CN104039811B

CN104039811B - 具有改善的细胞渗透性的新的大分子转导结构域的研发及其使用方法

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Publication number: CN104039811B
Application number: CN201280057886.2A
Authority: CN
Inventors: 申基德; 李刚真; 林善喜; 李秉圭; 金钟来
Original assignee: Industry Foundation of Chonnam National University
Current assignee: Industry Foundation of Chonnam National University
Priority date: 2011-11-23
Filing date: 2012-11-23
Publication date: 2018-02-23
Anticipated expiration: 2032-11-23
Also published as: WO2013077680A1; US9694087B2; CN104039811A; US9259481B2; ES2621337T3; EP2784081A1; US20140329737A1; JP2015508993A; EP2784081B1; US20160199504A1; EP2784081A4; JP6001082B2

Abstract

本发明涉及一种改善的大分子转导结构域（MTD），其帮助渗透生物活性分子的细胞膜，具有增强的细胞渗透性。特别地，根据本发明改善的MTD与现有的MTD相比，可以更加有效地从体内和体外传递多种类型的生物活性分子，并且由此可被有效地用于基因改变生物活性分子以具有细胞渗透性的方法中或者用于将生物活性分子传输至细胞内的方法中等。另外地，改善的MTD对于研发改进的MTD的使用在药物传递系统中成为可能的新的药物和不断改进的药物，重组蛋白质疫苗或DNA/RNA治疗剂，基因或蛋白质治疗，以及药理学或医学有用的蛋白质制备或医学、药理学和药物组合物是非常有用的。

Description

具有改善的细胞渗透性的新的大分子转导结构域的研发及其使用方法

技术领域

本发明涉及改进的大分子转导结构域(MTD)及其制备方法，编码改进的MTD的多核苷酸，使用改进的MTD通过基因工程而令生物活性分子具有细胞渗透性的方法，以及使用改进的MTD而将生物活性分子导入细胞的方法，所述改进的MTD由于对常规MTD的氨基酸序列的改进而具有比常规MTD更加改善的细胞渗透性，其帮助将生物活性分子递送至细胞。

背景技术

细胞膜由于不可渗透性而作用为蛋白质、核酸、肽和不溶化合物进入细胞的障碍物。在细胞内药物转导中的这种问题必须在疾病的治疗、预防和诊断领域中被解决。通常，将生物活性分子渗透至细胞内的方法包括电穿孔，使用脂质体的膜融合，使用磷酸钙、例如为聚乙烯亚胺(PEI)的阳离子聚合物或DEAE-右旋糖苷的转染，病毒转染，和单细胞显微注射。此外，最近对于有效的细胞内药物转导来说，采用例如为纳米颗粒的药物递送系统的内噬作用的技术已被使用，但是由于免疫系统内的快速损失所导致的传递效率的降低，或者由于与细胞的相互作用所导致的位阻，需要对实现有效的细胞内药物递送进行更多的研究。因此，目前对于通过生物膜和细胞的核膜来递送例如蛋白质、核酸等大分子而不损坏细胞膜的方法存在持续的需求。

在1988年，Green和Loewenstein小组(Green和Loewenstein.Cell55,1179-1188(188))以及Frankel和Pabo小组(Frankel和Pabo.Cell55,1189-1193(188))分别发现了转导结构域将HIV-1的转录相关蛋白质、Tat渗透通过细胞膜并反式激活病毒基因，该HIV-1是导致获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病毒。表现出细胞渗透性的Tat结构域为Tat蛋白质的第48至第57的碱性氨基酸序列(GRKKRRQRRR)，并且发现该序列在渗透细胞膜中扮演着重要的作用(Vives等,J.Biol.Chem.272,16010-16017(1997)；Futaki等,J.Biol.Chem.276,5836-5840(2001)；Wadia,J.S.和S.F.Dowdy,Cum Opin.Biotechnolol.13(1):52-6(2002)；Wadia等,Nature Medicine10(3),310-315(2004))。

作为另一个例子，由16个肽组成的触角足突变同源域衍生的穿膜肽(penetratin)(RQIKIYFQNRRMKWKK)可被使用((Joliot等,Proc Natl Acad Sci USA88:1864-1868(1991)；Derossi等,J Biol Chem269,10444-10450(1994)；Joliot,A.和A.Prochiantz,Nat.Cell Biol.6(3):189-96(2004))；并且除了穿膜肽，具有类似序列和机理和肽序列被广泛地称为蛋白质转导结构域(PTD)。已经发现这样的PTD的细胞内物质转导的机理通过扰乱细胞表面上的细胞膜并将物质递送至细胞内，或者通过由在细胞表面上存在的膜蛋白的多种不同的葡聚糖的负电荷和构成将要被递送至细胞内的PTD的碱性氨基酸残基的正电荷之间的静电作用导致的内噬作用而在核内体内累积物质，而不是通过直接将物质渗透至细胞膜内来执行((J.S.Wadia,等,Nat.Med.10:310-315(2004)；I.Nakase,等Biochemistry46:492-501(2007)；H.L.Amand,等,Biochim.Biophys.Acta(2011))。然而，这样的PTD的物质转导机理在将例如为肽、蛋白质、核酸等的物质转导至活体的深层组织中是困难的。特别地，肽或蛋白质在核内体内累积，并且当在细胞内结合至溶酶体的时候，容易通过溶酶体的蛋白酶而被降解。据此，当使用PTD转导足够高浓度的肽或蛋白质的时候，能够作用于细胞质内目标的有效组分可以由核内体发出，其在使用PTD的蛋白质转导中成为问题(F.Milletti,Drug Discovery Today17:850-860(2012))。

随后，在2000年，由纤维原细胞生长因子(FGF)的单肽衍生的MTS(AAVLLPVLLAAP)被合成并制造(DaeWoong Jo等,Nat.Biotech.第19卷,2001)。MTS由12个疏水氨基酸组成，其中一个缬氨酸和两个亮氨酸存在于连续具有两个丙氨酸、并且包括脯氨酸的序列之间，并且与常规PTD具有截然不同的特性。此外，目前作为更加改进的转导结构域，具有比PTD和MTS更加改善的将材料传递至细胞内的效率、以及不同结构和静电特征的新的细胞膜可渗透肽被研发，并且肽为大分子转导结构域(MTD)(参见WO 2008/093982)。

当使用本发明人在技术上研发的MTD的时候，不像转导至HIV-TAT细胞内，内噬作用和能量在物质的细胞内转导中都是不需要的，并且用于与细胞膜直接相互作用的细胞膜的刚性和完整度用作为重要的因素，并且由此也可执行细胞之间的连续转导。出于这种原因，MTD对于将目标蛋白质递送至细胞内是高效的，并且与常规的细胞膜可渗透肽TAT相比能够递送至活体内的深层组织中。此外，衍生自分泌蛋白或细胞膜蛋白的单一序列的疏水MTD通过改进主要由三个部分组成的单肽的疏水区域的序列来制备，所述的三个部分包括N端的疏水区域和C端的分泌蛋白切割位点、形成螺旋结构以具有细胞膜靶标活性的疏水区域。MTD直接渗透通过细胞膜，而不损坏细胞，并允许例如为蛋白质的大分子被递送至细胞内以表现出它们自身的功能。

然而，因为MTD通常由疏水氨基酸组成，并由此降低物理性能和适用性，所以当在与强疏水肽或蛋白质相关的制备中的时候，当在常规缓冲条件下在预定浓度或更高浓度熔融的时候，或者根据转导物质的特征，MTD就可被沉淀。因此，与在所使用的浓度范围内未沉淀并考虑到将被转导的物质的特征时表现出最优化的渗透性和活性的MTD的组合也可能是需要的。

因此，本发明人研发了新的细胞膜渗透结构域，通过缺失或修饰氨基酸序列或嵌合融合而具有改善的细胞膜渗透性，从而改善物理特性和常规MTD的适用性，并提高细胞膜渗透性及其确定的细胞内转导作用，由此证明比常规MTD更加改善的作用，由此完成本发明。

发明内容

技术问题

本发明被发明以研发如上所述的肽，其通过改进传统MTD肽的氨基酸序列而具有更佳的细胞渗透性，并意图提供改进的MTD，其由于缺失、修饰或嵌合融合至传统MTD的氨基酸序列并多核苷酸编码改进的MTD而具有改善的细胞膜渗透性和物理特性。

本发明还意图提供一种使用改进的MTD来基因设计生物活性分子以具有细胞渗透性的方法，以及使用改进的MTD将生物活性分子输入至细胞内的方法。

然而，本发明所要实现的技术目标并不限于如上所述的目标，并且本领域技术人员将根据如下的说明而清楚地理解将不会被描述的其它目标。

技术方案

本发明的多个方面提供了由通式1表达的肽，其中A1为蛋氨酸(M，Met)；A2为选自由精氨酸(R，Arg)、组氨酸(H，His)和赖氨酸(K，Lys)构成的组的氨基酸；并且MTD具有选自由序列编号为1至7构成的组的氨基酸序列：

[通式1]

A1-A2-MTD；和

编码所述肽的多核苷酸。

在本发明的一种实施方式中，所述肽调解生物活性分子至细胞内的转运，并具有选自由序列编号为15至35构成的组的氨基酸序列。

在本发明的另一种实施方式中，多核苷酸具有选自由序列编号为36至56构成的组的碱基序列。

在本发明的一种实施方式中，序列编号为15的氨基酸序列可由序列编号为36的序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的另一种实施方式中，序列编号为16的氨基酸序列可由序列编号为37的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为17的氨基酸序列可由序列编号为38的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为18的氨基酸序列可由序列编号为39的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为19的氨基酸序列可由序列编号为40的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为20的氨基酸序列可由序列编号为41的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为21的氨基酸序列可由序列编号为42的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为22的氨基酸序列可由序列编号为43的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为23的氨基酸序列可由序列编号为44的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为24的氨基酸序列可由序列编号为45的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为25的氨基酸序列可由序列编号为46的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为26的氨基酸序列可由序列编号为47的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为27的氨基酸序列可由序列编号为48的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为28的氨基酸序列可由序列编号为49的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为29的氨基酸序列可由序列编号为50的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为30的氨基酸序列可由序列编号为51的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为31的氨基酸序列可由序列编号为52的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为32的氨基酸序列可由序列编号为53的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为33的氨基酸序列可由序列编号为54的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为34的氨基酸序列可由序列编号为55的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

