７５mL／分、溶媒Ａ：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、pH７、溶媒Ｂ：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７、溶媒Ｂ：２０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、pH７、２ＭＮａＣｌ；７．５分での２０から６０％へのＢの直接
勾配）；１０％変性ポリアクリルアミドゲル上に産物を単一バンドとして流した
。ＯＤ₂₆₀ ＝０．３〜１の画分を、光脱保護化ステップ（後述）のために直接、
用いた。３及び４の、塩基−リンカー−ペプチドのコンジュゲートを、次の通り
調製した：３又は４のいずれかの約２００nmole 及び２０倍過剰のビスマレイミ
ドを１mLの５０mMリン酸緩衝液、pH５．５中で、４℃で１５時間、インキュベー
トした。逆相ＨＰＬＣ及び凍結乾燥による精製の後、化合物６及び７の同定を、
Ｍａｌｄｉ−ＴｏＦＭＳにより確認した。次に、６又は７のいずれか（１５０
nmoles）を１００mLの１０mM ＴＥＡＡ、pH６．５、１００mM ＮａＣｌ中で１
００nmolesの塩基−リンカー−ペプチドと、１５時間、４℃でインキュベートし
た。その産物を逆相ＨＰＬＣにより精製し（ＶｙｄａｃＲＰ−１８カラム、上
述と同じ条件）、凍結乾燥してＭａｌｄｉ−ＴｏＦＭＳ（７）により分析した
。３つのコンジュゲートのＣ末端システイン上の２−ニトロ−４，５−ジメトキ
シベンジル保護基を、光分解により除去して次の通り化合物８，９及び１０を供
した：化合物８について、保護化コンジュゲートを含む１００mLのＦＰＬＣ精製
画分を１５分、アルゴンで脱気し、次に３０分、隔膜でキャップしたガラス容器
内で水銀ランプ（４５０Ｗハイ・プレッシャー水銀ランプ、Ａｃｅ−Ｈａｎｏ
ｖｉａ；Ｐｙｒｅｙ^TMフィルター、カットオフ² ３００nm）に露出した。化合物
９及び１０のために、１０nmolのコンジュゲートを１０mM ＤＴＴ１００mLに
溶かし、脱気して、上述の通り光分解した。３０分の照射後、ＭＡＬＤＩ−Ｔｏ
ＦＭＳにより残った出発材料は検出することができなかった。その反応混合物
をＨＰＬＣにより分離し（ＶｙｄａｃＲＰ−１８カラム、上述の条件）、産物
画分を凍結乾燥した。そのコンジュゲートを凍結して保存し、ファージへの十分
な結合を確実にするために、光脱保護化の後、１週間以内に用いた。

【０１０２】酸ヘルパーファージの作製。プライマーＫ０７−ＮａｒＩ−ｐｒｉｍ（5'-ACAACTTTCAACGGCGCCAGTTTCAGCGG
-3'）でＫｕｎｋｅｌ変異誘発１９）により、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージの
成熟ｐIII タンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の第３及び第４のコドンの間にＮａｒ
Ｉ制限部位を導入してＮａｒＩ−ヘルパーファージを供した。両端にＮａｒＩ制
限部位を有するアミノ酸 GAAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQ-ggcPAGE（酸ペプ
チド配列を下線で、ＧＧＣモチーフを小文字で示す）をコードするＤＮＡを、プ
ライマーＮａｒＩｆｗｄ（5'-ACTACAAATTGGCGCCGCTCAGCTCGAAAAAGAGC-3'）及び
ＮａｒＩｂｃｋ（5'-AATTATAGGCGCCAGCCGGGCAACCGCCCTGAGCCAGTTCCTTTTCC-3'）
で、プラスミドｐＣＲII酸（Ellis L. Reinberz, Dana Farher Cancer Institut
e, Boston）で、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により生産した。そのＰＣＲ産
物をＮａｒＩで消化し、ＮａｒＩで消化したＮａｒＩ−ヘルパーファージに挿入
して酸ヘルパーファージを供した。

【０１０３】スタフィロコッカルヌクレアーゼ−ｐIII 融合体及び３９−Ａ１１Ｆａｂ−
ｐIII 融合体をコードするファージミドの作製。ＳＮａｓｅ−ｐIII 融合体を作製するため、プライマー：5'-CGCGAATTGGCCCAG CCGGCC ATGGCCGCAACTTCAACTAAA-3'（ＳｆｉＩ制限部位を下線で示す）及び5'-GCG
AATTGGTGCGGCCGCTTGACCTGA-ATCAGCGTTG-3'（ＮｏｔＩ制限部位を下線で示す）で
、ＳＮａｓｅをコードする遺伝子を有するプラスミドｐＯＮＦ１（１０）で行っ
た。その産物を、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで消化し、プラスミドｐＦＡＢ−５ｃ（
１１）の誘導体である。ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩで消化したｐＦＡＢ−５ｃ．Ｈｉｓ
に挿入して、ファージミドｐII７８−６を供した。陰性対照として、ファージミ
ドｐＣｏｍｂ３Ｈ．ＤＡを用いた。このファージミド（１２）は、ｐIII タンパ
ク質に融合した３９−Ａ１１Ｆａｂ抗体（１３）を有する。ＳＮａｓｅ及び対
照タンパク質の両方の発現は、ｌａｃプロモーターにより駆動される。

【０１０４】ファージ粒子の生産ファージ粒子を、Ｏｒｕｍｅｔａｌ．（１１）に従う小さな改変を伴って
生産した。要約すると、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅをｐII７８−６又はｐＣｏｍｂ
３Ｈ．ＤＡで形質転換し、３７℃で、２×ＹＴブロス及び１００mg／mLアンピシ
リン中で振とうした。０．５のＯＤ₆₀₀ で、酸ヘルパーファージを１．５×１０ ⁸ cfu／mLの最終濃度で加え、３７℃で２０分、インキュベートした。その細胞を
ペレット化し、２×ＹＴ、１００mM ＩＰＴＧ、１００mg／mLアンピシリン、５
０mg／mLカナマイシン中に再度懸濁し、１４時間、ＲＴで振とうした。細胞をペ
レット化し、その上清中のファージ粒子をＰＥＧで沈殿させ、次にＴＢＳ（２５
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．４、１４０mM ＮａＣｌ、２．５mM ＫＣｌ）中
に再度懸濁した。ファージタイトレーションを、標準的な手順（１４）を用いて
、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅで行った。

【０１０５】ファージへの塩基−リンカー−基質コンジュゲートの共有結合約１０⁸ のファージ粒子を、１mMのメルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）並びに
１nmolの塩基−リンカー−オリゴデオキシヌクレオチド（８）、塩基−リンカー
−ｐＴｐ（９）又は塩基−リンカー−ｐＴｐＴｐ（１０）のいずれかを補足した
４０mLの緩衝液Ａ（ＴＢＳ、１０mM ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ）中で、３７℃
で、６０分、インキュベートし、次にＰＥＧで２回、沈殿させて、緩衝液Ａ中に
再度懸濁した。

【０１０６】ファージ固定化及び固体支持体からの放出。塩基−リンカー−基質コンジュゲートに共有結合した約１０⁸ のファージ粒子
を、５０mLの磁石ストレプトアビジンビーズ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎ
ｈｅｉｍ、ビオチン結合能：１．５nmol／mL）と、１mLの緩衝液Ａ中で、１５分
、２３℃でインキュベートし；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む緩衝液Ａ中で
８回の１分の洗浄を行い、次に２回の１分の洗浄を緩衝液Ａ中で行った。ビーズ
上に固定されたファージの数を、そのビーズを緩衝液Ａに懸濁し、次に大腸菌Ｘ
Ｌ１−ｂｌｕｅにビーズ懸濁液を直接、感染させ、そして滴定するか、又はビー
ズのＤＮａｓｅＩでの処理（１unit／mLのＤＮａｓｅ１、１０mMのＭｇＣｌ₂ 、
２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８、２３℃で１５分）の後に感染させることによ
り決定した。固体支持体からのカルシウム依存性遊離（開裂）を、ビーズを緩衝
液Ｂ（ＴＢＳ、１０mM ＣａＣｌ₂ 、０．１％ＢＳＡ）に懸濁し、２３℃で５分
、インキュベートし、そしてその上清を滴定することにより検査した。ビーズか
らのカルシウム依存性放出（漏出）を、ビーズを緩衝液Ａに再度懸濁し、５分、
２３℃でインキュベートし、そしてその上清を滴定することにより検査した。

【０１０７】ライブラリー様アンサンブルからの活性酵素の富化ＳＮａｓｅ又は３９−Ａ１１Ｆａｂを提示するファージ粒子を１：１００の
比で混合し、ビーズ−リンカー−オリゴデオキシヌクレオチドコンジュゲート（
８）を共有結合させた。次にファージを磁石ストレプトアビジンビーズに固定し
、緩衝液Ａで洗い、そして上述の通り緩衝液Ｂ中でインキュベートして、大腸菌
ＸＬ１−ｂｌｕｅにその上清を感染させ、その細胞を、１００mg／mLのアンピシ
リンを含むＬＡプレートにプレートした。ランダムに採取したコロニーを、ＰＣ
Ｒ又は制限酵素消化によりＳＮａｓｅ−又は対照クローンとして同定した。

【０１０８】結果及び議論選択スキーム。ファージ−ディスプレイ型のディレクティド酵素エボルーションのための上述
のストラテジーをテストするために、ファージに提示される酵素に、又はその近
くに所定の基質を選択的に結合させるための一般的な方法を開発することが最初
に必要であった。重要なのは、その基質が、それがコンジュゲートした酵素の活
性部位に生産的に結合することができるように結合しなければならないことであ
る。更に、基質は、ライブラリーのメンバー間の反応産物のクロスオーバーがな
いことを確実にするためにファージに共有結合すべきである。１つの可能性ある
ストラテジーは、ジスルフィド交換反応による基質での酵素又はその近くのファ
ージコートタンパク質（例えばｐIII タンパク質）の選択的な化学修飾に関する
。例えば、部位特異的変異誘発を介してスタフィロコッカルヌクレアーゼの活性
部位の近くに導入されたシステイン残基は、ジスルフィド交換反応（１５）によ
り特有の化学的官能性を選択的に導入するために用いられている、この方法を、
繊維状ファージ上で発現されるタンパク質に適用するために、ｐVI、ｐVII 及び
ｐIXコートタンパク質の３つの単一のシステインを最初にアラニンに変異誘発し
た。ｐIII タンパク質中の埋もれたシステインは、それらは構造的に重要なジス
ルフィド架橋を形成する（１６）ようであるので、変化しないままであった。不
幸なことに、ジスルフィド交換、マレイミド付加又はアルキル化反応により、フ
ァージ上に提示されるいくつかの酵素の活性部位の近くに導入されたユニークシ
ステイン残基を選択的に修飾するためのくり返しの試みは、ファージコートタン
パク質の大きな非特異的ラベリングをおこした。特有の表面システイン残基を含
むｐIII 融合タンパク質の可能な選択的ラベリングを行う条件又は試薬は見い出
されなかった。ファージコートを構成する何千ものタンパク質は、化学反応のた
めの特異性要求を極めて大きなものにし；またタンパク質生合成における固有の
誤差率によるシステインミスインコーポレーションの可能性は、このようなタン
パク質の大きなアセンブルのため大きくなる。あるいは、ｐIII タンパク質中の
システイン残基は架橋試薬にアクセス可能になる。

【０１０９】これらの問題を克服するために、化学的架橋の前に改変の部位で非共有結合複
合体の選択的形成を行う２ステップ法を開発した（図９及び１０）。その複合体
は、ヘテロ２量化前に基質が共有結合する合成塩基性ペプチドＢ：C(GGS)₄ AQLKK KLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQ GGC、及び繊維状ファージのｐIII コートタンパク質
へのＮ末端融合体として発現される酸性ペプチドＡ：GAAQLEKELQALEKENAQLEWELQ ALEKELAQ GGCPAGAからなるヘテロダイマーコイル−コイルである。酸及び塩基ペ
プチド（下線）を、それらの小さなサイズ（３０アミノ酸）及び安定な平行した
ヘテロダイマーコイル−コイル構造を形成する高い傾向のため、二量化ドメイン
として選択した−酸−酸及び塩基−塩基ホモダイマーは、ヘテロダイマーより１
０⁵ 倍悪い効率で形成する。合成（Ｂ）及びファージにコードされた（Ａ）ペプ
チドのヘテロダイマー化は、基質を、提示された酵素の近くに運び、各々のペプ
チド上のシステイン間の自発的なジスルフィド結合形成を導くはずである（図１
０）。トリペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓを、２つのヘリックス間のジスルフ
ィド架橋の形成を容易にするために酸及び塩基ペプチドのＣ末端に加えた（１７
）。その基質を基質の酵素への生産的結合を容易にするためにフレキシブルリン
カーを介して塩基性ペプチドＢに共有結合させる（図９）。酸性ペプチドＡを、
以下の理由のため、提示された酵素自体でなくファージのｐIII タンパク質に融
合させる：（ｉ）酸ペプチド配列の酵素への挿入は酵素機能を妨害し得る；（ii
）塩基−リンカー−ペプチドのフレキシブルリンカー並びにｐIII タンパク質及
びｐIII と提示された酵素との間に挿入されたペプチドリンカーは、酵素の活性
部位に対する基質の多くの可能な配向を許容するはずである；そして（iii）各
々の酵素に機能的なコンジュゲーション部位を操作しなければならないより、多
くの酵素−基質対を提示するために酸ペプチド伸長部を有する単一のヘルパーフ
ァージを用いることが可能であるはずである。

【０１１０】酸ヘルパーファージ及び塩基−リンカー−基質コンジュゲートの形成塩基−リンカー基質コンジュゲートをファージに結合させるために、我々は、
Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ内のｐIII タンパク質のＮ末端に酸性ペプチドＡ
を導入した。その酵素ライブラリーをｐIII コートタンパク質のＮ末端に融合し
；この構成物をファージ内に保有させる。ヘルパーファージによる重感染により
、ファージミドＤＮＡを含むがそのコートがヘルパーファージゲノムによりコー
ドされるタンパク質から（１つを除いて）なるファージ粒子を生産する。１つの
例外は、ファージの一端に４〜５のコピー中に存在するｐIII タンパク質である
。ファージのパッケージングの間、酵素−ｐIII 融合体及び酸ペプチドＡ−ｐII
I 融合体の両方が生産され、典型的な調製物から得られたファージ粒子は、１又
は０の酵素−ｐIII 融合体、及び酸ペプチドＡ−ｐIII 融合体の３〜５のコピー
を有する。

【０１１１】酸ペプチド−ｐIII 融合体を有するファージを形成するために、システイン残
基を含むＣ末端伸長部と共に酸性ペプチドＡをコードするＤＮＡをＭ１３Ｋ０７
ヘルパーファージの遺伝子III の５’−端に導入した。得られた酸ヘルパーファ
ージ粒子は、細菌ペプチドＢでコートされたＥＬＩＳＡプレート上に、Ｍ１３Ｋ
０７より１００倍超、より効率的に固定化され、このことは、変異体ヘルパーフ
ァージがそれらのｐIII タンパク質上にアクセス可能な酸ペプチド伸長部を有す
ることを示す。同様に、ｐIII 融合タンパク質を含む大腸菌に酸ヘルパーファー
ジを重感染させた場合、得られたファージ粒子は、ｐIII 融合タンパク質に加え
て、修飾ｐIII 伸長部を提示した（図１０）。酸ペプチドの挿入は、ヘルパーフ
ァージのタイター又はレスキュー効率を大きく変化させないようであった。

