ES2377660T3

ES2377660T3 - Nuevo péptido que penetra en las células

Info

Publication number: ES2377660T3
Application number: ES06822433T
Authority: ES
Inventors: Shusei Uno; Kaeko Kamide; Hiroshi Nakakubo
Original assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 2005-10-28
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2012-03-29
Anticipated expiration: 2026-10-27
Also published as: JPWO2007049731A1; WO2007049731A1; EP1950294B1; US20100048487A1; US8691528B2; JP5043672B2; EP1950294A1; US8044019B2; EP1950294A4; US20120064570A1

Abstract

Un peptido (I) que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada mas abajo: B-X-Z-X-Arg-Z-Tyr-J-X-01-X-Arg-02-X-X o X-X-01-Arg-X-02-X-J-Tyr-Z-Arg-X-Z-X-B, en el que (i) B es arginina o lisina, (ii) al menos uno de 01 u 02es arginina, (iii) Z es un aminoacido hidrófobo, (iv) J es serina o alanina, y (v) X es un aminoacido elegido aleatoriamente; o (II) que tiene uno o varios aminoacidos elegidos aleatoriamente en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal de la secuencia de aminoacidos definida en (I), a condición de que sea capaz de transportar proteinas dentro de las celulas y/o dentro de los nucleos.

Description

Nuevo peptido que penetra en las celulas.

Campo tecnico

La presente invenci6n se refiere a un nuevo peptido que penetra en las celulas y a un producto farmaceutico que contiene al peptido.

Antecedentes de la invencion

Los acidos nucleicos, en su uso terapeutico o diagn6stico, no penetran por la membrana celular, a diferencia de las proteinas normales, aunque recientemente se ha encontrado que hay peptidos que transportan proteinas y acidos nucleicos dentro de las celulas y nucleos en los organismos vivos (denominados de aqui en adelante en este documento "Proteinas TAT") (del documento no de patente 1 al documento no de patente 3). Ademas, se ha encontrado que una proteina de fusi6n de un peptido que consiste en 11 aminoacidos particulares de las proteinas TAT con otra proteina penetra por la membrana celular; a dichas regiones, esenciales para el traspaso de la membrana celular, es decir, los peptidos que penetran en las celulas, se las denominan PTD (Protein Transduction Domains) (documento no de patente 4).

Hasta ahora, se han desarrollado metodos para transportar proteinas y acidos nucleicos dentro de las celulas por medio de varios peptidos que penetran en las celulas. Especificamente, se ha propuesto un metodo que utiliza un polipeptido parcial particular de la proteina TAT del VIH-1 (documento de patente 1).

Aunque existen peptidos naturales que penetran en las celulas que se usan convencionalmente, se plantea el problema de su baja eficacia de desplazamiento. Por esta raz6n, ha habido una demanda en el desarrollo de peptidos con una alta eficacia en el transporte.

Documento de patente 1: JP-A-HEI-10-33186

Documento de no patente 1: Green, M. et al. Cell 55, 1179-1188 (1988)

Documento de no patente 2: Frankel, A.D. et al. Cell 55, 1189-1193 (1988)

Documento de no patente 3: Fawell, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 664-668 (1994)

Documento no de patente 4: Nagahra, H. et al. Nature Medicine 4, 1449-1452 (1998)

La publicaci6n de Golovkina et al., Journal of Virology, volumen 72, pps 3066-3071 (1998) describe un receptor de proteina de membrana para la uni6n del virus del tumor mamario de rat6n (MMTV). La secuencia de la proteina del receptor de MMTV, segun se representa en la Fig. 3, muestra en un sobrelapamiento parcial la siguiente secuencia: RELERVYSQRSR. La publicaci6n de Kokura et al., Journal of Biological Chemistry, volumen 278, pps 20133-20139 (2003) describe un "proteina de uni6n de Ski C184M" intracelular (citos6lica). La misma secuencia de sobrelapamiento que se menciona con relaci6n a la publicaci6n de Golovkina, tambien aparece en la secuencia de C184M segun se representa en la Fig., 1. Ademas, la publicaci6n de Royo et al., Journal of Biological Chemistry, volumen 271, pps 21021-21019 (1996) muestra secuencias de aminoacidos de la lipoxigenasa de patata (vease la Fig. 1).

Descripcion de la invencion

Problemas que soluciona la invenci6n

Un objeto de la presente invenci6n es proporcionar un nuevo peptido que penetra en las celulas y un producto farmaceutico que contiene al peptido.

Medios para solucionar los problemas

La presente invenci6n proporciona un polipeptido como se expone en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. La presente invenci6n proporciona ademas un ADN que consiste en las secuencias de ADN que codifican a dicho peptido, un vector recombinante que contiene dicho ADN, y un transformante que comprende dicho vector recombinante. La presente invenci6n proporciona ademas una sustancia ligada al peptido como se expone en la reivindicaci6n 7. Las realizaciones preferidas de la sustancia ligada al peptido son expuestas en las subreivindicaciones. La presente invenci6n proporciona ademas un producto farmaceutico que contiene dicha sustancia ligada al peptido, que se usa preferentemente como farmaco antialergico.

Los presentes inventores investigaron diligentemente para proporcionar un peptido que consistia en una nueva secuencia de aminoacidos, util como peptido de penetraci6n en la celula, identificaron la secuencia de aminoacidos del peptido que transporta proteinas en las celulas a una frecuencia mas alta que los peptidos que penetran en las celulas convencionales y desarrollaron la presente invenci6n. Especificamente, los presentes inventores

descubrieron un peptido con una transferibilidad intracelular alta, en una biblioteca de peptidos aleatoria de 1012 moleculas por cribado completo. Se piensa que los peptidos seleccionados utilizando esta tecnica son particularmente muy transferibles entre los peptidos con capacidad de desplazamiento intracelular.

En consecuencia, la presente invenci6n es como sigue:

(1): Un peptido (I) que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada mas abajo:

en donde (i) B es arginina o lisina, (ii) al menos uno de 01 u 02 es arginina, (iii) Z es un aminoacido hidr6fobo, (iv) J es serina o alanina, y (v) X es un aminoacido elegido aleatoriamente;

: o (II) que tiene un aminoacido o varios aminoacidos elegidos aleatoriamente en el extremo C-terminal y/o extremo Nterminal de la secuencia de aminoacidos definida en (I), a condici6n de que sea capaz de transportar proteinas dentro de las celulas y/o dentro de los nucleos.

(2): El peptido segun (1), que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por cualquiera de SEQ ID N0S:1 a 34 en el listado de secuencias en donde un aminoacido o varios aminoacidos han sido sustituidos, delecionados, anadidos o insertados.

(3): Un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por cualquiera de SEQ ID N0S:1 a 47 en el listado de secuencias en donde uno o dos aminoacidos han sido sustituidos, delecionados, anadidos o insertados, y su peptido de cadena invertida, teniendo el peptido la capacidad de desplazarse en las celulas.

(4): Un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por cualquiera de SEQ ID N0S:1 a 47 en el listado de secuencias, y su peptido de cadena invertida.

(5): Un ADN que consiste en la secuencia de ADN que codifica el peptido segun cualquiera de los puntos (1) a (4) anteriores.

(6): Un vector recombinante que contiene el ADN segun el punto (5) anterior.

(7): Un transformante que comprende el vector recombinante segun el punto (6) anterior.

(8): Una sustancia ligada al peptido incluyendo el peptido segun cualquiera de los puntos (1) a (4) anteriores y, unido a esto, una sustancia bioactiva.

(9): La sustancia ligada al peptido segun el punto (8) anterior, en donde la sustancia bioactiva es una proteina que tiene actividad biol6gica, un polipeptido que tiene actividad biol6gica, un liposoma que encapsula a un farmaco, un liposoma que encapsula a un farmaco polietilenglicolado, un compuesto de bajo peso molecular, un acido nucleico, una perla magnetica, una nanoparticula o un fago.

(10): La sustancia ligada al peptido segun el punto (8) anterior, en donde la proteina que tiene actividad biol6gica es una proteina que tiene de aproximadamente 10 KDa a aproximadamente 120 KDa o de 4 a 30 polipeptidos.

(11): La sustancia ligada al peptido segun el punto (8) anterior, en donde la proteina que tiene actividad biol6gica es el factor de transcripci6n MI (MITF).

(12): La sustancia ligada al peptido segun cualquiera de los puntos de (8) a (11) anteriores, que es transportada dentro de las celulas y/o de los nucleos.

(13): La sustancia ligada al peptido segun cualquiera de los puntos de (8) a (11) anteriores, que es transportada dentro de las celulas.

(14): Un producto farmaceutico que contiene la sustancia ligada al peptido segun el punto (8) anterior.

(15): El producto farmaceutico segun el punto (14) anterior, que se usa como farmaco antialergico.

Efecto de la Invenci6n

Segun la presente invenci6n, es posible proporcionar un peptido que penetre dentro de la celula transportando proteinas dentro de las celulas y/o dentro de los nucleos con una frecuencia mas alta que los peptidos que penetran en las celulas convencionales y un producto farmaceutico que contiene el peptido.

Breve Descripcion de los Dibujos

Fig.1. Una representaci6n que muestra los resultados de una prueba de desplazamiento intracelular de un peptido marcado con fluorescencia. Los paneles superiores muestran la fluorescencia de FITC; los paneles inferiores muestran las imagenes microsc6picas de interferencia diferencial de celulas en combinaci6n con imagenes fluorescentes.

Fig. 2. Una representaci6n que muestra los resultados de una prueba de desplazamiento intracelular de un peptido marcado con fluorescencia usando el sistema Chamber SlideTM. Los paneles superiores de fotografias muestran la fluorescencia de FITC; los paneles inferiores muestran imagenes microsc6picas de interferencia diferencial de celulas en combinaci6n con imagenes fluorescentes.

Fig. 3. Una representaci6n que muestra los resultados de analisis por citometria de flujo.

Fig. 4. Una representaci6n que muestra los resultados de pruebas de desplazamiento intracelular de proteinas de fusi6n eGFP usando un microscopio confocal.

Fig. 5. Una representaci6n que muestra las estructuras de rueda de los peptidos KSH1 y KSH1-1 a 1-9. En los dibujos de mas abajo, las abreviaturas para los aminoacidos usados en las estructuras de rueda son definidas como sigue: A: alanina, V: valina, L: leucina, I: isoleucina, P: prolina, F: fenilalanina, W: tript6fano, M: metionina, G: glicina,

S: serina, T: treonina, C: cisteina, Y: tirosina, N: asparagina, Q: glutamina, E: acido glutamico, K: lisina, R: arginina,

H: histidina, D: acido aspartico.

Fig. 6. Una representaci6n que muestra los resultados de analisis de los peptidos marcados con fluorescencia KSH1 y KSH1-1 a 1-9 en celulas CH0 por citometria de flujo (FACS).

Fig. 7. Una representaci6n que muestra las estructuras de rueda de los peptidos KSH1-11 a 1-24 y KSH1-35.

Fig. 8. Una representaci6n que muestra los resultados de analisis de los peptidos marcados con fluorescencia KSH1-11 a 1-24 y KSH1-35 en celulas CH0 por citometria de flujo.

Fig. 9. Una representaci6n que muestra las estructuras de rueda de los peptidos KSH1-24 a 1-26 y KSH1-28 a 1-30.

Fig. 10. Una representaci6n que muestra los resultados de analisis de los peptidos marcados con fluorescencia KSH1-1, KSH1-24 a 1-26 y KSH1-28 a 1-30 en celulas CH0 por citometria de flujo.

Fig. 11. Una representaci6n que muestra las estructuras de rueda de los peptidos KSH1-27, KSH1-33, KSH1-34 y KSH1-36.

Fig. 12. Una representaci6n que muestra los resultados de analisis de peptidos marcados con fluorescencia de KSH1-27, KSH1-33, KSH1-34 y KSH1-36 en celulas CH0 por citometria de flujo.

Fig. 13. Una representaci6n que muestra la estructura de rueda de un peptido de una secuencia de aminoacidos obtenida a partir de los resultados de una investigaci6n de modificaci6n del peptido KSH1.

Fig. 14. Una representaci6n que muestra el constructo de la expresi6n de proteinas de fusi6n eGFP.

Fig. 15. Mapas del vector de las proteinas de fusi6n eGFP.

Fig. 16. Una representaci6n que muestra c6mo insertar oligos sintetico dentro de un vector. Este dibujo es para un vector tipo D.

Fig. 17. Una representaci6n que muestra los resultados de pruebas de desplazamiento intracelular de proteinas de fusi6n eGFP usando un microscopio confocal. Los paneles superiores muestran la fluorescencia de FITC; los paneles inferiores muestran imagenes microsc6picas de interferencia diferencial de celulas junto con imagenes fluorescentes.

Fig. 18. Una representaci6n que muestra las estructuras de rueda de los peptidos KSH3 a KSH10.

Fig. 19. Una representaci6n que muestra los resultados de las pruebas del desplazamiento intracelular con la adici6n de 25 μM de cada peptido marcado con fluorescencia. Los paneles superiores muestran la fluorescencia de FITC; los paneles inferiores muestran imagenes microsc6picas de interferencia diferencial de celulas junto con imagenes fluorescentes.

Fig. 20. Una representaci6n que muestra las estructuras de rueda de los peptidos KSH2 y KSH2-1 a 2-4.