在本发明的还一种实施方式中，序列编号为35的氨基酸序列可由序列编号为56的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

本发明的另一个方面提供了基因设计具有细胞渗透性的生物活性分子的方法，包括使具有选自由序列编号为15至35构成的组的氨基酸序列的肽连接至生物活性分子。

在本发明的一种实施方式中，所述连接通过使生物活性分子连接至肽的N端、C端或者两端来实施。

在本发明的另一种实施方式中，所述连接通过使相反设置的肽的氨基酸连接至生物活性分子的C端来实施。

在本发明的还一种实施方式中，所述连接通过肽键或化学键来实施。

在本发明的还一种实施方式中，所述化学键可以选自二硫键、二胺键、硫-胺键、羧基-胺键、酯键和共价键。

在本发明的还一种实施方式中，生物活性分子选自由蛋白质、多肽和肽构成的组。

在本发明的还一种实施方式中，生物活性分子选自由生长因子、酶、转录因子、毒素、抗原肽、抗体和抗体片段构成的组。

在本发明的还一种实施方式中，生物活性分子可以选自酶、激素、载体蛋白、免疫球蛋白、抗体、结构蛋白、运动功能蛋白、受体、信号蛋白、储藏蛋白、膜蛋白、跨膜蛋白、内蛋白、外蛋白、分泌蛋白、病毒蛋白、天然蛋白、糖蛋白、裂解蛋白、具有二硫键的蛋白、蛋白复合物、化学修饰的蛋白和朊病毒。

在本发明的还一种实施方式中，生物活性分子可以选自由核酸、编码核酸序列、mRNA、反义RNA(miRNA或siRNA)分子、碳水化合物、脂质和醣脂构成的组。

在本发明的还一种实施方式中，生物活性分子为治疗药物或毒性化合物。

本发明的又一个方面提供了将生物活性分子输送至个体细胞内的方法，包括对个体施用连接生物活性分子的选自由序列编号为15至35构成的组的氨基酸序列。

有益效果

本发明的改进的MTD比常规MTD具有不可忽视的更佳的将生物活性分子传递至细胞内的细胞渗透性，并有效地维持了所传递的生物活性分子在细胞内的活性。因此，本发明的改进的MTD可被用于药物传递系统内，用于DNA/RNA治疗的重组蛋白疫苗或药物，用于基因和蛋白质治疗的方法，药理学或医学有用的蛋白质、或者药物医学和药物组合物的制备，并且对于研发新的和改进的药物也是非常有用的。

附图说明

图1至4为使用PEP FOLD服务器程序来分析本发明的改进的MTD的二级结构的结果。

图5为通过流式细胞术在人类结肠直肠癌细胞中分析本发明的改进的MTD的细胞渗透性定量分析结果。

图6为通过流式细胞术在人类胚胎肾细胞中分析本发明的改进的MTD的细胞渗透性定量分析结果。

图7-9为通过共聚焦激光扫描显微术在皮肤源角化细胞内可视观察本发明的改进的MTD的细胞渗透性的结果；MR形式：改进的MTD通过通式A1-A2-MTD表达，其中A1为蛋氨酸并且A2为精氨酸；MH形式：改进的MTD通过A1-A2-MTD来表达，其中A1为蛋氨酸并且A2为组氨酸；和MK形式：改进的MTD通过通式A1-A2-MTD来表达，其中A1为蛋氨酸并且A2为赖氨酸。

图10为通过共聚焦激光扫描显微术在人类宫颈癌细胞内可视观察本发明的改进的MTD的细胞渗透性的结果；MR形式：改进的MTD通过通式A1-A2-MTD表达，其中A1为蛋氨酸并且A2为精氨酸；MH形式：改进的MTD通过A1-A2-MTD来表达，其中A1为蛋氨酸并且A2为组氨酸；和MK形式：改进的MTD通过通式A1-A2-MTD来表达，其中A1为蛋氨酸并且A2为赖氨酸。

图11示出了显示在EpiOral皮肤模型中本发明的改进的MTD的细胞组织中的渗透性的图像，该图像由共聚焦激光扫描显微术摄取。

图12为本发明的改进的MTD的皮肤渗透性通过共聚焦激光扫描显微术在体内的鉴定结果。

图13为通过共聚焦激光扫描显微术使乙酰化六肽结合本发明的改进的MTD来制备的肽复合物的细胞渗透性在体外的鉴定结果。

图14为示出了通过共价键使改进的MTD与LacZ siRNA结合的图像。

图15示出了显示静脉注射至老鼠内的本发明的改进的MTD渗透至活体器官的肺组织内的图像，由共聚焦激光扫描显微术摄取。

图16示出了显示当改进MTD被静脉注射至老鼠内的时候，改进的MTD被渗入至活体的肺组织内，由此降低β牛乳糖蛋白的表达的图像。

具体实施方式

虽然低分子量合成化合物或天然化合物可被容易地递送至细胞内，但是例如蛋白质、肽和核酸的大分子由于大分子量而并不会渗入至呈双层脂质膜结构的细胞膜内。为了克服这样的大分子不会渗透通过细胞的质膜的缺陷，研发了大分子细胞内转导技术(MITT,韩国专利公开号10-2009-0103957)。

因为物质转导结构域仅由疏水氨基酸组成，所以当MITT被用于使例如为硫酸类肝素蛋白多糖(HSPG)的碳水化合物带负电并且令例如为粘多糖的多糖和唾液酸带负电的时候，到达具有负电荷和亲水性的细胞膜的能力就会被限制。

因为在MITT中使用的位于N端的信号肽为指示蛋白质翻译后转运的短肽，所以对于不同的蛋白质来说信号肽的通用结构由包括蛋白质的的起始密码子M的两亲性结构域组成，并且两亲性分子由两个结构域组成，例如亲水性(极性)结构域和疏水性(非极性)结构域。发明人希望考虑信号肽的两亲性特征，因为两个结构域的作用是明显的，发明人估计信号肽的连续性将被良好地保存。

然而，当带正电的氨基酸是延续的，或者其中包括连续的至少三个带正电的氨基酸的序列或者五个氨基酸的序列与疏水肽连接的时候，发明人估计疏水肽将不会直接渗透过细胞膜并转导至细胞内，而是通过内噬作用而转导至细胞内，正如PTD那样。

基于这样的设想，发明人提供了新的改进的MTD，通过将具有正电荷的一个或两个亲水性(极性)氨基酸应用于常规的疏水MTD来加强至具有负电荷的细胞膜的可接近性而更加有效地将生物活性分子传递至细胞内，并且由此完成本发明。

本发明提供了由通式1表达的肽，其中A1为蛋氨酸(M，Met)；A2为选自由精氨酸(R，Arg)、组氨酸(H，His)和赖氨酸(K，Lys)构成的组的氨基酸；并且MTD具有由序列编号为1至7构成的组的氨基酸序列：

[通式1]

A1-A2-MTD；和

编码所述肽的多核苷酸。

与在韩国专利公开10-2009-0103957中公开的MTD相比，所述肽调解生物活性分子至细胞内的转运并表现出极佳的细胞渗透性。在本发明中，所述肽被称为“改进的MTD”。

所述肽可以选自由序列编号为15至35构成的组的氨基酸序列，但是本发明不限于此。

所述肽优选具有被量化的一个序列以允许相对比较在韩国专利公开10-2009-0103957中研发的193个MTD，并且尽管本发明不限于此，所选择的满足如下的条件：

1)脯氨酸位于序列的中间；2)相对于每个结构域通过评价使用Signal P程序诱导细胞外分泌物的可能性而获得的数值为60％或更大；(3)使用Protparam程序(参见http://web.expasy.org/protparam/)评价的脂溶指数为100至300；4)使用Protscale程序评价的弹性(平均弹性)(参见http://web.expasy.org/protscale/)为0.36或更大；5)使用Protparam程序评价的亲水性为3.0或更小；6)使用Protparam程序评价的不稳定指数为30至60；7)使用Protscale(极性)程序评价的极性为0.1或更大。

序列编号为1的氨基酸序列可由序列编号为8的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

序列编号为2的氨基酸序列可由序列编号为9的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

序列编号为3的氨基酸序列可由序列编号为10的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

序列编号为4的氨基酸序列可由序列编号为11的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

序列编号为5的氨基酸序列可由序列编号为12的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

序列编号为6的氨基酸序列可由序列编号为13的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

序列编号为7的氨基酸序列可由序列编号为14的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。

本发明的多核苷酸可以是RNA或DNA的类型，并且DNA包括cDNA和合成DNA。所述DNA可以是单链或者双链。如果DNA为单链的，那么其可以是编码链或者非编码(反义)链。编码序列可以是与选自序列编号为36至56的碱基序列相同的，或者是与之不同的编码序列。所述编码序列通过基因编码的简并或冗余而获得，并编码相同的多肽。

本发明的多核苷酸还包括如上所述的多核苷酸的变形，其对由推导序列编号为15至35的氨基酸序列表征的多核苷酸的片段、类似物或衍生物进行编码。多核苷酸的变形可以是多核苷酸的天然生成的等位变形或者多核苷酸的非天然生成的变形。

本发明的多核苷酸可以具有由选自序列编号为36至56的碱基序列表征的编码序列的天然生成的等位变形。所述的等位变形为具有至少一个核苷酸的替代、缺失或添加的多碱基序列的替换形式，而编码多核苷酸的功能基本上不变化。

本领域技术已知的是单氨基酸可以由至少一个核苷酸密码子编码，并且多核苷酸可被容易地改变来制备替换的多核苷酸编码的相同的肽。因此，在本发明的另一种实施方式中，多核苷酸包括替换的碱基序列编码的包括如上所述的氨基酸序列的肽。核酸分子编码的包括所要求保护的氨基酸序列的肽包括所要求保护的序列和碱基序列编码的位于所要求保护的氨基酸序列的N端或C端的任意氨基酸的任意组合。

本发明的另一个方面提供了一种使用改进的MTD对生物活性分子进行基因设计以具有细胞渗透性的方法。

生物活性分子的治疗应用通常由于低细胞渗透性而受到限制。尽管生物活性分子已经示出通过细胞内的内噬过程而被细胞所摄取，但是采用这种方式进入细胞的分子通常会被细胞内的细胞内小泡捕集并在溶酶体中降解。

