WO2005022156A1 - タンパク質の固定化方法 - Google Patents

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WO2005022156A1
WO2005022156A1 PCT/JP2004/012447 JP2004012447W WO2005022156A1 WO 2005022156 A1 WO2005022156 A1 WO 2005022156A1 JP 2004012447 W JP2004012447 W JP 2004012447W WO 2005022156 A1 WO2005022156 A1 WO 2005022156A1
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WO
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protein
tag
immobilized
carrier
immobilizing
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PCT/JP2004/012447
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French (fr)
Inventor
Tsuyoshi Yamada
Yorimasa Suwa
Takeshi Tsutsumi
Original Assignee
Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd.
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Publication date
Application filed by Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd. filed Critical Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd.
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Priority to US10/569,883 priority patent/US7754497B2/en
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction

Definitions

  • the present invention relates to a protein immobilization method that can be widely used, for example, when immobilizing a protein on the surface of a carrier.
  • one of the protein and protein to be subjected to the interaction analysis or one of the protein and compound is immobilized on a sensor chip, and then the other protein or compound is immobilized. Is applied to a sensor chip, and the mass change resulting from the protein-protein interaction or protein-compound interaction is detected as an SPR signal.
  • the interaction analysis using the principle of SPR has a merit that the required amount of protein is small because it is a highly sensitive functional analysis method.
  • the present invention provides a method for immobilizing various proteins of interest on a carrier regardless of the amount of the protein of interest and without non-specifically immobilizing contaminating proteins.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for immobilizing proteins that can be performed.
  • the present inventors have conducted intensive studies and as a result, purified the protein having the first tag portion and the second tag portion using the first tag portion, and immobilized the purified protein on a carrier.
  • the protein is allowed to act after activating the reactive group on the side of the immobilization carrier, thereby allowing the second tag portion of the protein to interact with the immobilization carrier and immobilizing the protein with the protein.
  • the present invention has been found that various proteins of interest can be firmly immobilized irrespective of the amount of the protein of interest and without non-specifically immobilizing contaminating proteins, regardless of the amount of protein of interest. Was completed.
  • the present invention includes the following.
  • the interaction between the second tag portion and the binding site of the second tag portion of the immobilized carrier and the covalent bond between the reactive group and the protein are performed.
  • a protein immobilization method wherein the protein is immobilized on the immobilization carrier.
  • the first step includes a step of separating and extracting the protein using a purification means having a first tag site binding site, wherein the protein is immobilized according to (1).
  • the reactive group is a carboxyl group
  • amine coupling is performed between the carboxyl group and an amino group in the protein to be immobilized. Immobilization method.
  • the histidine tag and the immobilized carrier are caused to interact via Ni 2 + -nitrilotriacetic acid (Ni-NTA).
  • the histidine tag and the immobilized carrier are allowed to interact with each other via N-iminodiacetic acid (Ni-IDA) (7).
  • Ni-IDA N-iminodiacetic acid
  • the second fragment is a histidine tag
  • the antibody is an anti-histidine fragment antibody
  • the histidine tag is immobilized between the histidine tag and the immobilized carrier via an anti-histidine tag antibody.
  • a sample containing a test substance to be detected is placed on an immobilized carrier having a protein immobilized by the protein immobilization method according to any one of (1) to (11).
  • a protein-immobilized carrier, and a method for detecting affinity between the protein immobilized on the immobilized carrier and the test substance contained in the sample is placed on an immobilized carrier having a protein immobilized by the protein immobilization method according to any one of (1) to (11).
  • the affinity between the protein and the test substance is detected by the principle of surface plasmon resonance. (12) The protein-test substance affinity described in (12). Detection method.
  • a substrate a polysaccharide molecular chain provided on the substrate, into which a reactive group capable of covalently bonding to the protein to be immobilized has been introduced, and a protein to be immobilized, wherein the protein is as described above.
  • the method for immobilizing a protein according to the present invention can be applied when immobilizing a protein on an immobilization carrier, and is not limited to a specific technical range.
  • the method for immobilizing a protein according to the present invention may include surface plasmon resonance
  • SPR Surface Plasmon Resonanse
  • QCM quartz crystal microbalance
  • DPI dual-polarization interferometry
  • the method for immobilizing a protein according to the present invention is not limited to the production of a sensor chip using the principle of SPR or the principle of QCM.
  • a protein chip protein array
  • affinity It can also be applied when making beads (affinity columns).
  • this sensor chip has a light-transmitting substrate 1, a metal film 2 provided on one main surface of the substrate 1, and an immobilization device provided on the metal film 2. And a carrier 3.
  • the immobilization carrier 3 is a self-assembled monolayer (SAM) having a reactive group such as a lipoxyl group or a SAM and a lipoxymethyl dextran immobilized on the metal film 2.
  • SAM self-assembled monolayer
  • the immobilization carrier 3 has a reactive group that covalently binds the protein to be immobilized.
  • the reactive group of the immobilization carrier 3 means a functional group that forms a covalent bond with the protein to be immobilized. Examples of the reactive group include a carboxylic group and a thiol group.
  • the immobilization carrier 3 may have a polysaccharide molecular chain into which a reactive group that covalently binds to the protein to be immobilized has been introduced. When the immobilization carrier 3 has the polysaccharide molecular chain, the protein to be immobilized is covalently bonded to the reactive group present in the polysaccharide molecular chain and forms a chelate with the polysaccharide molecular chain. It is fixed to the immobilization carrier 3. Examples of the polysaccharide molecular chain include dextran.
  • the immobilization carrier 3 has a second tag part binding site that binds to the second tag part of the protein to be immobilized.
  • the binding site of the second tag portion is appropriately selected according to the second tag portion. For example, for a protein having a histidine-one tag as the second tag portion, nitritrilotriacetic acid (NTA) Or iminodiacet ic acid
  • IDA dal thione S-transferase-tagged protein and maltose
  • an antigen peptide is used as the second tag part.
  • an antibody that reacts with the antigen peptide by an antigen-antibody reaction can be used as the second tag portion binding site as the second tag portion binding site.
  • the immobilization target is not particularly limited as long as it has two tag portions, that is, a protein having a first tag portion and a second tag portion, and any protein can be applied. can do.
  • the first tag portion is a tag portion used when purifying the protein to be immobilized, and is a site that interacts with the first tag portion binding site in the purification step.
  • the binding site of the first tag portion is appropriately selected according to the first tag portion. For example, for a protein having a histidine-one tag as the first evening portion, nitrilotriacetic acid (NTA ) Or iminodiacetic acid (IDA), daltathione for proteins having a daluzion thione S transferase-tag as the first tag part, and maltose for proteins having a maltose-binding protein-one tag. be able to.
  • an antibody that reacts with the antigen peptide by an antigen-antibody can be used as the first tag portion binding site as the first tag portion binding site.
  • the first tag portion for example, histidine ligase (hereinafter, referred to as His-tag), daldin thione S-transferase one tag (hereinafter, referred to as GST-tag), maltose-binding protein one tag (hereinafter, referred to as MBP-tag), antigen peptides and the like.
  • His-tag histidine ligase
  • GST-tag daldin thione S-transferase one tag
  • MBP-tag maltose-binding protein one tag
  • a FLAG-tag, an MBP-tag and a GST-tag are preferable.
  • the second tag portion is a site that interacts with the second tag portion binding site on the side of the immobilization carrier 3 and contributes to the binding between the protein and the immobilization carrier 3.
  • the second tag section may be different from the first tag section, and includes the evenings listed for the first tag section.
  • a His-tag and a GST-tag are preferable as the second tag portion.
  • the protein is not limited at all, and a protein having any property can be applied.
  • the protein may be a basic protein or an acidic protein, and may be a hydrophobic protein or a hydrophilic protein.
  • the evening protein having the first and second evening portions includes a recombinant vector having the first and second evening portions and a gene encoding a protein in a frame-matched state. It can be prepared by expressing as a fusion protein of the first tag portion and the second tag portion and a protein.
  • the first and second tag portions function as tags, respectively, that is, they exist on either the N-terminal or C-terminal side of the protein as long as they can interact with the tag binding site. You may do it.
  • the first tag portion and the second tag portion may be adjacent or separately.
  • the method for preparing the protein having the first and second evening portions to be immobilized is not limited at all, and any preparation method can be applied. For example, (1) a method of introducing a gene encoding the protein into a vector, and then introducing the recombinant vector into a host and expressing the protein in the host, or (2) a method such as a wheat germ cell-free system. Methods for expressing the protein in a cell system are mentioned.
  • the plasmid DNA for introducing the gene encoding the protein having the first and second fragments to be immobilized may be a plasmid derived from an E. coli bacterium (for example, pET30b or the like).
  • E. coli bacterium for example, pET30b or the like.
  • PBR system PBR system
  • pUC system such as pUC118, pUC119, pUC18 and pUC19, pBluescript, etc.
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, etc.
  • yeast-derived plasmids for example, ⁇ system such as ⁇ 13, YCp system such as YCp50.
  • phage DNA include ⁇ phage (Charon4A, Cliaron21A, EMBL3, EMBL4, AgtlOAgtlh ⁇ , etc.).
  • animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, plant viruses such as cauliflower mosaic virus, and insect virus vectors such as baculovirus can also be used.
  • the cDNA of the gene is first cut with an appropriate restriction enzyme, and then an appropriate vector]) NA And a method of inserting into a restriction enzyme site or a multiple cloning site and ligating to a vector.
  • the two can be linked by the in vitro method using PCR or the in vivo method using yeast or the like. It may be a method.
  • a transformant expressing the protein is obtained by introducing a recombinant vector containing a gene encoding a protein having a first tag portion and a second tag portion to be immobilized into a host.
  • a host is not particularly limited as long as it can express the above-mentioned gene, but plants belonging to Poaceae, Brassicaceae, Solanaceae, Leguminosae, etc., and Escherichia such as Escherichia coli.
  • a bacterium belonging to the genus Bacillus such as Bacillus subtilis, or a genus such as Pseudomonas putida; Examples include yeast such as Pombe (Schizosaccharomyces pombe), animal cells such as COS cells and CH0 cells, and insect cells such as Si9.
  • yeast such as Pombe (Schizosaccharomyces pombe)
  • animal cells such as COS cells and CH0 cells
  • insect cells such as Si9.
  • Methods for introducing the above-described recombinant vector into a plant include ordinary transformation methods, for example, an electroporation method (electroporation method), an agrobacterium method, a particle gun method, and a PEG method.
  • the method for introducing the above-described recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria, and examples thereof include a method using calcium ions and an electro-bolization method.
  • the method for introducing the above-described recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast, and examples thereof include an elect-portation method, a spheroplast method, and a lithium acetate method.
  • monkey cells such as COS-7, Vero, Chinese Hams evening ovary cells (CH0 cells), and mouse / cells are used.
  • the method for introducing the above-described recombinant vector into animal cells is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electroporation method, calcium phosphate method, ribofect Chillon method and the like can be mentioned.
  • the method for introducing the above-described recombinant vector into insect cells is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into insect cells, and examples thereof include a calcium phosphate method, a lipofection method, and an electroporation method.
