WO2017188731A1 - 경구 투여용 유전자 전달을 위한 나노입자 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

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WO2017188731A1
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이용규
이동윤
강성훈
비슈누레부리
현은주
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한국교통대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to targeted nanoparticles for efficient oral administration of genes, and more particularly, to gene delivery nanoparticles comprising ionic polymers and genes to which bile acids or bile acid derivatives are covalently bound, and pharmaceutical compositions comprising the same. It is about.
  • the present invention relates to a gene delivery nanoparticles and pharmaceutical compositions comprising the same for delivering genes or therapeutic proteins to small intestine cells to be targeted and minimizing side effects and providing the efficiency of current therapeutic techniques.
  • Gene therapy which treats a disease by delivering a therapeutic gene to a desired organ in the body and expressing a new protein in a cell, is not a treatment for a symptom of the disease, but a method of removing the cause of the disease.
  • Gene therapy has a superior selective treatment effect compared to treatment with general drugs, and can be applied for a long time by improving the treatment rate and treatment speed of diseases that are difficult to control with other treatments.
  • Gene therapy is the next generation treatment technology described for the treatment of various diseases, but when the macromolecules such as DNA and RNA are delivered into the cells in aqueous solution, they are rapidly degraded by specific enzymes in vivo and have low cell transfer rates. In order to be effective, it is essential to develop a gene carrier for safely delivering a therapeutic gene to a desired target cell to obtain high expression efficiency.
  • Gene carriers should be low or non-toxic and capable of delivering genes to the cells of interest selectively and effectively. These gene carriers can be largely divided into viral and non-viral.
  • the viral vector is a retrovirus (RV), adenovirus (AV), adeno-associated virus (AAV) and the like as a gene carrier, a non-viral vector (non While gene transfer efficiency is higher than that of -viral vector, the immune response or cancer induced by the vector itself is a problem when applied in the body, and there is a limit in the size of the gene that can be inserted into the vector.
  • RV retrovirus
  • AV adenovirus
  • AAV adeno-associated virus
  • Non-viral vectors such as polymers and nanoparticles
  • methods using non-viral vectors such as cationic polymers have been studied a lot due to the simplicity of the manufacturing method and the relatively low risk.
  • the specific mechanism is to stabilize the gene by forming a complex through electrostatic interaction with the negatively charged gene, and after the complex binds to the cell surface by electrical interaction between the positive charge on the surface and the negative charge on the cell surface, the endosome Genes are released into the cytoplasm).
  • cationic polymers include cationic homopolymers such as protamine, polyethyleneimine (PEI), polyamidoamine, poly-L-lysine (PLL), polyaminoester, polypropyleneimine and polyethylene glycol Cationic block copolymers such as (PEG) -block-polyL-lysine and PEG-PEI, and the like, which compresses genes such as DNA to form nanoparticles to protect genes from enzymatic degradation and to rapidly It penetrates into the cell and helps it escape from the endosome.
  • PEI polyethyleneimine
  • PLL polyamidoamine
  • PLL poly-L-lysine
  • PEG polyethylene glycol Cationic block copolymers
  • PEG polyethylene glycol Cationic block copolymers
  • non-viral vectors have the advantages of biodegradability, low toxicity, non-immunogenicity, and ease of use compared to viral vectors, but problems such as relatively low transduction efficiency and limited particle size compared to viral vectors.
  • PEI Polyethyleneimine
  • Korean Laid-Open Patent Publication No. 10-2010-0122405 is a siRNA carrier in which siRNA is bound to an amphiphilic polymer nanoparticle, which is a complex in which a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer are bound, and a chitosan and polyethyleneimide, respectively, as bile acids.
  • Amphiphilic polymer nanoparticles in the form of nanoparticles prepared by combining complexes with - ⁇ -cholanic acid (5- ⁇ -cholanic acid) and then mixing the respective complexes are disclosed.
  • the document describes spherical self-assembly in aqueous systems due to amphipathicity of hydrophobic groups of bile acids and hydrophilic groups of chitosan and polyethyleneimine (PEI), and thus, chitosan-bile acid / polyethyleneimine (PEI) -bile acid composite nanoparticles It is disclosed that polyethyleneimine and chitosan, which have strong amphiphiles on the surface, and bile acids, which are hydrophobic, are located in the core. However, due to the seriousness of the toxicity of PEI, clinical trials are not accessible.
  • Diabetes mellitus is a metabolic disease that increases the concentration of glucose in the blood due to insufficient insulin secretion or normal function. Insulin is not properly secreted or secreted insulin does not work properly in the body It is called type 2 diabetes when it is uncontrolled and rises, and when blood sugar rises due to the inability to secrete insulin from the pancreas, it is called type 1 diabetes. In the case of type 1 diabetes, insulin administration therapy is necessary. Type 2 diabetes is based on lifestyle modifications and may require additional oral hypoglycemic agents. In the case of medicine to take once or three times a day, depending on the time of action of the drug or side effects slightly different.
  • glucagon like peptide 1 (GLP-1), an insulin secreting peptide, is an incretin hormone secreted by L-cells of the ileum and colon.
  • the main action of glucagon-like peptide-1 is to increase insulin secretion, and glucose secretion occurs due to the concentration of glucose, so hypoglycemia does not occur.
  • This feature is applied as a treatment method for type 2 diabetes, but since the blood half-life is very short in about 2 minutes, it has a big limitation in developing as a drug.
  • the glucagon-like peptide-1 agonist (agonist) developed and marketed accordingly is Exendin, a glucagon-like peptide-1 analog purified from the salivary glands of the glia monster. There are four.
  • DPP-IV Dipeptidyl peptidase-4
  • glucagon-like peptide-1 with resistance to DPP-IV (Dipeptidyl peptidase-4)
  • a method of increasing the resistance of DPP-IV alone cannot provide sufficient duration of physiological activity.
  • exendin-4 the patient is injected twice a day. It must be administered, and there is still a disadvantage that vomiting-induced nausea and nausea following administration are a great burden to the patient.
  • non-viral carriers that is, carriers using cationic lipids or polymers.
  • the efficiency of such nonviral carriers is less than that of viral carriers, but has the advantages of in vivo stability, easy production process, and low cost.
  • it is difficult to form a mixture due to its unique properties and weak anion.
  • the present inventors have conducted research to solve the above problems, the bile acid or bile acid derivatives include the surface-modified ionic polymer and gene, the ion complex of the ionic polymer and gene in the core of the nanoparticles for gene delivery
  • a bile acid or bile acid derivative having a hydrophilic ionic group on the surface of the nanoparticles it is possible to improve the stability in the body, to minimize the toxicity in vivo to reduce the above side effects, oral
  • the present invention has been found to be able to overcome the obstacles associated with administration.
  • an object of the present invention is a gene delivery nanoparticle capable of effectively delivering a therapeutic gene to a desired position in a cell, at least one ionic polymer covalently bound to a bile acid or bile acid derivative; And a gene, wherein the covalently bound bile acid or bile acid derivative is to provide a nanoparticle for gene delivery having an ionic group.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for treating diabetes comprising the nanoparticles for gene delivery as an active ingredient.
  • the present invention comprises one or more ionic polymers and genes in which the bile acid or bile acid derivative is covalently bonded, wherein the covalently bound bile acid or bile acid derivative comprises a nanoparticle for gene delivery having an ionic group to provide.
  • the ionic polymer may be a cationic polymer.
  • the cationic polymer may be selected from the group consisting of chitosan, protamine, poly-L-lysine (PLL: poly-L-lysine) and polyamidoamine (PAMAM: polyamidoamine).
  • the ionic polymer may be an anionic polymer, in this case further comprises a cationic polymer.
  • the anionic polymer may be selected from heparin (hyparin), hyaluronic acid (hyaluronic acid) and chondroitin sulfate (chondroitin sulfate), the cationic polymer is chitosan, glycochitosan, protamine, Poly-L-lysine (PLL) and polyamidoamine (PAMAM).
  • heparin hyperarin
  • hyaluronic acid hyaluronic acid
  • chondroitin sulfate chondroitin sulfate
  • PAMAM polyamidoamine
  • the ionic polymer covalently bonded to the bile acid or bile acid derivative may be covalently bonded through disulfide bonds.
  • the bile acid or derivative thereof is deoxycholic acid (deoxycholic acid), taurodioxycholic acid (taurodeoxycholic acid), taurocholic acid (TCA: taurocholic acid), glycocholic acid (glycocholic acid) and glycochenoxoxycholic acid (glycochenodeoxycholic acid), more preferably taurocholic acid (TCA).
  • the gene is single- or double-stranded DNA (deoxyribonucleic acid), single- or double-stranded RNA (ribonucleic acid), plasmid form DNA (plasmid DNA; pDNA), antisense oligonucleotide (oligonucleotide) , Ribozyme, catalytic RNA and nucleotides.
  • the gene may be at least one selected from plasmid form DNA (pDNA) and antisense oligonucleotides.
  • the gene is a glucagon-like peptide-1 gene (GLP-1, Gluca-1 like peptide-1 gene), GLP-1 peptide (GLP-1 peptide), GLP-1 variant, GLP-1 derivative, GLP-1 Agonist (GLP-1 agonist), liraglutide or exendin-4.
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1 gene
  • GLP-1 peptide GLP-1 peptide
  • GLP-1 variant GLP-1 derivative
  • GLP-1 Agonist GLP-1 agonist
  • liraglutide or exendin-4 a glucagon-like peptide-1 gene
  • the degree to which the bile acid or derivative thereof is covalently bonded according to the number of functional groups of the ionic polymer may vary, but preferably the bile acid or its derivative and the ionic polymer are 1: 1. It may be covalently bonded at a molar ratio of 300.
  • the gene delivery nanoparticles can be absorbed regardless of the particle size, but preferably may have a particle size of 500 nm or less.
  • the ionic polymer and gene covalently bonded to the bile acid or bile acid derivative may be combined in a molar ratio of 1: 1 to 1: 200.
  • the N / P ratio (the number of nitrogen atoms / phosphate atoms of the gene of the ionic polymer covalently bonded bile acid or bile acid derivative) of the nanoparticles for gene delivery may be 1 to 200. .
  • the present invention is a glucagon-like peptide-1 (GLP-1, Gluca-1 like peptide-1), GLP-1 peptide (GLP-1 peptide), GLP- 1 variant, GLP-1 derivative, GLP-1 agonist, Liraglutide or Exendin-4, wherein the covalently linked bile acid or bile acid derivative is ionic It provides a pharmaceutical composition for treating diabetes comprising nanoparticles for gene delivery having a group as an active ingredient.
  • the composition may be for oral administration.
  • Gene delivery nanoparticles according to the present invention is a new oral gene delivery system that can detect ingested meals and regulate blood sugar levels and insulin secretion in biological systems, including ionic polymers and genes in which bile acids or bile acid derivatives are covalently bound. do.
  • an ion complex in which a negatively charged gene is enclosed inside the cationic polymer is present in the core portion of the nanoparticle, and the cationic polymer Bile acids or derivatives thereof covalently bonded to are nanoparticles in which the bile acids or derivatives thereof are surface modified with a hydrophilic anionic group on the surface of the nanoparticles.
  • the nanoparticles for gene delivery of the present invention are ion complexes in which negatively charged genes are encapsulated inside the cationic polymer due to the electrostatic interaction between the negatively charged gene and the cationic polymer.
  • the cationic polymer of the complex and the anionic polymer covalently bonded to the bile acid having a hydrophilic anionic group or a derivative thereof are bonded by electrostatic interaction so that the bile acid or derivative thereof covalently bonded to the anionic polymer has a hydrophilic ionic group.
  • Bile acids or derivatives thereof, which are located on the surface of the nanoparticles in an excited form, are nanoparticles in surface modified form.
  • the gene-transfer nanoparticle of the present invention protects cationic polymers and genes from gastric acid through direct physical binding, and can be safely delivered to small intestine cells, and L- which expresses GLP-1 gene in small intestine cells. It can be used as a targeted nanoparticle to be expressed only in cells.
  • the genes in the gastrointestinal tract due to the ionic complexes present in the core of the nanoparticles as well as deliver the genes well through the intestinal mucosa It was very stable. From this it can be seen that the gene delivery nanoparticles according to the present invention is very suitable for oral administration.
  • the bile acid modified on the surface of the nanoparticles according to the present invention inhibits GI degradation of the nanoparticles and absorbs the ASBT (apical sodium bile acid transporter) receptor of the intestinal cell membrane in the ileum of the small intestine, thereby treating the gene into cells. Can deliver improved gene expression.
  • ASBT apical sodium bile acid transporter
  • GLP-1, GLP-1 peptide, GLP-1 variant, GLP-1 derivative, GLP-1 agonist, Liraglutide or exendin as therapeutic genes.
  • -4 (exendin-4) is used to enter bile acids and cationic polymers modified on the surface of the nanoparticles according to the present invention by the enzyme glutathione and pH in the intestinal cells to enter the portal vein, the isolated therapeutic gene It is delivered only to the nucleus of the cell, so that a large amount of GLP-1, GLP-1 peptide, GLP-1 variant, GLP-1 derivative, GLP-1 agonist, liraglutide ( Liraglutide) or exendin-4 are expressed to efficiently indicate the efficacy of diabetes treatment.
  • the gene delivery nanoparticles according to the present invention is successful GLP-1, GLP-1 peptide (GLP-1 peptide), GLP-1 variant, GLP-1 derivative, GLP-1 agonist (oral administration to diabetic mouse model) GLP-1 agonist, Liraglutide or Exendin-4 can be expressed and insulin secreted to lower blood sugar, effectively preventing or treating diabetes, especially type 2 diabetes. .
  • the present invention provides a novel oral gene delivery system comprising: at least one ionic polymer covalently linked to a bile acid or bile acid derivative; And a gene; wherein the covalently bound bile acid or bile acid derivative provides a nanoparticle for gene delivery having an ionic group.
  • Genes are in the form of large polymer chains charged with anions, and when they are present alone, they have the shape of relatively bulky random coils, which makes it difficult to transfer genes into cells, resulting in electrostatic interactions with these genes.
  • Cationic polymers that can form ionic complexes are used.
  • the nanoparticle for gene delivery of the present invention includes an ion complex of a gene and an ionic polymer, the ionic polymer forming the anionic gene and the ion complex is necessarily a cationic polymer, the cationic polymer is covalently bonded with bile acids It may be in the form.
  • Nanoparticles for gene delivery of the present invention is formed by the electrostatic interaction between the covalently bonded cationic polymer and the gene and bile acid or derivatives thereof, or the electrostatic discharge between the anionic polymer, cationic polymer and gene covalently bonded bile acids or derivatives thereof Formed by spontaneous interactions, it is possible to induce cell internalization of genes more safely.
  • the ionic complex of the cationic polymer and the gene is present in the core of the nanoparticle, and the bile acid having the hydrophilic ionic group is located on the surface of the nanoparticle, and the bile acid is surface modified.
  • bile acid surface modified nanoparticles of the present invention When bile acid surface modified nanoparticles of the present invention were used to deliver therapeutic genes to target cells, they were very stable in the gastrointestinal tract due to the well-transmitted genes through the intestinal mucosa and the ion complexes present in the nanoparticle cores. . From this it can be seen that the gene delivery nanoparticles according to the present invention is very suitable for oral administration.
  • the ionic polymer may be a cationic polymer.
  • the negatively charged gene forms an ion complex encapsulated inside the cationic polymer due to electrostatic interaction with the cationic polymer, and the formed ion complex is located at the core portion of the nanoparticle.
  • the bile acid or derivative thereof covalently bound to the cationic polymer is positioned on the surface of the nanoparticle in the form of a hydrophilic ionic group.
  • the cationic polymer is a non-toxic polymer having a weight average molecular weight of 100 to 100,000, for example chitosan (CS), glycochitosan, protamine (Prot), poly-L It may be selected from the group consisting of lysine (PLL: poly-L-lysine) and polyamidoamine (PAMAM: polyamidoamine), preferably chitosan (CS), protamine (Prot), poly-L-lysine (PLL) Or polyamidoamine (PAMAM).
  • CS chitosan
  • Prot protamine
  • PLL poly-L-lysine
  • PAMAM polyamidoamine
  • Chitosan is a very safe cationic polysaccharide that exists naturally in the structure of (1-> 4) 2-amino-2-deoxy- ⁇ -D-glucan.
  • Chitosan is a basic polysaccharide prepared by N-deacetylating chitin obtained from natural crustaceans and the like, and is known to exhibit biodegradability, biocompatibility, and low cytotoxicity.
  • Protamine is a natural cationic protein rich in arginine. It is a protein that is involved in the expression of genetic information through association or dissociation with DNA such as histones. Known. Typically, the molecular weight of protamine extracted from the sperm nucleus of fish is about 4,000 to 10,000, and 70% or more of the constituent amino acids are present as arginine, but the present invention is not limited thereto.
  • Protamine of the present invention includes both protamine itself and its pharmaceutically acceptable salts. Specifically, the salt of protamine of the present invention encompasses salt forms by acidic substances, including hydrochloride or sulfate. Protamine can be used in any form because it can be dissolved in water without salt formation, and the salt form can also be dissolved in water.
  • Poly-L-lysine (PLL: poly-L-lysine) is connected to peptide bonds, which are biodegradable, to form genes and ionic complexes that can be delivered into cells, but because they are somewhat toxic, There is a limit can be used to attach the endosomes destroying substances or endosomal fusion peptides.
  • the ionic polymer may be an anionic polymer, in this case necessarily further includes a cationic polymer to form an ion complex with the gene. That is, the negatively charged gene forms an ion complex encapsulated inside the cationic polymer due to the electrostatic interaction with the cationic polymer, and the formed ion complex is located at the core of the nanoparticle.
  • the anionic polymer is coupled to the cationic polymer of the ion complex by electrostatic interaction, and the bile acid or derivative thereof covalently bonded to the anionic polymer is positioned on the surface of the nanoparticle in the form of a hydrophilic ionic group. .
  • the anionic polymer may be selected from heparin (hyparin), hyaluronic acid (hyaluronic acid) and chondroitin sulfate (chondroitin sulfate), the cationic polymer is chitosan, glycochitosan, protamine, Poly-L-lysine (PLL) and polyamidoamine (PAMAM).
  • heparin hyperarin
  • hyaluronic acid hyaluronic acid
  • chondroitin sulfate chondroitin sulfate
  • PAMAM polyamidoamine
  • Heparin is a structure containing a hydroxyl group, a carboxyl group and an amino group, and can be used for non-fractionated heparin, high molecular weight heparin, low molecular weight heparin, heparin fragment, recombinant heparin, heparin analogue, heparan sulfate, sulfonated polysaccharide with heparin activity, and the like. Can be.
  • the bile acid or derivative thereof has a hydrophilic anionic group in addition to the functional group which can be covalently bonded to the ionic polymer, deoxycholic acid (DCA: deoxycholic acid), taurodioxy It may be selected from the group consisting of taurodeoxycholic acid, taurocholic acid (TCA), glycocholic acid (glycocholic acid) and glycochenodeoxycholic acid, more preferably hydrophilic It may be taurocholic acid (TCA) having four or more anionic groups.
  • DCA deoxycholic acid
  • TCA taurocholic acid
  • TCA glycocholic acid
  • glycochenodeoxycholic acid more preferably hydrophilic It may be taurocholic acid (TCA) having four or more anionic groups.
  • the bile acid is absorbed into the liver at a high efficiency of more than 95% through the ileum portion of the small intestine, which is called the 'enterohepatic circulation', and as a biological surfactant that plays an important role in the lipid migration to the intestinal circulation, Because it is specifically recognized by the ASBT (apical sodium-dependent bile acid transporter) present in the terminal intestinal part, it can act as a target ligand in oral delivery.
  • ASBT apical sodium-dependent bile acid transporter
  • the bile acid absorbed through the ileum portion is located on the surface of the gene delivery nanoparticles, so that the absorption of the gene delivery nanoparticles into the target cell through the intestinal lining, which is the biggest problem of the conventional oral administration method, is via ASBT. It serves to increase the [Fig. 1]. Because of this, the nanoparticles for gene delivery of the present invention can be used for oral use because it is easy to absorb through the ileum portion that absorbs bile acids, thereby increasing the bioavailability of the drug.
  • the ionic polymer covalently bonded to the bile acid or bile acid derivative may be covalently bonded through disulfide bonds.
  • Disulfide bonds are sensitive to glutathione secreted from enteric cells and have a tendency to be easily separated.
  • SS Disulfide bonds
  • the type of genes that can be bound to the nanoparticles for gene delivery of the present invention is not particularly limited, and according to the object of the present invention is delivered to a desired target to achieve any desired therapeutic effect
  • Genes are also included within the scope of the present invention.
  • the gene of the present invention may be a normal gene of a therapeutic gene associated with a disease, a gene for inhibiting expression of a target protein, a large or small polynucleotide including an antisense polynucleotide, or any RNA form including a ribozyme or siRNA. Genes may be included.
  • single- or double-stranded DNA deoxyribonucleic acid
  • single- or double-stranded RNA ribonucleic acid
  • plasmid form DNA plasmid DNA; pDNA
  • antisense oligonucleotides ribozymes, catalytic RNAs and nucleotides
  • the gene may be one or more selected from.
  • the gene may be at least one selected from plasmid form DNA (pDNA) and antisense oligonucleotides.
  • the gene may be a genetic drug, where the genetic drug refers to a gene that is medicinal for treating or preventing one or more diseases.
  • the gene is an insulin secreting peptide, which may be a gene encoding GLP-1, and preferably a glucagon-like peptide-1 gene (GLP-1, Glucagon like peptide-1 gene), or a GLP-1 peptide (GLP-1). peptide), GLP-1 variant, GLP-1 derivative, GLP-1 agonist, Liraglutide or Exendin-4.
  • GLP-1 gene and “GLP-1 variant” are used to refer to the nucleic acid (DNA) molecule encoding the gene.