Fig. 21. Una representaci6n que muestra los resultados de las pruebas del desplazamiento intracelular con la adici6n de 50 μM, 25 μM y 12,5 μM de cada peptido marcado con fluorescencia. Los paneles superiores muestran la fluorescencia de FITC; los paneles inferiores muestran imagenes microsc6picas de interferencia diferencial de celulas junto con imagenes fluorescentes.

El mejor modo para llevar a cabo la invenci6n

La presente invenci6n se describe a continuaci6n mas detalladamente.

(1) Peptidos

En la presente invenci6n, los peptidos incluyen la forma L o la forma D de un peptido que tiene la secuencia de aminoacidos B-X-Z-X-Arg-Z-Tyr-J-X-01-X-Arg-02-X-X o X-X-01-Arg-X-02-X-J-Tyr-Z-Arg-X-Z-X-B. En esta secuencia de aminoacidos, B es arginina o lisina, y al menos uno de 01 u 02 son arginina, y Z es un aminoacido hidr6fobo, y J es serina o alanina, y X es un aminoacido elegido aleatoriamente. En este documento, B es deseablemente arginina. Si al menos uno de 01 u 02 son arginina, el otro puede ser un aminoacido elegido aleatoriamente. El aminoacido hidr6fobo para Z es cualquiera de leucina, fenilalanina, isoleucina, valina, tirosina, y tript6fano, y es deseablemente leucina, fenilalanina, isoleucina o tript6fano, y lo mas deseablemente es isoleucina o tript6fano.

Al poseer la secuencia de aminoacidos B-X-Z-X-Arg-Z-Tyr-J-X-01-X-Arg-02-X-X o X-X-01-Arg-X-02-X-J-Tyr-Z-Arg-X-Z-X-B puede ser que tengan una secuencia de aminoacidos de los 15 aminoacidos mostrados por dichas secuencias descritas solas, o puede tener un aminoacido o varios aminoacidos elegidos aleatoriamente en el extremo C-terminal y/o extremo N-terminal de dicha secuencia de aminoacidos descrita. Tambien se entiende lo mismo para el peptido que es capaz de transportar proteinas dentro de las celulas y/o dentro de los nucleos. Los aminoacidos elegidos aleatoriamente no estan particularmente limitados, y deseablemente son aminoacidos basicos (arginina, histidina, lisina), tript6fano, prolina, glicina, cisteina y alanina, mas deseablemente glicina, cisteina y arginina. Su numero no esta particularmente limitado.

Como peptido mas deseable de los peptidos mostrados por la secuencia de aminoacidos B-X-Z-X-Arg-Z-Tyr-J-X-01-X-Arg-02-X-X o X-X-01-Arg-X-02-X-J-Tyr-Z-Arg-X-Z-X-B, se puede mencionar la forma L o la forma D de un peptido que consiste en una de las secuencias de aminoacidos mostradas por SEQ ID N0S:1 a 34 en el listado de secuencias y su peptido de cadena invertida. Como peptido todavia mas deseable, se puede mencionar la forma L o la forma D de un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por SEQ ID N0:1, 2, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33 o 34 en el listado de secuencias. El peptido mas deseable es el aminoacido mostrado por SEQ ID N0:1, 7, 8, 9, 11, 13, 17, 18, 19, 20, 22, 25, 26, 27, 29, 30, 32, 33 o 34 en el listado de secuencias.

En la presente invenci6n, un peptido de cadena invertida se refiere a un peptido obtenido invirtiendo la disposici6n de aminoacidos del extremo N-terminal al extremo C-terminal de una cierta secuencia, por ejemplo, (extremo N)-AB-C-D-(extremo C), para obtener el peptido (extremo N)-D-C-B-A-(extremo C).

En la presente invenci6n, los peptidos tambien incluyen, ademas de los peptidos ya mencionados, peptidos que tienen la forma L o la forma D del peptido mostrada por alguna de las SEQ ID N0S:35 a 47 en el listado de secuencias y su peptido de cadena invertida. Son particularmente deseables de estos peptidos la forma L o la forma D de un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por SEQ ID N0:35, 36, 38, 39, 42, 43, 45, 46 o 47 en el listado de secuencias.

El poseer la forma L o la forma D de un peptido y su peptido de cadena invertida significa tener de manera aleatoria uno o varios aminoacidos en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal de las 15 secuencias de aminoacidos mostradas por alguna de SEQ ID N0S:35 a 47 en el listado de secuencias. Tambien se entiende lo mismo para el peptido que es capaz de transportar proteinas dentro de las celulas y/o dentro de los nucleos. Aunque los aminoacidos elegidos aleatoriamente no esten particularmente limitados, los aminoacidos basicos (arginina, histidina, lisina), tript6fano, prolina, glicina, cisteina y alanina son deseables, y glicina, cisteina y arginina son mas deseables. Su numero no esta particularmente limitado.

Ademas, los peptidos de la presente invenci6n mostrados por SEQ ID N0S:1 a 47 en el listado de secuencias incluyen peptidos que tienen una secuencia de aminoacidos en donde 1 o 2 aminoacidos han sido delecionados, anadidos, insertados o sustituidos por otros aminoacidos, o peptidos que tienen una secuencia de aminoacidos que consiste en una combinaci6n de estos. Tambien se entiende lo mismo para el peptido que tiene la capacidad de desplazarse a las celulas. En este caso, aun si un aminoacido ha sido insertado, delecionado o sustituido, se pueden mencionar las secuencias de aminoacidos capaces de transportar proteinas dentro de las celulas y/o dentro de los nucleos a una frecuencia similar a la de los peptidos mostrados por SEQ ID N0S:1 a 47 en el listado de secuencias. Si un aminoacido ha sido insertado, delecionado o sustituido, la posici6n de la introducci6n, eliminaci6n o sustituci6n no esta particularmente limitada.

La presente invenci6n incluye particularmente un peptido con tres aminoacidos del extremo C-terminal delecionados del peptido mostrado por la secuencia B-X-Z-X-Arg-Z-Tyr-J-X-01-X-Arg-02-X-X. El peptido puede ser un peptido que tiene 1 o 2 aminoacidos del extremo C-terminal delecionados.

En este documento, los peptidos que consisten en las secuencias de aminoacidos mostradas por SEQ ID N0S:1 a 47 en el listado de secuencias son nuevas secuencias sin homologia con ningun PTD conocido de los que han sido publicados hasta ahora, y que no mostraron ninguna homologia con ninguna secuencia de cDNA humana que haya sido publicada hasta ahora.

El peptido de la presente invenci6n se puede preparar segun un metodo comunmente conocido de la sintesis de peptidos y la sustituci6n, la adici6n o la deleci6n se puede conseguir facilmente cambiando el tipo de aminoacido protegido. Se pueden introducir aminoacidos especiales, tales como el D-aminoacido y sarcosina (N-metilglicina). Los metodos de sintesis del peptido incluyen, por ejemplo, la sintesis en fase s6lida, sintesis en fase liquida; despues de la reacci6n sintetica, se puede purificar y aislar el peptido usado en la presente invenci6n combinando metodos ordinarios de purificaci6n, por ejemplo, extracci6n con disolventes, destilaci6n, columna cromatografica, cromatografia liquida o recristalizaci6n.

Los metodos comunmente conocidos de sintesis de peptidos incluyen, por ejemplo, los metodos descritos en de (i) a

(v): mas abajo.

(i): M. Bodanszky y M.A. 0ndetti, Peptide Synthesis, Editores Interscience, Nueva York, (1966)

(ii): Schroeder y Luebke, The Peptide, Academic Press, Nueva York, 1965

(iii) Nobuo Izumiya, et al. Peptide GoseiinoiKiso to Jikken, publicado por Maruzen Co. (1975)

(iv): Haruaki Yajima y Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza 1, Tanpakushitsu no Kagaku IV, 205 (1977)

(v): Haruaki Yajima, editor: Zoku lyakuhin no Kaihatsu, volumen 14,

Sintesis de Peptido, Hirokawa Shoten

(2): Secuencias de ADN y los ADN

En la presente invenci6n, los ADN incluyen un ADN que consiste en la secuencia de ADN que codifica el peptido representado por la secuencia de aminoacidos mostrada por alguna de SEQ ID N0S:1 a 47 en el listado de secuencias; especificamente, dichos ADN incluyen, pero sin limitaci6n, un ADN que consiste en la secuencia de ADN mostrada por SEQ ID N0:48 o 49 en el listado de secuencias. La secuencia de ADN mostrada por SEQ ID N0:48 o 49 en el listado de secuencias codifica la secuencia de aminoacidos mostrada por SEQ ID N0:33 o 34 en el listado de secuencia, respectivamente.

En la presente invenci6n, el ADN contiene un ADN que consiste en una secuencia de ADN que forma hibridos con una cadena complementaria del ADN que consiste en la secuencia de ADN que codifica el peptido mostrado por alguna de SEQ ID N0S:1 a 4 7 en el listado de secuencias en condiciones rigurosas.

En la presente invenci6n, la secuencia de ADN que forma hibridos en condiciones rigurosas contiene una secuencia de ADN que tiene una homologia de aproximadamente el 80 % o mas, preferiblemente de aproximadamente el 90 %

o mas, mas preferiblemente de aproximadamente el 95 % o mas, con una cadena complementaria de la secuencia de ADN que codifica el peptido mostrado por SEQ ID N0:1 o 2 en el listado de secuencias. La hibridaci6n se puede realizar segun algun metodo comunmente conocido o algun metodo basado en esta, por ejemplo, algun metodo descrito en Molecular Cloning, 2a edici6n (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) y otros por el estilo. Las condiciones altas y rigurosas se refieren, por ejemplo, a condiciones que implican una concentraci6n de sodio de aproximadamente 19 mM a aproximadamente 40 mM, preferiblemente de aproximadamente 19 mM a aproximadamente 20 mM, y una temperatura de aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°C, preferiblemente de aproximadamente 60°C a aproximadamente 65°C. En particular, es el mas preferible un caso en donde la concentraci6n de sodio es aproximadamente 19 mM y la temperatura es aproximadamente 65°C.

Las secuencias de ADN de la presente invenci6n incluyen secuencias que tienen una identidad de aproximadamente el 50 % o mas respecto a las secuencias de ADN que codifican los peptidos mostrados por SEQ ID N0S:1 a 47 en el listado de secuencias. Las secuencias de ADN de la presente invenci6n contienen una secuencia de ADN que tiene una identidad preferiblemente de aproximadamente el 60 % o mas, mas preferiblemente de aproximadamente el 70 % o mas, todavia mas preferiblemente de aproximadamente el 80 % o mas, todavia aun mas preferiblemente de aproximadamente el 90 % o mas, aun mas preferiblemente de aproximadamente el 95 % o mas.

Las secuencias de ADN de la presente invenci6n incluyen las secuencias de ADN que codifican los peptidos mostrados por SEQ ID N0S:1 a 47 en el listado de secuencias en donde las bases han sido insertadas, delecionadas o sustituidas. En este documento, como numero de bases insertadas, suprimidas o sustituidas, se pueden mencionar 1 base o 2 bases o mas; por ejemplo, de 1 base a 10 bases, preferiblemente de 1 base a 5 bases. En este caso, aun si una base ha sido insertada, delecionada o sustituida, se puede mencionar una secuencia de ADN capaz de transportar proteinas dentro de las celulas y/o dentro de los nucleos a una frecuencia similar a la de las secuencias de ADN que codifican los peptidos mostrados por SEQ ID N0S:1 a 47 en el listado de secuencias. Si se ha insertado, delecionado o sustituido una base, la posici6n de la introducci6n, deleci6n o sustituci6n no esta particularmente limitada.

El ADN de la presente invenci6n se puede sintetizar segun algun metodo comunmente conocido. El cDNA que codifica la proteina de fusi6n, de ser preparado; se puede obtener por amplificaci6n mediante el metodo PCR utilizando cebadores.

Los cebadores que se pueden usar en la presente invenci6n incluyen, por ejemplo, un cebador para su uso en la preparaci6n de un cDNA que codifica una proteina de fusi6n con una proteina fluorescente verde eGFP (Proteina Fluorescente Verde mejorada) por sus siglas en ingles, "enhanced green florescent protein".

(3) Vectores recombinantes y transformantes

Los vectores recombinantes usados en la presente invenci6n incluyen vectores que pueden ser expresados en celulas procariotas tales como Escherichia coli (por ejemplo, pBR322, pUC119 o sus derivados). Ademas, en celulas eucari6ticas, los vectores de expresi6n para levadura incluyen, por ejemplo, vectores de plasmido, tales como pAURll2 (Takara Bib Inc). Los vectores que se pueden expresar en celulas derivadas de mamiferos incluyen, por ejemplo, vectores de plasmido tales como pcDNAS.l (Invitrogen) y vectores virales, tales como el ADN de pD0N-AI (Takara Bio Inc). [0028]

Un vector recombinante de la presente invenci6n se prepara recombinando todo o una parte del ADN que tiene la secuencia de ADN de la presente invenci6n con estos vectores recombinantes por algun metodo comunmente conocido.

El vector recombinante se puede obtener, por ejemplo, por algun metodo descrito en Molecular Cloning, 2a edici6n

(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).