本发明的改进的MTD似乎比传统的MTD具有更加有效的细胞渗透性。本发明的改进的MTD可以以套装的形式提供，其包括本领域技术人员已知的用于帮助将肽连接至目标多肽的所需组分。相继地，连接至改进的MTD的目标蛋白质在这种方式中可以在体外或在体内递送至细胞，用于细胞内的内噬作用。

如上所述的多核苷酸可被插入至蛋白质表达载体中以产生通过如上所述的改进的MTD的作用而可由其外侧传递至细胞内的蛋白质。

表达载体被基因设计以将在N端和/或C端方向上编码MTD的核酸序列结合至作为生物活性分子的编码肽、多肽、蛋白质结构域或全长蛋白质的核酸序列，并位于正确的读取框架内从而使得由大分子转导结构域和目标生物活性分子构成的重组蛋白可被表达。表达载体可以在原核或真核表达系统中使用的容易获得的那些中选择。

如在本发明中所使用的，MTD为导引目标蛋白质从细胞外部至内部的细胞内转运的大分子转导结构域，并且改进的MTD比传统MTD具有更加增强的细胞渗透性。在本发明的另一种实施方式中，改进的MTD可以包括肽或多肽通过细胞膜进入细胞的可替换的序列调解进口。

目标蛋白质为通常表现出小于通过细胞膜的最佳渗透性的蛋白质，但是当N端和/或C端连接至本发明的改进的MTD的时候，其由细胞的外部转运至内部。

目标蛋白质可以在改进的MTD和目标多肽、蛋白质结构域或全长蛋白质之间具有切割位点，并且所述切割位点可替换地为因子X位点或者本领域技术人员已知的另一个位点，从而切割重组蛋白质以从主体肽或多肽物理移除改进的MTD。

如在本发明中所使用的，术语“生物活性分子”包括如果被纳入至细胞内能够表现出生物作用的任意分子。因为分子量范围为约100,000至约1百万的非常大的蛋白质被细胞所输出(例如抗体、纤维蛋白原和巨球蛋白)，非常大的蛋白质可以通过本发明的方法而被运输至细胞内。

生物活性分子的例子包括但不限于蛋白质、多肽和肽，其包括生物活性分子的功能结构域，例如生长因子、酶、转录因子、毒素、抗原肽(对于疫苗)、抗体和抗体片段。生物活性分子的其它例子包括核酸，例如质粒、编码核酸序列、mRNA和反义RNA分子、碳水化合物、脂质和糖脂。生物活性分子的其它例子包括用于诊断、治疗和/或预防疾病的那些，特别是具有低细胞膜渗透性的那些。这些治疗剂的一些例子包抗癌药物，例如道诺红霉素，和有毒化学物，因为当通过这种方法施用的时候其可以使用更低的计量，所以现在其可被更加安全地施用。生物活性分子的又一个例子为抗原肽。抗原肽可被给予以提供免疫保护，当涉及免疫反应通过细胞输入的时候。其他的例子包括免疫抑制肽(即现有技术已知的阻断自体反应T细胞)。大量的其它例子对于本领域技术人员是显而易见的。

适用于本发明的生物活性分子的代表性例子根据它们的功能包括酶、激素、转运蛋白、免疫球蛋白或抗体、结构蛋白、运动功能蛋白、受体、信号蛋白和储藏蛋白；根据它们的位置和作用包括膜蛋白或跨膜蛋白、内蛋白、外蛋白或分泌蛋白、病毒蛋白、天然蛋白、糖蛋白、裂解蛋白、具有二硫键的蛋白、蛋白复合物、化学修饰的蛋白和朊病毒。

标准的重组核酸方法可被用于表达基因设计的重组蛋白。编码本发明的改进的MTD的核酸序列可在具有合适的信号和处理序列以及调控序列的核酸表达载体中克隆用于转录和翻译，并且可以使用自动有机合成方法而合成蛋白质。用于合成蛋白质的方法例如在文献[Methods in Enzymology,第289卷:Solid-Phase Peptide Synthesis，GreggB.Fields(编者),Sidney P.Colowick,Melvin I.Simon(编者),Academic Press(1997)]中公开。

为了获得克隆基因或核酸、例如编码MTD肽的cDNA高水平表达，MTD序列典型地被亚克隆至表达载体内，其包含用于引导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及在核酸编码蛋白质的情况中为用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子为本领域已知的，并且在文献[Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,ColdSpring Harbor Laboratory,N.Y.(2001)；和Ausubel等,Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)]中公开。用于表达本发明的改进的MTD的细菌表达系统例如在大肠杆菌、芽孢杆菌和沙门氏菌(Palva等,Gene22:229-235(1983)；Mosbach等,Nature302:543-545(1983))中提供。用于这样的表达系统的试剂盒为市售的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统为本领域已知的并且同样为市售的。在本发明的另一种实施方式中，真核表达载体可以是腺病毒载体，腺相关载体或逆转录病毒载体。

通常地，用于表达通过将蛋白质连接至改进的MTD的N端、C端或两端来制备的细胞可渗透重组蛋白的表达载体可以包括调控序列，例如包括可操作地连接至序列编码大分子转导结构域的启动子。

可以使用的诱导型启动子的非限制性例子包括类固醇-激素响应启动子(例如蜕皮激素响应、雌激素响应和糖皮质激素响应启动子)，四环素“Tet-On”和“Tet-Off”系统，和金属响应启动子。该构建体可被引入至合适的宿主细胞内，例如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或组织培养细胞。该构建体还可被引入至胚胎干细胞以产生作为模型体的基因转移生物。大量合适的载体和启动子为本领域技术人员已知的并且为市售的，用于产生本发明的重组构建体。

已知的方法可被用于构造包含本发明的多核苷酸的载体和合适的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/基因重组。例如，这样的技术在文献[Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,ColdSpring Harbor Laboratory,N.Y.(2001)；和Ausubel等,Current Protocols inMolecular Biology Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)]中公开。

适用于制造细胞可渗透重组蛋白质的宿主细胞包括细菌细胞和真核细胞(例如真菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞)。宿主细胞可通过任意常规方法分裂，包括冻融循环、声波降解法、机械分裂或者使用细胞裂解剂。文献[Scopes,Protein Purification:Principlesand Practice,New York:Springer-Verlag(1994)]公开了用于纯化重组(和非重组)蛋白质的一些通用方法。所述方法例如包括离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱法、选择性沉淀、透析和疏水作用色谱。这些方法可以经调整以设计出用于细胞可渗透重组蛋白质的纯化策略。如果细胞可渗透重组蛋白质包括纯化处理，例如附加表位或金属螯合序列，那么亲和色谱法可被用于极大地纯化蛋白质。

所产生的蛋白质的量可以通过直接地(例如使用蛋白质印迹分析)或间接地(即通过用于特定的DNA结合活性的细胞的分析材料，例如通过电泳迁移率变动分析)通过检测大分子转导结构域来评价。蛋白质可在纯化之前、在任何纯化步骤过程中、或者在纯化之后被检测。在某些方案中，纯化或者完全地纯化是不需要的。

通过本发明的方法制备的基因设计的重组蛋白为细胞可渗透蛋白质，并可被用作为蛋白质基疫苗，特别是当灭杀或衰减全部生物疫苗为不切实际的时候。通过本发明的方法制备的细胞可渗透蛋白质还可被用于治疗多种疾病，特别是免疫疾病或癌症。细胞可渗透蛋白质可被传递至细胞的内部，消除利用重组载体来转染或转换细胞的需求。本发明的细胞可渗透蛋白质可在体外使用来评价蛋白质功能或者可被用于维持细胞处于所期望的状态。

本发明的改进的MTD可被用于在体外或在体内将肽、多肽、蛋白质结构域或者蛋白质递送至目标细胞的内部。改进的MTD可以通过源自重组DNA或RNA分子由重组蛋白质的表达而形成的肽键连接至目标蛋白质，或者可以通过连接子的方式共价连接至MTD而被连接至目标蛋白质。共价键可被用于将本发明的改进MTD连接至非蛋白质分子，例如多核苷酸，用于输入至细胞内。

根据本发明基因设计具有细胞膜渗透性的蛋白质的方法提供了一种用于将治疗蛋白质产物递送至细胞内的方式。本发明与细胞外蛋白质递送的在先描述方法的组合提供了以稳定的、功能性的形式以控制释放的方式传递蛋白质以输入至细胞内的方法。

多肽使用合适的表达载体和表达系统来制造。细胞渗透性基于蛋白质或多肽通过重组具有位于N端和/或C端的MTD的蛋白质至所表达的多肽的表达而被赋予。较不稳定的蛋白质通过本领域技术人员已知的并且在先描述的方法而被稳定化。递送至细胞外环境通过在恰当的载体中、例如微球载体提供稳定化的重组蛋白质来完成。蛋白质的选择将指示恰当的载体和表达系统，以及合适的稳定和递送技术。药物递送系统领域的技术人员可以从所描述的那些中选择出合适的技术。

如在本发明中所使用的，术语“细胞膜”涉及包含脂质的屏障，其将细胞或细胞团与细胞外空间相隔离。细胞膜包括但不限于质膜、细胞壁、细胞内细胞器膜，例如线粒体膜、核膜等。

如在本发明中所示的，术语“生物活性分子”涉及能够诱发或改进在系统内的生物响应的化合物或分子。生物活性分子的非限制性的例子包括抗体(例如单克隆的、嵌合的、人源化的等)、胆固醇、激素、抗病毒剂、肽、蛋白质、化疗剂、小分子、维生素、辅助因子、核苷、核甘酸、寡核苷酸、酶核酸、反义核酸、三螺旋形成寡核苷酸、2,5-A嵌合体、siNA、siRNA、miRNA、RNAi抑制剂、dsRNA、同种异型酶、其适配子、诱饵和类似物。本发明的生物活性分子还包括能够调节其它生物活性分子的药代动力学和/或药效动力学的分子，例如脂质和例如为聚胺、聚酰胺、聚乙二醇和其他聚酯的聚合物。在特定的实施方式中，术语生物活性分子与术语“大分子”可互换地使用。

