KR102386478B1 - 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, [일반식 °로 표시되는 아미노산으로 이루어진 세포 투과성 펩타이드, 상기 세포 투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 세포 투과성 펩타이드 및 생물학적 활성 물질을 포함하는 복합체, 상기 복합체를 포함하는 물질 전달용 조성물을 제공한다.

Description

신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도{Novel cell penetrating peptides and use thereof}
세포 투과능이 우수한 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
일반적으로 친수성이거나 분자량이 크고 거대한 물질들은 세포막이라는 장벽에 의해 세포 안으로 들어갈 수 없다. 세포막은 펩타이드나 단백질, 핵산과 같은 거대 분자가 세포 내로 들어오지 못하게 막고, 세포막 수용체에 의한 엔도사이토시스(endocytosis)라는 생리적 기작을 통해 세포 내로 들어오더라도 세포의 용해소체 분획(lysosomal compartment)과 융합되어 결국 분해되므로, 상기 거대 분자들을 이용한 질병의 치료 및 예방에 있어서 많은 제약이 따른다. 또한, 항암제의 경우 세포 내로 약물을 전달하기 위해서는 다약제 저항성(multidrug resistance)과 같은 장애물을 극복해야만 한다. 이에 약물 분해를 막기 위해 다양한 거대 분자 및 약물이 함유된 전달체를 엔도사이토시스 과정을 통하지 않고, 직접 세포 내로 전달하는 많은 방법이 제시되었다. 이러한 방법들에는 마이크로 주입(microinjection), 전기천공법(electroporation) 등이 있는데, 이는 세포막에 손상을 줄 가능성이 있다. 또 다른 방법들로 세포투과성 물질을 이용하는 방법 등이 있다. 하지만 이러한 방법을 통하여 세포 내로 약물들을 전달하였다 하더라도 약효를 발휘하기 위해서는 특정한 기관으로 이동되어야 하는 문제가 있다.
따라서 상기와 같은 한계점들을 극복하고 안정성 및 물질 전달 효율을 높일 수 있는 다양한 약물전달체들이 많이 연구 개발되어 왔으며, 대표적으로 리포좀(liposome)과 마이셀(micelle)이 있다. 리포좀은 인공적으로 만든 인지질 전달체로 친유성 및 친수성 약물 모두 봉입할 수 있으며, 생체적합성 물질이므로 독성이 없고 약물을 외부환경으로부터 보호한다. 하지만 흡수가 지연되고 분포의 제한을 받으며 대사율이 낮아지며, 간이나 비장의 세포에 포획되어 혈액으로부터 신속하게 제거되는 단점이 있다. 마이셀은 약물의 용해도 및 생체이용률을 높여줄 수 있는 특징이 있으나, 물질의 세포 내로의 이동에 관한 효과와 기초 의학적 및 임상적 적용가능성에 대해서는 아직도 많은 연구가 필요하다. 이러한 한계점 때문에, 생체물질을 생체 내로 효과적으로 전달할 수 있고 세포독성이 없으며, 특히 엔도사이토시스를 통하여 들어가지 않는 새로운 제제들이 필요하다.
이러한 측면에서, 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide)가 새로운 대안으로써 주목받아왔다. 세포 투과성 펩타이드는 일종의 신호 펩타이드(signal peptide)로서 단백질, DNA, RNA 등과 같은 고분자 물질을 세포 내로 전달하고자 하는 목적으로 사용되는 일종의 특정 아미노산 서열이 조합된 펩타이드이다. 예컨대, HIV 바이러스에서 유래된 TAT 단백질에 존재하는 11개 아미노산 서열이 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)(120 kDa) 단백질의 세포 내 및 조직 내 전달이 가능하다는 것을 보여준 1990년대 이후부터 본격적으로 관련 연구가 진행되었다. 초파리의 단백질에서 유래한 안테나페디아(Antennapedia(Penetratin)), HSV-1 바이러스로부터 유래된 VP22, 시미안 바이러스 40 거대 항원 T(Simian Virus 40 large antigen T)로부터 유래한 Pep-1이 대표적인 1세대 세포투과성 펩타이드로 여겨지며 TAT과 함께 많이 사용되어져 왔다. 또한, 폴리 아르기닌(poly Arginine), 폴리 라이신(poly Lysine)과 같이 단순히 아르기닌 및 라이신과 같은 양이온성 아미노산이 반복적으로 여러 개 연결된 펩타이드도 세포 투과능이 뛰어난 것으로 보고되었으며(한국 공개특허 제10-2020-0104524호), 다양한 물질 전달에 응용되고 있다. 그러나 대부분 이러한 세포투과성 펩타이드는 면역원성, 독성의 가능성을 내포하고 있고, 인간세포에 전달되는 효능이 떨어지는 것으로 여겨진다. 따라서 독성이 유발하지 않고 생체 내에서의 안전성을 가지며 효과적으로 물질을 전달할 수 있는 세포 투과성 펩타이드의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 상기와 같은 우수한 효과를 갖는 신규한 세포 투과성 펩타이드를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 기존의 참조 펩타이드를 기준으로 아미노산 서열을 다양하게 변형시킨 세포 투과성 펩타이드를 설계 및 합성하고, 이의 우수한 세포 투과성을 확인하였는 바, 이로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 일 양상은 신규한 세포 투과성 펩타이드를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 세포 투과성 펩타이드 및 생물학적 활성 물질을 포함하는 복합체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 복합체를 포함하는 물질 전달용 조성물, 및 상기 조성물을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 물질 전달방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 세포 투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
일 양상은 하기 [일반식 Ⅰ]로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 세포 투과성 펩타이드를 제공한다.