El transformante de la presente invenci6n se refiere a un transformante que comprende un vector recombinante de la presente invenci6n. Como huesped, se pueden usar celulas de Escherichia coli, levadura, animal y otras por el estilo. La Escherichia coli es preferible. Tambien se pueden usar como huespedes aux6trofos y cepas sensibles a antibi6ticos.

El transformante de la presente invenci6n se puede preparar segun algun metodo comunmente conocido. Por ejemplo, la transformaci6n se puede realizar segun los metodos descritos en Molecular Cloning, 2a edici6n (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, , 1989), como el metodo de polietilenglicol de protoplastos y el metodo de electroporaci6n.

(4) Sustancias ligadas al peptido

En la presente invenci6n, las sustancias ligadas al peptido incluyen las que contienen el peptido mostrado por la secuencia de aminoacido: B-X-Z-X-Arg-Z-Tyr-J-X-01-X-Arg-02-X-X o X-X-01-Arg-X-02-X-J-Tyr-Z-Arg-X-Z-X-B o el peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por alguna de SEQ ID N0S:1 a 47 en el listado de secuencias y una sustancia biol6gicamente activa.

En la presente invenci6n, el peptido mostrado por la secuencia de aminoacidos: B-X-Z-X-Arg-Z-Tyr-J-X-01-X-Arg-02-X-X o X-X-01-Arg-X-02-X-J-Tyr-Z-Arg-X-Z-X-B o el peptido mostrado por alguna de SEQ ID N0S:1 a 47 en el listado de secuencias se puede utilizar como peptido que penetra dentro de la celula; ligando el peptido de la presente invenci6n a una sustancia biol6gicamente activa, la sustancia biol6gicamente activa puede ser transportada dentro de las celulas y/o dentro de los nucleos. Mas preferiblemente, la sustancia biol6gicamente activa es transportada dentro de las celulas. En este documento, las celulas son celulas de animal, en particular celulas humanas. Las celulas humanas pueden ser celulas adhesivas o celulas flotantes, y pueden ser celulas que configuren varios 6rganos en los organismos vivos.

En la presente invenci6n, las sustancias biol6gicamente activas incluyen proteinas que tienen alguna actividad biol6gica, peptidos que tienen alguna actividad biol6gica, liposomas que encapsulan farmacos, liposomas que encapsulan farmacos polietilenglicolados (tambien denominados en este documento de aqui en adelante como "liposomas que encapsulan farmacos PEGlicolados"), compuestos se bajo peso molecular, acidos nucleicos, perlas magneticas, nanoparticulas y fagos.

En este documento, las proteinas que tienen alguna actividad biol6gica incluyen proteinas para el tratamiento, la prevenci6n y/o el diagn6stico de alguna enfermedad y otros por el estilo, siendo proteinas con tamanos de aproximadamente 10 KDa a aproximadamente 500 KDa; de aproximadamente 10 KDa a aproximadamente 120 proteinas KDa particularmente deseables. Especificamente, dichas proteinas incluyen, pero sin limitaci6n, enzimas, anticuerpos, factores de transcripci6n y sus peptidos parciales. Las enzimas incluyen S0D (Molecules and Cells 2005, 19, 191-197, W.S. Eum et al.). Los anticuerpos incluyen anticuerpos contra proteinas intracelulares, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos contra proteinas ajenas, tales como virus y otros por el estilo (Current Molecular Medicine 2004, 4, 519-528, M.N. Lobato y T.H. Rabbitts, Molecular Therapy 2003, 8, 355-366, Y.Y. Wheeler et al y similares). Los factores de transcripci6n incluyen el factor de transcripci6n MI (factor de transcripci6n asociado a la microftalmia: tambien denominado en este documento de aqui en adelante "MITF") y otros por el estilo. En este documento, MITF es una especie de factor regulador de la transcripci6n que existe en organismos vivos, siendo una proteina capaz de regular la expresi6n de genes c-kit, caracteristico de los mastocitos. Especificamente, dichos factores de transcripci6n incluyen, pero sin limitaci6n, los diversos MITF descritos en el documento JP-A2004-201547.

En la presente invenci6n, los polipeptidos que tienen una actividad biol6gica incluyen peptidos para el tratamiento, la prevenci6n y/o el diagn6stico de la enfermedad y otros por el estilo, siendo deseables los peptidos que tienen de 2 a 100 aminoacidos; y los peptidos que tienen de 4 a 30 aminoacidos particularmente deseables. Especificamente, dichos peptidos incluyen, pero sin limitaci6n, HSP (Proteina de Choque Termico, por sus siglas en ingles "Heat Shock Protein") peptido analogo 20 (J Appl Physiol 98: 1836-1845, 2005), peptido antibacteriano KLAK (Cancer Research 61, 7709-7712, 2001), HIF-la (Proc Natl Acad Sci USA 99: 10423-10428, 2002), PKC (Proteina Quinasa C) peptido inhibitorio δ (Proc Natl Acad Sci USA 98: 11114-11119, 2001), VIVIT (Nature Medicine 10: 305-309, 2004) y otros por el estilo.

En la presente invenci6n, los liposomas incluyen vesiculas unilaminares pequenas (tambien denominadas en este documento de aqui en adelante "SUV", por sus siglas en ingles "small unilamellar vesicles"), vesiculas unilaminares grandes (tambien denominadas en este documento de aqui en adelante "LUV", por sus siglas en ingles "large unilamellar vesicles"), vesiculas multilaminares (tambien denominadas en este documento de aqui en adelante "MLV" por sus siglas en ingles "multilamellar vesicles") y otros por el estilo; los preferibles son SUV o LUV. Ademas, los liposomas que encapsulan farmacos incluyen farmacos antiinflamatorios, tales como el sodio diclofenac y tobramicina encapsulados en los liposomas descritos anteriormente.

En la presente invenci6n, los liposomas que encapsulan farmacos PEGilados (PEG) incluyen liposomas que encapsulan al farmaco unido a la superficie de este.

Un farmaco encapsulado por liposoma o un farmaco encapsulado por liposoma PEGilado en la presente invenci6n se puede preparar por los metodos descritos en los documentos JP-A-HEI-4-346918, JP-A-HEI-10-29930, el impreso para la publicaci6n de la solicitud de patente internacional N°. 97/29128 o el impreso para la publicaci6n de la solicitud de patente Internacional No 01/064743.

En la presente invenci6n, los compuestos de bajo peso molecular incluyen, por ejemplo, farmacos antiinflamatorios, tales como el sodio diclofenac, tobramicina y ciclosporina.

En la presente invenci6n, los acidos nucleicos incluyen, por ejemplo, plasmidos, siARN y ADN antisentido para genes relacionados con la enfermedad.

En la presente invenci6n, las perlas magneticas incluyen, por ejemplo, particulas de 6xidos de iones supermagneticos introducidas en celulas T, celulas B o macrofagos para rastrear la localizaci6n de dichas celulas por MRI (Advanced Drug Delivery Reviews 57: 637-651, 2005).

En la presente invenci6n, las nanoparticulas incluyen, por ejemplo, nanoparticulas que tienen proteinas, compuestos de bajo peso molecular, acidos nucleicos, polisacaridos y otros por el estilo encapsulados en estas (Advanced Drug Delivery Reviews 57: 637-651, 2005).

En la presente invenci6n, los fagos incluyen, por ejemplo, fagos Ml3 que incorporan varias unidades de expresi6n de cDNA (Advanced Drug Delivery Reviews 57: 529-546, 2005).

En la presente invenci6n, una sustancia ligada al peptido que contiene el peptido de la presente invenci6n y una proteina que tiene actividad biol6gica como se describe anteriormente se puede obtener cultivando celulas huesped transformadas usando un vector recombinante que comprende un ADN que codifica la sustancia, y aislando la proteina producida asi por algun metodo, tal como cromatografia liquida de alta resoluci6n (HPLC). El ADN usado en esta invenci6n puede ser un ADN que comprenda una fusi6n del gen que codifica el peptido de la presente invenci6n y el gen que codifica una proteina o un polipeptido con la actividad biol6gica que se describe anteriormente. 0 bien, para obtener una sustancia ligada al peptido que contiene el peptido de la presente invenci6n y la proteina que tiene actividad biol6gica, se pueden expresar los genes respectivos para adquirir el peptido de la presente invenci6n y la proteina o el polipeptido con actividad biol6gica, y se pueden fusionar mediante alguna reacci6n quimica. Como medio de fusi6n por reacci6n quimica, se puede mencionar un puente de disulfuro usando un residuo cisteina y otros por el estilo. 0 bien, se puede preparar la sustancia ligada al peptido que contiene el peptido de la presente invenci6n y una proteina que tiene actividad biol6gica por un metodo que use a un agente de reticulaci6n quimico. En este caso, es preferible prevenir la reticulaci6n entre el peptido de la presente invenci6n y el sitio activo funcional de la proteina con actividad biol6gica; como metodo de reticulaci6n quimica, se puede mencionar el metodo descrito en el documento JP-A-HEI-10-33186 y otros por el estilo.

Ademas, usando el metodo de reticulaci6n quimica, tambien se puede unir el peptido de la presente invenci6n a un farmaco encapsulado por un liposoma, un farmaco encapsulado por un liposoma PEGilado o un compuesto de bajo peso molecular.

Uniendo el peptido en la presente invenci6n a un farmaco encapsulado por el liposoma o un farmaco encapsulado por el liposoma PEGilado, el farmaco encapsulado en el liposoma se puede administrar dentro de las celulas. Los metodos de uni6n del peptido en la presente invenci6n incluyen, por ejemplo, un metodo en donde el residuo cisteina es introducido en el extremo N-terminal o C-terminal, y uni6n del peptido a un farmaco encapsulado por liposoma que tiene un grupo maleimida o un farmaco encapsulado por liposoma PEGilado via un grupo SH y otros por el estilo.

(5) Productos farmaceuticos

Se puede utilizar la sustancia ligada al peptido de la presente invenci6n como un producto farmaceutico. Ademas, la sustancia biol6gicamente activa deseada puede ser transportada dentro de las celulas y/o dentro de los nucleos uniendo el peptido de la presente invenci6n a la sustancia biol6gicamente activa; por lo tanto, segun la clase de sustancia biol6gicamente activa que se una, el peptido de la presente invenci6n puede ser utilizado como un farmaco terapeutico y/o farmaco profilactico para una amplia variedad de enfermedades. La sustancia biol6gicamente activa que se une al peptido de la presente invenci6n es preferiblemente una proteina que tiene actividad biol6gica. Mas preferiblemente, uniendo el peptido de la presente invenci6n a un mutante MITF, el peptido de la presente invenci6n puede ser utilizado como un farmaco antialergico.

De ser usado como producto farmaceutico, la sustancia unida al peptido en la presente invenci6n se puede preparar como una preparaci6n y se puede administrar segun metodos comunmente conocidos. Por ejemplo, la sustancia unida al peptido se puede administrar a seres humanos u otros mamiferos en la forma de un liquido como tal, o como una composici6n farmaceutica en forma de una forma farmaceutica apropiada, oralmente o parenteralmente.

Para producir una soluci6n y otras formas similares, se puede usar un disolvente o agente de suspensi6n apropiado.

En la producci6n de comprimidos o capsulas como forma farmaceutica apropiada, se puede usar un excipiente apropiado. Las preparaciones liquidas para administraci6n oral, es decir, jarabes, suspensiones, soluciones y otros por el estilo, comprenden a un diluyente inerte comunmente usado. Las preparaciones tambien pueden comprender, ademas del diluyente inerte, agentes auxiliares, por ejemplo, agentes humectantes, adyuvantes de suspensi6n, agentes edulcorantes, agentes aromaticos, colorantes, conservantes, estabilizadores y otros por el estilo.

La dosis de la sustancia unida al peptido de la presente invenci6n para seres humanos se determina segun la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la dieta, duraci6n de la administraci6n, el metodo de administraci6n, la velocidad de excreci6n, combinaci6n de farmacos y la gravedad de la condici6n del paciente tratado, en consideraci6n a estos y otros factores. Por ejemplo, la dosis es de aproximadamente 0,01 mg./kilogramo a aproximadamente 1,0 mg./kilogramo, y se puede administrar una vez al dia o en partes divididas.

Ejemplos

La presente invenci6n se describe ademas mas especificamente segun los ejemplos siguientes, con los cuales, sin embargo, la presente invenci6n nunca se encuentra limitada.

Ejemplo 1 Prueba del paso a traves de la membrana celular usando peptidos sinteticos

Ejemplo 1-1 Secci6n de secuencias peptidicas que penetran las celulas

Se concentraron secuencias peptidicas transferibles intracelularmente segun el metodo descrito en el documento JP-A-2005-13073, usando una biblioteca de celulas Jurkat (ATCC N0. TIB-152). Especificamente, despues de preparar una biblioteca de virus in vitro que presentaba peptidos aleatorios de 15 aminoacidos (abreviados de aqui en adelante en este documento IVV) (escala de la biblioteca 1012), la biblioteca fue anadida a las celulas HeLa (ATCC N0. CCL2) o a las celulas Jurkat. Despues, los cDNA de IVV que se habian desplazado en las celulas fueron recuperados por PCR, los IVV se prepararon otra vez y se anadieron a las celulas. Repitiendo la operaci6n de adici6n-recuperaci6n, los "peptidos que se desplazaron en las celulas" que estaban presentes en la biblioteca se concentraron. Para identificar las bibliotecas en donde los peptidos intracelularmente transferibles habian sido concentrados en las diversas etapas de la operaci6n de concentraci6n, se seleccionaron aleatoriamente 11 clases de secuencias de aminoacidos de las bibliotecas despues de la 5a a la 8a operaci6n de concentraci6n, y los peptidos se examinaron segun su capacidad de desplazamiento intracelular.

