KR101141737B1

KR101141737B1 - 신규한 항체 고정화용 융합단백질

Info

Publication number: KR101141737B1
Application number: KR1020090108541A
Authority: KR
Inventors: 김창섭; 차형준
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2009-11-11
Filing date: 2009-11-11
Publication date: 2012-05-03
Also published as: KR20110051778A

Abstract

본 발명은 신규한 항체 고정화용 융합단백질에 관한 것으로, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래의 단백질 A 또는 상기 단백질 A의 단편과 홍합접착단백질(mussel adhesive protein)을 포함하는 항체 고정화용 융합단백질에 관한 것이다. 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질은 홍합접착단백질이 고체 기질에 효과적으로 부착되어 단백질 A 또는 단백질 A의 단편이 항체와 효과적으로 결합할 수 있도록 유도할 수 있으며, 이에 결합된 항체는 항원과 결합이 가능한 방향으로 고정화될 수 있으므로, 면역반응용 바이오 칩 및 항원 검출방법에 유용하게 사용될 수 있다.

항체, 고정, 융합단백질, 홍합, 단백질 A

Description

신규한 항체 고정화용 융합단백질{Novel immobilizing fusion protein for effective and oriented immobilization of antibody on surfaces}

본 발명은 신규한 항체 고정화용 융합단백질에 관한 것으로, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래의 단백질 A 또는 상기 단백질 A의 단편과 홍합접착단백질(mussel adhesive protein)을 포함하는 항체 고정화용 융합단백질에 관한 것이다.

항체를 기반으로 한 생물학적 정량 기술 (antibody-based bioassay)은 항원에 대한 항체의 높은 특이성과 친화력에 기인하는 생체물질간의 상호작용 분석을 위한 주요한 기술 중 하나이다. 이를 위하여 금, 유리, 고분자 기반의 표면과 같은 고체 기질 상에 항체를 고정화시키고 항원과 항체의 상호작용을 측정하게 되며, 따라서 고체 기질 상에 효율적으로 항체를 고정화하는 것은 매우 중요하다.

항체를 고체 기질상에 고정화 시키기 위한 많은 기술들이 개발되었으며, 그 중 물리적 흡착 방법 (physical adsorption method)이 가장 먼저 이용되었다. 그러나 상기 방법은 부착된 항체가 임의적인 방향성(random orientation)을 나타내고 변성되는 등 재연성이 매우 나쁜 문제점이 지적되었다(Ferretti S et al., Self- assembled monolayers: a versatile tool for the formulation of bio-surfaces. Trends Anal. Chem., 19; 530-540, 2000).

상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 항체 고정화 기술로 공유 고정화 기술 (covalent immobilization)이 있다. 그러나 상기 항체의 직접적인 공유 고정화 기술은 물리적 흡착 방법의 문제점을 어느 정도 개선하였지만, 여전히 부착된 항체가 임의적인 방향성(random orientation)을 나타내는 문제점이 지적되었다.

상기와 같이 임의의 방향성을 가진 항체의 항원 결합 능력은 바람직한 방향성을 가진 항체의 항원 결합 능력과 비교하였을 때 2 내지 3배 정도 감소하는 것을 보인다(Cho IH et. al., Site-directed biotinylation of antibodies for controlled immobilization on solid surfaces. Anal. Biochem. 365; 14-23, 2007: Kang JH et. al., Improving immunobinding using oriented immobilization of an oxidized antibody. J. Chromatogr. A 116; 9-14, 2007).

상기 문제점을 해결하기 위해 개선된 공유 고정화 방법들이 개발되었다. 예를 들어, 항체의 탄수화물(carbohydrate) 이나 이황화 결합(disulfide bond)을 이용하여 부위 특이적(site-specific)으로 항체를 고정화하는 방법이 개발되었다(Neves-petersen MT et. al., Photonic activation of disulfide bridges achieves oriented protein immobilization on biosensor surfaces. Protein Sci. 15: 343-351, 2006).

그러나 상기 방법은 부위 특이적으로 항체를 표면에 고정화함으로써 바람직한 방향성을 유지하지만, 항체를 표면에 고정화하기 전에 항체에 탄수화물 산화과 정이나 이황화 결합을 끊는 과정과 같은 전처리 과정을 거쳐야 하기 때문에, 항체가 변형(modification)되어 항체의 항원 결합 능력이 감소되는 문제점이 있다.

