KR100495138B1 - 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유기화합물과 공유결합함으로써 유기화합물의 식물세포 침투를 가능하게 하는 HIV-1 Tat 수송 도메인, Tat 벡터, 식물세포 내로 침투 가능하고 식물 세포 내에서 활성을 나타내는 Tat 융합단백질, 그 융합단백질을 발현시키는 발현벡터 등에 관한 것이다.

Description

식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체{Plant cell transducing domain-cargo molecule complex}
본 발명은 식물체 또는 식물세포 내로 단백질 등의 유기화합물을 투과시킬 수 있는 식물세포 투과 도메인, 식물세포 투과 도메인-화물 분자 복합체 및 그 복합체를 세포 내로 도입시키는 방법에 관한 것이다.
근래에 인체 면역결핍 바이러스 (Hunan Immunodeficiency Virus type-1)가 발현하는 단백질의 하나인 Tat(transactivator of transcription) 단백질이 효율적으로 세포막을 통과하여 세포질 및 세포핵 내로 쉽게 이동한다는 것이 밝혀졌다 (Frankel and Pabo, 1988; Green and Loewenstein, 1988). 최근 오브알부민(ovalbumin), β-갈락토시다아제(galactosidase), 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 같은 이종 단백질을 HIV-1 Tat 단백질과 융합시켜 투여하였을 때 생체 각 조직 및 배양된 세포 내로 직접 운반된다는 것을 보여주었다 (Fawell et al., 1994; Schwartze et al., 1999). 이러한 기능은 Tat 단백질의 중간부위에 위치하는 염기성 영역에 의하여 이루어지는 것으로 밝혀졌고 이 부분이 단백질 세포전달 영역(Protein Transduction Domain)으로 알려졌다(Nagahara et al., 1998; Vives et al, 1997). HIV-1 Tat 이외에도 안테나피디아 호메오도메인 (Anntennapedia Homeodomain)에서 유래된 펩타이드 등도 단백질을 세포 내로 전달시킬 수 있다고 보고되었다(Derossi et al., 1996). 이들에 의한 단백질 세포전달 기전은 정확히 알려지지 않았지만 단백질의 세포막 투과에는 특정 수용체나 운반체가 관여하지 않는 것으로 보이며 단백질 세포전달 부위가 직접 세포막의 지질 층과 작용함으로써 일어나는 것으로 이해하고 있다.
위에서 언급한 단백질 세포전달 능력을 가진 펩타이드들은 일반적으로 수개 내지 십수개의 아미노산 잔기를 갖고 있고 펩타이드들의 아미노산 구성을 살펴보면 양성전하를 갖는 아르기닌이나 라이신 잔기가 풍부하다는 것을 알 수 있다. 또한, 올리고아르기닌과 올리고라이신을 단백질에 공유결합시켜 단백질의 세포 내 전달 능력을 확인한 보고들이 있다.
상기 Tat 도메인에 관한 연구내용이 진전되어 현재 단백질 세포전달 영역에 재조합된 많은 단백질이 동물세포에 매우 효과적으로 투과되고 있다는 결과가 계속 보고되고 있다. 이 결과는 현재 유전자 치료(gene therapy)에 대응되는 단백질 치료(protein therapy)의 신개념으로 동물세포 및 조직에 단백질이 직접 투과되는 연구가 진행되고 있다. 일례로 항산화효소인 수퍼옥사이드 디스뮤테이스(superoxide dismutase; SOD)가 투과된 세포의 항산화 기능이 강화된 현상이 보고되었다. 향후 많은 유용 단백질이 질병의 치료 등 다양한 목적을 가지고 이용될 것으로 예견된다.
그러나, 상기 연구들은 모두 동물세포 또는 미생물세포를 대상으로 하여 이루어진 것이며, 아직까지 단백질을 식물세포 내로 직접 전달하는 시도는 없었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 다양한 생체 기능 단백질들에 식물세포로의 전달(투과) 능력이 있는 식물세포 투과 도메인을 공유결합시켜 복합체 또는 융합 단백질로 발현시키고 이를 식물세포 내로 운반하려는 것이다.
