WO2021145595A1 - 생체 내 약물 전달을 위한 지질 나노입자 및 이의 용도 - Google Patents

생체 내 약물 전달을 위한 지질 나노입자 및 이의 용도 Download PDF

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김민정
정한샘
권효경
서윤미
정예희
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Definitions

  • the present invention relates to lipid nanoparticles and uses thereof for drug delivery in vivo.
  • the drug delivery system designed to efficiently deliver the required amount of drug by reducing side effects and maximizing efficacy and effect, can create economic benefits comparable to new drug development, while It is a high-value-added core technology with great potential for success, and its purpose is to improve the quality of patient treatment by making drug administration more efficient.
  • the solubilization technology of poorly soluble drugs belonging to the drug absorption promotion technology which is one of the core technologies of the drug delivery system, is considered the most reasonable method to reduce the development cost of new drug substances and at the same time increase the added value of currently marketed drugs.
  • the development of improved new drugs through the development of drug solubilization technology in a situation where new drug development conditions are poor as in Korea is a field that can create enormous added value at a low cost.
  • Gene therapy using gene drug delivery systems holds great promise for correcting genetic linkages and treating numerous diseases.
  • effective gene delivery is one of the main tasks, and viral delivery has been demonstrated to be effective in gene delivery.
  • drawbacks such as immunogenicity, limitations in the size of injected DNA, and difficulties in mass production, limit the use of viruses as gene delivery systems.
  • Non-viral gene carriers such as cationic liposomes and polymers are beginning to gain attention as alternative means of viral systems.
  • polymeric carriers The improved stability profile and ease of preparation and manipulation of polymeric carriers have prompted research into the design and synthesis of non-toxic and biodegradable polymeric carriers for effective and safe gene delivery.
  • Nucleic acids such as antisense RNA and siRNA, are substances that can inhibit the expression of specific proteins in vivo, and are spotlighted as an important tool for the treatment of cancer, genetic diseases, infectious diseases, autoimmune diseases, etc. (Novina and Sharp, Nature, 430, 161-164, 2004).
  • nucleic acids such as siRNA are difficult to deliver directly into cells and are easily degraded by enzymes in the blood, so many studies are being conducted to overcome them.
  • lipid-DNA conjugates and polymer-DNA conjugates are mainly used (Hirko et al., Curr. Med.
  • Lipid-DNA conjugates bind nucleic acids and deliver nucleic acids into cells, and are widely used at the cellular level, but in vivo, local injections cause inflammation in the body in many cases (Filonand and Phillips, Biochim. Biophys. Acta, 1329). , 345-56, 1997) and the like.
  • non-viral carriers have a problem with low transfection efficiency. Many efforts have been made to increase transfection efficiency, but this is still far from a system considered stable. In addition, non-viral gene carrier carriers exhibit remarkably high cytotoxicity due to poor biocompatibility and non-biodegradability.
  • the present inventors have excellent drug encapsulation rate and as a result of earnest efforts to develop novel particles that can efficiently deliver anionic drugs, nucleic acids, etc. to a target organ or cell, ionizable lipids; phospholipids; cholesterol; And by preparing lipid nanoparticles comprising a lipid-PEG (polyethyleneglycol) conjugate, and confirming that the lipid nanoparticles are specifically delivered to liver tissue, and drugs such as anionic compounds or nucleic acids can be encapsulated with high efficiency The present invention was completed.
  • lipid-PEG polyethyleneglycol
  • Another object of the present invention is (1) the lipid nanoparticles; And (2) to provide a composition for delivery of a drug (anionic drug, nucleic acid, or a combination thereof) comprising an anionic drug, a nucleic acid, or a combination thereof.
  • a drug anionic drug, nucleic acid, or a combination thereof
  • Another object of the present invention is (1) the lipid nanoparticles; And (2) to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease comprising an anionic drug nucleic acid, or a combination thereof as an active ingredient.
  • One aspect for achieving the above object is a 6-membered heterocyclic amine and an alkyl-epoxide bonded ionizable lipid (ionizable lipid); phospholipids; cholesterol; And it provides lipid nanoparticles comprising a lipid-PEG (polyethyleneglycol) conjugate.
  • ionizable lipid alkyl-epoxide bonded ionizable lipid
  • phospholipids phospholipids
  • cholesterol lipid nanoparticles comprising a lipid-PEG (polyethyleneglycol) conjugate.
  • Lipid nanoparticles according to one embodiment are specific to liver tissue, have excellent biocompatibility, and can deliver gene therapy with high efficiency, so that they can be usefully used in related technical fields such as lipid nanoparticle-mediated gene therapy and imaging technology.