따라서 항체를 전혀 변형시키지 않으면서 항체를 고체 기질에 고정화시키기 위한 방법의 개발이 절실히 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래의 단백질 A 또는 상기 단백질 A의 단편과 홍합접착단백질(mussel adhesive protein)을 포함하는 융합단백질이 항체를 효과적으로 고정화할 수 있음을 밝혀 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래의 단백질 A 또는 상기 단백질 A의 단편과 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 홍합접착단백질(mussel adhesive protein)을 포함하는 항체 고정화용 융합단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 항체 고정화용 융합단백질이 포함된 면역반응용 바이오 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 바이오 칩을 준비하는 단계, 상기 바이오 칩에 검출 대상의 항원에 대한 항체를 고정화하는 단계, 상기 고정화된 항체를 포함하는 바이오 칩에 시료를 반응시키는 단계 및 항원-항체반응 여부를 측정하는 단계를 포함하는 항원 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래의 단백질 A 또는 상기 단백질 A의 단편과 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 홍합접착단백질(mussel adhesive protein)을 포함 하는 항체 고정화용 융합단백질을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 항체 고정화용 융합단백질이 포함된 면역반응용 바이오 칩을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 바이오 칩을 준비하는 단계, 상기 바이오 칩에 검출 대상의 항원에 대한 항체를 고정화하는 단계, 상기 고정화된 항체를 포함하는 바이오 칩에 시료를 반응시키는 단계 및 항원-항체반응 여부를 측정하는 단계를 포함하는 항원 검출방법을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 항체 고정화용 융합단백질은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래의 단백질 A 또는 상기 단백질 A의 단편과 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 홍합접착단백질(mussel adhesive protein, MAP)을 포함한다.

상기 황색포도상구균 유래의 단백질 A는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있으며;

상기 단백질 A의 단편은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열 중에서 연속하는 50 내지 500개의 아미노산으로 이루어진 서열을 가질 수 있으며, 보다 바람직하게는 58 내지 500개의 아미노산으로 이루어진 서열을 가질 수 있다. 상기 단백질 A의 단편이 50개 미만인 경우 항체 고정화 효율이 떨어지므로, 상기 단백질 A의 단편은 50 내지 500개의 아미노산으로 이루어진 서열로 구성되는 것이 바람직하다.

더 바람직하게는 상기 단백질 A의 단편은 서열번호 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 A 도메인, 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 B 도메인, 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 C 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 D 도메인 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 E 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 B 도메인 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 C 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 13의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 13의 아미노산 서열은 황색포도상구균 유래의 단백질 A의 B와 C도메인이 결합된 BC도메인의 아미노산 서열이다(Ulhen M. et. al., Stapylococcal protein A consists of five IgG-binding domains. Eur. J. Biochem. 156; 637-643, 1986).

본 발명의 항체 고정화용 융합단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 홍합접착단백질(mussel adhesive protein, MAP)의 N말단 또는 C말단에 상기 단백질 A 또는 상기 단백질 A의 단편이 결합된 것일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 홍합접착단백질의 N말단 또는 C말단에 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 단백질 A의 BC 도메인을 융합하여 제조할 수 있으며, 더 바람직하게는 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 홍합접착단백질의 N말단에 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 단백질 A의 BC 도메인을 융합하여 제조할 수 있으며, 가장 바람직하게는 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 홍합접착단백질에 상기 단백질 A 또는 단백질 A의 단편을 결합시켜 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질을 제조하기 위해서는 당업계에서 사용되는 융합 단백질의 제조방법을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 특별히 제한되지는 않는다. 그러나 바람직하게는 홍합접착단백질의 유전자가 삽입된 벡터에 상기 단백질 A 또는 단백질 A의 단편의 유전자를 추가 삽입하고, 이를 형질전환체에 주입한 다음 발현을 유도함으로써 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질을 제조할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 서열번호 6의 홍합접착단백질의 서열을 근거로 프라이머 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머를 제조하여 PCR로 증폭시키고, 증폭된 홍합접착단백질 유전자를 벡터에 삽입하여 pET-MAP를 제작한 다음, 단백질 A의 B 도메인 및 C 도메인 서열을 근거로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 제조하여 PCR로 증폭시키고, 증폭된 BC 도메인 유전자를 pET-MAP 벡터에 삽입하여 pET-BC-MAP 벡터를 제작한다. 이 때 추후 정제를 용이하게 하기 위하여 BC-MAP 융합단백질의 C-말단에 히스티딘 태그(Histidine tag)가 융합되도록 한다(<실시예 1> 내지 <실시예 2> 참조).