[일반식 Ⅰ]
Xa-H-Xb-[E-X1-L]-Xc-Xd-[DE-X2-SV]-Xe-Xf-G
상기 일반식 Ⅰ에서,
Xa는 Gly(G), Ala(A), 또는 Ser(S)이고;
Xb는 His(H) 또는 Ala(A)이며;
Xc는 Lys(K) 또는 Arg(R)이고;
Xd는 Ser(S), Gln(Q), Leu(L), 또는 Ala(A)이며;
Xe는 Thr(T), Lys(K), 또는 Arg(R)이고;
Xf는 Ser(S), 또는 Gln(Q)이며;
X1은 Arg(R), 또는 Ala(A) 이고; 및
X2는 Trp(W) 또는 Ile(I)일 수 있다.
일 양상은 기초연구 분야, 다양한 질병의 진단 및 치료 분야 등에서 유용하게 활용될 수 있는 세포 투과성 펩타이드에 관한 것으로서, 한정되지 않은 수의 디자인으로 확장 가능한 16개의 아미노산으로 구성된 기본 플랫폼 펩타이드 구조에 관한 것이다.
본 명세서에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 펩타이드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 상기 펩타이드는 D-아미노산을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 한편, 본 발명의 상기 펩타이드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩타이드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다. 한편, 본 명세서 내에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 약어로 기재하였다.
본 명세서에서 용어, "세포 투과성"이란, 펩타이드가 세포(막)를 투과하여 세포 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "펩타이드(peptide)"란 아미노산의 중합체로서, 보통 소수의 아미노산이 연결된 형태를 펩타이드라 하며, 많은 아미노산이 연결되면 단백질이라 부른다. 이러한 펩타이드 및 단백질 구조에서 아미노산 간의 연결은 아마이드(amide) 결합 또는 펩타이드 결합으로 이루어져 있다. 펩타이드 결합이란 카르복실기(-COOH)와 아미노기(-NH2) 사이에 물(H2O)이 빠져나가고 -CO-NH- 형태를 이루는 결합이다.
따라서, 본 명세서에서 "세포 투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptide, CPP)"는 인비트로(in vitro) 및/또는 인비보(in vivo)에서 이동 대상(cargo)을 세포 내로 이동시킬 수 있는 펩타이드를 의미한다. 본 명세서에서, "이동 대상(cargo)"은 세포 투과성 펩타이드와 결합하여 세포 내로 이동할 수 있는 물질을 모두 포함하며, 예를 들어 세포 투과 효율을 높이길 원하는 모든 물질로 예를 들면 일반적인 경로를 통해서는 세포 내로 이동이 용이하지 않은 생물학적 활성 물질을 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 [일반식 Ⅰ]의 신규 펩타이드는 대표적으로 서열번호 1 내지 서열번호 54로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 서열번호 1 내지 54로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다.
본 명세서 내에서 상기 펩타이드의 아미노산은 변화시킬 수 있는데, 상기와 같은 변화는 펩타이드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 것을 말한다. 예를 들어, 펩타이드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.
상기 [일반식 Ⅰ]로 나타내어지는 세포 투과성 펩타이드의 N-말단 및 C-말단에는 상기 세포 투과성 펩타이드로서의 효과를 증대시킬 수 있는 다양한 아미노산을 추가로 부가하거나 결실시킬 수도 있다.
또한 상기 펩타이드는 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group), 부톡시카르보닐기(butoxycarbonyl group), 아릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있고; 및/또는 상기 펩타이드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH2), 삼차 알킬기(tertiary alkyl group) 및 아자이드(azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 선택적으로, 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "안정성"은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 상기 펩타이드를 보호하는 인비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드가 투과 가능한 세포의 종류로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 뇌혈관장벽 내피세포(brain endothelial cell), 암세포, 혈액세포(blood cell), 림프구(lymphocyte), 면역세포, 줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 신경줄기세포(neural stem cell; NSC), T 세포, B 세포, 자연살해세포(natural killer cell; NK cell), 대식세포(macrophage), 신경세포(neuron), 신경아교세포(glial cells), 미세아교세포(microglia), 성상세포(astrocyte) 및 근육세포(muscle cell)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 각 펩타이드의 순도가 90% 이상이 되도록 제작할 수 있으며, 예컨대 직접 합성하거나 펩타이드 제조회사에 제조를 의뢰한 후 구입하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 D-form이나 L-form, 서열 중 일부만 D-form이나 L-form으로 구성된 펩타이드, 또는 이들의 라세미체 형태로 모두 제작하여 사용될 수 있다. 또한, 펩타이드의 안정성을 높이기 위해 그 외의 당업계에 공지된 통상적인 변형이 가능하다. 본 발명에서는 바람직하게 고체상 펩타이드 합성(Solid state peptide synthesis) 방법을 이용하여 펩타이드를 합성하였으나, 전술한 바와 같이 펩타이드 합성 방법 및 조건이 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 세포 투과능이 우수한 세포 투과성 펩타이드를 발굴하였으며, 우수한 세포 투과능을 갖는 펩타이드를 추가적으로 발굴하기 위하여, 상기 발굴된 펩타이드의 서열 및 구조를 기반으로 16개 아미노산을 기준으로 특정 위치의 아미노산을 변형 또는 치환시켜 다양한 펩타이드 후보군을 설계 및 합성하였으며, 이의 세포 투과성을 분석함으로써 본 발명에 따른 우수한 세포 투과능을 갖는 다양한 세포 투과성 펩타이드들을 발굴하였다.