  • PR0TEI0S manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • PR0TEI0S manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • a recombinant vector for wheat germ cell-free system containing a gene encoding a protein having a first tag portion and a second tag portion to be immobilized as type III eg, For example, mRNA is synthesized in a reaction system containing pEU3- ⁇ plasmid (manufactured by Toyobo) and thermoT7 RNA polymerase (manufactured by Toyobo).
  • the synthesized mRNA is subjected to phenol / cloth form treatment to remove the protein, and then exchanged with a buffer for PR0TEIOS by ethanol precipitation.
  • a protein having a first tag portion and a second tag portion to be immobilized is synthesized using the synthesized mRNA according to the protocol of PR0TEIOS.
  • the protein to be immobilized is purified using the first tag portion.
  • purifying using the first tag portion means that the first tag portion of the protein to be immobilized interacts with the binding site of the first tag portion so that the protein to be immobilized is converted into contaminating proteins and the like. It means to separate and extract from the biological material containing.
  • the purification method include a method using affinity chromatography, an affinity resin and a magnetic pease.
  • examples of the purification means having the first tag portion binding site include a carrier having the first tag portion binding site immobilized thereon, a column filled with the carrier, and the like. Carriers include agarose and sepharose.
  • a protein to be immobilized having the FLAG tag as the first tag portion is prepared by the method described above.
  • the solution containing the protein to be immobilized is brought into contact with a carrier such as agarose carrying the anti-FLAG tag antibody.
  • the complex of the carrier to be immobilized and the carrier bound via the antigen-antibody reaction is separated.
  • FLAG Petit By adding 2004/012447 to the complex, the protein to be immobilized can be competitively eluted. Further, the eluted protein to be immobilized can be separated from the carrier or FLAG peptide by, for example, low-speed centrifugation (for example, 2000 g).
  • the reactive group of the immobilization carrier 3 is activated.
  • Activation means transition of a reactive group to a state where a covalent bond can be formed with a protein to be immobilized, which is present near the reactive group.
  • the immobilized carrier 3 having a lipoxyl group as a reaction group for example, a mixture of N-ethyl N '-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDO and N-hydroxysucc inimide (NHS)) is used.
  • EEO and N-hydroxysucc inimide N-hydroxysucc inimide
  • the protein to be immobilized is allowed to act on the immobilization carrier 3, and the protein is immobilized.
  • the second evening part of the protein to be immobilized interacts with the immobilization carrier 3.
  • the interaction means that the second tag part binds to the second tag part binding site, and the protein is immobilized to the protein.
  • the protein is relatively loosely bound to the immobilized carrier 3.
  • nickel or the like is added to NTA or IDA introduced into the immobilized carrier 3.
  • Metal through the nickel The His-tag and NTA or IDA form a complex Nickel can be trapped by NTA or IDA either before or after activation of the immobilized carrier 3.
  • the His-tagged protein And the immobilized carrier 3 into which NTA or IDA has been introduced.
  • the immobilized carrier 3 into which daryuthione is introduced and the protein are combined with a phosphate buffer solution (eg, PBS) under physiological conditions or a physiological condition.
  • a phosphate buffer solution eg, PBS
  • a Hepes buffer eg, HBS
  • a phosphate buffer (eg, PBS) under physiological conditions or a Hepes buffer (eg, HBS) under physiological conditions are also used. They can interact when they coexist.
  • the protein to be immobilized since the second tag portion of the protein to be immobilized interacts with the immobilization carrier 3, the protein to be immobilized is It is present at a relatively high concentration near the immobilization carrier 3. others 2004/012447 As a result, a covalent bond is easily formed between the activated reactive group and the protein, and a covalent bond is easily formed between the activated reactive group and the protein.
  • the reactive group when the reactive group is a hydroxyl group, a covalent bond is formed between the amino group present in the protein to be immobilized and the reactive group, that is, an amide coupling is formed.
  • the reactive group is a carboxyl group
  • the covalent bond between the free thiol group present in the protein to be immobilized and the reactive group is formed by converting the lipoxyl group to PDEA, that is, ligand-thiol coupling.
  • PDEA 2- (2-pyridinyldithio) ethaneamine hydrochloride
  • the carboxyl group is reacted with cystamine diliydrocliloride, and then converted to a thiol group by reduction with dithiothrei tol (DTT). Then, a covalent bond (disulfide bond) is formed between the PDEA-formed lipoxyl group and the thiol group on the side of the immobilization carrier 3. That is, a surface thiol coupling is formed.
  • DTT dithiothrei tol
  • the protein to be immobilized is purified using the first tag portion, and the interaction between the second tag portion and the second tag binding site and the covalent bond between the reactive group and the protein are formed. By doing so, the protein to be immobilized can be immobilized on the immobilization carrier.
  • the method for immobilizing a protein according to the present invention since the protein to be immobilized is purified using the first tag portion, the biological material containing contaminating proteins is removed, and the protein to be immobilized is removed. Can act on the immobilized carrier 3 at a high concentration.
  • the protein can be concentrated to a high concentration in the vicinity of the immobilization carrier 3 in order to cause the interaction between the second tag portion and the second tag portion binding site. it can. Therefore, according to the method for immobilizing a protein according to the present invention, even when a small amount of protein, which is difficult to be present at a high concentration in the vicinity of the immobilization carrier 3 in the conventional method, is to be immobilized, contamination can be prevented.
  • the protein to be immobilized can be covalently bound to the immobilization carrier 3 without immobilizing the protein nonspecifically.
  • the sensor chip prepared by applying the protein immobilization method according to the present invention can be used in a system for detecting a test substance having an affinity for an immobilized protein.
  • test substance means a substance having an affinity for the immobilized protein.
  • the test substance may be any known compound or a novel compound, for example, nucleic acids, carbohydrates, lipids, proteins, peptides, amino acids, low-molecular organic compounds, and compounds prepared using combinatorial chemistry technology. Libraries, random peptide libraries produced by solid phase synthesis or phage display, or natural components derived from microorganisms, animals, plants, marine organisms, and the like.
  • a prism 4 provided on a main surface opposite to a main surface provided with an immobilized carrier 3 on a substrate 1, and a prism 4 provided on a main surface.
  • a light source 6 that impinges the polarized light 5 on the sensor chip via the prism, a detection unit 8 on which the reflected light 7 reflected by the metal film 2 is incident on the polarized light 5 incident via the prism 4, and an immobilization in which the protein is immobilized.
  • a flow cell 9 in contact with the carrier 3.
  • the solution containing the sample containing the test substance to be detected flows into the flow cell 9, and the dark portion of the reflected light 7 changes from I to
  • the detector 8 detects the amount of shift to II.
  • the change in mass on the surface of one sensor chip is plotted on the vertical axis as a result of detection, and the time change in mass is displayed as measurement data (one gram of sensor).
  • the rate of this change in refractive index is substantially the same for all biomolecules (proteins, nucleic acids, and lipids), and interactions can be viewed in real time without labeling the biomolecules.
  • any protein can be immobilized regardless of the type of protein, and at the same time, the protein can be immobilized firmly for a long period of time. Therefore, screening of new drug targets or new drug candidate compounds using various types of proteins becomes possible.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of a main part of a sensor chip manufactured by applying the protein immobilization method according to the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic configuration diagram for explaining the configuration of an analyzer using the principle of SPR.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of analysis of proteins (cyclophilin A and FKBP12) purified using a His tag by SDS-PAGE and CBB staining.
  • FIG. 4 is a characteristic diagram showing one gram of a sensor when unpurified proteins (cyclophilin A and FKBP12) are concentrated (affinity concentration) on a sensor chip using a His tag.
  • FIG. 5 is a photograph showing a result of analyzing a protein (cyclophilin A) purified using a FLAG tag by SDS-PAGE and CBB staining.
  • Fig. 6 is a characteristic diagram showing a gram of a sensor when a protein (cyclophilin A) purified using FLAG is concentrated on a sensor chip using a His tag (affinity-concentration). .
  • FIG. 7 shows the sensorgram of the protein (cyclophilin A) purified by FLAG tag and immobilized on the sensor chip via covalent bond (amin coupling) and His tag.
  • FIG. Figure 8 shows that after purifying proteins (PPART and RAR- ⁇ ) with the FLAG tag, the purified protein was bound to the sensor chip via a covalent bond (amin coupling) and a His tag.
  • FIG. 6 is a characteristic diagram showing a sensorgram when immobilized.
  • FIG. 9 is a characteristic diagram showing the results of measuring the binding between cyclophilin A and cyclosporin A immobilized by applying the protein immobilization method according to the present invention, and the binding between FKBP12 and FK506 immobilized. is there. Explanation of symbols
  • Comparative Example 1 a method for purifying a trace protein expressed in a wheat germ cell-free system using a His tag will be described.
  • cyclophilin A hereinafter referred to as rcypj
  • FKBP 12 hereinafter referred to as “FKBP”
  • the above protein was subcloned into the plasmid vector pEU3- ⁇ (manufactured by Toyobo) for wheat germ cell-free system by genetic manipulation. It was made to become.
  • the base sequence and amino acid sequence of the His tag were as shown below.
  • PR0TEI0S manufactured by Toyobo Co., Ltd. was used as a wheat embryo cell-free system.
  • each protein expression plasmid for a cell-free wheat germ cell constructed by genetic manipulation was used as type III, and the plasmid was prepared using tliermoT7 RNA polymerase (manufactured by Toyobo).
  • mRNA was synthesized at 37 ° C for 4 hours.
  • the synthesized niRNA was subjected to phenol / cloth-form treatment to remove proteins, and then exchanged with a buffer for PR0TEIOS by ethanol precipitation.
  • protein was synthesized at 26 for 20 hours in a 0.3 ml reaction system based on the protocol of PR0TEIOS.
  • a sample in which the same reaction was performed without using mRNA was also prepared as a control.
  • About 0.3 ml of the synthesis reaction product is centrifuged at high speed.
  • the collected beads are mixed with an elution buffer (PBS pH 7.4 / 0.05% Tween20 / 250 mM imidazole, etc.) 1 and left at room temperature for 5 to 10 minutes.
  • the supernatant was collected as an eluate (E1).
  • the same operation was performed once again, and the eluate (E2) was recovered.
  • Fig. 3 shows the results of analysis of the sample obtained by the above-described operations by SDS-PAGE and CBB staining.
  • lane A (apply) is the protein synthesis reactant before purification
  • lane F (flow-through) is the residue after separation and recovery of beads
  • lanes E1 and E2 are shown.
  • the left lane of each lane A is a molecular weight marker.
  • two bands (arrow “NS” in FIG. 3) were detected at around 50 kDa together with the target protein FKBP or Cyph. Since this band was also detected in the non-expression sample, it was inferred that the protein was intrinsic to the wheat germ cell-free system and had activity similar to the His tag.
  • Cyph and FKBP were used as proteins.
  • the protein is a plasmid vector for wheat germ cell-free system by genetic manipulation
  • the cDNA was subcloned into PEU3-Ni1 to make a fusion protein with a His tag at the C-terminus.
  • PR0TEIOS manufactured by Toyobo
  • an NTA sensor chip prepared by the present inventors was used.
  • the NTA sensor chip has a dextran disposed on a substrate.
  • BIACORE S51 manufactured by Biacore
  • mRNA and further proteins were synthesized in the same manner as in Comparative Example 1 from each protein expression plasmid for a wheat germ cell-free system constructed by genetic manipulation.