상기와 같이 제조된 벡터를 형질전환체, 바람직하게는 대장균에 삽입하여 발현시키고 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 23.5kDa 크기의 BC-MAP 융합단백질을 제조할 수 있다(<실시예 3> 참조).

본 발명의 항체 고정화용 융합단백질은 항체와 항원이 잘 결합할 수 있도록, 항체를 바람직한 방향으로 항체를 고정화시킬 수 있다. 구체적으로 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질은 항체의 FC 부위와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 A 및 단백질 A의 단편과 다양한 고체 기질에 접착할 수 있는 활성이 있는 홍합접착단백질이 융합되어 있어, 항체를 항원과 결합이 가능한 방향으로 고정화시킬 수 있다.

본 발명의 일실험예에서 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질의 항체 고정화 활성이 매우 우수함을 홍합접착단백질만을 사용한 경우와 단백질 A의 단편(BC 도메인)만을 사용한 경우와 비교한 결과, 홍합접착단백질만을 사용한 경우 0.9%, 단백질 A의 단편만을 사용한 경우 4.4%이었으나 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질을 사용한 경우 20%의 획기적인 항체 고정화 효율을 나타낸다(<실험예 1> 참조).

따라서 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질은 홍합접착단백질이 고체 기질에 효과적으로 부착되어 단백질 A 또는 단백질 A의 단편이 항체와 효과적으로 결합할 수 있도록 유도할 수 있으며, 이에 결합된 항체는 항원과 결합이 가능한 방향으로 고정화될 수 있다(도 1 참조).

한편 본 발명의 면역반응용 바이오 칩은 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질이 포함된 것이다.

상기 면역반응용 바이오 칩은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질이 고체 기질에 고정된 것일 수 있다.

상기 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질이 고체 기질에 고정되는 것은 융합단백질에 포함된 홍합접착단백질에 의한 것이며, 홍합접착단백질이 고체 기질에 제한 없이 접착될 수 있으므로, 상기 고체 기질은 바이오 칩에 사용되는 것이라면 한정되지 않는다. 그러나 바람직하게는 금, 유리, 변형된 실리콘, 테트라플루오로에틸렌(tetrafluoroethylene), 폴리스티렌(polystyrene) 및 폴리프로필렌(polyprophylene) 등 흔히 사용되는 중합체나 겔 등을 사용할 수 있다. 또한 상기 기판의 표면은 중합체, 플라스틱, 수지, 탄수화물, 실리카, 실리카 유도물질, 탄소, 금속, 무기 유리 및 막 등으로 표면 처리될 수 있다. 상기 기판은 지지체로서의 역할 뿐 아니라, 고정된 항체와 항원 간의 결합 반응이 일어나는 장소를 제공한다. 상기 기판의 규격 및 기판 상에 고정되는 위치, 크기 및 모양은 분석의 목적, 점적 기기(spotting machine) 및 스캐너(scanner) 등의 장치에 따라 변화될 수 있다.

한편 본 발명의 항원 검출방법은 상기 본 발명의 바이오 칩을 준비하는 단계, 상기 바이오 칩에 검출 대상의 항원에 대한 항체를 고정화하는 단계, 상기 고정화된 항체를 포함하는 바이오 칩에 시료를 반응시키는 단계 및 항원-항체반응 여부를 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 항원을 검출하는 방법에는 본 발명의 바이오 칩을 사용하는 것 이외에 당업계에 공지된 방법이 적용될 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 바이오 칩 상의 고정화된 항체를 시료, 바람직하게는 환자로부터 채취한 혈액 또는 체액 등과 반응시켜 항원-항체 반응 여부를 확인함으로써 항원을 검출할 수 있다. 상기 항원-항체 반응 여부를 확인하기 위해서 항체의 종류에 따라 각각 다른 발색 물질을 사용할 수 있으며, 동시에 여러 색의 형광을 사용하여 여러 종류의 항원을 검색할 수도 있다.