  • the term 'ionizable lipid' or 'lipidoid' refers to an amine-containing lipid that can be easily protonated, for example, a lipid whose charge state changes depending on the surrounding pH.
  • the ionizable lipid may be a 6-membered heterocyclic amine and an alkyl-epoxide bonded thereto.
  • the ionizable lipid may be a compound having properties similar to lipids produced by the reaction of a 6-membered heterocyclic amine and an alkyl-epoxide, and more specifically, a 6-membered heterocyclic amine with an alkyl-epoxide It may be a compound produced by a ring opening reaction of an epoxide by reacting.
  • the ionizable lipid may be protonated (positively charged) at a pH below the pKa of the cationic lipid, and may be substantially neutral at a pH above the pKa.
  • the lipid nanoparticles may include protonated ionizable lipids and/or ionizable lipids exhibiting neutrality.
  • the ionizable lipid is an ionizable compound having lipid-like properties, such that the drug is highly efficiently encapsulated in lipid nanoparticles through electrostatic interaction with a drug (eg, anionic drug and/or nucleic acid). can play a role.
  • a drug eg, anionic drug and/or nucleic acid
  • the 6-membered heterocyclic amine may have a piperazine or piperidine structure.
  • the 6-membered heterocyclic amine may be a chain or non-chain amine including a tertiary amine, and according to one example , , , , , and It may be at least one selected from the group consisting of.
  • the 6-membered heterocyclic amine is 1,4-bis(3-aminopropyl) piperazine, N-(3-Aminopropyl) piperidine, (1-Methyl-4-piperidinyl)methanamine, 2-(4-Methyl -piperazin-1-yl)-ethylamine, 1-(2-Aminoethyl) piperazine, and 1-(3-aminopropyl) piperazine may be at least one selected from the group consisting of piperazine.
  • lipid nanoparticles According to the type of amine contained in the ionizable lipid, (i) drug encapsulation rate, (ii) PDI (polydispersity index) of the lipid nanoparticles. and/or (iii) the efficiency of drug delivery to liver tissue, and/or cells constituting the liver (eg, hepatocytes and/or liver sinusoidal endothelial cells (LSEC)) may be different. there is.
  • the size of the produced particles is uniform (or has a low PDI value);
  • liver tissue and/or cells constituting the liver eg, hepatocytes and/or LSEC.
  • the lipid nanoparticles comprising an ionizable lipid comprising 1,4-bis(3-aminopropyl)piperazine may contain different types of amines.
  • a lipid nanoparticle comprising an ionizable lipid may have one or more of the following characteristics:
  • the size of the produced particles is uniform (or has a low PDI value);
  • liver tissue and/or cells constituting the liver eg, hepatocytes and/or LSEC.
  • the alkyl-epoxide may have a structure as shown in Formula 1 below.
  • the alkyl-epoxide may have a carbon length of C6 to C14, C6 to C12, C6 to C10, C8 to C14, C8 to C12, C8 to C10, C10 to C14, C10 to C12, or C10, for example, For example, it may be 1,2-epoxydodecane of C10.
  • the ionizable lipid may have the general formula of Formula 2 below.
  • the structure of Formula 2 is an example of the structure of the ionizable lipid according to an embodiment, and the structure of the ionizable lipid may be different depending on the type of the 6-membered heterocyclic amine and the alkyl-epoxide.
  • lipid nanoparticles comprising ionizable lipids including ionizable lipids having a chemical structure of 2 may have one or more of the following characteristics than lipid nanoparticles comprising other types of ionizable lipids. there is:
  • the size of the produced particles is uniform (or has a low PDI value);
  • liver tissue and/or cells constituting the liver eg, hepatocytes and/or LSEC.
  • the lipid nanoparticles may have a pKa of 5 to 8, 5.5 to 7.5, 6 to 7, or 6.5 to 7.
  • pKa is an acid dissociation constant, and points out what is generally used as an index
  • the pKa value of the lipid nanoparticles is important in terms of in vivo stability of the lipid nanoparticles and drug release of the lipid nanoparticles.
  • the lipid nanoparticles exhibiting a pKa value in the above range can be safely delivered to a target organ (eg, liver) and/or target cell (hepatocyte, and/or LSEC) in vivo, and the target organ and/or LSEC Alternatively, it can reach the target cell and display a positive charge after endocytosis, so that the encapsulated drug is released through electrostatic interaction with the anionic protein of the endosome membrane.