Ejemplo 1-2 Analisis por microsc6pico confocal

Con el PTD sacado de la proteina TAT de VIH mostrada por SEQ ID N0: 50 en la secuencia expuesta como control positivo (en las FIG. 1 a FIG. 3, denominado "Positivo" "o TAT"), y un mutante del PTD derivado de TAT mostrado por SEQ ID N0:51 en el listado de secuencias, publicado por Ulo Langel et al. ("Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications", Series: Pharmacology and Toxicology: Basic and Clinical Aspects Volumen: 3, 2002), como control negativo (en la FIG. 1, denominado "Negativo"), los peptidos de las 11 secuencias seleccionadas en el Ejemplo 1-1 fueron evaluados.

Los peptidos de las 11 secuencias seleccionadas en el Ejemplo 1-1 se sintetizaron por el metodo en fase s6lida y se marcaron fluorescentemente acoplando la 5,6-carboxifluoresceina al extremo N-terminal de cada peptido. Ademas, los peptidos se purificaron por HPLC obteniendose una pureza del 70 % o mas. Posteriormente, cada peptido fluorescentemente marcado fue disuelto en Dimetil Sulf6xido (DMS0) al 10 % para obtener 1 mM (de aqui en adelante denominado en este documento soluci6n peptidica).

Se usaron tres clases de celulas para incorporar los peptidos: celulas CH0 (ATCC N0. CCL-61), celulas HeLa y celulas Jurkat. Se inocularon por separado 104 celulas CH0 y celulas HeLa y 105 celulas Jurkat en una placa de 96

pocillos y se cultivaron durante 2 o 3 dias. Posteriormente, cuando las celulas se hicieron confluentes, cada soluci6n peptidica fue anadida a cada tipo de celula, y las celulas se incubaron durante 1 hora. Despues de que cada tipo de la celula se lavara con PBS tres veces, se anadieron 100 μL de una soluci6n de tripsina-EDTA 1 mM al 0,25 % y la tripsinizaci6n fue realizada a temperatura ambiente durante 5 minutos. Despues se anadieron 400 μL de PBS (FCS al 10 %) para neutralizar la tripsina, las celulas se lavaron tres veces con 1 mL de HBSS (soluci6n salina equilibrada de Hanks/ producida por Invitrogen). Despues del lavado, las celulas se suspendieron en 50 μL de HBSS y se analizaron utilizando un microscopio confocal. Las medidas y el analisis fueron realizados usando un sistema de un microscopio laser de interferencia diferencial confocal (Bio-Rad, Radience2100/Green He-Ne, 488 nm, microscopio: Nikon, ECLIPSE E600).

Como consecuencia, el peptido de la nueva secuencia del candidato de PTD mostrada por SEQ ID N0:33 en el listado de secuencias (en FIG. 1 a FIG. 3, denominado "KSH1") mostr6 la transferibilidad intracelular mas alta. Los resultados para el peptido KSH1, control positivo y control negativo son mostrados en la FIG. 1. En todas las celulas CH0, celulas de HeLa y celulas Jurkat, se observ6 la fluorescencia del peptido KSH1. La intensidad de fluorescencia del peptido KSH1 fue mas alta que la intensidad de fluorescencia del control positivo. Ademas, el peptido intracelularmente transportado no fue localizado, pero fue detectado tanto en el nucleo como en citoplasma.

A partir de estos resultados, se encontr6 que el peptido KSH1 se desplazaba en las celulas. Tambien se encontr6 que su cantidad excedia la del los peptido TAT derivado del VIH, un PTD convencionalmente conocido.

Ademas, las celulas CH0 se inocularon en el sistema Chamber SlideTM (producido por Nunc), se anadi6 a las celulas CH0 25 μM de cada uno del peptido KSH1 y del control positivo, y fue determinada la transferibilidad intracelular de esto usando un microscopio confocal.

Los resultados se muestran en la FIG. 2.

A partir de estos resultados se encontr6 que el peptido KSH1 fue desplazado en todas las celulas CH0.

Ejemplo 1-3 Analisis de citometria de flujo

Cada soluci6n peptidica, ajustada a 1 mM, fue diluida con un medio a tres niveles, 100 μM, 50 μM, y 25 μM, y se anadi6 a las celulas. Se usaron tres clases de celulas: celulas CH0, celulas HeLa y celulas Jurkat. Despues de anadir cada soluci6n peptidica, las celulas se incubaron durante 1 hora. Despues de lavar las celulas con PBS tres veces, se anadieron 100 μL de una disoluci6n de tripsina-EDTA 1 mM al 0,25 %, y se realiz6 tripsinizaci6n a temperatura ambiente durante 5 minutos. Despues de anadir 400 μL de PBS (FCS al 10 %) para parar la tripsinizaci6n, las celulas se lavaron con 1 mL de HBSS tres veces. Despues del lavado, las celulas se suspendieron en 500 μL de PBS (FCS al 10 %) y se sometieron a un analisis de citometria de flujo (de aqui en adelante en este documento, FACS) usando FACS Calibur (Becton Dickinson).

Los resultados se muestran en la FIG. 3. La ordenada indica el numero de celulas; la abscisa indicala intensidad de fluorescencia.

A partir de estos resultados se encontr6 que el peptido KSH1 mostraba una transferibilidad intracelular de 3 a 10 veces mas alta que el control positivo, con una potente capacidad de desplazamiento.

Ejemplo 2 Confirmaci6n de la actividad de desplazamiento usando la proteina de fusi6n eGFP

Ejemplo 2-1 Construcci6n del vector de expresi6n de His-eGFP

Con un cDNA de eGFP (eGFP-NII) (producido por Amersham Pharmacia) como plantilla, fue construido por el metodo PCR el "vector de expresi6n His-eGFP" con un marcador de His y sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricci6n.

La PCR fue realizada usando el kit PCR Easy-A (producido por Stratagene). Un ADN del cDNA de eGFP (eGFP-NII) para la plantilla fue diluido en 200 ng/mL. Los ADN sinteticos para los cebadores fueron ajustados a 20 μM. se mezclaron la plantilla, el cebador Fw y el cebador Rv, cada 1 μl, 10 μl del tamp6n de PCR Easy-A, 8 μl de dNTP (2,5 mM) y 0,5 μl de Easy-A, y esta mezcla fue rellenada con agua destilada esteril hasta completar 100 μl. Las condiciones de amplificaci6n de la PCR fueron como sigue: 94°C durante 2 minutos, 1 ciclo; y 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 2 minutos, 30 ciclos.

En esta invenci6n, la PCR fue realizada usando el cebador Fw mostrado por SEQ ID N0:116 en el listado de secuencia (Nco-His-GFP-f) y el cebador Rv mostrado por SEQ ID N0:117 en el listado de secuencia (GFP-Rev-Bam).

Despues, para clonarse en un vector, el fragmento amplificado por PCR fue digerido con las endonucleasas de restricci6n Ncol y BamHI, y fue recuperado un fragmento de ADN de 0,8 kb. El fragmento de ADN recuperado fue insertado en pET14b. El "vector de expresi6n His-eGFP " asi construido es un vector en el que la proteina de fusi6n His-eGFP es expresada en el control del promotor T7.

Ejemplo 2-2 Construcci6n del His-nueva secuencia candidato de PTD -vector de expresi6n eGFP

Por un metodo PCR, con un cDNA de eGFP (eGFP-NII) como plantilla, "un vector de expresi6n His-KHSl-eGFP" con un marcador His, fue construida un nueva secuencia candidato de PTD y sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricci6n.

La PCR fue realizada usando el cebador Fw mostrado por SEQ ID N0:118 en el listado de secuencia (KSH-kp-ndGF-f) y el cebador Rv mostrado por SEQ ID N0:117 en el listado de secuencia (GFP-Rev-Bam). Ademas la PCR fue realizada con el fragmento amplificado como plantilla, usando el cebador FV mostrado por SEQ ID N0:119 en el listado de secuencia (KSH-kp-nd-f2) y el cebador Rv mostrado por SEQ ID N0:117 en el listado de secuencia (GFP-Rev-Bam).

Posteriormente, para clonarlo en un vector, el fragmento amplificado por PCR fue digerido con las endonucleasas de restricci6n Ncol y BamHI, y fue recuperado un fragmento de ADN de 0,8 kb. El fragmento de ADN recuperado fue insertado en pET14b.

El "vector de expresi6n de His-KHSl-eGFP" asi construido tiene la proteina de fusi6n His-KSH1-eGFP expresada en el control del promotor T7.

Ejemplo 2-3 Preparaci6n de proteinas de fusi6n eGFP

Despues de que la cepa de BL21LysS, derivada de la cepa B de Escherichia coli, fuera transformada con el "vector de expresi6n His-eGFP" y el "vector de expresi6n de His-KSH1-eGFP" fuera construido en los Ejemplos 2-1 y 2-2, respectivamente, cada transformante fue precultivado en 20 mL de LB (37°C, 15 horas).

El caldo de precultivo fue inoculado a 1 L de LB al 2 %, y cultivado a 37°C durante 2,5 horas. Se anadi6 IPTG a una concentraci6n final de 1 mM, y se realiz6 un cultivo mas durante 4 horas. Despues de la centrifugaci6n (4000 revoluciones por minuto, 20 minutos Hitachi himac CR7) y de la recolecci6n de las celulas bacterianas, las celulas bacterianas se suspendieron en 50 mL de PBS. Ademas, la suspensi6n fue centrifugada (3500 revoluciones por minuto, 20 minutos KUB0TA 5200), y se recuperaron las celulas bacterianas. Posteriormente, las celulas bacterianas se suspendieron en 30 mL de PBS y se sometieron a ciclos de congelaci6n-descongelaci6n tres veces. Despues de la adici6n de 15 μL de la soluci6n de DNasa (Benzonase Takara NV677 bio) e incubaci6n de las celulas bacterianas a temperatura ambiente durante 10 minutos, se realiz6 un centrifugado (18000 revoluciones por minuto, 20 minutos T0MY UD-201), y el sobrenadante fue recuperado. El sobrenadante fue aplicado a una columna Ni-NTA equilibrada con PBS (QIAGEN 30430). Despues de que la columna fuera lavada con 50 mL de un PBS que contenia imidazol 10 mM, las proteinas de fusi6n se eluyeron con 4 mL de un PBS que contenia imidazol 200 mM. 15 μL del eluato se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE (gel de gradiente PAG-Mini, al 4-20 %, Productos quimicos Daiichi Pure), el gel despues de ser sometido a electroforesis se tin6 usando Quick CBB (Industrias Quimicas Wako Pure, 299-50101) y se realiz6 la detecci6n de proteinas.

Como consecuencia, se detectaron los grupos con los tamanos deseados correspondientes a la proteina de fusi6n His-KSH1-eGFP y a la proteina de fusi6n His-eGFP.

Ejemplo 2-4 Confirmaci6n del desplazamiento intracelular de la proteina de fusi6n KSH1

Se realiz6 una prueba de desplazamiento intracelular de cada proteina de fusi6n usando celulas CH0.

Se inocularon celulas CH0 o celulas HeLa en una placa de 96 pocillos a 104 celulas por pocillo; 2 dias mas tarde, se usaron las celulas despues de hacerse confluente. Despues de lavar las celulas con medio MEM tres veces, se anadi6 una soluci6n peptidica que comprendia His-nueva secuencia candidato de PTD -proteina de fusi6n eGFP y una soluci6n peptidica que comprendia la proteina de fusi6n His-eGFP, cada 100 μL, y las celulas se incubaron a 37°C durante 1 hora. Despues de lavar las celulas con PBS tres veces, las celulas fueron recuperadas via tripsinizaci6n. Despues de que las celulas recuperadas se lavaran con medio MEM un tiempo, y con PBS (FCS al 10 %) tres veces, las celulas se suspendieron en 100 μL de PBS (FCS al 10 %) y se sometieron a microscopia confocal.

A consecuencia de la microscopia confocal, se detect6 la fluorescencia de eGFP en las celulas a las cuales habia sido anadida la soluci6n peptidica que comprendia His -nueva secuencia candidato de PTD -proteina de fusi6n eGFP.

Los resultados se muestran en la FIG. 4.

A partir de estos resultados, se encontr6 que His -nueva secuencia candidato de PTD -proteina de fusi6n eGFP (en la FIG. 4, denominado "KSH1") se desplaz6 en las celulas. Sin embargo, no se detect6 ningun desplazamiento de His-eGFP (en la FIG. 4, denominado "His").

Ademas, debido a que se detect6 His -nueva secuencia candidato de PTD -proteina de fusi6n eGFP con un modelo de punto por punto, fue demostrada su localizaci6n en el endosoma. Esto discrepa con el hecho de que el peptido no se localiza solo en las celulas como se muestra en el Ejemplo 1-2. Se ha publicado que las proteinas de fusi6n de PTD son incorporadas en las celulas por macropinocitosis y que se localizan en el endosoma (J Control Release. 20 de enero de 2005; 102 (1):247-53 "Cationic TAT peptide transduction domain enters cells by macropinocytosis". Kaplan IM, Wadia JS, Dowdy SF.). Como consecuencia, se sugiri6 que la nueva secuencia candidato de PTD podia penetrar a traves de la membrana celular por el mismo mecanismo que otros peptidos PTD.