상기 검출 대상이 되는 항원은 면역분석 방법에 의하여 검출 가능한 모든 생체활성물질(bioactive materials)로서 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 자가항체(autoantibody), 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 항원을 포함하는지 여부 또는 그 농도를 측정하기 위한 대상 시료는 어떤 처리도 거치지 않은 상태로 사용되거나 적당한 완충용액에 의해서 희석된 상태로 사용될 수 있다. 적당한 시간 동안 인큐베이션한 후, 포획항체와 미처 결합하지 못한 표적 물질 및 결합이 가능하지 않은 시료 내 다른 물질은 다음 단계 수행 전에 세척하여 제거하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.

한편 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질 발현용 벡터는 프로모터와 이와 작동 가능하게 연결된 본 발명의 융합단백질를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단백질 A 또는 단백질 A의 단편과 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 홍합접착단백질이 융합된 단백질을 암호화하는 것이라면, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 15의 염기서열을 가질 수 있다. 상시 서열번호 15는 단백질 A의 BC 도메인과 상기 홍합접착단백질이 융합된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열이다.

상기 본 발명의 항체 고정화용 융합단백질 발현용 벡터는 가장 바람직하게는 2a에 기재된 개열지도를 가지는 벡터일 수 있다.

상기 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 상기 프로모터는 형질전환용으로 사용되는 것이라면 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 대장균에서 기능할 수 있는 프로모터를 사용할 수 있으며 보다 바람직하게는 T7 프로모터를 사용할 수 있다.

또한 상기 ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.

아울러, 본 발명의 벡터에는 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

한편 본 발명의 형질전환체는 본 발명의 벡터로 형질전환된 것이며, 상기 형질전환체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 대장균일 수 있다.

상기 '형질전환'은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

상기 벡터를 이용한 형질전환 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며 바람직하게는 열충격 방법을 이용할 수 있다(Doskocil J et. Al., Increased transformation frequency in E.coli. Biochem Biophys Res Commun 82: 477-483, 1978).

본 발명의 항체 고정화용 융합단백질은 홍합접착단백질이 고체 기질에 효과적으로 부착되어 단백질 A 또는 단백질 A의 단편이 항체와 효과적으로 결합할 수 있도록 유도할 수 있으며, 이에 결합된 항체는 항원과 결합이 가능한 방향으로 고정화될 수 있으므로, 면역반응용 바이오 칩 및 항원 검출방법에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

BC 단백질 및 BC - MAP 융합단백질의 발현 벡터 제작

<1-1> BC 단백질의 발현 벡터 제작

BC 단백질 발현을 위한 벡터를 제작하기 위하여 Staphylococcus aureus (기 탁번호: ATCC 6538)에서 얻은 유전체를 주형으로 하여, 서열번호 1의 BC-N 프라이머와 서열번호 5의 BC-C 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 유전자를 pET22b(+)(Novagen, 미국) 벡터의 NdeI과 XhoI 제한효소 자리에 삽입하여 도 2b에 기재된 바와 같이 pET-BC 벡터를 제조하였다.

상기 BC 단백질에는 분리, 정제 및 확인을 용이하게 하기 위해 C-말단에 히스티딘 태그(histidine tag)가 포함될 수 있도록 하였다.

<1-2> BC - MAP 단백질의 발현 벡터 제작

BC-MAP 융합단백질 발현을 위한 벡터를 제작하기 위해서 우선 pET-MAP 벡터를 제작하였다. pMDG05(D.S. Hwang 등, 2004, Applied and Environmental Microbiology, 70, 3352-3359)를 주형으로 하여 서열번호 3의 MAP-N 프라이머와 서열번호 4의 MAP-C 프러이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 유전자를 pET22b(+)(Novagen, 미국)의 NcoI과 XhoI 제한효소 자리에 삽입하여 pET-MAP 벡터를 제작하였다.