  • a target organ eg, liver
  • target cell hepatocyte, and/or LSEC
  • phospholipids wrap and protect the core formed by the interaction of ionizable lipids and drugs within the lipid nanoparticles, and bind to the phospholipid bilayer of the target cell to release the drug into the cell. It can facilitate cell membrane passage and endosomal escape during delivery.
  • the phospholipid may be used without limitation, a phospholipid capable of promoting the fusion of lipid nanoparticles according to an embodiment, for example, dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), distearoylphosphatidylcholine (DSPC) , palmitoyloleoylphosphatidylcholine (palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), egg phosphatidylcholine (EPC), dioleoylphosphatidylcholine (dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DOPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DOPC) ), dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE), phosphatidylethanolamine (PE), dipalmitoylphosphatidylethanolamine (1,2-
  • lipid nanoparticles comprising DOPE may be effective for mRNA delivery (excellent drug delivery efficiency for mRNA), and in another example, lipid nanoparticles comprising DSPE may be effective for siRNA delivery (drugs for siRNA). excellent transfer efficiency).
  • Cholesterol among the components of the lipid nanoparticles provides morphological rigidity to the lipid filling in the lipid nanoparticles, and is dispersed in the core and surface of the nanoparticles to improve the stability of the nanoparticles. there is.
  • lipid-PEG (polyethyleneglycol) conjugate refers to a form in which a lipid and PEG are conjugated. , refers to a lipid in which a polyethylene glycol (PEG) polymer, which is a hydrophilic polymer, is bound to one end.
  • PEG polyethylene glycol
  • the lipid-PEG conjugate contributes to the particle stability of the nanoparticles in the serum in the lipid nanoparticles, and serves to prevent aggregation between nanoparticles.
  • the lipid-PEG conjugate protects the nucleic acid from degrading enzymes during in vivo delivery of the nucleic acid, thereby enhancing the stability of the nucleic acid in the body, and increasing the half-life of the drug encapsulated in the nanoparticles.
  • the PEG may be conjugated directly to the lipid or may be linked to the lipid via a linker moiety.
  • Any linker moiety suitable for linking PEG to a lipid can be used, including, for example, ester-free linker moieties and ester-containing linker moieties.
  • the ester-free linker moiety is an amido (-C(O)NH-), amino (-NR-), carbonyl (-C(O)-), carbamate (-NHC(O)O-) ), urea (-NHC(O)NH-), disulfide (-SS-), ether (-O-), succinyl (-(O)CCH2CH2C(O)-), succinamidyl (-NHC(O) )CHCHC(O)NH—), ethers, disulfides, as well as combinations thereof (eg, linkers containing both carbamate linker moieties and amido linker moieties).
  • ester-containing linker moieties include, for example, carbonates (-OC(O)O-), succinoyl, phosphate esters (-O-(O)POH-O-), sulfonate esters, and these including, but not limited to, combinations of
  • the average molecular weight of the lipid-PEG conjugate is 100 daltons to 10,000 daltons, 200 daltons to 8,000 daltons, 500 daltons to 5,000 daltons, 1,000 daltons to 3,000 daltons, 1,000 daltons to 2,600 daltons, 1,500 daltons to 2,600 daltons, 1,500 daltons to 2,500 daltons, 2,000 daltons to 2,600 daltons, 2,000 daltons to 2,500 daltons, or 2,000 daltons.
  • the lipid in the lipid-PEG conjugate may be used without limitation as long as it is a lipid capable of binding to polyethylene glycol, and phospholipids and/or cholesterol, which are other components of the lipid nanoparticles, may also be used.
  • the lipid in the lipid-PEG conjugate is ceramide (ceramide), dimyristoylglycerol (DMG), succinoyl-diacylglycerol (s-DAG), distearoylphosphatidylcholine (DSPC) , distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE), or cholesterol, but is not limited thereto.
  • the lipid-PEG conjugate is PEG bound to dialkyloxypropyl (PEG-DAA), PEG bound to diacylglycerol (PEG-DAG), PEG bound to phospholipids such as phosphatidylethanolamine (PEG- PE), PEG conjugated to ceramide (PEG-CER, ceramide-PEG conjugate, ceramide-PEG, PEG-ceramide conjugate, or PEG-ceramide), PEG conjugated to cholesterol or derivatives thereof, PEG-c-DOMG, PEG- DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, PEG-DSPE (DSPE-PEG), and mixtures thereof, for example, C16-PEG2000 ceramide (N-palmitoyl-sphingosine-1- ⁇ succinyl[ methoxy(polyethylene glycol)2000] ⁇ ), DMG-PEG 2000, 14:0 PEG2000 PE.