보다 구체적으로, 본 실시예에서는 제2020-0049621호의 16개 아미노산으로 구성된 펩타이드 (참조 펩타이드)를 기초로, 상기 16-mer의 참조 펩타이드에서 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 펩타이드를 기본 골격으로 하여, i) N-말단으로부터 1번째 위치의 아미노산이 필수적으로 치환되고 이외 3번째, 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드로 변형하거나, ii) 상기 기본 골격에서 N-말단으로부터 1번째 위치의 아미노산을 S로 치환하고, 3번째 아미노산을 H로 보존하면서, 동시에 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함한 펩타이드로 변형하거나, iii) 상기 기본 골격에서 N-말단으로부터 3번째 또는 5번째의 아미노산이 A로 치환하고, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드로 변형하거나, iv) 상기 기본 골격에서 N-말단으로부터 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드로 변형하거나, v) 상기 기본 골격에서 N-말단으로부터 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드로 변형하여 세포 투과성 펩타이드 후보군을 설계 및 합성하였다. 이후 상기 후보군들에 대하여 인비트로 세포 투과성 분석을 실시하여 최종적으로 총 54종의 세포 투과성 펩타이드를 발굴하였으며, 결과적으로 N-말단으로부터 N-말단으로부터 2번째 내지 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 위치의 아미노산인 영역이 보존되는 것이 세포 투과성을 유지하는데 중요함을 알 수 있었다.
상기 실시예의 결과로부터, 본 발명에 따른 펩타이드는 우수한 세포 투과성을 가지며, 이를 기반으로 상기 펩타이드와 결합한 임의의 물질을 세포 내로 효과적으로 유입시킬 수 있는 전달체로서 활용 가능함을 알 수 있었다.
다른 양상은 상기 세포 투과성 펩타이드 및 생물학적 활성 물질을 포함하는 복합체를 제공한다.
상기 복합체는 펩타이드와 물질이 단순히 혼합(mixing)된 것, 펩타이드와 물질이 혼합되어 형성된 것, 또는 이들이 화학적 결합에 의해 연결되거나 컨쥬게이션되어 생성된 것을 모두 포함한다. 또한, 복합체는 물리적 결합, 화학적 결합, 공유 결합, 비공유 결합, 자기조립화로 연결되거나, 매개체를 이용하여 통합된 또는 융합된 형태로 연결될 수 있다.
또한, 상기 복합체는 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질이 서로 융합(fusion)된 상태로 발현되어 이룬 복합체가 될 수 있다. 예를 들어, 하나의 벡터 내에 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질을 발현하는 유전자를 삽입한 후, 상기 벡터로 생물을 형질전환시켜 벡터에 삽입된 유전자를 발현하도록 하면, 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질이 융합 단백질(fusion protein)로서 발현될 수 있다. 융합 단백질로 발현될 때, 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질 간에 임의의 링커가 포함되도록 할 수 있다.
또한, 상기 복합체에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 생물학적 활성 물질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위해서, 단일 또는 복수개가 결합된 형태를 모두 포함할 수 있으며, 전달하고자 하는 생물학적 활성물질에 따라 세포 투과성 펩타이드의 결합 개수는 당업자에게 용이하게 선택 또는 조절될 수 있다.
세포 투과성 펩타이드에 결합되어 복합체를 형성할 수 있는 상기 생물학적 활성 물질은 바람직하게는 '생물학적 또는 약제학적 활성을 갖는 물질'을 의미하며, 이는 세포 내(세포질 또는 핵 내)로 투과되어 생리활성조절에 관여하거나 약리효과를 발현할 수 있는 것 또는 운반되어 작용해야 하는 세포 내, 조직 내, 세포간질, 혈액 등 다양한 생체 내 부위에서도 생물학적 활성을 갖는 물질을 의미한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 화합물(chemical compound), 단백질, 당단백질, 펩타이드 항체(antibody), 효소(enzyme), 핵산분해효소(nuclease), 호르몬, 사이토카인(cytokine), 전사인자(transcription factor), 독소, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 천연물(natural product), 반합성 물질(semi-synthetic drug), 약물(drug), 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 바이러스, 양자점(quantum dots), 및 형광색소(fluorochrome)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 생물학적 활성 물질은 예를 들면 화합물(chemical compound), 단백질, 당단백질, 펩타이드, 항체(antibody), 효소(enzyme), 핵산분해효소(nuclease), 호르몬, 사이토카인(cytokine), 전사인자(transcription factor), 독소, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 천연물(natural product), 반합성 물질 (semi-synthetic drug), 약물(drug), 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 바이러스, 양자점(quantum dots), 및 형광색소(fluorochrome)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 화합물은 약물로서 기능할 수 있는 화학 물질을 포함하는 광범위한 개념으로, 천연 또는 합성 화학 물질을 포함한다.
상기 핵산분해효소는 예를 들면 CAS9(CRISPR associated protein 9), CAS12, CAS13, CAS14, CASΦ, CAS variants, Cfp1(CxxC-finger protein-1), ZEN(Zinc-finger nucleases) 및 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산은 예를 들면 DNA, RNA, ASO(Antisense oligonucleotide), 마이크로RNA(microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 원형 RNA(circular RNA), 긴 비암호화 RNA(long noncoding RNA; lncRNA), 작은 활성화 RNA(small activating RNA; saRNA), 전령 RNA(messenger RNA; Mrna), 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 추가적으로 decoy DNA, plasmid, shRNA, 안티센스 RNA, 올리고리보뉴클레오티드, 또는 전달 RNA (transfer RNA) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 약물(drug)은 화합물 약물(chemical drug), 바이오 약물(bio drug), 핵산 약물(nucleic acid drug), 펩타이드 약물(peptide drug), 단백질 약물(protein drug), 천연물 약물(natural product drug), 호르몬(hormone), 조영제(contrast agent) 및 항체(antibody)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "조영제"라 함은 의학적 영상 촬영(imaging)에서 생체 내 구조 또는 유체의 조영을 위해 사용되는 모든 물질을 포함하는 광범위한 개념이다. 적합한 조영제는 방사선비투과 조영제(radiopaque contrast agent), 상자성 조영제(paramagnetic contrast agent), 초상자성 조영제(superparamagnetic contrast agent), CT (computed tomography) 조영제 및 기타 조영제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예를 들면, 방사선비투과 조영제(X-레이 영상용)는 무기 요오드 화합물 및 유기 요오드 화합물(예를 들면, 디아트리조아트), 방사선비투과 금속 및 그의 염(예를 들면, 은, 금, 백금 등) 및 기타 방사선비투과 화합물(예를 들면, 칼슘염, 황산바륨과 같은 바륨염, 탄탈룸 및 산화 탄탈룸)을 포함할 것이다. 적합한 상자성 조영제(MR 영상용)는 가돌리늄 디에틸렌 트리아민펜타아세트산(gadolinium diethylene triaminepentaacetic acid, Gd-DTPA) 및 그의 유도체, 및 기타 가돌리늄, 망간, 철, 디스프로시움(dysprosium), 구리, 유로피움(europium), 에르비움(erbium), 크롬, 니켈 및 코발트 복합체, 예를 들면, 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산(DOTA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,-N',N"-트리아세트산(D03A), 1,4,7-트리아자시클로노난-N,N',N"-트리아세트산(NOTA), 1,4,8,10-테트라아자시클로테트라데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (TETA), 히드록시벤질에틸렌-디아민 디아세트산(HBED) 등을 포함한다. 적합한 초상자성 조영제(MR 영상용)는 자철석(magnetite), 초상자성 산화철 (super-paramagnetic iron oxide, SPIO), 초소 초상자성 산화철(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO) 및 단결정성(monocrystailine) 산화철을 포함한다. 다른 적합한 조영제는 요오드화 및 비요오드화(non-iodinated), 이온성 및 비이온성 CT 조영제, 및 스핀-표지(spin-label)와 같은 조영제, 또는 기타 진단 활성제(diagnostically effective agent)이다.
