KR102253359B1 - 신규한 융합 단백질-기반 나노입자 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 융합 단백질-기반 나노입자 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102253359B1
KR102253359B1 KR1020190036045A KR20190036045A KR102253359B1 KR 102253359 B1 KR102253359 B1 KR 102253359B1 KR 1020190036045 A KR1020190036045 A KR 1020190036045A KR 20190036045 A KR20190036045 A KR 20190036045A KR 102253359 B1 KR102253359 B1 KR 102253359B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tyr
lys
pro
gly
ser
Prior art date
Application number
KR1020190036045A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190113677A (ko
Inventor
차형준
양장우
정연수
조윤기
Original Assignee
포항공과대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 포항공과대학교 산학협력단 filed Critical 포항공과대학교 산학협력단
Publication of KR20190113677A publication Critical patent/KR20190113677A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102253359B1 publication Critical patent/KR102253359B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 홍합 접착 단백질-기반 나노입자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 홍합 접착 단백질에 기능성 펩타이드가 융합된, 유전자 또는 약물 전달용 융합 단백질; 상기 융합 단백질을 기반으로 하는 유전자 또는 약물 전달용 융합 단백질-기반 나노입자의 제작 방법; 상기 방법에 의해 제작된 유전자 또는 약물 전달용 융합 단백질-기반 나노입자; 및 상기 나노입자를 이용한 CRISPR/CAS9 유전자 편집 시스템을 제공한다. 본 발명에 따른 융합 단백질을 기반으로 한 유전자 또는 약물 전달용 나노입자는 유전자 전달을 위한 기능성 펩타이드가 홍합 접착 단백질에 융합되어 있어 생체적합성이 우수하고, 표적 세포 내로 효과적으로 침투하므로, CRISPR/CAS9 유전자 편집 시스템 뿐만 아니라 생체재료 기반의 유전자 편집용 전달체 및 목적 약물을 담지하여 전달하는 약물 전달체로서 다양한 질환의 치료 및 연구에 활용할 수 있다.

Description

신규한 융합 단백질-기반 나노입자 및 이의 용도{A Noble Fusion Protein-based Nanoparticles and Uses Thereof}
본 발명은 신규한 융합 단백질-기반 나노입자 및 이의 용도에 관한 것이다.
유전자편집기술 중 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템은 CRISPR 단백질, cas9 단백질, gRNA로 구성되며 원하는 DNA 서열을 정확하게 잘라낼 수 있는 시스템으로 Zinc Finger나 TALEN에 비교하여 편집의 정확도와 적용가능 범위가 매우 넓은 유전자 편집기술이다.
CRISPR/CAS9 단백질과 gRNA를 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 벡터에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 대부분 아데노 부속 바이러스(addeno-associated virus)에 국한되고 있으며, 안전성의 문제로 인하여 임상으로의 적용에 한계가 있다.
유전자 전달의 효율을 증대시키기 위하여 유전자 결합 펩타이드(DNA binding peptide), 세포투과성 펩타이드(cell penetrating peptide) 또는 핵위치 신호(Nuclear localization signal) 등의 기능성 펩타이드를 벡터에 연결하여 활용하는 연구가 많이 수행되고 있다. 유전자 결합 펩타이드는 주로 양이온성의 아미노산으로 이루어져 있어 음이온성의 유전자와 결합할 수 있어 벡터의 유전자 담지 능력을 향상시킬 수 있다. 세포투과성 펩타이드는 주로 막-이동 서열(membrane-translocating sequence)나 단백질 투과 도메인(protein transduction domain)으로부터 유도되어 단백질, DNA, RNA 등의 고분자 물질을 세포막의 손상 없이 세포 내로 이동시킬 수 있어 벡터의 세포유입을 증대시킬 수 있으며, 핵위치 신호는 핵의 내부로 선택적으로 수송하는 아미노산 서열로, 벡터와 유전자를 보다 효율적으로 핵 내부로 전달할 수 있어 유전자 전달을 위한 기능성 펩타이드로서 각광받고 있다.
다이온 결합(Polyion complex)은 양전하를 여러 개 띄는 고분자와 음전하를 여러 개 띄는 고분자를 이용하여 그 분자들 간의 정전기적 인력을 통해 분자들을 자가 조립(Self-assembly)시키는 방법이다. 이 방법은 고분자들로 새로운 물질을 만들고자 할 때 화학적 촉매제나 효소, 빛, 열 등의 외부 요인을 필요로 하지 않기 때문에 생체에 사용되는 재료를 만드는 기술로 사용되고 있다.
또한, 이러한 전하를 띄는 고분자 물질과 함께 생체 내에서 전하를 띄는 생체활성물질인 치료용 단백질과 유전자와 이온 복합체를 형성하여 약물을 전달하는 연구가 진행되고 있다. K. Kataoka 등은 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리-L-리신(poly-L-lysine)의 블록 공중합체와 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리-L-아스파테이트(poly-L-aspartate)의 블록 공중합체를 함께 사용하여, 서로 다른 전하를 지닌 고분자 간의 이온결합을 이용하여 나노입자를 만드는 폴리온 복합미셀 'polyion complex (PIC) micelle'이라는 개념을 제시한 바 있다(참조: A. Harada and K. Kataoka, Macromolecules , 28, 5294 (1995)).
홍합 접착 단백질은 홍합의 족사에서 유래된 단백질로 뛰어난 접착능과 생체 적합성을 지닌다. 이러한 성질로 인체 내에서 면역반응을 일으키지 않기 때문에 하이드로젤, 나노섬유, 나노입자 등의 제형으로 가공하여 여러 병증의 치료에 사용한 예가 있다.
본 발명자들은 이전의 연구에서, 홍합단백질을 응용한 생체접착소재가 대장균을 이용한 대량 생산이 가능하여 충분한 재료 확보가 가능하고 체내의 습한 환경에서 접착력과 생체적합성, 생분해성이 우수하다는 것을 확인한 바 있다(국제특허공개 WO2006/107183 또는 WO2005/092920).
그러나, 홍합 접착 단백질과 철 이온을 이용한 나노입자를 생체 내 물질 전달에 사용가능함이 확인되었으나, 다이온 결합을 이용한 나노입자 제조에 대해서는 보고된 바가 없으며, 유전자 편집을 위한 벡터로의 활용은 보고된 적이 없다.