  • the GLP-1 gene, GLP-1 variant or GLP-1 derivative may be expressed in a circular or linear plasmid.
  • the GLP-1 variant is GLP-1 (7-34), GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), Val 8 -GLP-1 (7-37), Gln 8 -GLP- 1 (7-37), D-Gln 9 -GLP-1 (7-37), Thr 18 -Lys 18 -GLP-1 (7-37), Lys 18 -GLP-1 (7-37), His 7 -GLP-1 (7-37), Ser 8 -GLP-1 (7-37) or Tyr 8 -GLP-1 (7-37), the sequence listing of which can be found in US 2013-0210717 A1. Known.
  • the GLP-1 gene, GLP-1 peptide, GLP-1 variant, GLP-1 derivative, GLP-1 agonist, liraglutide or exendin-4 ( By using exendin-4) complexed with the nanoparticles for gene delivery it can be obtained an excellent blood sugar lowering effect when administered in vivo, which can effectively treat or prevent diabetes, especially type 2 diabetes.
  • the degree to which the bile acid or derivative thereof is covalently bonded according to the number of functional groups of the ionic polymer.
  • the bile acid or its derivatives and ionic polymer may be covalently bonded in a molar ratio of 1: 1 to 1: 300.
  • the bile acids or derivatives thereof and cationic polymers may be covalently bonded at a molar ratio of 1: 1 to 1: 100.
  • the bile acids or derivatives thereof and heparin may be covalently bound in a molar ratio of 1: 1 to 1:30.
  • the bile acid or a derivative thereof and hyaluronic acid may be covalently bonded at a molar ratio of 1: 1 to 1: 200.
  • the gene delivery nanoparticles can be absorbed regardless of the particle size, preferably 500 nm or less, more preferably 100 to 300 nm.
  • the zeta potential of the nanoparticles for gene delivery may vary depending on the type of ionic polymer used on the surface of the nanoparticles, and specifically, bile acid or a derivative thereof is cationic Gene delivery nanoparticles formed by the electrostatic interaction between the polymer and the gene may exhibit a zeta potential in the range of 10 to 30 mV.
  • gene transfer nanoparticles formed by electrostatic interactions between anionic polymers, cationic polymers and genes to which bile acids or derivatives thereof are covalently bound may exhibit zeta potentials in the range of -10 to -30 mV.
  • the ionic polymer and gene covalently bonded to the bile acid or bile acid derivative may be combined in a molar ratio of 1: 1 to 1: 200, preferably in a molar ratio of 1: 1 to 1: 100. have.
  • the binding ratio is in the range of no side effects on the cell growth due to the expression rate of the gene and cytotoxicity due to the gene delivery nanoparticles delivered in the cell.
  • the amphiphilic polymer and gene covalently bonded to the bile acid or bile acid derivative is a weight ratio / mole ratio of 1: 1 to 1: 200, preferably a weight ratio / mole ratio of 1: 3 to 1: 30. It can be mixed with. Since the cationic polymer has a limit to bind and can be delivered only in a range capable of having an optimal strong binding capacity, the ion complex is well formed according to the electrostatic interaction between the cationic polymer and the gene within the above range. .
  • the anionic polymer, cationic polymer and gene covalently bonded to the bile acid or bile acid derivative is 3: 1: 1 to 10: 1: 200 weight ratio / molar ratio, preferably 3: 1 It may be mixed in a weight ratio / molar ratio of 1: 1 to 10: 1: 30.
  • the range is an optimum range that can maintain the bonding force by using charge to charge, the formulation is not made and the stability is lost when out of that range.
  • the N / P ratio of the gene transfer nanoparticles (number of nitrogen atoms / number of phosphate atoms of the gene of the ionic polymer, particularly amphiphilic polymer covalently bonded bile acid or bile acid derivative) is 1 To 200.
  • the N / P ratio is contained within the above range, the gene stabilization by the cationic polymer is well stabilized to increase the cell uptake rate and form a stable gene delivery nanoparticles.
  • the present invention is a glucagon-like peptide-1 (GLP-1, Gluca-1 like peptide-1), GLP-1 peptide (GLP-1 peptide), GLP- 1 variant, GLP-1 derivative, GLP-1 agonist, Liraglutide or Exendin-4, wherein the covalently linked bile acid or bile acid derivative is ionic It provides a pharmaceutical composition for treating diabetes comprising nanoparticles for gene delivery having a group as an active ingredient.
  • the gene delivery nanoparticles are a glucagon-like peptide-1 (Glucagon like peptide 1, GLP-1) gene, a GLP-1 peptide, a GLP-1 variant, and a GLP-1 derivative, a type of insulin secreting peptide.
  • GLP-1 agonist, liraglutide or exendin-4 as therapeutic genes are absorbed by target cells to increase insulin secretion and increase blood glucose levels Induce insulin secretion (Glucose dependent secretion) to prevent hypoglycemia. Therefore, it can be usefully used for the treatment of diabetes, especially type 2 diabetes.
  • active ingredient in the present invention, when the composition is administered to a subject, includes those having the activity of preventing or treating diabetes as compared to otherwise.
  • the subject may be one or more mammals, for example one selected from the group consisting of humans, mice, hamsters, dogs, cats, horses, cattle, pigs and goats.
  • prevention includes preventing the concentration of glucose in the blood from being higher than that in which the composition is not administered.
  • treatment includes lowering the concentration of glucose in the blood compared to when the composition is not administered.
  • composition of the present invention may include the nanoparticles for gene delivery alone or may further include one or more pharmaceutically acceptable carriers, adjuvant or excipients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a conventional formulation in the pharmaceutical field, for example, tablets, pills, hard and soft capsules, liquids, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, elixirs (elixirs) or the like for oral administration (elixirs) or It may be formulated as a parenteral formulation of sterile aqueous or oily solvent for intravenous, subcutaneous, sublingual, intramuscular administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and / or mineral oil, and the like, It is not limited to this.
  • Excipients that can be used in the pharmaceutical compositions of the present invention include sweeteners, binders, solubilizers, solubilizers, wetting agents, emulsifiers, isotonic agents, adsorbents, disintegrants, antioxidants, preservatives, lubricants, fillers, fragrances, and the like.
  • the ratio and nature of the can be determined by the solubility and chemical properties of the selected tablet, the chosen route of administration and standard pharmaceutical practice.
  • excipients include lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose, glycine, silica, talc, stearic acid, sterin, magnesium stearate, magnesium aluminum silicate, starch, gelatin, tragacanth rubber, alginine acid, Sodium alginate, methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, agar, water, ethanol, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, sodium chloride, calcium chloride, orange essence, strawberry essence, vanilla flavor and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in a parenteral dosage form, in which case, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration or topical administration may be used, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition is prepared as a solution or suspension by mixing the active ingredient, that is, the nanoparticles for gene delivery, in water with a stabilizer or buffer, and such a solution or suspension It may be prepared in unit dosage forms of ampoules or vials.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may more preferably be an oral dosage form.
  • composition of the present invention may be sterile, further include adjuvants such as preservatives, stabilizers, hydrating or emulsifiers, salts and / or buffers for the control of osmotic pressure, and further include other therapeutically useful substances. It may also be formulated according to conventional methods of mixing, granulating or coating.
  • the dosage for a mammal including a human may vary depending on the age, weight, sex, dosage form, health condition and degree of disease of the patient. It may be divided once or twice a day, or administered via oral or parenteral routes.
  • Hep Low-molecular weight heparin
  • MW: 83 kDa was purchased from Bioland Co., Ltd., Korea (PluronicTaurocholic acid sodium salt), DMF (dimethyl formamide), protamine (Prot), chitosan (CS), acetone, 4-NPC (4-methyl morpholin, 4-nitrophenyl chloroformate), TEA (trimethylamine) , NHS (N-hydroxysuccinimide), EDC (N- (3-Dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride), EDA (ethylene diamine) and cystamine dihydrochloride were purchased from sigma chemical.co (St.
  • CaCo2 cells, MDCK-ASBT and MDCK cell lines were purchased from Korea Cell Line Bank.
  • pDNA gene is Escherichia coli Plasmid DNA (Sigma-aldrich, Product Codes D4154 and D3404) derived from RR1 was used.
  • TCA taurocholic acid
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • TEA triethylamine
  • 4-NPC 4-nitrophenyl chloroformate
  • the reaction solution was dialyzed with distilled water for 2 days using a dialysis membrane (MWCO: 1000 Da) for 3 days while changing the medium every 6 hours. After dialysis the reaction was lyophilized to give Prot-TCA (78 ⁇ 2% yield, FIG. 2).
  • the Prot-TCA and CS-TCA were prepared by covalently bonding amine groups of Prot and CS to hydroxyl groups of TCA, respectively. To confirm this, Prot-TCA and CS-TCA were dissolved in 10 mg / mL in D2O, respectively, and then subjected to 1 H NMR analysis. The results are shown in FIGS. 3 and 5, from which peaks for amide bond conjugation between TCA and Prot and amide bond conjugation between TCA and CS were detected at ⁇ 8 ppm.
  • Example 3 Preparation of polyamidoamine covalently bonded to taurocholic acid (polyamidoamine-Taurocholic acid conjugate, hereinafter referred to as 'PAMAM-TCA')
  • PAMAM-TCA was prepared in the same manner as in Example 1, the structure was confirmed by FT-IR and FT-NMR (50% yield, Figure 6 ).
  • PLL-TCA was prepared in the same manner as in Example 1 except for using poly-L-lysine instead of Prot (Protamine), and the structure was confirmed by FT-IR and FT-NMR (yield 55%). , FIG. 7).
  • Example 5 Preparation of nanoparticles (hereinafter referred to as 'Prot-TCA / GLP-1') comprising a gene encoding GLP-1 and covalently bound taurocholic acid
  • Prot-TCA (1 mg / mL) dissolved in 10 mM HEPES buffer (pH 7.4) was used as stock solution.
  • a gene encoding GLP-1 (Glucagon like peptide-1) (7.780 mg) was dissolved in 10 mM HEPES buffer (pH 7.4) (1.922 mL) to prepare a GLP-1 gene solution.
  • GLP-1 gene solution (10 mL) was added dropwise to stock Prot-TCA solution (10 mL) under gentle vortex. Then, the reaction was left at room temperature for 1 hour and lyophilized for 2 days to obtain Prot-TCA / GLP-1 [Fig. 8].
  • CS-TCA / GLP-1 was obtained by the same method as Example 5 except for using CS-TCA instead of Prot-TCA of Example 5.
  • Prot-TCA / GLP-1 (Example 5) and CS-TCA / GLP-1 (Example 6) were dissolved at 1 mg / mL in D2O, respectively.
  • the nanoparticles have an average size of about 150 nm and have a relatively uniform size distribution.
  • the zeta potential of the nanoparticles prepared in Example 5 was measured using a zeta potential analyzer, indicating a positive zeta potential.
  • This positive charge means that the gene encoding the negatively charged GLP-1 is completely enclosed within the gene transfer complex, and the positive surface charge facilitates the entry of the gene transfer nanoparticles into the cell. .
  • the electrostatic repulsion force is generated between the particles to reduce the aggregation phenomenon between the particles.
  • the nanoparticles according to the present invention may be usefully used as gene carriers for delivering genes by forming complexes with genes.
  • Prot-TCA / GLP-1 (Example 5) and CS-TCA / GLP-1 (Example 6) were each stored for 48 hours at 37 ° C. under 20% serum and then treated with 0.5M EDTA. Then, 1% SDS was added to separate the gene encoding GLP-1 from each of Prot-TCA / GLP-1 (Example 5) and CS-TCA / GLP-1 (Example 6).
  • both Prot-TCA / GLP-1 (Example 5) and CS-TCA / GLP-1 (Example 6) were stable at pH 3 up to 24 hours.
  • GFP green fluorescent protein
  • the GLP-1 ELISA kit was used to quantify GLP-1 expression in vitro in response to sugar levels in the medium, resulting in improved expression of the gene encoding GLP-1.
  • mice Balb / c mice were kept in wooden cages and provided with food and water regularly. The animals were fasted for 12 hours prior to oral administration of the therapeutic gene complex. After 12 hours of fasting, each of the nanoparticles for gene delivery of Examples 5 and 6 containing 100 ⁇ g of the eGFP gene was administered by oral gavage. Animals were sacrificed 24 hours after administration and quantified in vivo gene expression and in vivo distribution of samples with confocal microscope.
  • the gene delivery nanoparticles of the present invention confirmed the enhanced eGFP gene expression in the ileum and liver fragments.
  • TCA covalently bound to protamine and chitosan prevented GI (gastrointestinal) degradation and helped the uptake and expression of eGFP.
  • ZDFRs Five-week-old Zucker diabetic fatty rats (ZDFRs) were kept in wooden cages and provided with food and water regularly. The animals were fasted for 12 hours prior to oral administration of the gene delivery nanoparticles of Examples 5 and 6. After 12 hours of fasting, 100 ⁇ g of the nanoparticles for gene delivery of Examples 5 and 6 were orally administered, respectively. Blood glucose levels were measured by taking blood from the tail vein at predetermined time intervals 24 hours after administration. Surprisingly, blood glucose levels were regulated to normal blood glucose levels. After 5 days, the animals were sacrificed and the expression of GLP-1 and insulin in the ileum and liver fragments was analyzed with an ELISA kit. As a result, improved expression of GLP-1 peptide and insulin protein was shown after oral administration of the gene delivery nanoparticles of the present invention compared to the control group.
  • the gene delivery complexes of the present invention are safe, non-toxic and can be used to treat diabetes.
  • Covalent bonds of taurocholic acid and protamine were prepared using triethylamine (hereinafter TEA) and 4-nitrophynyl chloroformate (hereinafter 4-NPC) for the hydroxyl group of taurocholic acid and the amine group of protamine.
  • TEA triethylamine
  • 4-NPC 4-nitrophynyl chloroformate
  • pDNA / Prot-TCA showed excellent stability under the above-described conditions, which can be explained by the increase in stability to pH due to the binding of taurocholic acid, a kind of bile acid.
  • pDNA / Prot not bound with taurocholic acid was used, and the size tended to increase with time at pH5.2, 7.4 and distilled water, and the size tended to decrease with time at pH1.8. Confirmed. In particular, the size tends to decrease at pH1.8 because protamines are vulnerable to acidic conditions, causing degradation and breaking physical bonds with pDNA.
  • the prepared pDNA / Prot-TCA is placed on a silicon wafer and then dried naturally to prepare a sample for analysis.
  • the analysis was performed by Scanning Electron Microscopy and photographed under the condition of 10.0kV and x2,000 magnification.
  • the prepared pDNA / Prot-TCA had a particle shape having a size of 100 nm, and all observed particles also had a tendency to have the same size.
  • HCT 116 cells were used to confirm the toxicity of the prepared pDNA / Prot-TCA, and MTT test method was used as a method for verifying toxicity.
  • protamine showed a survival rate of more than 85%, and covalently bound protamine between taurocholine also showed a high survival rate of more than 80%.
  • HCT 116 cells were used to confirm the cellular uptake of the prepared pDNA / Prot.
  • the experimental method was prepared by dispensing HCT 116 cells in 8 well plates at a concentration of 10 5 cell / well, and then injecting pDNA / Prot and pDNA / Prot-TCA combined with Rhdamine-B. After 2 hours of incubation, the cells were washed three times using PBS and observed using confocal microscopy.
  • Caco-2 cells were tested in single layer culture to verify cell permeability of pDNA / Prot-TCA. The test was run for a total of 6 hours, and samples were taken at 10, 30, 1, 2, 4 and 6 hours.
  • Rhodamine B-coupled protamine was used, and the mice used Balb / c 7 weeks of age. After 6 hours of fasting, oral administration of the drug was 0.2, 0.5 In vivo distribution at, 2, 6, 12, 24 hours was confirmed by fluorescence image and fluorescence values.
  • the pDNA / Prot-TCA was absorbed through the small intestine, the absorption proceeded in the small intestine within a short time within 30 minutes, and gradually removed after being absorbed into the liver for 2-6 hours. This is to follow the in vivo circulation of known taurocholic acid as it is, the pDNA / Prot-TCA prepared also does not interfere or harm the in vivo absorption of taurocholic acid, and verified to maintain the original circulation pathway It was.
  • TCA In order to conjugate TCA to chitosan, TCA (50 mmol) was dissolved in DMSO (10 mL), and 4-NPC (200 mg) and TEA (100 ⁇ g) were added thereto, and reacted at room temperature for 1 hour to prepare TCA-NPC. .
  • CS-TCA 150 nmol ⁇ 50 nmol
  • pDNA 1 nmol
  • pDNA 1 nmol
  • the prepared pDNA / CS-TCA was confirmed to maintain a very stable state for at least 24 hours.
  • Zeta potential analyzer was used to verify the production of pDNA / CS-TCA, and surface charge (mV) was measured to confirm the presence of the preparation.
  • pDNA / CS-TCA Conventional pDNA has -2.96 mV and chitosan has 36.12 mV. Since the pDNA / CS-TCA is prepared to have 19.55 ⁇ 25.68 mV, which is the pDNA / CS-TCA prepared by completely covering the surface of the pDNA of the anionic pDNA has a cation surface charge. This confirmed the complete preparation of pDNA / CS-TCA.
  • pDNA / CS-TCA showed excellent stability under the above-mentioned conditions, and it was found that the stability to pH was increased by binding of taurocholine acid, a kind of bile acid.
  • MDCK-ASBT cells were used to confirm the toxicity of the prepared pDNA / CS-TCA, and MTT test method was used as a method for verifying toxicity.
  • pDNA / CS-TCA was confirmed to show a high survival rate of more than 80%.
  • MDCK-ASBT cells were used to confirm the cellular uptake capacity of the prepared pDNA / CS-TCA.
  • the experimental method was prepared by dispensing MDCK-ASBT cells in 8 well plates at a concentration of 10 5 cell / well, and then injected with sample Rhdamine-B-coupled pDNA / Chitosan and pDNA / CS-TCA. After 2 hours of incubation, three washes were performed using PBS and observed using confocal microscopy.
  • the pDNA / CS-TCA has a superior cell uptake capacity than the control pDNA / Chitosan, the number was confirmed to be about 2 times or more.
  • Caco-2 cells were tested in single layer culture to verify cell permeability of pDNA / CS-TCA. The test was run for a total of 6 hours, and samples were taken at 10, 30, 1, 2, 4 and 6 hours.
  • the pDNA / CS-TCA has a superior cell permeability than the control pDNA / Chitosan, which can be seen that the subsequent absorption of pDNA / CS-TCA through the small intestine in animal experiments.
  • Luciferase method was used to verify gene expression effects of pDNA / CS-TCA.
  • PDNA, pDNA / Chitosan and bPEI were used as controls.
  • pDNA / CS-TCA had at least 2 times up to 50 times more effects than pDNA and pDNA / Chitosan, which were negative controls, and had better gene transfer effect than bPEI, a positive control group.
  • Rhodamine B-coupled chitosan was used, and the mice used Balb / c 7 weeks of age, and after 6 hours of fasting, the drug was orally administered at 12 hours. In vivo distribution of was confirmed by fluorescence image.
  • pDNA / CS-TCA is absorbed through the small intestine, in particular, the ileum, and the absorption progresses in the liver. It follows the in vivo circulation pathway of known taurocholic acid as it is, and the pDNA / Chitosan-TCA prepared also does not interfere or harm the in vivo absorption of taurocholic acid, and maintains the original circulation pathway. It was.
  • TCA In order to conjugate TCA to chitosan, TCA (50 mmol) was dissolved in DMSO (10 mL), and 4-NPC (200 mg) and TEA (100 ⁇ g) were added thereto, and reacted at room temperature for 1 hour to prepare TCA-NPC. .
  • Polyamidoamine 100 mg was dissolved in HEPES buffer solution and the prepared TCA-NPC (20 mg) was added and stirred for 24 hours. After the dialysis to remove the unreacted, the dialysis was performed using a 1 kDa brain filter vessel dialysis in distilled water for 24 hours. After lyophilization, the final obtained product PAMAM-TCA was obtained.
  • PAMAM-TCA 150 nmol ⁇ 50 nmol
  • pDNA 1 nmol
  • PAMAM-TCA 150 nmol ⁇ 50 nmol
  • pDNA 1 nmol
  • TCA In order to conjugate TCA to chitosan, TCA (50 mmol) was dissolved in DMSO (10 mL), and 4-NPC (200 mg) and TEA (100 ⁇ g) were added thereto, and reacted at room temperature for 1 hour to prepare TCA-NPC. .
  • Poly-L-lysine 50 mg was dissolved in HEPES buffer solution and TCA-NPC (20 mg) prepared was added and stirred for 24 hours. After the dialysis to remove the unreacted, the dialysis was performed using a 1 kDa brain filter vessel dialysis in distilled water for 24 hours. After the freeze-drying to obtain the final product PLL-TCA.
  • Hep-S-S-TCA The synthesis of Hep-S-S-TCA began with a conjugate of heparin and cystamine. That is, the carboxyl group of heparin was covalently bonded to the amine group of cystamine through EDC (1-ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) / NHS (N-bromosuccinimide) chemistry.
  • Heparin 100 mg was dissolved in 10 mL of MES buffer (50 mmol, pH 6) and stirred in a cold bath until the solution became clear. Excess EDC (2.4 equivalents to heparin) was added and stirred for 10 minutes, then excess NHS (2.5 times equivalent to EDC) was added at room temperature and stirred for 10 minutes. After carboxyl activity by EDC and NHS, cystamine (100 ⁇ g) was added and reacted at pH 7 for 24 hours. After the reaction was dialyzed with secondary distilled water for 24 hours and lyophilized to obtain Hep-S-S-NH2 (Fig. 9).
  • TCA In order to conjugate TCA to activated heparin, TCA (50 mmol) was dissolved in DMSO (10 mL), and then 4-NPC (200 mg) and TEA (100 ⁇ g) were added and reacted at room temperature for 1 hour to give TCA-NPC. Prepared (FIG. 10).