본 발명은 표적 식물세포 또는 세포 핵에 침투가 용이하지 않거나 또는 본래 유용한 속도로 표적 세포에 투입할 수 없는 생물학적으로 활성인 단백질, 핵산 및 기타 분자를 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 화물 분자의 세포내 전달은 5개 내지 12개의 염기성 아미노산 잔기 즉, 라이신 또는 아르기닌으로 이루어진 염기성 펩타이드, HIV-1 Tat(48-57) 또는 이 펩타이드의 양단으로부터 각각 1 또는 2개의 아미노산이 결여된 변형체 중의 하나로 구성되는 식물세포 투과 도메인을 통하여 수행된다. 구체적으로, 본 발명은 신규의 식물세포 투과 도메인, 식물세포 투과 도메인-화물 분자 복합체 등에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"화물 분자"란 본래 표적 식물세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 식물세포로 들어갈 수 없는, 식물세포 투과 도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 식물세포 투과 도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체이거나 식물세포 투과 도메인-화물 분자 복합체의 화물 분자 부분을 의미한다. 화물 분자로서는 폴리펩티드, 단백질, 핵산 및 다당류, 기타 유기화합물 등을 포함한다. 본 발명의 용도 또는 응용에 있어서 "화물 분자"는 예컨대 약물 또는 수용체 등을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 "화물 분자"는 "목표 단백질" 등과 동일, 유사한 의미로 사용되었다.
"식물세포 투과 도메인-화물 분자 복합체"란 식물세포 투과 도메인 및 1개 이상의 화물 분자 부분을 포함하며, 식물세포 투과 도메인과 화물 분자의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.
또한, "표적세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 표적세포는 식물체내의 식물세포 또는 식물체 외에서 배양된 식물세포를 말한다.
본 명세서의 "식물세포 투과 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 HIV-1 Tat(48-57) 또는 이 펩타이드의 양단으로부터 각각 1 또는 2개의 아미노산이 결여된 변형체, 라이신 또는 아르기닌 5 내지 12개로 이루어진 염기성 펩타이드 중의 하나로 구성된 것을 말한다.
본 명세서의 "화물 단백질" 또는 "목표 단백질"은 상기 식물세포 투과 도메인과 공유결합을 이루어 식물세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 치료 분자, 예방 분자 등을 의미하며, 실제로는 순수한 단백질에만 한정되는 것이 아니라, 펩타이드, 폴리펩타이드, 당류와 결합된 당단백질, 펩티도글리칸 등을 통칭하는 표현으로 사용한다.
또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "투과"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "도입", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.
본 발명은 세포 내에서 기능할 수 있는 다양한 고분자 및 저분자 유기화합물들을 포함하는 화물 분자를 표적세포 내로 운반하고 세포 내에서 활성을 가지도록 하기 위하여 HIV-1 Tat(48-57) 또는 이 펩타이드의 양단으로부터 각각 1 또는 2개의 아미노산이 결여된 변형체, 라이신 또는 아르기닌 5 내지 12개로 이루어진 염기성 펩타이드 중의 하나로 이루어진 식물세포 투과 도메인 및 식물세포 투과 도메인- 융합단백질을 포함하는 식물세포 투과 도메인-화물 분자 복합체, 이를 세포 내로 도입시키는 방법 및 그 용도를 제공한다.
이하 발명의 상세한 설명에서는 화물 분자로서 임의의 "단백질"을 선택하여 세포 내로 도입하는 올리고라이신-화물 분자 복합체 등에 관하여 설명한다. 그러나, 이것은 발명의 설명의 편의를 위한 것일 뿐 화물 분자가 "단백질"에만 한정되거나, 본 발명의 범위가 올리고라이신 융합 단백질 등에만 한정되는 것이 아님을 밝혀 둔다.