본 발명자들은 목적 유전자 및/또는 약물을 세포 내에 효과적으로 전달할 수 있는 전달체를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 홍합 접착 단백질에 기능성 펩타이드 융합시킨 후 티로신 잔기를 DOPA(dihydroxyphenylalanine)로 변환시킨 융합 단백질을 제작하였다. 또한, 상기 융합 단백질에 음전하를 지닌 폴리전해질(polyelectrolyte)을 처리하여, 상기 융합 단백질에서 양전하를 지닌 라이신 잔기와 음전하를 지닌 폴리전해질 간의 다이온 결합을 유도하고 가교를 위한 별도의 재료 없이 전기방사법을 통해 나노입자를 제작하였고, 상기 제작된 나노입자는 목적 물질의 전달체로서 효과적으로 목적 물질을 타겟 세포 내에 전달할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 홍합 접착 단백질에 기능성 펩타이드가 융합된, 유전자 또는 약물 전달용 융합 단백질을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 유전자 또는 약물 전달용 융합 단백질-기반 나노입자의 제작 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 따라 제작된, 유전자 또는 약물 전달용 융합 단백질-기반 나노입자를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질-기반 나노입자를 포함하는, CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템을 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명에 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 홍합 접착 단백질(Mussel Adhesive Protein, MAP)에 유전자 전달용 기능성 펩타이드를 융합시킴으로써 제작된, 홍합 접착 단백질에 유전자 전달용 기능성 펩타이드가 연결된 재조합 홍합 접착 단백질인 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 홍합 접착 단백질에 유전자 전달을 위한 기능성 펩타이드가 연결된 융합 단백질을 기반으로 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 홍합 접착 단백질은 전체 티로신 잔기의 10 내지 100%가 도파(DOPA)로 변형된 것이다.
대부분의 홍합 접착 단백질의 전체 아미노산 서열에서 티로신이 차지하는 비중은 약 20-30%이다. 천연 홍합 접착 단백질 내의 티로신은 수화 과정을 통하여 -OH 기가 첨가되어 도파의 형태로 변환된다. 그러나, 대장균에서 생산된 홍합 접착 단백질은 티로신 잔기들이 변환되어 있지 않으므로, 별도의 효소 및 화학적 처리 방법에 의하여 티로신 잔기를 도파로 변환시키는 수정 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 홍합 접착 단백질에 포함된 티로신 잔기를 도파로 수정하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 티로시나아제를 사용하여 티로신 잔기를 도파 잔기로 수정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 버섯 티로시나아제를 이용한 in vitro 효소 반응을 통해 상기의 도파 전환율을 만족시키는 홍합 접착 단백질을 생산하였다.
본 발명에서, "홍합 접착 단백질"은 홍합에서 유래한 접착 단백질로, 바람직하게는, 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus)에서 유래한 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및 Mgfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 fp(foot protein)-1 (서열번호 1), fp(foot protein)-1 변이체 (서열번호 3), fp-2 (서열번호 4), fp-3 (서열번호 5), fp-4 (서열번호 6), fp-5 (서열번호 7), 및 fp-6 (서열번호 8)로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 상기 군에서 선택된 1 종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 국제공개번호 제 WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다.
상기 홍합 접착 단백질은 fp-151(서열번호 9), fp-131(서열번호 10), fp-353(서열번호 11), fp-153(서열번호 12), fp-351(서열번호 13) 등의 융합 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합 접착단백질은 fp-1(서열번호 1)에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드(서열번호 2)가 1 내지 12회 또는 그 이상으로 연속하여 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열번호 2의 데카펩타이드가 12회 연속하여 연결된 fp-1 변이체 폴리펩타이드(서열번호 3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 홍합 접착 단백질은 접착력을 유지하는 전제 하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단이나 아미노 말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD (Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는, RGD(Arg Gly Asp), RGDS(Arg Gly Asp Ser), RGDC(Arg Gly Asp Cys), RGDV(Arg Gly Asp Val), RGDSPASSKP(Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro), GRGDS(Gly Arg Gly Asp Ser), GRGDTP(Gly Arg Gly Asp Thr Pro), GRGDSP(Gly Arg Gly Asp Ser Pro), GRGDSPC(Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys) 및 YRGDS(Tyr Arg Gly Asp Ser)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 기능성 펩타이드는 유전자 전달 기능을 갖는 펩타이드로서, 유전자 결합 펩타이드(DNA binding peptide, DBP), 세포투과성 펩타이드(Cell penetrating peptide, CPP), 페너트라틴(penetratin), 핵위치 신호(Nuclear localization signal, NLS) 및 T-ag 펩타이드로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기'유전자 결합 펩타이드'는 유전자와 결합할 수 있는 DBP 펩타이드(Nicole M. Moore, Clayton L. Sheppard, Shelly E. Sakiyama-Elbert, 2009. Acta Biomaterialia 5: 854-864)일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 유전자 결합 활성을 나타내는 한, 임의의 유전자 결합 펩타이드를 이용할 수 있다.
본 발명에서, '세포투과성 펩타이드'는 9mer arginine (polyR) 펩타이드(Wender P. A., Mitchell D. J., Pattabiraman K., Pelkey E. T., Steinman L. and Rothbard J. B. 2000. PNAS 97: 13003-13008)나 penetratin 펩타이드(Kaplan, I.M. et al. 2005. J. Control, Release 102: 247-253)일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 세포막을 효율적으로 투과할 수 있는 세포 투과 활성을 나타내는 한, 임의의 세포투과성 펩타이드를 이용할 수 있다.
본 발명에서, '핵위치 신호 펩타이드'는 SV40(Gorlich D, Kutay U. Annu Rev Cell Dev Biol 1999. 15:607-60), T-ag(Hui-Yuan Wang, Jing-Xiao Chen, Yun-Xia Sun, Ji-Zhe Deng, Cao Li, Xian-Zheng Zhang, Ren-Xi Zhuo. 2011. Journal of Controlled Release 155: 26-33)일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 핵 내에 물질을 전달할 수 나타내는 한, 임의의 핵위치 신호 펩타이드를 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 유전자 또는 약물 전달용 융합 단백질-기반 나노입자의 제작 방법 및 이에 의해 제작된 유전자 또는 약물 전달용 융합 단백질-기반 나노입자를 제공한다:
(a) 상기 융합 단백질 및 상기 융합 단백질과 다이온 결합(Polyion complex)이 가능한 폴리전해질(polyelectrolyte)을 혼합하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 혼합물에 나노입자 내에 적재되는 목적 유전자 또는 약물을 혼합하여 전기방사하는 단계.
상기 나노입자는 상기 융합 단백질의 라이신 잔기의 양전하와 음전하를 지닌 폴리전해질(polyelectrolyte)의 다이온 결합을 통해 가교를 이룰 수 있다.
상기 폴리전해질은 폴리포스페이트인 것이 바람직하나, 다이온 결합을 유도할 수 있는 조성물로 음전하를 가진 유전자, 단백질, 고분자, 또는 다당류 역시 이용할 수 있으며, 구체적으로 트리폴리인산(TPP), 히아루론산(Hyaluronic acid, HA), 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA) 등 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 폴리포스페이트는 소듐 트리폴리포스페이트(TPP), 소듐 피로포스페이트(PP), 소듐 트리메타포스페이트(STP), 및 소듐 헥사메타포스페이트(SHMP)로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종이나, 이에 제한되지 않고, 본 발명의 융합 단백질과 다이온 결합(Polyion complex)을 형성할 수 있는 한, 임의의 폴리포스페이트를 이용할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질-기반 나노입자는, 생체 내외에 전달시키고자 하는 목적 물질을 담지 또는 적재할 수 있는 한, 임의의 물질도 전달하여 목적 효과를 달성할 수 있다.
바람직하게는, 목적 유전자 또는 약물이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유전자는 플라스미드, mRNA, RNA, DNA 또는 이의 조합인 것일 수 있다.