【０１１２】基質が結合している合成塩基−リンカー−ペプチド（Ｂ）は、２０の残基（Ｇ
ｌｙＧｌｙＳｅｒ）₄ リンカー、及びその後にその塩基配列を構成する３０のア
ミノ酸からなっている（図９）。塩基−リンカーペプチドは、ペプチドの基質へ
の有効な選択的カップリング、及びファージへのジスルフィド形成を各々許容す
るＮ−及びＣ−末端にシステイン残基も含む（図９及び１０）。合成ペプチドの
Ｃ末端システインは、最初に、光化学的に除去できる２−ニトロ−４，５−ジメ
トキシベンジル保護基で保護される。これは、基質が（例えばジスルフィド交換
、アルキル化、又はミカエル付加反応により）チオール特異的反応により選択的
に結合するのを許容する。基質コンジュゲーションの後、Ｃ末端システインは、
高収率で光化学的に脱保護化されて、ファージ上の酸ペプチド伸長部への架橋の
ために利用できる遊離チオールを形成する。基質及び塩基−リンカーペプチドの
化学的コンジュゲーション、並びにこのコンジュゲートのファージへの架橋は別
個に行われるので、多くの異なる化学及び反応条件を用いて塩基−リンカーペプ
チド及び基質を結合させることができる。更に、そのコンジュゲートの組成は、
それをファージに架橋する前に、（例えば質量分析により）精製し、キャラクタ
ライズすることができる。

【０１１３】モデルシステムとしてのスタフィロコッカルヌクレアーゼ。酵素スタフィロコッカルヌクレアーゼは、１４９アミノ酸長の一本鎖のポリペ
プチド鎖からなる十分にキャラクタライズされた酵素である（１８）。その酵素
は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ｓｓＤＮＡ、及び二本鎖ＤＮＡのホスホジエ
ステル結合を、Ａ，Ｕ−又はＡ，Ｔ−の豊富な領域で優先的に加水分解して３’
−ホスフェート及び５’−ヒドロキシル末端を形成する（１８）。酵素活性のた
めにＣａ²⁺が要求され、酵素作用を調節するためのメカニズムを供する。更に、
ＳＮａｓｅは、ファージ上のｐIII 融合タンパク質として上手く提示されている
（１９）。

【０１１４】一本鎖オリゴヌクレオチド基質とその開裂産物との間を容易に区別できる試薬
、抗体又はレセプターは利用できない（相補オリゴヌクレオチドは分解されるで
あろう）ので、ｓｓＤＮＡの酵素開裂が固体支持体からのファージの遊離を引き
おこす選択スキームを開発した。このスキームにおいて、１ラウンドの選択は、
次のステップに関する：ｉ）（ＳＮａｓｅを不活性化するためにＣａ²⁺の欠如下
での）ＳＮａｓｅを提示するファージの、固体基質への、一本鎖オリゴデオキシ
ヌクレオチドの結合；ii）洗浄による未結合ファージの除去；（iii）Ｃａ²⁺の
添加による開裂反応の開始、及びiv）溶出されたファージの単離。選択の後のラ
ウンドにおいて溶出は、次第に増加するストリンジェント条件、例えばより短い
反応時間、より低い温度及びpHの変化の下で行うことができる。ファージの固体
支持体への結合は、５’−ビオチニル化オリゴデオキシヌクレオチド−ペプチド
Ｂコンジュゲートとファージ上の酸ペプチドＡ伸長部との間のコイルド−コイル
形成、次のその２つのペプチドのジスルフィド架橋及びストレプトアビジンビー
ズへの固定化により行われる（図９）。ファージを基質を介して固体支持体に結
合させるこのスキームは、酵素又は基質がファージへの結合の間、不活性状態に
維持され、そして次に反応条件の変化により活性化されることを要求する。この
ような変化に、pHの調節、コファクター又はコサブストレートの添加、及び基質
の光化学又は化学的活性化がある。結合形成が固体支持体上のファージ固定化を
引きおこす生体分子縮合反応の場合、活性酵素の捕獲が産物特異的試薬、抗体又
はレセプターによるので、反応を開始させる必要はない。

【０１１５】基質のファージへの共有結合ＳＮａｓｅ又はコントロールタンパク質（抗体３９−Ａ１１Ｆａｂフラグメ
ント）のいずれかを提示するファージを、酸ヘルパーファージの重感染により調
節した。塩基−リンカー−基質コンジュゲートのファージへの結合の効率を評価
するために、過剰なコントロールコンジュゲート“ｐＴｐ”−ペプチドＢ（化合
物９）を、ファージと共にインキュベートした。その塩基−リンカー−ｐＴｐコ
ンジュゲートは、ビオチン成分、次にデオキシチミジン−３’，５−ジホスフェ
ート（ｐＴｂ）、フレキシブルペプチドリンカー及び塩基ペプチド配列、並びに
Ｃ末端システインからなる。その塩基−リンカー−ｐＴｐコンジュゲートは、溶
液中で野生型ＳＮａｓｅのための基質ではない（ｐＴｐはＳＮａｓｅの潜在的な
インヒビターである）（２０）。ファージ及び基質−ペプチドＢコンジュゲート
を、最初に、還元剤メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）とインキュベートして、
ファージ酸ペプチド上のシステイン又は合成ペプチド上のシステイン間のジスル
フィド結合を還元した。次に、ＭＥＡ及び遊離塩基−リンカー−ｐＴｐを、ＰＥ
Ｇ沈殿により除去し、磁石ストレプトアビジンビーズを加えた。１０回の洗浄後
、固定化されたファージの数を、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅのビーズでの感染及び
ファージの滴定により決定した。この方法で測定する場合、ファージ固定化の効
率は、ＳＮａｓｅ及び３９−Ａ１１Ｆａｂを提示する両方のファージについて
約１０％であった（図１０）。

【０１１６】次に、ＳＮａｓｅを提示するファージに結合したオリゴヌクレオチド基質がＣ
ａ²⁺の欠如下で安定であるか否かを決定した。塩基−リンカー−オリゴデオキシ
ヌクレオチドコンジュゲートを、（ＥＤＴＡの存在下で）ＳＮａｓｅを提示する
ファージに結合させ、上述の通り固定化効率を測定した。固定化の効率も約１０
％であり（図１１）、このことは、束縛されたオリゴデオキシヌクレオチド基質
がＣａ²⁺の欠如下でＳＮａｓｅにより開裂されないことを示す。真の固定化効率
は、ファージのいくつかがビーズに結合する場合に非感染性にされるなら、観察
される値より高い可能性がある。この考えを、束縛されたオリゴデオキシヌクレ
オチド基質を開裂し、固定化されたファージを遊離させるはずであるＤＮａｓｅ
Ｉの添加によりテストした。図１１に見られるように、固定化されたファージの
ほとんどは非感染性であったが、ＤＮａｓｅＩの添加により感染性になり、この
ことは、真の固定化効率は約８０％であることを示す（図１１）。オリゴデオキ
シヌクレオチド−ペプチドＢコンジュゲートが含まれないなら、ファージの０．
０１％未満しか固定されず；野生型Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを重感染に用
いるなら、約０．３％のファージが固定化される。これにより、基質のファージ
ｐIII タンパク質への結合のための２−ステッププロトコルは効率的であり、極
めて部位特異的であるようである。

【０１１７】固体支持体からのファージの酵素依存性開裂及び富化ファージが提示するＳＮａｓｅが、分子内反応において束縛されたオリゴデオ
キシヌクレオチド基質を特異的に開裂することができるか否かを決定するために
、Ｃａ²⁺を固定化ファージに加えて酵素を活性化させた。Ｆａｂ３９−Ａ１１を
提示するコントロールファージの０．２％の遊離と対照的に、約１５％のファー
ジが遊離した（図１１）。この実験は、ＳＮａｓｅが、予想通りに、コントロー
ルタンパク質よりかなり効率的に固体支持体からファージを開裂し、遊離させる
ことを証明する。しかしながら、ファージの小さいが重要な画分は、アッセイの
間に支持体から漏出するようである（このバックグラウンド漏出は、塩基−リン
カー−オリゴデオキシヌクレオチド及び塩基−リンカー−ｐＴｐコンジュゲート
の両方について、並びに提示されたタンパク質の両方について、Ｃａ²⁺なしで観
察される）（図１１）。Ｃａ²⁺の添加は、支持体からのファージ放出の最初のバ
ーストを導くが、ファージの放出は、Ｃａ²⁺なしで観察される漏出に対応するレ
ベルに迅速に下降する。この結果は、分子内開裂により溶液に放出されるファー
ジは、分子内開裂反応の結果として支持体から他のファージを放出しないことを
証明する。それゆえ、交差反応は、ＳＮａｓｅのような極めて活性な酵素でさえ
も重要ではないようである。

【０１１８】上述の分析は、触媒的に不活性なタンパク質を提示するファージのライブラリ
ー様アンサンブルからＳＮａｓｅを提示するファージを富化することが可能であ
るはずであることを示唆する。これをテストするために、ＳＮａｓｅ及びＦａｂ
３９Ａ−１１コントロールタンパク質を提示するファージを１：１００の比で混
合し、オリゴデオキシヌクレオチド−ペプチドＢコンジュゲートに架橋して固定
化した。Ｃａ²⁺とのインキュベーションの後、回収されたファージの比は２２：
１８であり、それは１００より少し高い富化率に相当する。この富化の程度は、
５ラウンドの選択及び増幅の後、１０¹⁰のメンバーのライブラリーから活性な触
媒を単離するために十分であるはずである。

【０１１９】富化率は、同様に、支持体からのファージのバックグラウンド漏出を最小にす
ることにより増加させることができる。この漏出は、支持体からのストレプトア
ビジンの放出、又は合成及びファージかコードするペプチドの間のジスルフィド
架橋の減少もしくは間違った形成から生じ得る。我々は、現在、これらの可能性
を研究している。あるいは、富化因子は、酵素触媒開裂反応の程度を増加させる
ことにより、増加させることができる。ファージ生産の条件下で、ファージから
発現されるｐIII 融合タンパク質に対するヘルパーファージから発現されるｐII
I の比は、ファージのほとんどが野生型ｐIII タンパク質のみをし；ファージの
小画分のみがタンパク質−ｐIII 融合体を有するようである。それら自体を開裂
することができるファージの数は、単に、酵素を提示するファージの数を増加さ
せることにより増加させることができる。本明細書に記載されるファージミド／
ヘルパーファージの組合せのため、我々は、ファージの約１５％だけが一価であ
ると評価する。好適なベクターデザイン及びファージ調製により、その平均提示
を、ファージ当り約１のタンパク質に増加させることが可能であるはずである。
これは、開裂対漏出比を７倍、増加させ、従って現在の約１００から約７００に
、活性対不活性酵素の富化率を増加させるはずである。

【０１２０】本明細書に記載される選択スキームを小分子基質に関連する反応のために用い
ることができるか否かを検査するために、ｐＴｐＴｐ−ペプチドＢコンジュゲー
ト（化合物１０）を、ＳＮａｓｅ又はコントロールタンパク質を提示するファー
ジに結合させた。ファージは、上述の富化ルーチンを介して保有させ、またＳＮ
ａｓｅを提示するファージを富化した。ｐＴｐＴｐ基質が２つのチミジンの間の
ホスホジエステル結合で開裂されたことを示すためにＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分
析を用いた。副産物は検出されなかった。これにより、その方法は、高分子及び
小分子基質の両方に適用できるようである。我々は、現在、酵素又は抗体起源の
ライブラリーから新規触媒を単離する可能性を研究している。

【０１２１】ファージ上に提示されるほとんどの酵素ライブラリーはＭ１３Ｋ０７のような
ヘルパーファージによる重感染を要求する。それゆえ、本明細書に記載される選
択プロトコルは、これらのライブラリーに直接、適用することができる−１つは
、単純に、酸ペプチドヘルパーファージでのファージミドにコードされるライブ
ラリーの重感染の後にファージを調製し、そして選択された基質を細菌ペプチド
Ｂにコンジュゲートすることを必要とする。同様に、この方法は、構造的に多様
なタンパク質の集団に適用することができる。ゲノムによりコードされるタンパ
ク質の収集は１つのこのような集団である。例えば、この選択スキームを用いて
、ゲノムタンパク質ライブラリーから予め決められた基質特異性を有する天然の
キナーゼを単離することが可能であるはずである。天然の酵素（及びそれをコー
ドする遺伝子）をその触媒活性に基づいて単離するこの型の機能的クローニング
は、天然の酵素により触媒される多くの反応に適用できるはずである。

【０１２２】実施例１に用いた引用文献及び文書

【０１２３】

【表１】

【０１２４】

【表２】実施例２：触媒としてのファージが提示するリパーゼ及びＸＹ交換対としてのＤＮＡオリゴを用いるリパーゼ変異体の単離これは、図８に示す選択スキームの一例である。

【０１２５】ファージミド作製：テンプレートとしてのＨｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼ遺伝
子（ＳＰ４００）、並びにプライマーＦｗｄ：GTCACAGATCCTCGCGAATTGGCCCAGCCG
GCCATGGCCGAGGTCTCGCAGGATCTGTTTAACCAGTTC、及びＲｅｖ：CAGTCACAGATCCTCGCGA
ATTGGTGCGGCCGCAAGACATGTCCCAATTAACCCGAAGTACCを、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限
酵素で消化して、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで消化したファージミドｐＦａｂ５Ｃに
挿入した（φrum ら、1993, NAR 21 : 4491-4498）。得られたファージミドｐＦ
ａｂ−ＳＰ４００は、（Ｎ末端から読んで）ｐｅｌＢシグナル配列（下線）、成
熟リパーゼをコードする遺伝子、及びアミノ酸残基１９８からのｐIII 遺伝子（
下線）を含む配列番号：１で示す遺伝子を有する。ｐＦａｂ−ＳＰ４００リパー
ゼライブラリーは、リパーゼアミノ酸配列において異なるいくつかのこのような
ファージミド構成物を含む。

【０１２６】ファージ粒子の生産ファージ粒子を、φrum ら（上述）に従う小さな改変と共に生産する。要約す
ると大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’をｐＦａｂ−ＳＰ４００リパーゼライブラリーで形質
転換し、そして１００μｇ／mLアンピシリンを含むＬＢ培地中で３７℃で振とう
する。０．５のＯＤ₆₀₀ で、酸ヘルパーファージ（ｐIII のＮ末端に３０量体の
酸ペプチド伸長部を有するＭ１３Ｋ０７誘導体、Pedersenら、PNAS (1998)、出
版中）を、１．５×１０⁸cfu／mLの最終濃度まで加え、３７℃で２０分、インキ
ュベートした。その細胞をペレット化し、ＬＢ、５μＭＩＰＴＧ、１００μｇ
／mLアンピシリン、５０μｇ／mLカナマイシンに再度懸濁して、６〜８時間、３
７℃で振とうした。細胞をペレット状にし、その上清内のファージ粒子をＰＥＧ
で沈殿させ、次にＴＢＳ（２５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．４、１４０mM Ｎ
ａＣｌ、２．５mM ＫＣｌ）に再度懸濁した。ＰＥＧ沈殿及び再度の懸濁をくり
返し、そして最後にファージを、滅菌ろ過した。