본 발명자들은 특정 기능을 가진 단백질 또는 펩타이드 등의 화물 분자를 식물세포 내로 침투시키는 기술을 개발하기 위하여 표적(식물)세포 내로 화물 분자 및/또는 목표 단백질을 전달할 수 있는 식물세포 투과 도메인-화물 분자 복합체 발현벡터인 pTat를 제조하였다. 신규 제조된 벡터는 아미노 말단부터 6개의 히스티딘, HIV-1 Tat(48-57) 또는 이 펩타이드의 양단으로부터 각각 1 또는 2개의 아미노산이 결여된 변형체와 화물 분자로서의 목표 단백질을 융합 단백질 형태로 발현시킬 수 있도록 고안되었다. 식물세포 투과 도메인 부분이 단백질 등의 화물 분자를 세포 내로 전달할 수 있는 능력을 용이하게 분석할 수 있도록 하기 위하여 GFP(Green Fluorescence Protein: 녹색형광단백질)를 목표 단백질로 선택하여 GFP의 염기서열에 해당하는 DNA 절편을 pTat 벡터에 삽입시켜 Tat-GFP 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터인 pTat-GFP를 제조하였다.
본 발명은 식물세포 또는 세포핵에 비침투성이거나 침투가 용이하지 않은 생물학적 활성을 지닌 화물 분자와 공유결합되어 화물 분자를 식물세포 내로 전달하는 식물세포 투과 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 화물 분자가 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 식물세포 투과 도메인이 HIV-1 Tat(48-57) 또는 양 말단으로부터 각각 1개 또는 2개의 아미노산이 결여된 펩타이드들, 라이신 또는 아르기닌 5 내지 12개로 이루어진 염기성 펩타이드 중의 하나인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 식물세포 투과 도메인과 화물 분자가 공유결합되어 식물세포 또는 세포 핵 내로 침투 가능하고 식물세포 내에서 활성을 나타내는 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 식물세포 투과 도메인의 카르복시 말단 측에 화물 단백질이 공유결합되어 식물세포 내로 침투 가능한 식물세포 투과 도메인 융합단백질에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 화물 단백질이 녹색형광단백질(GFP)인 것을 특징으로 한다.
나아가, 본 발명은 상기 식물세포 투과 도메인을 발현시키는 벡터를 미생물에서 발현시키는 단계;
발현된 식물세포 투과 도메인을 정제하는 단계;
정제된 식물세포 투과 도메인의 카르복시 말단측에 화물분자 복합체를 결합시키는 단계;
식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체를 식물세포 또는 세포핵에 가하는 단계;로 구성되는 것을 특징으로 하는 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체를 식물세포 내로 투과시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체를 발현시키는 벡터를 미생물에서 발현시키는 단계;
발현된 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체를 정제하는 단계;
정제된 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체를 식물세포 또는 세포핵에 가하는 단계;로 구성되는 것을 특징으로 하는 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체를 식물세포 내로 투과시키는 방법에 관한 것이다.
본 기술은 식물세포 투과 도메인이 N-말단에 붙어있는 녹색형광단백질(green fluorescence protein; GFP)을 이용하여 식물의 세포와 조직에서도 단백질이 투과될 수 있음을 증명한 첫 번째 연구결과이다. 즉 식물세포 투과도메인-GFP 단백질이 성공적으로 당근의 원형질 세포(도 1 참조)와 피마자의 자엽 조직(도 2 참조)에 투과되었다. 원형질 세포의 경우에는 단백질을 배지 내에 첨가하는 단순한 방법에 의하여 투과 실험이 실행되었으며, 자엽 조직의 경우에는 관다발 조직에 주사하는 방법으로 이루어졌다. 식물세포 투과 도메인과 결합하지 아니한 대조군 GFP는 세포 및 조직을 투과하지 못하였다.