5 Ejemplo 3 Prueba del desplazamiento intracelular usando peptidos sinteticos de secuencias PTD modificadas

En los Ejemplos y dibujos de mas abajo, los numeros de identificaci6n de secuencia en el listado de secuencias correspondientes a los nombres de los peptidos individuales son los que se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

indicaci6n en Ejemplos y Figuras: SEQ ID N0:

KSH1-1: 1

KSH1-2: 2

KSH1-3: 3

KSH1-4: 4

KSH1-5: 5

KSH1-6: 6

KSH1-7: 7

KSH1-8: 8

KSH1-9: 9

KSH1-11: 10

KSH1-12: 11

KSH1-13: 12

KSH1-14: 13

KSH1-15: 14

KSH1-16: 15

KSH1-17: 16

KSH1-18: 17

KSH1-19: 18

KSH1-20: 19

KSH1-21: 20

KSH1-22: 21

KSH1-23: 22

KSH1-24: 23

KSH1-25: 24

KSH1-26: 25

KSH1-27: 26

KSH1-28: 27

KSH1-29: 28

KSH1-30: 29

KSH1-33: 30

KSH1-34: 31

KSH1-35: 32

KSH1: 33

KSH1-36: 34

KSH3: 35

KSH4: 36

KSH5: 37

KSH6: 38

KSH7: 39

KSH8: 40

KSH9: 41

KSH10: 42

KSH2: 43

KSH2-1: 44

KSH2-2: 45

KSH2-3: 46

KSH2-4: 47

Positivo o TAT: 50

Negativo: 51

Ejemplo 3-1 Analisis de KSH1-1 a KSH1-9

La predicci6n de la estructura de rueda (Trends Genet. 16 (6): 276-7, 2000) de la secuencia primaria del peptido KSH1 (SEQ ID N0:33 en el listado de secuencia) revel6 hallazgos caracteristicas de la formaci6n de un grupo 5 lisina/arginina, la presencia de dos tript6fanos, el dep6sito de prolina, un aminoacido rigido, y la presencia de arginina en una posici6n pegada a tript6fano, aunque la arginina no estaba implicada en la formaci6n del grupo. Como consecuencia, a fin de determinar la implicaci6n de estas secuencias caracteristicas en el desplazamiento intracelular, fueron disenadas las SEQ ID N0S:1 a 9 del listado de secuencias (FIG. 5). Cada peptido fue sintetizado, se marc6 fluorescentemente, se purific6 y se disolvi6 de la misma manera que en el Ejemplo 1-2, se

10 realiz6 una prueba del desplazamiento en celulas CH0, y se realiz6 una evaluaci6n por analisis con microsc6pico confocal y FACS. El analisis FACS se realiz6 de la misma manera que en el Ejemplo 1-3. Para el peptido KSH1 y las secuencias PTD modificadas, es decir, peptidos de KSH1-1 a KSH1-9 (SEQ ID N0S:1 a 9 en el listado de secuencia), se muestran las intensidades de fluorescencia determinadas por analisis FACS en la FIG. 6. Las concentraciones de adici6n del peptido fueron 50 μM, 25 μM, 12,5 μM y 6,5 μM.

15 Cuando la lisina del grupo lisina/arginina era sustituida con arginina (KSH1-1), a una concentraci6n de 50 μM, la eficacia del desplazamiento disminuia en aproximadamente el 20 % comparado con KSH1; sin embargo, cuando la concentraci6n de peptido se reducia, el desplazamiento intracelular se acentuaba comparado con KSH1 (aproximadamente 2 veces a 25 μM, aproximadamente 8 veces a 12,5 μM, aproximadamente 2 veces a 6,25 μM). Esto demostr6 la importancia del grupo lisina/arginina.

20 Despues de esto, para examinar el papel de la arginina no implicada en la formaci6n del grupo respecto a las tres argininas que estaban presentes en KSH1, esta arginina fue sustituida con alanina. Cuando la arginina se sustituia con alanina, el desplazamiento intracelular disminuia notablemente, habiendo s6lo desplazamiento intracelular a 50

μM (KSH1-3). Se encontr6 que este requerimiento de la arginina en los alrededores del tript6fano desempena un papel importante en el desplazamiento intracelular.

Para examinar el significado de la prolina, que se piensa que influye en la conformaci6n de los peptidos, la prolina fue sustituida con alanina; no se observ6 ninguna influencia en la transferibilidad intracelular (KSH1-2).

El tript6fano es un aminoacido caracteristico de KSH1, y hay dos tript6fanos localizados en los polos del grupo lisina/arginina en la estructura de rueda con una estructura de sandwich de treonina. Cuando los dos tript6fanos se sustituian ambos con alanina, ya no se observaba ningun desplazamiento intracelular (KSH1-6). Con este hallazgo se deduce que el tript6fano era importante para el desplazamiento intracelular.

Se examin6 si la transferibilidad intracelular cambiaba aumentando el numero de tript6fanos. Cuando se sustituy6 treonina con tript6fano para formar un grupo tript6fano (KSH1-7), la transferibilidad intracelular se acentuaba notablemente. Comparado con KSH1, se detect6 un desplazamiento intracelular de no menos de 3 veces mas alto, entre 25 μM y 6,15 μM, y se detect6 un desplazamiento intracelular de no menos de 10 veces mas alto a 12,5 μM. La acentuaci6n de la transferibilidad mostr6 el mismo perfil que KSH1-1. Sin embargo, aun cuando tres tript6fanos se disponian uniformemente en la estructura de rueda, el desplazamiento intracelular no cambiaba (KSH1-4). A partir de este hallazgo, se pens6 que la transferibilidad intracelular se acentuaba debido a la formaci6n del grupo tript6fano.

Ya que la transferibilidad se acentuaba formando el grupo tript6fano, y teniendo en cuenta que los resultados para KSH1-1, la lisina fue sustituida con arginina (KSH1-8); el desplazamiento intracelular disminuy6 a 50 μM, pero el desplazamiento a 25 μM o menos fue acentuado. Ya que se esperaba que la ampliaci6n del grupo tript6fano acentuaria el desplazamiento intracelular, el numero de tript6fanos fue aumentado a 4 (KSH1-9), pero fue obtenida la misma tendencia que KSH1-8.

Ejemplo 3-2 Analisis de KSH1-11 a 1-23 y KSH1-35

Para determinar que aminoacidos son importantes para el desplazamiento intracelular, se realiz6 la sustituci6n de alanina completa sobre la base de KSH1-1 para disenar de KSH1-11 (SEQ ID N0:11 en el listado de secuencia) a KSH1-23 (SEQ ID N0:22 en el listado de secuencia) y KSH1-35 (SEQ ID N0:32 en el listado de secuencia) (FIG. 7). Cada peptido fue sintetizado, se marc6 fluorescentemente, se purific6 y se disolvi6 de la misma manera que en el Ejemplo 1-2, se realiz6 una prueba del desplazamiento en celulas CH0, y se realiz6 una evaluaci6n por analisis con microsc6pico confocal y FACS. El analisis FACS se realiz6 de la misma manera que en el Ejemplo 1-3. Para KSH1 y las secuencias PTD modificadas, es decir, de KSH11-11 a 23 y KSH1-35, las intensidades de fluorescencia determinadas por el analisis FACS se muestran en la FIG. 8. Las concentraciones de adici6n de peptido fueron 50 μM, 25 μM, 12,5 μM y 6,5 μM.

Cuando se sustituia arginina y tript6fano con alanina, el desplazamiento intracelular disminuia claramente. Cuando se sustituia la 7a tirosina con alanina, no se observaba casi ningun desplazamiento intracelular (KSH1-17); se encontr6 que la 7a tirosina era importante para el desplazamiento intracelular. Incluso cuando se sustituia la 1a arginina con alanina, el desplazamiento intracelular no disminuia mucho (KSH1-11). Cuando se sustituian otros argininas con alanina, el desplazamiento intracelular disminuia (KSH1-15 y KSH 1-22); sin embargo, comparado con la 13a arginina substituida (KSH1-3), la reducci6n del desplazamiento intracelular era menor.

En cuanto al tript6fano, el 6° tript6fano era mas importante para el desplazamiento intracelular que el 3° (KSH1-13, KSH1-6). Con estas conclusiones, se pens6 que la 13a arginina, 6a arginina y 7a tirosina desempenaban un papel importante en el desplazamiento intracelular, y que los otros aminoacidos contribuian de menor manera al desplazamiento intracelular (KSH1-11, KSH1-12, KSH1-14, KSH1-19, KSH1-20, KSH1-23, KSH1-35).

El unico caso en el que la sustituci6n de alanina acentuaba el desplazamiento intracelular era la sustituci6n de la 8a serina con alanina.

Ejemplo 3-3 Analisis de KSH1-24 a 1-26 y KSH1-28 a 1-30

En un intento de sustituir dos tript6fanos con otros aminoacidos hidr6fobos, fueron disenados KSH11-24 (SEQ ID N0:23 en el listado de secuencia) a KSH1-26 (SEQ ID N0:25 en el listado de secuencia) y KSH1-28 (SEQ ID N0:27 en el listado de secuencia) a KSH1-30 (SEQ ID N0:29 en el listado de secuencia) (FIG. 9).

Cada peptido fue sintetizado, se marc6 fluorescentemente, se purific6 y se disolvi6 de la misma manera que en el Ejemplo 1-2, se realiz6 una prueba del desplazamiento en celulas CH0, y se realiz6 una evaluaci6n por analisis con microsc6pico confocal y analisis FACS. El analisis FACS se realiz6 de la misma manera que en el Ejemplo 1-3. Para KSH1 y las secuencias PTD modificadas, es decir, KSH11-24 a 1-26 y KSH1-28 a 1-30, las intensidades de fluorescencia determinadas por el analisis FACS se muestran en la FIG. 10. Las concentraciones de adici6n del peptido eran 50 μM, 25 μM, 12,5 μM y 6,5 μM.

En primer lugar, se sustituyeron dos tript6fanos con leucina (KSH1-24), fenilalanina (KSH1-25) e isoleucina (KSH126); el desplazamiento intracelular disminuy6 con leucina, pero fue casi el mismo que en KSH1-1 con fenilalanina e

isoleucina. Como consecuencia, respecto a KSH1-18, fue disenada una modificaci6n para sustituir la 8a serina de KSH1-26 con alanina, pero el desplazamiento intracelular se acentuaba muy poco.

Ademas, se sustituyeron dos tript6fanos con otros aminoacidos hidr6fobos, es decir, valina y tirosina (KSH1-29, KSH1-30); el desplazamiento intracelular disminuy6 ligeramente con valina, pero hubo un buen desplazamiento intracelular con tirosina. Resumiendo estos resultados para los aminoacidos hidr6fobos que sustituyen al tript6fano, el desplazamiento intracelular era mejor en el orden de isoleucina, tirosina, fenilalanina, valina y leucina.

Ejemplo 3-4 Analisis de KSH1-27, KSH1-33, KSH1-34 y KSH1-36

Se disenaron KSH1-27 (SEQ ID N0:26 en el listado de secuencia), KSH1-33 (SEQ ID N0:30 en el listado de secuencia), KSH1-34 (SEQ ID N0:31 en el listado de secuencia) y KSH1-36 (SEQ ID N0:34 en el listado de secuencia) (FIG. 11)

Cada peptido fue sintetizado, se marc6 fluorescentemente, se purific6 y se disolvi6 de la misma manera que en el Ejemplo 1-2, se realiz6 una prueba del desplazamiento en celulas CH0, y se realiz6 una evaluaci6n por analisis con microsc6pico confocal y analisis FACS. El analisis FACS se realiz6 de la misma manera que en el Ejemplo 1-3. Para KSH1 y las secuencias PTD modificadas, es decir, KSH1-27, KSH1-33, KSH1-34 y KSH1-36, las intensidades de fluorescencia determinadas por el analisis FACS se muestran en la FIG. 12. Las concentraciones de adici6n del peptido fueron 50 μM, 25 μM, 12,5 μM y 6,5 μM.

A partir de los resultados de KSH1-18, todas las serina y treonina fueron sustituidas con alanina (KSH1-27); comparado con KSH1-1, el desplazamiento intracelular disminuy6 ligeramente, pero el desplazamiento a concentraciones bajas fue casi el mismo.

En KSH1-3, cuando se sustituia la arginina (13a) existente en los alrededores del 6° tript6fano en la estructura de rueda con alanina, el desplazamiento intracelular se hacia muy poco observable. Como consecuencia, para determinar que posici6n de la arginina es importante en KSH1-33, en los alrededores del tript6fano en la estructura de rueda o en la 13a posici6n, la 13a arginina fue sustituida con alanina, y la 10a treonina fue sustituida con arginina. Como consecuencia, el desplazamiento intracelular fue casi equivalente o mas que KSH1-1 en la Tabla 1-1. A partir de este descubrimiento, se concluy6 que la presencia de arginina en los alrededores del 6° tript6fano en la estructura de rueda era importante.