【０１２７】塩基−リンカー−ＤＮＡコンジュゲート（“塩基−リンカー−Ｘ”）の合成光保護してＦ−ｍｏｃ保護した化合物、Ｆｍｏｃ−Ｓ−（２−ニトロ−４，５
−ジメトキシベンジル）−Ｌ−システイン１を合成する。得られた粗産物を更に
真空で乾燥させ、そして塩基−リンカーペプチドC(GGS)₄ AQLKKKLQALKKKNAQLKWKL QALKKK -LAQGGc（塩基配列を下線で、光保護化システインを小文字で示す）の合
成に直接、用いる。おおよその長さ及び配列が5'-SH-GGGAAGAACCC-3'であるＤＮ
Ａオリゴを、５’−チオール（５’−チオール−モディフィアーＣ６、Ｇｌｅｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で合成し、樹脂からの除去の後、逆相ＨＰＬＣにより精製
し；チオール上のトリチル保護基をＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈのプロトコルに
従って除去した。その産物を凍結乾燥し、水に溶かして、次の通り塩基−リンカ
ーペプチドにコンジュゲートした：塩基−リンカーペプチドを２０倍モル過剰の
Ｎ，Ｎ’−ビス（３−マレイミドプロピオニル）−２−ヒドロキシ−１，３−プ
ロパンジアミンと、リン酸ナトリウム緩衝液pH５．５中で、約１０時間、窒素下
で４℃で反応させた。得られた産物を逆相ＨＰＬＣにより反応混合物から精製し
た。その緩衝液をリン酸ナトリウム、pH７に調節し、ＮａＣｌを加えて沈殿を回
避し、そして上述のＤＮＡオリゴを加え、そしてその溶液をＲＴで、約１０時間
、窒素下でインキュベートした。その産物をアニオン交換ＦＰＬＣにより精製し
、そして産物画分を光脱保護ステップのために用いる。その光脱保護化ステップ
において、Ｃ末端システイン上の２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル保護
基を以下の通り光分解により除去をする：その保護されたコンジュゲート（前掲
）をアルゴンで全体を脱気し、次に水銀ランプに、隔壁キャップ化ガラス容器内
で３０分、露出して、脱保護化した塩基−リンカー−ＤＮＡコンジュゲートを生
成した。

【０１２８】 “ＤＮＡ−ｐｎｐブチレートエステル−カラムマトリックス”コンジュゲートの合成この選択に用いるべきＹ−基質−カラム成分を、おおよその長さ及び配列が5'
-SH-CCCTTCTT-3’及び5'SH-TTCTTGGGの５’−チオール修飾ＤＮＡオリゴを、ｐ
−ニトロ−フェニル−ブチレートエステル又はｐ−ニトロ−フェニル−パルミテ
ートエステルに、例えばチオール化ＤＮＡの、ブチレート又はパルミテート上の
マレイミドユニットとの反応により結合させることにより調製する。次にその産
物を、カラムマトリックスに、オルト又はメタ位のいずれかを介して、マトリッ
クス上の官能基との特異的反応により結合させる。

【０１２９】塩基−リンカー−ＤＮＡコンジュゲートのファージへの共有結合約１０¹⁰のファージ粒子を、４mL ＴＢＳ、１０mM ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳ
Ａ、１mMメルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）及び１００mmolの塩基−リンカー−
ＤＮＡ中で、６０分、インキュベートし、次にＰＥＧで２回、沈殿させ、リパー
ゼ緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．５、０．３mM ＣａＣｌ、０．１
mM ＭｇＣｌ₂ 、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に再度懸濁する。

【０１３０】塩基−リンカー−ＤＮＡコンジュゲートが結合しているファージのプレソーティング塩基−リンカー−ＤＮＡコンジュゲートが結合しているファージを除くために
、上述の共有結合手順を介して行ったファージを、塩基−リンカー−ＤＮＡ−コ
ンジュゲート中のＤＮＡに相補的な配列のＤＮＡオリゴ（例えば配列GGGAAGAACC
C）を有するアフィニティーカラムに充填する。カラムで遅く出たファージを収
集する。

【０１３１】ライブラリー内で最も活性なリパーゼの単離 “ＤＮＡ−ｐｎｐブチレート”がマトリックスに結合しているカラムをリパー
ゼ緩衝液中で平衡化する。次に、塩基−リンカー−ＤＮＡコンジュゲートが結合
しているファージ粒子（上述）をカラムに充填する。収集した各々の画分におい
てタイター決定を行う。有意な数のファージを含む最も速く動く画分は、より活
性なリパーゼを有するファージを含む。

【０１３２】実施例３：ＰＣＲ増幅性ＤＮＡライブラリー及びＸＹ交換対（Ｙ交換ユニットは、Ｘオリゴ上の重複結合部位を有する２つのオリゴＹ₁ 及びＹ₂ からなる）としてのＤＮＡオリゴを用いる、ＲＮＡ開裂性デオキシリボヌクレオチド変異体の単離ＤＮＡライブラリー作製ＰＣＲ反応を、テンプレート5'-ggaagggatggtcacatgcaCTAGTTAGGCTAGCTACAACG
ATTTTTCCcggtaagcttggcaactgac-3'（プライミング部位は小文字の部分、デオキ
シリボザイム触媒モチーフは５’端から数えて２番目の下線と３番目の下線との
間の部分、基質結合配列は２番目及び３番目の下線の部分、Ｘ交換成分を５’端
の下線の部分である）上のプライマー“センス”：5'-GGAAGGGATGGTCACATGCA-3'
及び“アンチセンス”：5'-ビオチン-GTCAGTTGCCAAGCTTACCG-3'で行った。ＰＣ
Ｒ産物をストレプトアビジンアフィニティーカラム（Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｔｈｅ
Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，Ｔｅｘａｓ）をくり返し通過させることにより固定化し、
数カラム容量の洗浄液（１ＭＮａＣｌ、０．１mM ＥＤＴＡ、５０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、pH７．５）で洗い、そして非ビオチニル化鎖を１００mM ＮａＯＨ
で溶出した。一本鎖ＤＮＡ分子をエタノールで沈殿させ、以下に記載のカラムベ
ースの選択に用いる。上述の（“野生型”）配列のｓｓＤＮＡ分子は、Ｍｇ⁺⁺依
存性反応において配列5'-r(GGAAAAAGUAACUAG)-3'のＲＮＡ分子を開裂する。デオ
キシリボザイムライブラリー（後述）は、プライミング部位間で配列の異なるい
くつかのｓｓＤＮＡ分子を含む。

【０１３３】Ｙ−ＲＮＡ標的−カラムマトリックスの調製配列5'-ビオチン-d(TACACG)-r(GGAAAAAGUAACUAG)-d(TTAGTGTCTCACCATCATCC)-3
'及び5'-biotin-d(TACACG)-r(GGAAAAAGUAACUAG)-d(TTAGTGTCTCGTGAATCCCT)-3'（
Oligos Etc., USA）の２つの混合ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴの等モル溶液を、ストレ
プトアビジンアフィニティーカラムをくり返し通過させることにより固定化し、
そして数カラム容量の洗浄緩衝液（１ＭＮａＣｌ、０．１mM ＥＤＴＡ、５０
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH７．５）で洗った。Ｙ交換成分Ｙ₁ 及びＹ₂ を下線で
示す。

【０１３４】ｓｓＤＮＡライブラリー中の最も活性なＲＮＡ開裂性デオキシリボザイムの単離ｓｓＤＮＡライブラリー（上述）を、“Ｙ１−ＲＮＡ−ビオチン”及び“Ｙ２
−ＲＮＡ−ビオチン”標的基質（上述）が洗浄緩衝液中で固定化されているスト
レプトアビジンカラムに充填する。数カラム容量の洗浄液での平衡化の後、反応
緩衝液（１０mM ＭｇＣｌ₂ 、１ＭＮａＣｌ、５０mM ＴｒｉｓＨＣｌ pH
７．５）の流れをしばらく維持する。画分を収集し、そのＤＮＡ含有量を（例え
ばＵＶ検出により）測定する。有意な量のＤＮＡを含む最も速く動く画分は、最
も活性なマグネシウム依存性ＲＮＡ開裂性分子を有するＤＮＡを含むはずである
。

【０１３５】実施例４：アルドール形成を触媒する酵素の最適化。この例において、ポリヒスチジンループ及び関連する金属イオンはＸユニットを含み；二歯状のリガンド（エチレンジアミン）はＹユニットを構成するケトン基質を、エチレンジアミン（ＥＤＡ）成分に結合させ、酵素にポリヒス
チジンループを保有させる、ケトン及び酵素を好適な金属イオン（例えばＦｅ）
の存在下で混合した場合、ポリヒスチジン及び金属イオンは速度論的に及び熱動
力学的に安定な相互作用を形成するであろう。ＥＤＡ−ケトンは、ポリヒスチジ
ン結合金属の残りの２つの配位部位について競合するであろう。アルドラーゼ活
性を有する酵素は、カラム緩衝液中のアルデヒドとの、酵素に結合したケトンの
反応を促進してアルドール産物を形成するであろう。典型的には、このアルドー
ルは特定の頻度で、脱水を行ってα，β−不飽和ケトンを形成する。このコンジ
ュゲートしたオレフィンは、カラム上で遊離チオールとミカエル付加反応を行い
、それにより酵素を固定化する。しかしながら、その緩衝液中のＥＤＡ−ケトン
コンジュゲートは、固定化された酵素と交換してそのもとの基質結合形態で酵素
を放出するであろう。のセット・アップにおいて、Ｈｉｓ＊金属−ＥＤＡはＸ−
Ｙを表し、そしてその産物結合成分は、水の除去後に産物を捕獲する求核基であ
る。その示される選択スキームは、アルドール及び脱水反応を効率的に触媒する
酵素について選択するはずである。

【０１３６】実施例５：実施例１に記載のファージ提示システム内に組み込まれるのに適したＸＹ交換対の例実施例１に記載のファージ提示システムにおけるＸＹ“実施形態” 溶液１：Ｘを基質でなく塩基−リンカーペプチドに結合させることを除いて、
実施例１からのガイドラインに従って、塩基−リンカーＸを合成する（上述の実
施例２を参照のこと）。上述の実施例１に記載されるように、塩基−リンカー−
Ｘコンジュゲートを（ヘルパーファージ上の）ｐIII 上の酸伸長部に架橋する。
Ｙを基質に結合し、選択を行う（上述の実施例２を参照のこと）。

【０１３７】溶液２：ヘルパーファージのｐIII のＮ末端に、又はｐIII の露出したループ
内に、４，５又は６のヒスチジンを挿入する（Ｈｉｓ₄ 及び金属イオンはＸ成分
を含む）。基質に、金属リガンド（例えば２歯状又は３歯状）をフレキシブルリ
ンカー（例えばポリエチレングリコール）を介して結合させる。ファージ及び金
属リガンド基質を、選択された金属の存在下で混合し、次に選択を行う（図１２
Ｂを参照）。

【０１３８】溶液３：酸又はＨｉｓ４ペプチド配列を、好ましくはリンカーに接続したｐII
I 及び酵素内の、ファージミド上の酵素−ｐIII 融合体に挿入する。一般的なタンパク質のためのＸＹ“実施形態” 溶液１：酸ペプチド又はＨｉｓ₄ 配列を露出したループに、又は酵素のＮ−又
はＣ−末端に挿入する。上述の通り進行する。

【０１３９】溶液２：（ＤＮＡレベルで）ユニークシステインを酵素に導入し、チオール特
異的反応（例えばジスルフィド結合形成、マレイミドへの付加反応）によりＸ成
分に結合させ、上述の通り進行する。実施例６：プラスミド−ペプチド、ポリペプチド又はｍＲＮＡ−ペプチドシステム内に組み込むのに特に適した交換対の例以下に、交換対−基質がプラスミド−ペプチドシステム（Schatz et al., 199
6, Meth. Enzym., vol. 267, pp. 171-191) 、ポリソーム−ペプチドシステム（
Mattheakis et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, pp. 9022-9
026 ; He and Taussig, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25, pp. 5132-51
34）又はｍＲＮＡペプチドシステム（Roberts and Szostak, 1997, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, vol. 94, pp. 12297-12302)において酵素にいかに結合し得る
かを記載する。

【０１４０】ｍＲＮＡ−タンパク質融合体内のｍＲＮＡの部分がＸユニット（例えばテンプ
レートＤＮＡ中のＤＮＡ配列 5'-GCCGAAGCGCAATGAAGGGCAACCCG-3' を含むもの）
になるようにテンプレートＤＮＡをデザインする。図１３Ａを参照のこと。要求
される基質をＤＮＡＹ−ユニットに結合させる（例えば基質を、２つのオリゴ
Y1 : 3'-TTACTTCCCGTTGGGC-5' 及びY2 : 3'-CGGCTTCGCGTTACTT-5' の混合物に結
合させる）。次に、ｍＲＮＡ−ペプチド融合物の調製の後、ｍＲＮＡ−ペプチド
融合体（Ｘユニットを有するもの）及び基質コンジュゲート（Ｙユニットを有す
るもの）を混合し、そして例えばその混合物を産物結合カラムに適用なことによ
り、基質リローディング選択を行う。

【０１４１】あるいは、ＸユニットをｍＲＮＡ及びコードされたペプチドを接続するリンカ
ーの部分であり得る（例えばｍＲＮＡ及びペプチドを接続するリンカー内にＤＮ
Ａ配列：5'-GCCGAAGCGCAATGAAGGGCAACCCG-3'を含む。）。図１３Ｂを参照のこと
。次に、基質コンジュゲートと混合し、上述の通り基質リローディング選択を行
う。

【０１４２】実施例７：より活性の少いプロテアーゼ変異体を生産する細胞のバックグラウンドにおけるより活性なプロテアーゼを生産する細胞の富化この例において、個々のユニットは、細胞、ＸＹ交換対を介して細胞の表面に
結合した基質、及び細胞により生産され分泌される酵素からなる（図１４）。周
囲の媒体内の遊離Ｙ−基質は、細胞表面に結合した基質を連続的に置換する、結
果として、分泌される酵素の局所的濃度は、他のいずれかの細胞の結合した基質
の近くでよりも、分泌される細胞に結合した基質の近くでかなり高くなるので、
より活性の小さい酵素を分泌する細胞上より、活性な酵素を分泌する細胞上に結
合した産物が多くなるであろう。

【０１４３】基質は多くの方法で細胞表面に結合することができる。例えば、リン脂質、脂
肪酸、ステロール、コレステリルエステルは、標的反応の基質で誘導化すること
ができる。細胞とインキュベートした時に、これらの分子は直ちに膜内部に局在
化し、基質を細胞の表面上に露出させる。あるいは、基質は表面構成物と反応す
る架橋試薬で誘導化することができる。最後に、基質は、ポリサッカライド又は
膜タンパク質のような膜構成物に結合する構造（例えばタンパク質、抗体）で誘
導化することができる。

【０１４４】原理は、個々のユニットが、細胞（例えばバチルス）、結合した基質（ペプチ
ド）、及び分泌された酵素（プロテアーゼ）からなる場合にここで例示する。Ｈ
ｉｓ６−金属−ＩＤＡ又はＨｉｓ６−金属−ＮＴＡ複合体をＸＹ交換対として用
いる。選択を、カラム形態で行う。そのカラムマトリックスを、プロテアーゼの
ための標的配列を有するペプチドでコートする。そのペプチドを、一緒でカラム
マトリックスに結合させ、その他端はポリヒスチジン（Ｈｉｓ₆ ）タグを有する
。