  • PEG-DAA dialkyloxypropyl
  • the lipid nanoparticles including the ceramide-PEG conjugate when included, the lipid nanoparticles including other types of lipid-PEG conjugates may have one or more of the following characteristics than when the lipid nanoparticles are included:
  • the size of the produced particles is uniform (or has a low PDI value);
  • liver tissue and/or cells constituting the liver eg, hepatocytes and/or LSEC.
  • PEG in the lipid-PEG conjugate is a hydrophilic polymer and has the ability to inhibit the adsorption of plasma proteins, thereby increasing the circulation time of the lipid nanoparticles in the body and preventing aggregation between nanoparticles.
  • the lipid-PEG conjugate may exhibit a stealth function in vivo to prevent degradation of nanoparticles.
  • the PEG may be a functional group bound to a side not bound to a lipid (functionalized PEG).
  • the functional group that can be used is at least one selected from the group consisting of succinyl, carboxylic acid, maleimide, amine, biotin, cyanur, and folate.
  • the lipid-PEG conjugate is 0.1 to 15 mol%, 0.25 to 15 mol%, 0.5 to 15 mol%, 1 to 15 mol%, 1.5 to 15 mol%, 2 to 15 mol%, 2.5 to 15 mol%, 0.1 to 12.5 mol%, 0.25 to 12.5 mol%, 0.5 to 12.5 mol%, 1 to 12.5 mol%, 1.5 to 12.5 mol%, 2 to 12.5 mol%, 2.5 to 12.5 mol%, 0.1 to 10 mol% , 0.25 to 10 mol%, 0.5 to 10 mol%, 1 to 10 mol%, 1.5 to 10 mol%, 2 to 10 mol%, 2.5 to 10 mol%, 0.1 to 7.5 mol%, 0.25 to 7.5 mol%, 0.5 to 7.5 mol%, 1 to 7.5 mol%, 1.5 to 7.5 mol%, 2 to 7.5 mol%, 2.5 to 7.5 mol%, 0.1 to 5 mol%, 0.25 to 5 mol%, 0.5
  • the liver tissue, hepatocyte, and / or LSEC targeting effect (drug delivery effect) of the lipid nanoparticles may depend on the content of the lipid-PEG conjugate contained in the lipid nanoparticles.
  • 0.1-15 mol%, 0.25-15 mol%, 0.5-15 mol%, 1-15 mol%, 1.5-15 mol%, 2-15 mol%, 2.5-15 mol% of the lipid-PEG conjugate 0.1 to 12.5 mol%, 0.25 to 12.5 mol%, 0.5 to 12.5 mol%, 1 to 12.5 mol%, 1.5 to 12.5 mol%, 2 to 12.5 mol%, 2.5 to 12.5 mol%, 0.1 to 10 mol%, 0.25 to 10 mol%, 0.5 to 10 mol%, 1 to 10 mol%, 1.5 to 10 mol%, 2 to 10 mol%, 2.5 to 10 mol%, 0.1 to 7.5 mol%, 0.25 to 7.5 mol%, 0.5 to 7.5 mol%, 1 to 7.5 mol%, 1.5 to 7.5 mol%, 2 to 7.5 mol%, 2.5 to 7.5 mol%, 0.1 to 5 mol%, 0.25 to 5 mol%, 0.5 to 5 mol%, 1 to 5
  • the cholesterol is 10 to 60 mol%, 20 to 60 mol%, 30 to 60 mol%, 30 to 55 mol%, 30 to 52.5 mol%, 30 to 52 mol%, 30 to 51 mol%, 30 to 50 mol%, 30 to 47.5 mol%, 30 to 45 mol%, 30 to 44 mol%, 30 to 43.5 mol%, 30 to 43 mol%, 30 to 41.5 mol%, 30 to 40 mol%, 30 to 39.5 mol%, 35-60 mol%, 35-55 mol%, 35-52.5 mol%, 35-52 mol%, 35-51 mol%, 35-50 mol%, 35-47.5 mol%, 35-45 mol% %, 35 to 44 mol%, 35 to 43.5 mol%, 35 to 43 mol%, 35 to 41.5 mol%, 35 to 40 mol%, 35 to 39.5 mol%, 37 to 60 mol%, 37 to 55 mol%, 37 to 52.5 mol%, 37 to 52 mol%, 35 to 51