상기 제작된 pET-MAP에 BC 단백질을 암호하는 DNA 서열을 삽입하기 위하여 Staphylococcus aureus(ATCC 6538)의 유전체를 주형으로 하여 서열번호 1의 BC-N 프라이머와 서열번호 2의 BC-C 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 상기 증폭된 유전자를 pET-MAP의 NdeI과 NcoI 제한효소 자리에 삽입하여 도 2a에 기재된 바와 같이 pET-BC-MAP를 제작하였다(도 2a 참조).

상기 BC-MAP 융합단백질에는 분리, 정제 및 확인을 용이하게 하기 위해 C-말 단에 히스티딘 태그(histidine tag)가 포함될 수 있도록 하였다.

< 실시예 2>

BC 단백질과 BC - MAP 융합단백질을 발현시키는 형질전환체의 제조

BC 단백질과 BC-MAP 융합단백질을 발현시키는 형질전환체를 제조하기 위하여, 통상적인 클로닝으로 많이 사용되는 대장균 TOP10 (Invitrogen)과 단백질 발현용으로 사용된 대장균 BL21(DE3)를 CaCl₂ 버퍼를 사용하여 반응력 있는(competent) 세포를 만든 다음, 42℃에서 2분간 방치하는 열충격 방법을 통해 플라스미드를 숙주세포에 삽입되도록 하였다. 이후 형질전환된 콜로니의 선별을 위해 플라스미드의 특성상 앰피실린 (ampicillin, Sigma)을 사용하였다.

또한 상기 <실시예 1>에서 제작된 벡터들은 널리 이용되는 대장균 발현용 프로모터인 T7 프로모터를 포함하도록 하였고 IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside, Sigma, 미국)를 이용하여 발현을 유도하였다.

< 실시예 3>

SDS - PAGE 를 통한 단백질 발현 확인 및 정제

상기 <실시예 2>의 각 균주들을 발현시키는 배지로서 50g/ml 농도의 암피실린이 첨가된 LB배지를 이용하였다. 단백질의 발현을 위하여 배양액의 흡광도 (absorbance)가 600nm에서 0.8~0.9정도가 되었을 때 유도물질인 IPTG를 첨가 (1mM) 하였다.

상기 균주를 10시간 동안 37℃ 배양기에서 배양한 뒤 회수하였다. 배양된 세포를 4000rpm에서 10분간 원심 분리하였고 상등액을 제거하고 세포를 회수한 뒤 pH 8.0 용해 용액(lysis buffer, 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM imidazole)에 부유시킨 다음 초음파 해체기(sonicator)를 이용해 파쇄하였다. BC 단백질과 BC-MAP 융합단백질의 발현 여부를 SDS-PAGE 상에서 확인하기 위해 파쇄된 샘플의 일부를 전세포 파쇄액(whole cell lysate), 수용성 분액(soluble fraction) 그리고 불용성 분액으로 나누었다. 나머지 전세포 파쇄액은 9000rpm에서 50분간 원심분리하여 상등액만을 회수하였다. 그 상등액은 히스태그 컬럼(His-tag column)을 이용하여 수용성 분액으로 발현되는 BC 단백질과 BC-MAP 융합단백질을 분리 정제하였다.

각 분액들과 정제된 샘플을 SDS-PAGE 용 버퍼 (0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 10% 글리세롤, 5% SDS, 5% 베타-메르캅토에탄올, 0.25% 브로모페놀블루)에 희석한 후 100℃에서 5분간 끓여 변성시켰다. 이 시료를 15% SDS-폴리 아크릴아미드 겔에 전기영동하여 그 결과를 도 4a 및 도 4b에 기재하였다.

상기 도 3a 및 도 3b에 기재한 바와 같이, BC 단백질과 BC-MAP 융합단백질은 대부분 수용성 분액으로 발현된다는 것과 BC 단백질과 BC-MAP 융합단백질이 약 95% 정도의 순도로 정제됨을 확인할 수 있다.