【０１４５】実験を次の通り行う。関心のプロテアーゼ（例えばＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのＣ−成分又は市販のＳａｖｉｎａｓｅプロテアーゼ
）を分泌するバチルス細胞を、指数増殖期に収集し、好適な緩衝液に再懸濁し、
細胞表面成分に架橋するであろう二官能性分子と共にインキュベートする。その
二官能性分子はイミノ二酢酸（ＩＤＡ）又はニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）成分に
連結したＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）成分であり得る。ＮＨＳは、細
胞表面上の一級アミンと反応し、それはＩＤＡ又はＮＴＡ成分を細胞表面に共有
結合で固定する。

【０１４６】細胞の分離のための好適なカラムマトリックス（例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ又
はＳｅｐｈａｄｅｘ）は、関心のプロテアーゼのためのペプチド標的（例えばＣ
−成分の場合、配列 IELSEPIGNTVCHHHHHH ）でコート又は誘導化される。一端に
おいて、そのペプチドはポリヒスチジンの伸長部を有する。他端において、それ
は（例えばＮＨＳ活性化Sepharose,Pharmacia Biotech)とのＮ末端アミンの反応
を介して）カラムマトリックスに結合される。

【０１４７】ＩＤＡ−又はＮＴＡ−改変細胞は、ペプチド改変カラムに、好適な緩衝液（例
えばＮｉ⁺⁺，Ｚｎ⁺⁺，Ｃｕ⁺⁺、又はＣｏ⁺⁺を加えた２×ＹＴ又はＬＢ培地；温度
３５〜５０℃）内で充填される。流速は０．５mL／分未満に維持される。複合体Ｈｉｓ６−金属−ＩＤＡ（又はＨｉｓ６−金属−ＮＴＡ）が形成され、
これによりプロテアーゼ基質は細胞に結合される。細胞が活性なプロテアーゼを
分泌するなら、これらは標的を開裂し、そしてカラムマトリックスから細胞を放
出させ；また、Ｈｉｓ６−金属−ＩＤＡ（又はＨｉｓ６−金属ＮＴＡ）複合体は
迅速に平衡化して、基質又は産物の、新しい基質との連続的な置換を引きおこす
。結果として、より効率的な酵素を分泌する細胞、又はより多くの活性酵素を分
泌する細胞は、そのカラムの底で最初に溶出される。

【０１４８】その原理を以下の方法でテストする。いくつかのプロテアーゼ変異体を分泌す
る細胞、又は種々の量で同じでプロテアーゼを分泌する細胞を、上述の通りテス
トし、そして基質リローディングプロトコルを記載される通り行った。より効率
的なプロテアーゼ、又はプロテアーゼの大部分を分泌する細胞は最初に溶出され
よう。

【０１４９】選択のストリンジェンシーは、カラムマトリックス上に固定された基質の密度
、及び細胞表面上のＩＤＡ−（又はＮＴＡ−）カップリング密度により調節され
る。異なる条件、例えば塩濃度、pH又は温度で改良された発現又は活性を有する
変異体は、この方法によって単離することができる。実施例８：ＸＹ交換対としてのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド二本鎖、及び標的基質としてのＹ−ユニットの部分を用いる、ハンマーヘッドリボザイムの単離ハンマーヘッドは、特定のホスホジエステルを開裂して、１min^-1 近い速度（
Ｋcat ）で３’−環状ホスフェート及び５’−ヒドロキシ末端を作り出す天然の
酵素である（Stage-Zimmermann et al., 1998, RNA vol. 4, pp. 875-89 ）。そ
の特異性は、リボザイムと標的との間の単純なワトソン−クリック塩基対形成に
より媒介され、開裂のための標的配列における唯一の要求がＵの後にＡ，Ｕ又は
Ｃが続くことであるので、そのハンマーヘッドは、本質的にいずれのＲＮＡ分子
をも開裂するようデザインすることができる。しかしながら治療に用いるために
、ハンマーヘッドは１つの大きな欠点を有する。２つの二本鎖を特異性を増加さ
せるために伸長させる場合、オフレートは顕著に減少し、リボザイムはターンオ
ーバーできない。開裂速度の増加したハンマーヘッド変異体についての調査する
ために、例えばランダム化配列のストレッチを含むＲＮＡプールからの試験管内
選択を行う（Vaish et al, 1997, Bio-chemistry, vol. 36, pp. 6495-501 ）。
しかしながら、その選択プロトコルは全てにおいて、研究が一ラウンドの開裂に
基づいていると報告している。基質リローディングストラテジーを用いて、リボ
ザイムはそれら自体を、カラムから溶出されるべき固定化マトリックスから、複
数回、放出させなければならない。以下の実験における塩濃度、温度及び二本鎖
長は、開裂後にリボザイムが基質を迅速に遊離させるために最適化される。その
遊離されたリボザイムは、２つの同軸上に積み重なった５bpヘリックスにより安
定化された新しい標的に迅速に結合する。この迅速をＸ−Ｙ交換は、Ｙがリボザ
イムにより半分に開裂され、それによりＸ−Ｙ相互作用を不安定化する事実によ
り達成される（図３Ａを参照のこと）。カラムを介しての緩衝液の連続的な流れ
を適用する場合、より迅速に開裂するリボザイムが最初に溶出する。

【０１５０】競合する内部構造又はミスホールディングのため、ゆっくりした基質結合（及
びそれゆえ迅速を溶出プロフィール）を示すＲＮＡ分子の潜在的な選択を排除す
るために、非開裂性ＤＮＡ−基質オリゴと効率的に相互作用するであろう分子に
ついてのプレ選択を任意に行うことができる（図１５Ｂを参照のこと）。その原理を証明するために、我々は、リボザイムの保存されたコア内の７つの
部位を任意抽出するよう選択した（図１５を参照）。これは、１６３８４の異な
る分子に相当し、そのうちの１つは約１mm^-1の開裂速度を示す野生型ハンマーヘ
ッドに相当する（Stage-Zimmermann et al., 1998, RNA, vol. 4, pp. 875-89）
。後述の実験における我々のライブラリーは１０¹³超のＲＮＡ分子を含むので、
我々は、野生型リボザイム又は少くとも野生型の速度を有するリボザイムを単離
すると期待できる。

【０１５１】実験の概要材料：１．図１５に示すＲＮＡライブラリー（約１００μｇ）を慣用的な技術（テン
プレートとしてランダム化合成ＤＮＡオリゴを用いるＴ７ＲＮＡポリメラーゼに
よる試験管内転写）により生産する。そのライブラリーをＰＡＧＥにより精製し
、カラム緩衝液に再び溶かし、−８０℃で１０μｇアリコート中に保存する。

【０１５２】２．（２−アミノ−１−（２−ピリジルジチオ）−エタンを介する）基質オリ
ゴのカップリングのためのＮＨＳ活性化Ｓｅｐａｒｏｓｅ及びシリコーン処理し
たガラスカラム（０．２cm×１０cm）。３．基質ＲＮＡオリゴ（図１５）を、慣用的な化学により合成し、ＨＰＬＣで
精製する。５’−チオホスフェート−ＨＥＧ−スペーサーを、５’端に組み込む
（５’−チオホスフェート−ＨＥＧスペーサーAGCUGUCACUCC−３’）４．デオキシヌクレオチドに基づくカウンター選択ＤＮＡオリゴ（図１５Ｂ）
を、慣用的な化学により合成する（５’−チオホスフェート−HEGspacer-AGCTGT
CACTCC−３’）。

【０１５３】５．カラム緩衝液（１０mM ＭｇＣｌ₂ 、５０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、pH７．
５）。実験手順：（ＤＮＡカウンター選択−ステップ２〜４は任意である）１．１００nmolのＲＮＡ基質オリゴ又は１００nmolのカウンター選択ＤＮＡオ
リゴを、活性化ジスルフィドで誘導化した１mLベッド容量ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅに、０．２cm直径、１０cm長シリコーンガラスカラム内に充填し、使
用直前に５容量のカラム緩衝液で平衡化する。

【０１５４】２．ＲＮＡライブラリーをＤＮＡオリゴカラムに充填し、１０容量のカラム緩
衝液で２０℃で１mL／分の流速で洗浄する。３．そのカラム温度を６０℃に調節し、そのＲＮＡを２カラム容量のＨ₂ Ｏ中
に溶出する。４．その緩衝液を０．２５ＭＮａＯＨでpH６．０に調節し、そのＲＮＡを２
．５容量のＥｔＯＨで沈殿させ、２０mLのカラム緩衝液に再び溶かす。

【０１５５】５．このサンプルを、３７℃で５分、インキュベートして、そのＲＮＡを再生
し、注意深くＲＮＡカラムに充填する。その温度は、後の選択の最適化のために
２５〜５０℃の範囲に調節すべきである。その流速は、リボザイムの基質リロー
ディングを許容するため０．５mL／分未満に維持すべきである。６．サンプルをカラムの底から収集し、標準的な方法によりリボザイム活性に
ついて個々にテストする（Vaish et al., 1997, Biochemistry, vol. 36, pp.64
95-501）。

【０１５６】７．リボザイム活性を示す最も早く収集されたプールからのリボザイムを３’
端相補プライマーを用いて逆転写し、上及び下流の適合プライマーを用いてＰＣ
Ｒ増幅する。Ｔ７プロモーターを、後の転写を可能にする上流プライマーに含め
る。そのＤＮＡプールをプラスミド内にクローン化し、個々のクローンを配列決
定により分析する。個々のクローンからのリボザイムを、Ｔ７転写により生産し
、テストする。

【０１５７】実施例９：Ｈｉｓタグ化タンパク質を提示するファージのプレ富化特定のタンパク質は繊維状ファージ上に提示するのが困難である。特に、大き
なタンパク質又は大腸菌に対して毒性又は生長阻害効果を有するタンパク質は、
低い提示効率を有する。即ち、生産されたファージ粒子の大部分は表面にｐIII
融合体を有さない。融合タンパク質を提示する千のファージのうちの１つ程度の
少なさの提示効率が報告されいる（Jestin et al., 1999, Angew.Chemi. Int. E
d., vol. 38, pp.1124-1127 ; Demartis et al., 1999, JMB, vol. 286, pp. 61
7-633 ）。このような場合、ｐIII 融合体をコードするＤＮＡを有するが、その
表面上にその融合体を提示しない大きく過剰なファージ粒子のため、高い非特異
的バックグラウンドが予想される。この潜在的な問題を克服するため、我々は、
ｐIII コートタンパク質と酵素との間にヒスチジンタグを挿入し、Ｎｉ−ＮＴＡ
カラムクロマトグラフィーにあるＨｉｓ−タグ化タンパク質を提示するファージ
の精製を許容する。

【０１５８】ヒスチジンタグについて以下に記載するのと同様に用いられている他のタグに
はインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）−キチン結合ドメイン融合体（Chong et al., 19
97, Gene, vol. 192, pp 271-281）、ＦＬＡＧペプチド（Slootstra et al, 199
7, Molecular Diversity, vol 2, pp. 156-164）、及びマルトース結合タンパク
質（Pryor and Leiting, 1997, Protein expression and Puritication, vol. 1
0, pp. 309-319）がある。

【０１５９】リパーゼ−Ｈｉｓ６−ｐIII 又はセルラーゼ−Ｈｉｓ６−ｐIII 融合タンパク質を提示するファージのＮｉ−ＮＴＡカラム精製Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（ＱｉａｇｅｎＳｐｉｎＫｉｔ）を６００μＬ
の“５０mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH８、３００μｍＮａｃｌ，１mMイミダ
ゾール、０．０５％ＢＳＡ”で平衡化した（７００Ｇで２分、遠心）。４００μ
のファージ調製物（実施例１０及び１１を参照のこと）（約１０12のファージ粒
子）に、１００μＬの“２５０mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH８、１．５ＭＮ
ａＣｌ、０．２５％ＢＳＡ”及び４μＬの１００μＭイミダゾールを加え、その
溶液を予め平衡化したカラムに充填し、２００Ｇで４分、遠心した。そのカラム
を６００μＬ“５０mMリン酸ナトリウム緩衝液pH８、３００mM ＮａＣｌ、２０
mMイミダゾール、０．０５％ＢＳＡ”で２回、洗った（各々２００Ｇで４分、７
００Ｇで２分、遠心）。次に、そのファージを３×３３３μＬの“５０mMリン酸
ナトリウム緩衝液pH８、３００mM ＮａＣｌ、２５０mMイミダゾール、０．０５
％ＢＳＡ”で溶出し（７００Ｇ、２分）、そしてその９９９μＬ溶出物をＰＥＧ
で沈殿させ、４００μＬの“５０mMリン酸ナトリウム緩衝液pH８、３００mM Ｎ
ａＣｌ、１mMイミダゾール、０．０５％ＢＳＡ”に再度懸濁した。その溶液を新
しいスピンカラムに充填し、その手順をくり返した。但し、最終的なＰＥＧ沈殿
物は５０μＬＴＥ緩衝液pH８に溶かした。この手順は、Ｈｉｓタグ化タンパク
質を提示するファージについて約５００倍、富化した。

【０１６０】実施例１０：ファージが提示するリパーゼ及びＸＹ交換対としてのＤＮＡオリゴを用いる、過剰なより少い活性のリパーゼ変異体のバックグラウンドにおける野生型リパーゼの富化これは、図１０Ｂに示す選択スキームの一例である。

【０１６１】ファージミド作製ファージミドｐｈ８（野生型リパーゼ）及びｐｈ１８（リパーゼＳ１４６Ａ変異体）：ＤＮＡオリゴ“Ｎｏｔ−Ｈｉｓ６−センス”(5
'-GGCCGCACCAGGAGGAGGATCACATCACCA-TCACCATCACTC-3'）及び“Ｎｏｔ−Ｈｉｓ６
−アンチセンス”（5'-GGCCGAGTGA-TGGTGATGGTGATGTGATCCTCCTGGTGC-3'）をアニ
ーリングし、その二本鎖産物をＮｏｔＩで消化したｐＦａｂ−ＳＰ４００（上述
）及びｐＦａｂ−ＳＰ４００−Ｓ１４６Ａ（その活性を少くとも１００倍、低下
させる、位置１４６にセリンからアラニンへの変異を有することを除いてｐＦａ
ｂ−ＳＰ４００と同一）に連結した。その得られたファージミドｐｈ８（野生型
リパーゼ）及びｐｈ１８（リパーゼＳ１４６Ａ変異体）は、配列番号：２に示す
アミノ酸配列を有する（野生型を示す）。得られた遺伝子融合体は、（Ｎ末端か
ら読んで）ｐｅｌＢシグナル配列（下線、成熟リパーゼをコードする遺伝子（ｗ
ｔ又はＳ１４６Ａ変異体）、６のヒスチジンタグ（ボールド）を有する挿入物（
イタリック）、及びアミノ酸残基１９８からのｐIII 遺伝子（下線）を含む。