如在本发明中所使用的，术语“大分子”涉及大的分子(分子量大于1,000道尔顿)，例如但不限于生物来源或合成来源的肽、蛋白质以及寡核苷酸和多核苷酸。

如在本发明中所使用的，术语“肽”涉及由单链D-或L-氨基酸或者通过肽键结合的D-和L-氨基酸混合物构成的化合物。优选地，肽包含至少两个氨基酸残基并且在长度上小于约50个氨基酸。

如在本发明中所使用的，术语“蛋白质”涉及由线性设置的通过肽键连接的氨基酸组成的化合物，但是与肽相比，具有明确定义的构象。蛋白质与肽相反，优选是包含50个或更多的氨基酸的链。

如在本发明中所使用的，术语“多肽”涉及至少两个氨基酸残基并包含一个或多个肽键的聚合物。多肽涵盖肽和蛋白质，而无需考虑多肽是否具有明确定义的构象。

如在本发明中所使用的，术语“核酸”涉及寡核苷酸或多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，以及RNA或DNA的类似物，例如由任意的单链或双链形式的核苷酸类似物构成。

氨基酸残基在这里涉及为它们标准的单字母符号或三字母符号或者它们的全称：A，Ala，丙氨酸；C，Cys，半胱氨酸；D，Asp，天门冬氨酸；E，Glu，谷氨酸；F，Phe，苯丙氨酸；G，Gly，甘氨酸；H，His，组氨酸；I，Ile，异亮氨酸；K，Lys，赖氨酸；L，Leu，亮氨酸；M，Met，蛋氨酸；N，Asn，天冬酰胺；P，Pro，脯氨酸；Q，Gln，谷氨酰胺；R，Arg，精氨酸；S，Ser，丝氨酸；T，Thr，苏氨酸；V，Val，缬氨酸；W，Trp，色氨酸；X，Hyp，羟基脯氨酸；和Y，Tyr，酪氨酸。

如在本发明中所使用的，术语“大分子转导结构域(MTD)”是指帮助大分子转运至细胞内的肽。

除非另有所指，在这里所使用的所有的技术和科技术语均具有与本发明所属的相同的本领域技术人员所常规理解的含义。尽管与在这里所描述的那些类似的和等价的任意方法和材料也可被用于实践或测试本发明，但是特定的方法和材料现在将被描述。在这里所提及的所有的出版物在这里均通过参考而被全部引入，从而揭示并描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。必须注意到入在这里和在所附加的权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数，除非在文本中清楚地另有所指。

在本发明示例性的实施方式中，发明人证明了在现有专利中公开的涉及衍生自信号肽的细胞可渗透肽的大分子转导结构域(MTD)的结构特征(韩国专利公开10-2009-0103957:NOVEL MACROMOLECULE TRANSDUCTION DOMAINS AND METHODS FORIDENTIFICATION AND USES THEREOF)通过PEP FOLD服务器服务程序使用融合有EGFP荧光蛋白的N端序列的序列未被损坏，其可以在线证实(参见图1至4)。

在本发明的又一个示例性实施方式中，通过将FITC荧光物质连接至MTD而形成的复合物被制备以定量地确定MTD肽的细胞渗透性，并且细胞利用FITC-MTD肽进行处理并随后使用流式细胞分析仪进行分析。结果，与常规MTD相比，在本发明的改进的MTD中示出更高的荧光信号，并且此外，使改进的MTD穿透至细胞内的作用通过确认MTD比蛋白质转导结构域(PTD)更加有效地递送FITC至细胞内而被证明。

在本发明的又一个示例性的实施方式中，细胞渗透性和细胞内定位使用通过令FITC荧光物质连接至MTD来制备的复合物通过共聚焦显微镜而被直视。结果，与常规MTD相比，更高的细胞渗透性在改进MTD中，其与流式细胞术的结果是相同的，并且其还确定了MTD的细胞渗透性比PTD更高。

此外，在本发明的又一个示例性实施方式中，融合MTD2173A的LacZ siRNA-Cy3被静脉注射地至老鼠以令肺组织渗透性通过共聚焦显微镜可视化，并且在老鼠中由LacZsiRNA持续表达的β-半乳糖苷酶蛋白的产生的降低通过使用显微镜观察摘除的用X-gal染色的肺组织而确定，证明了改进MTD至组织内的长时间渗透。

在下文，示例性的实施例将被提出以帮助理解本发明。然而，下文的实施例仅被提供以使得本发明可被更完全地理解，而不限制本发明的范围。

实施例1.用于发明改进的MTD的MTD肽的选择

发明人选择目标MTD的序列来增强转导能力，该序列满足如下的序列条件，其被量化以相对比较在由本发明人在先研发的技术、即韩国专利公开110-2009-0103957中研发的193个MTD。

选择条件如下：

1)在大分子转导结构域的序列中，选择脯氨酸位于中间的MTD序列。

2)在大分子转导结构域的序列中，选择具有高细胞外分泌-诱导性的MTD序列。

3)在大分子转导结构域的序列中，选择满足特定水平的脂溶脂数的MTD序列，脂溶脂数为确定MTD的生理化学特征的因素。

4)在大分子转导结构域的序列中，选择满足特定水平的弹性的MTD序列，弹性为确定MTD的生理化学特征的因素。

5)在大分子转导结构域的序列中，选择满足特定水平的亲水性的MTD序列，亲水性为确定MTD的生理化学特征的因素。

6)在大分子转导结构域的序列中，选择满足特定水平的不稳定指数的MTD序列，其为确定MTD的生理化学特征的因素。

7)在大分子转导结构域的序列中，选择满足特定水平的极性的MTD序列，极性为确定MTD的生理化学特征的因素。

如上所述的条件将被详细地描述。

为了筛选特定的代表性序列，如将在步骤1)中所描述的，基于脯氨酸的存在和位置而确定代表性序列。

在构成MTD序列的氨基酸的丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸和异亮氨酸中，具有短侧链序列和小尺寸的脯氨酸对用于形成氨基酸序列的二级结构的自由度具有影响，并有助于MTD穿过细胞膜的渗透。在标题为“NOVEL MACROMOLECULE TRANSDUCTION DOMAINS ANDMETHODS FOR IDENTIFICATION AND USES THEREOF”的韩国专利公开号10-2009-0103957中公开的MTD中，在它们氨基酸序列的中间具有脯氨酸，由此被分类以具有用于形成氨基酸序列的二级结构的高自由度的49个MTD被确定。

相继地，在步骤1)中所选择的MTD中，选择具有高细胞外分泌可能性的序列。一些水溶性蛋白质具有可以与受体介导输送相互作用的信号，并且在信号介导输送中，蛋白质具有一个或多个指示传递目标的信号序列。因此，假定相对于细胞外分泌-诱导序列更高的相似性可以改善转导能力，使用Signal P程序来评价细胞外分泌-诱导能力。相对于每个结构域来说，评价10％至90％之间的可能性，并且在步骤1)中确定的MTD中，被评价具有60％或更大可能性的序列被选择为改进的目标序列。

相继地，在步骤2)中所选择的MTD中，如在步骤3)中所描述的，选择满足特定水平的脂溶指数的序列，脂溶指数为确定MTD的生理化学特征的因素。脂溶指数为确定通过氨基酸的侧链的碳链来确定的分子的总体积的物理特征，并被评价为改进细胞膜的结构的特征。使用Protparam程序通过MTD的每个氨基酸序列的原始值和全部序列的平均值确定脂溶脂数(参见http://web.expasy.org/protparam/)。所述的Protparam程序在可视化由氨基酸组成的蛋白质或肽的物理特征时是有用的工具，并且被评价以具有100至300的脂溶脂数的序列被选择为代表性序列来改善转到能力。

相继地，在步骤3)中所选择的MTD中，如在步骤4)中所描述的，选择满足特定水平的弹性的序列，弹性为确定MTD的生理化学特征的因素。所述弹性为涉及MTD的N端氨基酸和C端氨基酸之间相关性和自由度的生理化学特征，并提供结构弹性，并与至细胞膜的亲和性相关。使用Protscale(平均弹性)程序评价所述弹性根据氨基酸序列的长度和氨基酸的侧链序列的结构(refer to http://web.expasy.org/protscale/)。所述Protscale程序被用作为用于数字化由氨基酸组成的蛋白质或肽的物理特征的工具，并且在步骤3)中确定的MTD中，使用Protscale(平均弹性)程序来评价的具有0.36或更大弹性的序列被选择为用于改善转导能力的代表性序列。

相继地，在步骤4)中所选择的MTD中，如在步骤5)中所描述的，满足特定水平的亲水性的序列被选择，亲水性为确定MTD的生理化学特征的因素。所述亲水性为通过氨基酸的原始特征来确定的生理化学特征，并被认为是确定物理特性的特征，并且已知当亲水性为3.0或更大的时候会导致严重的凝聚。此外，通过MTD的氨基酸的原始数值和全部序列的平均值来确定亲水性，并使用Protparam程序来评价。据此，在步骤4)中所选择的MTD中具有3.0或更小的亲水性的序列具有1.3至3.9之间数值的亲水性的评价结果被确定为用于改进的代表性序列。

相继地，在步骤5)中所选择的MTD中，如在步骤6)中所描述的，满足特定水平的大分子转导结构域的不稳定指数的序列被确定。所述不稳定指数为指示氨基酸序列稳定性的特征，通过氨基酸在序列上的设置次序来确定，并且随着不稳定指数的增加，不稳定性也增加。所述不稳定指数为确定MTD的生理化学特征的因素，被认为是对结构域的细胞内稳定性具有影响的特征，并使用Protparam程序来评价。据此，在不稳定指数为0至130的MTD中，在步骤5)中确定的MTD中具有30至60的不稳定性的序列被选择为用于改进的代表性的序列。

相继地，在步骤6)中所选择的MTD中，如在步骤7)中所描述的，满足特定水平的MTD极性的序列被确定，极性为确定MTD的生理化学特征的因素。所述极性为示出相对于水的亲和性的比例，其通过氨基酸组分的碳链长度和羟基基团的存在而确定。所述极性为确定MTD的物理特性以及亲水性的特征，并被认为对细胞膜的亲和性具有影响。所述极性通过MTD的氨基酸的原始数值和全部序列的平均值来确定，并使用Protscale(极性)程序来评价。据此，在步骤6)中确定的MTD中，使用Protscale(极性)程序而评价为具有0.1或更大极性的序列被选择为用于改进的代表性序列。