  • Hep-S-S-TCA was synthesized to locally release therapeutic genes in response to intracellular glutathione concentrations, and FIGS. 9-11 illustrate a scheme for preparing Hep-S-S-TCA.
  • Protamine (150 nmol to 50 nmol) and pDNA (1 nmol) are prepared by adding HEPES buffer solution, respectively. After stirring the protamine solution, 10 ⁇ l of HEPES buffer solution containing pDNA was added at the same time. After adding all the predetermined amounts of pDNA, the mixture was further stirred for 20 minutes and the reaction was completed to obtain the final obtained product pDNA / Prot.
  • Hep-S-S-TCA (20 mg) and pDNA / Prot were added to each HEPES buffer solution. Then, Hep-S-S-TCA solution was stirred and at the same time, 1 ml of HEPES buffer solution containing pDNA / Prot was added. After adding all the predetermined amounts of pDNA / Prot, the mixture was further stirred for 30 minutes and the reaction was completed to obtain the final product pDNA / Prot / Hep-S-S-TCA.
  • the electrophoresis method was used, and the background condition was HEPES buffer solution, and the weight ratio was compared to the ratio of 1: 0.5, 1, 2, 3, 4, and 6 for optimum conditions. It was confirmed.
  • the prepared pDNA / Prot was prepared very stably, and it was confirmed that the pDNA / Prot was completely prepared when manufactured using a minimum 1: 2 weight ratio.
  • the prepared pDNA / Prot was manufactured very stably, and as a result, it was confirmed that the prepared pDNA / Prot was manufactured under the optimum conditions.
  • the prepared pDNA / Prot / Hep-S-S-TCA was prepared in a very stable manner, and it was confirmed that it was completely prepared when manufactured using a minimum 1: 3 weight ratio.
  • the prepared pDNA / Prot / Hep-S-S-TCA was placed on a silicon wafer, and then dried to prepare a sample for analysis by transmission electron microscopy.
  • the prepared pDNA / Prot / Hep-SS-TCA was confirmed to have a particle shape having a size of 100 nm of particles, and by observing the coating layer of Hep-SS-TCA on the surface, the pDNA / Prot / Hep-SS-TCA was Confirmed to be fully prepared. It was also confirmed that all the observed particles also had the same size.
  • Electrophoresis was used to measure the gene encapsulation rate of pDNA / Prot / Hep-S-S-TCA, and the encapsulation rate was measured by measuring the amount of DNA separated by electrophoresis.
  • the maximum encapsulation effect at a weight ratio of 1: 6 to 70% of the encapsulation rate, and 1: 3 has an encapsulation effect of about 15%. It has the maximum encapsulation effect at 1: 6, but the weight ratio optimized for gene transfer is 1: 3, as mentioned in the test for the production of pDNA / Prot / Hep-SS-TCA through electrophoresis and particle size analysis. Fixed with.
  • the prepared pDNA / Prot / Hep-S-S-TCA effectively protects the pDNA from DNAse, a pDNA degradation requirement, and maintains a very stable state.
  • MDCK-ASBT cells were used to confirm the cellular uptake of the prepared pDNA / Prot / Hep-SS-TCA.
  • the experimental method was prepared by dispensing MDCK-ASBT cells in 8 well plates at a concentration of 10 5 cell / well, and then injected with sample Rhdamine-B-coupled pDNA / Prot and pDNA / Prot / Hep-SS-TCA. After 2 hours of incubation, three washes were performed using PBS and observed using confocal microscopy.
  • the pDNA / Prot used as a control also had a surface charge of the cation and showed a slight absorption capacity, but the resulting pDNA / Prot / Hep-SS-TCA had better cell uptake than the control pDNA / Prot. It was confirmed.
  • HepG2 cells were used to confirm the cell expression effect of the prepared pDNA / Prot / Hep-SS-TCA.
  • the experimental method was prepared by dispensing HepG2 cells in 8 well plates at a concentration of 10 5 cell / well, and then injected pDNA / Prot and pDNA / Prot / Hep-SS-TCA to which sample eGFP was added. After 24 hours of incubation, the cells were washed three times using PBS and observed using confocal microscopy.
  • MDCK-ASBT cells were used to confirm the toxicity of the prepared pDNA / Prot / Hep-S-S-TCA, and MTT test method was used as a method for verifying toxicity.
  • Hep-S-S-TCA showed a high survival rate of 90% or more, pDNA / Prot / Hep-S-S-TCA also 90% or more.
  • Caco-2 cells were tested by culturing in a single layer to verify cell permeability of pDNA / Prot / Hep-S-S-TCA. The test was run for a total of 6 hours, and samples were taken at 10, 30, 1, 2, 4 and 6 hours.
  • Rhodamine B-bound protamine was used, and the mice were Balb / c 7 weeks old, and the drug was orally administered after 6 hours of fasting.
  • the in vivo distribution at 6 hours after intravenous administration was confirmed by fluorescence imaging of tissues and cells.
  • Example 13 Preparation of chitosan (hereinafter referred to as 'CS-S-S-TCA') in which TCA is covalently bonded to disulfide bonds
  • Chitosan (100 mg) is dissolved in 10 mL of MES buffer (50 mmol, pH 6) and stirred in a cold bath until the solution is clear. Excess EDC (5 equivalents to chitosan) was added and stirred for 10 minutes, then excess NHS (2.5 times equivalent to EDC) was added at room temperature and stirred for 10 minutes. After carboxyl activity by EDC and NHS, cysteine (500 ⁇ g) was added and reacted at pH 7 for 24 hours. After the reaction was dialyzed with secondary distilled water for 24 hours and lyophilized to obtain Chitosan-S-S-COOH.
  • TCA In order to conjugate TCA to activated chitosan Chitosan-SS-COOH, TCA (50 mmol) was dissolved in DMSO (10 mL), followed by addition of 4-NPC (200 mg) and TEA (100 ⁇ g) and reaction at room temperature for 1 hour. TCA-NPC was prepared.
  • TCA-NPC 100 mg
  • 4-MMP 30 ⁇ l
  • ethylenediamine 1 ml
  • CS-S-S-TCA (20 nmol) and pDNA (1 nmol) were prepared by adding HEPES buffer solution, respectively. Then, the prepared CS-S-S-TCA solution was stirred, and at the same time, 10 ⁇ l of HEPES buffer solution containing pDNA was added. After adding all of the predetermined amount of pDNA, the mixture was further stirred for 10 minutes and the reaction was completed to obtain the final obtained product pDNA / CS-S-S-TCA.
  • the prepared pDNA / CS-S-S-TCA was prepared in a very stable manner and was completely prepared when manufactured using a minimum 1: 5 weight ratio. And the optimum weight ratio was set to 1:50 by applying the change of particle size.
  • pDNA / CS-S-S-TCA showed excellent stability under the above-described conditions, which may be explained by the increase in stability to pH due to the binding of taurocholine acid, a kind of bile acid.
  • MDCK-ASBT cells were used to confirm the toxicity of the prepared pDNA / CS-S-S-TCA, and MTT test method was used as a method for verifying toxicity.
  • MDCK-ASBT cells were used to confirm cell uptake of the prepared pDNA / CS-SS-TCA.
  • the experimental method was prepared by dispensing MDCK-ASBT cells in 8 well plates at a concentration of 10 5 cell / well, and then injecting pDNA / Chitosan and pDNA / CS-SS-TCA combined with Rhdamine-B. After 2 hours of incubation, the cells were washed three times using PBS and observed using confocal microscopy.
  • pDNA / Chitosan used as a control also had a surface charge of the cation and showed a slight absorption capacity, but the resulting pDNA / CS-SS-TCA was confirmed to have a better cell uptake than the control pDNA / Chitosan It was.
  • Caco-2 cells were tested in single layer culture to verify cell permeability of pDNA / CS-S-S-TCA. The test was run for a total of 6 hours, and samples were taken at 10, 30, 1, 2, 4 and 6 hours.
  • Rhodamine B-coupled chitosan was used, and the mice were Balb / c 7 weeks old, and oral administration of the drug after 6 hours of fasting. In vivo distribution at time was confirmed by fluorescence image.
  • pDNA / CS-S-S-TCA is absorbed through the small intestine, especially the ileum, and some absorption progresses in the liver. It follows the in vivo circulation pathway of known taurocholic acid up to the small intestine, and pDNA / Chitosan prepared by disulfide disulfide bond (-SS-) from the small intestine accumulates in the small intestine out of the circulation pathway of taurocholic acid. It is shown.
  • TCA 50 mmol
  • DMSO 10 mL
  • 4-NPC 200 mg
  • TEA 100 ⁇ g
  • activated protamine 100 nmol
  • the TNBSA method was used to verify the synthesis of Prot-S-S-TCA, and more precisely, the amine group of protamine was quantified to determine the percentage of amine group consumed, that is, TCA bound. In addition, surface charge was measured using a Zeta potential analyzer.
  • the prepared pDNA / Prot-S-S-TCA was prepared in a very stable manner and was completely prepared when manufactured using a minimum 1: 5 weight ratio.
  • the optimum weight ratio was set to 1: 200 by applying the change of particle size and the surface charge value.
  • MDCK-ASBT cells were used to confirm the toxicity of the prepared pDNA / Prot-S-S-TCA, and MTT test method was used as a method for verifying toxicity.
  • pDNA / Prot-S-S-TCA showed a high survival rate of more than 90%.
  • MDCK-ASBT cells were used to confirm the cellular uptake of the prepared pDNA / Prot-SS-TCA.
  • the experimental method was prepared by dispensing MDCK-ASBT cells in 8 well plates at a concentration of 10 5 cell / well, and then injected with sample Rhdamine-B-coupled pDNA / Prot and pDNA / Prot-SS-TCA. After 2 hours of incubation, three washes were performed using PBS and observed using confocal microscopy.
  • the pDNA / Prot used as a control also had a surface charge of the cation and showed a slight absorption capacity, but the resulting pDNA / Prot-SS-TCA was confirmed to have a better cell uptake capacity than the control pDNA / Prot. It was.
  • Caco-2 cells were tested in single layer culture to verify cell permeability of pDNA / Prot-S-S-TCA. The test was conducted for a total of 6 hours, and samples were taken at 10, 30, 1, 2, 4 and 6 hours immediately after the test.
  • Luciferase method was used to verify the gene expression effect of pDNA / Prot-S-S-TCA. As controls, pDNA, Prot, Prot-TCA and bPEI were used.
  • pDNA / Prot-S-S-TCA had at least 2 times up to 10 times more effects than the negative control pDNA, Prot, Prot-TCA, and had a gene transfer effect similar to that of the positive control group bPEI.
  • Rhodamine B-bound protamine was used, and the mice were Balb / c 7 weeks old, and after 6 hours of fasting, the drug was orally administered. In vivo distribution at time was confirmed by fluorescence image.
  • TCA was initially aminoated to induce conjugation with HA.
  • the synthesis of aminated TCAs is as follows.
  • TCA (1 mmol) was dissolved in DMF (dimethylformamide) (5 mL) at 0 ° C. and stirred until the solution became clear.
  • TEA 6 mmol
  • 4-NPC 5 mmol
  • the pellet was dispersed in ethyl acetate (20 mL), transferred to a separatory funnel, and extracted with the same amount of distilled water. The aqueous layer was collected, the remaining organic solvent was removed by a rotary evaporator, and lyophilized for 48 hours to obtain TCA-NPC.
  • TCA-NPC (1 mmol) formed was dissolved in DMF (5 mL), and 4-MMP (4-mercapto-4-methylpentan-2-one) (2 mmol) was added thereto, and stirred at 50 ° C. for 60 minutes. Then, ethylene diamine (100 mmol) was added dropwise and reacted at room temperature for 16 hours. Excess acetone was added and the resulting precipitate was filtered and lyophilized for 48 hours to give TCA-NH 2 (FIG. 17).
  • Hep-TCA was obtained in the same manner as in Example 17, except that Hep was used instead of HA.
  • TNBS analysis confirmed successful amination of TCA. These results show that each TCA molecule has one amine group in its backbone. Conjugation of Hep or HA with TCA was confirmed by 1 H NMR analysis [FIG. 18]. The presence of the TCA moiety from peaks near 1.0-1.5 ppm and the presence of the HA moiety from peaks near 3.5-3.9 ppm confirmed that a stable amide bond was formed between TCA and HA from 8 ppm new peak. It became.
  • Prot (1 mg / mL) dissolved in 10 mM HEPES buffer (pH 7.4) was used as stock solution.
  • the gene encoding GLP-1 (7.780 mg) was dissolved in 10 mM HEPES buffer (pH 7.4) (1.922 mL) to prepare a GLP-1 gene solution.
  • the GLP-1 gene solution was added dropwise to the stock Prot solution under gentle vortex to prepare a Prot / GLP-1 ion complex solution. A positive zeta potential and a strong interaction were observed when Prot: GLP-1 of the Prot / GLP-1 ion complex was at a molar ratio of 1:20.
  • Prot / GLP-1 ion complex was added 1: 1 (v / v) to HA-TCA aqueous solution under gentle vortex and incubated at room temperature for 30 minutes, and then lyophilized to obtain prot / GLP-1 / HA-TCA. (20% yield).
  • Prot / GLP-1 / Hep-TCA was obtained in the same manner as in Example 19, except that Hep was used instead of HA.
  • Prot / GLP-1 ion complexes with different molar ratios between GLP-1 and Prot were prepared, and genes encoding GLP-1 for Prot were complexed at a molar ratio of 1:20 by gel retardation experiments. This was confirmed.
  • the prot / GLP-1 ion complex was stable in serum, and even if the Prot / GLP-1 ion complex was coated with Hep-TCA or HA-TCA, it was still stable in serum without losing the structural integrity of the Prot / GLP-1 ion complex. It was confirmed.
  • TEM analysis confirmed that the particle size increased from 185 nm to 235 nm when Prot / GLP-1 ion complex was coated with Hep-TCA or HA-TCA, and Prot with Hep-TCA or HA-TCA. Transparent coating shells were observed on TEM micrographs after coating the / GLP-1 gene complex.
  • the stability of the particles at various pH conditions was confirmed. In other words, they were placed in three pH solutions, pH 3, pH 5 and pH 7.4, similar to the pH conditions in the stomach, duodenum and ileum fragments of the GI tract, and the particle size was observed. As a result, the prot / GLP-1 ion complex was unstable at pH 3, while the prot / GLP-1 gene complex coated with a polysaccharide-TCA polymer such as Hep-TCA or HA-TCA was found to be Hep-TCA or HA-TCA. Particle stability was improved due to the coating of the polysaccharide-TCA polymer, it was confirmed that it is stable up to 24 hours at pH 3. Therefore, after coating with the polysaccharide-TCA polymer it was confirmed that the particles are stable.
  • GFP green fluorescent protein
  • Caco-2 monolayers were cultured at the apical part of the transwell plate and MDCK-ASBT cell line was cultured at the basal part. Delivery of Prot / GLP-1 / HA-TCA (Example 19) and Prot / GLP-1 / Hep-TCA (Example 20) coated with Hep-TCA and HA-TCA, respectively. Minimal expression of eGFP was observed from Prot / GLP-1 / HA-TCA (Example 19) and Prot / GLP-1 / Hep-TCA (Example 20) in Caco-2 monolayers. This suggests that shell plays an important role in the release of target genes.
  • GLP-1 ELISA kit which quantifies in vitro GLP-1 expression in response to sugar levels in the medium, resulted in improved expression of the gene encoding GLP-1.
  • mice Balb / c mice were kept in wooden cages and provided with food and water regularly. The animals were fasted for 12 hours prior to oral administration of the therapeutic gene complex. Twelve hours after fasting, samples containing 100 ⁇ g of eGFP gene were administered by oral gavage. Animals were sacrificed 24 hours after administration and quantified in vivo gene expression and in vivo distribution of samples with confocal microscope.
  • the gene delivery complex of the present invention confirmed enhanced eGFP gene expression in ileum and liver fragments due to HA-TCA or Hep-TCA.
  • ZDFRs Five-week-old Zucker diabetic fatty rats (ZDFRs) were kept in wooden cages and provided with food and water regularly. The animals were fasted for 12 hours prior to oral administration of the therapeutic gene complex. After 12 hours of fasting, 100 ⁇ g of Prot / GLP-1 / HA-TCA (Example 19) and Prot / GLP-1 / Hep-TCA (Example 20) were administered orally, respectively. Blood glucose levels were measured by taking blood from the tail vein at predetermined time intervals 24 hours after administration. Surprisingly, blood glucose levels were regulated to normal blood glucose levels. After 5 days, the animals were sacrificed and the expression of GLP-1 and insulin in different tissues was analyzed with an ELISA kit. As a result, GLP-1 peptide and insulin protein expression improved after oral administration of GLP-1 loaded polysaccharide-TCA gene complexes compared to the control group.
  • nanoparticles for gene delivery of the present invention namely prot / GLP-1 / HA-TCA (Example 19) and prot / GLP-1 / Hep-TCA (Example 20), were administered orally and intravenously at different concentrations, respectively.
  • Blood of laboratory animals was taken at predetermined time intervals to analyze the complete blood content and to evaluate the expression of biological markers that determine liver and kidney activity. As a result, even when administered at a very high concentration of the gene delivery nanoparticles of the present invention showed little toxicity.
  • the nanoparticles for gene delivery of the present invention are safe, non-toxic, and usable for the treatment of diabetes.
  • Gene delivery nanoparticles according to the present invention is a new oral gene delivery system that can detect ingested meals and regulate blood sugar levels and insulin secretion in biological systems, including ionic polymers and genes in which bile acids or bile acid derivatives are covalently bound. do.
  • an ion complex in which a negatively charged gene is enclosed inside the cationic polymer is present in the core portion of the nanoparticle, and the cationic polymer Bile acids or derivatives thereof covalently bonded to are nanoparticles in which the bile acids or derivatives thereof are surface modified with a hydrophilic anionic group on the surface of the nanoparticles.
  • the nanoparticles for gene delivery of the present invention are ion complexes in which negatively charged genes are encapsulated inside the cationic polymer due to the electrostatic interaction between the negatively charged gene and the cationic polymer.
  • the cationic polymer of the complex and the anionic polymer covalently bonded to the bile acid having a hydrophilic anionic group or a derivative thereof are bonded by electrostatic interaction so that the bile acid or derivative thereof covalently bonded to the anionic polymer has a hydrophilic ionic group.
  • Bile acids or derivatives thereof, which are located on the surface of the nanoparticles in an excited form, are nanoparticles in surface modified form.
  • the gene-transfer nanoparticle of the present invention protects cationic polymers and genes from gastric acid through direct physical binding, and can be safely delivered to small intestine cells, and L- which expresses GLP-1 gene in small intestine cells. It can be used as a targeted nanoparticle to be expressed only in cells.
  • the genes in the gastrointestinal tract due to the ionic complexes present in the core of the nanoparticles as well as deliver the genes well through the intestinal mucosa It was very stable. From this it can be seen that the gene delivery nanoparticles according to the present invention is very suitable for oral administration.
  • the bile acid modified on the surface of the nanoparticles according to the present invention inhibits GI degradation of the nanoparticles and absorbs the ASBT (apical sodium bile acid transporter) receptor of the intestinal cell membrane in the ileum of the small intestine, thereby treating the gene into cells. Can deliver improved gene expression.
  • ASBT apical sodium bile acid transporter
  • GLP-1, GLP-1 peptide, GLP-1 variant, GLP-1 derivative, GLP-1 agonist, Liraglutide or exendin as therapeutic genes.
  • -4 (exendin-4) is used to enter bile acids and cationic polymers modified on the surface of the nanoparticles according to the present invention by the enzyme glutathione and pH in the intestinal cells to enter the portal vein, the isolated therapeutic gene It is delivered only to the nucleus of the cell, so that a large amount of GLP-1, GLP-1 peptide, GLP-1 variant, GLP-1 derivative, GLP-1 agonist, liraglutide ( Liraglutide) or exendin-4 are expressed to efficiently indicate the efficacy of diabetes treatment.
  • the gene delivery nanoparticles according to the present invention is successful GLP-1, GLP-1 peptide (GLP-1 peptide), GLP-1 variant, GLP-1 derivative, GLP-1 agonist (oral administration to diabetic mouse model) GLP-1 agonist, Liraglutide or Exendin-4 can be expressed and insulin secreted to lower blood sugar, effectively preventing or treating diabetes, especially type 2 diabetes. .

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Abstract

본 발명에 따른 유전자 전달용 나노입자는 섭취된 식사를 감지하고 생물학적 시스템 내 혈당 수치와 인슐린 분비를 조절할 수 있는 새로운 경구 유전자 전달 시스템으로 경구 투여용 유전자 전달을 위한 나노입자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자 및 유전자를 포함하는 유전자 전달용 나노입자 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

경구 투여용 유전자 전달을 위한 나노입자 및 이를 포함하는 약학 조성물
본 발명은 효율적인 경구 투여용 유전자 전달을 위한 표적형 나노입자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자 및 유전자를 포함하는 유전자 전달용 나노입자 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 표적하고자하는 소장세포에 유전자나 치료단백질을 전달하여 부작용을 최소화하고 현재 치료기술의 효율성을 제공하기 위한 유전자 전달용 나노입자 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 유전자 치료(gene therapy)는 질병의 증상을 치료하는 것이 아니고 질병의 원인을 제거하여 치료하는 방식이다. 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해 우수한 선택적 치료효과를 가지고, 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 개선하여 오랜 기간 동안 적용할 수 있다.
유전자 치료는 다양한 질병 치료를 위하여 기재되고 있는 차세대 치료 기술이나, 거대분자인 DNA, RNA 등을 수용액 상태로 세포내로 전달하는 경우 생체 내 특정효소에 의해 급속하게 분해되고 세포전달률이 낮아, 유전자 치료를 효과적으로 하기 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적세포로 안전하게 전달하여 높은 발현 효율을 얻을 수 있도록 하는 유전자 전달체(gene carrier)를 개발하는 것이 필수적이다.