  • a sample in which the same reaction was performed without using mRNA was also prepared as a control.
  • About 0.3 ml of the synthesis reaction product was subjected to high-speed centrifugation (12000 g, 10 minutes) to remove the precipitate, and used as a protein sample or a control sample used for the following measurement.
  • the CM5 sensor chip (manufactured by Biacore) is washed with pure water, and mixed with a mixture of 0.8 Nethyl-N '-(dime teyl aminopropyl) carbodi imide (EDC) 0.27M N-hydroxysucc inimide (NHS).
  • EDC Nethyl-N '-(dime teyl aminopropyl) carbodi imide
  • NHS N-hydroxysucc inimide
  • the sensor chip was processed for 10 minutes. Subsequently, the sensor chip was treated for 2 hours with 16 mg / ml of N- (5-amino-to carboxypentyl) iminodiacetic acid, disodium salt, mono ydraie (AB-NTA). Next, the sensor chip was washed with pure water, and further washed with 50 mM NaOH and 50 HC1.
  • NTA-sensor chip was used as NTA-sensor chip.
  • one NTA sensor chip was set in BIACORE S51, and the system was filled with running buffer (PBS PH7.4 / 0.005. Tween20, etc.).
  • Spot 1 was treated with 0.5 M NiCl 2 at a flow rate of 10 L / min for 1 minute (spot 2 was not treated), and Ni 2+ was bound only to spot 1 of the NTA sensor chip.
  • the system both spots 1 and 2) was then treated with the protein sample or control sample (non-expressing sample) diluted 10-fold in running buffer at a flow rate of 10 L / min for 3 minutes.
  • Figure 4 shows the sensorgram for the above operation.
  • spot 1 (+ Ni ion)
  • about 1700 RU of protein was bound on the sensor chip for Cyph and about 1800 RU for FKBP, whereas about 1500 MJ of protein was found on the sensor chip for the control sample. Bound. Therefore, when concentration (affinity concentration) is performed without purification, not only the target protein but also contaminating proteins derived from the cell-free system of wheat germ are concentrated on the sensor chip, and moreover, the target protein is more contaminated than the target protein. It was speculated that there was more protein.
  • spot 2 (-Ni ion) had a binding amount of only about 200 RU in all samples, contaminant proteins bound with affinity for Ni ion in spot 1 as well as the target protein described above. was thought to be.
  • Example 1 describes a method for purifying a trace protein expressed in a wheat germ cell-free system using a FLAG tag.
  • Cyph was used as the protein.
  • the above-mentioned protein was subcloned into the wheat embryo cell-free plasmid vector PEU3-NII by genetic manipulation, and a fusion protein with a His tag and a FLAG tag at the N-terminus was used. did.
  • the FLAG tag is the first tag section in the present invention.
  • the nucleotide and amino acid sequences of the His tag and FLAG tag sequences were as shown below.
  • PR0TEI0S manufactured by Toyobo Co., Ltd. was used as a wheat embryo cell-free system.
  • niRNA and proteins were synthesized in the same manner as in Comparative Example 1 from an expression plasmid for a wheat embryo cell-free system constructed by genetic manipulation.
  • a sample in which the same reaction was performed without using DLRNA was also prepared.
  • about 0.3 ml of the synthesis reaction product was subjected to high-speed centrifugation (12000 g, 10 minutes) to remove the precipitate, mixed with M2 agarose (Sigma) 25 ⁇ 1, and left at room temperature for 1 hour. Collect M2 agarose from the above mixture by low-speed centrifugation (2000g, 3 minutes) and buffer
  • the mixture was mixed with 0.1 mg / ml of FLAG peptide (manufactured by Sigma) 501 and left at room temperature for 1 hour. T JP2004 / 012447 The supernatant separated from the mixture by low-speed centrifugation was recovered as an eluate (E1). The same operation was performed once again, and the eluate (E2) was recovered.
  • FIG. 5 shows the results of analyzing the samples obtained by the above operations by SDS-PAGE and CBB staining.
  • lane A (Apply) is a protein synthesis reaction product before purification
  • lanes E1 and E2 show an eluate (E1) and an eluate (E2), respectively.
  • the left lane of each lane A is a molecular weight marker.
  • E1 and E2 only the target protein, Cyph, was detected, and contaminating protein that could cause a problem was not detected.
  • Example 2 the present invention is applied to a method in which a trace protein expressed in a wheat germ cell-free system is purified by FLAG, and then concentrated on a sensor chip with a His tag (affinity-concentration). explain.
  • Cyph was used as the protein.
  • the cDNA was subcloned into the wheat embryo cell-free plasmid vector PEU3-NII by genetic manipulation, with a His tag and FLAG fragment at the N-terminus.
  • the fusion protein was added.
  • the FLAG tag is the first tag part in the present invention
  • the His tag is the second tag part.
  • PR0TEI0S Toyobo Co., Ltd.
  • An NTA sensor chip (Biaco chip (Biacore)) was used as the sensor chip.
  • the NTA sensor chip has a dextran disposed on a substrate.
  • BIACORE3000 manufactured by Biacore
  • mRNA and protein were synthesized in the same manner as in Comparative Example 1 from 5 g of an expression plasmid for a cell-free wheat germ constructed by genetic manipulation. At this time, a sample in which the same reaction was performed without using mRNA (non-expression sample) was also prepared as a control. Next, about 0.3 ml of the synthesis reaction product was subjected to high-speed centrifugation (12000 g, 10 minutes) to remove the precipitate, mixed with M2 agarose (manufactured by Sigma) 251, and left at room temperature for 1 hour. Collect M2 agarose from the above mixture by low-speed centrifugation (2000g, 3 minutes), and buffer
  • the mixture was mixed with 0.1 mg / ml of FLAG peptide (manufactured by Sigma) and left at room temperature for 1 hour.
  • the supernatant separated from the mixture by low-speed centrifugation was collected as an eluate.
  • the eluate collected from a sample synthesized using mRNA was used as a protein sample, and the eluate collected from a non-expression sample was used as a control sample.
  • the NTA sensor chip was set on the BIACORE3000, and the system was filled with a running buffer (such as PBS pH 7.4 / 0.005% Tween20).
  • the system was then treated with 0.5M NiCl, at a flow rate of 10 / L / min for 1 minute, to allow N to bind to the NTA sensor chip.
  • the system was then treated with the protein or control sample for 1 minute at a flow rate of 10 L / min.
  • Figure 6 shows the sensorgram for the above operation. Approximately 5100 RU of protein bound to the sensor chip in the evening protein sample, whereas only about 60 IOJ of protein bound to the sensor chip in the control sample. The results showed that once purified with the FLAG tag, only the target protein, Cypli, was effectively concentrated on the sensor chip.
  • Example 3 a small amount of protein expressed in a wheat germ cell-free system by applying the present invention was purified using a FLAG tag, and then covalently bonded to a sensor chip (amin coupling). And a method for immobilizing the purified protein via a His tag.
  • Cyph was used as the protein.
  • cDNA was subcloned into the above-mentioned protein into a wheat embryo cell-free plasmid vector pEU3-NII by genetic manipulation, and a His tag and a FLAG tag were added to the N-terminus. It was made to be a fusion protein.
  • the FLAG tag is the first tag unit in the present invention
  • the His tag is the second tag unit.
  • PR0TEI0S manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • the sensor chip the NTA sensor chip (Biaco chip (Biacore)) used in Example 2 was used.
  • the measurement device used was BIAC0RE3000 (manufactured by Piacore).
  • mRNA and protein were synthesized in the same manner as in Example 2, and the eluate was recovered.
  • the eluate collected from the sample synthesized using mRNA was used as the protein sample for fixation, and the eluate collected from the non-expression sample was solidified. 2004/012447 Used as control sample for regular use.
  • the NTA sensor chip was set on the BIACORE3000, and the system was filled with running buffer (such as PBS pH 7.4 / 0.0053 ⁇ 4 Tween20).
  • running buffer such as PBS pH 7.4 / 0.0053 ⁇ 4 Tween20.
  • the system was treated with 0.5 M NiCl 2 at a flow rate of 10 wL / min for 1 minute to bind N 2 on one NTA sensor chip.
  • the fixed reaction was terminated by decomposing the unreacted active intermediate by treating for 7 minutes and treating the system with 25 OmM imidazole buffer for 1 minute at a flow rate of 10 nL / min.
  • the protein was removed from the surface of the sensor chip, and the sensorgram in the above procedure is shown in Figure 7.
  • About 5600 IUJ of protein was immobilized on the sensor chip for the protein sample for fixation, whereas about 5600 IUJ for the control sample for fixation. Only the 280R11 protein was immobilized on the sensor chip, indicating that only the target protein, Cyph, was effectively immobilized on the sensor chip.
  • Example 4 describes a method for immobilizing a protein in the same manner as in Example 3, except that PPAR r and RAR- ⁇ were used as the protein.
  • BIACORE S51 manufactured by Biacore
  • one NTA sensor chip used in Comparative Example 2 was used as a sensor chip.
  • Fig. 8 shows the sensorgram in the above operation.
  • PPAR T about 4700 RU of protein was fixed.
  • RAR- ⁇ about 3400RU of protein is immobilized. It was.
  • Example 5 describes a method for measuring the protein-test substance interaction using a protein expressed in a wheat germ cell-free system immobilized on a sensor chip by applying the present invention.
  • Cyph and FKBP were used as proteins.
  • test substances cyclosporin A, which is known to bind to Cyph, and FK506, which is known to bind to FKBP, were used.
  • BIACORE S51 manufactured by Biacore
  • the NTA sensor chip used in Comparative Example 2 was used as a sensor chip.
  • the operation of fixing the evening protein to one sensor chip was performed in the same manner as in Example 3.
  • FKBP was fixed at about 2000 RU at spot 1 and Cyph was fixed at about 3400 RU at spot 2 of the same flow cell.
  • LuM cyclosporin A was injected into the above sensor chip for 1.5 minutes, left for about 8 minutes until the response returned to the baseline, and then luM FK506 was injected for 1.5 minutes.
  • Figure 9 shows the sensorgram for the above operation. When cyclosporin A was injected, a response of about 43 RU was detected only in the Cyph spot, and when FK506 was injected, a response of about 51 RU was detected only in the FKBP spot.
  • a protein to be immobilized having a first tag portion and a second tag portion is purified using the first tag portion, and the reactive group on the immobilization carrier side is activated. Subsequently, the second tag portion of the protein is allowed to interact with the immobilized carrier, and the protein is covalently bonded to the immobilized carrier.
  • Tan according to the present invention According to the protein immobilization method, various proteins of interest can be firmly immobilized on the immobilization carrier regardless of the amount of the target protein and without non-specifically immobilizing contaminating proteins. can do. Sequence listing free text
  • SEQ ID NOs: 1 and 2 are the base sequence and amino acid sequence of a His tag (including a stop codon), respectively.
  • SEQ ID NOS: 3 and 4 are the base sequence and amino acid sequence of the His tag and FLAG tag (including the start codon), respectively.