【０１６２】ファージ粒子の生産ファージ粒子を、φrum et al.に従って小さな改変を伴って生産した（実施例
２を参照のこと）。要約すると、大腸菌ＸＬＩｂｌｕｅをファージミドｐｈ８（
Ｌｉｐａｓｅｗｅ）もしくはファージミドｐｈ１８（ＬｉｐａｓｅＳ１４６
Ａ変異体は、又はｐｈ１３（陰性対照；リパーゼのかわりにＨｉｓタグ化セルラ
ーゼを有するが、ｐｈ８及びｐｈ１８構成物と同一である）のいずれかで形質転
換した。その形質転換した細胞を３７℃、１００μｇ／mLアンピシリン、５μｇ
／mLテトラサイクリン及び２％グルコースを含む２×ＹＴ培地中で振とうした。
０．５のＯＤ₆₀₀ で、酸ヘルパーファージ（Ｍ１３Ｋ０７誘導体、ｐIII のＮ末
端に３０’マーのペプチド伸長部を有するもの）を、１．５×１０⁸cfu／mLの最
終濃度まで加え、３７℃で２０分、インキュベートした。その細胞をペレット状
にし、２×ＹＴ、５μＭＩＰＴＧ（ｐｈ１３について１００mM ＩＰＴＧ）、
１００μｇ／mLアンピシリン、５０μｇ／mLカナマイシンに角度懸濁し、３０℃
で３時間、振とうした、細胞をペレット化し、上清中のファージ粒子を３回、Ｐ
ＥＧ沈殿させ、４００μＬのＴＥ緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８；１
mM ＥＤＴＡ）に再度懸濁した。

【０１６３】塩基−リンカー−Ｘのファージへの共有結合の前に（以下参照）、リパーゼ変
異体を提示するファージについてのプレ富化ステップを、実施例９のプロトコル
に従って行った。その手順は、一般に、入力ファージの０．０４〜０．２％の回
収を導き；我々は、回収されたファージの９０％超がリパーゼを提示すると見積
もった。

【０１６４】活性なヒスチジンタグ化リパーゼはファージ上に提示される調製されたファージがリパーゼ−ｐIII 融合タンパク質を提示することを確認
するため、マイクロタイタープレートの別個のウェルを、ヒスチジンタグ（Ｐｅ
ｎｔａ−Ｈｉｓ抗体、Ｑｉａｇｅｎ）に対する抗体、リパーゼタンパク質に対す
る抗体、又は陰性対照として、関係のないアミラーゼ酵素に対する抗体でコート
した。非Ｈｉｓタグ化野生型リパーゼ（ｐｈ３）、Ｈｉｓタグ化野生型リパーゼ
（ｐｈ８）又はＨｉｓタグ化リパーゼＳ１４６Ａ変異体（ｐｈ１８）を別個のウ
ェルに加えた。図１６に示す結果は、ｐｈ８及びｐｈ１８の両方が予想される通
りＨｉｓタグを提示することを示し；非Ｈｉｓタグ化野生型リパーゼは抗Ｈｉｓ
抗体に有意に結合しない。変異体及び野生型リパーゼの両方は、予想される通り
、抗リパーゼ抗体に固定される。最後に、関連のない抗体に固定化されたリパー
ゼ変異体はない。それゆえ、ｐｈ８及びｐｈ１８ファージミドは、ファージの表
面上に正確にホールディングされたリパーゼ−ヒスチジンタグ−ｐIII 融合体を
コードすると結論づけられる。Ｈｉｓ−タグ化ファージ（ｐｈ８及びｐｈ１８）
を、実施例９に記載のＮｉ−ＮＴＡカラム精製ステップを介して採取した。富化
ステップは、Ｈｉｓタグ化タンパク質を提示するファージからほぼ全体がなるフ
ァージ集団を作り出すと予想される。その手順は、２つの連続的なＮｉ−ＮＴＡ
カラム精製：最初に再現可能に回収されるインプットの０．２〜０．３％、２番
目に回収されるンプットの１０〜２０％に関する。これらの数字は、得られたフ
ァージ集団が提示されたタンパク質に関して劇的に富化されること、及び最終的
なファージ集団はタンパク質をほぼ全てが提示するファージからなることを示す
として解釈される。最後に、ブリリアントグリーンプレートアッセイにおいて、
野生型リパーゼ−Ｈｉｓ−ｐIII 融合体を含む細胞はリパーゼ活性を示すが、リ
パーゼＳ１４６Ａ−ｐIII 融合体を含む細胞はリパーゼ活性を示さない。それゆ
え、ｐｈ８は活性を正確にホールディングした野生型リパーゼを提示し、ｐｈ１
８ファージは少いリパーゼ活性の正確にホールディングされたリパーゼＳ１４６
Ａ変異体を提示することが試験的に結論づけられる。

【０１６５】塩基−リンカー−ＤＮＡコンジュゲート（“塩基−リンカー−Ｘ”）の合成 Pedersen 5, PNAS (1998), 95, 10523-10528に記載されるプロトコルに従って
、塩基−リンカーペプチドC(GGS)₄AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKK-LAQGGC をＤＮ
Ａオリゴ“Ｘ−２６mer”（HS-5'-ATTAAATTAGCGCAATGAAGGGCAAC-3'）の５’−チ
オールにコンジュゲートし、光脱保護化した。下線の配列がＸ成分を構成する。
得られたコンジュゲートは“塩基−Ｘ−２６mer ”と呼ぶ。

【０１６６】Ｙ−基質−ビオチンコンジュゲートの合成一端にマレイミド成分、他端にビオチン、及びまん中にリパーゼのための基質
として機能するエステルを含むヘテロ官能性分子（３９）（図１７を参照）を調
製した。ω−アミノドデカン酸を、ビオチン−ＮＨＳと結合したメチルエステル
（４０）として最初に保護し、次に加水分解してビオチン−酸（４１）を供した
。収束的に、マレイミドアルコール（４２）を、マレイミド−ＮＨＳを６−ヒド
ロキシエチルアミンと反応させることにより調製した。（４１）と（４２）との
間のエステル化により標的基質を供した。最後に、化合物（３９）をＹ１ＤＮ
Ａオリゴ（5'-SH-AATAAATAAACGGGTTG-CCCTTCATT-3'）又はＹ２ＤＮＡオリゴ（
5'-TTCATTGCGCTTCGGCAAATAAATAA-SH-3' ）のいずれかにコンジュゲートした。下
線の配列はＹ１及びＹ２交換成分を構成する。

【０１６７】ファージへの塩基−リンカー−ＤＮＡコンジュゲートの共有結合Ｘ−２６mer コンジュゲート（上述）をＮｉ−ＮＴＡ精製ファージ（上述）に
、例えば上述の実施例１のガイドラインに従うことにより共有結合させる。その
カップリング反応からのファージを任意に、高い程度のカップリングを保証する
ために、別の精製ステップを介して採取することができる。これは、ファージの
Ｘ−２６mer に相補的なビオチニル化オリゴ固定化されているストレプトアビジ
ンでコートしたビーズへのアニーリングに関する。Ｘ−２６mer に共有結合して
いないファージを除去するために数回、洗浄した後、ＤＮＡ二本鎖を融解するた
めに温度を上げて、その結合したファージを放出させる。

【０１６８】より活性なリパーゼの単離Ｙ１−基質−ビオチン及びＹ２−基質−ビオチンコンジュゲートを、ストレプ
トアビジン誘導化マトリックス（例えば４％アガロースに固定したストレプトア
ビジン、Ｓｉｇｍａ）と、１〜１０μＭの濃度で混合しそして室温で１〜２時間
、インキュベートする。そのカラムを洗浄し、Ｘ―２６mer コンジュゲートが結
合しているファージ（上述）を、リパーゼ活性及び２０〜３５℃で効率的なアニ
ーリング（ＭｇＣｌ₂ 及びＣａＣｌ₂ ）を許容する緩衝液に加える。あるいは、
そのカップリングステップを、カラムで直接、行う。ファージに結合したＸ−２
６mer ＤＮＡは、Ｙ１−又はＹ２−基質−ビオチン分子とアニーリングし、基質
を介してマトリックス上に固定されるであろう。触媒として活性なリパーゼを提
示するファージは基質を開裂してカラムを介してのマイグレーションを続けるで
あろう；別のＹ１−又はＹ２−基質との相互作用に基づいて、ファージを再び固
定化するであろう交換反応がおこり得る。より少い触媒リパーゼは、所定の基質
に結合したより長い時間を費すであろう。それゆえ、触媒的により活性なファー
ジは、より少い活性のファージより迅速にマイグレートし、それゆえカラムの底
で最初に収集することができる。

【０１６９】実施例１１：Ｘユニットとしてのセルラーゼのセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、並びに基質及びＹ−ユニットの両方としてのＡｖｉｃｅｌ（セルロース）マトリックスを用いる、より小さな活性の変異体セルラーゼのバックグラウンドにおける、繊維状ファージ上に提示される野生型セルラーゼＣ６Ｂの富化ファージミド作製ファージミドｐｈ７（クローニングベクター）：ＤＮＡオリゴ“Ｎｏｔ−Ｈｉｓ６−センス”（上述）及び“Ｎｏｔ−Ｈｉｓ６
−アンチセンス”（上述）をアニーリングし、その二本鎖産物を、ＮｏｔＩで消
化したｐＦａｂ５ｃ，Ｈｉｓ（φrum et al., 1993, Nucleic Acids Research,
vol. 21, pp. 4491-4498）に連結し、ファージミドｐｈ７を形成した。基本的に
、これは、アミノ酸配列：APGGSHHHHHHSをｐIII コートタンパク質のＮ末端に付
加する（Ｈｉｓタグを下線で示す）。

【０１７０】ファージミドｐｈ１３（セルラーゼｗｔ）：ＰＣＲ反応をプライマー NcoI-Cellulase-fwd : 5'-CGACATGCCATGGCGCAGTCCGGCAATCCGTTCTC. NotI-Cellulase-bck : 5'-CCTTTAGAGCCTGCGGCCGCGCCTCCTGGGAGGCACTGGCTGTACC
AC. を用いて、Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓの野生型セルラーゼＣ６Ｂをコ
ードする合成ＤＮＡ構成物で行った。

【０１７１】その産物をＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで消化した
ｐｈ７（上述）に挿入してｐｈ１３を供した。ファージミドｐｈ１４（セルラーゼＤ３１６Ａ）：変異Ｄ３１６Ａを有するＤＮＡ分子をテンプレートとして用いた他は、ｐｈ１
３についてと同様に作製した。

【０１７２】ファージミド１６（セルラーゼＤ１３９Ａ，Ｄ３１６Ａ）：２つのＰＣＲ反応を最初に行った。１つにおいて、変異Ｄ３１６Ａ（上述）を
含むテンプレートを、プライマー： D139A-fwd: 5'-GCTGTGATTCTGGAACCCGCGGCCATC-GGCAACATGGTGAC. NotI-Cellulase-bck: 5'-CCTTTAGAGCCTGCGGCCGCGCCTCCTGGGAGGCACTGGCTGTACCA
C. と共に用いた。

【０１７３】別のＰＣＲにおいて、同じテンプレートであるが、プライマー： D139A-bck: 5'-GTCACCATGTTGCCGAT-GGCCGCGGGTTCCAGAATCACAGC. を用いた。その２つのＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、プライマー“Ｎｏ
ｔＩ−Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ−ｆｗｄ”（上述）及び“ＮｏｔＩ−Ｃｅｌｌｕｌａ
ｓｅ−ｂｃｋ”（上述）を用いてＰＣＲ反応のためのテンプレートとして用いた
。得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ
で消化したｐｈ７（上述）に挿入した。得られた遺伝子融合体は、配列番号：３
に示す配列を有する（示される野生型；ｐｅｌＢの最初のコドンで始まり、ｐII
I の終止コドンで終わる）。これは、次のタンパク質融合体に相当する（Ｎ末端
から読む）：ＰｅｌＢペプチド、セルラーゼＣ６Ｂ、ヒスチジンリンカー、ｐII
I コートタンパク質。

【０１７４】ファージミドｐｈ１７（セルラーゼ結合ドメイン、ＣＢＤ）：ＰＣＲ反応を、Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓからの野生型セルラーゼ
Ｃ６Ｂをコードする合成ＤＮＡ（上述）及びプライマー“NcoI-CBD-fwd”（5'-C
GACATGCCATGGCGGCGAGAG-GCGCTGCCGGTTC-3'）及び“NotI-Cellulase-bck”（上述
）を用いて行った。その産物をＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、ＮｃｏＩ及びＮ
ｏｔＩで消化したｐｈ７（上述）に挿入してｐｈ１７を供した。得られたタンパ
ク質融合体は配列番号：４に示す配列を有する。これは、次のタンパク質融合体
に相当する：（Ｎ末端から読んで）：ｐｅｌＢリーダーペプチド、ＣＢＤドメイ
ン、ヒスチジンタグ、ｐIII コートタンパク質。

【０１７５】ファージ粒子の調製１００μＭのＩＰＴＧをヘルパー・ファージでの重感染の後に加えたことを除
いて実施例１０に記載される通り調製した。活性なヒスチジンタグ化セルラーゼはファージ上に提示される調製されたファージがセルラーゼ−ｐIII 又はＣＢＤ−ｐIII 融合タンパク質
を提示することを確認するために、マイクロタイタープレートの別個のウェルを
ヒスチジンタグに対する抗体、セルラーゼＣ６Ｂタンパク質に対する抗体、又は
陰性対照として関連のないリパーゼ酵素に対する抗体（ＳＰ４００、実施例２を
参照）でコートした。セルラーゼｗｔ（ｐｈ１３）、セルラーゼＤ３１６Ａ（ｐ
ｈ１４）、セルラーゼＤ３１６Ａ、Ｄ１３９Ａ（ｐｈ１６）、ＣＢＤ（ｐｈ１７
）又は関連のないリパーゼ酵素（ｐｈ３）を提示する約１０⁸ のファージを各々
のウェルに加えた。図１８に示す結果は、ｐｈ１３，ｐｈ１４，ｐｈ１６、及び
ｐｈ１７の全てがＨｉｓタグを提示することを示す。全長セルラーゼ（ｐｈ１３
，ｐｈ１４，ｐｈ１６）は抗セルラーゼ抗体に結合し、ＣＢＤドメインはこの抗
体に結合しない。予想される通り、陰性対照（ｐｈ３）は抗Ｈｉｓ又は抗セルラ
ーゼ抗体に結合しない。また、予想される通り、セルラーゼ及びＣＢＤ提示ファ
ージは抗リパーゼ抗体に結合せず；リパーゼ提示ファージ（ｐｈ３）は予想通り
結合した。それゆえ、ｐｈ１３，ｐｈ１４及びｐｈ１６ファージミドはセルラー
ゼヒスチジンタグ−ｐIII 融合体をコードすること、並びにこれらはファージの
表面上に正確にホールディングされる可能性が高いことが結論づけられる。Ｈｉ
ｓタグ化ファージ（ｐｈ１３，ｐｈ１４，ｐｈ１６、及びｐｈ１７）を、実施例
９に記載されるＮｉ−ＮＴＡカラム精製ステップを介して採取した。富化ステッ
プは、Ｈｉｓタグ化タンパク質を提示するファージからほぼ全体がなるファージ
集団を生産すると予想される。その手順は、２つの連続的なＮｉ−ＮＴＡカラム
精製に関する；第１の再現可能に回収される０．１％未満のインプット、第２の
回収される約２０％のインプット。これらの数は得られたファージ集団が、提示
されたタンパク質に関して劇的に富化されていること、及び最終的なファージ集
団がタンパク質をほぼ全てが提示するファージからなることを示すとして解釈さ
れる。最後に、液体ＣＭＣ−コンゴーレッドセルラーゼ活性アッセイにおいて、
野生型セルラーゼを発現するファージミドを有するＸＬＩｂｌｕｅの細胞抽出
物はセルラーゼ活性を示すが、変異体Ｄ３１６Ａセルラーゼを発現する細胞はそ
うでないことが確認された（データは示さない）。それゆえ、ｐｈ１３−ファー
ジは活性な正確にホーハディングされた野生型セルラーゼを提示し；ｐｈ１４及
びｐｈ１６ファージは、セルラーゼ活性が減少した正確にホールディングされた
セルラーゼ変異体を提示することが提案される。