상기 약물은 저분자량 약물, 유전자 약물, 단백질 약물, 항체 약물, 합성화합물 약물 또는 이의 조합일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로는, 상기 저분자량 약물은 독소루비신, 닥디토마이신, 미토마이신, 블레오마이신, 시타라바인, 아자세르진, 메클로레타민, 시클로포스파마이드, 트라이에틸렌멜라민, 트레오설판, 레티노익산, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 아스피린, 살리실레이트, 이부프로펜, 플루르비프로펜, 피록시캄, 나프로센, 페노프로펜, 인도메타신, 페닐부타존, 메소트렉세이트, 메클로에타민, 덱사메타손, 프레드니솔론, 셀레콕시브, 발데콕시브, 니메슐리드, 코르티손, 및 코르티코스테로이드 등일 수 있다.
상기 유전자(gene) 약물은 작은 간섭 리보핵산(small interfering RNA, siRNA), 작은 헤어핀 리보핵산(small hairpin RNA, shRNA), 마이크로 리보핵산(microRNA, miRNA), 플라스미드 데옥시리보핵산(plasmid DNA) 등일 수 있고, 상기 단백질 (protein) 약물 은 단일클론 항체(monoclonal antibody)계의 트라스트주맵(trastuzumab), 리투시맵(rituximab), 베바시주맵(bevacizumab), 세투시맵(cetuximab), 보테조밉(bortezomib), 엘로티닙(erlotinib), 제피티닙(gefitinib), 이매티닙 메실레이트(imatinib mesylate), 수니티닙(sunitinib); 효소(enzyme)계의 L-아스파라지나제(L-asparaginase); 호르몬(hormone)계의 트리톨레린 아세테이트(triptorelin acetate), 메제스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 플루타미드(flutamide), 비카루타마이드(bicalutamide), 고세레린(goserelin); 시토크롬 씨(cytochrome c), p53 단백질 등일 수 있다. 특히 상기 약물은 항암 효과가 있는 독소루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플레틴, 카보플래틴, 5-FU, 에토포시드, 및 캄토테신 등의 항암제일 수 있다.
또한, 본 발명의 나노입자에는 인체의 세포나 조직과 상호작용을 통하여 세포의 성장과 분화를 촉진시키고 아울러 조직의 재생과 회복을 도와주는 작용에 관여하는 각종 생리활성물질들이 쉽게 적재되거나 부착될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "생리활성물질"은 각종 생체분자들을 총칭하며 세포, 단백질, 핵산, 당, 효소 등을 포함한다. 상기 생리활성물질은 세포, 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 단당류, 올리고당류, 지방산, 핵산일 수 있고, 바람직하게는 세포일 수 있다.
상기 "세포"는 원핵세포 및 진핵세포를 포함한 모든 세포일 수 있고, 일 예로 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 지방질줄기세포(adipose stem cell), 조골세포(osteoblast), 치주인대세포(periodontal ligament cell), 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 섬유세포(fibroblast), 간세포(hepatocyte), 신경세포(neurons), 암세포(cancer cell), B cell, 백혈구세포(white blood cell) 등을 포함한 면역세포 및 배아세포 등일 수 있다.
이 외에도, 생리활성물질은 핵산 물질로서 플라스미드 핵산, 당 물질로서 히아루론산, 헤파린 황산염, 콘드로이틴 황산염, 알진염, 단백질 물질로서 호르몬 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 나노 입자의 크기는 평균 지름 80 ~ 130 nm인 범위일 수 있으며, 바람직하게는 110nm일 수 있다. 이러한 크기는 상기 나노 복합체가 표적 세포로 이동하기에 적절하며, 인체에 투입될 때에는 주사, 경구, 피부 등 다양한 방법을 통해 전달될 수 있다. 적재된 약물은 치료 효과적인 질환 상태 또는 증상이 있는 사람 또는 기타 포유동물에 적합하게는 주사 또는 기타 다른 방법으로 전달될 수 있지만, 특히, 비경구로 전달되는 것이 바람직하다. 비경구란 근육내, 복막내, 복부내, 피하, 정맥 및 동맥내를 의미한다. 그러므로, 본 발명의 나노입자는 대표적으로 주사 제형으로 제제될 수 있다. 본 발명의 주사가능한 나노입자는 임의의 적합한 방법, 바람직하게는 피하 바늘을 통한 주사에 의해 사람 또는 기타 포유 동물의 체내에 주사 또는 삽입할 수 있다. 예를 들면, 주사 또는 기타 다른 방식으로 동맥내, 정맥내, 비뇨생식기, 피하, 근육내, 피하, 두개내, 심장막내, 흉막내, 또는 기타 신체강 또는 가능한 공간내로 투여할 수 있다. 또는, 카테터 또는 시린지를 통해 예를 들어 관절경 시술 동안에 관절내로, 또는 비뇨생식관내로, 맥관내로, 구개내로 또는 흉막내, 또는 신체내 임의의 체강 또는 가능한 공간내로, 수술, 외과, 진단 또는 중재 시술 도중에 도입할 수 있다.
본 발명의 홍합 접착 단백질 및 목적 유전자 또는 약물을 다양한 비율로 혼합하여 전기방사를 통해 복합체 나노입자를 제조할 수 있다.
예컨대, 융합 단백질(mMAP-DBP) 및 pgLuc의 경우, 1: 0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:1 내지 8:1 (w/w)의 비율로 혼합한 후, 전기방사를 통하여 복합체 나노입자를 제조할 수 있다
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계의 혼합물과 유전자 또는 약물을 혼합한 후, 이를 전기방사하여 복합체 나노입자를 제조하는 단계이다. 전기방사공정은 고분자 용액이나 용융된 고분자를 소정 전압으로 하전시킬 때 발생하는 전기적 인력 및 척력을 이용하여 나노입자를 형성시키는 기술이다. 전기방사공정은 수 nm ~ 수천 nm 크기의 다양한 직경을 갖는 나노입자를 제조할 수 있으며, 장비 구조가 간단하고, 광범위한 재료에 적용이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 전기방사공정을 수행하기 위하여, 융합 단백질, 폴리전해질 및 유전자를 물 기반의 용매에 용해시킬 수 있다. 유기 용매 대신에 물 기반의 용매를 사용함으로써 전기방사동안 남아있는 용매의 독성 효과를 배제할 수 있다. 상기 물 기반의 용매는 증발성을 향상시키기 위하여, 유기 용매를 더 혼합할 수 있으며, 바람직하게는 증류수에 대해 60~80% (v/v)의 에탄올을 더 혼합할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 나노입자를 포함하는 약학적 조성물을 제공할 수 있는데, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 나노입자는 생체적합성이 우수할 뿐 아니라, 효과적인 세포내 주입 및 유전자 편집 효과를 통해 생체 내외 전달체로서의 활용가능성을 입증하였다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 홍합 접착 단백질(Mussel Adhesive Protein, MAP)에 기능성 펩타이드가 연결된 융합 단백질; 상기 융합 단백질과 다이온 결합(Polyion complex)이 가능한 폴리전해질(polyelectrolyte); 및 적재되는 목적 유전자;를 포함하는 유전자 전달용 융합 단백질-기반 나노입자를 포함하는, CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 fp-1 폴리펩타이드의 라이신 잔기를 이용한 다이온 결합을 통한 CRISPR/Cas9 유전자 편집체 전달용 나노입자를 제공한다.