Abstract

第１タグ部及び第２タグ部を有する固定化対象のタンパク質を当該第１タグ部を用いて精製する第１工程と、上記タンパク質に対して共有結合可能な反応基を有する固定化担体における当該反応基を活性化する第２工程と、上記第２工程の後、上記固定化担体に対して、上記第１工程で精製されたタンパク質を含む溶液を作用させる第３工程とを含み、上記第３工程では、上記第２タグ部と上記固定化担体の第２タグ部結合部位との間の相互作用及び上記反応基と上記タンパク質との間の共有結合を介して、上記タンパク質を上記固定化担体に固定化することにより、目的のタンパク質量に関係なく、さらに夾雑タンパク質を非特異的に固定化することなく、目的の様々なタンパク質を担体に対して強固に固定化する方法を提供する。

Description

タンパク質の固定化方法
技術分野
本発明は、 例えば担体の表面上にタンパク質を固定化する際に広く利用できる タンパク質の固定化方法に関する。 明
背景技術
タンパク質 -タンパク質間の相互作用、 及び、 タンパク質-化合物間の相互作用 に関する情報は、 新規創薬夕ーゲット及び/書又は新規医薬品候補化合物の発見を 行う上で非常に有用な情報である。 一方、 網羅的なタンパク質機能解析において は、 微小スケールで発現したタンパク質を用いて解析できることが、 コスト及び スループットの点で重要である。 上記情報を取得するために、 或いは微小スケー ルで発現したタンパク質を用いた解析を達成するために、 近年特にラジオァイソ トープを用いず表面プラズモン共鳴 （Surface Plasmon Resonanse : SPR) の原理 を応用したリアルタイムでの相互作用解析を行う装置、 例えば、 Biacore 3000 (ビアコア社製） 等が用いられるようになった。
この SPRの原理を用いた相互作用解析では、 相互作用解析を行うタンパク質 -夕 ンパク質間における一方を、 或いは、 タンパク質-化合物間における一方をセン サーチップ上に固定化し、 その後、 他方のタンパク質或いは化合物をセンサ一チ ップ上に作用させ、 タンパク質-夕ンパク質相互作用或いは夕ンパク質-化合物相 互作用に起因する質量変化を SPRシグナルとして検出する。 なお、 この SPRの原理 を用いた相互作用解析は、 高感度の機能解析手法であることから、 タンパク質必 要量は、 少ないというメリットを有する。
SPRの原理を用いた相互作用解析においては、 センサ一チップ上にタンパク質 を固定化する際、 例えば、 低 pHかつ低塩濃度の条件下で、 タンパク質のアミノ基 とセンサーチップ上のカルボキシル基とをカップリングさせる方法、 すなわちァ ミンカップリング方法が使用される。 しかしながら、 この条件下では、 タンパク 質の失活を招きやすく、 また酸性タンパク質を固定化できないといった問題があ つた。 一方、 ヒスチジンタグ等のタグを用いる場合には、 センサーチップへの固 定化では広範囲のヒスチジンタグ融合タンパク質を固定化できるが、 その結合は 不安定であり、 相互作用測定が不可能であるといった問題があった。 そこでこれ ら問題を解決するために、 既に本発明者らは、 タグ融合タンパク質のタグを介し た結合とァミンカツプリングを連続して行うことにより、 生理的 pHかつ生理的塩 濃度下でほとんどすべてのタンパク質を安定してセンサーチップ上に固定化でき る技術（ァフィニティー ·ァミンカップリング方法）を開発し、 特許出願している (特願 2002- 335334)。
一方、 コムギ胚芽無細胞系などのタンパク質の種類を問わず発現可能な発現系 が開発されている。 しかしながら、 このような発現系では、 目的タンパク質の発 現量が微量であることが多い。 このような微量な目的タンパク質を上記ァフィ二 ティー 'ァミンカップリング方法によってセンサ一チップ上に固定化した場合に は、 夾雑タンパク質も同時にカップリングされてしまうため、 相互作用測定の S/N比の点で満足できる結果が得られない場合が多い。 発明の開示
そこで、 本発明は、 上述した実状に鑑み、 目的のタンパク質量に関係なく、 さ らに夾雑タンパク質を非特異的に固定化することなく、 目的の様々なタンパク質 を担体に対して強固に固定化できるタンパク質の固定化方法を提供することを目 的とする。
上述した目的を達成するため、 本発明者が鋭意検討した結果、 第 1タグ部及び 第 2タグ部を有するタンパク質を第 1タグ部を用いて精製し、 担体に精製した夕 ンパク質を固定化する際に、 固定化担体側の反応基を活性化させた後に、 当該夕 ンパク質を作用させることで、 当該タンパク質の第 2タグ部と固定化担体とを相 互作用させるとともに当該タンパク質と固定化担体とを共有結合させることがで き、 目的のタンパク質量に関係なく、 さらに夾雑タンパク質を非特異的に固定化 することなく、 目的の様々なタンパク質を強固に固定化できることを見出し、 本 発明を完成するに至った。 2004/012447 本発明は、 以下を包含する。
( 1 ) 第 1タグ部及び第 2夕グ部を有する固定化対象のタンパク質を当該第 1 タグ部を用いて精製する第 1工程と、 上記タンパク質に対して共有結合可能な反 応基を有する固定化担体における当該反応基を活性化する第 2工程と、 上記第 2 工程の後、 上記固定化担体に対して、 上記第 1工程で精製されたタンパク質を含 む溶液を作用させる第 3工程とを含み、 上記第 3工程では、 上記第 2タグ部と上 記固定化担体の第 2タグ部結合部位との間の相互作用及び上記反応基と上記タン パク質との間の共有結合を介して、 上記タンパク質を上記固定化担体に固定化す ることを特徴とするタンパク質の固定化方法。
(2) 第 1工程では、 上記タンパク質を、 第 1タグ部結合部位を有する精製手 段を用いて、 分離及び抽出する工程を含むことを特徴とする （1) 記載のタンパ ク質の固定化方法。
(3) 上記第 1タグ部結合部位は、 第 1タグ部に対する抗体であることを特徴 とする （2) 記載のタンパク質の固定化方法。
( 4 ) 上記第 1夕グ部は FLAG夕グであり、 上記第 1夕グ部結合部位は抗 FLAG夕 グ抗体であることを特徴とする （3) 記載のタンパク質の固定化方法。
(5) 上記反応基はカルボキシル基であり、 第 3工程では、 当該カルボキシル 基と上記固定化対象のタンパク質におけるァミノ基との間でアミンカツプリング させることを特徴とする （1) 記載のタンパク質の固定化方法。
(6) 上記第 2タグ部はヒスチジンタグであり、 上記第 3工程では、 当該ヒス チジンタグと固定化担体との間で相互作用させることを特徴とする （1) 記載の タンパク質の固定化方法。
(7) 上記第 3工程で、 上記ヒスチジンタグと固定化担体との間で錯体を介し て相互作用させることを特徴とする （6) 記載のタンパク質の固定化方法。
(8) 上記第 3工程で、 上記ヒスチジンタグと固定化担体との間で Ni2+- nitrilotriacetic acid(Ni-NTA)を介して相互作用させることを特徴とする
(7) 記載のタンパク質の固定化方法。
(9) 上記第 3工程で、 当該ヒスチジンタグと固定化担体との間で N - iminodiacetic acid (Ni- IDA)を介して相互作用させることを特徴とする （7) 記 載のタンパク質の固定化方法。
(10) 固定化担体の第 2タグ部結合部位は第 2タグ部に対する抗体であるこ とを特徴とする （1) 記載のタンパク質の固定化方法。
(1 1) 上記第 2夕グ部はヒスチジンタグであり、 上記抗体は抗ヒスチジン夕 グ抗体であり、 第 3工程では、 当該ヒスチジンタグと固定化担体との間で抗ヒス チジンタグ抗体を介して相互作用させることを特徵とする （10) 記載のタンパ ク質の固定化方法。
(1 2) (1) 〜 （1 1) のいずれか 1項記載のタンパク質の固定化方法によ り固定化したタンパク質を有する固定化担体に対して、 検出対象の被験物質を含 む試料を作用させる工程と、 上記固定化担体に固定化されたタンパク質と、 上記 試料に含まれる被験物質との親和性を検出する工程とを含むタンパク質-被験物 質親和性検出方法。
(1 3) 上記親和性を検出する工程では、 表面プラズモン共鳴の原理により上 記タンパク質と上記被験物質との親和性を検出することを特徴とする （12) 記 載のタンパク質-被験物質親和性検出方法。
(14) (1) 〜 （1 1) のいずれか 1項記載のタンパク質の固定化方法によ り、 タンパク質を固定化した固定化担体。
(1 5) 基板と、 基板上に配設され、 固定化対象のタンパク質と共有結合可能 な反応基が導入された多糖分子鎖と、 固定化対象のタンパク質とを備え、 上記夕 ンパク質が上記反応基と共有結合するとともに、 上記多糖分子鎖とキレートを介 して相互作用していることを特徴とする （14) 記載のタンパク質を固定化した 固定化担体。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明に係るタンパク質の固定化方法は、 固定化担体に対してタンパク質を固 定化する際に適用することができ、 特定の技術範囲に限定して適用するものでは ない。 例えば、 本発明に係るタンパク質の固定化方法は、 表面プラズモン共鳴
(Surface Plasmon Resonanse:SPR) の原理を利用した解析に用いるタンパク質 を固定化したセンサーチップを作製する際にも適用できるし、 SPRの原理以外の 原理を利用するセンサーチップを作製する際にも適用できる。 例えば、 SPRの原 理以外の原理としては、 水晶振動子マイクロバランス （Quartz- crys tal microbalance : QCM ) の 原理や二面偏波式干渉法 （Dual Pol arizat ion Interferometry:DPI)の原理を挙げることができる。
さらに、 本発明に係るタンパク質の固定化方法は、 SPRの原理や QCMの原理を利 用したセンサ一チップを作製する際に限定されず、 例えば、 いわゆるプロテイン チップ (プロティンアレイ） やァフィ二ティ一ビ一ズ (ァフィニティ一カラム) を作製する際にも適用することができる。
以下では、 SPRの原理を利用した解析に用いるセンサ一チップを例示して説明 する。 このセンサ一チップは図 1に示すように、 光透過性を有する基板 1と、 基 板 1の一主面上に配設された金属膜 2と、 金属膜 2上に配設された固定化担体 3 とを備えている。 固定化担体 3は、 力ルポキシル基等の反応基を有する自己組織 化単分子膜 （SAM) 、 或いは、 SAM及び力ルポキシメチルデキストランを、 金属膜 2上に固定化したものである。
固定化担体 3は、 固定化対象のタンパク質を共有結合する反応基を有している。 固定化担体 3の反応基とは、 固定化対象のタンパク質との間で共有結合を形成す る官能基を意味する。 反応基としては、 例えば、 力ルポキシル基及びチオール基 を挙げることができる。 固定化担体 3は、 固定化対象のタンパク質と共有結合す る反応基が導入された多糖分子鎖を有していてもよい。 固定化担体 3が当該多糖 分子鎖を備えている場合には、 固定化対象のタンパク質は、 多糖分子鎖に存在す る反応基と共有結合し、 かつ、 多糖分子鎖とキレートを形成することにより固定 化担体 3に固定される。 当該多糖分子鎖としては、 例えば、 デキストランが挙げ られる。
また、 固定化担体 3は、 固定化対象のタンパク質における第 2タグ部と結合す る第 2タグ部結合部位を有している。 第 2タグ部結合部位は、 第 2タグ部に応じ て適宜選択されるが、 例えば、 第 2タグ部としてヒスチジン一タグを有するタン パク質に対しては ni t ri lotriacet ic ac id ( NTA ) 又は iminodiacet ic acid