유전자 전달체는 독성이 낮거나 없어야 하며, 유전자를 선택적이고 효과적으로 원하는 세포에 전달할 수 있어야 한다. 이러한 유전자 전달체는 크게 바이러스성과 비바이러스성으로 나눌 수 있다.
바이러스성 벡터(viral vector)는 레트로 바이러스(RV; Retro Virus), 아데노 바이러스(AV; Adeno Virus), 아데노 부속 바이러스 (AAV; Adeno Associated Virus) 등을 유전자 전달체로 이용한 것으로서, 비바이러스성 벡터(non-viral vector)에 비하여 유전자 전달 효율이 높은 반면, 체내 적용 시 벡터 자체가 유발하는 면역반응이나 암 유발 등이 문제가 되며, 벡터에 삽입할 수 있는 유전자의 크기에도 제한이 있다.
고분자나 나노입자 등의 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 의한 생물학적 위험성이 낮고, 비면역원성이며, 변형 및 대량생산이 가능하고, 전달할 수 있는 유전자의 크기에도 비교적 제한이 없다는 장점 때문에 최근 많은 연구가 이루어지고 있다. 특히, 양이온성 고분자 등의 비 바이러스성 벡터를 이용하는 방법이 제조방법의 간편성이나 상대적으로 낮은 위험성 때문에 많이 연구되고 있다. 구체적인 메커니즘은 음전하를 띄고 있는 유전자와 정전기적 상호 작용을 통해 복합체를 형성하여 유전자를 안정화시키고, 복합체 표면의 양전하와 세포 표면의 음전하가 전기적 상호작용에 의하여 복합체가 세포 표면에 결합한 후 엔도좀(endosome)으로부터 세포질로 유전자가 방출되는 과정을 거친다.
이러한 양이온성 고분자의 구체적인 예로는, 프로타민, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아미도아민(polyamidoamine), 폴리-L-라이신(PLL), 폴리아미노에스테르, 폴리프로필렌이민과 같은 양 이온성 단일중합체 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-블록-폴리L-리신 및 PEG-PEI와 같이 양 이온성 블록 공중합체 등을 들 수 있으며, 이들은 DNA 등의 유전자를 압축하여 나노 입자를 형성함으로써 효소 분해로부터 유전자를 보호하고, 빠르게 세포 안으로 침투하여 엔도좀(endosome)에서 빠져나올 수 있도록 도와준다.
대부분의 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 비해 생분해성, 낮은 독성, 비면역원성, 사용상의 간편함 등의 장점을 가지나, 바이러스성 벡터에 비해 상대적으로 낮은 형질도입 효율, 제한적인 입자 크기 등의 문제점을 가지고 있다.
현재 비바이러스성 벡터로서 가장 광범위하게 연구되고 있는 폴리에틸렌이민(PEI) 역시 생체 내 형질도입 효율이 현저히 떨어지며, 높은 세포독성 및 낮은 혈액 적합성으로 인한 유전자의 낮은 발현 효과 등의 문제점이 있다.
한편, 한국 공개특허 제10-2010-0122405호는 친수성 고분자와 소수성 고분자가 결합된 복합체인 양친성 고분자 나노 입자에 siRNA를 결합시킨 siRNA 전달체로, 친수성 고분자로 키토산과 폴리에틸렌이미드 각각을 담즙산인 5-β-콜란산(5-β-cholanic acid)과 결합시켜 복합체를 생성한 후 각각의 복합체를 혼합하여 제조된 나노입자 형태의 양친성 고분자 나노입자를 개시하고 있다. 특히 상기 문헌은 담즙산의 소수성기와 키토산, 폴리에틸렌이민(PEI)의 친수성기에 의한 양친성으로 인하여 수계에서 구형의 자기집합체를 형성하며, 이로 인해 키토산-담즙산/폴리에틸렌이민(PEI)-담즙산 복합체 나노 입자는 표면에는 강한 양친성을 띄는 폴리에틸렌이민과 키토산이, 내부(core)에는 소수성인 담즙산이 위치하고 있음을 개시하고 있다. 그러나 PEI의 독성의 심각성 때문에 임상실험에는 접근하지 못하고 있다.
따라서, 안전하고 효율적인 유전자 전달을 위해 기존의 비바이러스성 벡터의 장점은 그대로 유지하면서 형질도입(transfection) 효율을 증강시킨 유전자 전달체의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 당뇨병(diabetes mellitus)은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않아 혈중 포도당의 농도가 높아지는 대사질환으로, 인슐린이 제대로 분비되지 않거나 분비된 인슐린이 체내에서 제대로 작용하지 못하여 체내의 혈당이 조절되지 못하고 상승하는 경우를 제 2형 당뇨병이라고 하며, 췌장에서 인슐린을 분비하지 못하여 혈당이 상승하는 경우를 제 1형 당뇨병이라고 한다. 제1형 당뇨병의 경우에는 반드시 인슐린 투여 치료가 필요하다. 제2형 당뇨병의 경우에는 생활 습관 교정을 기본으로 하며 추가로 경구용 혈당 강하제의 투여가 필요할 수 있다. 먹는 약의 경우 하루 1~3회 복용하며 약의 작용 시간에 따라 먹는 시간이라든지 부작용 등이 조금씩 다르다.
현재 당뇨병의 치료법으로는 식사요법, 운동요법, 설폰요소제, 비구아니드(biguanide)계 약물, α-글루코시다아제 억제제, 인슐린 등이 이용되고 있으며 새로운 약물의 개발에 대한 많은 연구를 통해 다양한 인슐린 등이 개발되어 임상에 적용되고 있다.
한편 인슐린 분비 펩타이드의 일종인 글루카곤 유사 펩타이드-1 (Glucagon like peptide 1, GLP-1)은 회장과 대장의 L-세포에서 분비되는 인크레틴 (incretin) 호르몬이다. 글루카곤 유사 펩타이드-1의 주요한 작용은 인슐린 분비를 증가시키며, 포도당의 농도에 따른 인슐린 분비 (Glucose dependent secretion)가 이루어져 저혈당이 발생하지 않는다. 이런 특징으로 제 2형 당뇨병의 치료방법으로 적용되나, 혈중 반감기가 2분 내외로 매우 짧기 때문에 약제로 개발하는데 큰 제약을 갖고 있다. 이에 따라 개발되어 시판되는 글루카곤 유사 펩타이드-1(Glucagon like peptide-1) 작용제 (아고니스트)로서는 글리아 몬스터 도마뱀 (glia monster)의 침샘으로부터 정제된 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체인 엑센딘(Exendin)-4가 있다. 이는 DPP-IV (Dipeptidyl peptidase-4)에 대한 저항성과 함께 글루카곤 유사 펩타이드-1 보다 높은 생리 활성을 가지며, 따라서 체내 반감기가 2-4시간으로 글루카곤 유사 펩타이드-1에 비해 길어진 체내 반감기를 가진다 (US 5,424,286). 그러나 DPP-IV의 저항성을 증가시키는 방법만으로는 충분한 생리활성의 지속기간을 기대할 수 없는데, 예를 들어 현재 시판되고있는 엑센딘-4 (엑세나티드, exenatide)의 경우 환자에게 하루 2회 주사를 통해 투여되어야 하며, 투여에 따른 구토유발 및 메스꺼움 현상이 환자에게 큰 부담으로 작용되는 단점이 여전히 남아있다.
그러나 이들 치료제들은 약효가 낮거나 간 기능 장애, 저혈당, 유산혈증 등과 같은 많은 부작용을 일으키는 문제점이 있다. 따라서, 기존 당뇨병 치료제의 부작용을 줄이고 대사이상 증세 등을 개선시켜 주며 장기복용 시에도 안전성이 우수한 당뇨병 치료제에 대한 요구가 있다.
그리고 이러한 문제를 해결하기 위해 바이러스 전달체를 이용한 기술이 대두 되었는데, 이 기술은 비특이적 면역 반응 등의 위험성에 노출되어 있으며, 생산 공정이 복잡하여 상용화에 많은 문제점이 있다. 따라서 최근의 연구 방향은 비바이러스성 전달체, 즉 양이온성 지질이나 고분자를 이용한 전달체를 이용하는 방향으로 진행되고 있다. 이러한 비바이러스성 전달체의 효율은 바이러스성 전달체에 미치지 못하지만 생체 내 안정성과 생산 공정이 쉽고 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다. 그러나 고분자와 유전자를 이용하여 혼합물을 만들고자 할 때에 유전자 특유의 단단한 성질과 약음이온성으로 혼합물의 형성에 큰 어려움을 겪는다.
이에, 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 담즙산 또는 담즙산 유도체가 표면 수식된 이온성 고분자 및 유전자를 포함하되, 유전자 전달용 나노입자의 코어에 이온성 고분자와 유전자의 이온 복합체를 포함하고, 나노입자의 표면에 친수성의 이온성기를 가지는 담즙산 또는 담즙산 유도체가 위치함으로써, 체내에서의 안정성을 향상시킬 수 있으며, 생체 내에서의 독성을 최소화하여 상기한 부작용을 감소시킬 수 있고, 경구 투여와 관련된 장애를 극복할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포 내에서 목적하는 위치에 치료 유전자를 효과적으로 전달할 수 있는 유전자 전달용 나노입자로, 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 고분자; 및 유전자를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 유전자 전달용 나노입자를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 전달용 나노입자를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 고분자 및 유전자를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 유전자 전달용 나노입자를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이온성 고분자는 양이온성 고분자일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 양이온성 고분자는 키토산, 프로타민, 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이온성 고분자는 음이온성 고분자일 수 있으며, 이 경우 양이온성 고분자를 더 포함한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 음이온성 고분자는 헤파린(heparin), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate)에서 선택될 수 있고, 상기 양이온성 고분자는 키토산, 글리코키토산, 프로타민, 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자는 이황화 결합을 통해 공유결합된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 디옥시콜린산 (deoxycholic acid), 타우로디옥시콜린산 (taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산 (TCA: taurocholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid) 및 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxycholic acid)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 타우로콜린산 (TCA: taurocholic acid)이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA(deoxyribonucleic acid), 단일가닥 또는 이중가닥 RNA(ribonucleic acid), 플라스미드 형태 DNA(plasmid DNA; pDNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 리보자임, 촉매적 RNA 및 뉴클레오타이드 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자는 플라스미드 형태 DNA(pDNA)및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 유전자는 글루카곤 유사 펩타이드-1 유전자(GLP-1, Glucagon like peptide-1 gene), GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 또는 엑센딘-4(exendin-4)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 이온성 고분자의 작용기 수에 따라 공유결합되는 정도가 달라질 수 있으나, 바람직하게 상기 담즙산 또는 이의 유도체와 이온성 고분자는 1 : 1 내지 1 : 300의 몰비로 공유결합될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 전달용 나노입자는 입자 크기에 관계없이 흡수가 가능하나, 바람직하게는 500 nm 이하의 입자 크기를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자 및 유전자는 1 : 1 내지 1 : 200의 몰비로 결합될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 전달용 나노입자의 N/P 비(담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자의 질소 원자 개수/유전자의 인산염 원자 개수)는 1 내지 200 일 수 있다.
또한, 본 발명은 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 고분자 및 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1, Glucagon like peptide-1), GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 또는 엑센딘-4(exendin-4)를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 유전자 전달용 나노입자를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여용일 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 전달용 나노입자는 섭취된 식사를 감지하고 생물학적 시스템 내 혈당 수치와 인슐린 분비를 조절할 수 있는 새로운 경구 유전자 전달 시스템으로, 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자 및 유전자를 포함한다.
본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 음전하의 유전자와 양이온성 고분자의 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 고분자 내부에 음전하의 유전자가 봉입된 이온복합체가 나노입자의 코어 부분에 존재하며, 상기 양이온성 고분자에 공유결합된 담즙산 또는 그의 유도체는 친수성의 음이온성기를 가진 형태로 나노입자의 표면에 위치하는, 담즙산 또는 그의 유도체가 표면 수식된 형태의 나노입자이다.
또한, 본 발며의 유전자 전달용 나노입자는 음전하의 유전자와 양이온성 고분자의 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 고분자 내부에 음전하의 유전자가 봉입된 이온복합체가 나노입자의 코어 부분에 존재하며, 상기 이온복합체의 양이온성 고분자와, 친수성의 음이온성기를 가지는 담즙산 또는 그의 유도체가 공유결합된 음이온성 고분자가 정전기적 상호작용으로 결합되어 상기 음이온성 고분자에 공유결합된 담즙산 또는 그의 유도체는 친수성의 이온성기를 가진 형태로 나노입자의 표면에 위치하는, 담즙산 또는 그의 유도체가 표면 수식된 형태의 나노입자이다.
따라서, 본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 양이온성 고분자와 유전자를 직접적인 물리적인 결합을 통해 위산으로부터 방어를 하며, 안전하게 소장세포에 전달할 수 있으며, 또한 소장세포 내에 GLP-1 유전자를 발현하는 L-Cell에서만 발현되도록 하는 표적형 나노입자로 사용할 수 있다.
치료 유전자를 표적 세포로 전달하기 위하여 본 발명의 담즙산또는 그의 유도체가 표면 수식된 나노입자를 사용하는 경우 장 점막을 통해 유전자를 잘 전달함과 동시에 나노입자의 코어에 존재하는 이온복합체로 인하여 위장관에서 매우 안정하였다. 이로부터 본 발명에 따른 유전자 전달용 나노입자는 경구 투여용으로 매우 적합함을 알 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자의 표면에 수식된 담즙산으로 인하여 나노입자의 GI 분해를 억제하고 작은 창자의 회장 부분에서 장 세포 막의 담즙산 수용체인 ASBT(apical sodium bile acid transporter) 수용체를 흡수하여 세포 내로 치료 유전자를 전달할 수 있어 향상된 유전자 발현을 나타낼 수 있다.
특히, 치료유전자로 GLP-1, GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 또는 엑센딘-4(exendin-4)을 사용한 경우 장 세포내의 효소인 글루타티온 및 pH에 의해 본 발명에 따른 나노입자의 표면에 수식된 담즙산과 양이온성 고분자가 분리되어 portal vein으로 들어가며, 분리된 치료유전자는 장세포의 핵으로만 전달되어 많은 양의 GLP-1, GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 또는 엑센딘-4(exendin-4)이 발현되어 당뇨병 치료 효능을 효율적으로 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 유전자 전달용 나노입자는 당뇨병 마우스 모델에 경구 투여시 성공적인 GLP-1, GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 또는 엑센딘-4(exendin-4)을 발현시킴과 동시에 인슐린을 분비시켜 혈당 강하 효과를 나타내 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1 - 회장 부분에서 ASBT를 통한 본 발명의 유전자 전달용 나노입자의 흡수과정을 나타낸 모식도
도 2 - 실시예 1의 Prot-TCA의 제조과정을 나타낸 반응식
도 3 - 실시예 1에서 제조된 Prot-TCA의 1H NMR
도 4 - 실시예 2의 CS-TCA의 제조과정을 나타낸 반응식
도 5 - 실시예 2에서 제조된 CS-TCA의 1H NMR
도 6 - 실시예 3의 PAMAM-TCA의 제조과정을 나타낸 반응식
도 7 - 실시예 4의 PLL-TCA의 제조과정을 나타낸 반응식
도 8 - 실시예 7의 pDNA/Prot-TCA 의 제조과정을 나타낸 반응식
도 9 - 실시예 11의 Hep-S-S-NH2의 제조과정을 나타낸 반응식
도 10 - 실시예 11의 TCA-NPC의 제조과정을 나타낸 반응식
도 11 - 실시예 11의 Hep-S-S-TCA의 제조과정을 나타낸 반응식
도 12 - 실시예 11에서 제조된 Hep-S-S-NH2 및 Hep-S-S-TCA의 1H NMR
도 13 - 실시예 13에서 제조된 CS-S-S-TCA의 제조과정을 나타내는 반응식
도 14 - 실시예 13에서 제조된 CS-S-S-TCA의 1H NMR
도 15 - 실시예 15의 Prot-S-S-TCA의 제조과정을 나타내는 반응식
도 16 - 실시예 16의 pDNA/Prot-S-S-TCA의 제조과정을 나타내는 반응식
도 17 - 실시예 17에서 제조된 TCA-NPC 및 TCA-NH2의 1H NMR
도 18 - 실시예 17에서 제조된 HA -TCA의 1H NMR
이하, 본 발명에 대하여 보다 구체적으로 설명한다. 이 때 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 새로운 경구 유전자 전달 시스템으로, 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 고분자; 및 유전자;를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 유전자 전달용 나노입자를 제공한다.
유전자는 음이온으로 대전된 거대한 고분자 사슬 형태로, 유전자 단독으로 존재하는 경우 비교적 부피가 큰 랜덤코일의 형태를 띠고 있어 유전자를 세포 내로 전달하기 어렵기 때문에 이러한 유전자와의 정전기적 상호작용을 통해 나노 크기의 이온복합체를 형성할 수 있는 양이온성 고분자를 사용한다.
본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 유전자와 이온성 고분자의 이온복합체를 포함하며, 음이온성의 유전자와 이온복합체를 형성하는 이온성 고분자는 반드시 양이온성 고분자이며, 상기 양이온성 고분자는 담즙산과 공유결합된 형태일 수 있다.
본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 양이온성 고분자 및 유전자 간의 정전기적 상호작용으로 형성되거나, 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 음이온성 고분자, 양이온성 고분자 및 유전자 간의 정전기적 상호작용으로 형성된 것으로, 보다 안전하게 유전자의 세포 내재화를 유도할 수 있다.
즉, 본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 양이온성 고분자와 유전자의 이온복합체가 나노입자의 코어에 존재하며, 친수성의 이온성기를 가지는 담즙산이 나노입자의 표면에 위치하는, 담즙산이 표면 수식된 형태의 나노입자이다.
치료 유전자를 표적 세포로 전달하기 위하여 본 발명의 담즙산이 표면 수식된 나노입자를 사용하는 경우 장 점막을 통해 유전자를 잘 전달함과 동시에 나노입자의 코어에 존재하는 이온복합체로 인하여 위장관에서 매우 안정하였다. 이로부터 본 발명에 따른 유전자 전달용 나노입자는 경구 투여용으로 매우 적합함을 알 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이온성 고분자는 양이온성 고분자일 수 있다. 상기 이온성 고분자가 양이온성 고분자인 경우 음전하의 유전자는 양이온성 고분자와 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 고분자 내부에 봉입된 이온복합체를 형성하고, 형성된 이온복합체는 나노입자의 코어 부분에 위치하며, 양이온성 고분자에 공유결합된 담즙산 또는 그의 유도체는 친수성의 이온성기를 가진 형태로 나노입자의 표면에 위치하게 된다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 양이온성 고분자는 독성이 없는 중량평균분자량 100 내지 100,000인 고분자로, 예를 들면 키토산(chitosan; CS), 글리코키토산, 프로타민(protamine; Prot), 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 키토산(CS), 프로타민(Prot), 폴리-L-라이신(PLL) 또는 폴리아미도아민(PAMAM)일 수 있다.
키토산(chitosan)은 (1->4) 2-amino-2-deoxy-β-D-glucan의 구조를 가지는 천연에 존재하는 매우 안전한 양이온성 다당류이다. 키토산은 천연의 갑각류 등으로부터 얻어지는 키틴(chitin)을 N-탈아세틸화하여 제조되는 염기성 다당류로서, 생분해성, 생체적합성 및 낮은 세포독성을 나타낸다고 알려져 있다. 본 발명에서는 바람직하게 생분해서 생체적합성이 우수한 천연 고분자인 수용성 키토산 또는 글리콜기가 도입되어 수용성이 더욱 증대된 글리콜 키토산을 사용할 수 있다.
프로타민(protamine)은 아르기닌이 풍부한 천연의 양이온성 단백질로서, 동물의 정소 중에서 특히 연어를 포함한 어류의 정자핵에 많이 존재하며, 히스톤과 같이 DNA와 회합 또는 해리를 통하여 유전정보 발현에 관여하는 단백질로 알려져 있다. 통상, 어류의 정자핵으로부터 추출되는 프로타민의 분자량은 약 4,000 내지 10,000이며, 구성 아미노산의 70% 이상이 아르기닌으로 존재하나 본 발명이 여기에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 프로타민은 프로타민 자체 및 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 모두 포함한다. 구체적으로 본 발명의 프로타민의 염은 염산염 또는 황산염을 포함한 산성물질에 의한 염 형태를 포괄한다. 프로타민은 염 형성 없이도 물에 용해가 가능하며 염 형태 또한 물에 용해가 가능하므로 어떤 형태로든 사용 가능하다.
폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine)은 생분해설인 펩타이드 결합으로 연결되어 있어 유전자와 이온복합체를 형성해서 세포 내로 전달될 수 있으나, 다소 독성을 나타내므로 단독으로 높은 전달 효율을 나타내는데에는 한계가 있어 엔도좀 파괴 물질이나 엔도좀 융합펩타이드 등을 부착시켜 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이온성 고분자는 음이온성 고분자일 수 있으며, 이 경우 유전자와의 이온복합체를 형성하기 위하여 반드시 양이온성 고분자를 더 포함한다. 즉 음전하의 유전자는 양이온성 고분자와 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 고분자 내부에 봉입된 이온복합체를 형성하고, 형성된 이온복합체는 나노입자의 코어 부분에 위치한다. 상기 음이온성 고분자는 이온복합체의 양이온성 고분자와 정전기적 상호작용으로 결합되어 있으며, 상기 음이온성 고분자에 공유결합된 담즙산 또는 그의 유도체는 친수성의 이온성기를 가진 형태로 나노입자의 표면에 위치하게 된다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 음이온성 고분자는 헤파린(heparin), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate)에서 선택될 수 있고, 상기 양이온성 고분자는 키토산, 글리코키토산, 프로타민, 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
헤파린은 히드록시기, 카복실기 및 아미노기를 포함하는 구조로, 비분획 헤파린, 고분자량 헤파린, 저분자량 헤파린, 헤파린 단편, 재조합 헤파린, 헤파린 유사체, 헤파란 설페이트, 헤파린 활성을 갖는 설폰화된 다당류 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 상기 이온성 고분자와 공유결합될 수 있는 작용기 이외에 친수성의 음이온성기를 가지고 있는 것으로, 디옥시콜린산 (DCA: deoxycholic acid), 타우로디옥시콜린산 (taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산 (TCA: taurocholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid) 및 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxycholic acid)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 친수성의 음이온성기가 네개 이상 존재하는 타우로콜린산(TCA)일 수 있다.