상기 목적 유전자는 CRISPR/Cas9 체제의 구성물질에 해당하는 것이 바람직하다. 상기 CRISPR/Cas9 구성물질은 단백질, mRNA, plasmid 등으로 이루어진 Cas9; gRNA의 유전정보를 가진 plasmid나 gRNA; donor DNA 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명의 나노입자는 CRISPR/Cas9 체제의 구성물질을 담지하여 유전자 치료제 형태로도 응용할 수 있다.
상기 나노입자의 크기는 평균 지름 100 ~ 200 nm인 범위일 수 있으며, 이러한 크기는 상기 나노입자가 표적 세포막을 투과하기에 적절하며, 인체에 투입될 때에는 주사, 경구, 피부 등 다양한 방법을 통해 전달될 수 있으며, 유전질환에 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
따라서, 상기 본 발명의 융합 단백질을 이용한 gRNA와 Cas9 단백질의 유전정보를 가진 유전자를 담지한 나노입자 및 상기 본 발명의 나노입자를 이용한 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템으로 활용하는 방법을 제공할 수 있다.
결론적으로, 본 발명의 제조방법으로 제조된 본 발명의 융합 단백질 및 이를 기반으로 하는 나노입자는, 효과적인 목적 유전자 또는 약물의 전달이 가능하기 때문에 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템, 약물전달체 등의 다양한 생의학적 응용이 가능하다.
본 발명에 따른 융합 단백질을 기반으로 한 유전자 또는 약물 전달용 나노입자는 유전자 전달을 위한 기능성 펩타이드가 홍합 접착 단백질에 융합되어 있어 생체적합성이 우수하고, 표적 세포 내로 효과적으로 침투하므로, CRISPR/CAS9 유전자 편집 시스템 뿐만 아니라 생체재료 기반의 유전자 편집용 전달체 및 목적 약물을 담지하여 전달하는 약물 전달체로서 다양한 질환의 치료 및 연구에 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 CRISPR/Cas9 유전자 편집체 전달을 위한 홍합 접착 단백질 기반 다이온 결합(Polyion complex)에 의한 나노입자의 제작 및 상기 나노입자 속 담지된 두 플라스미드의 발현을 통해 CRISPR/Cas9 유전자 편집체가 작동하여 원하는 유전자를 편집하는 기작을 나타내는 모식도이다.
도 2는 홍합 접착 단백질 기반의 유전자 전달용 융합단백질의 발현을 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 홍합 접착 단백질의 DOPA 및 티로신 잔기의 peak intensity를 보여준다.
도 4는 홍합 접착 단백질과 Luciferase gRNA (guide RNA) 를 발현하는 플라스미드(plasmid) 유전자의 복합체를 질소와 인의 상대적 비율(N/P ratio)에 따라 전기영동으로 나타낸 사진이다.
도 5는 Cas9 단백질과 EGFP-gRNA (Enhanced Green Fluorescent Protein-Guide RNA) 유전자를 내재한 플라스미드들을 함유한 홍합 접착 단백질 기반 나노입자의 SEM 관찰결과이다.
도 6은 HEK 293 세포에 mCherry peptide가 달린 Cas9 단백질 유전자를 내재한 플라스미드(plasmid Cas9-mCherry, pCas9-mCherry)를 홍합 접착 단백질 기반의 나노입자(mMAP@pCas9-mCherry NPs)를 통해 전달했을 때 mCherry-Cas9이 발현됨을 보여주는 공초점 현미경(Confocal microscope) 결과이다.
도 7은 EGFP가 주입된 MDA-MB-231-Luc-GFP 세포에 Cas9 단백질 유전정보를 담은 플라스미드(plasmid Cas9, pCas9)과 EGFP-gRNA유전자(gGFP)를 내재한 플라스미드(plasmid gGFP, pgGFP)들을 함유한 홍합 접착 단백질 기반 나노입자 (mMAP@pCas9/pgGFP NPs)를 통해 전달했을 때 MDA-MB-231-Luc-GFP 세포에서 EGFP 단백질의 발현이 감소했음을 보여주는 형광 현미경(Fluorescence microscope) 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 제시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 기능성 펩타이드-홍합 접착 단백질 기반의 나노입자를 제조하기 위하여 하기와 같은 실험을 순차적으로 수행하였다.
본 발명의 나노입자를 제조하기 위한 전체적인 실험의 개요를 도 1에 나타내었다.
실시예 1. 홍합 접착 단백질-기능성 펩타이드 융합단백질 제조
본 발명자들은 홍합 접착 단백질에 유전자 전달을 위한 기능성 펩타이드가 연결된 융합 단백질을 다음과 같이 제조하였다.
먼저, 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 fp-1 중에서 80번 정도 반복되는 10개의 아미노산(AKPSYPPTYK)으로 구성된 데카펩타이드(decapeptide)가 12회 반복 연결된 데카펩타이드로 구성된 홍합 접착 단백질 fp-1(Mytilus mussel foot protein type 1) 변이체(서열번호 3)를 공지된 절차에 따라 준비하였다(참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2010, 107, 12850-3).
또한, 유전자 전달을 위한 기능성 펩타이드(표 1)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 프라이머를 제작하고, 상기와 같이 제조된 홍합 접착 단백질 fp-1 변이체에, 중합효소연쇄반응을 이용하여 연결하였다. 본 발명에 이용된 유전자 전달을 위한 기능성 펩타이드는 다음과 같다:
(i) 유전자 결합 펩타이드(DNA binding peptide, DBP)(Nicole M. Moore, Clayton L. Sheppard, Shelly E. Sakiyama-Elbert, 2009. Acta Biomaterialia 5: 854-864);
(ii) 세포투과성 펩타이드(Cell penetrating peptide, CPP)인 9mer 아르기닌(arginine)(polyR)(Wender P. A., Mitchell D. J., Pattabiraman K., Pelkey E. T., Steinman L. and Rothbard J. B. 2000. PNAS 97: 13003-13008); 및
(iii) 페너트라틴(penetratin)(Kaplan, I.M. et al. 2005. J. Control, Release 102: 247-253).
서열번호 펩타이드 아미노산 서열
14 DBP KWKWKKA
15 polyR RRRRRRRRR
16 penetratin RQIKIWFQNRRMK
또한, 상기 본 발명에 이용된 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
서열번호 프라이머 서열(5'→ 3')
17 fp-1 변이체 정방향 CATATGGCGAAACCGAGC
18 DBP 역방향 CTCGAGTTACGCTTTTTTCCATTTCCATTTCTTGTACGTTGGAGGATAAGAAG
19 polyR 역방향 CTCGAGTTAGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGCTTGTACGTTGGAGGATAAGAAG
20 Penetratin 역방향 CTCGAGTTATTTTTTCCATTTCATGCGGCGGTTCTGAAACCAAATTTTAATCTGGCGCTTGTACGTTGGAGGATAAGAAG
T7 프로모터를 포함하는 pET-22b(+) 벡터를 플라스미드 운반체로 사용하여, 각 플라스미드(MAP-DBP, MAP-PolyR, MAP-penetratin)를 대장균 TOP10 균주에 형질전환하였다. 또한, 융합 단백질의 발현을 위하여, 클로닝된 재조합 벡터를 대장균 BL21 (DE3) 균주에 다시 형질전환하였다(이하, 재조합 융합 단백질 MAP-DBP 및 재조합 융합 단백질 MAP-PolyR로 표기).