特别地，用于在韩国专利公开10-2009-0103957公开的MTD中发明改进MTD的目标MTD，JO-103(序列编号3)通过如下的过程来确定。

i)根据名称为“NOVEL MACROMOLECULE TRANSDUCTION DOMAINS AND METHODS FORIDENTIFICATION AND USES THEREOF”的韩国专利公开10-2009-0103957公开的MTD中的JO-103由LALPVLLLA序列组成；

ii)在使用Singal P程序评价细胞外分泌可能性中，具有90％的可能性；

iii)使用Protparam程序确定具有271的脂溶脂数；

iv)使用Protscale程序确定具有0.38的弹性；

v)使用Protparam程序确定具有2.8的疏水性；

vi)使用Protparam程序确定具有52的不稳定指数；

vii)使用Protscale程序确定具有0.13的极性。

由此，已知被确定为用于改善转导性的目标序列的JO-103为满足所有的7个步骤的目标结构域。

通过相同的方法，选择五个用于发明改进的MTD的目标MTD，并且特别地，所选择的目标MTD为MTD JO-018(序列编号1),MTD JO-067(序列编号2),MTD JO-103(序列编号3),MTD JO-159(序列编号4)和MTD JO-173(序列编号5)。

通过改变MTD JO-173的脯氨酸的位置来确保额外的弹性；并且制备中间肽MTD173A(序列编号7)。因为采用这种方式制备的MTD173A满足所有的7个步骤选择条件，所以其也被包括在用于发明改进MTD的目标MTD序列中。

此外，对于选择作为目标MTD的JO-18来说，序列被具有低亲水性的氨基酸所取代，由此推导中间肽，MTD18m(序列编号6)，从而改善物理特性。MTD18m也满足7个步骤的选择条件并由此也包括在用于发明改进MTD的目标MTD序列中。

实施例2.改进的MTD的发明

对于在实施例1中选择的7个目标MTD，添加1至2亲水性(极性)氨基酸以被施加至疏水性结构域，由此提高对细胞膜的可接近性，并由此产生更加有效地将生物活性分子传递至细胞内的新的改进MTD，并由此发明通过如下通式表示的肽：

[通式1]

A1-A2-MTD；

在这里，A1为蛋氨酸(M，Met)；A2为选自由精氨酸(R，Arg)、组氨酸(H，His)和赖氨酸(K，Lys)构成的组的氨基酸，其带有正电荷；并且MTD为选自在实施例1中选择的由序列编号为1至7构成的组的7氨基酸序列。

通过通式1发明的改进MTD的序列与在序列编号为15至35中所描述的氨基酸序列相同，并且基于所发明的氨基酸序列而合成肽，由此确定细胞渗透性。

实施例3.改进的MTD的二级结构的分析

使用PEP FOLD服务器程序进行分析在实施例2中发明的改进的MTD的二级结构。

结果，如在图1至4中所示的，确定在实施例2中发明的改进MTD不会损坏在名称为“NOVEL MACROMOLECULE TRANSDUCTION DOMAINS AND METHODS FOR IDENTIFICATION ANDUSES THEREOF”的韩国专利公开10-2009-0103957中公开的MTD的结构特征，并维持增加细胞膜渗透性的α-螺旋结构。

实施例4.改进的MTD的合成

在实施例2中设计的改进MTD的合成通过使用Fmoc固相肽合成(SPPS)由C端开始一个接一个地连接来完成。

特别地，首先，位于肽的C端的第一氨基酸被连接至其的树脂被使用。所提供的树脂被用于通过选择的合适的树脂合成，所述合适的树脂根据需要选自NH₂-Lys(Dde)-2-氯-三苯甲基树脂、NH₂-Met-2-氯-三苯甲基树脂、或者NH₂-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。

第二，其中N端利用Fmoc保护并且残基利用Trt、Boc、t-Bu等保护的移除所有酸的所有氨基酸材料被用于合成肽(Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Met-OH)。

第三，Fmoc通过在室温下使用20％哌啶的DMF执行持续5分钟的反应两次来移除。

第四，DMF、MeOH、MC和DMF被相继地冲洗。

第五，为了从树脂隔离合成的肽并移除残基的保护基，使用TFA/EDT/茴香硫醚/TIS/H2O＝90/2.5/2.5/2.5/2.5(TFA＝三氟乙酸、EDT＝1,2-乙二硫醇、TIS＝三异丙基硅烷)。

最后，在通过HPLC提纯之后，使用质谱仪来执行鉴定，并进行冻干，由此获得改进的MTD。

此外，为了合成荧光物质(FITC)连接的MTD，在通过如上所述的合成方法进行MTD合成之后，最终添加赖氨酸(K)以执行肽合成，并且随后FITC被结合至赖氨酸的自由氨残基。所合成的MTD-FITC与树脂相隔离，并通过HPLC提纯，并且肽的分子量通过质谱仪而被确定，并被冻干，由此制备MTD-FITC。其后，所合成的改进MTD-FITC在光线屏蔽状态下被溶解在无菌蒸馏水中至1mM的浓度，以少量分散在1.5mL的离心容器中，并冷冻储存直至使用。

实施例5.使用流式细胞术鉴定改进的MTD的体外细胞渗透性

为了确定本发明的改进的MTD和常规MTD(改进的目标MTD)的体外细胞渗透性，使用了流式细胞术。

特别地，利用FITC标记1、5或10μM的MTD之后，所合成的试样用于处理人结肠癌(HCT116,Cat No.CCL-247,ATCC,USA)，并培养4小时。HCT116细胞在包含10％的胎牛血清(FBS)和1％的盘尼西林/链霉素(10,000单位盘尼西林和10,000μg/mL链霉素，Invitrogen)的RPMI1640介质中在含有5％CO₂的湿润环境中在37℃下培养。在完成培养后，胰蛋白酶被处理以移除暴露至将要被处理的每个试样的HCT116细胞的细胞膜的游离MTD-FITC，并且使用冷的磷酸盐缓冲溶液冲洗所获得的细胞三次。

回收所冲洗的细胞，并施加至流式细胞术(FACS Calibur,Beckton-Dickinson,San Diego CA,USA)。对于每个试样，使用CellQues Pro细胞计数分析软件来分析细胞(1×10⁴)以对改进MTD-FITC和常规MTD-FITC的细胞渗透性执行定量比对和分析。

在图5中示出分析结果，并且特别地，在图5中示出流式细胞术结果，填充灰色的曲线指示单个细胞的细胞渗透性，绿色曲线指示1μM的处理浓度组的细胞渗透性，橙色曲线指示5μM的处理浓度组的细胞渗透性，并且红色曲线指示10μM的处理浓度组的细胞渗透性。

如在图5中所示的，可以看出10μM的MTD-FITC的比较几何均值，改进的MTD具有常规MTD的最小140％至最大270％的高荧光信号，并且甚至是低浓度的改进的MTD也具有与高浓度的常规MTD相类似水平的增强的细胞渗透性。

据此，可以看出本发明的改进的MTD与常规的MTD相比，细胞的质膜渗透性显著地增强。

实施例6.使用流式细胞仪鉴定改进的MTD的体外细胞渗透性(HEK293细胞)

另外地，对于衍生自人胚胎肾细胞的HEK293细胞来说，通过流式细胞仪确定体外细胞渗透性。通过使FITC连接至本发明的改进MTD和现有已知的MTD而制备试样，杂乱的肽被认为具有低细胞渗透性和细胞渗透性，并且具有先前评价的细胞渗透性的kFGF4衍生的大分子转导序列(MTS)被用作为对照组。

特别地，5μM的试样对人胚胎肾细胞(HEK293)进行处理，并培养6小时。HEK293细胞在包含10％胎牛血清和1％盘尼西林/链霉素(10,000单位盘尼西林和10,000μg/mL链霉素，Invitrogen)的RPMI1640介质中在含有5％CO₂的湿润环境中在37℃下培养。在完成培养后，胰蛋白酶被处理以移除暴露至将要被处理的每个试样的HCT116细胞的细胞膜的游离MTD-FITC，并且使用冷的磷酸盐缓冲溶液冲洗所获得的细胞三次。

回收所冲洗的细胞，并施加至流式细胞术(FACS Calibur,Beckton-Dickinson,San Diego CA,USA)。对于每个试样，使用CellQues Pro细胞计数分析软件来分析细胞(1×10⁴)以对改进MTD-FITC和现有技术MTD-FITC的细胞渗透性执行定量比对和分析。

在图6中示出分析结果，并且作为结果，确定具有序列编号为3的氨基酸序列的JO-103MTD肽在改进之后的细胞渗透性增强150％至190％，并且具有序列编号为4的氨基酸序列的JO-159MTD肽在改进之后的细胞渗透性增强180％至210％。此外，在通过改进具有序列编号为7的氨基酸序列的JO-173A MTD肽来制备的MTD肽的情况中，确定细胞渗透性被改善高达190-230％。

据此，可以看出本发明的改进的MTD与常规的MTD相比，细胞渗透性被显著地增强。

实施例7.使用共焦激光扫描显微镜鉴定改进的MTD的体外细胞渗透性

为了确定本发明的改进的MTD基于常规MTD的功能上的改善，可视的细胞渗透性使用共焦激光扫描显微镜相对于衍生自皮肤的细胞和衍生自癌症的细胞进行鉴定。

7-1.衍生自皮肤的细胞的细胞渗透性的鉴定

癌化的人角质形成细胞(HaCaT cells,Cat No.300493,CLS,Germany)被用作为衍生自皮肤的细胞，并且不具有细胞渗透性的杂乱的肽以及被认为具有细胞渗透性的Tat和MTS被用作为对照组。

特别地，在测试之前，HaCaT细胞在包含玻璃盖片的12孔培养板中培养24小时。HaCaT细胞在包含10％胎牛血清(FBS)和1％盘尼西林/链霉素(10,000单位盘尼西林和10,000μg/mL链霉素，Invitrogen)DMEM介质中在含有5％CO₂的湿润环境中在37℃下培养。在5μM的肽对HaCaT细胞进行处理1小时之后，所述细胞使用4％的多聚甲醛(PFA)在室温下固定20分钟以使用共聚焦显微镜观察细胞渗透性。