< 실험예 1>

BC - MAP 융합단백질의 항체 고정화 활성

BC-MAP 융합단백질의 항체 고정화 능력을 평가하기 위해 수정진동자마이크로밸런스 장치(모델명:QCM200, 제조사: Stanford Research Systems)를 이용하였다. 상기 수정진동자마이크로밸런스는 수정진동자(quartz crystal)의 진동수 변화를 측정함으로써 단위면적당 흡착되는 물질의 질량을 측정하는 장치이다. 따라서 표면에서 일어나는 상호작용을 진동수 변화로 분석할 수 있다.

상기 실험을 하기 전에 금으로 코팅된 수정진동자를 자외선에 20분 동안 노출시켜 깨끗하게 하고 250ul 주입 루프(injection loop)를 사용하여 샘플 용액 및 운반체 용액(1X phosphophate buffered saline, PBS(pH7.4))을 10ul/min으로 주입하였다.

BC-MAP 융합단백질이 항체와 결합할 때 홍합접착단백질이 영향을 미치는지에 대해 알아보기 위해 대조군으로 홍합접착단백질(0.2mg/ml)을 사용하였고 그 농도는 BC 단백질과 BC-MAP 융합단백질보다 높은 농도를 사용하였다. BC 단백질(0.12 mg/ml)과 BC-MAP 융합단백질(0.2 mg/ml)은 같은 몰 농도(8.5μM)를 사용하였고 항체로 사용한 항-DsRed 항체(Anti-DsRed antibody)는 0.13μM(20 μg/ml)의 몰 농도를 사용하였다.

BC 단백질과 BC-MAP 융합단백질이 코팅되어 있는 금 표면에 결합하는 항체의 단위 면적당 분자 수 대 금 표면에 결합한 BC 단백질과 BC-MAP 융합단백질의 단위 면적당 분자 수를 비교함으로써 항체 결합 효율을 평가하고 그 효율로 BC 단백질과 BC-MAP 융합단백질 중 어느 것이 항체와 결합하는 BC 도메인을 표면으로 잘 배열하였는지(well-oriented BC domain on bare gold)를 평가하였다. BC 도메인이 표면으 로 잘 배열되어 있다면, 항체와 결합할 수 있는 확률이 높아지게 되고 그 확률이 높을수록 항체와 항원 간의 상호작용을 향상시킬 수 있다. 항체와 항원이 상호작용이 잘 이루어진다는 것은 항체가 알맞은 방향으로 고정화되어 있다는 것을 의미한다.

구체적으로 금으로 코팅된 수정진동자를 유동 셀(flow cell)에 장착하고 수정진동자의 진동수가 안정화될 때까지 기다린 후, 수정진동자의 진동수가 안정화 되었을 때 각각 금으로 코팅된 수정진동자에 홍합접착단백질, BC 단백질 그리고 BC-MAP 융합단백질을 10ul/min으로 넣어주어 그 표면에 홍합접착단백질, BC 단백질 그리고 BC-MAP 융합단백질이 결합하도록 하고, 상기 실험 결과를 도 4a 및 도 4c에 기재하였다.

상기 도 4a 와 도 4c를 보면, 홍합접착단백질(MAP)의 경우 70 Hz의 진동수가 변화하였고 단위 면적 당 금 표면에 결합한 분자 수는 5.13*10¹³(molecule/cm²)이었으며, BC 단백질의 경우 23 Hz의 진동수가 변화하였고 단위 면적 당 금 표면에 결합한 분자 수는 1.69*10¹³(molecules/cm²)이었다. 그러나 BC-MAP 융합단백질 경우 38Hz의 진동수가 변화하였고, 단위면적 당 금 표면에 결합한 분자 수는 1.78*10¹³(molecules/cm²)이었다.

또한 홍합접착단백질, BC 단백질 그리고 BC-MAP 융합단백질을 처리한 후 반응하지 않은 자리에 비특이적인 항체의 흡착이 일어나는 것을 막기 위해 0.1% 소 혈청 알부민을 각각 홍합접착단백질, BC 단백질 그리고 BC-MAP 융합단백질이 코팅 된 표면에 처리하였다. 소 혈청 알부민을 처리한 후 20ug/ml의 항-DsRed 항체를 반응시켜 그 결과를 도 4b 및 도4c에 기재하였다.