MAP-DBP, MAP-PolyR 유전자로 형질전환된 대장균 균주를 50μg/ml의 암피실린(ampicillin)을 포함하는 LB 액체배지에서 37℃, 300 rpm의 조건으로 배양하였으며, 600 nm에 대한 광학 밀도(optical density; OD600)가 0.4 내지 0.6 수준에 이르렀을 때, 1 mM의 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 동일 조건에서 8 시간 배양하였다. 이렇게 배양된 세포는 4℃, 18,000 X g의 조건에서 10분 동안 원심분리하였으며, 용출 버퍼(10 mM Tris-HCl, 및 100 mM sodium phosphate, pH 8)에 재부유하여 200 Kpsi의 조건에서 세포 파쇄를 진행하였다. 이를 통해 얻은 세포 용해물(cell lysate)로부터 세포 파괴물(cell debris)를 얻어내기 위하여 4℃, 18,000 X g의 조건에서 20 분 동안 원심분리하였으며, 25%(v/v) 아세트산을 이용하여 목적 융합 단백질을 추출하고, 최종적으로 정제된 융합 단백질은 동결건조를 거친 후 -80℃에서 보관하였다. 단백질에 대한 생산 및 정제는 12%(w/v) SDS-PAGE를 통해 분석하고, 단백질의 농도는 Bradford assay(Bio-Rad)를 통해 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 홍합 접착 단백질-기능성 펩타이드 융합단백질이 성공적으로 발현되었음을 확인하였다.
특히, 이중 재조합 융합 단백질 MAP-DBP 및 재조합 융합 단백질 MAP-PolyR이 현저하게 발현되었고, MAP-penetratin은 발현되었으나 용매인 물에 잘 용해되지 않아 이하 실시예에서는 MAP-DBP 및/또는 MAP-PolyR을 사용하였다.
실시예 2. 목적 유전자를 내재한 홍합 접착 단백질 나노입자 제조
2.1. DOPA-변환된 홍합 접착 단백질 m MAP-DBP, m MAP-PolyR 및 pCas9, pgRNA 플라스미드 유전자 준비
본 발명자들은 목적 유전자를 내재한 기능성 펩타이드-홍합 접착 단백질-기반 나노입자를 제조하기 위하여, DOPA 잔기가 티로신 잔기에 비해 생체 내 접착성을 높일 수 있기 때문에 티로신 잔기를 DOPA 잔기로 변형한 DOPA-변환된 홍합 접착 단백질 mMAP-DBP, mMAP-PolyR을 다음과 같이 제조하였다:
실시예 1에서 제작한 본 발명의 재조합 융합 단백질 MAP-DBP 및 MAP-PolyR에 티로시나제(mushiroom tyrosinase) 효소를 이용한 시험관내(in vitro) 효소 반응을 수행하여, 상기 MAP-DBP 및 MAP-PolyR 내에 존재하는 티로신 잔기를 DOPA(dihydroxyphenylalanine)로 변환하였다.
구체적으로는 1.50 mg/ml의 MAP 용액 및 100 μg/mL의 티로시나제를 버퍼용액 (100 mM 인산나트륨, 20 mM 붕산, 25 mM 아스코르브산, pH 6.8)에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1% 아세트산 용액을 이용하여 투석하였다.
이때, 도 3에 나타낸 바와 같이 DOPA 및 티로신 잔기의 peak intensity를 통해 전체 티로신 잔기 중 약 17%가 DOPA로 전환되었음을 확인하였다.
그 결과, 각 MAP-DBP 및 MAP-PolyR의 티로신 잔기가 DOPA(dihydroxyphenylalanine)로 변환된 mMAP-DBP, mMAP-PolyR가 제작되었다.
본 발명자들은 유전자 전달체를 통한 유전자 전달 효과를 확인하기 위해 플라스미드 형태의 pCas9-mCherry와 pgRNA-EGFP를 전달 물질로 선정했다. 이들은 모두 U6 프로모터를 사용하여 진핵생물에서 발현이 가능하며, pCas9-mCherry의 경우 mCherry 펩타이드로 인해 발현시 빨간색 형광을 띄어 Cas9의 발현여부를 확인하기 용이하다. 위 플라스미드들은 addgene(pU6-(BbsI)_CBh-Cas9-T2A-mCherry was a gift from Ralf Kuehn (Addgene plasmid # 64324; http://n2t.net/addgene:64324 ; RRID:Addgene_64324, EGFP gRNA (BRDN0000563266) was a gift from John Doench & David Root (Addgene plasmid # 80036; http://n2t.net/addgene:80036 ; RRID:Addgene_80036))을 통해 구매했으며, 각각 대장균 Top10균주에 형질전환 후 midi-prep방식을 통해 플라스미드를 확보하였다.
2.2. gRNA 플라스미드 유전자 적재 단백질 복합체 제조
본 발명자들은 목적 유전자를 내재한 기능성 펩타이드-홍합 접착 단백질-기반 나노입자를 제조하기 위하여, gRNA 플라스미드 유전자 적재 단백질 복합체를 다음과 같이 제조하였다:
상기 실시예 2.1.에서 제조한 mMAP-PolyR, mMAP-DBP를 이용하여 gRNA 플라스미드(plasmid) 유전자와 복합체를 제조하였다.
구체적으로, mMAP-PolyR, mMAP-DBP 용액에 pgLuc 유전자를 다양한 N/P (단백질(질소)/핵산(인)) 비율로 가한 후, 30 분간 반응시켰다. 이렇게 제조한 복합체를 1%(w/v) 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동을 20 분간 실시하였다. 이때, 대조군으로 mMAP를 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, mMAP-DBP-pgLuc의 경우 4:1의 N/P 비율, mMAP-PolyR-pgLuc의 경우 8:1의 N/P 비율에서 각각 성공적으로 복합체가 형성된 것을 확인하였다.
2.3. gRNA 플라스미드 유전자 적재 단백질 나노입자 제조
본 발명자들은 유전자를 내재한 기능성 펩타이드-홍합 접착 단백질-기반 나노입자를 제조하기 위하여, gRNA 플라스미드 유전자 적재 단백질 나노입자를 다음과 같이 제조하였다:
상기 실시예 2.1에서 제조한 mMAP-PolyR을 이용하여 pCas9 및 pgRNA 플라스미드 유전자 적재가 적재된 나노입자 복합체(mMAP-PolyR@pCas9-mCherry + pgRNA-EGFP NPs)를 제조하기 위하여 다이온 결합과 전기방사 기술을 이용하였다.