结果，如在图7至9中所示的，可以观察到改进MTD的细胞渗透性通过本发明的肽的改进而被显著地改善。

7-2.宫颈癌细胞的细胞渗透性的鉴定

使用共聚焦显微镜(Carl Zeisse,Germany)比较衍生自作为衍生自癌症的细胞的人类宫颈癌的HeLa细胞(HeLa cell,Human cervix adenocarcinoma,Cat No.CCL-2,ATCC,USA)的细胞渗透性。

特别地，在测试之前，HeLa细胞在具有玻璃盖片的12孔培养板中培养24小时。HeLa细胞在包含10％胎牛血清(FBS)和1％盘尼西林/链霉素(10,000单位盘尼西林和10,000μg/mL链霉素，Invitrogen)DMEM介质中在含有5％CO₂的湿润环境中在37℃下培养。在5μM的肽对HaCaT细胞进行处理1小时之后，所述细胞使用4％的多聚甲醛(PFA)在室温下固定20分钟以使用共聚焦显微镜观察细胞渗透性。

为了直接检测吸收同化的MTD-FITC，细胞使用磷酸缓冲溶液和5μM作为核荧光染色溶液的4',6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)冲洗三次，被反向染色。在10分钟的DAPI染色之后，使用磷酸缓冲溶液冲洗细胞三次，并保存蛋白质的荧光标记，20μl的载体介质被滴加在载玻片上并观察。通过染色MTD-FITC处理的细胞来确定转移至核内和细胞渗透性，其通过DAPI染色来帮助区分细胞内的转移部分。此外，使用具有共聚焦显微镜的nomarski过滤器来观察原始形式的细胞，并且使用适用于荧光染料的过滤器来观察FITC荧光和DAPI荧光。

结果，如在图10中所示的，可以看出改进MTD比在测试中所使用的常规MTD肽(18m,67,103,159和173)具有显著更高的细胞内转导能力。此外，不像其中肽被连接至细胞膜外部的PTD(Tat)的结果，已经确定在测试中所使用的改进MTD(1018m,1067,1103,1159,1173A,2103和2159)被明显地分配至细胞质内，并且由此，在本发明中新发明的改进MTD的细胞渗透性的显著的改善在癌症细胞中也被观察到。

实施例8.改进的MTD的来自体内的上皮组织渗透性的鉴定

为了对本发明的改进MTD的来自体内的组织渗透性进行分析，在EpiOral上皮模型中(MatTek,MA,USA)，常规的FITC结合的MTD(18m,173)和改进MTD(1018m和1173A)被选择性地处理，并通过共聚焦显微镜(Carl Zeisse,Germany)进行可视地观察。

特别地，在测试的前一天，EpiOral上皮模型在12孔板中在含有5％CO₂的湿润环境中在37℃下培养15小时，每个孔包含0.5ml由MatTek提供的测试基质。测试当天，所述基质使用新的基质进行交换，50μM浓度的40μl MTD在EpiOral表皮上进行处理，并在含有5％CO₂的湿润环境中在37℃下培养5小时。所述的EpiOral上皮模型被固定在4％的多聚甲醛(PFA)中15小时或更长时间，并且使用Microm cryosector(Microm HM520cryostat,Thermo)制备冻干切片(6μm)并置于载玻片上以形成用于显微镜的载玻片。所形成的载玻片使用磷酸缓冲溶液处理10分钟来冲洗片段，并使用0.5mM的DAPI溶液处理5分钟来染色组织中的核。所染色的组织利用磷酸缓冲溶液再次冲洗三次，持续10分钟，使用载体介质固定至载玻片上，并通过共聚焦显微镜观察。结果在图11中示出。

相继地，如在图11中所示的，确定在阴性对照(载体)中没有示出显著水平的荧光，但是在测试中使用的改进MTD根据时间而被渗透至EpiOral上皮模型中。此外，与在测试中使用的常规MTD(18m和173)相比，确定荧光物质被更加有效地递送至深层组织，并且在改进MTD(1018m和1173A)中荧光的亮度也被增强。

实施例9.改进的MTD的体内上皮组织的渗透性的鉴定

为了对本发明的改进的体内上皮组织的渗透性进行分析，对于8周龄的雌性ICR老鼠(OrientBio,Korea)，浓度分别为100μg的100μl连接荧光指示剂(FITC)的改进MTD(M1067)-FITC、Tat-FITC和单独FITC被滴加在每个个体的尺寸为2.5cm×2.5cm的消毒纱布上，并使用Tegarderm(3M,USA)固定在老鼠的背部。在1、3、6和12小时之后，老鼠通过颈脱位法处死，并提取施加药物部分的皮肤。其后，皮肤被放置在4％的多聚甲醛中持续24小时来固定组织，并随后在6μm的冻干切片中制备来形成载玻片。所形成的载玻片利用PBS缓冲溶液处理10分钟来冲洗碎片，并暴露至0.5mM的DAPI溶液中5分钟来对组织中的核进行染色。所染色的组织利用PBS缓冲溶液再次冲洗三次，持续10分钟，使用载体介质而被固定，并通过共聚焦显微镜观察。结果在图12中示出。

相继地，如在图12中所示的，确定在阴性对照中没有检测到荧光信号，上皮渗透在仅存在FITC时并未被诱导，并且对于Tat-FITC处理的组，在作为皮肤最上层的角质层中特别地检测到荧光信号。然而，在测试中所使用的改进MTD、MTD1067中，确定至深层组织内的上皮渗透会根据施加时间而发生，并且所渗透的肽还特别地存在于皮肤滤泡细胞的细胞质内。因此，确定本发明的改进MTD表现出体内以及体外显著的极佳的组织渗透性。

实施例10.通过使乙酰化六肽连接至改进MTD来制备的肽复合物的体外细胞渗透性的鉴定

为了比较根据本发明的改进MTD的定位和运输组合的细胞渗透性，低分子量肽、乙酰化六肽被连接至其的肽复合物被合成，并且进行用于肽复合物的体外细胞渗透性的测试。

特别地，为了确定细胞渗透性，使用衍生自人类皮肤的黑素瘤细胞(A375SM,人类黑素瘤,KCLB No.80004,KCLB,Korea)，乙酰化六肽(AH，由有效增强褶皱并防止老化的六个氨基酸组成的肽)被应用为低分子量肽，并且具有序列编号为16的氨基酸序列的M1067肽和具有序列编号为17的氨基酸序列的M1103肽被用作为改进MTD。

特别地，在测试前一天，A375SM细胞在具有玻璃盖玻片的12孔培养板内培养24小时。A375SM细胞在包含10％FBS和1％盘尼西林/链霉素(10,000单位盘尼西林和10,000μg/mL链霉素，Invitrogen)的MEM基质中在含有5％CO₂的湿润环境中在37℃下培养。5μM的未被MTD连接的AH和改进MTD连接的MTD-AH分别对A375SM细胞处理6小时。在肽的处理之后，为了观察测试材料的细胞渗透性，细胞利用4％PFA在室温下固定20分钟。

为了直接检测内在化的MTD-AH，使用磷酸缓冲溶液冲洗细胞三次，并且使用4',6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)反向染色，其为核荧光染料。在DAPI染色10分钟之后，使用磷酸缓冲溶液冲洗三次细胞，并使用5μg/ml Con A(伴刀豆球蛋白A)再次进行反向染色，其为用于细胞膜的染料。在使用Con A染色10分钟之后，使用磷酸缓冲溶液冲洗细胞三次，并且为了保存蛋白质的荧光标签，20μl的载体介质被滴加在载玻片上来观察细胞。转移至核内和细胞渗透性通过使用DAPI和Con A染色每个处理的细胞以帮助区分细胞内转移部分来确定。此外，使用nomarski过滤器通过共聚焦显微镜来观察原始形式的细胞，并且FITC荧光、DAPI荧光和Con A荧光使用适用于荧光染料的过滤器来观察。

相继地，如在图13中所示的，确定通过使改进MTD、M1067在正向连接至乙酰化六肽而制备的M1067F-AH，和通过使改进MTD在反向方向连接至乙酰化六肽的C端而制备的M1067R-AH，通过使改进MTD、M1103的氨基酸在正向连接至乙酰化六肽而制备的M1103F-AH以及在反向连接至乙酰化六肽的C端的M1103R-AH具有显著极佳的细胞渗透性，与未连接MTD的乙酰化六肽对照组相对比。

据此，可以看出本发明发明的改进MTD被连接至生物活性分子，由此表现出极佳的细胞渗透性，当改进MTD的氨基酸序列在正向上被连接的时候，或者在被设置在反向上时而被连接的时候，并且由此，本发明不会被其连接方向限制。

实施例11.改进MTD的体内肺组织渗透性的鉴定

11-1.结合siRNA的MTD的制备

为了对本发明的改进MTD的体内肺组织渗透性进行分析，首先制备了结合siRNA的MTD。在这里，肽和siRNA之间的共价键使用4FB-siRNA和HyNic-肽根据solulink的寡核苷酸/肽结合方法来完成。

特别地，首先，N-琥珀酰亚胺-4-甲酰基苯甲酰胺(S-4FB)被溶解在DMF溶液中，S-4FB被添加至结合用量为LacZ siRNA和LacZ siRNA浓度20倍的缓冲溶液(100mM磷酸钠、150mM氯化钠，pH6.0)，并且反应在室温下进行2小时。为了使用缓冲溶液交换在反应混合物中存在的过量S-4FB，执行脱盐纯化。

其次，琥珀酰亚胺-6-肼基-烟碱(6-Boc-Hynic)和O-苯并三唑-1-基-四甲基脲(HBTU)被溶解在DMF中，添加二异丙基乙胺(DiPEA)，并且所获得的产物被立即添加至Fmoc保护的肽树脂。在反应1小时之后，为了与Hynic肽树脂相隔离，使用TFA/TIS/丙酮/H₂O(92.5/2.5/2.5/2.5)。所获得的产物通过HPLC提纯，并通过MS鉴定制备Hynic肽。

再次，4FB改进的LacZ siRNA和相应于4FB改进的LacZ siRNA5倍摩尔比的hynic肽在TurboLink催化缓冲溶液(10mM磷酸盐、15mM氯化钠、10mM苯胺，pH6.0)中混合，并在室温下反应2小时。