식물에 있어서 유전자에 의한 형질전환 연구는 동물에 비교하여 매우 광범위하고 용이하게 실시되어 왔다. 하지만 본 발명에서 제시하는 단백질 투과에 의한 형질전환 기술은 아직 보고된 적이 없는 새로운 내용이다. 병저항성에 관련된 또는 꽃의 색을 조절하는 단백질 등을 식물에 투입하여 식물의 경제성을 획기적으로 제고할 수 있는 기반기술이 본 발명에 의하여 제시되었다고 판단된다. 즉 단백질을 통한 형질전환 기술이 갖추어졌으며 이 기술의 적용범위는 매우 광범위하고 경제산업적인 가치가 매우 크다고 예상된다.
아래에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 자세히 살펴 본다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재에만 한정되는 것은 아니다.
재료
제한 효소와 T4 DNA 리가아제(ligase)는 Promega(USA)에서 구입하였고, Pfu 중합효소(polymerase)는 stratagene(USA)에서 구입하였다. 실험에 이용된 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer (USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa (Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 BL21(DE3) 플라스미드는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni-니트릴로삼아세트산 세파로즈 수퍼플로우(nitrilotriactic acid sepharose superflow)는 Qiagen(Germany)에서 구입하였다. 정제한 단백질의 염분을 제거하기 위해 사용된 컬럼 PD-10은 Amersham Pharmacia에서 구입하였다. SDS를 위한 시약들은 Sigma에서 구입했고, 킷트는 BIO-RAD 것을 사용했다. 세포 배양에 사용된 배양액 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)와 Antobiotics-Antimicotic, FBS(fetal bovine serum), NCS(newborn calf serum) 등은 GIBCO BRL에서 구입한 것을 사용했으며, 세포 내 GFP 단백질의 분포와 형광 유무를 관찰하기 위해 올림푸스 형광현미경(Olympus epifluorescence microscope)을 이용하였다. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였으며 특별한 언급이 없는 한 Sigma 시약회사에서 구입한 것이다.
<실시예 1> 수송도메인 융합단백질 발현 벡터의 제조
기능을 가진 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 침투시키는 기술을 개발하기 위하여 세포 내로 목표단백질을 전달할 수 있는 융합 단백질 발현벡터를 제조하였다.
수송 도메인이 단백질을 세포 내로 전달하는 능력을 용이하게 분석하기 위하여 녹색형광 단백질(Green Fluorescence Protein; 본 명세서에서 "GFP"라 약칭함)을 목표단백질로 선택하였다. GFP의 염기서열에 해당하는 DNA 절편을 플라스미드 pEGFP-C2(클론텍)를 이용하여 Pfu DNA 중합효소로 중합효소 연쇄반응시켜 GFP의 완전한 서열을 증폭하였다. 정방향 개시체(sense primer)는 5'-CTCGAGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3'이고, 역방향 개시체(antisense primer)의 서열은 5'-GGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3'이다. PCR산물은 XhoI-BamHI으로 잘리며, pET15b(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 XhoI-BamHI 자리에 서브클론되어 HIV-1 Tat의 염기성 도메인이 없는 GFP 융합단백질을 발현시키는 pGFP를 제조하였다. 약 0.7kb의 삽입체를 가진 클론은 XhoI-BamHI 제한효소 분석으로 선택되고 서열결정을 통하여 분석되었다.
GFP와 융합된 HIV-1 Tat(아미노산 48-57)을 발현시키는 pTat-GFP는 다음의 방법으로 제조되었다. 첫째, 두개의 올리고뉴클레오타이드가 제조되어 HIV-1 Tat의 염기성 도메인의 아홉개 아미노산을 코딩하는 이중사슬 올리고뉴클레오타이드로 어닐되었다. HIV-1 Tat의 염기성 도메인의 아홉개 아미노산을 코딩하는 서열은 위쪽 사슬(top strand) 5'-TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC-3'과 아래쪽 사슬(bottom strand) 5'-TCGAGTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCC-3'이다. 이중사슬 올리고뉴클레오타이드는 직접 pGFP의 NdeI-XhoI으로 소화된 부위에 연결된다. 그리하여 인프레임으로(in frame) 6개의 히스티딘 오픈리딩프레임과 연결된 Tat-GFP 발현 플라스미드인 pTat-GFP가 제조되었다.