구체적으로, 증류수에 4wt%의 MAP를 용해하고, pCas9-mCherry, pgRNA-EGFP를 1:1로 섞어 MAP 용액과 8:1의 N/P 비율로 혼합하였다. 여기에 나노입자를 만드는데 충분한 분자간 다이온 결합(Polyion complx)을 형성시키기 위해 0.1% 소듐 트리폴리인산(tripolyphosphate, TPP) 용액을 첨가하였다. 상기 혼합 용액을 전기방사하였다.
전기방사는 상기 용액을 실린지 펌프를 이용해 0.5 ml/h의 속도로 내보내면서 0.45 mm의 지름을 가진 끝이 평평한 바늘을 통과할 때 9 kV의 고전압을 걸어주면서 나노입자를 생성시키는 방식으로 진행하였고, 생성된 나노입자를 인산완충식염수(PBS; pH 7.4)를 포함하는 교반 수조 또는 알루미늄 호일 위에 수거하여 SEM로 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유전자 적재 나노입자(Mussel Adhesive Protein Nanoparticles, MAP NPs)의 형성을 확인하였다.
실시예 3. 목적 유전자를 내재한 홍합 접착 단백질 나노입자의 in vitro 전달
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 제작된 본 발명의 목적 유전자를 내재한, 기능성 펩타이드-홍합 접착 단백질-기반 나노입자인 MAP NPs를 CRISPR/Cas9 시스템에 적용했을 때, 유전자 편집체가 실제 전달되는 지의 여부 및 이의 특성을 인 비트로 상에서 확인하였다.
먼저, HEK 293 세포를 배지 500ul당 2.0 X 105개 비율로 24 시간 동안 배양하였다. 여기에 본 발명의 기능성 펩타이드가 융합된 홍합 접착 단백질-기반 나노입자(mMAP-PolyR@pCas9-mCherry)를 투여하고 48 시간이 지난 후, 액틴(actin)을 특이적으로 염색하는 팔로이딘-FITC(Phalloidin-Fluorescein isothiocynate)를 사용하여 세포가 초록색 형광을 띄도록 하였다. 세포 표본을 공초점 현미경(Confocal microscope)을 통해 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Cas9-mCherry의 형광 발현을 확인하였고, 이는 본 발명의 기능성 펩타이드가 연결된 홍합 접착 단백질-기반 나노입자(mMAP-PolyR@pCas9-mCherry)가 세포내로 성공적으로 전달되었음을 제시한다.
또한, 본 발명자들은 Cas9-mCherry에 의한 유전자 편집 여부를 확인하고자 하였다.
이를 위해, EGFP가 유전자에 삽입되어 있는 MDA MB231 세포를 배지 500ul 당 2.0 X 105개 비율로 24 시간 동안 배양하였다. 여기에 본 발명의 기능성 펩타이드가 연결된 홍합 접착 단백질 기반 나노입자(mMAP-PolyR@pCas9-mCherry + pgRNA-EGFP, mMAP-PolyR@pCas9/pgGFP NPs)를 투여하고 48 시간이 지난 후, 세포 표본을 형광 현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, EGFP의 형광 발현 수준이 감소했음을 확인하였고, 이는 본 발명의 유전자를 내재한 홍합 접착 단백질-기반 나노입자(mMAP-PolyR@pCas9/pgGFP NPs)가 세포 내로 효과적으로 전달되어 CRISPR/Cas9 유전자 편집체가 작동하여 타겟 유전자를 편집하였음을 제시한다.
종합적으로, 본 발명에서는 기능성 펩타이드가 연결된 재조합 홍합 접착 단백질 융합체에, 별개의 가교처리없이, 전기방사처리를 통해 이루어진 재조합 융합 단백질의 라이신 잔기와 트리폴리인산(Tripolyphosphate, TPP)의 다이온 결합(Polyion complex)에 의해 접착성과 생체 적합성을 동시에 나타내는 단백질 기반의 신규한 나노입자를 제작하였다. 상기 제조된 나노입자를 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템에 적용했을 때 우수한 CRISPR/Cas9 유전자 편집체 전달 및 편집 효과를 달성한 바, 본 발명은 유전자 편집을 위한 벡터 시스템으로 활용할 수 있다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> A Noble Fusion Protein-based Nanoparticles and Uses Thereof <130> POSTECH1-58P-1 <150> KR 10-2018-0035610 <151> 2018-03-28 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 800 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 <400> 1 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 50 55 60 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 115 120 125 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 130 135 140 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 145 150 155 160 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 165 170 175 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 180 185 190 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 195 200 205 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 210 215 220 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 225 230 235 240 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 245 250 255 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 260 265 270 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 275 280 285 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 290 295 300 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 305 310 315 320 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 325 330 335 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 340 345 350 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 355 360 365 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 370 375 380 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 385 390 395 400 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 405 410 415 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 420 425 430 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 435 440 445 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 450 455 460 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 465 470 475 480 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 485 490 495 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 500 505 510 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 515 520 525 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 530 535 540 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 545 550 555 560 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 565 570 575 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 580 585 590 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 595 600 605 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 610 615 620 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 625 630 635 640 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 645 650 655 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 660 665 670 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 675 680 685 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 690 695 700 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 705 710 715 720 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 725 730 735 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 740 745 750 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 755 760 765 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 770 775 780 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 785 790 795 800 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment sequence derived from fp-1 <400> 2 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 variant <400> 3 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 50 55 60 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 115 120 <210> 4 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-2 <400> 4 Leu Phe Ser Phe Phe Leu Leu Leu Thr Cys Thr Gln Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 Thr Asn Arg Pro Asp Tyr Asn Asp Asp Glu Glu Asp Asp Tyr Lys Pro 20 25 30 Pro Val Tyr Lys Pro Ser Pro Ser Lys Tyr Arg Pro Val Asn Pro Cys 35 40 45 Leu Lys Lys Pro Cys Lys Tyr Asn Gly Val Cys Lys Pro Arg Gly Gly 50 55 60 Ser Tyr Lys Cys Phe Cys Lys Gly Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asn Cys Asn 65 70 75 80 Leu Lys Asn Ala Cys Lys Pro Asn Gln Cys Lys Asn Lys Ser Arg Cys 85 90 95 Val Pro Val Gly Lys Thr Phe Lys Cys Val Cys Arg Asn Gly Asn Phe 100 105 110 Gly Arg Leu Cys Glu Lys Asn Val Cys Ser Pro Asn Pro Cys Lys Asn 115 120 125 Asn Gly Lys Cys Ser Pro Leu Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Thr Cys 130 135 140 Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Val His Ala Cys Lys Pro 145 150 155 160 Asn Pro Cys Lys Asn Lys Gly Arg Cys Phe Pro Asp Gly Lys Thr Gly 165 170 175 Tyr Lys Cys Arg Cys Val Asp Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gln Glu 180 185 190 Asn Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Ser Asn Gly Gly Thr Cys Ser Ala 195 200 205 Asp Lys Phe Gly Asp Tyr Ser Cys Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Phe Gly 210 215 220 Pro Glu Cys Glu Arg Tyr Val Cys Ala Pro Asn Pro Cys Lys Asn Gly 225 230 235 240 Gly Ile Cys Ser Ser Asp Gly Ser Gly Gly Tyr Arg Cys Arg Cys Lys 245 250 255 Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Lys Val Asn Val Cys Lys Pro Thr 260 265 270 Pro Cys Lys Asn Ser Gly Arg Cys Val