(IDA) 、 ダル夕チオン Sトランスフェラーゼータグを有するタンパク質に対して はダル夕チオン、 マルトース結合タンパク質一タグを有するタンパク質に対して はマルトースを挙げることができる。 また、 抗原ペプチドを第 2タグ部として有 4 012447 するタンパク質に対しては、 第 2タグ部結合部位として当該抗原ペプチドと抗原 抗体反応する抗体を第 2夕グ部結合部位として使用することができる。
また、 本発明に係るタンパク質の固定化方法において、 固定化対象としては、 2つのタグ部、 すなわち、 第 1タグ部及び第 2タグ部を有するタンパク質であれ ば特に限定されず、 如何なるタンパク質も適用することができる。
ここで、 第 1タグ部とは、 固定化対象のタンパク質を精製する際に用いるタグ 部であって、 精製工程において、 第 1タグ部結合部位と相互作用する部位である。 第 1タグ部結合部位は、 第 1タグ部に応じて適宜選択されるが、 例えば、 第 1夕 グ部としてヒスチジン一タグを有するタンパク質に対しては ni t ri lo t riace t ic acid (NTA) 又は iminod i acet ic ac id ( IDA) 、 第 1タグ部としてダル夕チオン S トランスフェラーゼータグを有するタンパク質に対してはダルタチオン、 マルト —ス結合タンパク質一タグを有するタンパク質に対してはマルトースを挙げるこ とができる。 また、 抗原ペプチドを第 1タグ部として有するタンパク質に対して は、 第 1タグ部結合部位として当該抗原ペプチドと抗原抗体反応する抗体を第 1 タグ部結合部位として使用することができる。 第 1タグ部としては、 例えば、 ヒ スチジン一夕グ （以下、 Hi s—タグと呼ぶ）、 ダル夕チオン Sトランスフェラーゼ 一タグ （以下、 GST—タグと呼ぶ） 、 マルトース結合タンパク質一タグ （以下、 MBP—タグと呼ぶ） 、 抗原ペプチド一夕グ等を挙げることができる。 抗原べプチ ドータグとは、 抗体が存在するペプチドをタグとするものであり、 例えば、 Hi s —タグ、 His G—タグ、 HA—タグ、 C-myc—タグ、 myc—タグ、 BPV- 1—タグ、 c l一 夕 グ、 Cre recombinase—タグ、 FLAG— タ グ、 NS 1 (81) 一タ グ、 green f luorescent prote in (GFP) —タグ、 IRS—タグ、 LexA—タグ、 Thioredoxin—タグ、 Polyoma vi rus med ium T ant igen epi tope—タク、 SV40 Large T Ant igen—タグ、 Paramoxyvi rus SV5—タグ、 Xpress—タグ、 GST—タグ、 MBP—夕グ等を挙げるこ とができる。 特に、 第 1タグ部としては、 FLAG—タグ、 MBP—タグ及び GST—夕グ が好ましい。
一方、 第 2タグ部とは、 固定化担体 3側の第 2タグ部結合部位と相互作用して、 タンパク質と固定化担体 3との結合に寄与する部位である。 第 2タグ部としては、 第 1タグ部と異なればよく、 上記第 1タグ部に関して列挙した夕グが挙げられる。 特に、 第 2タグ部としては、 Hi s—タグ及び GST—タグが好ましい。
タンパク質としては、 何ら限定されず、 如何なる特性、 性質のタンパク質をも 適用することができる。 特に、 タンパク質としては、 塩基性タンパク質であって も酸性タンパク質であってもよく、 また、 疎水性タンパク質であっても親水性夕 ンパク質であっても良い。
第 1夕グ部及び第 2夕グ部を有する夕ンパク質は、 第 1夕グ部及び第 2夕グ部 並びにタンパク質をコ一ドする遺伝子をフレームが一致した状態で有する組換え ベクタ一を用いて、 第 1タグ部及び第 2タグ部並びにタンパク質の融合タンパク 質として発現させることで調製できる。 なお、 融合タンパク質において、 第 1夕 グ部及び第 2タグ部は、 それぞれタグとして機能、 すなわち、 タグ部結合部位と 相互作用できる限り、 タンパク質に対して N末端又は C末端のいずれの側に存在し てもよい。 また、 融合タンパク質において、 第 1タグ部及び第 2タグ部は、 隣接 して又は別々に存在してもよい。
固定化対象の第 1夕グ部及び第 2夕グ部を有する夕ンパク質の調製方法として は、 何ら限定されず、 如何なる調製方法でも適用することができる。 例えば、 ( 1 )当該タンパク質をコードする遺伝子をベクターに導入し、 次いでこの組換え ベクターを宿主に導入し、 宿主中で当該タンパク質を発現させる方法又は（2 )コ ムギ胚芽無細胞系などの無細胞系において当該タンパク質を発現させる方法が挙 げられる。
( 1 )のタンパク質調製方法において、 固定化対象の第 1夕グ部及び第 2夕グ部 を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入するプラスミド DNAとしては、 大 腸菌由来のプラスミド （例えば pET30bなどの pET系、 PBR322および pBR325などの
PBR系、 pUC 118、 pUC 1 19、 pUC 18および pUC 19などの pUC系、 pB luescr ip t等) 、 枯 草菌由来のプラスミド （例えば pUB 1 10、 pTP5等）、 酵母由来のプラスミド （例え ば ΥΕρ 13などの ΥΕρ系、 YCp50などの YCp系等）などが挙げられる。 またファージ DNA としては、 λファージ （Charon4A、 Cliaron21A、 EMBL3、 EMBL4、 A gt l O A gt l h λ ΖΑΡ等） が挙げられる。 さらに、 レトロウイルス又はワクシニアウィルスなど の動物ウィルス、 カリフラワーモザイクウィルスなどの植物ウィルス、 またはバ キュロウィルスなどの昆虫ウィルスベクターを用いることもできる。 ベクターに固定化対象の第 1タグ部及び第 2タグ部を有するタンパク質をコー ドする遺伝子を挿入するには、 まず適当な制限酵素で当該遺伝子の cDNAを切断し、 次いで適当なベクター]) NAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイ卜に挿入 してベクターに連結する方法が用いられる。 またべクタ一と上記遺伝子の cDNAの それぞれ一部に相同な領域を持たせることにより、 PCRなどを用いた in vi t ro法 または酵母などを用いた in V ivo法によつて両者を連結する方法であってもよい。 次いで、 固定化対象の第 1タグ部及び第 2タグ部を有するタンパク質をコード する遺伝子を含む組換えベクターを、 宿主中に導入することにより、 当該タンパ ク質を発現する形質転換体を得ることができる。 宿主としては、 上記遺伝子を発 現できるものであれば特に限定されるものではないが、 イネ科、 アブラナ科、 ナ ス科、 マメ科等に属する植物、 大腸菌（Escherichia col i) 等のエッシェリヒァ 属、 バチルス ·ズブチリス（Bac i l lus subt i l is)等のバチルス属、 又はシユード モナス ·プチダ（Pseudomonas pu t ida)等のシユードモナス属に属する細菌、 サッ カロミセス 'セレピシェ（Saccharomyces cerevis iae) , シゾサッカロミセス 'ポ ンべ（Schi zosaccharomyces pombe)等の酵母、 COS細胞、 CH0細胞等の動物細胞、 あるいは Si9等の昆虫細胞が挙げられる。
植物への上記組換えベクターの導入方法は、 通常の形質転換方法、 例えば電気 穿孔法 （エレクトロボレ一シヨン法） 、 ァグロパクテリゥム法、 パーテイクルガ ン法、 PEG法等が挙げられる。
細菌への上記組換えべクタ一の導入方法は、 細菌に DNAを導入する方法であれ ば特に限定されず、 例えばカルシウムイオンを用いる方法、 エレクトロボレ一シ ョン法等が挙げられる。
酵母への上記組換えベクターの導入方法は、 酵母に DNAを導入する方法であれ ば特に限定されず、 例えばエレクト口ポレーシヨン法、 スフエロプラスト法、 酢 酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、 サル細胞 COS- 7、 Vero、 チャイニーズハムス夕 一卵巣細胞 （CH0細胞） 、 マウス!/細胞などが用いられる。 動物細胞への上記組換 えベクターの導入方法としては、 動物細胞に DNAを導入する方法であれば特に限 定されず、 例えばエレクトロボレ一シヨン法、 リン酸カルシウム法、 リボフェク シヨン法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、 Si9細胞などが用いられる。 昆虫細胞への上記 組換えベクターの導入方法としては、 昆虫細胞に DNAを導入する方法であれば特 に限定されず、 例えばリン酸カルシウム法、 リポフエクシヨン法、 エレクトロボ レ一シヨン法などが挙げられる。
一方、 （2 )のタンパク質の調製方法においては、 例えば、 コムギ胚芽無細胞系 として PR0TEI0S (東洋紡社製）を用いることができる。 PR0TEI0S (東洋紡社製）を用 いる場合には、 まず鍀型として固定化対象の第 1タグ部及び第 2タグ部を有する タンパク質をコードする遺伝子を含むコムギ胚芽無細胞系用組換えベクター（例 えば、 pEU3- ΝΠプラスミド（東洋紡社製）など）及び thermoT7 RNAポリメラ一ゼ (東洋紡社製） を含む反応系において、 mRNAを合成する。 次いで合成された mRNA は、 フエノール/クロ口ホルム処理によりタンパク質を除去した後、 エタノール 沈殿によって PR0TEI0S用のバッファーにバッファ一交換する。 次いで、 PR0TEI0S のプロトコルに従って、 合成された mRNAを用いて、 固定化対象の第 1タグ部及び 第 2タグ部を有するタンパク質を合成する。
本発明に係るタンパク質の固定化方法では、 まず固定化対象のタンパク質を第 1タグ部を用いて精製する。 ここで 「第 1タグ部を用いて精製する」 とは、 固定 化対象のタンパク質の第 1タグ部を第 1タグ部結合部位と相互作用させることで、 固定化対象のタンパク質を夾雑タンパク質等を含む生物材料から分離及び抽出す ることを意味する。 精製方法としては、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 ァ フィニティ一樹脂及び磁性ピーズを用いた方法が挙げられる。 なお、 第 1タグ部 結合部位を有する精製手段としては、 例えば第 1タグ部結合部位を固定した担体 又は当該担体を充填したカラム等が挙げられる。 担体としては、 ァガロース及び セファロ一スが挙げられる。
例えば、 第 1タグ部として FLAGタグを有するタンパク質の場合には、 まず上述 した方法で、 第 1タグ部として FLAGタグを有する固定化対象のタンパク質を調製 する。 次いで、 当該固定化対象のタンパク質を含む溶液を抗 FLAGタグ抗体を担持 するァガロース等の担体と接触させる。 次いで、 抗原抗体反応を介して結合した 固定化対象のタンパク質と担体との複合体を分離する。 次に、 例えば FLAGぺプチ 2004/012447 ドを当該複合体に添加することで、 固定化対象のタンパク質を競合溶出すること ができる。 さらに、 溶出した固定化対象のタンパク質を、 例えば低速遠心（例え ば、 2000g)などによつて担体や FLAGぺプチドから分離できる。