또한, GFP와 HIV-1 Tat의 염기성 도메인(아미노산 48-57)이 융합되어 코딩된 이 플라스미드는 변형되어 pGFP의 히스티딘 태그 부분과 GFP 유전자 사이에 수송 도메인의 다양한 변이형태 즉, 48-57 아미노산 잔기 중 양 말단으로부터 1개 또는 2개의 아미노산이 결여된 형태에 해당하는 올리고뉴클레오타이드가 어닐되어 삽입되었다.
플라스미드에 클론된 올리고뉴클레오타이드의 서열은 형광 자동 서열분석기 (fluorescence-based automated sequencer)(모델 373A, Applied Biosystems, Inc.)로 확인하였다.
<실시예 2> 식물세포 투과 도메인-GFP 융합단백질의 발현 및 정제
pGFP 및 pTat-GFP 등으로 형질전환된 E. coli BL21(파마시아)를 선택한 다음, 콜로니를 100㎍/㎖의 앰피실린이 함유된 LB 배지에 접종하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 밤새 배양한 배양액은 신선한 LB 배지에서 10배 희석하여 250rpm으로 교반하여 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D600 = 1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5mM 되게 한 다음 4시간을 더 배양하였다.
식물세포 투과도메인(이하 "PTD"와 혼용함)-GFP 융합단백질을 얻기 위하여 배양된 세포에 프로테아제 억제제(20mg/ml 소이빈 트립신 억제제, 2mg/ml 아프로티닌, 5mg/ml 류펩틴, 100mg/ml PMSF)가 포함된 결합완충용액(binding buffer; 5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)를 넣고 초음파처리(sonication)하여 수확하고 용균하였다. 완충액 A(buffer A; 6M 우레아, 20mM HEPES, pH 8.0, 100mM NaCl)에 넣고 초음파처리하여 세포를 파쇄시킨 다음 원심분리를 2회(16,500rpm×30min, 40,000rpm×30 min, 4℃) 연속 수행하여 불용성의 세포 파편(cell debris)을 제거하였다. 그 후 용균액(lysate)을 Ni+++-IDA 컬럼을 통해 정제하였다. 컬럼은 세척완충액(80mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척하였다. 단백질은 용출 완충액(1mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)로 용출한 후 PD-10 컬럼 크로마토그래피(Amersham)를 이용하여 단백질에 포함된 염분을 제거하였다.
<실시예 3> 세포 배양과 융합단백질의 세포 내 전달 실험
PTD-GFP vector와 GFP vector를 대장균 BL21 (DE3)에 transformation시킨 후 His·Bind kits(Novagen 70239-3)를 이용해 PTD－GFP (27.17kDa)와 GFP (26.18kDa)를 얻었다. 이 두 단백질은 SDS-PAGE와 Coomassie blue staining, Western blot을 이용해 확인한 후 실험에 이용하였다.
각각 1g(wet weight)정도의 당근의 현탁배양 세포를 1.5% 셀룰레이즈 (cellulase), 0.2% 매커로자임(macerozyme), 0.65M 소르비톨(sorbitol) 용액에 27℃에서 1시간 동안 배양하여 원형질 세포를 만들었다.
이 세포에 1시간동안 GFP(도 1a)과 PTD-GFP(도 1b)를 각각 처리한 후 광학현미경(윗 패널)과 형광현미경(아랫 패널)으로 관찰한 결과이다. 관찰 결과 PTD-GFP만 세포 안에 들어가 있는 것을 볼 수 있다.