Ademas, para determinar si la 13a arginina ya no era necesario si la arginina estaba presente en los alrededores del 3er tript6fano en KSH1-34, la existencia de la 14a tirosina en los alrededores del 3er tript6fano en la estructura de rueda fue sustituida con arginina. Como consecuencia, el desplazamiento intracelular disminuy6 bastante; se concluy6 que la presencia de arginina en los alrededores del 6° tript6fano en la estructura de rueda era esencial para el desplazamiento intracelular.

KSH1-36, el peptido de cadena invertida de KSH1, mostr6 un desplazamiento intracelular acentuado a concentraciones altas comparado con KSH1, pero el desplazamiento intracelular a la inversa tendia a disminuir a concentraciones bajas.

Ejemplo 3-5 Experimentos de desplazamiento intracelular en celulas HeLa y celulas Jurkat

En celulas HeLa como con las celulas CH0, se realizaron experimentos de desplazamientos intracelulares de peptidos sinteticos de secuencias PTD modificadas por analisis con microsc6pico confocal. Comparado con las celulas CH0, el desplazamiento intracelular era generalmente mas bajo, pero la tendencia era casi la misma que en las celulas CH0. Sin embargo, en las celulas HeLa respecto a las celulas CH0, el desplazamiento intracelular de KSH1-7 era mas bajo y, a la inversa, el desplazamiento intracelular de KSH1-16 era ligeramente mas alto. Para concluir, fue observado un desplazamiento intracelular mejor en celulas HeLa en los peptidos modificados KSH1-1, KSH1-8, KSH1-9, KSH1-18, KSH1-20 y KSH1-33.

En las celulas Jurkat tambien fueron realizados los experimentos de desplazamiento intracelulares de peptidos sinteticos de secuencias PTD modificadas por analisis con microsc6pico confocal. Comparado con las celulas CH0, el desplazamiento intracelular era generalmente bastante mas bajo, pero la tendencia era casi la misma que en las celulas CH0 y celulas las HeLa. Sin embargo, cuando el tript6fano se sustituia con otros aminoacidos hidr6fobos, el desplazamiento intracelular disminuia bastante. Para concluir, el mejor desplazamiento intracelular en celulas Jurkat fue observado en los peptidos modificados de SEQ ID N0S:KSH1-1, KSH1-7, KSH1-8, KSH1-9, KSH1-12, KSH1-14, KSH1-18, KSH1-20, KSH1-21 y KSH1-33 en la Tabla 1, comparado con el de SEQ ID N0:37 en el listado de secuencias.

A partir de los resultados de los Ejemplos 3-1 a 3-5, fueron identificadas las secuencias mostradas en la FIG. 13. En la figura, B es arginina o lisina, tanto 01 como 02 son arginina, Z es un aminoacido hidr6fobo, J es serina o alanina y X es un aminoacido elegido aleatoriamente.

Ejemplo 4 Prueba del desplazamiento intracelular de las secuencias PTD modificadas y las proteinas de fusi6n eGFP en celulas CH0

Ejemplo 4-1 Construcci6n del vector de expresi6n de la proteina de fusi6n eGFP

En la evaluaci6n del desplazamiento intracelular usando las proteinas de fusi6n eGFP, se prepararon dos clases de de insertos (tipo C y D en la FIG. 14).

Los cebadores para la amplificaci6n del inserto fueron disenados para permitir la adici6n en marco de un marcador

5 His y una secuencia PTD en el extremo N-terminal o C-termino de eGFP. El diseno era tal que el conector GGGS o GGGSS seria codificado hacia delante y hacia detras del marcador His y de la secuencia PTD, respectivamente. El resto PTD usado era una secuencia de ADN que codificaba el PTDl derivado del TAT del VIH, las partes de la secuencia de ADN de los conectores GGGS y GGGSS que codificaban el resto PTD se prepararon para producir secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restricci6n BamHI y Xhol, respectivamente.

10 Diseno de cebador

Configuraci6n de inserto C (tipo C en la FIG. 14)

Cebador directo C-F (SEQ ID N0:52 en el listado de secuencia) 5'-GCC ATG GTG AAG GGC GAG GAG CTG TTC3'

Cebador inverso C-R1 (SEQ ID N0:53 en el listado de secuencia) 5'-CAC CGC GGC GAC GTT GTC GTC GTT TCT 15 TCC TGC CGT AGG ATC CCC CTC CCT TGT ACA GCT CGT CCA TGC C-3'

Cebador inverso C-R2 (SEQ ID N0:54 en el listado de secuencia) 5'-CGC TCA GCG TCG ACT CAC CCG TGA TGA TGG TGG TGA TGA CTC GAG CCG CCA CCG CGG CGA CGT TGT CGT-3'

Configuraci6n del inserto D (tipo D en la FIG. 14)

Cebador directo D-F (SEQ ID N0:55 en el listado de secuencia) 5'-AAG CCA TGGGAG GGG GATCCT ACG GCA 20 GGA AGA AAC GAC GAC AAC GTC GCC GCG GTG GCG GCT CGA GTA TGG TGA GCA AGG GCG AGG A-3'

Cebador inverso D-R (SEQ ID N0:56 en el listado de secuencia) 5 '-CCG CTC AGC GTC GAC TCACCC GTG ATG ATG GTG GTG ATG AGA ACC ACC ACC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3'

Asi, es posible dividir al resto PTD con BamHI y Xhol, y sustituir al mismo con ADN sintetico. Con eGFP como plantilla, las anteriormente descritas SEQ ID N0S:52 a 56 en el listado de secuencias se insertaron entre las

25 secuencias de reconocimiento de la endonucleasa de restricci6n Ncol y Bpu1102I de pET14b (FIG. 15).

Las secuencias de PTD modificadas se insertaron usando los oligos sinteticos mostrados en la Tabla 2, por el metodo mostrado en la FIG. 16.

Tabla 2

Nombre del peptido PTD modificado: 0lig6mero directo (F) u olig6mero inverso (R) SEQ ID N0: en el listado de secuencia

KSH1: F R 58 59

KSH1-1: F R 60 61

KSH1-2: F R 62 63

KSH1-3: F R 64 65

KSH1-4: F R 66 67

KSH1-5: F R 68 69

KSH1-6: F R 70 71

KSH1-7: F R 72 73

KSH1-8: F R 74 75

KSH1-9: F R 76 77

KSH1-11: F R 78 79

KSH1-13: F R 80 81

KSH1-18: F R 82 83

KSH1-20: F R 84 85

KSH1-21: F R 86 87

KSH1-26: F R 88 89

KSH1-27: F R 90 91

KSH1-28: F R 92 93

KSH1-30: F R 94 95

KSH1-33: F R 96 97

KSH1-36: F R 98 99

Se us6 para el control negativo uno que tenia His s6lo anadido al extremo C-terminal, se amplific6 utilizando el grupo cebador de SEQ ID N0:52 y 56 en el listado de secuencias con eGFP como plantilla.

Despues de esto la cepa de BL21/LysS, derivada de la cepa B de Escherichia coli, fue transformada con el vector de expresi6n construido, cada transformante fue precultivada en 20 mL de LB (37°C, 15 horas). El caldo de precultivo fue trasplantada a 1 L de LB al 2 %, y el transformante fue cultivado a 37°C durante 2.5 horas. Se anadi6 IPTG a una concentraci6n final de 1 mM, y despues se realiz6 un cultivo durante 4 horas. Despues de la centrifugaci6n (4000 revoluciones por minuto, 20 minutos Hitachi himac CR7) y de la recuperaci6n de las celulas bacterianas, las celulas bacterianas se suspendieron en 50 mL de PBS. Se realiz6 un centrifugado (3500 revoluciones por minuto, 20

minutos KUB0TA 5200), y se recuperaron las celulas bacterianas. Las celulas bacterianas se suspendieron en 30 mL de HBSS y se sometieron a un ciclo de congelaci6n-descongelaci6n tres veces. Se anadi6 una soluci6n de DNasa (Benzonase Takara NV677 bio), 15 μL, y las celulas bacterianas se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se realiz6 un centrifugado (18000 revoluciones por minuto, 20 minutos T0MY UD-201), y el sobrenadante se recuper6. El sobrenadante se aplic6 a una columna Ni-NTA equilibrada con HBSS. Despues de que la columna fuera lavada con 50 mL de un imidazol 10 mM conteniendo HBSS, las proteinas de fusi6n se eluyeron con 4 mL de imidazol 200 mM conteniendo HBSS.

Ejemplo 4-2 Desplazamiento intracelular de secuencias PTD modificadas y proteinas de fusi6n eGFP en celulas CH0

El desplazamiento intracelular de proteinas de fusi6n fue investigado usando celulas CH0. Las celulas CH0 se inocularon en una placa de 48 pocillos a 2x104 celulas por pocillo; las celulas se usaron despues de volverse confluentes. Despues de lavar las celulas con medio MEM tres veces, se anadieron 150 μL de la soluci6n de proteina, y las celulas se incubaron a 37°C durante 3 horas. Despues del lavado de la placa con PBS tres veces, fue anadido tripsina al 0,25 % /EDTA a 100 μL/pocillo, fue anadido un medio MEM que contenia FCS al 10 % a 400 μL/pocillo, y las celulas fueron recuperadas. Despues de lavar con HBSS tres veces, las celulas recuperadas se suspendieron en 100 μL de HBSS que contenia FCS al 10 %, y se sometieron a la microscopia confocal. La concentraci6n de adici6n fue ajustada para obtener intensidades de fluorescencia de 106, 5 x 105 y 2,5 x 105 como se determina midiendo la cantidad de fluorescencia derivada de eGFP (Ex 485 nm/Em 535 nm) usando ARV0 (Perkin-Elmer) (tiempo de medida 1 segundo).

Las proteinas de fusi6n de eGFP se prepararon con KSH1-1, KSH1-7, KSH1-8, KSH1-9, KSH1-18 y KSH1-33, mostrando un desplazamiento intracelular claramente acentuado comparado con el peptido KSH1 en el Ejemplo 3, asi como KSH1-20, KSH1-21, KSH1-26, KSH1-27, KSH1-28, KSH1-30 y KSH1-36. Para el analisis, se prepararon proteinas de fusi6n tipo C para KSH1, KSH1-1, KSH1-7 y KSH1-8, y se prepararon proteinas de fusi6n D para los otros peptidos.

Para las proteinas de fusi6n eGFP preparadas, se realiz6 una prueba de desplazamiento intracelular usando celulas CH0; los resultados se muestran en la FIG. 17. Los paneles superiores muestran la fluorescencia de la proteina eGFP que habia se desplazado en las celulas; los paneles inferiores muestran imagenes microsc6picas de interferencia diferencial de las celulas junto con imagenes fluorescentes. Las proteinas de fusi6n fueron anadidas a las celulas despues de que sus intensidades de fluorescencia se uniformizaran a 106. Cuando se anadieron las proteinas de fusi6n de las formas modificadas de KSH-1 que mostraban desplazamiento intracelular y eGFP a celulas CH0, se detect6 fluorescencia en las celulas; se encontr6 que todas las formas modificadas de KSH-1 retenian la capacidad de desplazar las proteinas de fusi6n dentro de las celulas. Comparado con el peptido solo, las proteinas de fusi6n mostraron diferencias mas pequenas en la eficacia de desplazamiento, pero las proteinas de fusi6n con KSH1-1, KSH1-7 y KSH1-27 mostraron un desplazamiento intracelular acentuado comparado con KSH1.

Cuando la hidrofobicidad del peptido anadido aumentaba, el desplazamiento intracelular con las proteinas de fusi6n mostraba una mayor tendencia a no reflejar los resultados con el peptido. Para KSH1-30, que tenia dos tript6fanos sustituidos con tirosina, el desplazamiento intracelular disminuia bastante con las proteinas de fusi6n a pesar de lo cual fueron obtenidos buenos resultados con el peptido; por lo tanto, para la sustituci6n de dos tript6fanos, la isoleucina (KSH1-26) era la mas conveniente.

Para el reemplazo de treonina y serina con alanina (KSH1-18, KSH1-20, KSH1-21), no se observ6 ninguna acentuaci6n clara del desplazamiento intracelular con las proteinas de fusi6n. Sin embargo, cuando todas las treoninas y serinas se sustituyeron con alanina (KSH1-27), el desplazamiento intracelular tendi6 a ser acentuado claramente; por lo tanto, se concluy6 que para cambiar la eficacia del desplazamiento intracelular de las proteinas de fusi6n, se requiere un cambio estructural mas grande en el resto peptidico que el peptido solo.

En resumen, con la adici6n de peptidos modificados de KSH1, las proteinas se desplazaban dentro de las celulas, pero la eficacia del desplazamiento de las proteinas de fusi6n era diferente a la del peptido solo.

Ejemplo 5 Prueba del desplazamiento intracelular de nuevas secuencias de PTD (SEQ ID N0S:39 a 47 en el listado de secuencia)

Ejemplo 5-1 Selecci6n de nuevas secuencias de PTD por analisis FACS

El peptido KSH1 era una secuencia obtenida de una biblioteca 7 veces concentrada de celulas Jurkat. A partir de ahi, se recogieron aleatoriamente 1000 IVV contenidos en la biblioteca 7 veces concentrada de celulas Jurkat, y se identificaron sus secuencias de ADN. Ya que el analisis de KSH1 condujo a la anticipaci6n de que cuando la secuencia del peptido era aplicada a la estructura de rueda, la presencia de un grupo lisina/arginina y el tript6fano eran importantes, se realiz6 un estrechamiento de 1000 secuencias con estas condiciones como criterio. Como consecuencia, 60 secuencias cumplian los criterios. De las 1000 secuencias, se observ6 una clase de la secuencia que aparece repetidamente. Para estas secuencias, se sintetizaron peptidos fluorescentemente marcados, y se analizaron sus capacidades de desplazamiento dentro de las celulas.