次に、 本発明に係るタンパク質の固定化方法では、 固定化担体 3の反応基を活 性化させる。 活性化とは、 反応基を、 当該反応基の近傍に存在する固定化対象の タンパク質に対して共有結合を形成しうる状態に遷移させることを意味する。 反 応基として力ルポキシル基を有する固定化担体 3に対しては、 例えば、 N- e thy卜 N' - (d ime thy l aminopropyl) carbod i imide (EDOと N - hydroxysucc inimide (NHS)の混 合液を作用させることによって、 力ルポキシル基を活性化することができる。 さらに、 本発明に係るタンパク質の固定化方法では、 固定化担体 3に対して固 定化対象のタンパク質を作用させ、 当該固定化対象のタンパク質が有する第 2夕 グ部と固定化担体 3とを相互作用させる。 ここで相互作用とは、 第 2タグ部と第 2タグ部結合部位とが結合し、 当該タンパク質と固定化担体 3とが比較的緩やか に結合することを意味する。 例えば、 第 2タグ部として Hi s—夕グを有するタン パク質の場合、 固定化担体 3に導入された NTAまたは IDAにニッケル等の金属をト ラップさせ、 ニッケルを介して H i s—タグと NTAまたは IDAとが錯体を形成する。 ニッケルを NTAまたは IDAにトラップさせるのは固定化担体 3の活性化の前後どち らでもかまわない。 これにより、 His—タグを有するタンパク質と NTAまたは IDA を導入した固定化担体 3とを相互作用させることができる。
また、 第 2タグ部として GST—夕グを有するタンパク質の場合、 ダル夕チオン が導入された固定化担体 3と当該タンパク質とを、 生理的条件のリン酸緩衝液 (たとえば PBS) や生理的条件の Hepes緩衝液 （たとえば HBS) 中に共存させるこ とで相互作用させることができる。 さらに、 抗原ペプチドを有するタンパク質及 び抗体を導入した固定化担体 3を用いる場合も、 同様に、 生理的条件のリン酸緩 衝液 （たとえば PBS) や生理的条件の Hepes緩衝液 （たとえば HBS) 中に共存させ ることで相互作用させることができる。
本発明に係るタンパク質の固定化方法では、 上述したように、 固定化対象の夕 ンパク質が有する第 2タグ部と固定化担体 3とを相互作用させているため、 固定 化対象のタンパク質は、 固定化担体 3の近傍に比較的高濃度に存在する。 このた 2004/012447 め、 活性化した反応基とタンパク質との間に共有結合が形成しやすい状態となり、 活性化した反応基とタンパク質との間に容易に共有結合が形成される。
例えば、 反応基が力ルポキシル基である場合、 固定化対象のタンパク質に存在 するアミノ基と反応基との間で共有結合を形成、 すなわちァミンカップリングを 形成する。 また、 反応基がカルボキシル基である場合、 力ルポキシル基を PDEA化 することにより、 固定化対象のタンパク質に存在する遊離のチオール基と反応基 との共有結合を形成、 すなわちリガンドチォ一ルカップリングを形成する。 さら に、 固定化対象のタンパク質が力ルポキシル基を有する場合、 予め当該タンパク 質を PDEA (2- (2-pyridinyldi thio) ethaneamine hydrochloride)と反応させて力 ルポキシル基を PDEA化する。 また、 固定化担体 3の力ルポキシル基を活性化させ た後に、 当該カルボキシル基を cys tamine d iliydroclilorideと反応させ、 その後 di t iothrei tol (DTT)で還元することによりチオール基に変換する。 そして、 PDEA化した力ルポキシル基と、 固定化担体 3側のチオール基の間で共有結合 （ジ スルフィ ド結合) を形成する。 すなわち、 サーフェスチオールカップリングを形 成する。
このように、 固定化対象のタンパク質を第 1タグ部を用いて精製し、 第 2タグ 部と第 2タグ結合部位との間の相互作用及び反応基とタンパク質との間の共有結 合を形成することによって、 固定化対象のタンパク質を固定化担体に固定化する ことができる。 本発明に係るタンパク質の固定化方法によれば、 第 1タグ部を用 いて固定化対象のタンパク質を精製しているため、 夾雑タンパク質を含む生物材 料が除去されており、 固定化対象のタンパク質を高濃度で固定化担体 3に作用さ せることができる。 さらに、 本発明に係るタンパク質の固定化方法によれば、 第 2タグ部と第 2タグ部結合部位とを相互作用させるために、 タンパク質を固定化 担体 3の近傍に高濃度に濃縮させることができる。 このため、 本発明に係るタン パク質の固定化方法によれば、 従来の方法においては固定化担体 3の近傍に高濃 度に存在させ難い微量のタンパク質を固定化対象とする場合でも、 夾雑タンパク 質を非特異的に固定化することなく、 固定化対象のタンパク質を固定化担体 3に 共有結合させることができる。
本発明に係るタンパク質の固定化方法を適用して作製されたセンサーチップは、 固定化したタンパク質に親和性を有するような被験物質を検出するようなシステ ムに用いることができる。
ここで、 被験物質とは、 固定化したタンパク質に対して親和性を有する物質を 意味する。 被験物質としては、 いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよ く、 例えば、 核酸、 糖質、 脂質、 タンパク質、 ペプチド、 アミノ酸、 有機低分子 化合物、 コンビナ卜リアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラ ィリー、 固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチド ライブラリ一、 あるいは微生物、 動植物、 海洋生物等由来の天然成分等が挙げら れる。
例えば、 SPRの原理を利用した解析装置では、 図 2に示すように、 基板 1にお ける固定化担体 3を配設した主面と反対の主面に配設したプリズム 4と、 プリズ ム 4を介してセンサーチップに偏光 5を入射する光源 6と、 プリズム 4を介して 入射した偏光 5が金属膜 2で反射した反射光 7が入射する検出部 8と、 タンパク 質を固定化した固定化担体 3に接するフローセル 9とを備える。
SPRの原理によれば、 光源 6から金薄膜 2に偏光 ·5を全反射するように当てる と、 反射光 7の一部に、 反射光強度が低下した部分が観察される。 この光の暗い 部分の現れる角度 （=屈折率の変化） は、 センサーチップ上での質量に依存する。 固定化担体 3に固定化されたタンパク質に被験物質が結合すると、 質量変化 （二 質量増） が生じ、 光の暗い部分が Iから I Iにシフトする （図 2 ) 。 limn2あたり lng の物質が結合すると Ι→Πに 0. 1度シフトすることが知られている。 逆に、 解離に より質量が減少すれば、 Π→Ιにその分だけ戻る。
したがって、 図 2に示した解析装置によれば、 検出対象の被験物質を含有する 試料を含む溶液をフローセル 9内に流入し、 反射光 7における暗い部分が Iから
I Iにシフトする量を検出部 8で検出する。 この解析装置では、 検出の結果として、 センサ一チップ表面での質量変化を縦軸にとり、 質量の時間変化を測定データと して表示する （センサ一グラム） 。 縦軸の単位は、 Resonance Uni t (=RU： レゾ ナンスユニット） で表され、 1 RU= l pg/腿2に相当する。 この屈折率変化の割合 は、 すべての生体分子 （タンパク質 ·核酸 '脂質） で実質的に同じであり、 生体 分子を標識することなく、 相互作用をリアルタイムでみることができる。 このような SPRの原理を利用した解析装置を用いれば、 特に、 タンパク質と被 験物質との相互作用解析を行うことができ、 なかでも新規創薬ターゲットおよび 新規医薬品候補化合物の発見を効率的に行うことができる。 特に、 本発明に係る タンパク質の固定化方法を適用して作製したセンサーチップでは、 タンパク質の 種類に限定されずに如何なるタンパク質も固定化できると同時に、 タンパク質を 長期間にわたって強固に固定化することができるため、 多種類のタンパク質を用 いた新規創薬ターゲットあるいは新規医薬品候補化合物のスクリーニングが可能 となる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003- 307588号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明に係るタンパク質の固定化方法を適用して作製したセンサ一チ ップの要部断面図である。
図 2は、 SPRの原理を利用した解析装置の構成を説明するための概略構成図で ある。
図 3は、 Hisタグを用いて精製したタンパク質（サイクロフィリン A及び FKBP12) を SDS- PAGE及び CBB染色で解析した結果の写真である。
図 4は、 未精製タンパク質（サイクロフィリン A及び FKBP12)を Hisタグを用いて センサーチップ上へ濃縮（ァフィニティーコンセントレーション）した際のセンサ 一グラムを示す特性図である。
図 5は、 FLAGタグを用いて精製したタンパク質（サイクロフィリン A)を SDS - PAGE及び CBB染色で解析した結果の写真である。
図 6は、 FLAG夕グを用いて精製したタンパク質（サイクロフィリン A)を Hi sタグ を用いてセンサーチップ上へ濃縮（ァフィニティ一コンセントレ一シヨン）した際 のセンサ一グラムを示す特性図である。
図 7は、 タンパク質（サイクロフィリン A)を FLAGタグで精製した後、 センサー チップに対して、 共有結合 (ァミンカツプリング）及び Hi sタグを介して上記精製 タンパク質を固定化した際のセンサーグラムを示す特性図である。 図 8は、 タンパク質（PPAR T及び RAR- α )を FLAGタグで精製した後、 センサ一チ ップに対して、 共有結合（ァミンカツプリング）及び Hi sタグを介して上記精製タ ンパク質を固定化した際のセンサーグラムを示す特性図である。
図 9は、 本発明に係るタンパク質の固定化方法を適用して固定化したサイクロ フィリン Aとサイクロスポリン Aとの結合及び固定化した FKBP12と FK506との結合 を測定した結果を示す特性図である。 符号の説明
1…基板、 2…金属膜、 3…固定化担体、 4…プリズム、 5…偏光、 6…光源、 7…反射光、 8…検出部、 9…フ口一セル 発明を実施するための最良の形態
〔実施例〕
以下、 実施例を用いて本発明に係るタンパク質の固定化方法をより詳細に説明 するが、 本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔比較例 1〕
比較例 1として、 コムギ胚芽無細胞系で発現させた微量タンパク質を Hi sタグ を用いて精製する方法について説明する。
本例では、 タンパク質としてサイクロフィリン A (以下、 rcyp j と呼ぶ）及び FKBP 12 (以下、 「FKBP」 と呼ぶ）を用いた。 なお、 上記タンパク質は、 遺伝子操作 によってコムギ胚芽無細胞系用のプラスミドベクタ一 pEU3- ΝΠ (東洋紡社製）に cDNAをサブクローニングし、 この際に上記タンパク質の C末端に Hisタグが付加し た融合タンパク質となるようにした。 なお、 Hi sタグ（終止コドンを含む）の塩基 配列及びアミノ酸配列は、 下記に示す配列であった。
CAT CAC CAT CAC CAT CAC TAA (配列番号 1 )