상기 담즙산은 소장의 회장 부분을 통해 95%이상의 높은 효율로 흡수가 되어 간으로 흡수되는데 이를 '장간순환(enterohepatic circulation)'이라 하며, 이러한 장간순환으로 지질 이동에 중요한 역할을 하는 생물학적 계면활성제로, 말단 장 부분에 존재하는 ASBT (apical sodium-dependent bile acid transporter)에 의해 특이적으로 인식되므로, 경구 전달에 있어서 표적 리간드로 작용할 수 있다.
즉, 회장 부분을 통해 흡수가 이루어지는 답즙산은 상기 유전자 전달용 나노입자의 표면에 위치함으로써 ASBT를 통하여 기존의 경구 투여 방식의 가장 큰 문제점인 장 내벽을 통한 상기 유전자 전달용 나노입자의 타겟 세포 내 흡수를 증대시키는 역할을 한다[도 1]. 이로 인하여 본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 담즙산을 흡수하는 회장 부분을 통해 흡수가 용이하므로 경구용으로 사용될 수 있으며, 이로인하여 약물의 생체내 이용률을 증대시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자는 이황화 결합을 통해 공유결합된 것일 수 있다.
이황화 결합(S-S)은 장세포에서 많이 분비되는 글루타티온(glutathione)에 민감하게 반응하고 쉽게 분리되는 경향을 가지고 있어 본 발명의 유전자 전달용 나노입자가 장세포에 접근하였을 때, 대부분이 분리되고 세포안으로 유전자만이 L-CELL의 핵안으로 들어가게 된다. 이렇게 들어간 유전자는 발현이 되어 GLP-1 펩타이드를 발현하여 손상된 기능을 회복시킬수 있는 기능을 하게되며, 다른 장기나 세포로의 무분별한 전달을 최소화하는데 역할을 하기도 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 유전자 전달용 나노입자에 결합될 수 있는 유전자의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 목적에 따라 원하는 표적에 전달되어 원하는 치료 효과를 발휘할 수 있는 어떠한 유전자도 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 유전자로는 질병과 관련된 치료 유전자의 정상 유전자, 표적 단백질의 발현 억제 유전자, 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 크고 작은 폴리뉴클레오티드, 라이보자임이나 siRNA를 포함하는 임의의 RNA 형태의 유전자가 포함될 수 있다. 구체적으로, 단일가닥 또는 이중가닥 DNA(deoxyribonucleic acid), 단일가닥 또는 이중가닥 RNA(ribonucleic acid), 플라스미드 형태 DNA(plasmid DNA; pDNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 리보자임, 촉매적 RNA 및 뉴클레오타이드 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자는 플라스미드 형태 DNA(pDNA) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 유전자는 유전자 약물일 수 있으며, 여기서 유전자 약물은 하나 이상의 질병 치료 또는 예방을 약효로 나타내는 유전자를 의미한다.
상기 유전자는 인슐린 분비성 펩타이드로, GLP-1을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 글루카곤 유사 펩타이드-1 유전자 (GLP-1, Glucagon like peptide-1 gene), GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 또는 엑센딘-4(exendin-4)일 수 있다.
본 발명에서 “GLP-1 유전자”, “GLP-1 변이체”의 용어는 해당 유전자를 코딩하는상기 핵산(DNA) 분자를 지칭하는 것으로 사용된다. 그외 GLP-작용제, 리라글루티드 또는 엑센딘-4 등도 유전자의 나열을 의미하는 경우에는 해당 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산(DNA) 분자를 지칭하는 것으로 사용된다.
상기 GLP-1 유전자, GLP-1 변이체 또는 GLP-1 유도체는 환형(circular) 또는 선형(linear) 플라스미드에 모두 포함되어 발현될 수 있다. 상기 GLP-1 변이체는 GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), Val8-GLP-1(7-37), Gln8-GLP-1(7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37), Thr18-Lys18-GLP-1(7-37), Lys18-GLP-1(7-37), His7-GLP-1 (7-37), Ser8-GLP-1(7-37) 또는 Tyr8-GLP-1(7-37)로 예시될 수 있으며, 이들의 서열목록은 US 2013-0210717 A1 에 공지되어 있다. 상기 GLP-1 유전자, GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 또는 엑센딘-4(exendin-4)를 이용하여 유전자 전달용 나노입자로 복합화하여 생체 내 투여시 우수한 혈당 저하 효과를 얻을 수 있으며, 이로 인해 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 이온성 고분자의 작용기 수에 따라 공유결합되는 정도가 달라질 수 있다. 바람직하게 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 이온성 고분자는 1 : 1 내지 1 : 300의 몰비로 공유결합될 수 있다.
바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 양이온성 고분자의 경우 1 : 1 내지 1 : 100의 몰비로 공유결합될 수 있다.
바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 헤파린의 경우 1 : 1 내지 1 : 30의 몰비로 공유결합될 수 있다.
바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 히알루론산의 경우에는 1 : 1 내지 1 : 200의 몰비로 공유결합될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 전달용 나노입자는 입자 크기에 관계없이 흡수가 가능하나, 바람직하게는 500 nm 이하일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 100 내지 300 nm이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 전달용 나노입자의 제타 전위는 나노입자의 표면에 사용된 이온성 고분자의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 구체적으로, 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 양이온성 고분자 및 유전자 간의 정전기적 상호작용으로 형성된 유전자 전달용 나노입자는 10 내지 30 mV 범위의 제타 전위를 나타낼 수 있다. 또한, 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 음이온성 고분자, 양이온성 고분자 및 유전자 간의 정전기적 상호작용으로 형성된 유전자 전달용 나노입자는 -10 내지 -30 mV 범위의 제타 전위를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자 및 유전자는 1 : 1 내지 1 : 200의 몰비, 바람직하게는 1 : 1 내지 1 : 100의 몰비로 결합될 수 있다. 상기의 결합 비율은 유전자의 발현율 및 세포 내 전달되는 유전자 전달용 나노입자로 인한 세포 독성에 따른 세포성장에 대한 부작용이 없는 범위이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 양온성 고분자 및 유전자는 1 : 1 내지 1 : 200 의 중량비/몰비, 바람직하게는 1 :3 내지 1 : 30 의 중량비/몰비로 혼합될 수 있다. 양이온성고분자가 결합할 수 있는 한계가 있고 최적의 강한 결합능력을 가질 수 있는 범위에서만 전달이 가능하기 때문에 상기 범위 내에서 양이온성 고분자와 유전자의 정전기적 상호작용에 따른 이온복합체의 형성이 잘 이루어진다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 음이온성 고분자, 양이온성 고분자 및 유전자는 3 : 1 : 1 내지 10 : 1: 200 의 중량비/몰비, 바람직하게는 3 : 1 : 1 내지 10 : 1: 30 의 중량비/몰비로 혼합될 수 있다. 상기 범위는 전하 대 전하(charge to charge)를 이용해서 결합력을 유지할 수 있는 최적의 범위로, 그 범위를 벗어나면 제형이 만들어지 않고 안정성을 잃어버린다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 전달용 나노입자의 N/P 비(담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자, 특히 양온성 고분자의 질소 원자 개수/유전자의 인산염 원자 개수)는 1 내지 200이다. 상기 N/P 비가 상기 범위 내로 포함되면 양이온성 고분자에 의한 유전자 안정화가 잘 이루어져 세포 흡수율이 높아지고 안정적인 유전자 전달용 나노입자를 형성할 수 있다.
또한, 본 발명은 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 고분자 및 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1, Glucagon like peptide-1), GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 또는 엑센딘-4(exendin-4)을 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 유전자 전달용 나노입자를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 유전자 전달용 나노입자는 인슐린 분비 펩타이드의 일종인 글루카곤 유사 펩타이드-1 (Glucagon like peptide 1, GLP-1) 유전자, GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 또는 엑센딘-4(exendin-4)을 치료 유전자로 포함하고 있어 타겟 세포에 흡수되어 인슐린 분비를 증가시키며, 혈중 포도당의 농도에 따른 인슐린 분비 (Glucose dependent secretion)를 일으켜 저혈당이 발생하지 않도록 한다. 따라서, 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "유효성분"이란 상기 조성물이 개체에 투여되는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 당뇨병의 예방 또는 치료하는 활성을 갖는 것을 포함한다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 마우스, 햄스터, 개, 고양이, 말, 소, 돼지 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 용어 "예방"이란, 상기 조성물이 투여되지 않은 것에 비하여 혈중 포도당의 농도가 높아지는 것을 방지하는 것을 포함한다. 용어 "치료"란 상기 조성물이 투여되지 않은 것에 비하여, 혈중 포도당의 농도를 낮추는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 유전자 전달용 나노입자를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 보강제 또는 부형제 등을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 환제, 경·연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭서제(elixirs) 등의 경구투여용 제제 또는 정맥내, 피하, 설하, 근육내 투여용 멸균성 수성 또는 오일상 용제의 비경구투여용 제제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및/또는 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 부형제로는 감미제, 결합제, 용해제, 용해보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡착제, 붕해제, 산화방지제, 방부제, 활탁제, 충진제, 방향제 등이 있으며, 이러한 부형제의 비율 및 성질은 선택된 정제의 용해도 및 화학적 특성, 선택된 투여경로 및 표준 약제 실무에 의해 결정될 수 있다. 부형제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스, 글라이신, 실리카, 탈크, 스테아린산, 스테린, 마그네슘 스테아린산염, 마그네슘 알루미늄 규산염, 녹말, 젤라틴, 트라가칸트 고무, 알지닌산, 소디움 알진산염, 메틸셀룰로오스, 소디움 카르복실메틸셀룰로오스, 아가, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화나트륨, 염화칼슘, 오렌지 엣센스, 딸기 엣센스, 바닐라 향 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여 형태로 제형화될 수도 있는데, 이러한 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이 때, 상기 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 상기 약학 조성물은 유효 성분, 즉, 상기 유전자 전달용 나노입자가 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합되어 용액 또는 현탁액으로 제조되고, 이러한 용액 또는 현탁액이 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 보다 바람직하게는 경구 투여 제형일 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 멸균되거나, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제를 더 포함할 수도 있고, 기타 치료적으로 유용한 물질을 더 포함할 수도 있으며, 혼합, 과립화 또는 코팅의 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물에서 유효성분인 상기 유전자 전달용 나노입자는 사람을 포함하는 포유류에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질병정도에 따라 달라질 수 있고, 1 일 1 회 또는 2 회 이상 분할되어 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
물질:
저-분자량의 헤파린 (Hep, average MW 5000 Da)은 메디플렉스(Mediplex Co., Ltd, 한국)로부터 구입하였고, 히알루론산 나트륨 (MW: 83 kDa)는 바이오랜드(Bioland Co., Ltd., 한국)로부터 구입하였고, TCA (PluronicTaurocholic acid sodium salt), DMF (dimethyl formamide), 프로타민(Prot), 키토산(CS), 아세톤, 4-NPC (4-methyl morpholin, 4-nitrophenyl chloroformate), TEA (trimethylamine), NHS (N-hydroxysuccinimide), EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride), EDA (ethylene diamine) 및 시스타민 이염산염은 sigma chemical.co (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. CaCo2 세포, MDCK-ASBT 및 MDCK 세포주는 한국세포주은행으로부터 구입하였다. pDNA 유전자는 Escherichia coli RR1으로부터 유래된 Plasmid DNA (sigma-aldrich사, Product Codes D4154 and D3404)을 사용하였다.
담즙산이 공유결합된 양이온성 고분자의 제조
실시예 1 : 타우로콜린산이 공유결합된 프로타민(Protamine-Taurocholic acid conjugate, 이하 'Prot-TCA'라 함)의 제조
투명한 용액이 될 때까지 0℃에서 TCA(taurocholic acid) (1 mmol)을 DMSO(dimethyl sulfoxide) (5 mL)에 용해시켰다. 그 후 TEA(triethylamine) (3 mmol) 및 4-NPC(4-nitrophenyl chloroformate) (2.5 mmol)을 차례로 가하고, 0℃에서 30분, 상온에서 30분간 반응시켰다. Prot(Protamine) (0.1 mmol)을 2차 증류수(double distilled water) (10 mL)에 용해시킨 후 상기 반응용액에 가하고 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 반응액을 투석막 (MWCO: 1000Da)을 이용하여 매 6시간마다 매질을 바꾸면서 3일동안 2차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조하여 Prot-TCA을 수득하였다(수득율 78±2%, 도 2).
1H NMR 및 TNBSA 분석을 통해 프로타민에 타우로콜린산이 공유결합되었음을 확인하였다(도 3).
실시예 2 : 타우로콜린산이 공유결합된 키토산(Chitosan-Taurocholic acid conjugate, 이하 'CS-TCA'라 함)의 제조
투명한 용액이 될 때까지 0℃에서 TCA (1 mmol)을 DMSO (5 mL)에 용해시켰다. 그 후 TEA (3 mmol) 및 4-NPC (2.5 mmol)을 차례로 가하고, 0℃에서 30분, 상온에서 30분간 반응시켰다. CS(Chitosan) (0.01 mmol)을 2차 증류수 (20 mL)에 용해시킨 후 상기 반응용액에 가하고 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 반응액을 투석막 (MWCO: 1000Da)을 이용하여 매 6시간마다 매질을 바꾸면서 3일동안 2차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조하여 CS-TCA을 수득하였다(수득율 92±2%, 도 4).
1H NMR 및 TNBSA 분석을 통해 키토산에 타우로콜린산이 공유결합되었음을 확인하였다(도 5).
(구조 확인)
상기 Prot-TCA 및 CS-TCA은 각각 Prot 및 CS의 아민 기가 TCA의 하이드록실 기에 공유결합되어 제조되었다. 이를 확인하기 위하여 D2O에 Prot-TCA 및 CS-TCA를 각각 10mg/mL로 용해시킨 후 1H NMR 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 3 및 도 5에 도시하였으며, 이로부터 TCA와 Prot 사이의 아미드 결합 컨쥬게이션 및 TCA와 CS 사이의 아미드 결합 컨쥬게이션에 대한 피크가 δ 8 ppm에서 검출되었다.
또한, 상기 Prot-TCA 및 CS-TCA의 아민기 함량을 알아보기 위하여 TNBSA (trinitro benzene sulphonate) 분석을 통해 Prot과 CS 각각에 TCA가 공유결합된 후 아미노화 정도를 정량화하였다. 그 결과 Prot-TCA는 Prot로의 TCA 공유결합 전에 비해 53%로, TCA의 공유결합 이후 아민기 함량이 감소되었음을 확인하였다.
실시예 3 : 타우로콜린산이 공유결합된 폴리아미도아민 (polyamidoamine-Taurocholic acid conjugate, 이하 'PAMAM-TCA'라 함)의 제조
Prot(Protamine) 대신에 폴리아미도아민를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 PAMAM-TCA를 제조하였으며, FT-IR과 FT-NMR을 통해 구조를 확인하였다(수득율 50%, 도 6).
실시예 4 : 타우로콜린산이 공유결합된 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine-Taurocholic acid conjugate, 이하 'PLL-TCA'라 함)의 제조
Prot(Protamine) 대신에 폴리-L-라이신을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 PLL-TCA를 제조하였으며, FT-IR과 FT-NMR을 통해 구조를 확인하였다(수득율 55%, 도 7).
담즙산이 공유결합된 양이온성 고분자 및 유전자를 포함하는 나노입자의 제조
실시예 5 : 타우로콜린산이 공유결합된 프로타민 및 GLP-1을 코딩하는 유전자를 포함하는 나노입자(이하 'Prot-TCA/GLP-1'이라 함)의 제조
10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4)에 용해된 Prot-TCA (1mg/mL)를 스톡 용액(stock solution)으로 사용하였다. GLP-1(Glucagon like peptide-1)을 코딩하는 유전자 (7.780 mg)를 10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4) (1.922 mL)에 용해시켜 GLP-1 유전자 용액을 제조하였다. gentle vortex 하에서 GLP-1 유전자 용액 (10 mL)을 스톡 Prot-TCA 용액 (10 mL)에 드랍와이즈 첨가하였다. 그런 다음, 반응물을 상온에서 1시간동안 방치하고 2일동안 동결건조하여 Prot-TCA/GLP-1을 수득하였다[도 8].
실시예 6 : 타우로콜린산이 공유결합된 키토산 및 GLP-1을 코딩하는 유전자를 포함하는 나노입자 (이하, 'CS-TCA/GLP-1'이라 함)의 제조
상기 실시예 5의 Prot-TCA 대신에 CS-TCA를 사용한 것으로 제외하고는 상기 실시예 5과 동일한 방법으로 CS-TCA/GLP-1을 수득하였다.
입자 크기 및 제타 전위를 분석하기 위하여 D2O에 Prot-TCA/GLP-1 (실시예 5) 및 CS-TCA/GLP-1 (실시예 6)을 각각 1mg/mL로 용해시켰다.
(나노입자의 형태학적 분석)
TEM(Transmission electron microscopy) 및 광산란 입자 분석기(Dynamic Light scattering particle size analyzer)를 이용하여 Prot-TCA/GLP-1 (실시예 5)의 형태 및 입자 크기 분포를 관찰하였다.
상기 나노입자의 크기는 평균 150 nm 정도이고, 상대적으로 균일한 크기의 분포를 나타내었다.
(나노입자의 표면 전하)
제타전위 분석기(Zeta analyzer)를 이용하여 상기 실시예 5에서 제조된 나노입자의 제타전위를 측정한 결과, 양성의 제타 전위를 나타내었다. 이처럼 표면 전하가 양전하를 띤다는 것은 음전하를 띠는 GLP-1을 코딩하는 유전자가 유전자 전달 복합체 내부에 완전히 둘러싸여 있음을 의미하고, 양성의 표면 전하는 유전자 전달 나노입자의 세포 내로의 유입을 용이하게 한다. 또한, 입자들 사이에 정전기적 반발력을 일으켜 입자들끼리의 응집 현상을 감소시킨다.
(나노입자의 안정성)
상기 실시예 5 및 6에서 제조된 나노입자의 안정성을 확인하기 위하여 겔 리타데이션(Gel retardation) 분석을 실시하였다.
겔 리타데이션 실험은 1% agaros 겔과 1x TBE buffer 용액을 사용하여 수행되었다. 본 발명의 나노입자에 봉입된 유전자 GLP-1은 0.5 ㎍/mL EtBr (ethidium bromide)로 염색되어져 겔 상에 나타났다. 상기 실험은 100V에서 30분동안 진행되었다.
그 결과, Prot-TCA에 GLP-1의 복합화 및 CS-TCA에 대한 GLP-1을 코딩하는 유전자의 복합화는 1 : 10 이상의 몰비에서 이루어짐을 확인하였다. 특히, 실시예 5의 Prot-TCA와 GLP-1의 복합화가 1 : 150의 몰비, 실시예 6의 CS-TCA와 GLP-1을 코딩하는 유전자의 복합화가 1 : 10의 몰비에서 이루어진 경우 GLP-1을 코딩하는 유전자 응축으로 인한 지연 현상이 야기되어 GLP-1을 코딩하는 유전자의 이동성이 완전히 지연되었다. 이로부터 상기 Prot-TCA 및 CS-TCA 각각은 GLP-1을 코딩하는 유전자을 효과적으로 응축시켜 유전자 전달 복합체 Prot-TCA/GLP-1 및 CS-TCA/GLP-1가 형성되었음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 나노입자는 유전자와 복합체를 형성함으로써 유전자를 전달하는 유전자 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.
(혈청 내 안정성)
상기 실시예 5 및 6에서 제조된 나노입자의 혈청 내 안정성을 확인하기 위하여 아래와 같이 실험을 실시하였다.
Prot-TCA/GLP-1(실시예 5) 및 CS-TCA/GLP-1(실시예 6)를 각각 20% 혈청 하에 37℃조건에서 48시간동안 보관한 뒤, 0.5M 의 EDTA를 처리하였다. 그런 다음, Prot-TCA/GLP-1(실시예 5) 및 CS-TCA/GLP-1(실시예 6) 각각으로부터 GLP-1을 코딩하는 유전자를 분리하기 위해 1% SDS를 첨가하였다.
그 결과, free 유전자 GLP-1과 비교하여 Prot-TCA/GLP-1(실시예 5) 및 CS-TCA/GLP-1(실시예 6) 각각에 봉입된 GLP-1을 코딩하는 유전자는 48시간 동안 혈청으로부터 분해되지 않았으며, 혈청 내에서 매우 안정함을 확인하였다.
(pH 조건에 대한 입자 안정성)
다양한 pH 조건에서 본 발명의 나노입자의 안정성을 확인하였다.
즉, 위장관(GI tract)의 위, 십이지장 및 회장(ileum) 단편에서의 pH 조건과 유사한 pH 3, pH5 및 pH 7.4의 세 가지 pH 용액에 Prot-TCA/GLP-1(실시예 5) 및 CS-TCA/GLP-1(실시예 6) 각각을 넣고, 입자 크기를 관찰하였다. 그 결과, Prot-TCA/GLP-1 (실시예 5)및 CS-TCA/GLP-1 (실시예 6) 모두 pH 3에서 24시간까지 안정함을 확인하였다.
실험예 1 : 시험관 내(in vitro) 유전자 발현 및 트랜스웰(transwell) 연구
ASBT(Apical Sodium-dependent Bile Salt Transporter)-과발현 MDCK 세포 및 Caco-2 세포주를 사용하여 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)의 발현을 관찰하였다.