【０１７６】ファージが提示するセルラーゼに関する基質リローディングの原性ＨｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓからのセルラーゼＣ６Ｂは２つのドメイ
ン：触媒活性を有するコア、及び約２５アミノ酸のリンカーを介してコアに接続
されたセルラーゼ結合ドメイン、ＣＢＤからなる。それゆえ、我々は、セルロー
スのためのＣＢＤのアフィニティーが好適に弱い場合にセルロース上の異なる部
位についてのＣＢＤの合理的な交換を達成することができる条件が存在し得、そ
してこの交換に基づくカラムベースの選択をセット・アップすることが可能であ
り得ると推論した。このような条件下で、ＣＢＤはセルロース上の部位に結合し
、それによりこの結合部位の近傍でコア酵素を保持するであろう；（図１９）。
活性な酵素は、ＣＢＤドメインが結合したセルロースストリングを開裂し得、従
って、それ自体を遊離させるが、より活性の少い酵素は、ＣＢＤがその結合部位
から会合するまで、セルロース上に固定されるであろう。１つの極端な例で、Ｃ
ＢＤのセルラーゼへの結合が極めて強力であるなら、そのセルラーゼは開裂によ
りカラムからそれ自体を遊離させ、ＣＢＤ−セルロースストリング複合体として
カラムから溶出する。この場合、基質の１回だけのターンオーバーが要求され、
従ってより優れたセルラーゼのために小さな選択圧であろう。他の極端な例で、
ＣＢＤ−セルロース相互作用は弱すぎて、その酵素のターンオーバー率でなくＣ
ＢＤ−セルロース複合体の半減期がカラムに固定された消費時間を決定するであ
ろう。この場合、それゆえ、より活性な酵素のための選択圧はほとんどないであ
ろう。

【０１７７】セルラーゼＣ６ＢのＣＢＤは、中性pHで酸処理したＡｖｉｃｅｌ^TM（微結晶性
セルロース、Ｍｅｒｃｋ）について高いアフィニティーで高pHで低いアフィニテ
ィーを有する。セルラーゼは、１１．６を超えるpHでＡｖｉｃｅｌ^TMから溶出さ
れ得る。それゆえ、我々は、セルラーゼが活性であろう条件、及び異なる比活性
のセルラーゼ間を区別するであろう多重ターンオーバーシステムを得るために適
切に低いＣＢＤ結合を定義するよう設定する。

【０１７８】提示されたセルラーゼのＣＢＤドメインはＡｖｉｃｅｌ^TMカラム材料に結合する我々は、ＸＹ−交換ユニットのための単純なモデルとしてＣＢＤ−セルラーゼ
相互作用を用いようとした。それゆえ、ＣＢＤドメインがリン酸で膨潤したＡｖ
ｉｃｅｌ^TMに可逆的に結合する能力を検査した。約１mgの酸で膨潤したＡｖｉｃ
ｅｌ^TMをＳｅｐｈａｃｒｙｌと混合して約２mLのカラムベッド容量を得た。Ｎｉ
−ＮＴＡ精製したｐｈ１７−ファージ（上述）をリン酸ナトリウム緩衝液pH７．
５中のゲルに充填し、pHを増加させて数カラム容量で洗った（以下と同じ条件）
。関連のないリパーゼ酵素を提示するコントロールファージを第１の画分から回
収し、ｐｈ１７−ファージは、リン酸ナトリウム緩衝液pH１１．６の数カラム容
量後まで、溶出されなかった（データは示さない）。それゆえ、ファージ上に提
示されたＣＢＤドメインは中性pHで酸で膨潤したＡｖｉｃｅｌに結合し；pH１１
．６でそのアフィニティーは減少し、ＣＢＤが溶出される。

【０１７９】活性なセルラーゼはより活性の少いセルラーゼ上で富化される次に、我々は、上述の通り調製した、ｗｔセルラーゼ（ｐｈ１３）又はＤ１３
９Ａ，Ｄ３１６Ａ変異体セルラーゼ（ｐｈ１６）を、Ａｖｉｃｅｌ^TM／Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ^TMカラムに充填した。この実験において、温度は５０℃であった。ま
た、そのローディング緩衝液は２０mMリン酸ナトリウム緩衝液pH７．５、０．０
５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎであった。１容量の２０mMリン酸ナトリウム
緩衝液pH７．５、０．０５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、５００mM ＮａＣ
ｌ及び１容量の２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．５、０．０５％ＢＳＡ、０．
０５％Ｔｗｅｅｎ、２００mM ＮａＣｌで洗った後、pHを次の６カラム容量のた
めにpH１０．６に増加させた。最後に、そのpHを１１．６に増加させた。

【０１８０】画分を収集し、各々の画分中のファージタイターを決定した。また、ｐｈ１３
：ｐｈ１６の比をＰＣＲ反応、次にＰｓｔＩ消化及びアガロースゲル分析により
決定した。Ｄ３１６Ａ変異をＰｓｔＩ部位に導入し、それゆえＰｓｔＩ消化は２
つのより小さなフラグメントを生ずる。それゆえ、アガロースゲル上の上側及び
真ん中のバンドの強度比は所定の画分中の変異体セルラーゼファージ（ｐｈ１６
）に対する野生型セルラーゼ（ｐｈ１３）の相対数と相関する。インプット中の
ｐｈ１３：ｐｈ１６の比は約０．７であった。（pH７．５に対応する）画分１〜
２及び（pH１０．６／１１．６に対応する）画分４〜１１において、ｐＨ１６フ
ァージは、ゲルから評価して、１〜１０倍、過剰であった。画分３において、ｐ
Ｈ１３：ｐＨ１６の比は約１．５であった。それゆえ、より少い活性の（二重変
異体、ｐｈ１６）セルラーゼのバックグラウンド中のより活性な（野生型、ｐｈ
１３）セルラーゼの約２倍の富化が達成された。アウトプットファージの５２％
が画分２〜４中に回収され、１７％が画分１及び７〜１１中で、そしてファージ
の３１％が、pH１１．６での３０カラム容量の洗浄の後、カラムに固定されたま
まであった。

【０１８１】同様の実験において、我々は、pH１４単一変異体のバックグラウンドにおいて
野生型セルラーゼを富化することができなかった。我々は、２フェーズの選択を
再現可能に観察した（即ち、第１の画分においてｐｈ１６１は過剰に回収され、
次にｐｈ１３が１又は２画分にわたり過剰に回収され、そして次にｐｈ１６残り
の画分において過剰に回収される）。これら２つのフェーズが存在するという事
実は、セルラーゼを提示するファージがカラムを介してマイグレートする時に少
くとも２つの出来事：ＣＢＤドメインのセルロースへの結合及びセルロースの開
裂がおこるという提案を強調する。

【０１８２】その実験において、ＣＢＤ−Ａｖｉｃｅｌ相互作用はＸＹ交換ユニットを表す
。この極めて単純なＸＹユニットは最適以下であろうことが予想される：第１に
、ほとんどの高分子相互作用はゆっくりとした速度論により記述され、それは、
この例におけるゆっくりとした基質リローディングを導くであろう。第２にオン
及びオフレートに関するＣＢＤ及びセルロースの結合は、pHの好適な選択を介し
て最適に見い出された。そのpHはセルラーゼの触媒活性にも作用するので、これ
は理想的ではない。おそらく、結合は、セルラーゼ活性を有意に妨害しない他の
手段、例えば塩濃度又は高濃度の界面活性剤を含めることにより調整することが
できる。ＣＢＤ−セルロース相互作用のアフィニティー及び／又は速度論がこの
方法で更に最適化できるなら、これは、選択のストリンジェンシーを増加させ、
これにより（野生型及び単一変異体セルラーゼにある上述の実験で示される）少
し異なるだけの活性のレベルでの酵素の分離を許容する。

【０１８３】あるいは、実施例１０のアプローチは、ファージが提示するセルラーゼに適用
することができる：ｉ）ファージ（ｐｈ１３，ｐｈ１４，ｐｈ１６，ｐｈ１７等
）を酸ヘルパーファージでレスキューする、ii）セルラーゼ変異体を提示するフ
ァージをＮｉ−ＮＴＡ精製する、iii）塩基−Ｘ−２６mer コンジュゲートをフ
ァージに結合する、iv）Ｙ−基質コンジュゲートをカラムに固定する（ここで基
質はセルロースをいい、例えばβ−１，４結合により連結した２又は６グルコー
スユニット）、ｖ）基質リローディングプロトコルを行う。これは、基質リロー
ディングの速度を上げ、少し異なるセルラーゼ活性の分離を許容し得る。

【０１８４】我々は、この単純なＣＢＤ−セルロース交換ユニットでさえ、より活性の少い
セルラーゼ（ｐｈ１６）のバックグラウンドにおいてより活性なセルラーゼ（ｐ
ｈ１３）について富化することが可能であると結論づけた。実施例１２：Ｘユニットとしてのポリヒスチジンタグ及びＹユニットとしてのイミノ二酢酸を用いる、過剰なより活性の少いＲＮａｓｅＡペプチド変異体のバックグラウンドにおける、ビーズ上の野生型ＲＮａｓｅＡペプチドの富化合成コンビナトリアルライブラリーの分野において基質リローディング原理を
テストするために、我々は、ＲＮａｓｅＡペプチドに関する簡単な実験をデザイ
ンした。２つのＣ末端がビオチニル化したペプチド：ペプチド１及びペプチド２
を、例えばGutte et al., 1971, Journal of Biological Chemistry, vol. 246,
pp. 1922-1941に概説されるように合成する。ペプチド１は、Ｎ末端に６のヒス
チジンが加えられていることを除いて野生型ＲＮａｓｅＡ配列を有する。ペプチ
ド２は、（例えば２つの活性部位ヒスチジン、Ｈ１２及びＨ１１９の一方又は両
方をアラニンで置換することにより）全体的に又は部分的にペプチドのリボヌク
レアーゼ活性を除去した変異が導入されていることを除いてペプチド１と同じ配
列を有する。脱保護化、合成支持体からの開裂、及びGutte et al, 1971, Journ
al of Biological Chemistry. vol. 246, pp.1922-1941に記載されるようなリホ
ールディングの後、ペプチドを、Ｃ末端ビオチン成分を介して、直径約１０〜１
００nmのストレプトアビジンでコートしたビーズに固定した。このようなビーズ
は、ストレプトアビジンを、Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド−活性化ラテックス
ビーズ（ＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．）に固定化することにより調製す
ることができる。一端がマトリックスに固定され、他端がイミノ二酢酸（ＩＤＡ
）又はニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）に結合したＲＮＡ分子を有するカラム（例え
ばＳｅｐｈａｒｏｓｅ又はＳｅｐｈａｄｅｘ）を調製する。これは、一端がチオ
ールで、他端がビオチンで官能化されたＲＮＡオリゴ（例えば２０nt長）の合成
により行うことができる（Oligo, Etc., Inc.）。次に、そのチオールを用いて
、標準的プロトコルにより、ＲＮＡ及びイミノジ酢酸（又はニトリロトリ酢酸）
を特異的に結合させる。

【０１８５】基質リローディング実験を次の通り行う（図２０）。ペプチド１又はペプチド
２のいずれかを有するビーズを、金属イオン（例えばＺｎ⁺⁺又はＮｉ⁺⁺）を含む
ＲＮａｓｅＡ活性（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ pH７又は８）を許容する緩衝液中
で混合し、上述のカラムに充填する。そのカラムを同じ緩衝液で洗い、画分を収
集する。それらのカラムを介してのマイグレーションの間、ペプチドビーズは、
６のＮ末端ヒスチジン、Ｚｎ⁺⁺又はＮｉ⁺⁺、及びＲＮＡ分子に結合したＩＤＡの
相互作用を介してカラムマトリックスに固定化される。これにより、有効にペプ
チドを有するビーズをＲＮａｓｅＡの基質であるＲＮＡに結合させるＨｉｓ６−
金属−ＩＤＡ複合体が形成される。その活性ＲＮａｓｅＡ（ペプチド１）は、結
合したＲＮＡを開裂し、それ自体を遊離させ、これによりそのカラムを介しての
マイグレーションを続行する。しかしながら、ペプチド２はペプチド１よりも触
媒的により活性が少く、より長時間、固定化されてとどまり、従っていくつかの
ターンオーバーの後、ペプチド１ビーズはそれらのＲＮＡ基質に対する触媒活性
の差の結果としてペプチド２ビーズから分離されるであろう。それゆえ、より活
性なＲＮａｓｅＡ変異体を有するビーズは、カラムの底で最初に収集され得る。

【０１８６】非天然アミノ酸を用いて、ＲＮａｓｅＡの触媒機構を検査し、そして潜在的に
、ＲＮａｓｅＡの新しく改良された変異体を、先に概説した基質リローディング
選択を用いて、進化させることができる（Jackson et al., 1994, Science, vol
. 266, pp. 243-247）。あるいは、全体的にランダムなペプチドライブラリーを
新規触媒について調査することができる。回収されたビーズ上のペプチドの配列
は、エドマン分解又は質量分析により決定することができる。

【０１８７】実施例１３：活性の少いＳｎａｓｅ変異体のバックグラウンドにおけるより活性なスタフィロコッカルヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ）変異体の富化。この選択は、より活性なこう酵素を単離するために電気泳動を用いる。Ｈｉｓ６タグを、ＳＮａｓｅ及びファージミドｐII７８−６（Pedersen et al
., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, pp. 10523-10528）内のｐIII
コートタンパク質を接続するリンカーに導入し、又はＨｉｓ６タグを、（Peder
sen et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, pp. 10523-10528に
記載される酸伸長部のＭ１３Ｋ０７へのクローニングについて概説されるクロー
ニング手順の後、）Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージのｇｐIII 遺伝子のＮ末端に
クローン化する。ファージ粒子を、通常のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ及びＨ
ｉｓ６タグ化ＳＮａｓｅファージミドを用いて、又はｐII７８−６ファージミド
及びＨｉｓ６タグ化ヘルパーファージを用いて生産する。両方の方法は、それら
の表面上にＳＮａｓｅ及びＨｉｓ６−タグを提示するファージを生産する。

【０１８８】約２０ヌクレオチドのＤＮＡオリゴを、標準的な手順を用いて、イミノジ酢酸
（ＩＤＡ）又はニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）で５’−端に誘導化する。例えば、
そのオリゴは、５’−チオールで合成することができ、次にそれは、二官能性Ｉ
ＤＡ−マレイミド成分で誘導化される。その誘導化オリゴは、別のプライマー、
及び１００〜１０００塩基対のＰＣＲ産物を作り出すテンプレートと共に、ＰＣ
Ｒのために用いられる。