His Hi s His Hi s His Hi s (配列番号 2 )
また、 コムギ胚芽無細胞系としては、 PR0TEI0S (東洋紡社製） を用いた。
まず遺伝子操作によって構築したコムギ胚芽無細胞系用の各タンパク質発現プ ラスミド 5 gを鐯型とし、 tliermoT7 RNAポリメラーゼ （東洋紡社製） を用いた 50 x lの反応系において、 mRNAを 37°Cで 4時間合成した。 次いで合成された niRNAは、 フエノール/クロ口ホルム処理によりタンパク質を除去した後、 ェタノ一ル沈殿 によって PR0TEI0S用のバッファーにバッファ一交換した。 合成された mRNA \0 g を用いて、 PR0TEI0Sのプロトコルに基づき 0. 3mlの反応系において、 タンパク質 を 26でで 20時間合成した。 この際に対照として、 mRNAを用いずに同様の反応を行 つたサンプル （無発現サンプル） も作製した。 合成反応物 約 0. 3mlを、 高速遠心
(12000g, 10分） によって沈殿を除去し、 さらに 0. 05 となるように Tween20 (バ ィォラッド社製） を、 さらに lOmMとなるように 1Mイミダゾ一ル水溶液を加えた。 上記サンプルに 5% Ni-NTA Magnet ic Agarose Beads (キアゲン社製) 50 ^ 1を加 え、 混和し、 室温で 1時間放置した。 上記混和物に磁石をあててビーズを分離し、 緩衝液 (PBS pH7. 4/0. 05¾ Tween20/20mMイミダゾールなど) 1mlを用いて数回洗 浄した。 次いで、 回収したビーズを溶出用緩衝液 （ PBS pH7. 4/0. 05% Tween20/250mMイミダゾールなど） 1と混和し、 室温で 5〜10分間放置後、 磁 石をあててビーズを分離し、 上清を溶出液 （E1) として回収した。 なお同様の操 作をもう一度行い、 溶出液 （E2) を回収した。
以上のような操作で得られたサンプルを SDS- PAGE及び CBB染色で解析した結果 を図 3に示す。 なお、 図 3中、 レーン A (アプライ）は精製前のタンパク質合成反 応物であり、 レーン F (フロースルー)はビーズを分離回収した後の残留物であり、 そしてレ一ン E1及び E2はそれぞれ溶出液（E1)及び溶出液 (E2)を示す。 また、 各レ —ン Aの左側のレーンは分子量マ一カーである。 FKBP又は Cypli溶出液（E1)サンプ ルのレーンには、 目的のタンパク質である FKBP又は Cyphとともに、 50kDa付近に 2 つのバンド（図 3中、 「NS」 の矢印）が検出された。 このバンドは無発現サンプル からも検出されていることから、 コムギ胚芽無細胞系内在性で Hisタグに類似し た活性を有するタンパク質と推察された。
〔比較例 2〕
比較例 2としてコムギ胚芽無細胞系で発現させた微量タンパク質を精製せずに Hisタグでセンサーチップ上に濃縮（ァフィニティ コンセントレーシヨン）する 方法を説明する。
本例では、 タンパク質として Cyph及び FKBPを用いた。 比較例 1と同様に、 上記 タンパク質は、 遺伝子操作によってコムギ胚芽無細胞系用のプラスミドベクター
PEU3 - Ni lに cDNAをサブクローニングし、 この際に C末端に Hi sタグが付加した融合 タンパク質となるようにした。 コムギ胚芽無細胞系としては、 PR0TEI0S (東洋紡 社製） を用い、 センサーチップとしては、 本発明者らが作製した NTAセンサーチ ップを用いた。 当該 NTAセンサーチップは、 基板上にデキストランが配設された ものである。 なお、 測定装置としては、 BIACORE S51 (ビアコア社製） を用いた。 まず遺伝子操作によって構築したコムギ胚芽無細胞系用の各タンパク質発現プ ラスミドから、 比較例 1と同様にして、 mRNA、 さらにタンパク質を合成した。 こ の際に、 対照として、 mRNAを用いずに同様の反応を行ったサンプル （無発現サン プル） も作製した。 合成反応物 約 0. 3mlを、 高速遠心 （12000g、 10分） によって 沈殿を除去し、 以下の測定に使用するタンパク質サンプル又は対照サンプルとし た。
次に CM5センサーチップ (ビアコア社製) を純水で洗浄し、 0. 8 N-e thyl-N' - (dime teyl aminopropyl) carbodi imide ( EDC ) 0. 27M N-hydroxysucc inimide (NHS) の混合液により上記センサ一チップを 10分間処理した。 続いて 16mg/mlの N -（5 - amino -ト carboxypentyl) iminodiacet ic acid, d i sodium sal t, mono ydra ie (AB-NTA) によりセンサーチップを 2時間処理した。 次いで、 セン サ一チップを純水で洗浄し、 さらに 50mM NaOH及び 50 HC1で洗浄した。 最後に もう一度純粋で洗浄したセンサーチップを NTA-センサーチップとして使用した。 次に NTAセンサ一チップを BIACORE S51にセットし、 ランニング緩衝液 （PBS PH7. 4/0. 005¾ Tween20など） でシステムを満たした。 スポッ ト 1に対して 0. 5M NiC l2を流速 10 L/分で 1分間処理し （スポット 2に対しては処理しない） 、 NTAセ ンサーチップのスポット 1にのみ Ni2+を結合させた。 次にシステム （スポット 1及 び 2の双方） に対してランニング緩衝液で 10倍に希釈した上記タンパク質サンプ ル若しくは対照サンプル（無発現サンプル）を流速 10 ^ L/分で 3分間処理した。
以上の操作におけるセンサーグラムを図 4に示す。 スポット 1 (+Niイオン） に おいて、 Cyphでは約 1700RUのタンパク質、 FKBPでは約 1800RUのタンパク質がセン サ一チップ上に結合したのに対し、 対照サンプルでも約 1500MJのタンパク質がセ ンサ一チップ上に結合した。 従って、 精製せずに濃縮（ァフィニティーコンセントレーション）した場合には、 目的のタンパク質のみでなくコムギ胚芽無細胞系に由来する夾雑タンパク質まで もがセンサーチップ上に濃縮され、 しかも目的タンパク質より夾雑タンパク質の ほうが多いことが推測された。 また、 スポット 2 (- Niイオン） においては全ての サンプルで結合量が 200RU程度にとどまつていたことから、 スポット 1において上 記目的タンパク質と同様に夾雑タンパク質も Niイオンに対する親和性で結合して いると考えられた。
〔実施例 1〕
実施例 1としてコムギ胚芽無細胞系で発現させた微量タンパク質を FLAGタグを 用いて精製する方法について説明する。
本例では、 タンパク質として Cyphを用いた。 なお、 上記タンパク質は、 遺伝子 操作によってコムギ胚芽無細胞系用のプラスミドベクター PEU3-NI Iに cDNAをサブ クローニングし、 この際に N末端に Hi sタグと FLAGタグが付加した融合タンパク質 となるようにした。 なお本例では、 FLAGタグが本発明における第 1タグ部である。 Hi sタグ及び FLAGタグ配列（開始コドンを含む）の塩基配列及びアミノ酸配列は、 下記に示す配列であった。
ATG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAA (配列番号 3 )
Met Hi s His His Hi s Hi s Hi s Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (配列番号 4 )
また、 コムギ胚芽無細胞系としては、 PR0TEI0S (東洋紡社製） を用いた。
まず遺伝子操作によって構築したコムギ胚芽無細胞系用の発現プラスミド から比較例 1と同様にして、 niRNA、 さらにタンパク質を合成した。 この際に、 対 照として、 DLRNAを用いずに同様の反応を行ったサンプル （無発現サンプル） も作 製した。 次いで、 合成反応物 約 0. 3mlを高速遠心 （12000g、 10分） によって沈殿 を除去した後、 M2 agarose (シグマ社製） 25 ^ 1と混和し、 室温で 1時間放置した。 上記混和物から低速遠心 （2000g、 3分) によって M2 agaroseを回収し、 緩衝液
(PBS pH7. 4/0. 1¾ Tween20など） 1mlで数回洗浄した。 回収した M2 agaroseを
0. lmg/mlの FLAG ペプチド （シグマ社製） 50 1と混和し、 室温で 1時間放置した。 T JP2004/012447 上記混和物から低速遠心によって分離した上清を、 溶出液 （E1) として回収した。 なお同様の操作をもう一度行い、 溶出液 （E2) を回収した。
以上の操作で得られたサンプルを SDS-PAGE及び CBB染色で解析した結果を図 5 に示す。 なお、 図 5中、 レーン A (アプライ）は精製前のタンパク質合成反応物で あり、 そしてレーン E1及び E2はそれぞれ溶出液（E1)及び溶出液（E2)を示す。 また、 各レーン Aの左側のレーンは分子量マーカ一である。 図 5から判るように、 溶出 液（E 1及び E 2)のレーンには、 目的タンパク質である Cyphだけが検出されており、 問題となるような夾雑夕ンパク質は検出されなかつた。
〔実施例 2〕
実施例 2では本発明を適用して、 コムギ胚芽無細胞系で発現させた微量タンパ ク質を FLAG夕グで精製した後、 Hisタグでセンサーチップ上に濃縮（ァフィニティ 一コンセントレーション）させる方法を説明する。
本例では、 タンパク質として Cyphを用いた。 実施例 1と同様に、 上記タンパク 質は遺伝子操作によってコムギ胚芽無細胞系用のプラスミドベクタ一 PEU3-NI Iに cDNAをサブクロ一ニングし、 この際に N末端に H i sタグと FLAG夕グが付加した融合 タンパク質となるようにした。 なお、 FLAGタグが本発明における第 1タグ部であ り、 Hi sタグが第 2タグ部である。 コムギ胚芽無細胞系としては PR0TEI0S (東洋 紡社製） を用いた。 センサーチップとしては NTAセンサーチップ（ビアコチップ (ビアコア社製））を用いた。 当該 NTAセンサーチップは、 基板上にデキストランが 配設されたものである。 なお、 測定装置としては BIACORE3000 (ビアコア社製） を用いた。
まず遺伝子操作によつて構築したコムギ胚芽無細胞系用の発現プラスミド 5 g から比較例 1と同様にして、 mRNA、 さらにタンパク質を合成した。 この際に、 対 照として、 mRNAを用いずに同様の反応を行ったサンプル （無発現サンプル） も作 製した。 次いで、 合成反応物 約 0. 3mlを高速遠心 （12000g、 10分） によって沈殿 を除去した後、 M2 agarose (シグマ社製） 25 1と混和し、 室温で 1時間放置した。 上記混和物から低速遠心 （2000g、 3分） によって M2 agaroseを回収し、 緩衝液
(PBS pH7. 4/0. 1% Tween20など） 1mlで数回洗浄した。 回収した M2 agaroseを