실시예 5 및 6의 유전자 전달용 나노입자에 eGFP 유전자 4 μg 을 각각 로딩한 후, 상기 세포주들로부터 성공적인 발현 및 녹색 형광을 관찰하였다.
그 다음, 이중층 세포배양 기술에서 유전자 복합체의 전달을 연구하기 위하여, 트랜스웰 플레이트의 정단 부위에서 Caco-2 단층을 배양하고, 기저 부위에서 MDCK-ASBT 세포주를 배양하였다. 그 결과 상기 나노입자들의 성공적인 전달이 관찰되었으며, 이로부터 TCA 분자는 이들 유전자 복합체의 흡수와 전달을 도와주는 역할을 하는 것을 알 수 있었다.
배지에서 당 수치에 반응하여 시험관 내 GLP-1 발현을 수치화하는 GLP-1 ELISA 키트를 사용하였으며, 그 결과, GLP-1을 코딩하는 유전자의 향상된 발현이 나타났다.
실험예 2 : 복합체의 생체 내(in vivo) 생체 분포(bio distribution)
eGFP 로딩된 실시예 5 및 6의 유전자 전달용 나노입자의 생체 내 생체 분포를 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
Balb/c 마우스를 나무로된 케이지에 가두고 규칙적으로 음식과 물을 제공해주었다. 치료 유전자 복합체의 경구 투여 전 12시간동안 상기 동물들을 금식시켰다. 금식 12시간 후 eGFP 유전자 100 μg을 함유하는 실시예 5 및 6의 유전자 전달용 나노입자 각각을 경구 위관영양법(oral gavage)으로 투여하였다. 투여 24시간 후 동물들을 희생시키고 공초점 현미경(confocal microscope)으로 생체 내 유전자 발현 및 시료의 생체 내 분포를 정량화하였다.
그 결과, 본 발명의 유전자 전달 나노입자로 인하여 회장과 간 단편에서의 향상된 eGFP 유전자 발현을 확인하였다. 또한, 프로타민과 키토산 각각에 공유결합된 TCA는 GI(gastrointestinal) 분해를 방지하고 eGFP의 흡수와 발현을 도와줌을 알 수 있었다.
실험예 3 : 생체 내(in vivo) GLP-1 을 코딩하는 유전자의 발현 및 혈당 수치의 조절
5주령의 ZDFR(Zucker diabetic fatty rats)을 나무로된 케이지에 가두고 규칙적으로 음식과 물을 제공해주었다. 실시예 5 및 6의 유전자 전달용 나노입자의 경구 투여 전 12시간동안 상기 동물들을 금식시켰다. 금식 12시간 후 실시예 5 및 6의 유전자 전달용 나노입자 100 μg을 각각 경구 투여시켰다. 투여 24시간 후 소정의 시간 간격으로 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈당 수치를 측정하였다. 놀랍게도 혈당 수치가 정상 혈당 수치로 조절되었음을 확인하였다. 5일 후, 실험동물들을 희생시키고 ELISA 키트로 회장과 간 단편에서의 GLP-1 및 인슐린의 발현을 분석하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 본 발명의 유전자 전달용 나노입자의 경구 투여 후 GLP-1 펩타이드와 인슐린 단백질의 향상된 발현이 나타났다.
실험예 4 : GLP-1 유전자 전달용 복합체의 생체 내(in vivo) 독성
4주령의 SD쥐(Sprague Dowley rats)를 나무로된 케이지에 가두고 규칙적으로 음식과 물을 제공해주었다. 실시예 5 및 6의 유전자 전달용 나노입자 100 μg를 각각 경구 및 정맥 투여하였다. 소정의 시간 간격으로 24시간 동안 실험동물의 혈액을 채취하여 일반 혈액 내용물(complete blood content)을 분석하고 간 및 신장의 활성을 결정하는 생물학적 마커의 발현을 평가하였다. 그 결과, 본 발명의 유전자 전달 복합체를 매우 높은 농도로 투여하였을 지라도 독성이 거의 나타나지 않았다.
투여 7일 후 동물들을 희생시키고, 회장과 간 단편의 면역 조직 검사를 실시하였다. 그 결과, 조직 내 어떠한 염증도 관찰되지 않았으며, 독성 역시 거의 나타나지 않았다.
따라서, 본 발명의 유전자 전달 복합체는 안전하고, 무독성이며, 당뇨병 치료에 사용가능함을 알 수 있었다.
실시예 7 : 타우로콜린산이 공유결합된 프로타민 및 pDNA를 포함하는 나노입자(이하 'pDNA/Prot-TCA'이라 함)의 제조
타우로콜린산과 프로타민의 공유결합은 타우로콜린산의 하이드록실 그룹과 프로타민의 아민그룹을 Triethylamine(이하 TEA)과 4-nitrophynyl chloroformate(이하 4-NPC)를 이용하여 제조하였다.
Prot - TCA의 제조
타우로콜린산 50mmol을 녹인 10ml의 증류수에 4-NPC 70mmol을 DMF 용액 3ml에 완전히 녹여 추가하고 TEA용액을 타우로콜린산 용액이 완전히 노란색으로 변할 때까지 추가(100 μl)하였다. 이후 5mmol의 프로타민을 추가한 후 24시간 교반하여 상온에서 반응을 진행하였다. 반응이 종료된 후 투석을 통해 미반응물을 제거하는데, 1kDa크기의 멤브레인 필터용기를 이용하며 24시간 통안 증류수에서 투석을 진행하였다. 이후 동결건조를 통하여 습득물 Prot-TCA을 수득하였다.
pDNA / Prot - TCA 의 제조
위의 실험 방법으로 제조된 Prot-TCA(150 nmol ~ 50 nmol)와 pDNA(1 nmol)를 각각 HEPES 버퍼용액에 추가하여 준비한다. 이후 제조된 Prot-TCA 용액을 교반하여 주고 동시에 pDNA가 들어간 HEPES 버퍼용액을 10 μl씩 추가한다. 정해진 량의 pDNA를 모두 추가한 이후 10분간 추가로 교반하여 주고 반응을 마무리하여 최종 습득물 pDNA/Prot-TCA을 수득하였다(도 8).
(pDNA/Prot-TCA의 pH에 대한 안정성 시험)
상기 제조된 pDNA/Prot-TCA의 안정성을 확인하기 위해 증류수, pH 5.2, 1.8, 7.4의 HEPES 버퍼용액 조건으로 시험하였다. 시험되는 인자는 시간에 따른 크기를 측정하여 pDNA/Prot-TCA와 pDNA/Prot의 안정성을 측정하며, 시간은 시험이 시작된 직후, 6, 12, 24 시간에 pDNA/Prot-TCA용액을 취하여 분석한다.
그 결과 pDNA/Prot-TCA는 상기 제시된 조건에서 뛰어난 안정성을 보이는 것을 확인했으며, 이는 담즙산의 일종인 타우로콜린산의 결합으로 pH에 대한 안정성이 증가된 것으로 설명할 수 있다. 대조군으로서는 타우로콜린산이 결합되지 않은 pDNA/Prot을 이용하였으며, pH5.2, 7.4 그리고 증류수 조건에서는 시간에 따라 크기가 증가하는 경향을, pH1.8에서는 시간에 따라 크기가 감소하는 경향을 띄는 것을 확인했다. 특히 pH1.8에서 크기가 감소되는 경향을 보이는 것은 프로타민이 산성의 조건에 취약하여 분해가 일어나며 pDNA와의 물리적 결합이 깨지는 현상 때문이다.
(pDNA/Prot-TCA의 SEM이미지를 이용한 합성확인)
제조된 pDNA/Prot-TCA를 silicon wafer에 올린후 자연건조를 하여 분석할 샘플을 준비한다. 분석은 Scanning Electron Microscopy를 이용하였으며, 10.0kV, x2,000배율의 조건으로 촬영되었다.
결과적으로 제조된 pDNA/Prot-TCA는 입자의 100nm 크기를 가지는 입자 모양을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 관찰된 모든 입자들 또한 동일한 크기를 가지는 경향을 확인하였다.
(HCT 116 세포를 이용한 pDNA/Prot-TCA의 독성시험)
제조된 pDNA/Prot-TCA의 독성을 확인하기 위해 HCT 116 세포를 이용하였으며, 독성의 검증방법으로는 MTT 실험방법을 이용하였다.
이론적으로 알려진 바와 같이 프로타민은 85%이상의 생존율을 보였으며, 타우로콜린사이 공유결합된 프로타민 또한 80%이상의 높은 생존율을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
(Confocal microscopy를 이용한 세포 흡수능 확인 시험)
제조된 pDNA/Prot의 세포 흡수능을 확인하기 위해 HCT 116 세포를 이용하였다. 실험 방법은 HCT 116 세포를 105 cell/well의 농도로 8 well plate에 분양시켜서 준비한 이후 샘플 Rhdamine-B가 결합된 pDNA/Prot과 pDNA/Prot-TCA를 주입한다. 2시간의 배양이후 PBS를 이용하여 3번의 세척과정을 걸치고 confocal microscopy를 이용하여 관찰한다.
그 결과 pDNA/Prot-TCA는 대조군인 pDNA/Prot보다 뛰어난 세포 흡수능을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 그 수치는 약 4배 이상으로 확인하였다.
(Caco-2 단일 층을 이용한 pDNA/Prot-TCA의 세포 투과능 검사)
pDNA/Prot-TCA의 세포 투과능을 검증하기 위해 Caco-2 세포를 단일 층으로 배양하여 시험하였다. 시험은 총 6시간 동안 진행이 되었으며, 10분, 30분, 1, 2, 4, 6시간에 샘플을 체취하여 검사하였다.
그 결과 pDNA/Prot-TCA는 대조군인 pDNA/Prot보다 뛰어난 세포 투과능을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 이후 동물실험에 있어서 소장을 통한 pDNA/Prot-TCA의 흡수가 가능하다는 것을 시사한다.
(경구투여를 통한 pDNA/Prot-TCA의 생체내 분포도 확인실험)
경구투여를 통한 pDNA/Prot-TCA의 생체내 분포도 확인실험을 위해 Rhodamine B가 결합된 프로타민을 이용하고 마우스는 Balb/c 7주령을 이용하였으며, 6시간의 금식이후 약물을 경구투여하고 0.2, 0.5, 2, 6, 12, 24 시간에서의 생체내 분포를 형광이미지와 형광수치를 통해 확인하였다.
그 결과 pDNA/Prot-TCA는 소장을 통해 흡수되며, 30분 내의 짧은 시간안에 소장에서 흡수가 진행이 되며, 2-6시간에 걸쳐 간으로 흡수된 이후 서서히 제거되는 현상을 확인하였다. 이는 기존의 알려진 타우로콜린산의 생체내 순환경로를 그대로 따라가는 것이며, 제조된 pDNA/Prot-TCA또한 타우로콜린산의 생체내 흡수효과를 방해하거나 해하지 않으며, 본래의 순환경로를 유지하는 것을 검증하였다.
실시예 8 : 타우로콜린산이 공유결합된 키토산 및 pDNA를 포함하는 나노입자(이하 'pDNA/CS-TCA'이라 함)의 제조
TCA -NPC의 제조
키토산에 TCA를 컨쥬게이션시키기 위하여, TCA (50 mmol)을 DMSO (10 mL)에 용해시킨 후 4-NPC(200mg) 및 TEA(100μg)를 가하고 상온에서 1시간동안 반응시켜 TCA-NPC를 제조하였다.
CS- TCA의 제조
키토산 (100mg)을 증류수에 용해시키고 제조된 TCA-NPC(20mg)를 추가하여 24시간 동안 교반시켰다. 이후 투석을 통해 미반응물을 제거하며, 투석은 1kDa의 브레인 필터용기를 이용하며 24시간 통안 증류수에서 투석을 진행하였다. 이후 동결건조를 통하여 최종 습득물 CS-TCA을 수득하였다.
pDNA /CS- TCA의 제조
위의 실험 방법으로 제조된 CS-TCA(150 nmol ~ 50 nmol)와 pDNA(1 nmol)를 각각 HEPES 버퍼용액에 추가하여 준비하였다. 이후 제조된 CS-TCA 용액을 교반하여 주고 동시에 pDNA가 들어간 HEPES 버퍼용액을 10 μl씩 추가하였다. 정해진 량의 pDNA를 모두 추가한 이후 10분간 추가로 교반하여 주고 반응을 마무리하여 최종 습득물 pDNA/CS-TCA을 수득하였다.
(전기영동 방법과 크기분석을 통한 pDNA/CS-TCA의 안정성 확인)
pDNA/CS-TCA의 안정성을 확인하기 위해 전기영동 방법과 그 크기를 측정하여 확인하였으며, 배경조건은 증류수를 이용하였다.
그 결과 제조된 pDNA/CS-TCA는 매우 안정적인 상태를 최소 24시간동안 유지하는 것을 확인하였다.
(표면전하 측정을 통한 pDNA/CS-TCA의 제조 검증)
pDNA/CS-TCA의 제조 검증을 위해 Zeta potential 분석기기를 이용하였으며, 표면전하(mV)를 측정하여 제조의 유무를 확인하였다.
기존의 pDNA는 -2.96 mV를 가지고 키토산은 36.12 mV를 가진다. 이후 pDNA/CS-TCA를 제조하면 19.55 ~ 25.68 mV를 가지는 데, 이는 양이온의 키토산이 음이온의 pDNA의 표면을 완전히 감싸 제조된 pDNA/CS-TCA가 양이온 표면전하를 가지는 것이다. 이를 통해 pDNA/CS-TCA의 완전한 제조를 확인하였다.
(pDNA/CS-TCA의 pH에 대한 안정성 시험)
상기 제조된 pDNA/CS-TCA의 안정성을 확인하기 위해 pH 5.2, 1.8, 7.4의 PBS 버퍼용액 조건으로 시험하였다. 시험되는 인자는 시간에 따른 크기를 측정하여 pDNA/CS-TCA의 안정성을 측정하며, 시간은 시험이 시작된 직후, 6, 12, 18, 24 시간에 pDNA/CS-TCA용액을 취하여 분석하였다.
그 결과 pDNA/CS-TCA는 상기 제시된 조건에서 뛰어난 안정성을 보이는 것을 확인했으며, 이는 담즙산의 일종인 타우로콜린산의 결합으로 pH에 대한 안정성이 증가됨을 알 수 있었다.
(MDCK-ASBT세포를 이용한 pDNA/CS-TCA의 독성시험)
제조된 pDNA/CS-TCA의 독성을 확인하기 위해 MDCK-ASBT 세포를 이용하였으며, 독성의 검증방법으로는 MTT 실험방법을 이용하였다.
결과적으로 pDNA/CS-TCA은 80%이상의 높은 생존율을 보이는 것을 확인하였다.
(Confocal microscopy를 이용한 세포 흡수능 확인 시험)
제조된 pDNA/CS-TCA의 세포 흡수능을 확인하기 위해 MDCK-ASBT 세포를 이용하였다. 실험 방법은 MDCK-ASBT 세포를 105 cell/well의 농도로 8 well plate에 분양시켜서 준비한 이후 샘플 Rhdamine-B가 결합된 pDNA/Chitosan과 pDNA/CS-TCA를 주입하였다. 2시간의 배양이후 PBS를 이용하여 3번의 세척과정을 걸치고 confocal microscopy를 이용하여 관찰하였다.
그 결과 pDNA/CS-TCA는 대조군인 pDNA/Chitosan보다 뛰어난 세포 흡수능을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 그 수치는 약 2배 이상인 것으로 확인하였다.
(Caco-2 단일 층을 이용한 pDNA/CS-TCA의 세포 투과능 검사)
pDNA/CS-TCA의 세포 투과능을 검증하기 위해 Caco-2 세포를 단일 층으로 배양하여 시험하였다. 시험은 총 6시간 동안 진행이 되었으며, 10분, 30분, 1, 2, 4, 6시간에 샘플을 체취하여 검사하였다.
그 결과 pDNA/CS-TCA는 대조군인 pDNA/Chitosan보다 뛰어난 세포 투과능을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 이후 동물실험에 있어서 소장을 통한 pDNA/CS-TCA의 흡수가 가능하다는 것을 알 수 있었다.
(pDNA/CS-TCA의 유전자 발현을 통한 유전자 전달능 검증)
pDNA/CS-TCA의 유전자 발현 효과 검증을 위해 Luciferase 방법을 이용하였다. 대조군으로서는 pDNA, pDNA/Chitosan 그리고 bPEI를 이용하였다.
그 결과 pDNA/CS-TCA는 음성 대조군인 pDNA, pDNA/Chitosan보다 최소 2배 최대 50배 이상의 효과를 가지는 것을 확인하였으며, 양성대조군인 bPEI보다도 뛰어난 유전자 전달효과를 가지는 것을 확인하였다.
(경구투여를 통한 pDNA/CS-TCA의 생체내 분포도 확인실험)
경구투여를 통한 pDNA/CS-TCA의 생체내 분포도 확인실험을 위해 Rhodamine B가 결합된 키토산을 이용하고 마우스는 Balb/c 7주령을 이용하였으며, 6시간의 금식이후 약물을 경구투여하고 12시간에서의 생체내 분포를 형광이미지를 통해 확인하였다.
그 결과 pDNA/CS-TCA는 소장 특히 회장을 통해 흡수되며, 간으로도 흡수가 진행되는 것을 확인하였다. 이는 기존의 알려진 타우로콜린산의 생체내 순환경로를 그대로 따라가는 것이며, 제조된 pDNA/Chitosan-TCA 또한 타우로콜린산의 생체내 흡수효과를 방해하거나 해하지 않으며, 본래의 순환경로를 유지하는 것을 검증하였다.
실시예 9 : 타우로콜린산이 공유결합된 폴리아미도아민 및 pDNA를 포함하는 나노입자(이하 'pDNA/PAMAM-TCA'이라 함)의 제조
TCA -NPC의 제조
키토산에 TCA를 컨쥬게이션시키기 위하여, TCA (50 mmol)을 DMSO (10 mL)에 용해시킨 후 4-NPC(200mg) 및 TEA(100μg)를 가하고 상온에서 1시간동안 반응시켜 TCA-NPC를 제조하였다.
PAMAM - TCA의 제조
폴리아미도아민 (100mg)을 HEPES 버퍼 용액에 용해시키고 제조된 TCA-NPC(20mg)를 추가하여 24시간 동안 교반시켰다. 이후 투석을 통해 미반응물을 제거하며, 투석은 1kDa의 브레인 필터용기를 이용하며 24시간 통안 증류수에서 투석을 진행하였다. 이후 동결건조를 통하여 최종 습득물 PAMAM-TCA을 수득하였다.
pDNA / PAMAM - TCA의 제조
위의 실험 방법으로 제조된 PAMAM-TCA(150 nmol ~ 50 nmol)와 pDNA(1 nmol)를 각각 HEPES 버퍼용액에 추가하여 준비하였다. 이후 제조된 MAM-TCA 용액을 교반하여 주고 동시에 pDNA가 들어간 HEPES 버퍼용액을 10 μl씩 추가하였다. 정해진 량의 pDNA를 모두 추가한 이후 10분간 추가로 교반하여 주고 반응을 마무리하여 최종 습득물 pDNA/PAMAM-TCA을 수득하였다.
실시예 10 : 타우로콜린산이 공유결합된 폴리-L-라이신 및 pDNA를 포함하는 나노입자(이하 'pDNA/PLL-TCA'이라 함)의 제조
TCA -NPC의 제조
키토산에 TCA를 컨쥬게이션시키기 위하여, TCA (50 mmol)을 DMSO (10 mL)에 용해시킨 후 4-NPC(200mg) 및 TEA(100μg)를 가하고 상온에서 1시간동안 반응시켜 TCA-NPC를 제조하였다.
PLL- TCA의 제조
폴리-L-라이신 (50mg)을 HEPES 버퍼 용액에 용해시키고 제조된 TCA-NPC(20mg)를 추가하여 24시간 동안 교반시켰다. 이후 투석을 통해 미반응물을 제거하며, 투석은 1kDa의 브레인 필터용기를 이용하며 24시간 통안 증류수에서 투석을 진행하였다. 이후 동결건조를 통하여 최종 습득물 PLL-TCA을 수득하였다.
pDNA /PLL- TCA의 제조
위의 실험 방법으로 제조된 PLL-TCA(150 nmol ~ 50 nmol)와 pDNA(1 nmol)를 각각 HEPES 버퍼용액에 추가하여 준비하였다. 이후 제조된 PLL-TCA 용액을 교반하여 주고 동시에 pDNA가 들어간 HEPES 버퍼용액을 10 μl씩 추가하였다. 정해진 량의 pDNA를 모두 추가한 이후 10분간 추가로 교반하여 주고 반응을 마무리하여 최종 습득물 pDNA/PLL-TCA을 수득하였다.
실시예 11 : TCA가 이황화 결합으로 공유결합된 헤파린(이하, 'Hep-S-S-TCA'라 함)의 제조
Hep-S-S-TCA의 합성은 헤파린과 시스타민의 컨쥬게이트로 시작되었다. 즉, 헤파린의 카복실기는 EDC(1-ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)/NHS(N-bromosuccinimide) chemistry를 통해 시스타민의 아민기와 공유결합되었다.
Hep-S-S-NH2의 제조
헤파린 (100 mg)을 10 mL의 MES 버퍼 (50mmol, pH 6)에 용해시키고, 용액이 투명해질 때까지 냉욕에서 교반시켰다. 과량의 EDC (헤파린에 대해 2.4 당량)를 가하고 10분간 교반시킨 다음, 상온에서 과량의 NHS (EDC에 대해 2.5배 당량)을 가하고 10분간 교반시켰다. EDC와 NHS에 의한 카복실기 활성 후 시스타민 (100μg)을 가하고 pH 7에서 24시간동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 2차 증류수로 24시간동안 투석하고 동결건조하여 Hep-S-S-NH2를 수득하였다(도 9).