상기 "바이오 약물"은 (오리지널) 생물학적 치료제(biologics) 및 바이오제네릭(biogenerics), 바이오베터(biobetters), 바이오서피어리어(biosuperiors) 등 다양한 바이오 의약품을 의미한다. 상기 바이오 약물은 생물학적 기원으로부터 제조, 분비 또는 반합성된 임의의 약물을 의미하며, 백신, 혈액 제제, 항원, 세포 제제, 유전자 치료제, 줄기세포 등을 모두 포함하며 이에 제한되지는 않는다.
상기 나노입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 양상은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 물질 전달용 조성물을 제공한다.
상기 물질 전달용 조성물은 생물학적 활성 물질을 생체 조직 또는 혈중으로 전달시키거나 세포 투과를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 조성물은 생체 조직을 구성하는 세포 또는 세포 간 연접을 통하여 전달될 수 있으나 전달 방식에는 제한이 없다.
상기 생체 조직은 하나 이상의 상피조직, 근육조직, 신경조직, 결합조직을 의미하며 각 장기는 하나 이상의 조직으로 이루어질 수 있으므로, 점막, 피부, 뇌, 폐, 간, 신장, 비장, 폐장, 심장, 위장, 대장, 소화관, 방광, 요관, 요도, 난소, 정소, 생식기, 근육, 혈액, 혈관, 림프관, 림프절, 흉선, 췌장, 부신, 갑상선, 부갑상선, 후두, 편도, 기관지, 폐포의 다양한 생체 장기가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 복합체를 특정 세포, 조직 또는 장기로 전달하고자 하는 경우, 상기 생물학적 활성을 갖는 물질은 특정 세포, 조직 또는 장기에서 특이적으로 발현하는 수용체와 선택적으로 결합할 수 있는 리간드의 세포외 부분 단백질, 또는 이들 수용체 또는 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체(mAb) 및 변형된 형태와 결합하여 복합체를 형성할 수 있다. 상기 펩타이드와 생물학적 활성을 갖는 물질의 결합은 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩타이드와 생물학적 활성을 갖는 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다.
상기 복합체를 포함하는 조성물이 약제학적 조성물로 이용되는 경우, 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 약 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 정맥내(intravenous), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 척수강내(intrathecal), 뇌실질내(intracerebroventricular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내로 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 상기 물질 전달용 조성물을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 물질 전달 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 물질 전달기능을 가지는 세포 투과성 펩타이드는 매우 작은 펩타이드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다.
다른 양상은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있는데, 상기 DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이라면, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있고, 상기 코딩 서열은, 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 중복성(redundancy)의 결과로서, 동일한 폴리펩타이드를 인코딩한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 또한 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하는 대립(allelic) 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 대립 변이체는, 인코딩(암호화)되는 폴리뉴클레오티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는, 하나 이상의 뉴클레오티드들의 치환, 결실, 또는 부가를 가질 수 있는 폴리염기서열의 교대(alternate) 형태이다. 단일 아미노산이 하나 이상의 뉴클레오티드 코돈에 의해 인코딩될 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 펩타이드를 암호화하는 교대 폴리뉴클레오티드를 제조하도록 용이하게 변형될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다.
일 양상에 따른 신규한 세포 투과성 펩타이드는 우수한 세포 투과능을 가지므로 생물학적 활성을 갖는 물질을 세포, 조직 등 생체 내로 효과적으로 전달할 수 있어 기초연구 분야, 다양한 질병의 진단 및 치료 분야 등에서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 참조 펩타이드의 기본 골격에서 N-말단으로부터 1번째 위치의 아미노산이 필수적으로 치환되고 이외 3번째, 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군(#1 내지 #10)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 참조 펩타이드의 기본 골격에서 N-말단으로부터 1번째 위치의 아미노산을 S로 치환하고, 3번째 아미노산을 H로 보존하면서, 동시에 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함한 펩타이드 후보군(#11 내지 #19)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 참조 펩타이드의 기본 골격에서 N-말단으로부터 3번째 또는 5번째의 아미노산이 A로 치환되고 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군(#20 내지 #30)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 참조 펩타이드의 기본 골격에서 N-말단으로부터 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군(#31 내지 #40)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 참조 펩타이드의 기본 골격에서 N-말단으로부터 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군(#40 내지 #54) 에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 세포 투과성 펩타이드 후보군 설계 및 합성
1-1. 세포 투과성 펩타이드 후보군 설계
본 실시예에서는 한국 특허출원 제2020-0049621호의 펩타이드 (GHHERLKSDEWSVTSG 이하, 참조 펩타이드로 명명함.)를 기본으로 하여, 다양하게 변형된 서열을 갖는 세포 투과성 펩타이드를 설계 및 합성하였다. 상기 참조 펩타이드의 서열 및 구조를 고려하여, 2번째 위치의 아미노산 (H), 4번째 위치의 아미노산 (E), 6번째 위치의 아미노산 (L), 9번째 위치의 아미노산 (D), 10번째 위치의 아미노산 (E), 12번째 위치의 아미노산 (S), 13번째 위치의 아미노산 (V) 및 16번째 위치의 아미노산 (G)은 변형시키지 않은 채, 나머지 위치의 아미노산들을 치환시키는 방식으로, 세포 투과성 펩타이드 후보군을 설계하였다.
1-2. 펩타이드 후보군의 합성 및 분리 정제
본 발명자들은 상기 실시예 1-1에 기재된 각 펩타이드를 합성하기 위하여 고체상 펩타이드 합성(Solid state peptide synthesis, SPPS) 방법을 이용하였다. 상기 방법은 레진의 N-말단에 N-말단이 F-moc로 보호되어 있는 아미노산의 C-말단을 하나씩 결합하는 유기합성법이다. 모든 반응의 용매는 N,N-다이메틸포름아마이드 (N,N-dimethylformamide; DMF)를 이용하였으며, 아미노산 커플링 조건은 2M 농도의 아미노산 용액을 0.5M DIC (N,N-Diisopropylcarbodiimide, DIC) 1 ml, 1 M Ethyl cyanohydroxyiminoacetate (Oxyma) 0.5 ml와 혼합하여 마이크로웨이브 합성기(Microwave synthesizer)에서 반응시켜 진행하였다. 또한 각 아미노산 서열마다 반응시간, 온도 또는 마이크로웨이브의 전압을 달리하여 아미노산을 제조하였다. 다음 아미노산을 합성하기 위해서는 이전 아미노산의 F-moc을 제거해야 하기 때문에 이를 위해 80% DMF와 20% 피페리딘(piperidine) 용액을 사용해 F-moc 보호기를 80℃에서 2분 동안 2회 디프로텍팅(deprotecting) 시켰다. 모든 커플링 과정 및 디프로텍팅 과정 사이에는 DMF와 염화메틸렌(dichloromethane, DCM)을 이용해 교대로 3회씩 세척하는 과정을 수행하였다.
상기 방법을 통해 합성된 펩타이드에 대하여, 추후 세포 투과성 여부를 관찰하고 정량화하기 위해 펩타이드의 N-말단에 카르복실기 (-COOH)를 포함하는 형광물질을 화학적 결합방법으로 연결할 수 있다. 이때 사용할 수 있는 상기 형광물질로는 5-FAM (5-carboxyfluorescein), FITC (Fluorescein-5-isothiocyanate), 시아닌 3 카르복시산(Cyanine 3 carboxylic acid), 시아닌 5 카르복시산(Cyanine5 carboxylic acid), 시아닌 7 카르복시산(Cyanine 7 carboxylic acid) 등이 있으며, 상기 형광물질 중 하나 이상을 사용할 수 있다.
이를 위해, 본 발명자들은 먼저 고체상의 레진에 합성된 펩타이드의 마지막 아미노산을 합성한 뒤 5-FAM : DIC : Oxyma : 레진을 2 : 2.5 : 4 : 1 비율로 잘 혼합시킨 후 상기 레진에서의 반응을 상온에서 2시간 동안 진행하되, 교반기(magnetic stirrer)를 이용하였다. 다음으로, 상기 합성과정 중 레진 색이 노란색에서 진한 노랑 또는 주황빛으로 변하면 DMF와 염화메틸렌을 교대로 3회씩 세척하는 과정을 실시하였다. 이어서 고체상 레진으로부터 펩타이드/5-FAM을 분리하기 위해 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid; TFA) : 트리이소프로필실란(Triisopropylsilane; TIS) : 증류수가 95 : 2.5 : 2.5로 혼합된 클리비지 용액에서 합성이 완료된 레진을 교반기를 이용해 2시간 동안 반응을 진행한 후 석면필터로 레진을 걸러 내었다. 걸러진 용액에서 용액은 질소 기체 하에서 증발시키고 침전물이 생기면 차갑게 보관한 다이에틸 에테르(diethyl ether)로 침전시켰다. 침전된 펩타이드/5-FAM은 진공상태에서 건조시킨 후 증류수로 녹여 동결건조 하였다.
동결건조된 펩타이드는 증류수나 아세토니트릴(Acetonitrile, ACN) 등으로 용해시키고 역상 고성능 액체 크로마토그래피(Reverse phase High-performance liquid chromatography)를 사용하여 분리 및 정제하였다. 이 때 상기 HPLC의 이동상 용매로는 Solvent A(증류수 99.9%, TFA 0.1%)와 Solvent B(증류수 9.9%, 아세토니트릴 90%, TFA 0.1%)를 사용하였다. HPLC 이동상은 Solvent A 90%와 Solvent B 10%로 시작하여 Solvent B를 1%/min gradient로 증가시키며 분리를 진행하였다. 이후 분리된 펩타이드 용액은 동결건조하여 용매를 제거하고 이후 원하는 용매에 녹여 실험을 진행하였다.
실시예 2. 인비트로 세포 투과성 분석
2-1. 실험 방법
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 합성한 펩타이드 후보군들의 세포 투과성을 평가하기 위하여, 인비트로에서 뇌혈관장벽세포에 대한 투과성 분석을 실시하였다.
구체적으로, 인간 뇌혈관장벽세포인 hCMEC/D3 세포를 384웰 플레이트에 분주하고, 세포가 플레이트 면적의 80~90%에 도달할 때까지 상피세포 성장 배지인 EGM(endothelial cell growth medium)에서 37℃, CO2 조건으로 밤새 배양하였다. 이어서 상기 실시예 1-2에서 제조한 FAM이 연결된 후보군 펩타이드들 및 음성대조군인 FAM 단독을 10uM로 성장인자가 없는 상기 배지에 희석하여 각 웰당 10μL씩 처리할 양을 제조하였다. 이어서 40μL의 세포가 배양되어 있는 플레이트에 상기 펩타이드를 희석하여 미리 제조한 용액을 웰당 10μL씩 처리한 후 2시간 동안 37℃ CO2 조건으로 배양하였다. 다음으로, 각 웰에서 펩타이드를 처리한 용액을 모두자동 플레이트 세척기로 제거하고, 1x PBS로 3회씩 세척하는 과정을 거친 후, 4% paraformaldehyde를 웰당 75μL씩 처리 후, 15분 동안 상온에서 세포를 고정하였다. 15분 뒤, 1x PBS로 3회 세척하는 과정을 반복한 후, Hoechst 33342를 1x PBS에 1:5000으로 희석하여 각 웰에 40μL씩 첨가하고, 15분 동안 상온에서 처리한 후 3회 씻어내었다. 다음으로 Cytation 5 장비로 DAPI를 기준으로 하여 초점을 맞춘 후 DAPI를 중심으로 20μm 크기로 세포의 구획을 정하고 이 크기의 세포만을 선택하여 FAM 형광을 이미지 리딩(image reading)한 후, 영상 처리하여 Mean-FAM value를 구하고 FAM 실험군을 음성대조군으로 보정한 그래프를 만들어 뇌혈관장벽세포 투과도를 계산하였다. 통계는 ONE-WAY ANOVA 분석으로 진행했고 multiple comparison(다중 비교)은 FAM 값을 대조군으로 하여 구하고 Bonferroni 방법(95% 신뢰도)으로 보정하였다(mean±SEM, *p<0.1, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001).
2-2. N-말단으로부터 1번째 위치의 아미노산을 필수적으로 치환하고 이외의 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군의 세포 투과성 분석
상기 실시예 1-1에서 설계한 대로, 참조 펩타이드에서 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 펩타이드를 기본 골격으로 하여, 나머지 위치의 아미노산들을 다양하게 변형시킨 펩타이드 후보를 설계하였다. 다만, 변형된 펩타이드 중 변형이 나타나지 않은 아미노산 서열의 위치는 기본 골격의 서열이 보존되었다. 구체적으로, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 1번 위치의 아미노산을 필수적으로 치환하고, 이외 3번째, 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함한 총 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군을 설계하였으며, 구체적인 서열정보를 하기 표 1에 나타내었다. 표 1에서 진하게 표시된 부분은 아미노산이 치환된 영역을 나타내는 것이다.
번호 명칭 서열 서열번호
1 #1 AHHEALKSDEWSVTSG 1
2 #2 AHHERLRSDEWSVTSG 2
3 #3 AHHERLKADEWSVTSG 3
4 #4 AHHERLKLDEWSVTSG 4
5 #5 AHHERLKQDEWSVTSG 5
6 #6 AHHERLKSDEISVTSG 6
7 #7 AHHERLKSDEWSVKSG 7
8 #8 AHHERLKSDEWSVRSG 8
9 #9 AHHERLKSDEWSVTQG 9
10 #10 SHAERLKSDEWSVTSG 10
상기 펩타이드 후보군에서의 세포투과성을 확인한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 상기 표 1의 #1 내지 #10에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
2-3. N-말단으로부터 1번째 위치의 아미노산이 S로의 치환 및 3번째 위치의 아미노산이 H로 보존되나, 이외의 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군의 세포 투과성 분석
상기 실시예 1-1에서 설계한 대로, 참조 펩타이드에서 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 펩타이드를 기본 골격으로 하여, 나머지 위치의 아미노산들을 다양하게 변형시킨 펩타이드 후보를 설계하였다. 다만, 변형된 펩타이드 중 변형이 나타나지 않은 아미노산 서열의 위치는 기본 골격의 서열이 보존되었다. 구체적으로, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 1번 위치의 아미노산을 S로 치환하고, 이외 3번째 아미노산을 H로 보존하고, 동시에 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함한 총 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군을 설계하였으며, 구체적인 서열정보를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에서 진하게 표시된 부분은 아미노산이 치환된 영역을 나타내는 것이다.
번호 명칭 서열 서열번호
1 #11 SHHEALKSDEWSVTSG 11
2 #12 SHHERLRSDEWSVTSG 12
3 #13 SHHERLKADEWSVTSG 13
4 #14 SHHERLKLDEWSVTSG 14
5 #15 SHHERLKQDEWSVTSG 15
6 #16 SHHERLKSDEISVTSG 16
7 #17 SHHERLKSDEWSVKSG 17
8 #18 SHHERLKSDEWSVRSG 18
9 #19 SHHERLKSDEWSVTQG 19
상기 펩타이드 후보군에서의 세포투과성을 확인한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 상기 표 2의 #11 내지 #19에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
2-4. N-말단으로부터 3번째 또는 5번째의 아미노산이 A로 치환되고 이외의 위치에서의 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군의 세포 투과성 분석
상기 실시예 1-1에서 설계한 대로, 참조 펩타이드에서 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 펩타이드를 기본 골격으로 하여, 나머지 위치의 아미노산들을 다양하게 변형시킨 펩타이드 후보를 설계하였다. 다만, 변형된 펩타이드 중 변형이 나타나지 않은 아미노산 서열의 위치는 기본 골격의 서열이 보존되었다. 구체적으로, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 채, 추가로 1번 위치의 아미노산을 치환없이 G로 보존하고, 이외 3번째 또는 5번째 아미노산을 A로 치환하였다. 동시에 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함한 총 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군을 설계하였으며, 구체적인 서열정보를 하기 표 3에 나타내었다. 표 3에서 진하게 표시된 부분은 아미노산이 치환된 영역을 나타내는 것이다.
번호 명칭 서열 서열번호
1 #20 GHAERLRSDEWSVTSG 20
2 #21 GHAERLKADEWSVTSG 21
3 #22 GHAERLKQDEWSVTSG 22
4 #23 GHAERLKSDEWSVTQG 23
5 #24 GHHEALRSDEWSVTSG 24
6 #25 GHHEALKADEWSVTSG 25
7 #26 GHHEALKLDEWSVTSG 26
8 #27 GHHEALKQDEWSVTSG 27
9 #28 GHHEALKSDEISVTSG 28
10 #29 GHHEALKSDEWSVRSG 29
11 #30 GHHEALKSDEWSVTQG 30
상기 펩타이드 후보군에서의 세포투과성을 확인한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 상기 표 3의 #20 내지 #30에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
2-5. N-말단으로부터 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군의 세포 투과성 분석
상기 실시예 1-1에서 설계한 대로, 참조 펩타이드에서 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 펩타이드를 기본 골격으로 하여, 나머지 위치의 아미노산들을 다양하게 변형시킨 펩타이드 후보를 설계하였다. 다만, 변형된 펩타이드 중 변형이 나타나지 않은 아미노산 서열의 위치는 기본 골격의 서열이 보존되었다. 구체적으로, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 채, 추가로 1번째 위치의 아미노산을 치환없이 G로 보존, 3번째 위치의 아미노산을 치환없이 H로 보존, 5번째 위치의 아미노산을 치환없이 R로 보존하고, 이외 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 2개의 아미노산 치환이 존재하는 펩타이드 후보군을 설계하였으며, 구체적인 서열정보를 하기 표 4에 나타내었다. 표 4에서 진하게 표시된 부분은 아미노산이 치환된 영역을 나타내는 것이다.
번호 명칭 서열 서열번호
1 #31 GHHERLRADEWSVTSG 31
2 #32 GHHERLRLDEWSVTSG 32
3 #33 GHHERLRQDEWSVTSG 33
4 #34 GHHERLRSDEISVTSG 34
5 #35 GHHERLRSDEWSVKSG 35
6 #36 GHHERLRSDEWSVRSG 36
7 #37 GHHERLRSDEWSVTQG 37
8 #38 GHHERLKADEISVTSG 38
9 #39 GHHERLKADEWSVKSG 39
10 #40 GHHERLKADEWSVRSG 40
상기 펩타이드 군에서의 세포투과성을 확인한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 상기 표 4의 #31 내지 #40에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
2-6. N-말단으로부터 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군의 세포 투과성 분석
상기 실시예 1-1에서 설계한 대로, 참조 펩타이드에서 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 펩타이드를 기본 골격으로 하여, 나머지 위치의 아미노산들을 다양하게 변형시킨 펩타이드 후보를 설계하였다. 다만, 변형된 펩타이드 중 변형이 나타나지 않은 아미노산 서열의 위치는 기본 골격의 서열이 보존되었다. 구체적으로, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 채, 추가로 1번째 위치의 아미노산을 치환없이 G로 보존, 3번째 위치의 아미노산을 치환없이 H로 보존, 5번째 위치의 아미노산을 치환없이 R로 보존, 7번째 위치의 아미노산을 치환없이 K로 보존하고, 이외 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 2개의 아미노산 치환이 존재하는 펩타이드 후보군을 설계하였으며, 구체적인 서열정보를 하기 표 5 나타내었다. 표 5에서 진하게 표시된 부분은 아미노산이 치환된 영역을 나타내는 것이다.
번호 명칭 서열 서열번호
1 #41 GHHERLKADEWSVTQG 41
2 #42 GHHERLKLDEISVTSG 42
3 #43 GHHERLKLDEWSVKSG 43
4 #44 GHHERLKLDEWSVRSG 44
5 #45 GHHERLKLDEWSVTQG 45
6 #46 GHHERLKQDEISVTSG 46
7 #47 GHHERLKQDEWSVKSG 47
8 #48 GHHERLKQDEWSVRSG 48
9 #49 GHHERLKQDEWSVTQG 49
10 #50 GHHERLKSDEISVKSG 50
11 #51 GHHERLKSDEISVRSG 51
12 #52 GHHERLKSDEISVTQG 52
13 #53 GHHERLKSDEWSVKQG 53
14 #54 GHHERLKSDEWSVRQG 54
상기 펩타이드 후보군에서의 세포투과성을 확인한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 상기 표 5의 #41 내지 #54에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 일 실시예에 따른 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로, N-말단으로부터 2번째 내지 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 위치의 아미노산인 영역의 보존과 함께 다른 위치에서의 아미노산이 치환된 경우에도, 우수한 세포 투과성을 나타내는 펩타이드의 고유한 구조가 유지됨을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
SEQUENCE LISTING <110> IMNEWRUN BIOSCIENCES, INC. <120> Novel cell penetrating peptides and use thereof <130> PN139684 <160> 54 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 Ala His His Glu Ala Leu Lys Ser Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 Ala His His Glu Arg Leu Arg Ser Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 Ala His His Glu Arg Leu Lys Ala Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 Ala His His Glu Arg Leu Lys Leu Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 Ala His His Glu Arg Leu Lys Gln Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 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Arg Leu Arg Ser Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 13 Ser His His Glu Arg Leu Lys Ala Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 14 Ser His His Glu Arg Leu Lys Leu Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 15 Ser His His Glu Arg Leu Lys Gln Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 16 Ser His His Glu Arg Leu Lys Ser Asp Glu Ile Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 17 Ser His His Glu Arg Leu Lys Ser Asp Glu Trp Ser Val Lys Ser Gly 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 18 Ser His His Glu Arg Leu Lys Ser Asp Glu Trp Ser Val Arg 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Artificial Sequence <400> 31 Gly His His Glu Arg Leu Arg Ala Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 32 Gly His His Glu Arg Leu Arg Leu Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 33 Gly His His Glu Arg Leu Arg Gln Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 34 Gly His His Glu Arg Leu Arg Ser Asp Glu Ile Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 35 Gly His His Glu Arg Leu Arg Ser Asp Glu Trp Ser Val Lys Ser Gly 1 5 10 15 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 36 Gly His His Glu Arg Leu Arg Ser Asp Glu Trp Ser Val Arg Ser Gly 1 5 10 15 <210> 37 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 37 Gly His His Glu Arg Leu Arg Ser Asp Glu Trp Ser Val Thr Gln Gly 1 5 10 15 <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 38 Gly His His Glu Arg Leu Lys Ala Asp Glu Ile Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 39 Gly His His Glu Arg Leu Lys Ala Asp Glu Trp Ser Val Lys Ser Gly 1 5 10 15 <210> 40 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 40 Gly His His Glu Arg Leu Lys Ala Asp Glu Trp Ser Val Arg Ser Gly 1 5 10 15 <210> 41 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 41 Gly His His Glu Arg Leu Lys Ala Asp Glu Trp Ser Val Thr Gln Gly 1 5 10 15 <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 42 Gly His His Glu Arg Leu Lys Leu Asp Glu Ile Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 43 Gly His His Glu Arg Leu Lys Leu Asp Glu Trp Ser Val Lys Ser Gly 1 5 10 15 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 44 Gly His His Glu Arg Leu Lys Leu Asp Glu Trp Ser Val Arg Ser Gly 1 5 10 15 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 45 Gly His His Glu Arg Leu Lys Leu Asp Glu Trp Ser Val Thr Gln Gly 1 5 10 15 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 46 Gly His His Glu Arg Leu Lys Gln Asp Glu Ile Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 47 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 47 Gly His His Glu Arg Leu Lys Gln Asp Glu Trp Ser Val Lys Ser Gly 1 5 10 15 <210> 48 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 48 Gly His His Glu Arg Leu Lys Gln Asp Glu Trp Ser Val Arg Ser Gly 1 5 10 15 <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 49 Gly His His Glu Arg Leu Lys Gln Asp Glu Trp Ser Val Thr Gln Gly 1 5 10 15 <210> 50 <211> 16 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Claims (11)

  1. 하기 일반식 Ⅰ로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 세포 투과성 펩타이드:
    [일반식 Ⅰ]
    Xa-H-Xb-E-X1-L-Xc-Xd-DE-X2-SV-Xe-Xf-G
    상기 일반식 Ⅰ에서,
    Xa는 Gly(G), Ala(A), 또는 Ser(S)이고;
    Xb는 His(H) 또는 Ala(A)이며;
    Xc는 Lys(K) 또는 Arg(R)이고;
    Xd는 Ser(S), Gln(Q), Leu(L), 또는 Ala(A)이며;
    Xe는 Thr(T), Lys(K), 또는 Arg(R)이고;
    Xf는 Ser(S), 또는 Gln(Q)이며;
    X1은 Arg(R), 또는 Ala(A)이고; 및
    X2는 Trp(W) 또는 Ile(I)인 것이며,
    상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 54로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포 투과성 펩타이드.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 뇌혈관장벽 내피세포(brain endothelial cell), 암세포, 혈액세포(blood cell), 림프구(lymphocyte), 면역세포, 줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 신경줄기세포(neural stem cell; NSC), T 세포, B 세포, 자연살해세포(natural killer cell; NK cell), 대식세포(macrophage), 신경세포(neuron), 신경아교세포(glial cells), 미세아교세포(microglia), 성상세포(astrocyte) 및 근육세포(muscle cell)로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드.
  4. 청구항 1 또는 청구항 3의 세포 투과성 펩타이드 및 상기 세포 투과성 펩타이드의 말단에 결합된 생물학적 활성 물질을 포함하는, 복합체.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 생물학적 활성 물질은 화합물(chemical compound), 단백질, 당단백질, 펩타이드, 항체(antibody), 효소(enzyme), 핵산분해효소(nuclease), 호르몬, 사이토카인(cytokine), 전사인자(transcription factor), 독소, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 천연물(natural product), 반합성 물질(semi-synthetic drug), 약물(drug), 리포좀, 바이러스, 양자점(quantum dots), 및 형광색소(fluorochrome)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 복합체.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 핵산분해효소는 CAS9(CRISPR associated protein 9), CAS12, CAS13, CAS14, CASΦ, Cfp1(CxxC-finger protein-1), ZEN(Zinc-finger nucleases) 및 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 복합체.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 핵산은 DNA, RNA, ASO(Antisense oligonucleotide), 마이크로RNA(microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 원형 RNA(circular RNA), 긴 비암호화 RNA(long noncoding RNA; lncRNA), 작은 활성화 RNA(small activating RNA; saRNA), 전령 RNA(messenger RNA; Mrna), 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 복합체.
  8. 청구항 4의 복합체를 포함하는, 물질 전달용 조성물.
  9. 청구항 8의 조성물을 인간을 제외한 포유동물의 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 물질 전달방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 세포는 뇌혈관장벽 내피세포(brain endothelial cell), 암세포, 혈액세포(blood cell), 림프구(lymphocyte), 면역세포, 줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 신경줄기세포(neural stem cell; NSC), T 세포, B 세포, 자연살해세포(natural killer cell; NK cell), 대식세포(macrophage), 신경세포(neuron), 신경아교세포(glial cells), 미세아교세포(microglia), 성상세포(astrocyte) 및 근육세포(muscle cell)로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는, 물질 전달방법.
  11. 청구항 1에 따른 펩타이드를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.


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