最后，过量的肽使用Sartorius Vivaspin渗滤从反应产物移除，并利用2％NuSieve GTG琼脂糖凝胶鉴定。使用质谱仪来确定肽的分子量，并且肽被冻干来制备siRNA-肽共价复合物。

11-2.改进MTD的体内肺组织渗透性的鉴定

为了对本发明的改进MTD的体内组织渗透性进行分析，通过实施例10-1的方法制备的融合至改进MTD2173A的200μg/头的LacZ-siRNA-Cy3被静脉注射至B6ROSA26老鼠内连续地表达β-半乳糖苷酶3天，并且在两天后，处死老鼠以提取肺部。所提取的肺部被放在4％的多聚甲醛(PFA)中15小时或更长以被固定，冻干切片使用Microm冷冻切片机(MicromHM520低温保持器,Thermo)来制备，并放置在载玻片上来制备用于显微镜的载玻片。所制备的载玻片利用磷酸缓冲溶液处理10分钟来冲洗片段，并利用0.5mM DAPI溶液处理5分钟来染色组织中的核。所染色的组织利用磷酸缓冲溶液被再次冲洗三次，持续10分钟，使用载体介质而被固定，并通过共聚焦显微镜观察。结果在图15中示出。其后，如上所述制备的载玻片在X-gal染料中反应过夜，并且随后，组织使用苏木精-曙红(HE)染色来观察β-半乳糖苷酶的活性。结果在图16中示出。

相继地，如在图15中所示的，可以看出在阴性对照(载体)中没有观察到显著水平的荧光，但是肺组织的细胞内渗透在测试中所使用的MTD-LacZ siRNA-Cy3中发生。

此外，如在图16中所示的，可以看出在阴性对照中的绝大多数器官碎片均观察到β-半乳糖苷酶活性，但是在MTD-LacZ siRNA-Cy3注射的老鼠的器官碎片中很少观察到。

据此，可以看出本发明的改进MTD可被用于传递例如为难于递送至细胞内的siRNA或药物的材料，并且可以有效地将材料或药物传递至器官组织内，并且所递送的材料或药物在组织中是有效的。

因此，可以看出本发明的改进MTD与常规MTD相比还增强了至组织内的体内渗透性以及细胞内渗透性。

实施例12.皮肤病学活性物质被结合至其的改进MTD的皮肤安全性的评价

12-1.改进MTD-香豆酸的合成

20％哌啶/N-甲基吡咯烷酮溶液对在实施例4中合成其中氨基酸在N端被连接的改进MTD(M1067)进行处理从而移除Fmoc基团，利用N-甲基吡咯烷酮和二氯甲烷冲洗，并且市售化合物香豆酸(Sigma,USA)被连接至其。在连接之后，所获得的产物利用N-甲基吡咯烷酮和二氯甲烷冲洗数次，并在氮气下干燥。在这里，所干燥的产物利用包含三氟乙酸：苯酚：硫代苯甲醚：水：三异丙基硅烷的比值为90：2.5：2.5：2.5：2.5(v/v)的溶液处理2至3小时来移除肽保护基团，连接肽的香豆酸与树脂相隔离，并使用二乙醚而沉淀肽。10％Pd/C被添加至甲醇以移除保护结合至香豆酸的C的第9碳的醇基的苄基基团，并在室温下在氢气中搅拌约1小时，通过使用硅藻土来移除Pd/C而获得的剩余溶液被减压并浓缩。如上所述获得的改进MTD-香豆酸衍生物使用洁净的具有包含0.1％三氟乙酸的梯度乙腈的反相高效液相色谱柱(Zobax,C8,21.1mm×25cm)来提纯，由此合成改进MTD-香豆酸衍生物，其中香豆酸被连接至具有由通式2表达的序列编号为16的氨基酸序列的改进MTD。

[通式2]

(4-羟基肉桂酰)Ala Ala Val Ala Pro Ala Ala Ala Arg Met

12-2.改进MTD-乙酰基五肽的合成

在化妆品行业市售的肽、乙酰基五肽(乙酰化的Lys Ther Ther Lys Ser)在实施例4中合成的其中氨基酸在N端被连接的具有序列编号为16的氨基酸序列的改进MTD(M1067)上被相继地合成，使用20％的哌啶/N-甲基吡咯烷酮溶液进行处理从而移除Fmoc基团，利用N-甲基吡咯烷酮和二氯甲烷冲洗数次，并在氮气下干燥。在这里，所干燥的产物利用包含三氟乙酸：苯酚：硫代苯甲醚：水：三异丙基硅烷的比值为90：2.5：2.5：2.5：2.5(v/v)的溶液处理2至3小时来移除肽保护基团，并且肽与树脂相隔离，并且随后，利用二乙醚来沉淀。如上所述获得的改进MTD-乙酰基五肽衍生物使用洁净的具有包含0.1％三氟乙酸的梯度乙腈的反相高效液相色谱柱(Zobax,C821.1mm×25cm)来提纯，由此合成由通式3表达的具有序列编号为16的氨基酸序列的改进MTD(M1067)。

[通式3]

Met Arg Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Lys*Ther Ther Lys Ser

*:乙酰化的赖氨酸

12-3.用于包含改进MTD(M1067)-香豆酸的化妆品的组合物的制备

包含改进MTD(M1067)-香豆酸或改进MTD(M1067)的香料组合物被配制成为在如下的表1中所示的组合物。

组分1至6被添加至水溶解器，加热至70℃以完全溶解，并被转移至乳化容器。组分7至11被添加至油溶解器，加热至70℃以完全溶解，并在乳化容器中混合。内容物被冷却至40℃，并且组分12、13和15被添加至乳化容器，并冷却至室温，由此制备包含改进MTD(M1067)-香豆酸的组合物。

对比实施例1：组分1至6被添加至水溶解器，加热至70℃以完全溶解，并被转移至乳化容器。组分7至11被添加至油溶解器，加热至70℃以完全溶解，并在乳化容器中混合。内容物被冷却至40℃，并且组分12至14被添加至乳化容器，并冷却至室温，由此制备包含改进MTD(M1067)的组合物。

对比实施例2：组分1至6被添加至水溶解器，加热至70℃以完全溶解，并被转移至乳化容器。组分7至11和16被添加至油溶解器，加热至70℃以完全溶解，并在乳化容器中混合。内容物被冷却至40℃，并且组分12和13被添加至乳化容器，并冷却至室温，由此制备包含香豆酸的组合物。

[表1]

包含改进MTD(M1067)-香豆酸的香料组合物的组合物(单位：wt％)

12-4.包含改进MTD(M1067)-乙酰基五肽的化妆品组合物的制备

包含改进MTD(M1067)-乙酰基五肽或改进MTD(M1067)的香料组合物被配制为在如下的表2中所示的组合物。

组分1至5被添加至水溶解器，加热至70℃以完全溶解，并被转移至乳化容器。组分6至10被添加至油溶解器，加热至70℃以完全溶解，并在乳化容器中混合。内容物被冷却至40℃，并且组分11、12和14被添加至乳化容器，并冷却至室温，由此制备包含改进MTD(M1067)-乙酰基五肽的组合物。

对比实施例3：组分1至5被添加至水溶解器，加热至70℃以完全溶解，并被转移至乳化容器。组分6至10被添加至油溶解器，加热至70℃以完全溶解，并在乳化容器中混合。内容物被冷却至40℃，并且组分11至13被添加至乳化容器，并冷却至室温，由此制备包含改进MTD(M1067)的组合物。

对比实施例4：组分1至5被添加至水溶解器，加热至70℃以完全溶解，并被转移至乳化容器。组分7至11和16被添加至油溶解器，加热至70℃以完全溶解，并在乳化容器中混合。内容物被冷却至40℃，并且组分11、12和15被添加至乳化容器，并冷却至室温，由此制备包含香豆酸的组合物。

[表2]

包含改进MTD(M1067)-乙酰基五肽的香料组合物(单位：wt％)

12-5.改进MTD和皮肤病学活性物质的复合物的皮肤安全性评价

为了确定在实施例4中合成的改进MTD(M1067)的安全性，对于在实施例12-1和12-2中合成的改进MTD(M1067)-香豆酸和改进MTD(M1067)-乙酰基五肽，使用人类皮肤执行原发性刺激试验。所述测试由专业临床研究机构Dermapro实施，并且临床组合物将如下所述地制备。选择满足临床测试标准并不属于排除标准的30个或更多个受测者。试样材料被应用于受测者的背部，并在48小时后移除。在移除之后的30分钟和24小时观察测试位置。

皮肤评价通过Frosch&Kligman方法(Frosch P.J和Kligman A.M.J Am AcadDermatol,1(1):35-41(1979))和在表3中所示的反映美容、化妆品和香料协会(CTFA)原则(美容、化妆品和香料协会，Washington,D.C.20005(1981))的标准来执行，对比反应48和72小时之后的平均程度，并且基于每个组合物的反应的平均程度来确定结果。

[表3]

斑贴试验反应记录

符号	等级	临床描述
			+	1	轻度红斑,斑点状或弥散的
++	2	中度均匀的红斑

+++	3	出现浮肿的重度红斑
			++++	4	出现浮肿和囊泡的重度红斑

[表4]

人类皮肤的原发性刺激试验结果(n＝30)

如在表4中所示的，改进MTD(M1067)、改进MTD(M1067)-香豆酸和改进MTD(M1067)-乙酰基五肽在人类皮肤原发性刺激试验中被评价为低刺激性材料。据此，改进MTD(M1067)通过专业研究机构来实施的临床试验而被证明为可安全地用于人类。

此外，通过如上所述的实施例可以看出本发明的改进MTD相对于常规MTD在细胞内渗透性和组织中的体内渗透性方面也被改善。而且，改进MTD还被证明为对于人类是安全的，并由此可被有效地用于多种不同的研究，以及需要有效的药物递送的特定疾病的病人的治疗，导致在研发新的和改进型的药物中具有高有效性。

虽然本发明已经参考特定的示例性实施方式示出并描述，但是本领域技术人员将理解的是对其所作出的形式和细节上的多种改变将不会脱离通过所附加的权利要求定义的本发明的范围。