TCA -NPC의 제조
활성화된 헤파린에 TCA를 컨쥬게이션시키기 위하여, TCA (50 mmol)을 DMSO (10 mL)에 용해시킨 후 4-NPC(200mg) 및 TEA(100μg)를 가하고 상온에서 1시간동안 반응시켜 TCA-NPC를 제조하였다(도 10).
Hep-S-S-TCA의 제조
그 후 DMSO (10 mL)에 용해된 활성화된 헤파린(100μg)을 가하고 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 반응액을 투석막(MWCO: 1000 Da)을 이용하여 매 3시간마다 매질을 바꾸면서 48시간동안 2차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조하여 Hep-S-S-TCA을 수득하였다(수득율 80±5%, 도 11, 도 12).
Hep-S-S-TCA는 세포 내 글루타티온(glutathione) 농도에 반응하여 치료 유전자를 국부적으로 방출하도록 합성되었으며, 도 9 내지 도 11에 Hep-S-S-TCA을 제조하기 위한 반응식을 예시하였다.
헤파린에 시스타민의 컨쥬게이션은 1H NMR 및 TNBS 분석에 따라 각각 정성적 및 정량적으로 결정되었으며[도 12], 이로부터, 각각의 헤파린 분자는 5개의 이황화 결합으로 결합된 TCA 분자가 부착되어 있음을 알 수 있었다.
실시예 12 : TCA가 이황화(Disulfide) 결합으로 공유결합된 헤파린, pDNA 및 프로타민을 포함하는 나노입자 (이하, pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA'라 함)의 제조
Hep-S-S-TCA의 제조에 있어서 상기 실시예11의 방법을 이용하였다.
pDNA / Prot의 제조
프로타민(150 nmol ~ 50 nmol)과 pDNA(1 nmol)를 각각 HEPES 버퍼용액에 추가하여 준비한다. 이후 프로타민 용액을 교반하여 주고 동시에 pDNA가 들어간 HEPES 버퍼용액을 10 μl씩 추가하였다. 정해진 량의 pDNA를 모두 추가한 이후 20분간 추가로 교반하여 주고 반응을 마무리하여 최종 습득물 pDNA/Prot을 수득하였다.
pDNA / Prot /Hep-S-S- TCA의 제조
Hep-S-S-TCA(20mg)과 pDNA/Prot을 각각 HEPES 버퍼용액에 추가하여 준비하였다. 이후 Hep-S-S-TCA 용액을 교반하여 주고 동시에 pDNA/Prot가 들어간 HEPES 버퍼용액을 1 ml씩 추가하였다. 정해진 량의 pDNA/Prot를 모두 추가한 이후 30분간 추가로 교반하여 주고 반응을 마무리하여 최종 습득물 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA을 수득하였다.
(전기영동 방법을 통한 pDNA/Prot의 제조 확인)
pDNA/Prot의 제조를 확인하기 위해 전기영동 방법을 이용하여 확인하였으며, 배경조건은 HEPES 버퍼용액을 이용하였고, 무게비를 1:0.5, 1, 2, 3, 4, 6비를 비교하여 최적의 조건을 확인하였다.
그 결과 제조된 pDNA/Prot는 매우 안정적으로 제조되었으며, 최소 1:2 무게비를 이용하여 제조하였을 때 완전히 제조됨을 확인하였다.
(입자의 크기 및 표면전하 분석을 통한 pDNA/Prot의 제조 확인)
pDNA/Prot의 제조를 확인하기 위해 입자의 크기 및 표면전하 분석을 이용하여 확인하였으며, 배경조건은 HEPES 버퍼용액을 이용하였고, 무게비를 1:0.5, 1, 2, 3, 4, 6비를 비교하여 최적의 조건을 확인하였다.
그 결과 제조된 pDNA/Prot는 매우 안정적으로 제조되었으며, 결과적으로 1:3 무게비를 이용하여 제조하였을 때 최적의 조건으로 제조됨을 확인하였다.
(전기영동 방법과 입자크기 분석을 통한 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 제조 확인)
pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 제조를 확인하기 위해 전기영동 방법과 입자크기 분석을 통하여 확인하였으며, 배경조건은 HEPES 버퍼용액을 이용하였고, 무게비를 1:3, 4.5비를 비교하여 최적의 조건을 확인하였다.
그 결과 제조된 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA는 매우 안정적으로 제조되었으며, 최소 1:3 무게비를 이용하여 제조하였을 때 완전히 제조됨을 확인하였다.
(pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 TEM이미지를 이용한 합성확인)
제조된 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA를 silicon wafer에 올린후 자연건조를 하여 분석할 샘플을 준비한 후 Transmission Electron Microscopy를 이용하여 분석하였다.
그 결과 제조된 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA는 입자의 100nm 크기를 가지는 입자 모양을 가지는 것을 확인할 수 있었으며 표면의 Hep-S-S-TCA의 코팅층을 관측함으로서 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA가 완전히 제조됨을 확인하였다. 또한 관찰된 모든 입자들 또한 동일한 크기를 가지는 경향을 확인하였다.
(pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 유전자 봉입율 측정)
pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 유전자 봉입율 측정을 위해 전기영동의 방법을 이용하였으며, 전기영동을 통해 분리된 DNA의 양을 측정함으로서 봉입율을 측정하였다.
그 결과 무게비 1:6에서 70%의 봉입율로 최대의 봉입 효과를 가지는 것을 확인하였고 1:3에서는 약15%의 봉입효과를 가짐을 확인하였다. 1:6에서 최대의 봉입효과를 가지지만, 상기 전기영동 방법과 입자크기 분석을 통한 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 제조 확인 실험에서 언급하였듯 유전자 전달을 위해 최적화된 무게비는 1:3으로 고정하였다.
(전기영동 방법을 통한 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 안정성 확인)
pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 안정성을 확인하기 위해 전기영동 방법을 이용하여 확인하였으며, 배경조건은 pDNA 분해요소인 DNAse가 포함된 HEPES 버퍼 용액을 이용하였다.
그 결과 제조된 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA는 pDNA 분해요서인 DNAse로부터 pDNA를 효과적으로 보호하며, 매우 안정적인 상태를 유지하는 것을 확인하였다.
(Confocal microscopy를 이용한 세포 흡수능 확인 시험)
제조된 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 세포 흡수능을 확인하기 위해 MDCK-ASBT 세포를 이용하였다. 실험 방법은 MDCK-ASBT 세포를 105 cell/well의 농도로 8 well plate에 분양시켜서 준비한 이후 샘플 Rhdamine-B가 결합된 pDNA/Prot과 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA를 주입하였다. 2시간의 배양이후 PBS를 이용하여 3번의 세척과정을 걸치고 confocal microscopy를 이용하여 관찰하였다.
그 결과 대조군으로서 사용된 pDNA/Prot 또한 양이온의 표면전하를 가지고 있어서 약간의 흡수능은 가지는 것을 보였지만, 결과적으로 제조된 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA가 대조군인 pDNA/Prot보다 뛰어난 세포 흡수능을 가지는 것을 확인하였다.
(Confocal microscopy를 이용한 세포 발현 확인 시험)
제조된 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 세포 발현 효과를 확인하기 위해 HepG2 세포를 이용하였다. 실험 방법은 HepG2세포를 105 cell/well의 농도로 8 well plate에 분양시켜서 준비한 이후 샘플 eGFP가 추가된 pDNA/Prot과 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA를 주입하였다. 24시간의 배양이후 PBS를 이용하여 3번의 세척과정을 걸치고 confocal microscopy를 이용하여 관찰하였다.
그 결과 제조된 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA가 eGFP 유전자를 성공적으로 전달하여 초록색 형광을 가지는 것을 확인하였으며, 그 정도가 대조군인 pDNA/Prot보다 월등히 높은 것을 확인하였다.
(MDCK-ASBT세포를 이용한 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 독성시험)
제조된 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 독성을 확인하기 위해 MDCK-ASBT 세포를 이용하였으며, 독성의 검증방법으로는 MTT 실험방법을 이용하였다.
결과적으로 Hep-S-S-TCA는 90% 이상, pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA 또한 90% 이상의 높은 생존율을 보이는 것을 확인하였다.
(Caco-2 단일 층을 이용한 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 세포 투과능 검사)
pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 세포 투과능을 검증하기 위해 Caco-2 세포를 단일 층으로 배양하여 시험하였다. 시험은 총 6시간 동안 진행이 되었으며, 10분, 30분, 1, 2, 4, 6시간에 샘플을 체취하여 검사하였다.
그 결과 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA는 대조군인 pDNA/Prot/CSA-TCA보다 낮은 세포 투과능을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 그 수치는 pDNA/Prot과 유사한 것으로 확인하였다. 이는 이황화 결합(-S-S-)에 의해 타우로콜린산이 Caco-2세포 내에서 분리되어 타우로콜린산만이 투과를 하고 pDNA/Prot/Hep는 세포내에 축적되는 것을 의미한다.
(경구투여를 통한 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 생체내 분포도 확인실험)
경구투여를 통한 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA의 생체내 분포도 확인실험을 위해 Rhodamine B가 결합된 프로타민을 이용하고 마우스는 Balb/c 7주령을 이용하였으며, 6시간의 금식이후 약물을 경구투여 혹은 정맥투여하고 6시간에서의 생체내 분포를 조직 그리고 세포단위의 형광이미지를 통해 확인하였다.
그 결과 pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA는 소장 특히 회장을 통해 흡수되며, 간으로도 약간의 흡수가 진행되는 것을 확인하였다. 이는 소장까지는 기존의 알려진 타우로콜린산의 생체내 순환경로를 그대로 따라가는 것이며, 소장에서 이황화 결합(-S-S-)이 분리되어 제조된 pDNA/Prot/Hep가 타우로콜린산의 순환경로를 벗어나 소장에 축적되는 것을 의미한다.
실시예 13 : TCA가 이황화 결합으로 공유결합된 키토산(이하, 'CS-S-S-TCA'라 함)의 제조
Chitosan -S-S- COOH의 제조
키토산 (100 mg)을 10 mL의 MES 버퍼 (50mmol, pH 6)에 용해시키고, 용액이 투명해질 때까지 냉욕에서 교반시킨다. 과량의 EDC (키토산에 대해 5 당량)를 가하고 10분간 교반시킨 다음, 상온에서 과량의 NHS (EDC에 대해 2.5배 당량)을 가하고 10분간 교반시켰다. EDC와 NHS에 의한 카복실기 활성 후 시스테인 (500μg)을 가하고 pH 7에서 24시간동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 2차 증류수로 24시간동안 투석하고 동결건조하여 Chitosan-S-S-COOH를 수득하였다.
TCA -NH2의 제조
활성화된 키토산 Chitosan-S-S-COOH에 TCA를 컨쥬게이션시키기 위하여, TCA (50 mmol)을 DMSO (10 mL)에 용해시킨 후 4-NPC(200mg) 및 TEA(100μg)를 가하고 상온에서 1시간동안 반응시켜 TCA-NPC를 제조하였다.
이후 제조된 TCA-NPC(100mg)을 DMF에 완전히 용해하고 4-MMP를 30μl 추가하여 4시간동안 반응한다. 이후 에틸렌디아민을 1ml추가하여 16시간 동안 반응시켜 TCA-NH2를 제조하였다.
CS-S-S- TCA의 제조
그 후 DMSO (10 mL)에 용해된 활성화된 키토산 Chitosan-S-S-COOH (100μg)을 가하고 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 반응액을 투석막(MWCO: 1000 Da)을 이용하여 매 3시간마다 매질을 바꾸면서 24시간동안 pH7의 조건인 2차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조하여 CS-S-S-TCA을 수득하였다. (수득율50%, 도 13, 도 14).
실시예 14 : TCA가 이황화(Disulfide) 결합으로 공유결합된 키토산 및 pDNA을 포함하는 나노입자 (이하, pDNA/CS-S-S-TCA'라 함)의 제조
CS-S-S-TCA(20nmol)와 pDNA(1 nmol)를 각각 HEPES 버퍼용액에 추가하여 준비하였다. 이후 제조된 CS-S-S-TCA 용액을 교반하여 주고 동시에 pDNA가 들어간 HEPES 버퍼용액을 10 μl씩 추가하였다. 정해진 량의 pDNA를 모두 추가한 이후 10분간 추가로 교반하여 주고 반응을 마무리하여 최종 습득물 pDNA/CS-S-S-TCA 을 수득하였다.
(전기영동 방법과 입자크기 분석을 통한 pDNA/CS-S-S-TCA의 제조 확인)
pDNA/CS-S-S-TCA의 제조를 확인하기 위해 전기영동 방법과 입자크기 분석을 통하여 확인하였으며, 배경조건은 HEPES 버퍼용액을 이용하였고, 무게비를 1:3, 4.5비를 비교하여 최적의 조건을 확인하였다.
전기영동 방법을 통해 확인한 결과 제조된 pDNA/CS-S-S-TCA는 매우 안정적으로 제조되었으며, 최소 1:5 무게비를 이용하여 제조하였을 때 완전히 제조됨을 확인하였다. 그리고 입자 크기의 변화를 적용하여 최적의 무게비는 1:50로 설정했다.
(pDNA/CS-S-S-TCA의 pH에 대한 안정성 시험)
상기 제조된 pDNA/CS-S-S-TCA의 안정성을 확인하기 위해 pH 5.2, 1.8, 7.4의 PBS 버퍼용액 조건으로 시험한다. 시험되는 인자는 시간에 따른 크기를 측정하여 pDNA/CS-S-S-TCA의 안정성을 측정하며, 시간은 시험이 시작된 직후, 6, 12, 18, 24 시간에 pDNA/CS-S-S-TCA용액을 취하여 분석한다.
그 결과 pDNA/CS-S-S-TCA는 상기 제시된 조건에서 뛰어난 안정성을 보이는 것을 확인했으며, 이는 담즙산의 일종인 타우로콜린산의 결합으로 pH에 대한 안정성이 증가된 것으로 설명할 수 있다.
(MDCK-ASBT세포를 이용한 pDNA/CS-S-S-TCA의 독성시험)
제조된 pDNA/CS-S-S-TCA의 독성을 확인하기 위해 MDCK-ASBT 세포를 이용하였으며, 독성의 검증방법으로는 MTT 실험방법을 이용하였다.
결과적으로 pDNA/CS-S-S-TCA은 90%이상의 높은 생존율을 보이는 것을 확인하였다.
(Confocal microscopy를 이용한 세포 흡수능 확인 시험)
제조된 pDNA/CS-S-S-TCA의 세포 흡수능을 확인하기 위해 MDCK-ASBT 세포를 이용하였다. 실험 방법은 MDCK-ASBT 세포를 105 cell/well의 농도로 8 well plate에 분양시켜서 준비한 이후 샘플 Rhdamine-B가 결합된 pDNA/Chitosan과 pDNA/CS-S-S-TCA를 주입한다. 2시간의 배양이후 PBS를 이용하여 3번의 세척과정을 걸치고 confocal microscopy를 이용하여 관찰한다.
그 결과 대조군으로서 사용된 pDNA/Chitosan 또한 양이온의 표면전하를 가지고 있어서 약간의 흡수능은 가지는 것을 보였지만, 결과적으로 제조된 pDNA/CS-S-S-TCA가 대조군인 pDNA/Chitosan보다 뛰어난 세포 흡수능을 가지는 것을 확인하였다.
(Caco-2 단일 층을 이용한 pDNA/CS-S-S-TCA의 세포 투과능 검사)
pDNA/CS-S-S-TCA의 세포 투과능을 검증하기 위해 Caco-2 세포를 단일 층으로 배양하여 시험하였다. 시험은 총 6시간 동안 진행이 되었으며, 10분, 30분, 1, 2, 4, 6시간에 샘플을 체취하여 검사하였다.
그 결과 pDNA/CS-S-S-TCA는 대조군인 pDNA/CS-TCA보다 낮은 세포 투과능을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 그 수치는 pDNA/Chitosan과 유사한 것으로 확인하였다. 이는 이황화 결합(-S-S-)에 의해 타우로콜린산이 Caco-2세포 내에서 분리되어 타우로콜린산만이 투과를 하고 pDNA/CS는 Caco-2 세포내에 축적되는 것을 나타낸다.
(경구투여를 통한 pDNA/CS-S-S-TCA의 생체내 분포도 확인실험)
경구투여를 통한 pDNA/CS-S-S-TCA의 생체내 분포도 확인실험을 위해 Rhodamine B가 결합된 키토산을 이용하고 마우스는 Balb/c 7주령을 이용하였으며, 6시간의 금식이후 약물을 경구투여하고 6시간에서의 생체내 분포를 형광이미지를 통해 확인하였다.
그 결과 pDNA/CS-S-S-TCA는 소장 특히 회장을 통해 흡수되며, 간으로도 약간의 흡수가 진행되는 것을 확인하였다. 이는 소장까지는 기존의 알려진 타우로콜린산의 생체내 순환경로를 그대로 따라가는 것이며, 소장에서 이황화 결합(-S-S-)가 분리되어 제조된 pDNA/Chitosan이 타우로콜린산의 순환경로를 벗어나 소장내에 축적되는 것을 나타낸다.
실시예 15 : TCA가 이황화 결합으로 공유결합된 프로타민(이하, 'Prot-S-S-TCA'라 함)의 제조
Prot -S-S-NH2의 제조
시스테인 (10 mmol)을 10 mL의 MES 버퍼 (50mmol, pH 6)에 용해시키고, 용액이 투명해질 때까지 냉욕에서 교반시켰다. 과량의 EDC (시스테인에 대해 2.4 당량)를 가하고 10분간 교반시킨 다음, 상온에서 과량의 NHS (EDC에 대해 2.5배 당량)을 가하고 10분간 교반시켰다. EDC와 NHS에 의한 카복실기 활성 후 프로타민 (150 mmol)을 가하고 pH 7에서 24시간동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 2차 증류수로 24시간동안 투석하고 동결건조하여 Prot-S-S-NH2를 수득하였다.
Prot -S-S- TCA의 제조
활성화된 프로타민에 TCA를 컨쥬게이션시키기 위하여, TCA (50 mmol)을 DMSO (10 mL)에 용해시킨 후 4-NPC(200mg) 및 TEA(100μg)를 가하고 활성화된 프로타민(100 nmol)을 추가한다. 이후 상온에서 1시간동안 반응시켜 Prot-S-S-TCA를 제조하였다(도 15).
실시예 16 : TCA가 이황화(Disulfide) 결합으로 공유결합된 프로타민 및 pDNA 을 포함하는 나노입자 (이하, pDNA/Prot-S-S-TCA'라 함)의 제조
Prot-S-S-TCA(200 μg)와 pDNA(1 μg)를 각각 HEPES 버퍼용액에 추가하여 준비하였다. 이후 제조된 Prot-S-S-TCA 용액을 교반하여 주고 동시에 pDNA가 들어간 HEPES 버퍼용액을 10 μl씩 추가하였다. 정해진 량의 pDNA를 모두 추가한 이후 10분간 추가로 교반하여 주고 반응을 마무리하여 최종 습득물 pDNA/ Prot-S-S-TCA을 수득하였다. (수득율: 80%, 도 16)
(TNBSA 방법 및 표면전하 측정을 이용한 Prot-S-S-TCA의 합성 검증)
Prot-S-S-TCA의 합성을 검증하기 위해 TNBSA 방법을 이용하였으며, 보다 정확히는 프로타민의 아민그룹을 수량화하여 소모된 아민그룹, 즉 TCA가 결합된 비율을 측정하였다. 또한 Zeta potential 분석기기를 이용하여 표면전하를 측정하였다.
그 결과 프로타민에 대하여 타우로콜린산의 공급비가 증가하면 증가할수록 프로타민의 아민 그룹이 감소하는 것을 확인하였으며, 이에 따라 표면전하 또한 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 변화는 공급비 1:15까지 이루어졌으며, 공급비 1:15 이후에는 큰 변화를 보이지 않았다. 이를 통해 타우로콜린산이 효과적으로 프로타민에 결합하였으며, 최적의 공급비는 1:15임을 확인하였다.
(전기영동 방법과 입자크기, 표면전하 분석을 통한 pDNA/Prot-S-S-TCA의 제조 확인)
pDNA/Prot-S-S-TCA의 제조를 확인하기 위해 전기영동 방법과 입자크기, 표면전하를 측정하여 확인하였으며, 배경조건은 HEPES 버퍼용액을 이용하였고, 무게비를 1:5, 25, 50, 100, 150, 200비를 비교하여 최적의 조건을 확인하였다.
전기영동 방법을 통해 확인한 결과 제조된 pDNA/Prot-S-S-TCA는 매우 안정적으로 제조되었으며, 최소 1:5 무게비를 이용하여 제조하였을 때 완전히 제조됨을 확인하였다. 그리고 입자 크기의 변화 및 표면전하 값을 적용하여 최적의 무게비는 1:200로 설정했다.
(pDNA/Prot-S-S-TCA의 pH에 대한 안정성 시험)
상기 제조된 pDNA/Prot-S-S-TCA의 안정성을 확인하기 위해 pH 5.2, 1.8, 7.4의 PBS 버퍼용액 조건으로 시험하였다. 시험되는 인자는 시간에 따른 크기를 측정하여 pDNA/Prot-S-S-TCA의 안정성을 측정하며, 시간은 시험이 시작된 직후, 6, 12, 24 시간에 pDNA/Prot-S-S-TCA용액을 취하여 분석하였다.
그 결과 pDNA/Prot-S-S-TCA는 상기 제시된 조건에서 뛰어난 안정성을 보이는 것을 확인했으며, 이는 담즙산의 일종인 타우로콜린산의 결합으로 pH에 대한 안정성이 증가된 것으로 설명할 수 있다.