【０１８９】一端にＩＤＡ又はＮＴＡで誘導化されたＤＮＡフラグメントを、先に生産され
たファージと共にインキュベートし、電気泳動のためのゲル、例えば、好適な緩
衝液中の０．５〜０．７％アガロースゲルに充填した。その緩衝液（Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ，pH５〜８）は、Ｃａ⁺⁺（ＳＮａｓｅ活性のため）及びＺｎ⁺⁺，Ｎｉ⁺⁺，
Ｃｏ⁺⁺、又はＣｕ⁺⁺（Ｈｉｓ６及びＩＤＡ又はＮＴＡ成分への配列のため）、並
びに高濃度の上述のＩＤＡ又はＮＴＡ誘導化ＤＮＡフラグメントを含む。

【０１９０】ファージ上に提示されるＨｉｓ６−タグは複合体Ｈｉｓ６−金属−ＩＤＡ（又
はＨｉｓ６−金属−ＮＴＡ）の形成を介してＤＮＡに結合する。同じファージ上
に提示されるＳＮａｓｅが活性であるなら、それは会合したＤＮＡを開裂する。
同時に、異なるＤＮＡフラグメント間の迅速な交換がファージ上の全長フラグメ
ントのコンスタントなリローディングを引きおこす。それゆえ、より活性なＳＮ
ａｓｅを提示するファージは平均して、より小さなＤＮＡのフラグメントと会合
し、それゆえ不活性なＳＮａｓｅを提示するファージと異なってマイグレートす
るであろう。その実験は、いくつかの異なるＳＮａｓｅ変異体を提示するファー
ジを混合し、そして上述の電気泳動によりより活性な変異体を単離することによ
り行われる。

【０１９１】実施例１４：ＸＹ交換対としてのＤＮＡオリゴ：蛍光偏光分光法により交換速度の測定間接的な基質リローディングプロトコルの基本的な特徴は、基質及び酵素に結
合するＸＹ交換である。理想的には、ＸＹユニットは、酵素への動力学的な、迅
速な、そして効率的な基質リローディングのための手段を供するはずである。

【０１９２】我々は、理想的なＸＹユニットの要求：迅速な変換、なお固有的に安定なＸＹ
複合体を（少くとも部分的に）満たすであろう核酸をデザインしようとした。そ
れゆえ、２セットのオリゴ：Ｓｅｔ＃１及びＳｅｔ＃２をデザインした。その２
セットのＸＹ複合体は、各々約６０及び４０℃の融解温度と予想された。動力学
的交換を供するために、２つのＤＮＡオリゴ：Ｙ１及びＹ２が、異なるがオーバ
ーラップするＸへの標的に結合するようにデザインした（材料及び方法を参照）
。オーバーラップがＸ−Ｙ１及びＸ−Ｙ２複合体の間のより迅速な交換を供する
であろうと予想した。

【０１９３】２セットのオリゴの交換率を、種々の温度で蛍光偏光分光法により分析した。
動力学的範囲（まだＸが複合体化している時にオリゴが比較的迅速に交換する温
度範囲）は、ＸＹ二本鎖の予想される融解温度より少し低かった。複合体に結合
したＹについての遊離Ｙの９０％交換（“ｔ（交換）”）を得るために要求され
る時間は３０〜５００秒の間で種々であった。

【０１９４】オリゴ及び最適化条件（特にＭｇ⁺⁺濃度及び温度）の他のデザインで、１秒当
り１より迅速な、おそらく１秒当り１０〜１００の核酸のための交換率を得るこ
とが可能であるはずである。材料及び方法ＤＮＡオリゴ配列

【０１９５】

【表３】

【０１９６】

【表４】Ｘ及びＹにおいて相補的である配列をボールドで示し、オーバーラップするＹ
１及びＹ２の領域を下線で示す。ＦＡＭは蛍光成分である。蛍光偏光分光法ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬＳ５０分光光度計で測定を行った。励起は４８
５nmであり、５２５nmでの放射を記録した。全ての測定を緩衝液Ａ（特に記さな
い限り、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH９、１００mM ＮａＣｌ、及び１mM Ｍ
ｇＣｌ₂ ）で行った。うすい管材をサンプルキュベットに接続し；それゆえ余分
な材料の添加の間、ふたを開ける必要はなかった。このセット・アップで、３０
秒以内に完了近くまで進行する反応の速度を測定することは可能でない。

【０１９７】結果核酸に基づくＸＹ好感ユニットのデザイン最終的な適用のため、酵素−リンカーＸＹリンカー−基質構造中のＸＹ交換ユ
ニットは、緩衝液中の過剰なＹ−基質分子で迅速な平衡化に達し、これにより、
緩衝液中のＹ−基質とのＹ−産物（又はＹ−基質）の交換を介して酵素に“結合
した”産物（又は基質）の迅速な交換を容易にするはずである。

【０１９８】この迅速な平衡化を達成するために、我々は、Ｘオリゴ上のオーバーラップす
る（しかし同一でない）結合部位と共に、２つのオリゴＹ１及びＹ２をデザイン
した。これにより、Ｙ２は、Ｙ１とアニーリングしないＸの部分を介してＸ：Ｙ
１複合体と一時的に相互作用することができるであろうし、その逆もあるであろ
う。Ｘに完全に相補的な配列にアニーリングする場合、Ｙ１及びＹ２は同数のＡ
Ｔ及びＧＣ塩基対を形成し、それゆえＸについて同一に近いアフィニティーを有
し、おそらく同様のオン及びオフ比を有すると予想される。それゆえ、Ｙ１はＹ
２がＹ１を置換するのと同様の速さでＸ：Ｙ２複合体からＹ２を置換するはずで
ある。

【０１９９】我々は、異なる長さのアニーリング部位並びに異なる相対的長さのアニーリン
グ及びオーバーラップ領域で２セットのオリゴをデザインした。オーバーラップ
する領域の配列（5'-TTCATT-3'）を、三重鎖形成を避けるために選択し；更に、
実験（及び実施例１０）において極めて低濃度のＸ及びＹを用いる。それゆえ、
三重鎖形成は極めて可能性が少い。

【０２００】Ｘ−Ｙ１複合体のＹ１とのＹ２の交換蛍光偏光を用いて２セットのオリゴの各々の交換率を分析した。溶液中の蛍光
標識した分子の蛍光偏光は、分子の回転緩和時間に比例する。粘度及び温度を一
定に維持するなら、蛍光偏光値は分子容量に直接、比例する。分子容量の変化は
、この研究に用いる通り、２つの分子の結合又は触媒から生じ得る。

【０２０１】最初に、オリゴＳｅｔ＃１を分析した。５nMの濃度及び４６℃の温度のフルオ
レセイン標識化Ｙ１オリゴ（Ｙ１−Ｆ１＃１、材料及び方法を参照）は、０．０
２８の蛍光偏光値を供する（図２１、上のパネルを参照）。時間ｔ＝６６０sec
でのオリゴＸ＃１の２００倍過剰量（１μＭ）の添加により、偏光は迅速に約０
．０３７の安定状態に増加し、このことは、Ｘ：Ｙ１−Ｆ１＃１複合体の形成を
示唆する。ｔ＝２４００で、Ｙ２＃１を２０倍過剰量でＸ（２０μＭ）に加えた
時、偏光は迅速に低下し、このことは、Ｘ：Ｙ１−Ｆ１＃１複合体からのＹ１−
Ｆ１＃１の放出を示す。よりもっともらしくは、Ｘ：Ｙ２＃１複合体が形成され
、Ｘ＃１からＹ１−Ｆ１＃１を置換することである。

【０２０２】Ｘ＃１からのＹ１−Ｆ１＃１の、Ｙ２＃１による置換は、比較的迅速な過程で
ある：３０分以内に、９０％の平衡化が観察される。Ｘ＃１：Ｙ１−Ｆ１＃１複
合体の形成は、よりゆっくりとした過程である（９０％の平衡化が観察されるの
に約６００秒）。しかしながら、これは、過剰なオリゴの濃度が２０倍低いとい
う事実によって説明される。

【０２０３】次に、５０℃で同じ結合反応を分析した。Ｘ：Ｙ１複合体の形成のためにより
少い時間（３００秒）が要求され；他方、交換は少しゆっくりと９０％完了に達
する（４０秒、表１を参照）。我々は、オーバーラップする標的が交換速度を上げることができるという考え
にチャレンジしようとした。それゆえ、Ｘ＃１：Ｙ−Ｆ１＃１複合体を、同一条
件（４６℃）であるが、（Ｙ２＃１のかわりに）オリゴＹ１＃１を２０倍過剰に
Ｘ＃１に加えた条件下で形成した。図２１、下のパネル及び表１から見ることが
できるように、Ｙ１−Ｆ１＃１の非標識化Ｙ１＃１による置換はゆっくりである
。９０％平衡化を得るために約５００秒が要求される。我々は、この場合のＹ１
及びＹ２のＸへのオーバーラッピング標的の原理が約１７の倍率で交換を加速さ
せると結論づけた。

【０２０４】オリゴＳｅｔ＃２を同じ方法で分析した。（表１を参照）。２４℃及び１mM
ＭｇＣｌ₂ の標準条件で、交換反応は２００秒以内に９０％完了に達する。その
温度を３０℃に増加させると、交換が４倍、スピード・アップし；同様に、Ｍｇ ⁺⁺ 濃度を１０mMに増加させると、交換を４倍、増加させる。そのセット・アップ
は約３０秒の応答時間を有する。それゆえ、我々は、１０mM ＭｇＣｌ₂ 及び３
０℃で交換率を測定しようとはしなかった。

【０２０５】最後に、オーバーラップする標的の原理を再びチャレンジした。最適以下の条
件（２４℃、１mM ＭｇＣｌ₂ ）下で、Ｘ１＝と複合体形成したＹ１−Ｆ１につ
いてのＹ１の交換は、５００秒以内に９０％完了に達し；これは、Ｙ１について
のＹ２の交換についてより２．５倍、ゆっくりである。それゆえ、これらの条件
下で交換率を２．５倍だけスピード・アップする場合でさえ、１つの“Ｙ−ユニ
ット”より２つを含めることが有利である。

【０２０６】図２１の下のパネルにおいて、蛍光偏光シグナルはベースライン（遊離と１−
Ｆ１についてのシグナルレベル）に下がらない。この観察は、Ｙ１のかわりのＹ
１の交換及びＹ１のかわりのＹ２の交換について、Ｓｅｔ＃１及びＳｅｔ＃２オ
リゴの両方について、並びに異なるＭｇＣｌ₂ 濃度で数回、行った。我々は、こ
の現象について説明できないが；それは測定される交換率に影響を与えるようで
はない。Ｘの欠如下での大きく過剰なＹ２の遊離Ｙ１−Ｆ１への付加は、蛍光偏
光シグナルに作用しない。

【０２０７】議論両方のオリゴのセットの交換率は、その温度に対する強い依存性を示し；選択
実験を行う温度は、その交換が効率的であるために、最適温度のナノ−約５℃の
比較的せまい窓内に維持するべきである。ＭｇＣｌ₂ 濃度は、交換率に強力に作
用した。同様の効果が、いわゆる“ＤＮＡアームドハンマーヘッドリボザイム”
について、Shimayama et al. (1995), FEBS Letters 368, 304-306により観察さ
れている。彼らは、ハイブリダイズするアームがデオキシリボヌクレオチドで置
換されているハンマーヘッドリボザイムの触媒活性が、（活性のためにＭｇ⁺⁺を
要求する）活性部位がＭｇ⁺⁺で飽和されていると思われる場合に、高いマグネシ
ウム濃度でさえ、Ｍｇ⁺⁺濃度に強く依存することを見い出した。それゆえ、それ
らの結果は、高いＭｇ⁺⁺濃度はＲＮＡ標的上の核酸アームの交換をスピード・ア
ップすると解釈することができる。

【０２０８】核酸に基づくＸＹ交換ユニットのデザインは、迅速かつ効率的な交換ユニット
を作り出すための極めて一般的な方法であるはずである。アニーリング部位の長
さ及び組成並びに選択を行う条件の適切な選択は、pH、塩、温度、圧力等の異な
る条件下でのＸＹ交換ユニットとしてのＤＮＡオリゴの使用を許容するはずであ
る。現在の研究において、Ｍｇ⁺⁺濃度又は温度のいずれかの最適化が交換率を装
置の限界（何１０秒のオーダー）までにすることができることを示した。他の条
件の最適化と潜在的に組み合わせた。これらの条件の組み合わせは、交換率を１
秒当り約１に下げるはずである。最後に、Ｙ１及びＹ２オリゴのアニーリング部
位及びオーバーラップ領域の相対的な長さ及び組成のチューニングは、更なる改
良をもたらすはずである。

【０２０９】Ｘオリゴへのオーバーラップ結合部位でのＹ１及びＹ２オリゴのデザインは交
換率を加速させた。おそらく、オーバーラップする標的は、１つのオリゴの他の
ものでの活性な置換を媒介する。この概念に、並びにアンチセンスＲＮＡの構造
的及び機械作用的特徴に基づくＸＹ交換ユニットのより精巧なデザインは、シス
テムの動力学を更に改善するはずである。

【０２１０】

【表５】第１のオリゴ（Ｙ１−Ｆ１）を５nMまで加え；第２のオリゴ（Ｘ）を１μＭま
で加え；第３のオリゴ（Ｙ２又はＹ１）を２０μＭまで加えた。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】次の一般構造：Ｃ−ＸＹ−Ｓ（式中、Ｃは触媒分子であり、ＸＹはＸＹ交換対であり、そしてＳは基質であ
る）を有する第１の型の個々のユニットの好適な例の図。基質Ｓは、前記個々の
ユニット内の触媒及び基質の間の触媒反応を許容するコンフィグレーションで触
媒に結合する。その触媒反応は、第２の型の個々のユニット：Ｃ−ＸＹ−Ｐ（式中、Ｃは触媒分子であり、ＸＹはＸＹ交換対であり、そしてＰは産物分子で
ある）を生ずる。基質と触媒との結合の性質は、基質分子から産物分子への反応を触媒すること
ができる触媒分子の明白な同定を許容する情報を含む存在物（例えば触媒自体又
はそれを提示するファージ）を単離する可能性を、産物の特徴（例えばマトリッ
クスへの結合アフィニティー）を用いて、供する。

【図２】ＸＹ交換対がＹ成分の別のＹ成分との非対称（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）交換（
即ちＹはＸではなくＹと交換する）を許容する個々の第１の型のユニットの図。
標的反応がおこった（図１）後、ＸＹ交換対は第２の型のユニット構造：Ｃ−ＸＹ−Ｐ及び未結合のＹ−Ｓ成分の間の交換反応を許容し、それにより新しい第１の型のユニット構造：Ｃ−ＸＹ−Ｓ及び未結合のＹ−Ｐ成分を形成し、その後、このユニットの触媒は、新しい結合した基質で更に別の触媒
反応を行うことができる。産物Ｐに結合するマトリックスは、上述のような交換反応がおこるまでＹ−Ｐ
成分を有効に結合したままにし、Ｃ−ＸＹ−Ｐ型の個々のユニットを有効に保持
し、新しく形成された第１の型のユニットＣ−ＸＹ−Ｓの形態でマトリックスか
ら触媒を有効に放出し、Ｙ−Ｐ成分をマトリックスに結合したままにするであろ
う。