0· lmg/mlの FLAGペプチド （シグマ社製） と混和し、 室温で 1時間放置した。 上記混和物から低速遠心によって分離した上清を溶出液として回収した。 なお、 下記においては、 mRNAを用いて合成したサンプルから回収した溶出液をタンパク 質サンプルとし、 無発現サンプルから回収した溶出液を対照サンプルとした。 次に NTAセンサーチップを BIACORE3000にセットし、 ランニング緩衝液 （PBS pH7. 4/0. 005% Tween20など） でシステムを満たした。 次にシステムに対して 0. 5M Ni C l,を流速 10 / L/分で 1分間処理し、 NTAセンサーチップ上に N を結合させた。 次いでシステムに対して上記タンパク質サンプルもしくは対照サンプルを流速 10 L/分で 1分間処理した。
以上の操作におけるセンサーグラムを図 6に示す。 夕ンパク質サンプルでは約 5100RUの夕ンパク質がセンサーチップ上に結合したのに対し、 対照サンプルでは 約 60 IOJのタンパク質しかセンサーチップ上に結合しなかった。 この結果より、 FLAGタグで一旦精製することで目的のタンパク質である Cypliのみが効果的にセン サ一チップ上に濃縮されたことが示された。
〔実施例 3〕
実施例 3では、 本発明を適用してコムギ胚芽無細胞系で発現させた微量夕ンパ ク質を、 FLAGタグを用いて精製した後、 センサーチップに対して、 共有結合（ァ ミンカツプリング）及び Hisタグを介して上記精製タンパク質を固定化する方法を 説明する。
本例では、 タンパク質としては Cyphを用いた。 実施例 1と同様に、 上記タンパ ク質は遺伝子操作によってコムギ胚芽無細胞系用のプラスミドベクタ一 pEU3- NI I に cDNAをサブクローニングし、 この際に N末端に H i sタグと FLAGタグを付加した融 合タンパク質となるようにした。 なお、 FLAGタグが本発明における第 1タグ部で あり、 Hi sタグが第 2タグ部である。 コムギ胚芽無細胞系としては PR0TEI0S (東 洋紡社製） を用いた。 センサ一チップとしては実施例 2で使用した NTAセンサ一 チップ（ビアコチップ（ビアコア社製））を用いた。 なお、 測定装置としては BIAC0RE3000 (ピアコア社製） を用いた。
まず、 実施例 2と同様にして、 mRNA及びタンパク質を合成し、 さらに溶出液を 回収した。 なお、 下記において、 mRNAを用いて合成したサンプルから回収した溶 出液を固定用タンパク質サンプルとし、 無発現サンプルから回収した溶出液を固 2004/012447 定用対照サンプルとした。
次に NTAセンサーチップを BIACORE3000にセッ トし、 ランニング緩衝液 （PBS pH7. 4/0. 005¾ Tween20など） でシステムを満たした。 次にシステムに対して 0. 5M NiCl2を流速 10 w L/分で 1分間処理し、 NTAセンサ一チップ上に N を結合させた。 さ らにシステムに対し 0. 2M N-et yl-N' - (d ime teyl aminopropyl) carbod i imide
(EDO t Q. 05M N-hydroxysucc inimide (NHS) の混合液を流速 10 L/分で 7分間 処理し、 NTAセンサーチップ上の力ルポキシル基を活性化 （活性中間体を形成） した。 次にシステムに対してランニング緩衝液で 5倍に希釈した上記固定用タン パク質サンプルもしくは固定用対照サンプルを流速 10 ^ L/分で 10分間処理した。 これにより目的タンパク質を、 Hi sタグの効果によってセンサーチップ上に濃縮 すると共に、 アミノ基によって活性中間体と化学反応して共有結合を形成させる ことでセンサーチップに固定した。 次にシステムに対し 1Mエタノールァミン緩衝 液を流速 10 μ Ι7分で 7分間処理することで未反応の活性中間体を分解して固定反 応を終了させた。 さらに、 システムに 25 OmMィミダゾール緩衝液を流速 10 n L/分 で 1分間処理することで未反応のタンパク質をセンサーチップ表面から除去した。 以上の操作におけるセンサーグラムを図 7に示す。 固定用タンパク質サンプル では約 5600IUJのタンパク質がセンサーチップ上に固定されたのに対し、 固定用対 照サンプルでは約 280R11のタンパク質しかセンサーチップ上には固定されてなか つた。 この結果より、 目的のタンパク質である Cyphのみが効果的にセンサーチッ プ上に固定されたことが示された。
〔実施例 4〕
実施例 4では、 タンパク質として PPAR r及び RAR- αを用いた以外は、 実施例 3 と同様にしてタンパク質を固定化する方法を説明する。
本例では測定装置として BIACORE S51 (ビアコア社製） を用い、 センサ一チッ プとしては比較例 2で使用した NTAセンサ一チップを用いた。 なお、 固定用タン パク質サンプルをィンジェクシヨンする際に、 ランニング緩衝液での希釈は行な わず、 またインジェクション時間は 15分間であった。
以上の操作におけるセンサーグラムを図 8に示す。 PPAR Tにおいては約 4700RU のタンパク質が固定された。 RAR- αにおいては約 3400RUのタンパク質が固定され た。 この結果から、 いずれのタンパク質にも本発明に係るタンパク質の固定化方 法を適用できることが示唆された。
〔実施例 5〕
実施例 5では本発明を適用してセンサーチップに固定したコムギ胚芽無細胞系 発現タンパク質を用いてタンパク質-被験物質間相互作用を測定する方法を説明 する。
タンパク質としては Cyphと FKBPを用いた。 なお、 被験物質としては、 Cyphに結 合することが知られているサイクロスポリン A及び FKBPに結合することが知られ ている FK506を用いた。 測定装置としては BIACORE S51 (ビアコア社製） を用い、 センサーチップとしては比較例 2で使用した NTAセンサーチップを用いた。 夕ン パク質をセンサ一チップに対して固定する操作は実施例 3と同様に行った。 この 結果、 同一フローセルのスポット 1に FKBPが約 2000RU、 スポット 2には Cyphが約 3400RU固定された。
上記のセンサーチップに対し luMのサイクロスポリン Aを 1. 5分間インジェクシ ヨンし、 レスポンスがベースラインまで戻るまで約 8分間放置後、 luMの FK506を 1. 5分間ィンジェクシヨンした。 以上の操作におけるセンサーグラムを図 9に示 す。 サイクロスポリン Aをインジェクションした際には Cyphのスポットにのみ約 43RUのレスポンスが検出され、 FK506をィンジェクシヨンした際には FKBPのスポ ッ卜にのみ約 51RUのレスポンスが検出された。
以上から本発明を適用することで特異的なタンパク質-被験物質間相互作用を 検出できることが示された。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明に係るタンパク質の固定化方法は、 第 1タグ部及び第 2タグ部を有する 固定化対象のタンパク質を第 1タグ部を用いて精製し、 固定化担体側の反応基を 活性化させた後に、 当該タンパク質の第 2タグ部と固定化担体とを相互作用させ るとともに当該タンパク質と固定化担体とを共有結合させる。 本発明に係るタン パク質の固定化方法によれば、 目的のタンパク質量に関係なく、 さらに夾雑タン パク質を非特異的に固定化することなく、 目的の様々なタンパク質を固定化担体 に対して強固に固定化することができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 1及び 2は、 それぞれ Hisタグ（終止コドンを含む）の塩基配列及びァ ミノ酸配列である。
配列番号 3及び 4は、 それぞれ Hisタグ及び FLAGタグ（開始コドンを含む）の塩 基配列及びアミノ酸配列である。

Claims

1 . 第 1夕グ部及び第 2タグ部を有する固定化対象のタンパク質を当該第 1 タグ部を用いて精製する第 1工程と、
上記タンパク質に対して共有結合可能な反応基を有する固定化担体における当 該反応基を活性化する第 2工程と、
上記第 2工程の後、 上記固定化担体に対して、 上記第 1工程で精製されたタン パク質を含む溶液を作用させる第 3工程とを含み、
上記第 3工程では、 上記第 2夕グ部と上記固定化担体の第 2夕グ部結合部位と の間の相互作用及び上記反応基と上記タンパク質との間の共有結合を介して、 上 記タンパク質を上記固定化担体に固定化することを特徴とするタンパク質の固定 化方法。
2 . 第 1工程では、 上記タンパク質を、 第 1タグ部結合部位を有する精製手 段を用いて、 分離及び抽出する工程を含むことを特徴とする請求の範囲 1記載の タンパク質の固定化方法。
3 . 上記第 1タグ部結合部位は、 第 1タグ部に対する抗体であることを特徴 とする請求の範囲 2記載のタンパク質の固定化方法。
4 . 上記第 1夕グ部は FLAGタグであり、 上記第 1夕グ部結合部位は抗 FLAG夕 グ抗体であることを特徴とする請求の範囲 3記載のタンパク質の固定化方法。
5 . 上記反応基は力ルポキシル基であり、 第 3工程では、 当該カルボキシル 基と上記固定化対象のタンパク質におけるァミノ基との間でアミンカツプリング させることを特徴とする請求の範囲 1記載のタンパク質の固定化方法。
6 . 上記第 2タグ部はヒスチジンタグであり、 上記第 3工程では、 当該ヒス チジンタグと固定化担体との間で相互作用させることを特徴とする請求の範囲 1 記載のタンパク質の固定化方法。
7 . 上記第 3工程で、 上記ヒスチジンタグと固定化担体との間で錯体を介し て相互作用させることを特徴とする請求の範囲 6記載のタンパク質の固定化方法。
8 . 上記第 3工程で、 上記ヒスチジンタグと固定化担体との間で Ni2+ - ni t ri l ot riace t i c ac id (Ni-NTA)を介して相互作用させることを特徴とする請求 の範囲 7記載の夕ンパク質の固定化方法。
9 . 上記第 3工程で、 当該ヒスチジンタグと固定化担体との間で Ni2+- iminodiacet ic acid (Ni-IDA)を介して相互作用させることを特徴とする請求の範 囲 7記載のタンパク質の固定化方法。
1 0 . 固定化担体の第 2タグ部結合部位は第 2タグ部に対する抗体であるこ とを特徵とする請求の範囲 1記載のタンパク質の固定化方法。
1 1 . 上記第 2タグ部はヒスチジンタグであり、 上記抗体は抗ヒスチジン夕 グ抗体であり、 第 3工程では、 当該ヒスチジンタグと固定化担体との間で抗ヒス チジンタグ抗体を介して相互作用させることを特徴とする請求の範囲 1 0記載の タンパク質の固定化方法。
1 2 . 請求の範囲 1〜1 1のいずれか 1項記載のタンパク質の固定化方法に より固定化したタンパク質を有する固定化担体に対して、 検出対象の被験物質を 含む試料を作用させる工程と、
上記固定化担体に固定化されたタンパク質と、 上記試料に含まれる被験物質と の親和性を検出する工程とを含むタンパク質-被験物質親和性検出方法。
1 3 . 上記親和性を検出する工程では、 表面プラズモン共鳴の原理により上 記タンパク質と上記被験物質との親和性を検出することを特徴とする請求の範囲 1 2記載のタンパク質-被験物質親和性検出方法。
1 4 . 請求の範囲 1〜1 1のいずれか 1項記載のタンパク質の固定化方法に より、 タンパク質を固定化した固定化担体。
1 5 . 基板と、 基板上に配設され、 固定化対象のタンパク質と共有結合可能 な反応基が導入された多糖分子鎖と、 固定化対象のタンパク質とを備え、 上記夕 ンパク質が上記反応基と共有結合するとともに、 上記多糖分子鎖とキレートを介 して相互作用していることを特徴とする請求の範囲 1 4記載のタンパク質を固定 化した固定化担体。
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