(MDCK-ASBT세포를 이용한 pDNA/Prot-S-S-TCA의 독성시험)
제조된 pDNA/Prot-S-S-TCA의 독성을 확인하기 위해 MDCK-ASBT 세포를 이용하였으며, 독성의 검증방법으로는 MTT 실험방법을 이용하였다.
결과적으로 pDNA/Prot-S-S-TCA은 90%이상의 높은 생존율을 보이는 것을 확인하였다.
(Confocal microscopy를 이용한 세포 흡수능 확인 시험)
제조된 pDNA/Prot-S-S-TCA의 세포 흡수능을 확인하기 위해 MDCK-ASBT 세포를 이용하였다. 실험 방법은 MDCK-ASBT 세포를 105 cell/well의 농도로 8 well plate에 분양시켜서 준비한 이후 샘플 Rhdamine-B가 결합된 pDNA/Prot과 pDNA/Prot-S-S-TCA를 주입하였다. 2시간의 배양이후 PBS를 이용하여 3번의 세척과정을 걸치고 confocal microscopy를 이용하여 관찰하였다.
그 결과 대조군으로서 사용된 pDNA/Prot 또한 양이온의 표면전하를 가지고 있어서 약간의 흡수능은 가지는 것을 보였지만, 결과적으로 제조된 pDNA/Prot-S-S-TCA가 대조군인 pDNA/Prot보다 뛰어난 세포 흡수능을 가지는 것을 확인하였다.
(Caco-2 단일 층을 이용한 pDNA/Prot-S-S-TCA의 세포 투과능 검사)
pDNA/Prot-S-S-TCA의 세포 투과능을 검증하기 위해 Caco-2 세포를 단일 층으로 배양하여 시험하였다. 시험은 총 6시간 동안 진행이 되었으며, 시험직후, 10분, 30분, 1, 2, 4, 6시간에 샘플을 체취하여 검사하였다.
그 결과 pDNA/Prot-S-S-TCA는 대조군인 pDNA/Prot-TCA보다 낮은 세포 투과능을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 그 수치는 pDNA/Prot과 유사한 것으로 확인하였다. 이는 이황화 결합(-S-S-)에 의해 타우로콜린산이 Caco-2세포 내에서 분리되어 타우로콜린산만이 투과를 하고 pDNA/Prot 보다 정확하게는 pDNA/Prot-SH는 Caco-2 세포내에 축적되는 것을 의미한다.
(제조된 pDNA/Prot-S-S-TCA의 유전자 발현을 통한 유전자 전달능 검증)
pDNA/Prot-S-S-TCA의 유전자 발현 효과 검증을 위해 Luciferase 방법을 이용하였다. 대조군으로서는 pDNA, Prot, Prot-TCA 그리고 bPEI를 이용하였다.
그 결과 pDNA/Prot-S-S-TCA는 음성 대조군인 pDNA, Prot, Prot-TCA보다 최소 2배 최대 10배 이상의 효과를 가지는 것을 확인하였으며, 양성대조군인 bPEI와 유사한 유전자 전달효과를 가지는 것을 확인하였다.
(경구투여를 통한 pDNA/Prot-S-S-TCA의 생체내 분포도 확인실험)
경구투여를 통한 pDNA/Prot-S-S-TCA의 생체내 분포도 확인실험을 위해 Rhodamine B가 결합된 프로타민을 이용하고 마우스는 Balb/c 7주령을 이용하였으며, 6시간의 금식이후 약물을 경구투여하고 6시간에서의 생체내 분포를 형광이미지를 통해 확인하였다.
그 결과 pDNA/Prot-S-S-TCA는 회장을 통해 흡수되며, 간으로는 전혀 흡수가 되지 않는 것을 확인하였다. 이는 소장까지는 기존의 알려진 타우로콜린산의 생체내 순환경로를 그대로 따라가는 것이며, 소장에서 이황화 결합(-S-S-)이 분리되어 제조된 pDNA/Prot이 타우로콜린산의 순환경로를 벗어나 소장내에 축적되는 것을 의미한다. 증거자료로서 Prot-TCA는 소장을 지나 간에서도 높은 양의 흡수율을 보인 것을 확인할 수 있다.
실시예 17 : TCA가 공유결합된 히알루론산(HA -TCA)의 제조
TCA는 HA와 컨쥬게이션을 유도하기 위하여 초기 아미노화되었다. 아미노화된 TCA의 합성은 다음과 같다.
TCA-NH2의 제조
0℃에서 TCA (1 mmol)을 DMF(dimethylformamide) (5 mL)에 용해시키고 용액이 투명해질 때까지 교반하였다. TEA (6 mmol) 및 4-NPC (5 mmol)를 차례로 가하고 0℃에서 1시간동안 반응시킨 후 상온에서 6시간 더 교반하였다. 그런 다음 5000 rpm으로 원심분리한 뒤, 펠렛을 에틸아세테이트 (20 mL)에 분산시키고 분별깔대기로 옮기고 동량의 2차 증류수를 가하여 추출하였다. 수층을 모아 회전증발기로 남아있는 유기 용매를 제거한 뒤, 48시간동안 동결건조시켜 TCA-NPC를 수득하였다.
형성된 TCA-NPC (1mmol)를 DMF (5mL)에 용해시킨 후 4-MMP(4-mercapto-4-methylpentan-2-one) (2 mmol)을 가하고 50℃에서 60분간 교반시켰다. 그런 다음, 에틸렌 디아민 (100mmol)을 드랍와이즈 첨가하고 상온에서 16시간동안 반응시켰다. 과량의 아세톤을 가하여 생성된 침전물을 여과한 후 48시간동안 동결건조시켜 TCA-NH2를 수득하였다(도 17).
HA-TCA의 제조
TCA와 HA(hyaluronic acid)의 컨쥬게이션은 EDC/NHS chemistry를 통해 수행되었다. HA의 카복실기는 초기 pH 4, 4℃에서 EDC(200mg)로 15분간 처리되었다. 그 후 NHS(100μg)를 가하고 10분간 교반하였다. TCA-NH2(100μg)를 가하고 pH 7, 상온에서 7시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 2차 증류수로 24시간동안 투석막(MWCO: 1000 Da)을 이용하여 투석한 뒤 48시간동안 동결건조하여 HA-TCA를 수득하였다[수득율 10%, 도 18].
실시예 18 : TCA가 공유결합된 헤파린(Hep-TCA)의 제조
HA 대신 Hep를 사용한 것을 제외하고는 실시예 17과 동일한 방법으로 Hep-TCA 를 수득하였다.
TCA의 아미노화는 TCA와 HA 또는 Hep 사이의 안정한 아미드 결합을 형성하는데 도움을 주었다. 도 18에 도시된 1H NMR 분석 결과, δ 8 ppm에서 TCA와 HA 사이의 아미드 결합 컨쥬게이션 피크가 검출되었다.
TNBS 분석을 통해 TCA의 성공적인 아미노화를 확인하였다. 이러한 결과로부터 각각의 TCA 분자는 그의 백본 내 하나의 아민 기를 가짐을 알 수 있었다. TCA로 Hep 또는 HA의 컨쥬게이션은 1H NMR 분석에 의해 확인되었다[도 18]. 1.0 내지 1.5 ppm 근처 피크들로부터 TCA 모이어티의 존재 및 3.5 내지 3.9 ppm 근처 피크들로부터 HA 모이어티의 존재가 확인되었으며, 8 ppm의 새로운 피크로부터 TCA와 HA 사이의 안정한 아미드 결합이 형성되었음이 확인되었다.
Hep 또는 HA 에 결합된 TCA 분자의 수를 정량화하기 위하여 황산 분석을 실시하였다. 이후 실험은 Hep 또는 HA와 TCA가 1 : 5의 컨쥬게이션 비율을 갖는 HA-TCA 또는 Hep-TCA으로 수행하였다. 게다가 이들의 제타 전위는 음 전하를 나타냈다.
실시예 19 : Prot/GLP-1/HA-TCA 의 제조
10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4)에 용해된 Prot (1mg/mL)을 스톡 용액으로 사용하였다. GLP-1을 코딩하는 유전자 (7.780 mg)를 10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4) (1.922 mL)에 용해시켜 GLP-1 유전자 용액을 제조하였다. gentle vortex 하에서 GLP-1 유전자 용액을 스톡 Prot 용액에 드랍와이즈 첨가하여 Prot/GLP-1 이온복합체 용액을 제조하였다. Prot/GLP-1 이온복합체의 Prot : GLP-1 이 1 : 20의 몰비인 경우 양성의 제타 전위 및 강한 상호작용이 나타났다.
gentle vortex 하에서 상기 Prot/GLP-1 이온복합체를 HA-TCA 수용액에 1 : 1 (v/v)로 가하고 상온에서 30분간 배양시킨 다음, 동결건조하여 prot/GLP-1/HA-TCA를 수득하였다(수득율 20%).
실시예 20 : prot/GLP-1/Hep-TCA 의 제조
HA 대신에 Hep를 사용한 것을 제외하고는 실시예 19와 동일한 방법으로 prot/GLP-1/Hep-TCA를 수득하였다.
GLP-1 및 Prot 사이의 상이한 몰 비율을 갖는 Prot/GLP-1 이온복합체를 제조하였으며, 겔 리타데이션 실험을 통해 Prot에 대해 GLP-1을 코딩하는 유전자가 1 : 20의 몰 비율로 복합화되어 있음이 확인되었다.
prot/GLP-1 이온복합체는 혈청 내에서 안정하였으며, Hep-TCA 또는 HA-TCA로 Prot/GLP-1 이온복합체를 코팅하더라도 Prot/GLP-1 이온복합체의 구조적 완전성을 잃지 않으면서 여전히 혈청 내 안정함을 확인하였다. 또한, TEM 분석을 통해 Hep-TCA 또는 HA-TCA로 Prot/GLP-1 이온복합체를 코팅하는 경우 185 nm에서 235 nm으로 입자 크기가 증가됨을 확인하였고, 또한, Hep-TCA 또는 HA-TCA로 Prot/GLP-1 유전자 복합체를 코팅한 후 TEM 현미경 사진에서 투명한 코팅 쉘이 관찰되었다.
다양한 pH 조건에서 입자의 안정성을 확인하였다. 즉, 위장관(GI tract)의 위, 십이지장 및 회장(ileum) 단편에서의 pH 조건과 유사한 pH 3, pH5 및 pH 7.4의 세 가지 pH 용액에 넣고, 입자 크기를 관찰하였다. 그 결과, prot/GLP-1 이온복합체는 pH 3에서 불안정하였지만, Hep-TCA 또는 HA-TCA와 같은 다당류-TCA 고분자로 코팅된 prot/GLP-1 유전자 복합체는 Hep-TCA 또는 HA-TCA와 같은 다당류-TCA 고분자의 코팅으로 인해 입자 안정성이 개선되었으며, pH 3에서 24시간까지 안정함을 확인하였다. 따라서, 다당류-TCA 고분자로 코팅된 후 입자는 안정함을 확인하였다.
실험예 7 : 시험관 내(in vitro) 유전자 발현 및 트랜스웰(transwell) 연구
ASBT(Apical Sodium-dependent Bile Salt Transporter)-과발현 MDCK 세포 및 Caco-2 세포주를 사용하여 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)의 발현을 관찰하였다.
실시예 19 및 20의 유전자 전달용 나노입자에 eGFP 유전자 4 μg 을 로딩한 후, 상기 세포주들로부터 성공적인 발현 및 녹색 형광을 관찰하였다.
그 다음, 이중층 세포배양 기술에서 유전자 복합체의 전달을 연구하기 위하여, 트랜스웰 플레이트의 정단 부위에서 Caco-2 단층을 배양하고, 기저 부위에서 MDCK-ASBT 세포주를 배양하였다. Hep-TCA 및 HA-TCA 각각이 코팅된 Prot/GLP-1/HA-TCA(실시예 19) 및 Prot/GLP-1/Hep-TCA(실시예 20)의 전달을 분석하였다. Caco-2 단층에서 Prot/GLP-1/HA-TCA(실시예 19) 및 Prot/GLP-1/Hep-TCA(실시예 20)로부터 eGFP의 최소한의 발현이 관찰되었다. 이로부터 쉘은 표적 유전자의 방출에 있어 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있었다.
배지에서 당 수치에 반응하여 시험관 내 GLP-1 발현을 수치화하는 GLP-1 ELISA 키트를 사용한 결과, GLP-1을 코딩하는 유전자의 향상된 발현이 나타났다.
실험예 8 : Prot/eGFP/다당류-TCA 유전자 복합체의 생체 내(in vivo) 생체 분포(bio distribution)
eGFP 로딩된 Prot/GLP-1/HA-TCA(실시예 19) 및 Prot/GLP-1/Hep-TCA(실시예 20)의 생체 내 생체 분포를 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
Balb/c 마우스를 나무로된 케이지에 가두고 규칙적으로 음식과 물을 제공해주었다. 치료 유전자 복합체의 경구 투여 전 12시간동안 상기 동물들을 금식시켰다. 금식 12시간 후 eGFP 유전자 100 μg을 함유하는 시료를 경구 위관영양법(oral gavage)으로 투여하였다. 투여 24시간 후 동물들을 희생시키고 공초점 현미경(confocal microscope)으로 생체 내 유전자 발현 및 시료의 생체 내 분포를 정량화하였다.
그 결과, 본 발명의 유전자 전달 복합체는 HA-TCA 또는 Hep-TCA로 인하여 회장 및 간 단편에서의 향상된 eGFP 유전자 발현을 확인하였다.
실험예 9 : 생체 내(in vivo) GLP-1을 코딩하는 유전자의 발현 및 혈당 수치의 조절
5주령의 ZDFR(Zucker diabetic fatty rats)을 나무로된 케이지에 가두고 규칙적으로 음식과 물을 제공해주었다. 치료 유전자 복합체의 경구 투여 전 12시간동안 상기 동물들을 금식시켰다. 금식 12시간 후 Prot/GLP-1/HA-TCA(실시예 19) 및 Prot/GLP-1/Hep-TCA(실시예 20) 100 μg을 각각 경구 투여시켰다. 투여 24시간 후 소정의 시간 간격으로 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈당 수치를 측정하였다. 놀랍게도 혈당 수치가 정상 혈당 수치로 조절되었음을 확인하였다. 5일 후, 실험동물들을 희생시키고 ELISA 키트로 상이한 조직에서의 GLP-1 및 인슐린의 발현을 분석하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 GLP-1 loaded polysaccharide-TCA gene complexes 의 경구 투여 후 GLP-1 펩타이드와 인슐린 단백질의 향상된 발현이 나타났다.
실험예 10 : bile acid mediated non-viral vectors 의 생체 내(in vivo) 독성
4주령의 SD쥐(Sprague Dowley rats)를 나무로된 케이지에 가두고 규칙적으로 음식과 물을 제공해주었다. 본 발명의 유전자 전달용 나노입자, 즉 prot/GLP-1/HA-TCA(실시예 19) 및 prot/GLP-1/Hep-TCA(실시예 20)를 각각 상이한 농도로 경구 및 정맥 투여하였다. 소정의 시간 간격으로 실험동물의 혈액을 채취하여 일반 혈액 내용물(complete blood content)을 분석하고 간 및 신장의 활성을 결정하는 생물학적 마커의 발현을 평가하였다. 그 결과, 본 발명의 유전자 전달용 나노입자를 매우 높은 농도로 투여하였을 지라도 독성이 거의 나타나지 않았다.
투여 7일 후 동물들을 희생시키고, 다른 장기의 면역 조직 검사를 실시하였다. 그 결과, 조직 내 어떠한 염증도 관찰되지 않았으며, 독성 역시 거의 나타나지 않았다.
따라서, 본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 안전하고, 무독성이며, 당뇨병 치료에 사용가능함을 알 수 있었다.
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 실시예에 대해 상세히 기술되었지만, 본 발명이 속하는 기술분야에 있어서 통상의 지식을 가진 사람이라면, 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명을 여러 가지로 변형하여 실시할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 앞으로의 실시예들의 변경은 본 발명의 기술을 벗어날 수 없을 것이다.
본 발명에 따른 유전자 전달용 나노입자는 섭취된 식사를 감지하고 생물학적 시스템 내 혈당 수치와 인슐린 분비를 조절할 수 있는 새로운 경구 유전자 전달 시스템으로, 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자 및 유전자를 포함한다.
본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 음전하의 유전자와 양이온성 고분자의 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 고분자 내부에 음전하의 유전자가 봉입된 이온복합체가 나노입자의 코어 부분에 존재하며, 상기 양이온성 고분자에 공유결합된 담즙산 또는 그의 유도체는 친수성의 음이온성기를 가진 형태로 나노입자의 표면에 위치하는, 담즙산 또는 그의 유도체가 표면 수식된 형태의 나노입자이다.
또한, 본 발며의 유전자 전달용 나노입자는 음전하의 유전자와 양이온성 고분자의 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 고분자 내부에 음전하의 유전자가 봉입된 이온복합체가 나노입자의 코어 부분에 존재하며, 상기 이온복합체의 양이온성 고분자와, 친수성의 음이온성기를 가지는 담즙산 또는 그의 유도체가 공유결합된 음이온성 고분자가 정전기적 상호작용으로 결합되어 상기 음이온성 고분자에 공유결합된 담즙산 또는 그의 유도체는 친수성의 이온성기를 가진 형태로 나노입자의 표면에 위치하는, 담즙산 또는 그의 유도체가 표면 수식된 형태의 나노입자이다.
따라서, 본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 양이온성 고분자와 유전자를 직접적인 물리적인 결합을 통해 위산으로부터 방어를 하며, 안전하게 소장세포에 전달할 수 있으며, 또한 소장세포 내에 GLP-1 유전자를 발현하는 L-Cell에서만 발현되도록 하는 표적형 나노입자로 사용할 수 있다.
치료 유전자를 표적 세포로 전달하기 위하여 본 발명의 담즙산또는 그의 유도체가 표면 수식된 나노입자를 사용하는 경우 장 점막을 통해 유전자를 잘 전달함과 동시에 나노입자의 코어에 존재하는 이온복합체로 인하여 위장관에서 매우 안정하였다. 이로부터 본 발명에 따른 유전자 전달용 나노입자는 경구 투여용으로 매우 적합함을 알 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자의 표면에 수식된 담즙산으로 인하여 나노입자의 GI 분해를 억제하고 작은 창자의 회장 부분에서 장 세포 막의 담즙산 수용체인 ASBT(apical sodium bile acid transporter) 수용체를 흡수하여 세포 내로 치료 유전자를 전달할 수 있어 향상된 유전자 발현을 나타낼 수 있다.
특히, 치료유전자로 GLP-1, GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 또는 엑센딘-4(exendin-4)을 사용한 경우 장 세포내의 효소인 글루타티온 및 pH에 의해 본 발명에 따른 나노입자의 표면에 수식된 담즙산과 양이온성 고분자가 분리되어 portal vein으로 들어가며, 분리된 치료유전자는 장세포의 핵으로만 전달되어 많은 양의 GLP-1, GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 또는 엑센딘-4(exendin-4)이 발현되어 당뇨병 치료 효능을 효율적으로 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 유전자 전달용 나노입자는 당뇨병 마우스 모델에 경구 투여시 성공적인 GLP-1, GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 또는 엑센딘-4(exendin-4)을 발현시킴과 동시에 인슐린을 분비시켜 혈당 강하 효과를 나타내 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
서열목록1: GLP-1 코딩 서열(DNA Sequence)

Claims (18)

  1. 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 고분자; 및
    유전자;
    를 포함하고,
    상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 유전자 전달용 나노입자.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 이온성 고분자는 양이온성 고분자인, 유전자 전달용 나노입자.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 양이온성 고분자는 키토산, 글리코키토산, 프로타민, 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 유전자 전달용 나노입자.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 이온성 고분자는 음이온성 고분자인, 유전자 전달용 나노입자.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 음이온성 고분자는 헤파린(heparin), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate)에서 선택되는 것인, 유전자 전달용 나노입자.
  6. 제 4항에 있어서,
    양이온성 고분자를 더 포함하는 것, 유전자 전달용 나노입자.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 양이온성 고분자는 키토산, 글리코키토산, 프로타민, 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine), 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 유전자 전달용 나노입자.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자는 이황화 결합을 통해 공유결합된 것인, 유전자 전달용 나노입자.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 담즙산 또는 이의 유도체는 디옥시콜린산 (deoxycholic acid), 타우로디옥시콜린산 (taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산 (TCA: taurocholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid) 및 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxycholic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 유전자 전달용 나노입자.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 담즙산 또는 이의 유도체는 타우로콜린산 (TCA: taurocholic acid)인, 유전자 전달용 나노입자.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 유전자는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA(deoxyribonucleic acid), 단일가닥 또는 이중가닥 RNA(ribonucleic acid), 플라스미드 형태 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 리보자임, 촉매적 RNA 및 뉴클레오타이드 중에서 선택된 하나 이상인, 유전자 전달용 나노입자.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 유전자는 GLP-1 유전자(GLP-1 gene), GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 및 엑센딘-4(exendin-4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 유전자 전달용 나노입자.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 담즙산 또는 이의 유도체와 이온성 고분자는 1 : 1 내지 1 : 300의 몰비로 공유결합되는 것인, 유전자 전달용 나노입자.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 나노입자의 크기는 500 nm 이하인, 유전자 전달용 나노입자.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자 및 유전자는 1 : 1 내지 1 : 200의 몰비로 결합되는 것, 유전자 전달용 나노입자.
  16. 제 1항에 있어서,
    상기 나노입자의 N/P 비(담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자의 질소 원자 개수/유전자의 인산염 원자 개수)는 1 내지 200인, 유전자 전달용 나노입자.
  17. 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 고분자 및 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1, Glucagon like peptide-1), GLP-1 펩타이드(GLP-1 peptide), GLP-1 변이체, GLP-1 유도체, GLP-1 작용제(GLP-1 agonist), 리라글루티드(Liraglutide) 또는 엑센딘-4(exendin-4)을 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 유전자 전달용 나노입자를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 경구 투여용인 약학 조성물.
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