【図３】本発明による個々のユニットの好適なＸＹ交換対の図。その触媒反応は、Ｘ及
びＹの解離を容易にする（例えば、ＸはＤＮＡ鎖、Ｙは相補的ＤＮＡ／ＲＮＡ／
ＤＮＡハイブリッド又はＤＮＡ／ＲＮＡ／マトリックスハイブリッド、ＹはＲＮ
ａｓｅ）他の例は、ＸとＹとの間の非共有結合（Ｈｉｓ₄ −Ｆｅ−ＩＤＡ及びＮＴＡ−
Ｆｅ−ＩＤＡ）、及びＸとＹとの間の共有結合（ジスルフィド）である。ジスル
フィドのような対称（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）交換ユニット（ＸＸ）は交換ユニッ
トとして用いることができることに注意のこと。

【図４】ＸＹ交換ユニットが別の酵素−基質対である、個々のユニットの図。

【図５】実施例２に記載されるＹ−基質分子の図。

【図６】実施例４に記載の選択スキームの図。アルドール形成を触媒する酵素の最適化
。

【図７】本発明の第２の態様に従う試験管内選択のための方法による好適な選択スキー
ムの図。

【図８】本発明の第２の態様に従う試験管内選択のための方法による好適な選択スキー
ムの図。

【図９】本明細書の研究例１の記載を支持する図。塩基−リンカー−基質コンジュゲー
トの構造及び合成。

【図１０】本明細書の研究例１の記載を支持する図。基質のファージ上のｐIII タンパク
質への共有結合。（ａ）酸ペプチド配列及びＣ末端システインをコードするＤＮ
Ａを遺伝子ｇIII のＮ末端に融合して酸ヘルパーファージを形成した。ファージ
ミドはｐIII タンパク質と融合してタンパク質ライブラリーをコードする；（ｂ
）ファージ生産はファージミドコード化タンパク質を提示するファージ粒子を導
く；ｐIII タンパク質は酸ペプチド伸長部を有する；（ｃ）酸及び塩基ペプチド
のコイル−コイル形成は基質をファージｐIII タンパク質に共有結合させる；（
ｄ）還元剤の除去はそれらのＣ末端システインを介しての酸及び塩基粒子の架橋
を導く；（ｅ）本研究において、スタフィロコッカルヌクレアーゼを提示するフ
ァージは、５’−ビオチニル化一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを介してスト
レプトアビジンビーズに結合する。活性な酵素を提示するファージは、分子内反
応におけるオリゴデオキシヌクレオチドの開裂により放出される。

【図１１】本明細書の研究例１の記載を支持する図。固定化及び固体支持体からのファー
ジの開裂。塩基−リンカーなし、塩基−リンカー−ｐＴｐ又は塩基−リンカー−
オリゴデオキシヌクレオチドコンジュゲートのいずれかが、（ａ）ＳＮａｓｅを
提示するファージ又は（ｂ）対照タンパク質Ｆａｂ３９−Ａ１１に架橋した。コ
ラム１〜４はストレプトアビジンビーズ上への固定化を示す。固定化は、直接（
コラム１〜３）、又はビーズのＤＮａｓｅＩ処理の後（コラム４）に、ビーズの
ファージタイタリングにより検査し；コラム５〜７は漏出（Ｃａ²⁺の欠如下で遊
離）を示し；コラム８〜１０は、Ｃａ²⁺誘導化遊離（開裂）を示す。回収率（％
）をコラム上の括弧内に示す。

【図１２】本明細書の研究例５の記載を支持する図。

【図１３】本明細書の研究例６の記載を支持する図。

【図１４】本明細書の研究例７の記載を支持する図。より活性なプロテアーゼを生産する
細胞の富化。

【図１５】本明細書の研究例８の記載を支持する図。ハンマーヘッドリボザイムの単離。

【図１６】本明細書の研究例１０を支持するデータ。より小さな活性の変異体における野
生型リパーゼの富化。

【図１７】本明細書の研究例１０の記載を支持する図。Ｙ−基質−ビオチンコンジュゲー
トの合成。

【図１８】本明細書の研究例１１の記載を支持する図。より小さな活性のセルラーゼ変異
体のバックグラウンドにおける野生型セルラーゼＣ６Ｂの富化。

【図１９】本明細書の研究例１１の記載を支持する図。ファージが提示するセルラーゼに
関する基質リローディングの原理。

【図２０】本明細書の研究例１２の記載を支持する図。より小さな活性のＲＮａｓｅＡ変
異体のバックグラウンドにおける野生型ＲＮａｓｅＡの富化。

【図２１】本明細書の研究例１４の記載を支持するデータ。蛍光偏光顕微鏡による交換率
の測定。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ケムス，ヨルゲンデンマーク国，デーコー−8240 リスコウ，ソルバッケン 15 (72)発明者ルン，メッテカトリネデンマーク国，デーコー−8210 オークスベー，イェンスバゲセンスバイ 44 １テーベーＦターム(参考） 2G045 AA28 AA40 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 FB01 GC30 JA11 4B063 QA05 QA20 QQ21 QQ44 QQ52 QR57 QR63 QR79 QR82 QS12 QS31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試験管内選択システムに用いるために適した複数の個々のユ
ニットを含むサンプルであって、該試験管内選択システムの目的が、触媒分子の
ライブラリーから、該ライブラリー内の触媒分子の残りのものと比べて、相対的
により有効な関心の特定の触媒活性を有する関心の触媒分子を選択することであ
り、そして前記試験管内選択システムが、最終的に収集される前に、前記関心の
触媒分子による複数の触媒活性ターンオーバー（即ち基質から産物への触媒活性
ターンオーバー）を許容することを特徴とし、そして前記サンプルが、（ｉ）個々のユニットの形態で供される触媒分子のライブラリーであって、該
個々のユニットが、一般構造：Ｃ−ＸＹ−Ｓ（式中、Ｃは触媒分子であり、ＸＹはＸＹ交換対であり、そしてＳは前記触媒分
子のライブラリー内に含まれる少くとも１の触媒により産物に触媒され得る基質
である）を有する第１の型の個々のユニットを含み、それにより一般構造：Ｃ−ＸＹ−Ｐ（式中、Ｃ及びＸＹは先に定義した意味を有し、そしてＰは前記第１の型の個々
のユニットの基質Ｓの触媒交換から生ずる産物分子である）を含む第２の型の個
々のユニットを得る可能性を与えるライブラリーを含み；そして（ａ）前記基質Ｓは、前記個々のユニット内での前記触媒と前記基質との間の
触媒反応を許容するコンフィグレーションで前記触媒に結合し；（ｂ）前記基質及び触媒の結合の性質は、前記産物の特徴を用いて、反応基質
分子を産物分子に触媒することができる触媒分子の明白な同定を許容する情報を
含む存在物を単離する可能性を与え；（ｃ）前記複数の個々のユニットを含むサンプルは、前記ＸＹ交換対がＹ成分
の別のＹ成分との非対称交換（即ちＹがＸとではなくＹと交換する）を許容し、
それにより前記ＸＹ交換対が、次に、ユニット構造：触媒−ＸＹ交換対−産物と、 “Ｙ−基質”成分と、の間の交換反応を許容し、それによりユニット構造：触媒−ＸＹ交換対−基質を形成することを特徴とするサンプル。
【請求項２】請求項１に記載の（ｉ）の個々のユニットが、生物学的に増
幅可能な個々のユニットである請求項１に記載の複数の個々のユニットを含むサ
ンプル。
【請求項３】請求項１に記載の（ｉ）の個々のユニットが、生物学的に増
幅可能な個々のユニットであり、前記基質及び前記触媒分子の両方が、前記生物
学的に増幅可能な個々のユニットの表面に結合する請求項１に記載の複数の個々
のユニットを含むサンプル。
【請求項４】前記（ｉ）の個々のユニットが、次の構造：触媒分子−フレ
キシブル（ＸＹ交換対）リンカー−基質を含む先の請求項のいずれかに記載の複
数の個々のユニットを含むサンプル。
【請求項５】請求項１に記載の前記（ｉ）の個々のユニットが、次の構造
：触媒分子−担体システム−ＸＹ交換対−基質、又はより好ましくは、構造：触
媒分子−担体システム−フレキシブル（ＸＹ交換対）リンカー−基質を含む先の
請求項のいずれかに記載の複数の個々のユニットを含むサンプル。
【請求項６】請求項３に記載の前記生物学的に増幅可能な個々のユニット
中の請求項５に記載の前記担体システムがファージである請求項３及び５に記載
の複数の個々のユニットを含むサンプル。
【請求項７】前記担体システムがビーズ粒子である請求項５に記載複数の
個々のユニットを含むサンプル。
【請求項８】前記触媒分子のライブラリーが、天然又は非天然ペプチド又
はポリペプチドのライブラリー、好ましくは酵素のライブラリーである請求項１
〜７のいずれかに記載の複数の個々のユニットを含むサンプル。
【請求項９】前記ライブラリーが、複数の異なる酵素活性を個々に有する
ポリペプチドを含むライブラリーである請求項８に記載の複数の個々のユニット
を含むサンプル。
【請求項１０】前記ライブラリーが、１又は複数の前駆体ポリペプチド由
来のポリペプチド変異体を含むライブラリーであり、ここで該前駆体ポリペプチ
ドが、密接に関連した酵素活性を示す請求項８に記載の複数の異なる個々のユニ
ットを含むサンプル。
【請求項１１】前記ライブラリーが、シャッフル化／組換え化／ドープ化
ポリペプチドを含むライブラリーである請求項８〜１０のいずれかに記載の複数
の個々のユニットを含むサンプル。
【請求項１２】前記触媒分子のライブラリーが、天然又は非天然核酸のラ
イブラリーである請求項１〜７のいずれかに記載の複数の異なる個々のユニット
を含むサンプル。
【請求項１３】前記ライブラリーが、複数の異なる触媒活性を有する核酸
を含むライブラリーである請求項１２に記載の複数の異なる個々のユニットを含
むサンプル。
【請求項１４】前記ライブラリーが、１又は複数の前駆体核酸由来の核酸
変異体を含むライブラリーであり、ここで該前駆体は核酸が、密接に関連した触
媒活性を示す請求項１２に記載の複数の異なる個々のユニットを含むサンプル。
【請求項１５】前記核酸のライブラリーが、シャッフル化／組換え化／ド
ープ化核酸を含むライブラリーである請求項１２〜１４のいずれかに記載の複数
の異なる個々のユニットを含むサンプル。
【請求項１６】前記触媒分子のライブラリーが、天然のポリマー分子、非
天然のポリマー分子、小有機分子、もしくは小無機分子、又はこれら分子の混合
物を含むライブラリーである請求項１〜７のいずれかに記載の複数の個々のユニ
ットを含むサンプル。
【請求項１７】前記ライブラリーがコンビナトリアル化学により作られる
請求項１６に記載の複数の個々のユニットを含むサンプル。
【請求項１８】前記触媒分子及び産物に触媒され得る基質（請求項１に記
載の（ｉ）が異なる化学物質のものである先の請求項のいずれかに記載の複数の
個々のユニットを含むサンプル。
【請求項１９】触媒分子のライブラリーから、該ライブラリー内の触媒分
子の残りのものと比べて、相対的により有効な関心の特定の触媒活性を有する関
心の触媒分子を試験管内で選択するための方法であって、該試験管内選択法が、
最終的に収集される前に、前記関心の触媒分子による複数の触媒活性ターンオー
バー（即ち基質から産物への触媒活性ターンオーバー）を許容することを特徴と
し、そして前記方法が、（ｉ）請求項１〜１８のいずれかに記載の複数の個々のユニットを含むサンプ
ルを、関心の触媒分子が関心の触媒活性を行う好適な条件下に、そして更に前記
個々のユニットがＹ−基質化合物に接触する条件下におき；（ii）前記産物分子を含む１又は複数の個々のユニットについて選択すること
により関心の触媒について選択し、（iii）前記産物の特徴を用いて、前記反応基質を産物に複数回、触媒するこ
とができる関心の触媒分子の明白な同定を許容する情報を含む存在物を単離し；
そして任意に、（iv）ステップ（iii）の前記存在物に含まれる情報を用いて前記関心の触媒
分子を形成して該形成された関心の触媒分子を含む個々のユニットを作製し、そ
して次に該個々のユニットを繰り返しステップにおける出発材料として用いるこ
とにより、ステップ（ｉ）〜（iii）を１又は複数回、繰り返すことを含む方法。
【請求項２０】前記関心の触媒分子が、アフィニティータグに結合した酵
素又はタンパク質であり、請求項１９に記載のステップ（ｉ）の前に任意のステ
ップが行われ、該任意のステップが、前記酵素又はタンパク質を表すユニットを
前記アフィニティータグを用いて単離する精製法を介して（全長）酵素又はタン
パク質を表す個々のユニットについての富化を含む請求項１９に記載の試験管内
選択のための方法。
【請求項２１】前記（全長）酵素又はタンパク質を表す個々のユニットが
、標識された酵素又はタンパク質を表すユニットを前記タグを用いて単離する抗
アフィニティータグ抗体カラムを利用して精製される請求項２０に記載の試験管
内選択のための方法。
【請求項２２】前記アフィニティータグが、関心の酵素又はタンパク質の
Ｃ末端に結合した６のヒスチジン残基を含み、前記（全長）酵素又はタンパク質
を表す個々のユニットが、標識された酵素又はタンパク質を表すユニットを前記
タグを用いて単離する、Ｎｉ−ＮＴＡカラム又は抗ヒスチジン抗体カラムで精製
される請求項２０に記載の試験管内選択のための方法。
【請求項２３】請求項１９に記載のステップ（ii）における関心の触媒分
子についての選択が、前記産物分子への特定の固定化により行われる請求項１９
に記載の試験管内選択のための方法。
【請求項２４】請求項１９に記載のステップ（ii）における関心の触媒分
子についての選択が、次のストラテジー：（ｉ）前記基質分子及び前記触媒分子を含む請求項１９に記載のステップ（ｉ
）における個々のユニットの実質的に各々がマトリックスに結合しており、そし
て前記基質が前記産物に変換される時に前記ユニットが前記マトリックスから遊
離されるシステムを作製し；そして（ii）前記マトリックスから遊離したユニットについて選択することにより行
われる請求項１９に記載の試験管内選択のための方法。
【請求項２５】関心の触媒分子についての選択（請求項１９に記載のステ
ップ（ii））が、次のストラテジー：（ａ）前記産物に特異的に結合するレセプターが産物−カラムのマトリックス
に沿って配置されている産物−カラムを作製し；そして（ｂ）前記産物−カラムの一端に個々のユニットのサンプルを加え、そして前
記カラムの反対の端に最後に到達する個々のユニットを単離することにより関心
の触媒分子について選択することのうちの１つにより行われる請求項１９に記載の試験管内選択のための方
法。
【請求項２６】前記関心の触媒分子の明白な同定を許容する情報を含む存
在物の単離（請求項１９に記載のステップ（iii））が、物理的又は化学的手順
により行われる請求項１９に記載の試験管内選択のための方法。
【請求項２７】前記物理的手順が電気泳動である請求項２６に記載の試験
管内選択のための方法。
【請求項２８】更に次のステップ：（ａ）好適な生産法により関心の好適な量で関心の単離された触媒分子を生産
することを含む請求項１９〜２７のいずれかに記載の試験管内選択のための方法。