상기 도 4b와 도 4c를 보면, 홍합접착단백질이 코팅된 표면에는 항-DsRed 항체를 반응시킨 후 7Hz의 진동수 변화하였고 4.96*10¹¹(molecules/cm²)의 단위면적 당 분자수가 결합하였으며 BC 단백질로 코팅된 표면에는 10.5Hz의 진동수가 변화하였고 항-DsRed 항체를 반응시킨 후 7.45*10¹¹(molecules/cm²)의 단위 면적당 분자수가 결합하였다. BC-MAP 융합단백질로 코팅된 표면에는 48Hz의 진동수가 변화하였고 항-DsRed 항체를 반응시킨 후 3.40*10¹²(molecules/cm²)의 단위 면적당 분자수가 결합하였다.

상기 결과를 종합하면, 홍합접착단백질, BC-MAP 융합단백질 그리고 BC 단백질은 각각 0.9%, 20% 그리고 4.4%의 항체 결합 효율을 보였다.

따라서 BC-MAP 융합단백질은 홍합접착단백질(MAP) 또는 BC 단백질에 비하여, BC 도메인이 표면으로 잘 배열될 수 있도록 함으로써 항체와 결합할 수 있는 확률을 높이고 항체와 항원 간의 상호작용을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.

도 1은 BC 단백질과 BC-MAP 융합단백질이 처리된 표면에서 항체 결합 능력의 차이를 비교한 개략도이다.

도 2a는 BC-MAP 융합단백질을 발현시키는 pET-BC-MAP 벡터의 개열지도이다.

도 2b는 BC 단백질를 발현시키는 pET-BC 벡터의 개열지도이다.

도 3a는 23.5kDa 크기의 BC-MAP 융합단백질 발현여부를 확인한 SDS-PAGE 겔 사진이다(M: 분자량 표지, 1: 전세포 파쇄액, 2: 수용성 분액, 3: 불용성 용액 및 4: 정제된 샘플).

도 3b는 14.5kDa 크기의 BC 단백질 발현여부를 확인한 SDS-PAGE 겔 사진이다(M: 분자량 표지, 1: 전세포 파쇄액, 2: 수용성 분액, 3: 불용성 용액 및 4: 정제된 샘플).

도 4a는 금 표면에 결합된 홍합접착단백질(MAP), BC-MAP 융합단백질 및 BC 단백질의 진동수 변화를 나타낸 그래프이다.

도 4b는 금 표면에 결합된 홍합접착단백질(MAP), BC-MAP 융합단백질 및 BC 단백질이 코팅된 표면에 결합된 항체의 진동수 변화를 나타낸 그래프