Asn Lys Gly Ser Ser Tyr Asn 275 280 285 Cys Ile Cys Lys Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gly Glu Asn Val 290 295 300 Cys Lys Pro Asn Pro Cys Gln Asn Arg Gly Arg Cys Tyr Pro Asp Asn 305 310 315 320 Ser Asp Asp Gly Phe Lys Cys Arg Cys Val Gly Gly Tyr Lys Gly Pro 325 330 335 Thr Cys Glu Asp Lys Pro Asn Pro Cys Asn Thr Lys Pro Cys Lys Asn 340 345 350 Gly Gly Lys Cys Asn Tyr Asn Gly Lys Ile Tyr Thr Cys Lys Cys Ala 355 360 365 Tyr Gly Trp Arg Gly Arg His Cys Thr Asp Lys Ala Tyr Lys Pro Asn 370 375 380 Pro Cys Val Val Ser Lys Pro Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Ile Trp 385 390 395 400 Asn Gly Lys Ala Tyr Arg Cys Lys Cys Ala Tyr Gly Tyr Gly Gly Arg 405 410 415 His Cys Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Lys Asn Pro Cys Ala Ser Arg Pro 420 425 430 Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Thr Asp Lys Gly Asn Gly Tyr Val Cys 435 440 445 Lys Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Gly Arg Tyr Cys Ser Leu Lys Ser Pro 450 455 460 Pro Ser Tyr Asp Asp Asp Glu Tyr 465 470 <210> 5 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-3 <400> 5 Pro Trp Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 6 <211> 750 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-4 <400> 6 Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Glu Pro Ser Gly Tyr Ala Asn Ile Gly His 1 5 10 15 Arg Arg Tyr Tyr Glu Arg Ala Ile Ser Phe His Arg His Ser His Val 20 25 30 His Gly His His Leu Leu His Arg His Val His Arg His Ser Val Leu 35 40 45 His Gly His Val His Met His Arg Val Ser His Arg Ile Met His Arg 50 55 60 His Arg Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Asn 65 70 75 80 His Val His Arg His Ser Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg 85 90 95 Val Leu His Arg His Val His Arg His Asn Val Leu His Gly His Val 100 105 110 His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu 115 120 125 His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Arg 130 135 140 His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu His Lys 145 150 155 160 His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Thr His Arg 165 170 175 Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys His Leu 180 185 190 His Lys His Gln Val Leu His Gly His Ile His Thr His Arg Val Leu 195 200 205 His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Thr 210 215 220 His Arg Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys 225 230 235 240 His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Met His Arg 245 250 255 Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys His Val 260 265 270 His Lys His His Val Val His Lys His Val His Ser His Arg Val Leu 275 280 285 His Lys His Val His Lys His Arg Val Glu His Gln His Val His Lys 290 295 300 His His Val Leu His Arg His Val His Ser His His Val Val His Ser 305 310 315 320 His Val His Lys His Arg Val Val His Ser His Val His Lys His Asn 325 330 335 Val Val His Ser His Val His Arg His Gln Ile Leu His Arg His Val 340 345 350 His Arg His Gln Val Val His Arg His Val His Arg His Leu Ile Ala 355 360 365 His Arg His Ile His Ser His Gln Ala Ala Val His Arg His Val His 370 375 380 Thr His Phe Glu Gly Asn Phe Asn Asp Asp Gly Thr Asp Val Asn Leu 385 390 395 400 Arg Ile Arg His Gly Ile Ile Tyr Phe Gly Gly Asn Thr Tyr Arg Leu 405 410 415 Ser Gly Gly Arg Arg Arg Phe Met Thr Leu Trp Gln Glu Cys Leu Glu 420 425 430 Ser Tyr Gly Asp Ser Asp Glu Cys Phe Val Gln Leu Leu Glu Gly Asn 435 440 445 Gln His Leu Phe Thr Val Val Gln Gly His His Ser Thr Ser Phe Arg 450 455 460 Ser Asp Leu Ser Asn Asp Leu His Pro Asp Asn Asn Ile Glu Gln Ile 465 470 475 480 Ala Asn Asp His Val Asn Asp Ile Ala Gln Ser Thr Asp Gly Asp Ile 485 490 495 Asn Asp Phe Ala Asp Thr His Tyr Asn Asp Val Ala Pro Ile Ala Asp 500 505 510 Val His Val Asp Asn Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asn His Val Lys Asn 515 520 525 Ile Ala Gln Thr Ala His His His Val Asn Asp Val Ala Gln Ile Ala 530 535 540 Asp Asp His Val Asn Asp Ile Gly Gln Thr Ala Tyr Asp His Val Asn 545 550 555 560 Asn Ile Gly Gln Thr Ala Asp Asp His Val Asn Asp Ile Ala Gln Thr 565 570 575 Ala Asp Asp His Val Asn Ala Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asp His Val 580 585 590 Asn Ala Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asp His Val Asn Asp Ile Gly Asp 595 600 605 Thr Ala Asn Ser His Ile Val Arg Val Gln Gly Val Ala Lys Asn His 610 615 620 Leu Tyr Gly Ile Asn Lys Ala Ile Gly Lys His Ile Gln His Leu Lys 625 630 635 640 Asp Val Ser Asn Arg His Ile Glu Lys Leu Asn Asn His Ala Thr Lys 645 650 655 Asn Leu Leu Gln Ser Ala Leu Gln His Lys Gln Gln Thr Ile Glu Arg 660 665 670 Glu Ile Gln His Lys Arg His Leu Ser Glu Lys Glu Asp Ile Asn Leu 675 680 685 Gln His Glu Asn Ala Met Lys Ser Lys Val Ser Tyr Asp Gly Pro Val 690 695 700 Phe Asn Glu Lys Val Ser Val Val Ser Asn Gln Gly Ser Tyr Asn Glu 705 710 715 720 Lys Val Pro Val Leu Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gly Lys Val Ser 725 730 735 Ala Leu Ser Asp Gln Gly Ser Tyr Asn Glu Gly Tyr Ala Tyr 740 745 750 <210> 7 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-5 <400> 7 Lys His His His His His His Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr 1 5 10 15 Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly 20 25 30 Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys 35 40 45 Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys 50 55 60 Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Ser Ser <210> 8 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-6 <400> 8 Ile Ala Ala Leu Cys Gly Ile Val Lys Ser Ile Asp Ser Asp Asp Ser 1 5 10 15 Asp Tyr Asp Tyr Lys Gly Arg Gly Tyr Cys Thr Asn Lys Gly Cys Arg 20 25 30 Ser Gly Tyr Asn Tyr Phe Gly Asn Lys Gly Tyr Cys Lys Tyr Gly Glu 35 40 45 Lys Ser Tyr Thr Tyr Asn Cys Asn Ser Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro 50 55 60 Arg Asn Pro Tyr Gly Lys Leu Lys Tyr Tyr Cys Thr Asn Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Cys Pro Asn Asn Tyr Tyr Phe Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Leu 85 90 95 Glu His His His His His His 100 <210> 9 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-151 <400> 9 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ser Ser 50 55 60 Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His 65 70 75 80 Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser 100 105 110 Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly 115 120 125 Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala Lys Pro Ser Tyr 130 135 140 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 145 150 155 160 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 165 170 175 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 180 185 190 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 195 200 <210> 10 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-131 <400> 10 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala Asp 50 55 60 Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn 65 70 75 80 Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn 85 90 95 Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 115 120 125 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 130 135 140 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 