도 2는 PTD-GFP가 식물의 조직에도 투과할 수 있는지를 알아보기 위해 피마자 자엽의 잎맥에 PTD-GFP와 GFP를 각각 1.23mg/100㎕를 주사하여 30분과 60분 후 광학현미경(top panel)과 형광현미경(bottom panel)으로 관찰한 결과이다. GFP의 경우는 잎맥 근처의 조직에 60분이 경과하였음에도 불구하고 투과하고 있지 않고 있다(그림 2a), PTD-GFP는 주사 후 30 분내로 잎맥주변의 조직(mesophyll cells)에서도 광범위하게 투과되어 있었다(그림 2b).
이 그림은 물관부(그림의 우측면에 위치)의 PTD-GFP가 우측의 많은 조직이 형광을 나타내고 있는 것으로 보아 조직의 투과가 우측에서 좌측으로 이동하고 있음을 보여주고 있다. 좌측의 붉은 바탕의 형광색은 엽록체 내의 틸라코이드 구조에서 유래되고 있는 것으로 GFP가 전혀 투과되어 있지 않음을 보여 주고 있다. 하루가 지난 이후에도 GFP의 경우 더 이상 투과되고 있지 않음이 확인되었다.
이상의 결과로부터 식물세포 투과 도메인이 공유결합된 단백질은 원형질 세포뿐만 아니라 식물조직에 직접 주사하는 방법으로도 식물체 내에 들어갈 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명은 식물세포 및 식물세포 핵, 식물조직에 불투과성인 단백질 등의 유기 고분자 물질을 용이하게 투과시키는 식물세포 투과 도메인을 제공한다.
식물용 농약이나 식물체 내에서 특정 기능을 발휘하는 효소 등을 본 발명의 식물세포 투과 도메인을 이용하여 식물체 내로 도입시킴으로써 유전자 조작방법의 여러 가지 문제점을 극복할 수 있고, 병충해도 효과적으로 극복할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a 및 1b는 식물세포 원형질에 단백질을 투과시키는 실험의 결과이다.
1a: GFP, 1b: 식물세포 투과 도메인-GFP 융합단백질
윗 패널은 광학현미경으로 촬영한 것, 아랫 패널은 형광현미경으로 촬영한 것이다.
도 2a 및 2b는 식물조직에 단백질을 투과시키는 실험의 결과이다.
2a: GFP, 2b: 식물세포 투과 도메인-GFP 융합단백질
<110> LEE, Woo Sung CHOI, Soo Young PARK, In Woo SHIN, Sung Ho PARK, Jinseu <120> Plant cell transducing domain and plant cell transducind domain-cargo molecule complex <130> WJTJ-SHK-TATplant <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Aequorea victoria <400> 1 ctcgaggtga gcaagggcga ggagctg 27 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Aequorea victoria <400> 2 ggatccttac ttgtacagct cgtccatgcc gag 33 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 3 taggaagaag cggagacagc gacgaagac 29 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 4 tcgagtcttc gtcgctgtct ccgcttcttc c 31 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <220> <221> CDS <222> (5)..(34) <400> 5 tagc ggc agg aag aag cgg aga cag cga cga aga c 35 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 6 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide coding transducing domain deleted from HIV-1 Tat <220> <221> CDS <222> (2)..(25) <400> 7 t aag aag cgg aga cag cga cga aga c 26 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide coding transducing domain deleted from HIV-1 Tat PTD <220> <221> CDS <222> (2)..(22) <400> 9 t aag cgg aga cag cga cga aga c 23 Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 10 Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide coding transducing domain deleted from HIV-1 Tat PTD <220> <221> CDS <222> (2)..(19) <400> 11 t aga aga cag cga cga aga c 20 Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide coding transducing domain deleted from HIV-1 Tat PTD <220> <221> CDS <222> (2)..(16) <400> 13 t aag aag cgg aga cag c 17 Lys Lys Arg Arg Gln 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 14 Lys Lys Arg Arg Gln 1 5 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide coding transducing domain deleted from HIV-1 PTD <220> <221> CDS <222> (2)..(19) <400> 15 t aag aag cgg aga cag cga c 20 Lys Lys Arg Arg Gln Arg 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 16 Lys Lys Arg Arg Gln Arg 1 5 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide coding transducing domain deleted from HIV-1 Tat PTD <220> <221> CDS <222> (2)..(22) <400> 17 t aag aag cgg aga cag cga cga c 23 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 18 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 <210> 19 <211> 757 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence fused polynucleotide coding 9 lysine residues and polynucleotide coding green fluorescence protein <220> <221> CDS <222> (2)..