Cada peptido fue sintetizado, se marc6 fluorescentemente, se purific6 y se disolvi6 de la misma manera que en el Ejemplo 1-2, y se realiz6 una prueba de desplazamiento intracelular dentro de las celulas CH0 por analisis FACS. Se us6 para el control positivo una secuencia PTD derivada del VIH de TAT (SEQ ID N0:51 en el listado de secuencia) y el peptido KSH1; se us6 para el control negativo una secuencia peptidica que carece de transferibilidad intracelular (SEQ ID N0:57 en el listado de secuencia).

A consecuencia del analisis FACS, fueron identificados una clase de secuencia que mostraba la misma transferibilidad que KSH1, y nueve clases de secuencias que mostraban la misma transferibilidad que PTD derivado de TAT, en celulas CH0. Estas nueve clases de secuencias peptidicas son como las mostradas por KSH3 a 10 y KSH2 (SEQ ID N0S:35 a 43 en el listado de secuencia) (FIG. 18).

Ejemplo 5-2 Analisis de transferibilidad celular de las nuevas secuencias de PTD por microscopia confocal

Para KSH2 a KSHI0 (SEQ ID N0S:35 a 43 en el listado de secuencia), se realiz6 una prueba del desplazamiento dentro de las celulas CH0 de la misma manera que en el Ejemplo 1-2, y se realiz6 un analisis con microsc6pico confocal. Se us6 para el control positivo una secuencia PTD derivada del TAT de VIH (SEQ ID N0:50 en el listado de secuencia) y el peptido KSH1; se us6 para el control negativo una secuencia peptidica que carece de la transferibilidad intracelular (SEQ ID N0:57 en el listado de secuencia).

En el analisis con microsc6pico confocal, se realiz6 una correcci6n de fondo usando celulas a las cuales habia sido anadido el peptido de control negativo (SEQ ID N0:57 en el listado de secuencia). A partir de aqui, se anadi6 el control positivo peptido de PTDl (SEQ ID N0:50 en el listado de secuencia), y se examin6 la fluorescencia en las celulas.

En cuanto a la nueva secuencia de PTD, cada peptido fue analizado en una serie de diluciones de 2 veces en tres niveles de 50 μM a 12,5 μM. Como consecuencia, los resultados del analisis con microsc6pico confocal mostraron la misma tendencia que los resultados del analisis FACS. Para las cuatro clases de KSH2, KSH3, KSH4, KSH6, KSH7 y KSHI0, los resultados del analisis con microsc6pico confocal, como con el analisis FACS, mostraron mejores perfiles de desplazamiento intracelular que PTDl (FIG. 19, los paneles superiores muestran la fluorescencia de peptidos marcados con fluorescencia desplazados dentro de las celulas; los paneles inferiores muestran imagenes microsc6picas de interferencia diferencial de las celulas junto con imagenes fluorescentes; la concentraci6n de adici6n del peptido fue 25 μM). Las secuencias candidato de PTD identificadas aqui retuvieron claramente la capacidad de desplazamiento intracelular. Cuando se realiz6 la busqueda de base de datos, no fueron observadas ninguna secuencia hom6loga; se encontr6 que todas eran nuevas secuencias PTD. En cuanto a KSH2, el peptido fue localizado como dispersados en la superficie de la membrana celular en las celulas HeLa, mostrando un modelo de transferibilidad diferente del de los otros PTD.

Ejemplo 5-3 Prueba del desplazamiento intracelular de nuevas secuencias de PTD y proteinas de fusi6n eGFP en celulas CH0

Para las seis clases de KSH2, KSH3, KSH4, KSH6, KSH7 y KSHI0, se prepararon proteinas de fusi6n eGFP, y si las secuencias tenian una actividad parecida a PTD las nuevas secuencias de PTD y las proteinas de fusi6n eGFP en celulas fue determinado el desplazamiento. Para las proteinas de fusi6n, fueron elegidas formas moleculares con un estado de solubilizaci6n alto. Como consecuencia, para KSH2 y KSH6, fue elegido el tipo molecular C enla FIG. 14, y para las restantes cuatro clases, fue elegido el tipo D en la FIG. 14. Las proteinas de fusi6n se prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 4-1. Las oligo-secuencias de hibridaci6n usadas en este caso son como las que se muestran en la Tabla 3. Se us6 para el control negativo EGFP-His; despues de que se normalizaran las intensidades de fluorescencia respectivas, fueron anadidas las proteinas de fusi6n respectivas a las celulas CH0.

Tabla 5

KSH3: F R 100 101

KSH4: F R 102 103

KSH6: F R 104 105

KSH7: F 106

R: 107

F: 108

KSH10

R: 109

F: 110

KSH2

R: 111

Despues de la incubaci6n a 37°C durante 1 hora, se realiz6 la tripsinizaci6n, y las celulas fueron recuperadas. Despues de la operaci6n de lavado, fue determinada la presencia o ausencia del desplazamiento dentro de las celulas usando un microscopio confocal. En la realizaci6n de la medida, se establecieron las condiciones bajo las cuales no se detect6 la fluorescencia en celulas CH0 a las cuales habia sido anadido el control negativo EGFP-His, despues de lo cual fueron realizadas las medidas de las celulas a las que se les habia anadido cada nueva proteina eGFP de fusi6n de PTD. Como consecuencia, se observ6 fluorescencia en celulas CH0 a las cuales se habia anadido cualquier nueva proteina de fusi6n de PTD preparada eGFP, demostrando el desplazamiento de las proteinas de fusi6n dentro de las celulas.

A partir de este hallazgo, se encontr6 que las seis clases de nuevas secuencias de PTD tenian la actividad tipo PTD anteriormente descrita. Para el peptido KSH7, los aminoacidos basicos compartidos por los conocidos PTD que han sido publicados hasta ahora, tales como arginina, estaban presentes solos, representando una nueva categoria de PTD. De las seis clases de los nuevo PTD, KSH4 y KSH2 mostraron el desplazamiento mas alto dentro de las celulas que los otros nuevos PTD y el peptido KSH1, y eran utiles cuando se usaba como carga una proteina, en particular, eGFP.

Ejemplo 6 Pruebas de desplazamiento intracelular de peptidos de la secuencia PTD modificados de SEQ ID N0:47 en celulas CH0

Ejemplo 6-1 Prueba de desplazamiento intracelular de peptidos de la secuencia PTD modificados usando un microscopio confocal

De las nuevas secuencias de PTD encontradas en el Ejemplo 5, el peptido KSH2 es muy capaz de desplazar eGFP dentro de las celulas; se hizo un intento para modificar el peptido KSH2. Se sintetizaron los peptidos de KSH2-1 a KSH2-4 (SEQ ID N0S:44 a 47 en el listado de secuencia), se marcaron fluorescentemente, se purificaron y se disolvieron de la misma manera que en el Ejemplo 1-2, se realiz6 una prueba del desplazamiento dentro de las celulas CH0, y se realiz6 un analisis con microsc6pico confocal.

El peptido KSH2 se caracteriza por la formaci6n de un grupo lisina-arginina en la estructura de rueda y por la presencia de dos tript6fanos. 0tra caracteristica es que estan presentes dos cisteinas como un sandwich de tript6fano. A partir de los analisis que han sido realizados hasta ahora, se ha encontrado que son importantes un grupo de aminoacidos basicos y el tript6fano. Como consecuencia, en la modificaci6n del peptido KSH2, fue examinada la influencia de la sustituci6n de dos cisteinas con otros aminoacidos (FIG. 20).

En primer lugar, se examinaron dos casos: se sustituyeron dos cisteinas con alanina (KSH2-1) o con tript6fano (KSH2-2). Se sintetizaron los peptidos marcados con FITC, y se examin6 su eficiencia de desplazamiento intracelular usando celulas CH0, HeLa y Jurkat (FIG. 21, la concentraci6n de adici6n del peptido fue de 50 μM, 25 μM o 12,5 μM).

Como consecuencia, a una concentraci6n de 50 μM, tanto KSH2-1 como KSH2-2 mostraron un desplazamiento intracelular mas alto que KSH2; cuando se diluy6 a 25 μM, KSH2-1 exhibia un desplazamiento intracelular notablemente disminuido. Sin embargo, KSH2-2 mostr6 una eficacia de desplazamiento intracelular mas alta que KSH2 aun cuando se diluia a 25 μM y 12,5 μM. En KSH2-2, que mostr6 un desplazamiento intracelular promovido, el numero de tript6fanos fue 4. Segun el numero de tript6fanos aumenta, el desplazamiento intracelular del peptido se acentua; sin embargo, ya que se pens6 que esto causaba probablemente insolubilizaci6n en la preparaci6n de la proteina de fusi6n, dos cisteinas fueron sustituidas una tras otro con alanina (KSH2-3 y KSH2-4), y el desplazamiento intracelular fue examinado. Cuando se examin6 la capacidad de desplazamiento intracelular de los peptidos marcados con FITC en celulas CH0, HeLa, y Jurkat, se encontr6 que en ambos casos, la capacidad del desplazamiento intracelular se acentuaba, comparado con KSH2.

Ejemplo 6-2 Prueba del desplazamiento intracelular de las proteinas de fusi6n de secuencias PTD modificadas y eGFP en celulas CH0

Para KSH2-3 y KSH2-4 (SEQ ID N0S:46 y 47 en el listado de secuencia), se prepararon las proteinas de fusi6n eGFP, y se compararon las capacidades de transferencia de KSH2 y de las proteinas de fusi6n eGFP en terminos de actividad del tipo PTD respecto al desplazamiento de las nuevas secuencias de PTD y de las proteinas de fusi6n

eGFP en las celulas. Las proteinas de fusi6n preparadas eran del tipo C en la FIG. 14 para KSH2 y del tipo D en la FIG. 14 para KSH2-3 y KSH2-4. Las proteinas de fusi6n se prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 4-1. Las oligo-secuencias de hibridaci6n usadas en esta invenci6n son como se muestran en la Tabla 4.

Tabla 6

F: 112

KSH2-3

R: 113

F: 114

KSH4

R: 115

Cuando se examin6 la capacidad de desplazamiento en las celulas CH0, el desplazamiento en las celulas fue confirmado tanto para las proteinas de fusi6n de KSH2-3 como para KSH2-4 con eGFP. En cuanto a la eficacia del desplazamiento intracelular, la capacidad de desplazamiento fue mas baja que la de la proteina de fusi6n eGFP con el peptido KSH2, pero era equivalente a la del PTDl derivado de TAT.

En resumen, se concluy6 que es eficiente elegir KSH2 cuando se usa como carga una proteina polimerica, y elegir las formas modificadas KSH2-3 y KSH2-4 cuando se usan sustancias de bajo peso molecular como los peptidos.

Aplicabilidad Industrial

Segun la presente invenci6n, es posible proporcionar un peptido que penetra en las celulas que tiene una nueva secuencia de aminoacidos y un producto farmaceutico que contiene el peptido. Esta aplicaci6n reivindica la prioridad segun la solicitud de patente japonesa N°. 2005-314355.

Listado de secuencias

<110> MITSUBISHI TANABE PHARMA C0RP0RATI0N

<120> NUEV0 PEPTID0 QUE PENETRA EN LAS CELULAS

<130> MP5209W0

<150> JP2005-314355

<151> 2005-10-28

<160> 119

<170> Patent In versi6n 3.1

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Inventor: Uno, Shusei: Kamide, Kaeko: Nakakubo, Hiroshi

<220>

<223> Peptido disenado para actuar como PTD (Dominio de transducci6n de la proteina)

<400> 1

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Peptido disenado para actuar como PTD(Dominio de transducci6n de la proteina)

<400> 2

5 <210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Peptido disenado para actuar como PTD(Dominio de transducci6n de la proteina)

<400> 3

<210> 4

<211> 15 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 4

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 25 <220>

<400> 5

<210> 6 30 <211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

35 <400> 6

<210> 7

<211> 15

<212> PRT 40 <213> Secuencia artificial <220>

<400> 7

5 <210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 8

<210> 9

<211> 15 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 9

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<400> 10

<210> 11 30 <211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

35 <400> 11

<210> 12

<211> 15

<212> PRT 40 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 12

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 13

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<400> 14

<210> 15 20 <211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

25 <400> 15

<210> 16

<211> 15

<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 16

35 <210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 40 <223> Peptido disenado para actuar como PTD (Dominio de transducci6n de la proteina)

<400> 17 <210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 18

10 <210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Peptido disenado para actuar como PTD (Dominio de transducci6n de la proteina)

<400> 19

<210> 20

<211> 15 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 20

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<400> 21

<210> 22 35 <211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

40 <400> 22 <210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 23

10 <210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Peptido disenado para actuar como PTD(Dominio de transducci6n de la proteina)

<400> 24

<210> 25

<211> 15 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 25

<210> 26

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<400> 26

<210> 27 35 <211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

40 <400> 27 <210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 28

10 <210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 29

<210> 30

<211> 15 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 30

<210> 31

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<400> 31

<210> 32 35 <211> 30

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

40 <400> 32 <210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 33

10 <210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 34

<210> 35

<211> 15 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> .