도 4c는 금 표면에 결합된 홍합접착단백질(MAP), BC-MAP 융합단백질 및 BC 단백질의 표면 밀도 및 상기 단백질이 코팅된 표면에 결합된 항체의 표면 밀도를 나타낸 도표이다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Novel immobilizing fusion protein for effective and oriented immobilization of antibody on surfaces <130> DPP20095435 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for BC protein <400> 1 gcgccatatg gcggataaca aattcaacaa agaacaac 38 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for BC protein <400> 2 gcgcccatgg ttttggtgct tgagcatcgt ttagc 35 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for MAP protein <400> 3 gggcccatgg ggtggcggag ggagctctga agaatataaa g 41 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for MAP protein <400> 4 cgcgctcgag gctgctgccg ccataatatt ttttatag 38 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for BC protein <400> 5 gcgcctcgag ttttggtgct tgagcatcgt ttagc 35 <210> 6 <211> 75 <212> PRT <213> mussel adhesive protein <400> 6 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 7 <211> 500 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 7 Met Lys Lys Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Arg Lys Leu Gly Val Gly Ile 1 5 10 15 Ala Ser Val Thr Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser Gly Gly Val Thr Pro 20 25 30 Ala Ala Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 35 40 45 Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe 50 55 60 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly 65 70 75 80 Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln 85 90 95 Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 100 105 110 Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 115 120 125 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys 130 135 140 Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys 145 150 155 160 Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn 165 170 175 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 180 185 190 Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln 195 200 205 Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe 210 215 220 Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly 225 230 235 240 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu 245 250 255 Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn 260 265 270 Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu 275 280 285 Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys 290 295 300 Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 305 310 315 320 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys 325 330 335 Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys 340 345 350 Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys 355 360 365 Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys 370 375 380 Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys 385 390 395 400 Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn 405 410 415 Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp 420 425 430 Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val 435 440 445 Val Asp Lys Lys Gln Pro Ala Asn His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln 450 455 460 Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val 465 470 475 480 Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg 485 490 495 Arg Arg Glu Leu 500 <210> 8 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 8 Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 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Ser Leu Lys Ile Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 12 <211> 59 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 12 Ala Asp Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Ile Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Asn Arg Asn Gly Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Ile Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 13 <211> 116 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 13 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn 50 55 60 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80 Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 85 90 95 Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 100 105 110 Gln Ala Pro Lys 115 <210> 14 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 14 Met Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe 50 55 60 Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn 65 70 75 80 Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp 85 90 95 Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp 100 105 110 Ala Gln Ala Pro Lys Pro Trp Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Glu Tyr 115 120 125 Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly 130 135 140 Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr 145 150 155 160 Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr 165 170 175 Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys 180 185 190 Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu His His His His His His 195 200 205 <210> 15 <211> 618 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein <400> 15 atggcggata acaaattcaa caaagaacaa caaaatgctt tctatgaaat cttacattta 60 cctaacttaa acgaagaaca acgcaatggt ttcatccaaa gcttaaaaga tgacccaagc 120 caaagcgcta accttttagc agaagctaaa aagctaaatg atgcacaagc accaaaagct 180 gacaacaaat tcaacaaaga acaacaaaat gctttctatg aaattttaca tttacctaac 240 ttaactgaag aacaacgtaa cggcttcatc caaagcctta aagacgatcc ttcagtgagc 300 aaagaaattt tagcagaagc taaaaagcta aacgatgctc aagcaccaaa accatggggt 360 ggcggaggga gctctgaaga atataaaggc ggctattatc cgggcaacac ctaccattat 420 cattctggcg gcagctatca tggctctggc tatcatggcg gctataaagg caaatattat 480 ggcaaagcga aaaaatatta ttataaatat aaaaacagcg gcaaatataa atatctgaaa 540 aaagcgagaa aatatcatag aaaaggctat aaaaaatatt atggcggcag cagcctcgag 600 caccaccacc accaccac 618

Claims

황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래의 단백질 A 또는 상기 단백질 A의 단편과 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 홍합접착단백질(mussel adhesive protein)을 포함하는 항체 고정화용 융합단백질로서, 상기 단백질 A의 단편은 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 A 도메인, 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 B 도메인, 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 C 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 D 도메인 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 E 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 항체 고정화용 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 단백질 A는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 항체 고정화용 융합단백질.
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제1항에 있어서, 상기 단백질 A의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 B 도메인 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 C 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 항체 고정화용 융합단백질.
제5항에 있어서, 상기 단백질 A의 단편은 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 BC 도메인인 것인 항체 고정화용 융합단백질.
제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 홍합접착단백질(mussel adhesive protein)의 N말단 또는 C말단에 단백질 A 또는 상기 단백질 A의 단편이 결합된 것인 항체 고정화용 융합단백질.
제7항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 항체 고정화용 융합단백질.
제1항의 항체 고정화용 융합단백질이 포함된 면역반응용 바이오 칩.
제9항에 있어서, 상기 융합단백질이 고체 기질에 고정된 것인 바이오 칩.
제9항의 바이오 칩을 준비하는 단계;

상기 바이오 칩에 검출 대상의 항원에 대한 항체를 고정화하는 단계;

상기 고정화된 항체를 포함하는 바이오 칩에 시료를 반응시키는 단계 및

항원-항체반응 여부를 측정하는 단계를 포함하는 항원 검출방법.
프로모터와 이와 작동 가능하게 연결된 제1항의 융합단백질를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항체 고정화용 융합단백질 발현용 벡터.
제12항에 있어서, 제1항의 융합단백질를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15의 염기서열을 가지는 벡터.
제12항에 있어서, 상기 벡터는 도 2a에 기재된 개열지도를 가지는 것인 벡터.
제12항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제15항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균인 형질전환체.