序列表自由正文

<110>株式会社普罗赛尔制药

<120>具有改善的细胞渗透性的新的大分子转导结构域的研发及其使用方法

<130>DFP14KR2114

<150>US 61/563,110

<151>2011-11-23

<160>56

<170>KopatentIn2.0

<210>1

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD JO-018氨基酸序列

<400>1

Ala Ala Leu Ile Gly Ala Val Leu Ala Pro Val Val Ala Val

1 5 10

<210>2

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD JO-067氨基酸序列

<400>2

Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala

1 5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD JO-103氨基酸序列

<400>3

Leu Ala Leu Pro Val Leu Leu Leu Ala

1 5

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD JO-159氨基酸序列

<400>4

Ile Ala Ile Ala Ala Ile Pro Ala Ile Leu Ala Leu

1 5 10

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD JO-173氨基酸序列

<400>5

Ala Val Ile Pro Ile Leu Ala Val Pro

1 5

<210>6

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD18m氨基酸序列

<400>6

Pro Ala Ala Leu Ala Ala Leu Pro Val Ala Val Val Ala Val

1 5 10

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD173A氨基酸序列

<400>7

Pro Ala Val Ile Pro Ile Leu Ala Val

1 5

<210>8

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD JO-018多核苷酸序列

<400>8

gcggcgctga ttggcgcggt gctggcgccg gtggtggcgg tg 42

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD JO-067多核苷酸序列

<400>9

gcggcggcgc cggcggtggc ggcg 24

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD JO-103多核苷酸序列

<400>10

ctggcgctgc cggtgctgct gctggcg 27

<210>11

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD JO-159多核苷酸序列

<400>11

aatgcgaatg cggcgaatcc ggcgaatctg gcgctg 36

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD JO-173多核苷酸序列

<400>12

gcggtgaatc cgaatctggc ggtgccg 27

<210>13

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD JO-018m多核苷酸序列

<400>13

ccggcggcgc tggcggcgct gccggtggcg gtggtggcgg tg 42

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD JO-173A多核苷酸序列

<400>14

ccggcggtga atccgaatct ggcggtg 27

<210>15

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1018氨基酸序列

<400>15

Met Arg Ala Ala Leu Ile Gly Ala Val Leu Ala Pro Val Val Ala Val

1 5 10 15

<210>16

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1067氨基酸序列

<400>16

Met Arg Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala

1 5 10

<210>17

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1103氨基酸序列

<400>17

Met Arg Leu Ala Leu Pro Val Leu Leu Leu Ala

1 5 10

<210>18

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1159氨基酸序列

<400>18

Met Arg Ile Ala Ile Ala Ala Ile Pro Ala Ile Leu Ala Leu

1 5 10

<210>19

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1173氨基酸序列

<400>19

Met Arg Ala Val Ile Pro Ile Leu Ala Val Pro

1 5 10

<210>20

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1018m氨基酸序列

<400>20

Met Arg Pro Ala Ala Leu Ala Ala Leu Pro Val Ala Val Val Ala Val

1 5 10 15

<210>21

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1173A氨基酸序列

<400>21

Met Arg Pro Ala Val Ile Pro Ile Leu Ala Val

1 5 10

<210>22

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2018氨基酸序列

<400>22

Met His Ala Ala Leu Ile Gly Ala Val Leu Ala Pro Val Val Ala Val

1 5 10 15

<210>23

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2067氨基酸序列

<400>23

Met His Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala

1 5 10

<210>24

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2103氨基酸序列

<400>24

Met His Leu Ala Leu Pro Val Leu Leu Leu Ala

1 5 10

<210>25

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2159氨基酸序列

<400>25

Met His Ile Ala Ile Ala Ala Ile Pro Ala Ile Leu Ala Leu

1 5 10

<210>26

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2173氨基酸序列

<400>26

Met His Ala Val Ile Pro Ile Leu Ala Val Pro

1 5 10

<210>27

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2018m氨基酸序列

<400>27

Met His Pro Ala Ala Leu Ala Ala Leu Pro Val Ala Val Val Ala Val

1 5 10 15

<210>28

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2173A氨基酸序列

<400>28

Met His Pro Ala Val Ile Pro Ile Leu Ala Val

1 5 10

<210>29

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3018氨基酸序列

<400>29

Met Lys Ala Ala Leu Ile Gly Ala Val Leu Ala Pro Val Val Ala Val

1 5 10 15

<210>30

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3067氨基酸序列

<400>30

Met Lys Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala

1 5 10

<210>31

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3103氨基酸序列

<400>31

Met Lys Leu Ala Leu Pro Val Leu Leu Leu Ala

1 5 10

<210>32

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3159氨基酸序列

<400>32

Met Lys Ile Ala Ile Ala Ala Ile Pro Ala Ile Leu Ala Leu

1 5 10

<210>33

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3173氨基酸序列

<400>33

Met Lys Ala Val Ile Pro Ile Leu Ala Val Pro

1 5 10

<210>34

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3018m氨基酸序列

<400>34

Met Lys Pro Ala Ala Leu Ala Ala Leu Pro Val Ala Val Val Ala Val

1 5 10 15

<210>35

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3173A氨基酸序列

<400>35

Met Lys Pro Ala Val Ile Pro Ile Leu Ala Val

1 5 10

<210>36

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1018多核苷酸序列

<400>36

atgagggcgg cgctgattgg cgcggtgctg gcgccggtgg tggcggtg 48

<210>37

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1067多核苷酸序列

<400>37

atgagggcgg cggcgccggc ggtggcggcg 30

<210>38

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1103多核苷酸序列

<400>38

atgaggctgg cgctgccggt gctgctgctg gcg 33

<210>39

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1159多核苷酸序列

<400>39

atgaggattg cgattgcggc gattccggcg attctggcgc tg 42

<210>40

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1173多核苷酸序列

<400>40

atgagggcgg tgattccgat tctggcggtg ccg 33

<210>41

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1018m多核苷酸序列

<400>41

atgaggccgg cggcgctggc ggcgctgccg gtggcggtgg tggcggtg 48

<210>42

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD1173A多核苷酸序列

<400>42

atgaggccgg cggtgattcc gattctggcg gtg 33

<210>43

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2018多核苷酸序列

<400>43

atgcacgcgg cgctgattgg cgcggtgctg gcgccggtgg tggcggtg 48

<210>44

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2067多核苷酸序列

<400>44

atgcacgcgg cggcgccggc ggtggcggcg 30

<210>45

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2103多核苷酸序列

<400>45

atgcacctgg cgctgccggt gctgctgctg gcg 33

<210>46

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2159多核苷酸序列

<400>46

atgcacattg cgattgcggc gattccggcg attctggcgc tg 42

<210>47

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2173多核苷酸序列

<400>47

atgcacgcgg tgattccgat tctggcggtg ccg 33

<210>48

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2018m多核苷酸序列

<400>48

atgcacccgg cggcgctggc ggcgctgccg gtggcggtgg tggcggtg 48<210>49

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD2173A多核苷酸序列

<400>49

atgcacccgg cggtgattcc gattctggcg gtg 33

<210>50

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3018多核苷酸序列

<400>50

atgaaggcgg cgctgattgg cgcggtgctg gcgccggtgg tggcggtg 48

<210>51

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3067多核苷酸序列

<400>51

atgaaggcgg cggcgccggc ggtggcggcg 30

<210>52

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3103多核苷酸序列

<400>52

atgaagctgg cgctgccggt gctgctgctg gcg 33

<210>53

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3159多核苷酸序列

<400>53

atgaagattg cgattgcggc gattccggcg attctggcgc tg 42

<210>54

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3173多核苷酸序列

<400>54

atgaaggcgg tgattccgat tctggcggtg ccg 33

<210>55

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3018m多核苷酸序列

<400>55

atgaagccgg cggcgctggc ggcgctgccg gtggcggtgg tggcggtg 48

<210>56

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MTD3173A多核苷酸序列

<400>56

atgaagccgg cggtgattcc gattctggcg gtg 33

Claims

1.由通式1表达的肽：

[通式1]

A1-A2-MTD

其中A1为蛋氨酸（M，Met），A2为选自由精氨酸（R，Arg）、组氨酸（H，His）和赖氨酸（K，Lys）构成的组的氨基酸，并且MTD的氨基酸序列为选自由序列编号为1至7构成的组的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的肽，其是将生物活性分子介导转运至细胞内的肽，并且氨基酸序列为选自由序列编号为15至35构成的组的氨基酸序列。

3.编码权利要求1或2所述的肽的多核苷酸。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其碱基序列为选自由序列编号为36至56构成的组的碱基序列。

5.一种基因设计具有细胞渗透性的生物活性分子的方法，包括：

将氨基酸序列为选自由序列编号为15至35构成的组的氨基酸序列的肽在正向上连接至生物活性分子或在反向上连接至生物活性分子的C端。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述连接通过肽键或化学键来完成。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述化学键选自由二硫键、二胺键、硫-胺键、羧基-胺键、酯键和共价键构成的组。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述生物活性分子选自由蛋白质和肽构成的组。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述生物活性分子选自由生长因子、酶、转录因子、毒素、抗原肽、抗体和抗体片段构成的组。

10.根据权利要求5所述的方法，其中，所述生物活性分子选自结构蛋白。

11.根据权利要求5所述的方法，其中，所述生物活性分子选自天然蛋白。

12.根据权利要求5所述的方法，其中，所述生物活性分子选自由酶、激素、载体蛋白、抗体、运动功能蛋白、受体、信号蛋白、储藏蛋白、膜蛋白、跨膜蛋白、内蛋白、外蛋白、分泌蛋白、病毒蛋白、糖蛋白、裂解蛋白、具有二硫键的蛋白、蛋白复合物、化学修饰的蛋白和朊病毒构成的组。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述具有二硫键的蛋白是免疫球蛋白。

14.根据权利要求5所述的方法，其中，所述生物活性分子选自由核酸、碳水化合物、脂质和糖脂构成的组。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述核酸选自由编码核酸序列、mRNA、反义RNA分子构成的组。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述反义RNA是miRNA。

17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述反义RNA是siRNA。

18.根据权利要求5所述的方法，其中，所述生物活性分子为治疗药物或毒性化合物。

19.一种氨基酸序列用于制备将生物活性分子输送至个体细胞内的肽的用途，其中：

将选自由序列编号为15至35构成的组的氨基酸序列形成肽并连接至生物活性分子。