<400> 35

<210> 36

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<400> 36

<210> 37 35 <211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

40 <400> 37 <210> 38

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 38

10 <210> 39

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 39

<210> 40

<211> 15 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 40

<210> 41

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<400> 41

<210> 42 35 <211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

40 <400> 42 <210> 43

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 43

10 <210> 44

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 44

<210> 45

<211> 15 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 45

<210> 46

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<400> 46

<210> 47 35 <211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

40 <400> 47

<210> 48

<211> 45

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia disenada basandose en PTD(Dominio de transducci6n de la proteina)

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (6) .. (6)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (15).. (15)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (24) .. (24)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (27).. (27)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (30) .. (30)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (33) .. (33)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (36) .. (36)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (39).. (39)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (45) .. (45)

<223> n representa cualquier base

<400> 48 aarytntgga tgmgntggta ywsnccnacn acnmgnmgnt ayggn 45

<210> 49

<211> 45

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (3) .. (3)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (9) .. (9)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (12).. (12)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (15).. (15)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (18).. (18)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (21).. (21)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (24).. (24)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (33) .. (33)

<223> n representa cualquier base

<220>

<221> caracteristica miscelanea

<222> (42).. (42)

<223> n representa cualquier base

<400> 49 ggntaymgnm gnacnacncc nwsntaytgg mgnatgtggy tnaar 45

<210> 50

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 50

<210> 51

<211> 10

<212> PRT 50 <213> Secuencia artificial <220>

<400> 51

5: <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> cebador

<400> 52 gccatggtga gcaagggcga ggagctgttc: 30

15: <210> 53 <211> 70 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 53

<210> 54

<211> 69

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> cebador

<400> 54

<210> 55 30 <211> 88

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

35 <400> 55

<210> 56

<211> 72

<212> DNA 40 <213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador

<400> 56

5 <210> 57

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 57

15: <210> 58 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

20: <400> 58 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtag ttggcgagta ccatcgcatc cacaacttg 59

<210> 59 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

25: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 59 gatccaagtt gtggatgcga tggtactcgc caactactcg tcgatacgga ggtggcggc: 59

30: <210> 60 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

35: <400> 60 gatccaggtt gtggatgcga tggtactcgo caactactcg tcgatacgga ggtggcggc 59

40: <210> 61 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 61 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtag ttggcgagta ccatcgcatc cacaacctg: 59

45: <210> 62 <211> 59

<212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

5: <400> 62 gatccaagtt gtggatgcga tggtactcgg caactactcg tcgatacgga ggtggcggc 59

10: <210> 63 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 63 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtag ttgccgagta ccatcgcatc cacaacttg: 59

15: <210> 64 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 64 gatccaagtt gtggatgcga tggtactcgc caactactcg tgcatacgga ggtggcggc: 59

25: <210> 65 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

30: <400> 65 tcgagccgcc acctccgtat gcacgagtag ttggcgagta ccatcgcatc cacaacttg 59

<210> 66 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

35: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 66 gatccaagtt gtggatgcga tggtggtcgc caactactcg tcgatacgga ggtggcggc: 59

40: <210> 67 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

45: <400> 67 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtag ttggcgacca ccatcgcatc cacaacttg 59

50: <210> 68 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 68 tcgagccgcc acctccgtat gcacgagtag tggccgacca ccatcgcatc cacaacctg: 59

5: <210> 69 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 69 gatccaggtt gtggatgcga tggtggtcgg ccactactcg tgcatacgga ggtggcggc: 59

15: <210> 70 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

20: <400> 70 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtag ttggcgagta agctcgcata gccaacttg 59

<210> 71 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

25: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 71 gatccaagtt ggctatgcga gcttactcgc caactactcg tcgatacgga ggtggcggc: 59

30: <210> 72 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

35: <400> 72 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtcc aaggcgagta ccatcgcatc cacaacttg 59

40: <210> 73 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 73 gatccaagtt gtggatgcga tggtactcgc cttggactcg tcgatacgga ggtggcggc: 59

45: <210> 74 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

50: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 74 gatccaggtt gtggatgcga tggtactcgc cctggactcg tcgatacgga ggtggcggc: 59

5: <210> 75 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

10: <400> 75 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtcc agggcgagta ccatcgcatc cacaacctg 59

<210> 76 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 76 gatccaggtt gtggatgcga tggtactcgc cctggactcg tcgatgggga ggtggcggc: 59

20: <210> 77 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

25: <400> 77 tcgagccgcc acctccccat cgacgagtcc agggcgagta ccatcgcatc cacaacctg 59

30: <210> 78 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 78 gatccaagtt gtggatgcga tggtactcgg gaactactcg tcgatacgga ggtggcggc: 59

35: <210> 79 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

40: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 79 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtag ttcccgagta ccatcgcatc cacaacttg: 59

45: <210> 80 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

50: <400> 80 gatccaagtt ggctatgcga tggtactcgc caactactcg tcgatacgga ggtggcggc 59

<210> 81 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

5: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 81 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtag ttggcgagta ccatcgcata gccaacttg: 59

10: <210> 82 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

15: <400> 82 gatccaggtt gtggatgcga tggtacgctc caactactcg tcgatacgga ggtggcggc 59

20: <210> 83 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 83 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtag ttggagcgta ccatcgcatc cacaacctg: 59

25: <210> 84 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

30: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 84 gatccaggtt gtggatgcga tggtactcgc cagccactcg tcgatacgga ggtggcggc: 59

35: <210> 85 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

40: <400> 85 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtgg ctggcgagta ccatcgcatc cacaacctg 59

<210> 86 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

45: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 86 gatccaggtt gtggatgcga tggtactcgc caactgctcg tcgatacgga ggtggcggc: 59

50: <210> 87 <211> 59

<212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

5: <400> 87 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagcag ttggcgagta ccatcgcatc cacaacctg 59

10: <210> 88 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 88 gatccaggtt gattatgcga atctactcgc caactactcg tcgatacgga ggtggcggc: 59

15: <210> 89 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 89 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtag ttggcgagta gattcgcata atcaacctg: 59

25: <210> 90 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

30: <400> 90 gatccaggtt gtggatgcga tggtacgctc cagctgctcg tcgatacgga ggtggcggc 59

<210> 91 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

35: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 91 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagcag ctggagcgta ccatcgcatc cacaacctg: 59

40: <210> 92 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

45: <400> 92 gatccaggtt gatcatgcga atctacgctc caactactcg tcgatacgga ggtggcggc 59

50: <210> 93 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 93 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtag ttggagcgta gattcgcatg atcaacctg: 59

5: <210> 94 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 94 gatccaggtt gtatatgcga tattactcgc caactactcg tcgatacgga ggtggcggc: 59

15: <210> 95 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

20: <400> 95 tcgagccgcc acctccgtat cgacgagtag ttggcgagta atatcgcata tacaacctg 59

<210> 96 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

25: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 96 gatccaggtt gtggatgcga tggtactcgc cacggactcg tgcctacgga ggtggcggc: 59

30: <210> 97 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

35: <400> 97 tcgagccgcc acctccgtag gcacgagtcc gtggcgagta ccatcgcatc cacaacctg 59

40: <210> 98 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 98 gatccggata ccgacgcacg accccgtcct actggagaat gtggctcagg ggtggcggc: 59

45: <210> 99 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

50: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 99 tcgagccgcc acccctgagc cacattctcc agtaggacgg ggtcgtgcgt cggtatccg: 59

5: <210> 100 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

10: <400> 100 gatccattcc gtcgcgctgg aaggaccaat tctggaagcg gtggcactac ggtggcggc 59

<210> 101 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 101 tcgagccgcc accgtagtgc caccgcttcc agaattggtc cttccagcgc gacggaatg: 59

20: <210> 102 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

25: <400> 102 gatccaagaa cgcatggaaa cattcgagct gccatcaccg tcatcaaatc ggtggcggc 59

30: <210> 103 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 103 tcgagccgcc accgatttga tgacggtgat ggcagctcga atgtttccat gcgttcttg: 59

35: <210> 104 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

40: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 104 gatccctcat cacgaagcag tacagatacc cgtccagacg acggtttaac ggtggcggc: 59

45: <210> 105 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

50: <400> 105 tcgagccgcc accgttaaac cgtcgtctgg acgggtatct gtactgcttc gtgatgagg 59

<210> 106 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

5: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 106 gatcccagca acatctgctc atcgcaatca acggataccc acgatacaat ggtggcggc: 59

10: <210> 107 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

15: <400> 107 tcgagccgcc accattgtat cgtgggtatc cgttgattgc gatgagcaga tgttgctgg 59

20: <210> 108 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 108 gatccaagcg accaacgatg cgattccgat acacatggaa tcctatgaag ggtggcggc: 59

25: <210> 109 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

30: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 109 tcgagccgcc acccttcata ggattccatg tgtatcggaa tcgcatcgtt ggtcgcttg: 59

35: <210> 110 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

40: <400> 110 gatcctggaa gtgccgtcgc caatgcttcc gtgtactgca tcattggaat ggtggcggc 59

<210> 111 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

45: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 111 tcgagccgcc accattccaa tgatgcagta cacggaagca ttggcgacgg cacttccag: 59

50: <210> 112 <211> 59

<212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

5: <400> 112 gatcctggaa ggcgcgtcgc caatgcttcc gtgtactgca tcattggaat ggtggcggc 59

10: <210> 113 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 113 tcgagccgcc accattccaa tgatgcagta cacggaagca ttggcgacgc gccttccag: 59

15: <210> 114 <211> 59

<212> DNA <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> DNA para reasociaci6n

<400> 114 gatcctggaa gtgccgtcgc caagctttcc gtgtactgca tcattggaat ggtggcggc: 59

25: <210> 115 <211> 59 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> DNA para reasociaci6n

30: <400> 115 tcgagccgcc accattccaa tgatgcagta cacggaaagc ttggcgacgg cacttccag 59

<210> 116 <211> 70 <212> DNA <213> Secuencia artificial

35: <220> <223> cebador

<400> 116

<210> 117 40 <211> 29

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

45 <400> 117 29 gcggatcccg gccgctttac ttgtacagc

<210> 118

<211> 75

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 118

<210> 119 <211 78

<212> DNA 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 119

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un peptido

(I)

que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada mas abajo: B-X-Z-X-Arg-Z-Tyr-J-X-01-X-Arg-02-X-X o X-X-01-Arg-X-02-X-J-Tyr-Z-Arg-X-Z-X-B, en el que (i) B es arginina o lisina, (ii) al menos uno de 01 u 02es arginina, (iii) Z es un aminoacido hidr6fobo, (iv) J

es serina o alanina, y (v) X es un aminoacido elegido aleatoriamente; o

(II)

que tiene uno o varios aminoacidos elegidos aleatoriamente en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal de la secuencia de aminoacidos definida en (I), a condici6n de que sea capaz de transportar proteinas dentro de las celulas y/o dentro de los nucleos.
2.

Un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por cualquiera de las SEQ ID N0S:1 a 47 en el listado de secuencias en el que uno o dos aminoacidos han sido sustituidos, delecionados, anadidos o insertados, y su peptido de cadena invertida, cuyo peptido tiene la capacidad de desplazarse en las celulas.
3.

Un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por cualquiera de las SEQ ID N0S:1 a 47 en el listado de secuencia, y su peptido de cadena invertida.
4.

Un ADN que consiste en la secuencia de ADN que codifica el peptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5.

Un vector recombinante que contiene el ADN de la reivindicaci6n 4.
6.

Un transformante que comprende del vector recombinante de la reivindicaci6n 5.
7.

Una sustancia unida al peptido que incluye el peptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y, unida a este, una sustancia biol6gicamente activa.
8.

La sustancia unida al peptido de la reivindicaci6n 7, en el que la sustancia biol6gicamente activa es una proteina que tiene actividad biol6gica, un polipeptido que tiene actividad biol6gica, un farmaco encapsulado por un liposoma, un liposoma que encapsula a un farmaco polietilenglicolado, un compuesto de bajo peso molecular, un acido nucleico, una perla magnetica, una nanoparticula o un fago.
9.

La sustancia unida al peptido de la reivindicaci6n 7, en el que la proteina que tiene actividad biol6gica es una proteina de aproximadamente 10 KDa a aproximadamente 120 KDa o un polipeptido que tiene de 4 a 30 aminoacidos.
10.

La sustancia unida al peptido de la reivindicaci6n 7, en el que la proteina que tiene actividad biol6gica es el factor de transcripci6n MI (MITF).
11.

La sustancia unida al peptido de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que es transportada dentro de las celulas y/o dentro de los nucleos.
12.

La sustancia unida al peptido de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que es transportada dentro de las celulas.
13.

Un producto farmaceutico que contiene la sustancia unida al peptido de la reivindicaci6n 7.
14.

El producto farmaceutico de la reivindicaci6n 13, que se usa como farmaco antialergico.

�Positivo�

Celulas HeLa Celulas CHO

ooaminoacido hid6fobo0 bien 01 o bien 02 es R

Tipo C

Tipo D

60

Oligodirecto Oligoinverso

Hibridacion

Oligo �ibridado

Ligamiento

Celulas CH0 Celulas HeLa Celulas Jurkat