145 150 155 160 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 165 170 <210> 11 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-353 <400> 11 Pro Trp Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Pro Trp Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr 50 55 60 Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly 65 70 75 80 Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys 85 90 95 Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr 100 105 110 His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala 115 120 125 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 130 135 140 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn 145 150 155 160 Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser 165 170 175 <210> 12 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-153 <400> 12 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ser Ser 50 55 60 Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His 65 70 75 80 Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser 100 105 110 Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly 115 120 125 Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Tyr Gly 130 135 140 Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg 145 150 155 160 Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys 165 170 175 Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser 180 185 <210> 13 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-351 <400> 13 Pro Trp Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Pro Trp Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr 50 55 60 Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly 65 70 75 80 Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys 85 90 95 Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr 100 105 110 His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala 115 120 125 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 130 135 140 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 145 150 155 160 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 165 170 175 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 180 185 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DBP <400> 14 Lys Trp Lys Trp Lys Lys Ala 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polyR <400> 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> penetratin <400> 16 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 variant primer F <400> 17 catatggcga aaccgagc 18 <210> 18 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DBP primer R <400> 18 ctcgagttac gcttttttcc atttccattt cttgtacgtt ggaggataag aag 53 <210> 19 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polyR primer R <400> 19 ctcgagttag cggcggcggc ggcggcggcg gcggcgcttg tacgttggag gataagaag 59 <210> 20 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Penetratin primer R <400> 20 ctcgagttat tttttccatt tcatgcggcg gttctgaaac caaattttaa tctggcgctt 60 gtacgttgga ggataagaag 80

Claims (11)

  1. 융합 단백질-기반 나노입자를 포함하는 유전자 전달체로서,
    상기 융합 단백질-기반 나노입자는,
    서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 홍합 접착 단백질(Mussel Adhesive Protein, MAP)에, 기능성 펩타이드가 연결된 융합 단백질과, 상기 단백질에 다이온 결합(Polyion complex)이 가능한 폴리전해질(polyelectrolyte)을 혼합한 후 목적 유전자를 적재시켜 전기 방사하여 제작되고;
    상기 융합 단백질은, 티로신 잔기가 도파(DOPA)로 전환된 것이며;
    상기 기능성 펩타이드는, 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 유전자 결합 펩타이드(DNA binding peptide, DBP), 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 세포투과성 펩타이드(Cell penetrating peptide, CPP) 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 페너트라틴(penetratin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 폴리전해질은 폴리포스페이트인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 폴리포스페이트는 소듐 트리폴리포스페이트(TPP), 소듐 피로포스페이트(PP), 소듐 트리메타포스페이트(STP), 및 소듐 헥사메타포스페이트(SHMP)로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 목적 유전자는 플라스미드, mRNA, RNA, DNA 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
KR1020190036045A 2018-03-28 2019-03-28 신규한 융합 단백질-기반 나노입자 및 이의 용도 KR102253359B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20180035610 2018-03-28
KR1020180035610 2018-03-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190113677A KR20190113677A (ko) 2019-10-08
KR102253359B1 true KR102253359B1 (ko) 2021-05-18

Family

ID=68208481

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190036045A KR102253359B1 (ko) 2018-03-28 2019-03-28 신규한 융합 단백질-기반 나노입자 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102253359B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090186413A1 (en) 2007-12-31 2009-07-23 Postech Academy-Industry Foundation Mussel adhesive protein as gene delivery

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101250923B1 (ko) * 2010-08-05 2013-04-04 포항공과대학교 산학협력단 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자로 형성된 코아세르베이트
KR101141737B1 (ko) * 2009-11-11 2012-05-03 포항공과대학교 산학협력단 신규한 항체 고정화용 융합단백질
KR101722503B1 (ko) * 2015-03-13 2017-04-04 포항공과대학교 산학협력단 홍합 접착 단백질을 이용한 약물전달용 pH-반응성 나노입자 및 이의 제조방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090186413A1 (en) 2007-12-31 2009-07-23 Postech Academy-Industry Foundation Mussel adhesive protein as gene delivery

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOTECHNOL. BIOENG. 2009; VOL.102, P. 616_623

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190113677A (ko) 2019-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Raymond et al. Multicomponent peptide assemblies
KR100608558B1 (ko) 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드 및 이의 용도
KR101095841B1 (ko) 표적 선택적 세포／조직 투과기능 활성을 가지는 펩타이드 및 그 용도
JP5416901B2 (ja) 興味のある分子の細胞内位置決めのためのベクターとして用いられるマウロカルシン由来ペプチド
Unzueta et al. Release of targeted protein nanoparticles from functional bacterial amyloids: A death star-like approach
Debabov et al. Recombinant spidroins as the basis for new materials
CN106906230B (zh) 重组药物载体蛋白基因及其制备方法与应用
KR20190019872A (ko) 표적특이적으로 물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 엑소좀
Huber et al. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials
Jallouk et al. Modifications of natural peptides for nanoparticle and drug design
JP3282130B2 (ja) ホメオボックス・ペプチドを含む新規な神経親和性成長因子
Wang et al. Peptide gene delivery vectors for specific transfection of glioma cells
KR100935030B1 (ko) 새로운 세포투과성 펩타이드 및 이를 이용한 생물학적 활성물질의 전달 방법
KR102253359B1 (ko) 신규한 융합 단백질-기반 나노입자 및 이의 용도
KR101064914B1 (ko) 자가면역질환, 알러지성 질환 및 염증성 질환 치료용 약제 조성물 및 이의 전달 방법
KR102274999B1 (ko) 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도
US8940868B2 (en) Elastin based growth factor delivery platform for wound healing and regeneration
KR101636538B1 (ko) 인간 ＮＬＢＰ 유래의 ＮＰ2 폴리펩티드 또는 ｄＮＰ2 폴리펩티드를 포함하는 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템
CN106957370B (zh) 一种可在肿瘤细胞内引发毒性的多肽
KR101595063B1 (ko) 세포결합 서열, 헤파린 결합 도메인 및 오스테오칼신 도메인을 포함하는 융합단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물
KR101678740B1 (ko) 세포 부착활성 및 골분화 촉진활성을 나타내는 피브로넥틴 융합단백질
KR102398339B1 (ko) 일산화질소 전달용 융합 펩타이드 및 이의 용도
JP2020510645A (ja) 新規のプロテイントランスダクションドメイン及びその用途
US11364321B2 (en) Nano scale decoration of scaffold-free microtissue using functionalised gold nanostructures
KR100495138B1 (ko) 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant