WO2023277575A1 - 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023277575A1
WO2023277575A1 PCT/KR2022/009320 KR2022009320W WO2023277575A1 WO 2023277575 A1 WO2023277575 A1 WO 2023277575A1 KR 2022009320 W KR2022009320 W KR 2022009320W WO 2023277575 A1 WO2023277575 A1 WO 2023277575A1
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WO
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peptide
cell
amino acid
cells
amino acids
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PCT/KR2022/009320
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English (en)
French (fr)
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남지영
김한주
이은아
안용일
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주식회사 아임뉴런
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Liposome is an artificially created phospholipid carrier that can encapsulate both lipophilic and hydrophilic drugs, and is non-toxic because it is a biocompatible material and protects the drug from the external environment.
  • absorption is delayed, distribution is limited, metabolic rate is low, and it is quickly removed from the blood by being captured by cells of the liver or spleen.
  • Micelles have characteristics that can increase the solubility and bioavailability of drugs, but much research is still needed on the effect of the movement of substances into cells and their basic medical and clinical applicability. Because of these limitations, there is a need for new agents that can effectively deliver biomaterials into the living body, have no cytotoxicity, and do not enter through endocytosis in particular.
  • the cell-penetrating peptide is a kind of signal peptide, which is a peptide in which a specific amino acid sequence is used for the purpose of delivering high molecular substances such as proteins, DNA, RNA, etc. into cells.
  • signal peptide which is a peptide in which a specific amino acid sequence is used for the purpose of delivering high molecular substances such as proteins, DNA, RNA, etc. into cells.
  • Antennapedia (Penetratin) derived from Drosophila protein, VP22 derived from HSV-1 virus, and Pep-1 derived from Simian Virus 40 large antigen T are typical first-generation cells It is considered a penetrating peptide and has been widely used together with TAT.
  • peptides such as poly Arginine and poly Lysine, in which several cationic amino acids such as arginine and lysine are repeatedly linked, have been reported to have excellent cell permeability (Korean Patent Publication No. 10-2020- 0104524), which is applied to various mass transfers.
  • the inventors of the present invention designed and synthesized cell-permeable peptides whose amino acid sequences were variously modified based on the existing reference peptides, and their excellent cell-permeability As confirmed, this completed the present invention.
  • one aspect is to provide novel cell penetrating peptides.
  • Another aspect is to provide a complex comprising the cell-penetrating peptide and a biologically active substance.
  • Another aspect is to provide a composition for mass delivery comprising the complex, and a mass delivery method comprising bringing the composition into contact with cells.
  • Another aspect is to provide a polynucleotide encoding the cell penetrating peptide.
  • One aspect provides a cell-permeable peptide consisting of an amino acid sequence represented by Formula I below.
  • X a is Gly(G), Ala(A), or Ser(S);
  • X b is His(H) or Ala(A);
  • X c is Lys(K) or Arg(R);
  • X d is Ser(S), Gln(Q), Leu(L), or Ala(A);
  • X e is Thr(T), Lys(K), or Arg(R);
  • X f is Ser(S), or Gln(Q);
  • X 1 is Arg(R), or Ala(A);
  • X 2 can be Trp(W) or Ile(I).
  • One aspect provides a cell-permeable peptide consisting of an amino acid sequence represented by the following general formula II.
  • X a is GH, AH, SH, or absent
  • X b is His(H) or Ala(A);
  • X c is Arg(R) or Ala(A);
  • X d is Lys(K) or Arg(R);
  • X e is Ser(S), Cys(C), Ala(A), Leu(L), or Gln(Q);
  • X f is Trp(W) or Ile(I);
  • X g is Thr(T), Asn(N), Lys(K), or Arg(R);
  • X h is SG, SV, SA, QG, or absent
  • X 1 and X 2 are absent or at least one is present, wherein X 1 is ESKAVKWSAL and X 2 can be G, GL, GLIES, GLIESESAET, or GLIECESAET.
  • One aspect relates to a cell-permeable peptide that can be usefully utilized in the field of basic research, diagnosis and treatment of various diseases, etc., a basic platform peptide structure consisting of 16 amino acids that can be extended to an unlimited number of designs and other not limited It relates to a basic platform peptide structure composed of various amino acids that can be extended to an unlimited number of designs.
  • amino acid herein includes the 22 standard amino acids that are naturally incorporated into peptides, as well as D-isomers and modified amino acids. Accordingly, the peptide may be a peptide containing D-amino acids. Meanwhile, the peptides of the present invention may include post-translational modified non-standard amino acids.
  • post-translational modifications are phosphorylation, glycosylation, acylation (including eg acetylation, myristoylation and palmitoylation), alkylation ), carboxylation, hydroxylation, glycation, biotinylation, ubiquitinylation, changes in chemical properties (e.g., beta-elimination deimidation) , deamidation) and structural changes (eg formation of disulfide bridges).
  • changes in amino acids caused by chemical reactions occurring in the course of bonding with crosslinkers to form a peptide conjugate include changes in amino acids, such as changes in an amino group, a carboxy group, or a side chain.
  • the amino acid sequences used in the present specification are abbreviated according to the IUPAC-IUB nomenclature.
  • cell permeability refers to the ability or property of a peptide to permeate a cell (membrane) and penetrate into the cell.
  • peptide is a polymer of amino acids, and a form in which a small number of amino acids are linked is usually called a peptide, and a form in which many amino acids are linked is called a protein. Connections between amino acids in these peptide and protein structures consist of amide bonds or peptide bonds.
  • a peptide bond is a bond between a carboxyl group (-COOH) and an amino group (-NH 2 ) in which water (H 2 O) escapes to form -CO-NH-.
  • the peptide may be isolated, artificially synthesized, or non-naturally occurring or engineered, and “non-naturally occurring or engineered” refers to a natural state. It means a state created by applying artificial deformation, not a state as it exists in .
  • the artificial modification is to improve cell permeability, and may include substitution, deletion, or addition of an amino acid sequence.
  • cell penetrating peptide refers to a peptide that can move a cargo into a cell in vitro and / or in vivo .
  • carrier includes all substances that can bind to cell-permeable peptides and move into cells, for example, all substances that want to increase cell penetration efficiency, for example, through a general route It may mean a biologically active substance that is not easily moved into cells.
  • the peptide may consist of an amino acid sequence represented by the following general formula III.
  • X aa is AH or absent;
  • X ba is His(H) or Ala(A);
  • X ca is Ala(A), Ser(S), or Cys(C);
  • X da is Thr(T) or Arg(R);
  • X ea is SG, QG, or absent; and
  • X 1a and X 2a are absent or at least one is present, wherein X 1a is ESKAVKWSAL and X 2a can be G, GL, GLIES, GLIESESAET, or GLIECESAET.
  • the peptide may consist of an amino acid sequence represented by Formula IV below.
  • X ab is His(H) or Ala(A);
  • X bb is Arg(R) or Ala(A);
  • X cb is KS, KA, KQ, KL, KC, RS, or RC;
  • X db is Trp(W) or He(I);
  • X eb is Thr(T), Lys(K), or Arg(R);
  • X fb is SG, QG, or absent; and
  • X 1b and X 2b are absent or at least one is present, where X 1b is ESKAVKWSAL and X 2b can be G, GL, GLIES, GLIESESAET, or GLIECESAET.
  • the peptide may consist of an amino acid sequence represented by the following general formula V.
  • X ac is Ser(S) or Cys(C);
  • X bc is Asn(N) or Thr(T);
  • X cc is SG, SV, SA or absent; and
  • X 1c and X 2c are absent or at least one is present, wherein X 1c is ESKAVKWSAL and X 2c can be G, GL, GLIES, GLIESESAET, or GLIECESAET.
  • the novel peptides of Formulas I to V may be representatively any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 216, but is not limited thereto.
  • the cell-penetrating peptide is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 91%, 92%, or 93% of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 216, respectively.
  • %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% may include an amino acid sequence having a sequence homology of 99% or more.
  • novel peptide of Formula I may be any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 54, and the novel peptide of Formula II to V is representative of SEQ ID NO: 55 to SEQ ID NO: 55 to V It may be any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 216.
  • the amino acid of the peptide may be changed, and such a change refers to changing the physicochemical properties of the peptide.
  • Amino acid changes can be made, for example, to improve the thermostability of the peptide, to alter the substrate specificity, to change the pH optimum, and the like.
  • Various amino acids capable of enhancing the effect as the cell penetrating peptide may be added or deleted to the N-terminus and C-terminus of the cell penetrating peptide represented by Formulas I to V.
  • the peptide can be synthesized by N- or C of the peptide to obtain chemical stability, enhanced pharmacological properties (half-life, uptake, potency, potency, etc.), altered specificity (eg, broad biological activity spectrum), and reduced antigenicity.
  • -A protecting group may be selectively bonded to the terminal.
  • the N-terminus of the peptide is an acetyl group, a fluorenylmethoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group group), a stearyl group, a butoxycarbonyl group, an aryloxycarbonyl group, and polyethylene glycol (PEG).
  • the C-terminus of the peptide is bound to any one protecting group selected from the group consisting of an amino group (amino group, -NH 2 ), a tertiary alkyl group, and an azide (-NHNH 2 )
  • the peptide may optionally further include a targeting sequence, a tag, a labeled residue, an amino acid sequence prepared for a specific purpose to increase half-life or stability of the peptide.
  • the term “stability” may refer to storage stability (eg, storage stability at room temperature) as well as in vivo stability that protects the peptide from attack by proteolytic enzymes in vivo.
  • the cell penetrating peptide is permeable to the type of cell, but is not limited thereto, for example, brain endothelial cells, cancer cells, blood cells, lymphocytes ), immune cells, stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSC), neural stem cells (NSC), T cells, B cells, natural killer cells (NK cells), It may be any one selected from the group consisting of macrophages, neurons, glial cells, microglia, astrocytes, and muscle cells.
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • NSC neural stem cells
  • B cells natural killer cells
  • NK cells natural killer cells
  • the peptides of the present invention can be produced so that the purity of each peptide is 90% or more through conventional peptide synthesis methods or production methods known to those skilled in the art, and can be directly synthesized or purchased after requesting production from a peptide manufacturer. .
  • the peptides are prepared in the form of D-form or L-form, peptides consisting only of D-form or L-form, or racemic forms thereof through conventional peptide synthesis methods or preparation methods known to those skilled in the art. can In addition, other conventional modifications known in the art are possible to increase the stability of the peptide.
  • the peptide was preferably synthesized using a solid state peptide synthesis method, but as described above, the method and conditions for synthesizing the peptide are not limited thereto.
  • the present inventors discovered cell-permeable peptides with excellent cell-penetrating ability, and in order to additionally discover peptides with excellent cell-penetrating ability, based on the sequence and structure of the discovered peptides, modified amino acids at specific positions based on 16 amino acids Alternatively, various peptide candidates were designed and synthesized by modifying their length, and by analyzing their cell permeability, various cell penetrating peptides having excellent cell penetrating ability according to the present invention were discovered.
  • the 2nd, 4th, 6th, 9th in the 16-mer reference peptide Using a peptide with the 10th, 12th, 13th, and 16th amino acids conserved as a basic skeleton, i) the amino acid at the 1st position from the N-terminus is essentially substituted, and the 3rd, 5th, 7th, 8th, 11th, 14th, and 15th positions, modified into a peptide containing one amino acid substitution, or ii) substituting the amino acid at the 1st position from the N-terminus in the basic framework with S, and the 3rd amino acid while conserved as H, simultaneously modifying to a peptide containing one amino acid substitution at the 5th, 7th, 8th, 11th, 14th and 15th positions, or iii) 3rd or 5th from the N-terminus in the
  • Cell-permeable peptide candidates were designed and synthesized by modifying the peptides with amino acid substitutions. Thereafter, in vitro cell permeability analysis was performed on the candidate groups, and a total of 54 cell-penetrating peptides were finally discovered, and as a result, the 2nd to 6th, 9th, 10th, and 12th It was found that it is important to maintain cell permeability that the region of the th, 13th and 16th amino acids is conserved.
  • the 4th, 6th, 9th, 10th, 12th in the reference peptide A first peptide candidate group in which amino acids at the 1st and 2nd positions from the N-terminus are AH or absent based on the amino acid position of the reference peptide, ii) a second peptide candidate group in which the first and second amino acids from the N-terminus are GH based on the amino acid position of the reference peptide, or iii) the first and second peptide candidates from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide It was classified as a third peptide candidate group in which the amino acid at the position is SH.
  • the first peptide candidate group based on the amino acid position of the reference peptide, 1 there is no additional amino acid substitution, or 2 at least one amino acid substitution at the 3rd, 8th, 14th, and 15th positions
  • peptide candidates whose lengths were modified were designed.
  • the 3rd, 8th, 14th, and 15th positions from the unsubstituted or N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide It was found that even when the length of the peptide was modified along with amino acid substitution in , the unique structure of the peptide exhibiting excellent cell permeability was maintained.
  • the second peptide candidate group based on the amino acid position of the reference peptide, 1 3 to 6 (first region, amino acid substitution at the 3rd or 5th position), 2 7th to 10th (second region, amino acid substitution at position 7 and/or position 8), or 3 position 11 to position 16 (region 3, amino acid substitution at position 11, 14, or 15)
  • first region amino acid substitution at the 3rd or 5th position
  • second region amino acid substitution at position 7 and/or position 8
  • 3 position 11 to position 16 region 3, amino acid substitution at position 11, 14, or 15
  • the 3rd, 5th, 7th, 8th, 11th, 14th from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide It was found that even when the length of the peptide was modified with amino acid substitutions at positions 1 and 15, the unique structure of the peptide exhibiting excellent cell permeability was maintained.
  • the third peptide candidate group based on the amino acid position of the reference peptide, 1 there is no additional amino acid substitution, 2 one amino acid substitution is included at the 8th or 14th position, 3 8th, 14th, and 16th position
  • peptide candidates whose lengths were modified were designed.
  • the third peptide candidate group in the third peptide candidate group according to one embodiment, unsubstituted based on the amino acid position of the reference peptide, or at the 8th, 14th, and 16th positions from the N-terminus It was found that even when the length of the peptide was modified along with amino acid substitution of , the unique structure of the peptide exhibiting excellent cell permeability was maintained.
  • Another aspect provides a complex comprising the cell-penetrating peptide and a biologically active substance.
  • the complex includes both those formed by simply mixing a peptide and a substance, those formed by mixing a peptide and a substance, and those formed by linking or conjugating these by a bond.
  • the term "complex" may be used interchangeably with conjugate or conjugate.
  • the complex may be a complex formed by expressing the peptide and the biologically active material in a fused state.
  • a gene expressing the peptide and a biologically active substance is inserted into one vector, and then an organism is transformed with the vector to express the gene inserted into the vector, the peptide and the biologically active substance form a fusion protein (fusion protein).
  • fusion protein When expressed as a fusion protein, an optional linker may be incorporated between the peptide and the biologically active substance.
  • the biologically active material is a protein
  • specific examples of binding to the complex that is, the fusion protein, are as follows: When preparing a primer to produce the fusion protein, the biologically active material is expressed.
  • a nucleotide encoding a carrier cell penetrating peptide is added in front of the nucleotide, and then the obtained nucleotide is inserted into a vector (eg, pET vector) using a restriction enzyme, transformed into an appropriate host cell, and expressed.
  • a vector eg, pET vector
  • the fusion protein can be effectively expressed by treating with an expression inducer such as IPTG (isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside).
  • IPTG isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside
  • the expressed fusion protein may be purified by a method such as His tag purification, dialyzed using PBS, and then concentrated by centrifugation.
  • the cell-permeable peptide may include a single or a plurality of combined forms in order to efficiently deliver the biologically active substance into the cell, and the cell-permeable peptide may be combined according to the biologically active substance to be delivered
  • the number can be easily selected or adjusted by a person skilled in the art.
  • the biologically active substance capable of forming a complex by being bound to a cell-penetrating peptide preferably means a 'substance having biological or pharmaceutical activity', which is penetrated into cells (cytoplasm or nucleus) to regulate physiological activity. It refers to substances that can be involved or express pharmacological effects, or substances that have biological activity in various parts of the body, such as cells, tissues, interstitial cells, and blood, which are transported and acted upon.
  • the compound is a broad concept including chemical substances that can function as drugs, including natural or synthetic chemical substances.
  • the nucleic acids include, for example, DNA, RNA, ASO (Antisense oligonucleotide), microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), circular RNA, long noncoding RNA lncRNA), small activating RNA (saRNA), messenger RNA (MRNA), aptamer, locked nucleic acid (LNA), peptide nucleic acid (PNA), and morpholino ), and may additionally include decoy DNA, plasmid, shRNA, antisense RNA, oligoribonucleotides, or transfer RNA, but is not limited thereto.
  • the nucleases include, for example, CAS9 (CRISPR associated protein 9), CAS12, CAS13, CAS14, CAS ⁇ , CAS variants, Cfp1 (CxxC-finger protein-1), ZEN (zinc-finger nucleases) and TALEN (Transcription activator- like effector nuclease), but is not limited thereto.
  • the drug is a chemical drug, a bio drug, a nucleic acid drug, a peptide drug, a protein drug, a natural product drug, It may be selected from the group consisting of hormones, contrast agents, and antibodies, but is not limited thereto.
  • contrast agent is a broad concept including all materials used for imaging structures or fluids in a living body in medical imaging.
  • Suitable contrast agents include, but are not limited to, radiopaque contrast agents, paramagnetic contrast agents, superparamagnetic contrast agents, computed tomography (CT) contrast agents, and other contrast agents.
  • radiopaque contrast agents for X-ray imaging
  • inorganic iodine compounds and organic iodine compounds e.g. diatrizoat
  • radiopaque metals and their salts e.g. silver, gold, platinum, etc.
  • other radiopaque compounds eg calcium salts, barium salts such as barium sulfate, tantalum and tantalum oxide.
  • Suitable paramagnetic contrast agents include gadolinium diethylene triaminepentaacetic acid (Gd-DTPA) and its derivatives, and other gadolinium, manganese, iron, dysprosium, copper, europium (europium), erbium, chromium, nickel and cobalt complexes such as 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N",N"'-tetraacetic acid ( DOTA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,-N',N"-triacetic acid (D03A), 1,4,7-triazacyclononane -N,N',N"-triacetic acid (NOTA), 1,4,8,10-tetraazacyclotetradecane-N,N',N",N"'-tetraacetic acid (TETA), hydroxybenzyl ethylene-d
  • Suitable superparamagnetic contrast agents include magnetite, super-paramagnetic iron oxide (SPIO), ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) and monocrystaline iron oxide.
  • SPIO super-paramagnetic iron oxide
  • USPIO ultrasmall superparamagnetic iron oxide
  • Other suitable contrast agents are iodinated and non-iodinated, ionic and nonionic CT contrast agents, and contrast agents such as spin-label, or other diagnostically effective agents.
  • biodrug refers to various biopharmaceuticals such as (original) biologics, biogenerics, biobetters, and biosuperiors.
  • the biodrug refers to any drug manufactured, secreted, or semi-synthesized from a biological origin, and includes, but is not limited to, vaccines, blood products, antigens, cell products, gene therapy products, stem cells, and the like.
  • the nanoparticles may be selected from the group consisting of iron oxide, gold, carbon nanotubes, and magnetic beads, but are not limited thereto.
  • compositions for mass delivery comprising the complex as an active ingredient.
  • the substance delivery composition may be used to deliver a biologically active substance into living tissue or blood or promote cell permeation.
  • the composition may be delivered through cells constituting biological tissues or cell-to-cell junctions, but the delivery method is not limited.
  • the biological tissue refers to one or more epithelial tissue, muscle tissue, nerve tissue, and connective tissue, and each organ may consist of one or more tissues, such as mucous membrane, skin, brain, lung, liver, kidney, spleen, lung, heart, and stomach. , large intestine, digestive tract, bladder, ureter, urethra, ovary, testis, genital organ, muscle, blood, blood vessel, lymphatic vessel, lymph node, thymus, pancreas, adrenal gland, thyroid, parathyroid gland, larynx, tonsils, bronchi, and alveoli. It may, but is not limited thereto.
  • the biologically active substance is an extracellular portion protein of a ligand capable of selectively binding to a receptor specifically expressed in a specific cell, tissue or organ, or A complex may be formed by combining with a monoclonal antibody (mAb) capable of specifically binding to these receptors or ligands and a modified form.
  • mAb monoclonal antibody
  • the binding of the peptide and the biologically active substance is by indirect linkage by a cloning technique using an expression vector at the nucleotide level, or by direct linkage by chemical or physical covalent or non-covalent bonds between the peptide and the biologically active substance. can do.
  • the composition including the complex when used as a pharmaceutical composition, the composition may include about 0.0001 to 50% by weight of the active ingredient based on the total weight of the composition.
  • composition may contain at least one active ingredient exhibiting the same or similar function in addition to the active ingredient.
  • composition may be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, and a mixture of one or more of these components, and, if necessary, an antioxidant , buffers, bacteriostatic agents and other conventional additives may be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate formulations for injections such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules, or tablets, and may act specifically on target organs.
  • a target organ-specific antibody or other ligand may be used in combination with the carrier.
  • it can be preferably formulated according to each disease or component by using an appropriate method in the art or by using a method disclosed in Remington's literature.
  • compositions containing the complex as an active ingredient are intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intrathecal, intracerebroventricular, subcutaneous, and intradermal. , It can be delivered into the body by injection through routes such as nasal, mucosal, inhalation, and oral.
  • the dosage varies depending on the subject's body weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of the disease.
  • Formulations for oral administration may be tablets, pills, soft or hard capsules, granules, powders, solutions or emulsions, but are not limited thereto.
  • Formulations for parenteral administration may be injections, drops, lotions, ointments, gels, creams, suspensions, emulsions, suppositories, patches or sprays, but are not limited thereto.
  • Another aspect provides a method for transferring a substance into a cell comprising the step of bringing the composition for substance delivery into contact with the cell.
  • the cells include brain endothelial cells, cancer cells, blood cells, lymphocytes, immune cells, stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSC), neural stem cells ( neural stem cell (NSC), T cell, B cell, natural killer cell (NK cell), macrophage, neuron, glial cell, microglia , It may be selected from the group consisting of astrocytes and muscle cells. In addition, the cells may be cells of humans and/or other mammals.
  • the cell-penetrating peptide having a substance transfer function according to the present invention is a very small peptide, biological interference with the active substance that may occur can be minimized.
  • Another aspect provides a polynucleotide encoding the peptide.
  • the polynucleotide may be in the form of RNA or DNA, including cDNA and synthetic DNA.
  • DNA can be single-stranded or double-stranded. If single-stranded, it may be the coding strand or the non-coding (antisense) strand, and the coding sequence encodes the same polypeptide as a result of degeneracy or redundancy of the genetic code.
  • the polynucleotide may also include a variant of a polynucleotide described herein, which variant of the polynucleotide may be a naturally occurring allelic variant of the polynucleotide or a non-naturally occurring variant of the polynucleotide.
  • An allelic variant is an alternating form of a polynucleotide sequence that may have a substitution, deletion, or addition of one or more nucleotides that does not substantially alter the function of the polynucleotide being encoded (encoded). It is well known in the art that a single amino acid can be encoded by more than one nucleotide codon and that the polynucleotide can be readily modified to produce alternating polynucleotides encoding the same peptide.
  • the novel cell-penetrating peptide according to one aspect has excellent cell-penetrating ability, it can effectively deliver substances having biological activity into cells, tissues, etc. in vivo, and can be usefully used in the field of basic research, diagnosis and treatment of various diseases, etc. there is.
  • Figure 1 shows that the amino acid at the 1st position from the N-terminus is essentially substituted in the basic framework of the reference peptide, and one amino acid is substituted at the 3rd, 5th, 7th, 8th, 11th, 14th and 15th positions It shows the cell permeability analysis results for the peptide candidates (#1 to #10) containing
  • Figure 3 is a peptide candidate group in which the 3rd or 5th amino acid from the N-terminus is substituted with A in the basic framework of the reference peptide and includes one amino acid substitution at the 7th, 8th, 11th, 14th and 15th positions Cell permeability analysis results for (#20 to #30) are shown.
  • Figure 4 is a cell permeability analysis for peptide candidates (#31 to #40) containing two amino acid substitutions at the 7th, 8th, 11th, 14th and 15th positions from the N-terminus in the basic framework of the reference peptide that showed the result.
  • Figure 5 shows the cell permeability analysis results for peptide candidates (#40 to #54) containing two amino acid substitutions at the 8th, 11th, 14th and 15th positions from the N-terminus in the basic framework of the reference peptide. will be.
  • FIG. 6 shows the results of cell permeability analysis for the peptide candidates (#55 to #64) in which only the length of the peptide was modified without replacing amino acids in the first peptide candidate group according to an embodiment.
  • Figure 7 is a peptide comprising at least one amino acid substitution at the 3rd, 8th, 14th, and 15th positions from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide in the first peptide candidate group according to one embodiment Cell permeability analysis results for peptide candidates (#65 to #77) with modified lengths are shown.
  • peptide candidate group 8 is a peptide candidate group in which the length of a peptide including an amino acid substitution at the 3rd or 5th position from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide is modified in the second peptide candidate group according to one embodiment (#78 to #92) shows the results of cell permeability analysis.
  • FIG. 9 is a peptide candidate group in which the length of a peptide including an amino acid substitution at the 7th and/or 8th position from the N-terminus is modified based on the amino acid position of the reference peptide in the second peptide candidate group according to one embodiment ( Cell permeability analysis results for #93 to #103) are shown.
  • Figure 10a is a peptide candidate group (#104 to #114 with a modified length of a peptide including an amino acid substitution at the 8th position from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide in the second peptide candidate group according to one embodiment. ) shows the cell permeability analysis results for.
  • 10B is a peptide candidate group in which the length of a peptide including an amino acid substitution at the 8th position from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide is modified in the second peptide candidate group according to an embodiment (# 115 to # 124 ) shows the cell permeability analysis results for.
  • 10c is a peptide candidate group (# 125 to # 136 in which the length of a peptide including an amino acid substitution at the 8th position from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide is modified in the second peptide candidate group according to an embodiment. ) shows the cell permeability analysis results for.
  • 11 is a peptide candidate group (#137 to #145) in which the length of a peptide including an amino acid substitution at the 11th position from the N-terminus is modified based on the amino acid position of the reference peptide in the second peptide candidate group according to one embodiment. ) shows the cell permeability analysis results for.
  • FIG. 12 is a modification of the length of a peptide including an amino acid substitution at the 14th position, or the 8th and 14th position from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide in the second peptide candidate group according to one embodiment.
  • Cell permeability analysis results for the peptide candidates (#146 to #157) are shown.
  • FIG. 13 is a modification of the length of a peptide including an amino acid substitution at the 15th position, or the 8th and 15th positions from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide in the second peptide candidate group according to one embodiment.
  • Cell permeability analysis results for the peptide candidates (#158 to #164) are shown.
  • 15 is a peptide candidate group in which the length of the peptide including an amino acid substitution at the 8th or 14th position from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide in the third peptide candidate group according to one embodiment is modified (# 174 to #183) shows the results of cell permeability analysis.
  • 16 is a modification of the length of a peptide including two amino acid substitutions at the 8th, 14th, and 16th positions from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide in the third peptide candidate group according to one embodiment Cell permeability analysis results for the selected peptide candidates (#184 to #201) are shown.
  • 17 is a modification of the length of a peptide including three amino acid substitutions at the 8th, 14th, and 16th positions from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide in the third peptide candidate group according to one embodiment Cell permeability analysis results for the selected peptide candidates (#202 to #216) are shown.
  • GHHERLKSDEWSVTSG a reference peptide
  • cell-permeable peptides having variously modified sequences were designed and synthesized.
  • the amino acid (E) at position 12, the amino acid at position 12 (S), the amino acid at position 13 (V), and the amino acid at position 16 (G) are not modified, and the amino acids at the remaining positions are substituted, thereby increasing cell permeability.
  • Peptide candidates were designed.
  • the present inventors used a solid state peptide synthesis (SPPS) method to synthesize each of the peptides described in Example 1-1.
  • SPPS solid state peptide synthesis
  • This method is an organic synthesis method in which the C-terminus of an amino acid whose N-terminus is protected by F-moc is coupled to the N-terminus of the resin one by one.
  • N , N -dimethylformamide (DMF) was used as the solvent for all reactions, and amino acid coupling conditions were 0.5M DIC ( N,N- Diisopropylcarbodiimide, DIC) 1 ml, 1 M Ethyl cyanohydroxyiminoacetate (Oxyma) was mixed with 0.5 ml and reacted in a microwave synthesizer.
  • amino acids were prepared by varying the reaction time, temperature, or microwave voltage for each amino acid sequence.
  • the F-moc of the previous amino acid must be removed.
  • the F-moc protecting group was deprotected twice for 2 minutes at 80 °C using 80% DMF and 20% piperidine solution ( deprotecting). Between all coupling processes and deprotection processes, a process of washing alternately three times using DMF and methylene chloride (dichloromethane, DCM) was performed.
  • a fluorescent substance containing a carboxyl group may be linked to the N-terminus of the peptides by a chemical bonding method in order to observe and quantify cell permeability later.
  • the fluorescent materials that can be used at this time include 5-carboxyfluorescein (5-FAM), Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC), Cyanine 3 carboxylic acid, Cyanine 5 carboxylic acid, Cyanine 7 carboxylic acid ( Cyanine 7 carboxylic acid) and the like, and one or more of the fluorescent materials may be used.
  • the present inventors first synthesized the last amino acid of the synthesized peptide in a solid phase resin, mixed 5-FAM: DIC: Oxyma: resin in a ratio of 2: 2.5: 4: 1, and then reacted in the resin. It proceeded for 2 hours at room temperature, and a magnetic stirrer was used. Next, when the resin color changed from yellow to deep yellow or orange during the synthesis process, a process of washing DMF and methylene chloride alternately three times was performed.
  • the lyophilized peptide was dissolved in distilled water or acetonitrile (ACN), and separated and purified using reverse phase high-performance liquid chromatography.
  • Solvent A distilled water 99.9%, TFA 0.1%)
  • Solvent B distilled water 9.9%, acetonitrile 90%, TFA 0.1%) were used as the mobile phase solvents of the HPLC.
  • the HPLC mobile phase was separated by starting with 90% of Solvent A and 10% of Solvent B and increasing Solvent B at a gradient of 1%/min. Thereafter, the separated peptide solution was lyophilized to remove the solvent, and then dissolved in a desired solvent to conduct the experiment.
  • Example 2 In vitro cell permeability analysis of 16-mer cell penetrating peptide candidates
  • Example 1 In order to evaluate the cell permeability of the peptide candidates synthesized in Example 1, the present inventors performed an in vitro permeability assay for blood-brain barrier cells.
  • hCMEC/D3 cells human blood-brain barrier cells
  • EMM endothelial cell growth medium
  • the FAM-linked candidate peptides prepared in Example 1-2 and the negative control FAM alone were diluted at 10 uM in the growth factor-free medium to prepare an amount to be treated by 10 ⁇ L per well.
  • 10 ⁇ L per well of a solution prepared by diluting the peptide was diluted on a plate in which 40 ⁇ L of cells were cultured, and then incubated for 2 hours at 37° C. CO 2 conditions.
  • the peptide conserving the 2nd, 4th, 6th, 9th, 10th, 12th, 13th and 16th amino acids in the reference peptide is used as a basic backbone, and the remaining positions Peptide candidates with variously modified amino acids were designed.
  • the position of the unmodified amino acid sequence was preserved in the basic framework sequence.
  • the amino acid at position 1 is essentially substituted from the N-terminus, and at positions 3, 5, 7, 8, 11, 14 and 15 other than
  • a peptide candidate group including a total of two amino acid substitutions including amino acid substitutions was designed, and specific sequence information is shown in Table 1 below. In Table 1, portions marked in bold represent regions where amino acids are substituted.
  • the peptide conserving the 2nd, 4th, 6th, 9th, 10th, 12th, 13th and 16th amino acids in the reference peptide is used as a basic backbone, and the remaining positions Peptide candidates with variously modified amino acids were designed. However, among the modified peptides, the position of the unmodified amino acid sequence was preserved in the basic framework sequence.
  • the amino acid at position 1 from the N-terminus is substituted with S, and the third amino acid is preserved as H, and at the same time, the 5th, 7th, 8th, 11th, 14th
  • a peptide candidate group containing a total of two amino acid substitutions including amino acid substitutions at positions 15 and 15 was designed, and specific sequence information is shown in Table 2 below. In Table 2, portions marked in bold represent regions where amino acids are substituted.
  • the peptide conserving the 2nd, 4th, 6th, 9th, 10th, 12th, 13th and 16th amino acids in the reference peptide is used as a basic backbone, and the remaining positions Peptide candidates with variously modified amino acids were designed.
  • the position of the unmodified amino acid sequence was preserved in the basic framework sequence.
  • the amino acid was conserved as G without substitution, and the third or fifth amino acid was substituted with A.
  • a peptide candidate group containing a total of two amino acid substitutions including amino acid substitutions at the 7th, 8th, 11th, 14th and 15th positions was designed, and specific sequence information is shown in Table 3 below. In Table 3, portions marked in bold represent regions where amino acids are substituted.
  • the peptide conserving the 2nd, 4th, 6th, 9th, 10th, 12th, 13th and 16th amino acids in the reference peptide is used as a basic backbone, and the remaining positions Peptide candidates with variously modified amino acids were designed. However, among the modified peptides, the position of the unmodified amino acid sequence was preserved in the basic framework sequence.
  • the peptide conserving the 2nd, 4th, 6th, 9th, 10th, 12th, 13th and 16th amino acids in the reference peptide is used as a basic backbone, and the remaining positions Peptide candidates with variously modified amino acids were designed. However, among the modified peptides, the position of the unmodified amino acid sequence was preserved in the basic framework sequence.
  • the peptide candidate group based on the amino acid position of the reference peptide, the 2nd to 6th, 9th, 10th, 12th, 13th and 16th amino acids from the N-terminus It was found that even when amino acids at other positions were substituted with preservation of the region, the unique structure of the peptide exhibiting excellent cell permeability was maintained.
  • cell-permeable peptides having variously modified sequences and lengths were designed and synthesized using Korean Patent Application No. 10-2020-0049621 peptide (GHHERLKSDEWSVTSG, hereinafter referred to as reference peptide) as a basic framework. .
  • the amino acid at the 4th position (E), the amino acid at the 6th position (L), the amino acid at the 9th position (D), the amino acid at the 10th position (E), the 12th position The amino acid (S) of and the amino acid (V) at the 13th position are not modified, and the amino acids at the remaining positions are substituted or deleted and an amino acid sequence is added to their N- and / or C-terminus, A candidate group of penetrating peptides was designed.
  • a first peptide candidate group in which amino acids at positions 1 and 2 in the reference peptide are AH or absent, amino acids at positions 1 and 2 are GH, and amino acids at positions 1 and 2 are SH.
  • Cell penetrating peptide candidates were designed and synthesized by classifying them into 3 peptide candidates.
  • the present inventors used a solid state peptide synthesis (SPPS) method to synthesize each of the peptides described in Example 3-1, and synthesized and separated and purified the peptides in the same manner as in Example 1-2 .
  • SPPS solid state peptide synthesis
  • Example 4 In vitro cell permeability analysis of cell permeable peptide candidates other than 16-mer
  • Example 3 In order to evaluate the cell permeability of the peptide candidates other than the 16-mers synthesized in Example 3, the present inventors performed in vitro permeability analysis for blood-brain barrier cells in the same manner as in Example 2-1.
  • a peptide candidate group with modified length was designed for peptides in which no additional amino acid substitution or at least one amino acid was substituted, and their cells Permeability was checked.
  • the amino acids at the 1st and 2nd positions in the reference peptide are AH or absent
  • Peptide candidate groups in which the length of peptides containing one or more amino acid substitutions was modified were designed, and specific sequence information is shown in Table 7 below.
  • Table 7 boldly marked regions correspond to reference peptides, and underlined regions represent regions in which amino acids have been substituted or added.
  • the amino acid substitution at the 3rd, 8th, 14th, and 15th positions from the unsubstituted or N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide was found that even when the length of the peptide was modified, the unique structure of the peptide exhibiting excellent cell permeability was maintained.
  • the peptide is divided into three regions, that is, 3 to 6 times (first region) and 7 times from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide Divided into ⁇ 10 (second region) and 11 to 16 (third region) position regions, targeting peptides in which one or more amino acids are substituted in each region or in two or more regions, a peptide candidate group whose length is modified designed, and to confirm their cell permeability.
  • the first region specifically, amino acid substitution at the 3rd or 5th position from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide
  • Table 8 A peptide candidate group in which the length of the included peptide was modified was designed, and specific sequence information is shown in Table 8 below. In Table 8, boldly marked regions correspond to reference peptides, and underlined regions represent regions in which amino acids have been substituted or added.
  • the second region specifically, the amino acid at the 7th and/or 8th position from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide Peptide candidates with modified peptide lengths including substitutions were designed, and specific sequence information is shown in Tables 9 and 10 below.
  • Tables 9 and 10 boldly marked regions correspond to reference peptides, and underlined regions represent regions in which amino acids have been substituted or added.
  • peptides having sequences corresponding to #92 to #103 in Table 9 and #104 to #136 in Table 10 are excellent brain It was confirmed that the influx effect into blood vessel barrier cells was exhibited.
  • the third region specifically, at the 11th, 14th, or 15th position from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide
  • a peptide candidate group in which the length of the peptide including the amino acid substitution was modified was designed, and a peptide candidate group combined with the second region amino acid substitution (8th position) was additionally set (#156, #163), and specific sequence information are shown in Table 11, Table 12, and Table 13 below.
  • Table 11, Table 12, and Table 13 boldly marked regions correspond to reference peptides, and underlined regions represent regions in which amino acids have been substituted or added.
  • the second peptide candidate group according to one embodiment, at the 3rd, 5th, 7th, 8th, 11th, 14th, and 15th positions from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide It was found that even when the length of the peptide was modified along with amino acid substitution of , the unique structure of the peptide exhibiting excellent cell permeability was maintained.
  • a peptide candidate group was designed in which the length of the peptide was modified without additional substitution of amino acids or at least one amino acid was substituted, and their cell permeability wanted to check.
  • the length of the peptide containing the amino acid substitution at the 8th or 14th position from the N-terminus based on the amino acid position of the reference peptide is modified
  • a peptide candidate group was designed, and specific sequence information is shown in Table 15 below. In Table 15, boldly marked regions correspond to reference peptides, and underlined regions represent regions in which amino acids have been substituted or added.
  • the peptide is unsubstituted based on the amino acid position of the reference peptide, or with amino acid substitutions at the 8th, 14th, and 16th positions from the N-terminus Even when the length of was modified, it was found that the unique structure of the peptide exhibiting excellent cell permeability was maintained.

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Abstract

신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 일반식 I 내지 V로 표시되는 아미노산으로 이루어진 세포 투과성 펩타이드, 상기 세포 투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 세포 투과성 펩타이드 및 생물학적 활성 물질을 포함하는 복합체, 상기 복합체를 포함하는 물질 전달용 조성물을 제공한다.

Description

신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도
세포 투과능이 우수한 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 특허출원은 2021년 07월 01일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2021-0086712호 및 특허출원 제10-2021-0086714호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
일반적으로 친수성이거나 분자량이 크고 거대한 물질들은 세포막이라는 장벽에 의해 세포 안으로 들어갈 수 없다. 세포막은 펩타이드나 단백질, 핵산과 같은 거대 분자가 세포 내로 들어오지 못하게 막고, 세포막 수용체에 의한 엔도사이토시스(endocytosis)라는 생리적 기작을 통해 세포 내로 들어오더라도 세포의 용해소체 분획(lysosomal compartment)과 융합되어 결국 분해되므로, 상기 거대 분자들을 이용한 질병의 치료 및 예방에 있어서 많은 제약이 따른다. 또한, 항암제의 경우 세포 내로 약물을 전달하기 위해서는 다약제 저항성(multidrug resistance)과 같은 장애물을 극복해야만 한다. 이에 약물 분해를 막기 위해 다양한 거대 분자 및 약물이 함유된 전달체를 엔도사이토시스 과정을 통하지 않고, 직접 세포 내로 전달하는 많은 방법이 제시되었다. 이러한 방법들에는 마이크로 주입(microinjection), 전기천공법(electroporation) 등이 있는데, 이는 세포막에 손상을 줄 가능성이 있다. 또 다른 방법들로 세포투과성 물질을 이용하는 방법 등이 있다. 하지만 이러한 방법을 통하여 세포 내로 약물들을 전달하였다 하더라도 약효를 발휘하기 위해서는 특정한 기관으로 이동되어야 하는 문제가 있다.
따라서 상기와 같은 한계점들을 극복하고 안정성 및 물질 전달 효율을 높일 수 있는 다양한 약물전달체들이 많이 연구 개발되어 왔으며, 대표적으로 리포좀(liposome)과 마이셀(micelle)이 있다. 리포좀은 인공적으로 만든 인지질 전달체로 친유성 및 친수성 약물 모두 봉입할 수 있으며, 생체적합성 물질이므로 독성이 없고 약물을 외부환경으로부터 보호한다. 하지만 흡수가 지연되고 분포의 제한을 받으며 대사율이 낮아지며, 간이나 비장의 세포에 포획되어 혈액으로부터 신속하게 제거되는 단점이 있다. 마이셀은 약물의 용해도 및 생체이용률을 높여줄 수 있는 특징이 있으나, 물질의 세포 내로의 이동에 관한 효과와 기초 의학적 및 임상적 적용가능성에 대해서는 아직도 많은 연구가 필요하다. 이러한 한계점 때문에, 생체물질을 생체 내로 효과적으로 전달할 수 있고 세포독성이 없으며, 특히 엔도사이토시스를 통하여 들어가지 않는 새로운 제제들이 필요하다.
이러한 측면에서, 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide)가 새로운 대안으로써 주목받아왔다. 세포 투과성 펩타이드는 일종의 신호 펩타이드(signal peptide)로서 단백질, DNA, RNA 등과 같은 고분자 물질을 세포 내로 전달하고자 하는 목적으로 사용되는 일종의 특정 아미노산 서열이 조합된 펩타이드이다. 예컨대, HIV 바이러스에서 유래된 TAT 단백질에 존재하는 11개 아미노산 서열이 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)(120 kDa) 단백질의 세포 내 및 조직 내 전달이 가능하다는 것을 보여준 1990년대 이후부터 본격적으로 관련 연구가 진행되었다. 초파리의 단백질에서 유래한 안테나페디아(Antennapedia(Penetratin)), HSV-1 바이러스로부터 유래된 VP22, 시미안 바이러스 40 거대 항원 T(Simian Virus 40 large antigen T)로부터 유래한 Pep-1이 대표적인 1세대 세포투과성 펩타이드로 여겨지며 TAT과 함께 많이 사용되어져 왔다. 또한, 폴리 아르기닌(poly Arginine), 폴리 라이신(poly Lysine)과 같이 단순히 아르기닌 및 라이신과 같은 양이온성 아미노산이 반복적으로 여러 개 연결된 펩타이드도 세포 투과능이 뛰어난 것으로 보고되었으며(한국 공개특허 제10-2020-0104524호), 다양한 물질 전달에 응용되고 있다. 그러나 대부분 이러한 세포투과성 펩타이드는 면역원성, 독성의 가능성을 내포하고 있고, 인간세포에 전달되는 효능이 떨어지는 것으로 여겨진다. 따라서 독성이 유발하지 않고 생체 내에서의 안전성을 가지며 효과적으로 물질을 전달할 수 있는 세포 투과성 펩타이드의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 상기와 같은 우수한 효과를 갖는 신규한 세포 투과성 펩타이드를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 기존의 참조 펩타이드를 기준으로 아미노산 서열을 다양하게 변형시킨 세포 투과성 펩타이드를 설계 및 합성하고, 이의 우수한 세포 투과성을 확인하였는 바, 이로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 일 양상은 신규한 세포 투과성 펩타이드를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 세포 투과성 펩타이드 및 생물학적 활성 물질을 포함하는 복합체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 복합체를 포함하는 물질 전달용 조성물, 및 상기 조성물을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 물질 전달방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 세포 투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
일 양상은 하기 일반식 Ⅰ로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 세포 투과성 펩타이드를 제공한다.
[일반식 Ⅰ]
Xa-H-Xb-[E-X1-L]-Xc-Xd-[DE-X2-SV]-Xe-Xf-G
상기 일반식 Ⅰ에서,
Xa는 Gly(G), Ala(A), 또는 Ser(S)이고;
Xb는 His(H) 또는 Ala(A)이며;
Xc는 Lys(K) 또는 Arg(R)이고;
Xd는 Ser(S), Gln(Q), Leu(L), 또는 Ala(A)이며;
Xe는 Thr(T), Lys(K), 또는 Arg(R)이고;
Xf는 Ser(S), 또는 Gln(Q)이며;
X1은 Arg(R), 또는 Ala(A) 이고; 및
X2는 Trp(W) 또는 Ile(I)일 수 있다.
일 양상은 하기 일반식 II로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 세포 투과성 펩타이드를 제공한다.
[일반식 II]
X1-[Xa-Xb-[E-Xc-L]-Xd-Xe-DE-Xf-SV-Xg-Xh]-X2
상기 일반식 II 에서, Xa는 GH, AH, SH, 또는 부재하고;
Xb는 His(H) 또는 Ala(A)이며;
Xc는 Arg(R) 또는 Ala(A)이고;
Xd는 Lys(K) 또는 Arg(R)이며;
Xe는 Ser(S), Cys(C), Ala(A), Leu(L), 또는 Gln(Q)이고;
Xf는 Trp(W) 또는 Ile(I)이며;
Xg는 Thr(T), Asn(N), Lys(K), 또는 Arg(R)이며;
Xh는 SG, SV, SA, QG, 또는 부재하고; 및
X1 및 X2는 부재하거나 적어도 하나 이상은 존재하며, 여기서, X1은 ESKAVKWSAL이고, X2는 G, GL, GLIES, GLIESESAET, 또는 GLIECESAET일 수 있다.
일 양상은 기초연구 분야, 다양한 질병의 진단 및 치료 분야 등에서 유용하게 활용될 수 있는 세포 투과성 펩타이드에 관한 것으로서, 한정되지 않은 수의 디자인으로 확장 가능한 16개의 아미노산으로 구성된 기본 플랫폼 펩타이드 구조와 이외 한정되지 않은 수의 디자인으로 확장 가능한 다양한 아미노산으로 구성된 기본 플랫폼 펩타이드 구조에 관한 것이다.
본 명세서에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 펩타이드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 상기 펩타이드는 D-아미노산을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 한편, 본 발명의 상기 펩타이드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩타이드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다. 한편, 본 명세서 내에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 약어로 기재하였다.
본 명세서에서 용어, "세포 투과성"이란, 펩타이드가 세포(막)를 투과하여 세포 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "펩타이드(peptide)"란 아미노산의 중합체로서, 보통 소수의 아미노산이 연결된 형태를 펩타이드라 하며, 많은 아미노산이 연결되면 단백질이라 부른다. 이러한 펩타이드 및 단백질 구조에서 아미노산 간의 연결은 아마이드(amide) 결합 또는 펩타이드 결합으로 이루어져 있다. 펩타이드 결합이란 카르복실기(-COOH)와 아미노기(-NH2) 사이에 물(H2O)이 빠져나가고 -CO-NH- 형태를 이루는 결합이다. 상기 펩타이드는 단리되거나 (Isolated), 인위적으로 합성되거나 (Artificially synthesized), 또는 비-천연 발생 또는 조작 (Non-naturally occurring or engineered)된 것일 수 있으며, 상기 “비-천연 발생 또는 조작”은 자연 상태에서 일어나는 존재 그대로의 상태가 아닌, 인위적인 변형을 가하여 생성된 상태를 의미한다. 여기서, 상기 인위적인 변형은 세포 투과도를 향상시키기 위한 것으로서, 아미노산 서열의 치환, 결실 또는 부가 등을 포함하는 것일 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 "세포 투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptide, CPP)"는 인비트로(in vitro) 및/또는 인비보(in vivo)에서 이동 대상(cargo)을 세포 내로 이동시킬 수 있는 펩타이드를 의미한다. 본 명세서에서, "이동 대상(cargo)"은 세포 투과성 펩타이드와 결합하여 세포 내로 이동할 수 있는 물질을 모두 포함하며, 예를 들어 세포 투과 효율을 높이길 원하는 모든 물질로 예를 들면 일반적인 경로를 통해서는 세포 내로 이동이 용이하지 않은 생물학적 활성 물질을 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 펩타이드는 하기 일반식 III로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
[일반식 III]
X1a-[Xaa-Xba-ERLK-Xca-DEWSV-Xda-Xea]-X2a
상기 일반식 III에서, Xaa는 AH 또는 부재하고; Xba는 His(H) 또는 Ala(A)이며; Xca는 Ala(A), Ser(S), 또는 Cys(C)이고; Xda는 Thr(T) 또는 Arg(R)이며; Xea는 SG, QG, 또는 부재하고; 및 X1a 및 X2a는 부재하거나 적어도 하나 이상은 존재하며, 여기서, X1a는 ESKAVKWSAL이고, X2a는 G, GL, GLIES, GLIESESAET, 또는 GLIECESAET일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 펩타이드는 하기 일반식 IV로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
[일반식 IV]
X1b-[GH-Xab-[E-Xbb-L]-Xcb-DE-Xdb-SV-Xeb-Xfb]-X2b
상기 일반식 IV에서, Xab는 His(H) 또는 Ala(A)이고; Xbb는 Arg(R) 또는 Ala(A)이며; Xcb는 KS, KA, KQ, KL, KC, RS, 또는 RC이고; Xdb는 Trp(W) 또는 Ile(I)이며; Xeb는 Thr(T), Lys(K), 또는 Arg(R)이고; Xfb는 SG, QG, 또는 부재하며; 및 X1b 및 X2b는 부재하거나 적어도 하나 이상은 존재하며, 여기서, X1b는 ESKAVKWSAL이고, X2b는 G, GL, GLIES, GLIESESAET, 또는 GLIECESAET일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 펩타이드는 하기 일반식 V로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
[일반식 V]
X1c-[SHHERLK-Xac-DEWSV-Xbc-Xcc]-X2c
상기 일반식 V에서, Xac는 Ser(S) 또는 Cys(C)이고; Xbc는 Asn(N) 또는 Thr(T)이며; Xcc는 SG, SV, SA 또는 부재하고; 및 X1c 및 X2c는 부재하거나 적어도 하나 이상은 존재하며, 여기서, X1c는 ESKAVKWSAL이고, X2c는 G, GL, GLIES, GLIESESAET, 또는 GLIECESAET일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 일반식 I 내지 V의 신규 펩타이드는 대표적으로 서열번호 1 내지 서열번호 216으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 서열번호 1 내지 216으로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. 더욱 구체적으로, 일반식 I의 신규 펩타이드는 대표적으로 서열번호 1 내지 서열번호 54로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열일 수 있으며, 일반식 II 내지 V의 신규 펩타이드는 대표적으로 서열번호 55 내지 서열번호 216으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열일 수 있다.
본 명세서 내에서 상기 펩타이드의 아미노산은 변화시킬 수 있는데, 상기와 같은 변화는 펩타이드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 것을 말한다. 예를 들어, 펩타이드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.
상기 일반식 I 내지 V로 나타내어지는 세포 투과성 펩타이드의 N-말단 및 C-말단에는 상기 세포 투과성 펩타이드로서의 효과를 증대시킬 수 있는 다양한 아미노산을 추가로 부가하거나 결실시킬 수도 있다.
또한 상기 펩타이드는 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 보호기가 선택적으로 결합되어 있을 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group), 부톡시카르보닐기(butoxycarbonyl group), 아릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있고; 및/또는 상기 펩타이드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH2), 삼차 알킬기(tertiary alkyl group) 및 아자이드(azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 선택적으로, 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "안정성"은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 상기 펩타이드를 보호하는 인비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드가 투과 가능한 세포의 종류로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 뇌혈관장벽 내피세포(brain endothelial cell), 암세포, 혈액세포(blood cell), 림프구(lymphocyte), 면역세포, 줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 신경줄기세포(neural stem cell; NSC), T 세포, B 세포, 자연살해세포(natural killer cell; NK cell), 대식세포(macrophage), 신경세포(neuron), 신경아교세포(glial cells), 미세아교세포(microglia), 성상세포(astrocyte) 및 근육세포(muscle cell)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 각 펩타이드의 순도가 90% 이상이 되도록 제작할 수 있으며, 예컨대 직접 합성하거나 펩타이드 제조회사에 제조를 의뢰한 후 구입하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 D-form이나 L-form, 서열 중 일부만 D-form이나 L-form으로 구성된 펩타이드, 또는 이들의 라세미체 형태로 모두 제작하여 사용될 수 있다. 또한, 펩타이드의 안정성을 높이기 위해 그 외의 당업계에 공지된 통상적인 변형이 가능하다. 본 발명에서는 바람직하게 고체상 펩타이드 합성(Solid state peptide synthesis) 방법을 이용하여 펩타이드를 합성하였으나, 전술한 바와 같이 펩타이드 합성 방법 및 조건이 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 세포 투과능이 우수한 세포 투과성 펩타이드를 발굴하였으며, 우수한 세포 투과능을 갖는 펩타이드를 추가적으로 발굴하기 위하여, 상기 발굴된 펩타이드의 서열 및 구조를 기반으로 16개 아미노산을 기준으로 특정 위치의 아미노산을 변형 또는 치환시키고, 이들의 길이를 변형함으로써 다양한 펩타이드 후보군을 설계 및 합성하였으며, 이의 세포 투과성을 분석함으로써 본 발명에 따른 우수한 세포 투과능을 갖는 다양한 세포 투과성 펩타이드들을 발굴하였다.
보다 구체적으로, 본 실시예에서는 한국 특허 출원 제10-2020-0049621호의 16개 아미노산으로 구성된 펩타이드 (참조 펩타이드)를 기초로, 상기 16-mer의 참조 펩타이드에서 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 펩타이드를 기본 골격으로 하여, i) N-말단으로부터 1번째 위치의 아미노산이 필수적으로 치환되고 이외 3번째, 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드로 변형하거나, ii) 상기 기본 골격에서 N-말단으로부터 1번째 위치의 아미노산을 S로 치환하고, 3번째 아미노산을 H로 보존하면서, 동시에 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함한 펩타이드로 변형하거나, iii) 상기 기본 골격에서 N-말단으로부터 3번째 또는 5번째의 아미노산이 A로 치환하고, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드로 변형하거나, iv) 상기 기본 골격에서 N-말단으로부터 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드로 변형하거나, v) 상기 기본 골격에서 N-말단으로부터 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드로 변형하여 세포 투과성 펩타이드 후보군을 설계 및 합성하였다. 이후 상기 후보군들에 대하여 인비트로 세포 투과성 분석을 실시하여 최종적으로 총 54종의 세포 투과성 펩타이드를 발굴하였으며, 결과적으로 N-말단으로부터 N-말단으로부터 2번째 내지 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 위치의 아미노산인 영역이 보존되는 것이 세포 투과성을 유지하는데 중요함을 알 수 있었다.
아울러, 보다 구체적으로, 본 실시예에서는 한국 특허 출원 제10-2020-0049621호의 16개 아미노산으로 구성된 펩타이드 (참조 펩타이드)를 기초로, 참조 펩타이드에서 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 및 13번째 아미노산을 필수적으로 보존한 펩타이드를 기본 골격으로 하여, i) 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 1번째 및 2번째 위치의 아미노산이 AH이거나 부재하는 제1 펩타이드 후보군, ii) 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 1번째 및 2번째 위치의 아미노산이 GH인 제2 펩타이드 후보군, 또는 iii) 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 1번째 및 2번째 위치의 아미노산이 SH인 제3 펩타이드 후보군으로 분류하였다.
뒤이어, 상기 제1 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 ① 아미노산의 추가적인 치환이 없거나, 또는 ② 3번째, 8번째, 14번째, 및 15번째 위치에서의 적어도 1 이상의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드를 대상으로, 이의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였다. 이후, 인비트로 세포 투과성 분석을 실시한 결과, 일 실시예에 따른 제1 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 비치환 또는 N-말단으로부터 3번째, 8번째, 14번째, 및 15번째 위치에서의 아미노산 치환과 함께 상기 펩타이드의 길이가 변형된 경우에도, 우수한 세포 투과성을 나타내는 펩타이드의 고유한 구조가 유지됨을 알 수 있었다.
또한, 상기 제2 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 ① 3~6번 (제1 영역, 3번째 또는 5번째 위치에서의 아미노산 치환), ② 7번~10번(제2 영역, 7번째 및/또는 8번째 위치에서의 아미노산 치환), 또는 ③ 11번~16번(제3 영역, 11번째, 14번째, 또는 15번째 위치에서의 아미노산 치환) 위치 영역에서의 치환을 포함하는 펩타이드를 대상으로, 이의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였다. 이후, 인비트로 세포 투과성 분석을 실시한 결과, 일 실시예에 따른 제2 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 3번째, 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째, 및 15번째 위치에서의 아미노산 치환과 함께 상기 펩타이드의 길이가 변형된 경우에도, 우수한 세포 투과성을 나타내는 펩타이드의 고유한 구조가 유지됨을 알 수 있었다.
또한, 상기 제3 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 ① 아미노산의 추가적인 치환이 없거나, ② 8번째 또는 14번째 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함하거나, ③ 8 번째, 14번째, 및 16번째 위치에서의 2개의 아미노산 치환을 포함하거나, 또는 ④ 8 번째, 14번째, 및 16번째 위치에서의 3개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드를 대상으로, 이의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였다. 이후, 인비트로 세포 투과성 분석을 실시한 결과, 일 실시예에 따른 제3 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 비치환되거나, 또는 N-말단으로부터 8번째, 14번째, 및 16번째 위치에서의 아미노산 치환과 함께 상기 펩타이드의 길이가 변형된 경우에도, 우수한 세포 투과성을 나타내는 펩타이드의 고유한 구조가 유지됨을 알 수 있었다.
상기 실시예들의 결과로부터, 본 발명에 따른 총 216종의 펩타이드는 우수한 세포 투과성을 가지며, 이를 기반으로 상기 펩타이드와 결합한 임의의 물질을 세포 내로 효과적으로 유입시킬 수 있는 전달체로서 활용 가능함을 알 수 있었다.
다른 양상은 상기 세포 투과성 펩타이드 및 생물학적 활성 물질을 포함하는 복합체를 제공한다.
상기 복합체는 펩타이드와 물질이 단순히 혼합(mixing)된 것, 펩타이드와 물질이 혼합되어 형성된 것, 또는 이들이 결합에 의해 연결되거나 컨쥬게이션되어 생성된 것을 모두 포함한다. 상기 용어, "복합체"는 컨쥬게이트(conjugate), 결합체와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 복합체는 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질이 서로 융합(fusion)된 상태로 발현되어 이룬 복합체가 될 수 있다. 예를 들어, 하나의 벡터 내에 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질을 발현하는 유전자를 삽입한 후, 상기 벡터로 생물을 형질전환시켜 벡터에 삽입된 유전자를 발현하도록 하면, 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질이 융합 단백질(fusion protein)로서 발현될 수 있다. 융합 단백질로 발현될 때, 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질 간에 임의의 링커가 포함되도록 할 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 활성 물질이 단백질인 경우, 상기 복합체, 즉, 융합 단백질에 대한 결합의 구체적인 예는 다음과 같다: 융합 단백질을 생산하기 위한 프라이머(primer) 제작시, 생물학적 활성 물질을 발현하는 뉴클레오티드 앞에 운반 세포 투과성 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드를 붙인 다음, 상기 수득한 뉴클레오티드를 제한 효소를 사용하여, 벡터 (예를 들어, pET 벡터)에 삽입하고, 적절한 숙주 세포에 도입(transformation)하여 발현시킨다. 이때, IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)와 같은 발현 유도제를 처리하여 융합 단백질이 효과적으로 발현되도록 할 수 있다. 이후, His tag 정제(purification)와 같은 방법을 통해 발현시킨 융합 단백질을 정제한 후, PBS를 이용하여 투석하고, 이후 원심 분리하여 농축시킬 수 있다.
또한, 상기 복합체에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 생물학적 활성 물질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위해서, 단일 또는 복수개가 결합된 형태를 모두 포함할 수 있으며, 전달하고자 하는 생물학적 활성물질에 따라 세포 투과성 펩타이드의 결합 개수는 당업자에게 용이하게 선택 또는 조절될 수 있다.
세포 투과성 펩타이드에 결합되어 복합체를 형성할 수 있는 상기 생물학적 활성 물질은 바람직하게는 '생물학적 또는 약제학적 활성을 갖는 물질'을 의미하며, 이는 세포 내(세포질 또는 핵 내)로 투과되어 생리활성조절에 관여하거나 약리효과를 발현할 수 있는 것 또는 운반되어 작용해야 하는 세포 내, 조직 내, 세포간질, 혈액 등 다양한 생체 내 부위에서도 생물학적 활성을 갖는 물질을 의미한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 화합물(chemical compound), 당단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 천연물(natural product), 반합성 물질(semi-synthetic drug), 마이크로입자, 나노입자, 바이러스, 양자점(quantum dots), 리포좀 및 형광색소(fluorochrome)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 또한 상기 생물학적 활성 물질은 항체(antibody), 약물(drug), 효소(enzyme), 핵산분해효소(nuclease), 호르몬, 사이토카인(cytokine), 전사인자(transcription factor) 및 독소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 또한 상기 화합물은 약물로서 기능할 수 있는 화학 물질을 포함하는 광범위한 개념으로, 천연 또는 합성 화학 물질을 포함한다.
상기 핵산은 예를 들면 DNA, RNA, ASO(Antisense oligonucleotide), 마이크로RNA(microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 원형 RNA(circular RNA), 긴 비암호화 RNA(long noncoding RNA; lncRNA), 작은 활성화 RNA(small activating RNA; saRNA), 전령 RNA(messenger RNA; Mrna), 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 추가적으로 decoy DNA, plasmid, shRNA, 안티센스 RNA, 올리고리보뉴클레오티드, 또는 전달 RNA (transfer RNA) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 핵산분해효소는 예를 들면 CAS9(CRISPR associated protein 9), CAS12, CAS13, CAS14, CASΦ, CAS variants, Cfp1(CxxC-finger protein-1), ZEN(Zinc-finger nucleases) 및 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약물(drug)은 화합물 약물(chemical drug), 바이오 약물(bio drug), 핵산 약물(nucleic acid drug), 펩타이드 약물(peptide drug), 단백질 약물(protein drug), 천연물 약물(natural product drug), 호르몬(hormone), 조영제(contrast agent) 및 항체(antibody)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "조영제"라 함은 의학적 영상 촬영(imaging)에서 생체 내 구조 또는 유체의 조영을 위해 사용되는 모든 물질을 포함하는 광범위한 개념이다. 적합한 조영제는 방사선비투과 조영제(radiopaque contrast agent), 상자성 조영제(paramagnetic contrast agent), 초상자성 조영제(superparamagnetic contrast agent), CT (computed tomography) 조영제 및 기타 조영제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예를 들면, 방사선비투과 조영제(X-레이 영상용)는 무기 요오드 화합물 및 유기 요오드 화합물(예를 들면, 디아트리조아트), 방사선비투과 금속 및 그의 염(예를 들면, 은, 금, 백금 등) 및 기타 방사선비투과 화합물(예를 들면, 칼슘염, 황산바륨과 같은 바륨염, 탄탈룸 및 산화 탄탈룸)을 포함할 것이다. 적합한 상자성 조영제(MR 영상용)는 가돌리늄 디에틸렌 트리아민펜타아세트산(gadolinium diethylene triaminepentaacetic acid, Gd-DTPA) 및 그의 유도체, 및 기타 가돌리늄, 망간, 철, 디스프로시움(dysprosium), 구리, 유로피움(europium), 에르비움(erbium), 크롬, 니켈 및 코발트 복합체, 예를 들면, 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산(DOTA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,-N',N"-트리아세트산(D03A), 1,4,7-트리아자시클로노난-N,N',N"-트리아세트산(NOTA), 1,4,8,10-테트라아자시클로테트라데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (TETA), 히드록시벤질에틸렌-디아민 디아세트산(HBED) 등을 포함한다. 적합한 초상자성 조영제(MR 영상용)는 자철석(magnetite), 초상자성 산화철 (super-paramagnetic iron oxide, SPIO), 초소 초상자성 산화철(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO) 및 단결정성(monocrystailine) 산화철을 포함한다. 다른 적합한 조영제는 요오드화 및 비요오드화(non-iodinated), 이온성 및 비이온성 CT 조영제, 및 스핀-표지(spin-label)와 같은 조영제, 또는 기타 진단 활성제(diagnostically effective agent)이다.
상기 "바이오 약물"은 (오리지널) 생물학적 치료제(biologics) 및 바이오제네릭(biogenerics), 바이오베터(biobetters), 바이오서피어리어(biosuperiors) 등 다양한 바이오 의약품을 의미한다. 상기 바이오 약물은 생물학적 기원으로부터 제조, 분비 또는 반합성된 임의의 약물을 의미하며, 백신, 혈액 제제, 항원, 세포 제제, 유전자 치료제, 줄기세포 등을 모두 포함하며 이에 제한되지는 않는다.
상기 나노입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 양상은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 물질 전달용 조성물을 제공한다.
상기 물질 전달용 조성물은 생물학적 활성 물질을 생체 조직 또는 혈중으로 전달시키거나 세포 투과를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 조성물은 생체 조직을 구성하는 세포 또는 세포 간 연접을 통하여 전달될 수 있으나 전달 방식에는 제한이 없다.
상기 생체 조직은 하나 이상의 상피조직, 근육조직, 신경조직, 결합조직을 의미하며 각 장기는 하나 이상의 조직으로 이루어질 수 있으므로, 점막, 피부, 뇌, 폐, 간, 신장, 비장, 폐장, 심장, 위장, 대장, 소화관, 방광, 요관, 요도, 난소, 정소, 생식기, 근육, 혈액, 혈관, 림프관, 림프절, 흉선, 췌장, 부신, 갑상선, 부갑상선, 후두, 편도, 기관지, 폐포의 다양한 생체 장기가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 복합체를 특정 세포, 조직 또는 장기로 전달하고자 하는 경우, 상기 생물학적 활성을 갖는 물질은 특정 세포, 조직 또는 장기에서 특이적으로 발현하는 수용체와 선택적으로 결합할 수 있는 리간드의 세포외 부분 단백질, 또는 이들 수용체 또는 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체(mAb) 및 변형된 형태와 결합하여 복합체를 형성할 수 있다. 상기 펩타이드와 생물학적 활성을 갖는 물질의 결합은 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩타이드와 생물학적 활성을 갖는 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다.
상기 복합체를 포함하는 조성물이 약제학적 조성물로 이용되는 경우, 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 약 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 정맥내(intravenous), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 척수강내(intrathecal), 뇌실질내(intracerebroventricular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내로 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 상기 물질 전달용 조성물을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 물질 전달 방법을 제공한다.
상기 세포는 뇌혈관장벽 내피세포(brain endothelial cell), 암세포, 혈액세포(blood cell), 림프구(lymphocyte), 면역세포, 줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 신경줄기세포(neural stem cell; NSC), T 세포, B 세포, 자연살해세포(natural killer cell; NK cell), 대식세포(macrophage), 신경세포(neuron), 신경아교세포(glial cells), 미세아교세포(microglia), 성상세포(astrocyte) 및 근육세포(muscle cell)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 또한 상기 세포는 인간 및/또는 이를 제외한 포유동물의 세포일 수 있다.
본 발명에 따른 물질 전달기능을 가지는 세포 투과성 펩타이드는 매우 작은 펩타이드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다.
다른 양상은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있는데, 상기 DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이라면, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있고, 상기 코딩 서열은, 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 중복성(redundancy)의 결과로서, 동일한 폴리펩타이드를 인코딩한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 또한 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하는 대립(allelic) 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 대립 변이체는, 인코딩(암호화)되는 폴리뉴클레오티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는, 하나 이상의 뉴클레오티드들의 치환, 결실, 또는 부가를 가질 수 있는 폴리염기서열의 교대(alternate) 형태이다. 단일 아미노산이 하나 이상의 뉴클레오티드 코돈에 의해 인코딩될 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 펩타이드를 암호화하는 교대 폴리뉴클레오티드를 제조하도록 용이하게 변형될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다.
일 양상에 따른 신규한 세포 투과성 펩타이드는 우수한 세포 투과능을 가지므로 생물학적 활성을 갖는 물질을 세포, 조직 등 생체 내로 효과적으로 전달할 수 있어 기초연구 분야, 다양한 질병의 진단 및 치료 분야 등에서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 참조 펩타이드의 기본 골격에서 N-말단으로부터 1번째 위치의 아미노산이 필수적으로 치환되고 이외 3번째, 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군(#1 내지 #10)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 참조 펩타이드의 기본 골격에서 N-말단으로부터 1번째 위치의 아미노산을 S로 치환하고, 3번째 아미노산을 H로 보존하면서, 동시에 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함한 펩타이드 후보군(#11 내지 #19)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 참조 펩타이드의 기본 골격에서 N-말단으로부터 3번째 또는 5번째의 아미노산이 A로 치환되고 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군(#20 내지 #30)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 참조 펩타이드의 기본 골격에서 N-말단으로부터 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군(#31 내지 #40)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 참조 펩타이드의 기본 골격에서 N-말단으로부터 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군(#40 내지 #54) 에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 일 실시예에 따른 제1 펩타이드 후보군에서, 아미노산의 치환 없이 펩타이드의 길이만을 변형시킨 펩타이드 후보군 (#55 내지 #64)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 일 실시예에 따른 제1 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 3번째, 8번째, 14번째, 및 15번째 위치에서의 적어도 1 이상의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군 (#65 내지 #77)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 일 실시예에 따른 제2 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 3번째 또는 5번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군 (#78 내지 #92)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 일 실시예에 따른 제2 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 7번째 및/또는 8번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군 (#93 내지 #103)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 일 실시예에 따른 제2 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 8번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군 (#104 내지 #114)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10b는 일 실시예에 따른 제2 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 8번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군 (#115 내지 #124)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10c는 일 실시예에 따른 제2 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 8번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군 (#125 내지 #136)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 일 실시예에 따른 제2 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 11번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군(#137 내지 #145)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12은 일 실시예에 따른 제2 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 14번째 위치, 또는 8번째 및 14번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군 (#146 내지 #157)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 일 실시예에 따른 제2 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 15번째 위치, 또는 8번째 및 15번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군 (#158 내지 #164)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 일 실시예에 따른 제3 펩타이드 후보군에서, 아미노산의 치환 없이 펩타이드의 길이만을 변형시킨 펩타이드 후보군 (#165 내지 #173)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15은 일 실시예에 따른 제3 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 8번째 또는 14번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군 (#174 내지 #183)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 일 실시예에 따른 제3 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 8번째, 14번째, 및 16번째 위치에서의 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군 (#184 내지 #201)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 일 실시예에 따른 제3 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 8번째, 14번째, 및 16번째 위치에서의 3개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군 (#202 내지 #216)에 대한 세포 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 16-mer 세포 투과성 펩타이드 후보군 설계 및 합성
1-1. 세포 투과성 펩타이드 후보군 설계
본 실시예에서는 한국 특허출원 제2020-0049621호의 펩타이드 (GHHERLKSDEWSVTSG 이하, 참조 펩타이드로 명명함.)를 기본으로 하여, 다양하게 변형된 서열을 갖는 세포 투과성 펩타이드를 설계 및 합성하였다. 상기 참조 펩타이드의 서열 및 구조를 고려하여, 2번째 위치의 아미노산 (H), 4번째 위치의 아미노산 (E), 6번째 위치의 아미노산 (L), 9번째 위치의 아미노산 (D), 10번째 위치의 아미노산 (E), 12번째 위치의 아미노산 (S), 13번째 위치의 아미노산 (V) 및 16번째 위치의 아미노산 (G)은 변형시키지 않은 채, 나머지 위치의 아미노산들을 치환시키는 방식으로, 세포 투과성 펩타이드 후보군을 설계하였다.
1-2. 펩타이드 후보군의 합성 및 분리 정제
본 발명자들은 상기 실시예 1-1에 기재된 각 펩타이드를 합성하기 위하여 고체상 펩타이드 합성(Solid state peptide synthesis, SPPS) 방법을 이용하였다. 상기 방법은 레진의 N-말단에 N-말단이 F-moc로 보호되어 있는 아미노산의 C-말단을 하나씩 결합하는 유기합성법이다. 모든 반응의 용매는 N,N-다이메틸포름아마이드 (N,N-dimethylformamide; DMF)를 이용하였으며, 아미노산 커플링 조건은 2M 농도의 아미노산 용액을 0.5M DIC (N,N-Diisopropylcarbodiimide, DIC) 1 ml, 1 M Ethyl cyanohydroxyiminoacetate (Oxyma) 0.5 ml와 혼합하여 마이크로웨이브 합성기(Microwave synthesizer)에서 반응시켜 진행하였다. 또한 각 아미노산 서열마다 반응시간, 온도 또는 마이크로웨이브의 전압을 달리하여 아미노산을 제조하였다. 다음 아미노산을 합성하기 위해서는 이전 아미노산의 F-moc을 제거해야 하기 때문에 이를 위해 80% DMF와 20% 피페리딘(piperidine) 용액을 사용해 F-moc 보호기를 80℃에서 2분 동안 2회 디프로텍팅(deprotecting) 시켰다. 모든 커플링 과정 및 디프로텍팅 과정 사이에는 DMF와 염화메틸렌(dichloromethane, DCM)을 이용해 교대로 3회씩 세척하는 과정을 수행하였다.
상기 방법을 통해 합성된 펩타이드에 대하여, 추후 세포 투과성 여부를 관찰하고 정량화하기 위해 펩타이드의 N-말단에 카르복실기 (-COOH)를 포함하는 형광물질을 화학적 결합방법으로 연결할 수 있다. 이때 사용할 수 있는 상기 형광물질로는 5-FAM (5-carboxyfluorescein), FITC (Fluorescein-5-isothiocyanate), 시아닌 3 카르복시산(Cyanine 3 carboxylic acid), 시아닌 5 카르복시산(Cyanine5 carboxylic acid), 시아닌 7 카르복시산(Cyanine 7 carboxylic acid) 등이 있으며, 상기 형광물질 중 하나 이상을 사용할 수 있다.
이를 위해, 본 발명자들은 먼저 고체상의 레진에 합성된 펩타이드의 마지막 아미노산을 합성한 뒤 5-FAM : DIC : Oxyma : 레진을 2 : 2.5 : 4 : 1 비율로 잘 혼합시킨 후 상기 레진에서의 반응을 상온에서 2시간 동안 진행하되, 교반기(magnetic stirrer)를 이용하였다. 다음으로, 상기 합성과정 중 레진 색이 노란색에서 진한 노랑 또는 주황빛으로 변하면 DMF와 염화메틸렌을 교대로 3회씩 세척하는 과정을 실시하였다. 이어서 고체상 레진으로부터 펩타이드/5-FAM을 분리하기 위해 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid; TFA) : 트리이소프로필실란(Triisopropylsilane; TIS) : 증류수가 95 : 2.5 : 2.5로 혼합된 클리비지 용액에서 합성이 완료된 레진을 교반기를 이용해 2시간 동안 반응을 진행한 후 석면필터로 레진을 걸러 내었다. 걸러진 용액에서 용액은 질소 기체 하에서 증발시키고 침전물이 생기면 차갑게 보관한 다이에틸 에테르(diethyl ether)로 침전시켰다. 침전된 펩타이드/5-FAM은 진공상태에서 건조시킨 후 증류수로 녹여 동결건조 하였다.
동결건조된 펩타이드는 증류수나 아세토니트릴(Acetonitrile, ACN) 등으로 용해시키고 역상 고성능 액체 크로마토그래피(Reverse phase High-performance liquid chromatography)를 사용하여 분리 및 정제하였다. 이 때 상기 HPLC의 이동상 용매로는 Solvent A(증류수 99.9%, TFA 0.1%)와 Solvent B(증류수 9.9%, 아세토니트릴 90%, TFA 0.1%)를 사용하였다. HPLC 이동상은 Solvent A 90%와 Solvent B 10%로 시작하여 Solvent B를 1%/min gradient로 증가시키며 분리를 진행하였다. 이후 분리된 펩타이드 용액은 동결건조하여 용매를 제거하고 이후 원하는 용매에 녹여 실험을 진행하였다.
실시예 2. 16-mer 세포 투과성 펩타이드 후보군의 인비트로 세포 투과성 분석
2-1. 실험 방법
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 합성한 펩타이드 후보군들의 세포 투과성을 평가하기 위하여, 인비트로에서 뇌혈관장벽세포에 대한 투과성 분석을 실시하였다.
구체적으로, 인간 뇌혈관장벽세포인 hCMEC/D3 세포를 384웰 플레이트에 분주하고, 세포가 플레이트 면적의 80~90%에 도달할 때까지 상피세포 성장 배지인 EGM(endothelial cell growth medium)에서 37℃, CO2 조건으로 밤새 배양하였다. 이어서 상기 실시예 1-2에서 제조한 FAM이 연결된 후보군 펩타이드들 및 음성대조군인 FAM 단독을 10uM로 성장인자가 없는 상기 배지에 희석하여 각 웰당 10μL씩 처리할 양을 제조하였다. 이어서 40μL의 세포가 배양되어 있는 플레이트에 상기 펩타이드를 희석하여 미리 제조한 용액을 웰당 10μL씩 처리한 후 2시간 동안 37℃ CO2 조건으로 배양하였다. 다음으로, 각 웰에서 펩타이드를 처리한 용액을 모두자동 플레이트 세척기로 제거하고, 1x PBS로 3회씩 세척하는 과정을 거친 후, 4% paraformaldehyde를 웰당 75μL씩 처리 후, 15분 동안 상온에서 세포를 고정하였다. 15분 뒤, 1x PBS로 3회 세척하는 과정을 반복한 후, Hoechst 33342를 1x PBS에 1:5000으로 희석하여 각 웰에 40μL씩 첨가하고, 15분 동안 상온에서 처리한 후 3회 씻어내었다. 다음으로 Cytation 5 장비로 DAPI를 기준으로 하여 초점을 맞춘 후 DAPI를 중심으로 20μm 크기로 세포의 구획을 정하고 이 크기의 세포만을 선택하여 FAM 형광을 이미지 리딩(image reading)한 후, 영상 처리하여 Mean-FAM value를 구하고 FAM 실험군을 음성대조군으로 보정한 그래프를 만들어 뇌혈관장벽세포 투과도를 계산하였다. 통계는 ONE-WAY ANOVA 분석으로 진행했고 multiple comparison(다중 비교)은 FAM 값을 대조군으로 하여 구하고 Bonferroni 방법(95% 신뢰도)으로 보정하였다(mean±SEM, *p<0.1, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001).
2-2. N-말단으로부터 1번째 위치의 아미노산을 필수적으로 치환하고 이외의 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군의 세포 투과성 분석
상기 실시예 1-1에서 설계한 대로, 참조 펩타이드에서 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 펩타이드를 기본 골격으로 하여, 나머지 위치의 아미노산들을 다양하게 변형시킨 펩타이드 후보를 설계하였다. 다만, 변형된 펩타이드 중 변형이 나타나지 않은 아미노산 서열의 위치는 기본 골격의 서열이 보존되었다. 구체적으로, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 1번 위치의 아미노산을 필수적으로 치환하고, 이외 3번째, 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함한 총 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군을 설계하였으며, 구체적인 서열정보를 하기 표 1에 나타내었다. 표 1에서 진하게 표시된 부분은 아미노산이 치환된 영역을 나타내는 것이다.
[표 1]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000001
상기 펩타이드 후보군에서의 세포투과성을 확인한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 상기 표 1의 #1 내지 #10에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
2-3. N-말단으로부터 1번째 위치의 아미노산이 S로의 치환 및 3번째 위치의 아미노산이 H로 보존되나, 이외의 위치에서 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군의 세포 투과성 분석
상기 실시예 1-1에서 설계한 대로, 참조 펩타이드에서 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 펩타이드를 기본 골격으로 하여, 나머지 위치의 아미노산들을 다양하게 변형시킨 펩타이드 후보를 설계하였다. 다만, 변형된 펩타이드 중 변형이 나타나지 않은 아미노산 서열의 위치는 기본 골격의 서열이 보존되었다. 구체적으로, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 1번 위치의 아미노산을 S로 치환하고, 이외 3번째 아미노산을 H로 보존하고, 동시에 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함한 총 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군을 설계하였으며, 구체적인 서열정보를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에서 진하게 표시된 부분은 아미노산이 치환된 영역을 나타내는 것이다.
[표 2]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000002
상기 펩타이드 후보군에서의 세포투과성을 확인한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 상기 표 2의 #11 내지 #19에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
2-4. N-말단으로부터 3번째 또는 5번째의 아미노산이 A로 치환되고 이외의 위치에서의 1개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군의 세포 투과성 분석
상기 실시예 1-1에서 설계한 대로, 참조 펩타이드에서 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 펩타이드를 기본 골격으로 하여, 나머지 위치의 아미노산들을 다양하게 변형시킨 펩타이드 후보를 설계하였다. 다만, 변형된 펩타이드 중 변형이 나타나지 않은 아미노산 서열의 위치는 기본 골격의 서열이 보존되었다. 구체적으로, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 채, 추가로 1번 위치의 아미노산을 치환없이 G로 보존하고, 이외 3번째 또는 5번째 아미노산을 A로 치환하였다. 동시에 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함한 총 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군을 설계하였으며, 구체적인 서열정보를 하기 표 3에 나타내었다. 표 3에서 진하게 표시된 부분은 아미노산이 치환된 영역을 나타내는 것이다.
[표 3]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000003
상기 펩타이드 후보군에서의 세포투과성을 확인한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 상기 표 3의 #20 내지 #30에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
2-5. N-말단으로부터 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군의 세포 투과성 분석
상기 실시예 1-1에서 설계한 대로, 참조 펩타이드에서 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 펩타이드를 기본 골격으로 하여, 나머지 위치의 아미노산들을 다양하게 변형시킨 펩타이드 후보를 설계하였다. 다만, 변형된 펩타이드 중 변형이 나타나지 않은 아미노산 서열의 위치는 기본 골격의 서열이 보존되었다. 구체적으로, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 채, 추가로 1번째 위치의 아미노산을 치환없이 G로 보존, 3번째 위치의 아미노산을 치환없이 H로 보존, 5번째 위치의 아미노산을 치환없이 R로 보존하고, 이외 7번째, 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 2개의 아미노산 치환이 존재하는 펩타이드 후보군을 설계하였으며, 구체적인 서열정보를 하기 표 4에 나타내었다. 표 4에서 진하게 표시된 부분은 아미노산이 치환된 영역을 나타내는 것이다.
[표 4]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000004
상기 펩타이드 군에서의 세포투과성을 확인한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 상기 표 4의 #31 내지 #40에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
2-6. N-말단으로부터 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드 후보군의 세포 투과성 분석
상기 실시예 1-1에서 설계한 대로, 참조 펩타이드에서 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 펩타이드를 기본 골격으로 하여, 나머지 위치의 아미노산들을 다양하게 변형시킨 펩타이드 후보를 설계하였다. 다만, 변형된 펩타이드 중 변형이 나타나지 않은 아미노산 서열의 위치는 기본 골격의 서열이 보존되었다. 구체적으로, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 2번째, 4번째, 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 아미노산을 보존한 채, 추가로 1번째 위치의 아미노산을 치환없이 G로 보존, 3번째 위치의 아미노산을 치환없이 H로 보존, 5번째 위치의 아미노산을 치환없이 R로 보존, 7번째 위치의 아미노산을 치환없이 K로 보존하고, 이외 8번째, 11번째, 14번째 및 15번째 위치에서 2개의 아미노산 치환이 존재하는 펩타이드 후보군을 설계하였으며, 구체적인 서열정보를 하기 표 5 나타내었다. 표 5에서 진하게 표시된 부분은 아미노산이 치환된 영역을 나타내는 것이다.
[표 5]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000005
상기 펩타이드 후보군에서의 세포투과성을 확인한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 상기 표 5의 #41 내지 #54에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 일 실시예에 따른 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로, N-말단으로부터 2번째 내지 6번째, 9번째, 10번째, 12번째, 13번째 및 16번째 위치의 아미노산인 영역의 보존과 함께 다른 위치에서의 아미노산이 치환된 경우에도, 우수한 세포 투과성을 나타내는 펩타이드의 고유한 구조가 유지됨을 알 수 있었다.
실시예 3. 16-mer 이외 세포 투과성 펩타이드 후보군의 제조
3-1. 세포 투과성 펩타이드 후보군 설계
본 실시예에서는 한국 특허출원 제10-2020-0049621호 펩타이드 (GHHERLKSDEWSVTSG, 이하, 참조 펩타이드로 명명함.)를 기본 골격으로 하여, 다양하게 변형된 서열 및 길이를 갖는 세포 투과성 펩타이드를 설계 및 합성하였다. 상기 참조 펩타이드의 서열 및 구조를 고려하여, 4번째 위치의 아미노산 (E), 6번째 위치의 아미노산 (L), 9번째 위치의 아미노산 (D), 10번째 위치의 아미노산 (E), 12번째 위치의 아미노산 (S), 및 13번째 위치의 아미노산 (V)은 변형시키지 않은 채, 나머지 위치의 아미노산들을 치환 또는 결실시키고 이들의 N- 및/또는 C-말단에 아미노산 서열을 추가하는 방식으로, 세포 투과성 펩타이드 후보군을 설계하였다.
이와 함께, 참조 펩타이드에서 1 및 2번째 위치의 아미노산이 AH이거나 부재하는 제1 펩타이드 후보군, 1 및 2번째 위치의 아미노산이 GH인 제2 펩타이드 후보군, 및 1 및 2번째 위치의 아미노산이 SH인 제3 펩타이드 후보군으로 분류하여 세포 투과성 펩타이드 후보군을 설계 및 합성하였다.
3-2. 펩타이드 후보군의 합성 및 분리 정제
본 발명자들은 상기 실시예 3-1에 기재된 각 펩타이드를 합성하기 위하여 고체상 펩타이드 합성(Solid state peptide synthesis, SPPS) 방법을 이용하였으며, 상기 실시예 1-2와 동일한 방식으로 펩타이드를 합성 및 분리 정제하였다.
실시예 4. 16-mer 이외 세포 투과성 펩타이드 후보군의 인비트로 세포 투과성 분석
4-1. 실험 방법
본 발명자들은 상기 실시예 3에서 합성한 16-mer 이외의 펩타이드 후보군들의 세포 투과성을 평가하기 위하여, 인비트로에서 뇌혈관장벽세포에 대한 투과성 분석을 실시예 2-1과 동일한 방식으로 실시하였다.
4-2. 제1 펩타이드 후보군에 대한 세포 투과성 분석
상기 실시예 3-1에서 설계한 대로, 제1 펩타이드 후보군에서, 아미노산의 추가적인 치환이 없거나, 또는 적어도 1 이상의 아미노산을 치환시킨 펩타이드를 대상으로 이의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였고, 이들의 세포 투과성을 확인하고자 하였다.
(1) 아미노산의 치환 없이 펩타이드의 길이만을 변형시킨 펩타이드 후보군
참조 펩타이드에서 1번째 및 2번째 위치의 아미노산이 AH이거나 부재하는 제1 펩타이드 후보군에서, 아미노산의 치환 없이 펩타이드의 길이만을 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였고, 구체적인 서열정보를 하기 표 6에 나타내었다. 표 6에서 진하게 표시된 부분은 참조 펩타이드와 상응하는 영역, 밑줄친 부분은 아미노산이 치환 또는 추가된 영역을 나타낸 것이다.
[표 6]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000006
상기 펩타이드 후보군에서의 세포 투과성을 확인한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 상기 표 6의 #55 내지 #64에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
(2) 1 이상의 아미노산의 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군
참조 펩타이드에서 1번째 및 2번째 위치의 아미노산이 AH이거나 부재하는 제1 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 3번째, 8번째, 14번째, 및 15번째 위치에서의 적어도 1 이상의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였고, 구체적인 서열정보를 하기 표 7에 나타내었다. 표 7에서 진하게 표시된 부분은 참조 펩타이드와 상응하는 영역, 밑줄친 부분은 아미노산이 치환 또는 추가된 영역을 나타낸 것이다.
[표 7]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000007
상기 펩타이드 후보군에서의 세포 투과성을 확인한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 상기 표 7의 #65 내지 #77에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 일 실시예에 따른 제1 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 비치환 또는 N-말단으로부터 3번째, 8번째, 14번째, 및 15번째 위치에서의 아미노산 치환과 함께 상기 펩타이드의 길이가 변형된 경우에도, 우수한 세포 투과성을 나타내는 펩타이드의 고유한 구조가 유지됨을 알 수 있었다.
4-3. 제2 펩타이드 후보군에 대한 세포 투과성 분석
상기 실시예 3-1에서 설계한 대로, 제2 펩타이드 후보군에서, 상기 펩타이드를 3개의 구역, 즉, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 3~6번(제1 영역), 7번~10번(제2 영역), 11번~16번(제3 영역) 위치 영역으로 나누고, 구역 별로 또는 2개 이상의 구역에서 하나 이상의 아미노산을 치환시킨 펩타이드를 대상으로 이의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였고, 이들의 세포 투과성을 확인하고자 하였다.
(1) 제1 영역 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군
참조 펩타이드에서 1번째 및 2번째 위치의 아미노산이 GH인 제2 펩타이드 후보군에서, 제1 영역, 구체적으로, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 3번째 또는 5번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였고, 구체적인 서열정보를 하기 표 8에 나타내었다. 표 8에서 진하게 표시된 부분은 참조 펩타이드와 상응하는 영역, 밑줄친 부분은 아미노산이 치환 또는 추가된 영역을 나타낸 것이다.
[표 8]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000008
상기 펩타이드 후보군에서의 세포 투과성을 확인한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 상기 표 8의 #78 내지 #92에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
(2) 제2 영역 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군
참조 펩타이드에서 1번째 및 2번째 위치의 아미노산이 GH인 제2 펩타이드 후보군에서, 제2 영역, 구체적으로, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 7번째 및/또는 8번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였고, 구체적인 서열정보를 하기 표 9 및 표 10에 나타내었다. 표 9 및 표 10에서 진하게 표시된 부분은 참조 펩타이드와 상응하는 영역, 밑줄친 부분은 아미노산이 치환 또는 추가된 영역을 나타낸 것이다.
[표 9]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000009
[표 10]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000010
상기 펩타이드 후보군에서의 세포 투과성을 확인한 결과, 도 9, 및 도 10a 내지 10c에 나타낸 바와 같이 상기 표 9의 #92 내지 #103, 표 10의 #104 내지 #136에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
(3) 제3 영역 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군
참조 펩타이드에서 1 및 2번째 위치의 아미노산이 GH인 제2 펩타이드 후보군에서, 제3 영역, 구체적으로, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 11번째, 14번째, 또는 15번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였고, 이와 함께, 제2 영역 아미노산 치환(8번째 위치)과 조합된 펩타이드 후보군을 추가적으로 설정하였으며 (#156, #163), 구체적인 서열정보를 하기 표 11, 표 12, 및 표 13에 나타내었다. 표 11, 표 12, 및 표 13에서 진하게 표시된 부분은 참조 펩타이드와 상응하는 영역, 밑줄친 부분은 아미노산이 치환 또는 추가된 영역을 나타낸 것이다.
[표 11]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000011
[표 12]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000012
[표 13]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000013
상기 펩타이드 후보군에서의 세포 투과성을 확인한 결과, 도 11 내지 도 13에 나타낸 바와 같이 상기 표 11의 #137 내지 #145, 표 12의 #146 내지 #157, 및 표 13의 #158 내지 #164에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 일 실시예에 따른 제2 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 3번째, 5번째, 7번째, 8번째, 11번째, 14번째, 및 15번째 위치에서의 아미노산 치환과 함께 상기 펩타이드의 길이가 변형된 경우에도, 우수한 세포 투과성을 나타내는 펩타이드의 고유한 구조가 유지됨을 알 수 있었다.
4-4. 제3 펩타이드 후보군에 대한 세포 투과성 분석
상기 실시예 3-1에서 설계한 대로, 제3 펩타이드 후보군에서, 아미노산의 추가적인 치환 없거나, 또는 적어도 1 이상의 아미노산을 치환시킨 펩타이드를 대상으로 이의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였고, 이들의 세포 투과성을 확인하고자 하였다.
(1) 아미노산의 치환없이 펩타이드의 길이만을 변형시킨 펩타이드 후보군
참조 펩타이드에서 1 및 2번째 위치의 아미노산이 SH인 제3 펩타이드 후보군에서, 아미노산의 치환 없이 펩타이드의 길이만을 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였고, 구체적인 서열정보를 하기 표 14에 나타내었다. 표 14에서 진하게 표시된 부분은 참조 펩타이드와 상응하는 영역, 밑줄친 부분은 아미노산이 치환 또는 추가된 영역을 나타낸 것이다.
[표 14]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000014
상기 펩타이드 후보군에서의 세포 투과성을 확인한 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이 상기 표 14의 #165 내지 #173에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
(2) 하나의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군
참조 펩타이드에서 1번째 및 2번째 위치의 아미노산이 SH인 제3 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 8번째 또는 14번째 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였고, 구체적인 서열정보를 하기 표 15에 나타내었다. 표 15에서 진하게 표시된 부분은 참조 펩타이드와 상응하는 영역, 밑줄친 부분은 아미노산이 치환 또는 추가된 영역을 나타낸 것이다.
[표 15]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000015
상기 펩타이드 후보군에서의 세포 투과성을 확인한 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 상기 표 15의 #174 내지 #183에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
(3) 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군
참조 펩타이드에서 1 및 2번째 위치의 아미노산이 SH인 제3 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 8번째, 14번째, 및 16번째 위치에서의 2개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였고, 구체적인 서열정보를 하기 표 16에 나타내었다. 표 16에서 진하게 표시된 부분은 참조 펩타이드와 상응하는 영역, 밑줄친 부분은 아미노산이 치환 또는 추가된 영역을 나타낸 것이다.
[표 16]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000016
상기 펩타이드 후보군에서의 세포 투과성을 확인한 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이 상기 표 16의 #184 내지 #201에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
(4) 3개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군
참조 펩타이드에서 1 및 2번째 위치의 아미노산이 SH인 제3 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 N-말단으로부터 8번째, 14번째, 및 16번째 위치에서의 3개의 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드의 길이를 변형시킨 펩타이드 후보군을 설계하였고, 구체적인 서열정보를 하기 표 17에 나타내었다. 표 17에서 진하게 표시된 부분은 참조 펩타이드와 상응하는 영역, 밑줄친 부분은 아미노산이 치환 또는 추가된 영역을 나타낸 것이다.
[표 17]
Figure PCTKR2022009320-appb-img-000017
상기 펩타이드 후보군에서의 세포 투과성을 확인한 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이 상기 표 17의 #202 내지 #216에 해당하는 서열의 펩타이드가 우수한 뇌혈관장벽세포로의 유입 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 일 실시예에 따른 제3 펩타이드 후보군에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치를 기준으로 비치환되거나, 또는 N-말단으로부터 8번째, 14번째, 및 16번째 위치에서의 아미노산 치환과 함께 상기 펩타이드의 길이가 변형된 경우에도, 우수한 세포 투과성을 나타내는 펩타이드의 고유한 구조가 유지됨을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (17)

  1. 하기 일반식 I로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 세포 투과성 펩타이드:
    [일반식 I]
    Xa-H-Xb-[E-X1-L]-Xc-Xd-[DE-X2-SV]-Xe-Xf-G
    상기 일반식 I에서,
    Xa는 Gly(G), Ala(A), 또는 Ser(S)이고;
    Xb는 His(H) 또는 Ala(A)이며;
    Xc는 Lys(K) 또는 Arg(R)이고;
    Xd는 Ser(S), Gln(Q), Leu(L), 또는 Ala(A)이며;
    Xe는 Thr(T), Lys(K), 또는 Arg(R)이고;
    Xf는 Ser(S), 또는 Gln(Q)이며;
    X1은 Arg(R), 또는 Ala(A)이고; 및
    X2는 Trp(W) 또는 Ile(I)인 것인, 세포 투과성 펩타이드.
  2. 하기 일반식 II로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 세포 투과성 펩타이드:
    [일반식 II]
    X1-[Xa-Xb-[E-Xc-L]-Xd-Xe-DE-Xf-SV-Xg-Xh]-X2
    상기 일반식 II에서, Xa는 GH, AH, SH, 또는 부재하고;
    Xb는 His(H) 또는 Ala(A)이며;
    Xc는 Arg(R) 또는 Ala(A)이고;
    Xd는 Lys(K) 또는 Arg(R)이며;
    Xe는 Ser(S), Cys(C), Ala(A), Leu(L), 또는 Gln(Q)이고;
    Xf는 Trp(W) 또는 Ile(I)이며;
    Xg는 Thr(T), Asn(N), Lys(K), 또는 Arg(R)이며;
    Xh는 SG, SV, SA, QG, 또는 부재하고; 및
    X1 및 X2는 부재하거나 적어도 하나 이상은 존재하며, 여기서, X1은 ESKAVKWSAL이고, X2는 G, GL, GLIES, GLIESESAET, 또는 GLIECESAET인 것인, 세포 투과성 펩타이드.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 하기 일반식 III로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 세포 투과성 펩타이드:
    [일반식 III]
    X1a-[Xaa-Xba-ERLK-Xca-DEWSV-Xda-Xea]-X2a
    상기 일반식 III 에서, Xaa는 AH 또는 부재하고;
    Xba는 His(H) 또는 Ala(A)이며;
    Xca는 Ala(A), Ser(S), 또는 Cys(C)이고;
    Xda는 Thr(T) 또는 Arg(R)이며;
    Xea는 SG, QG, 또는 부재하고; 및
    X1a 및 X2a는 부재하거나 적어도 하나 이상은 존재하며, 여기서, X1a는 ESKAVKWSAL이고, X2a는 G, GL, GLIES, GLIESESAET, 또는 GLIECESAET이다.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 하기 일반식 IV로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 세포 투과성 펩타이드:
    [일반식 IV]
    X1b-[GH-Xab-[E-Xbb-L]-Xcb-DE-Xdb-SV-Xeb-Xfb]-X2b
    상기 일반식 IV에서, Xab는 His(H) 또는 Ala(A)이고;
    Xbb는 Arg(R) 또는 Ala(A)이며;
    Xcb는 KS, KA, KQ, KL, KC, RS, 또는 RC이고;
    Xdb는 Trp(W) 또는 Ile(I)이며;
    Xeb는 Thr(T), Lys(K), 또는 Arg(R)이고;
    Xfb는 SG, QG, 또는 부재하며; 및
    X1b 및 X2b는 부재하거나 적어도 하나 이상은 존재하며, 여기서, X1b는 ESKAVKWSAL이고, X2b는 G, GL, GLIES, GLIESESAET, 또는 GLIECESAET이다.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 하기 [일반식 V]로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 세포 투과성 펩타이드:
    [일반식 V]
    X1c-[SHHERLK-Xac-DEWSV-Xbc-Xcc]-X2c
    상기 일반식 V 에서, Xac는 Ser(S) 또는 Cys(C)이고;
    Xbc는 Asn(N) 또는 Thr(T)이며;
    Xcc는 SG, SV, SA 또는 부재하고; 및
    X1c 및 X2c는 부재하거나 적어도 하나 이상은 존재하며, 여기서, X1c는 ESKAVKWSAL이고, X2c는 G, GL, GLIES, GLIESESAET, 또는 GLIECESAET이다.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 54로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 55 내지 서열번호 216으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드.
  8. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 세포는 뇌혈관장벽 내피세포(brain endothelial cell), 암세포, 혈액세포(blood cell), 림프구(lymphocyte), 면역세포, 줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 신경줄기세포(neural stem cell; NSC), T 세포, B 세포, 자연살해세포(natural killer cell; NK cell), 대식세포(macrophage), 신경세포(neuron), 신경아교세포(glial cells), 미세아교세포(microglia), 성상세포(astrocyte) 및 근육세포(muscle cell)로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드.
  9. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 세포 투과성 펩타이드 및 생물학적 활성 물질을 포함하는, 복합체.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 생물학적 활성 물질은 단백질, 화합물(chemical compound), 당단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 천연물(natural product), 반합성 물질(semi-synthetic drug), 마이크로입자, 나노입자, 바이러스, 양자점(quantum dots), 리포좀 및 형광색소(fluorochrome)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 복합체
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 생물학적 활성 물질은 항체(antibody), 약물(drug), 효소(enzyme), 핵산분해효소(nuclease), 호르몬, 사이토카인(cytokine), 전사인자(transcription factor) 및 독소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 복합체
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 핵산은 DNA, RNA, ASO(Antisense oligonucleotide), 마이크로RNA(microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 원형 RNA(circular RNA), 긴 비암호화 RNA(long noncoding RNA; lncRNA), 작은 활성화 RNA(small activating RNA; saRNA), 전령 RNA(messenger RNA; Mrna), 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 복합체.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 핵산분해효소는 CAS9(CRISPR associated protein 9), CAS12, CAS13, CAS14, CASΦ, CAS variants, Cfp1(CxxC-finger protein-1), ZEN(Zinc-finger nucleases) 및 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 복합체.
  14. 청구항 9의 복합체를 포함하는, 물질 전달용 조성물.
  15. 청구항 14의 조성물을 인간을 제외한 포유동물의 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 물질 전달방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 세포는 뇌혈관장벽 내피세포(brain endothelial cell), 암세포, 혈액세포(blood cell), 림프구(lymphocyte), 면역세포, 줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 신경줄기세포(neural stem cell; NSC), T 세포, B 세포, 자연살해세포(natural killer cell; NK cell), 대식세포(macrophage), 신경세포(neuron), 신경아교세포(glial cells), 미세아교세포(microglia), 성상세포(astrocyte) 및 근육세포(muscle cell)로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는, 물질 전달방법.
  17. 청구항 1 또는 청구항 2에 따른 펩타이드를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
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