(748) <400> 19 t agg aag aag cgg aga cag cga cga aga ctc gag gtg agc aag 43 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Val Ser Lys 1 5 10 ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc atc ctg gtc gag ctg gac 91 Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp 15 20 25 30 ggc gac gta aac ggc cac aag ttc agc gtg tcc ggc gag ggc gag ggc 139 Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly 35 40 45 gat gcc acc tac ggc aag ctg acc ctg aag ttc atc tgc acc acc ggc 187 Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly 50 55 60 aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc ctc gtg acc acc ctg acc tac ggc 235 Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly 65 70 75 gtg cag tgc ttc agc cgc tac ccc gac cac atg aag cag cac gac ttc 283 Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe 80 85 90 ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag cgc acc atc ttc 331 Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe 95 100 105 110 ttc aag gac gac ggc aac tac aag acc cgc gcc gag gtg aag ttc gag 379 Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu 115 120 125 ggc gac acc ctg gtg aac cgc atc gag ctg aag ggc atc gac ttc aag 427 Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys 130 135 140 gag gac ggc aac atc ctg ggg cac aag ctg gag tac aac tac aac agc 475 Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser 145 150 155 cac aac gtc tat atc atg gcc gac aag cag aag aac ggc atc aag gtg 523 His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val 160 165 170 aac ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac ggc agc gtg cag ctc gcc 571 Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala 175 180 185 190 gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc ccc gtg ctg ctg 619 Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu 195 200 205 ccc gac aac cac tac ctg agc acc cag tcc gcc ctg agc aaa gac ccc 667 Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro 210 215 220 aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc gtg acc gcc gcc 715 Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala 225 230 235 ggg atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag ta aggatcc 757 Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 240 245 <210> 20 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 20 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Val Ser Lys Gly Glu 1 5 10 15 Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp 20 25 30 Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala 35 40 45 Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu 50 55 60 Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys 85 90 95 Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys 100 105 110 Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp 115 120 125 Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp 130 135 140 Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn 145 150 155 160 Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe 165 170 175 Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His 180 185 190 Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp 195 200 205 Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu 210 215 220 Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile 225 230 235 240 Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 245

Claims (9)

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  8. HIV-1 Tat(48-57), HIV Tat(49-57), HIV Tat(50-57), 라이신 또는 아르기닌 7 내지 12개로 이루어진 염기성 펩타이드들 중의 하나인 식물세포 투과 도메인을 발현시키는 벡터를 미생물에서 발현시키는 단계;
    발현된 식물세포 투과 도메인을 정제하는 단계;
    정제된 식물세포 투과 도메인의 카르복시 말단측에 화물분자 복합체를 결합시키는 단계;
    식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체를 식물세포 또는 식물조직에 가하는 단계;로 구성되는 것을 특징으로 하는 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체를 식물세포 내로 투과시키는 방법.
  9. HIV-1 Tat(48-57), HIV Tat(49-57), HIV Tat(50-57), 라이신 또는 아르기닌 7 내지 12개로 이루어진 염기성 펩타이드들 중의 하나인 식물세포 투과 도메인과 화물 분자가 공유결합된 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체를 발현시키는 벡터를 미생물에서 발현시키는 단계;
    발현된 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체를 정제하는 단계;
    정제된 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체를 식물세포 또는 식물조직에 가하는 단계;로 구성되는 것을 특징으로 하는 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체를 식물세포 내로 투과시키는 방법.
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