  • the sum of the lipid-PEG conjugate and cholesterol is 30 to 70 mol%, 40 to 70 mol%, 40 to 60 mol%, 40 to 55 mol%, 40 to 53.5 mol%, 40 to 50 mol% , 40 to 47.5 mol%, 40 to 45 mol%, 40 to 44,5 mol%, 42 to 60 mol%, 42 to 55 mol%, 42 to 53.5 mol%, 42 to 50 mol%, 42 to 47.5 mol% , 42 to 45 mol%, 42 to 44,5 mol%, 44 to 60 mol%, 44 to 55 mol%, 44 to 53.5 mol%, 44 to 50 mol%, 44 to 47.5 mol%, 44 to 45 mol% , 44 to 44.5 mol%, 44.5 to 60 mol%, 44.5 to 55 mol%, 44.5 to 53.5 mol%, 44.5 to 50 mol%, 44.5 to 47.5 mol%, or 44.5 to 45 mol% included in the lipid nanoparticles it may be
  • the ionizable lipid is 10 to 70 mol%, 10 to 60 mol%, 10 to 55 mol%, 10 to 50 mol%, 10 to 45 mol%, 10 to 42.5 mol%, 10 to 40 mol% %, 10 to 35 mol%, 10 to 30 mol%, 10 to 26.5 mol%, 10 to 25 mol%, 10 to 20 mol%, 15 to 60 mol%, 15 to 55 mol%, 15 to 50 mol%, 15 to 45 mol%, 15 to 42.5 mol%, 15 to 40 mol%, 15 to 35 mol%, 15 to 30 mol%, 15 to 26.5 mol%, 15 to 25 mol%, 15 to 20 mol%, 20 to 60 mol%, 20 to 55 mol%, 20 to 50 mol%, 20 to 45 mol%, 20 to 42.5 mol%, 20 to 40 mol%, 20 to 35 mol%, 20 to 30 mol%, 20 to 26.5 mol%, 20-25 mol%, 15 to 20 mol%,
  • the phospholipid is 1 to 50 mol%, 5 to 50 mol%, 5 to 40 mol%, 5 to 30 mol%, 5 to 25 mol%, 5 to 20 mol%, 5 to 15 mol%, 5 to 13 mol%, 5 to 10 mol%, 10 to 30 mol%, 10 to 25 mol%, 10 to 20 mol%, 10 to 15 mol%, 10 to 13 mol%, 15 to 30 mol%, 15 to 25 mol%, 15 to 20 mol%, 20 to 30 mol%, or 20 to 25 mol% may be included in the lipid nanoparticles.
  • mol% (mol%, mole percent) is expressed as a percentage by dividing the number of moles of a specific component by the sum of moles of all components and then multiplying by 100, and expressed as a formula, for example, the following formula can be equal to 1.
  • the lipid nanoparticles are ionizable lipid: phospholipid: cholesterol: lipid-PEG conjugate in a molar ratio of 20 to 50: 10 to 30: 20 to 60: 0.1 to 10, 20 to 50: 10 to 30: 20 to 60: 0.25 to A molar ratio of 10, 20 to 50: 10 to 30: 30 to 60: A molar ratio of 0.25 to 10, 20 to 50: 10 to 30: 30 to 60: A molar ratio of 0.1 to 5, 20 to 50: 10 to 30: 30 to 60: 0.5 to 5 molar ratio, 25 to 45: 10 to 25: 40 to 50: 0.5 to 3 molar ratio, 25 to 45: 10 to 20: 40 to 55: 0.5 to 3 molar ratio, 25 to 45: 10 to 20: 40 to 55: a molar ratio of 1.0 to 1.5, 40 to 45: 10 to 15: 40 to 45: a molar ratio of 0.5 to 3.0, 40 to 45: 10 to 15: a molar ratio of 40 to 45: 0.5 to 3,
  • the number of moles of cholesterol is decreased as much as the number of moles of the lipid-PEG conjugate is increased while the sum of moles of the lipid-PEG conjugate and the number of moles of cholesterol among the components included in the lipid nanoparticles is kept constant.
  • the molar ratio means the mole ratio
  • part by weight means the weight ratio in which each component is included.
  • the lipid nanoparticles include 20 to 50 parts by weight of an ionizable lipid, 10 to 30 parts by weight of a phospholipid, 20 to 60 parts by weight (or 20 to 60 parts by weight) of cholesterol, and 0.1 to 10 parts by weight of a lipid-PEG conjugate. (or 0.25 to 10 parts by weight, 0.5 to 5 parts by weight).
  • the lipid nanoparticles contain 20 to 50% by weight of an ionizable lipid, 10 to 30% by weight of a phospholipid, 20 to 60% by weight (or 30 to 60% by weight) of cholesterol, and 0.1% by weight of a lipid-PEG conjugate, based on the total weight of the nanoparticles.
  • the lipid nanoparticles contain 25 to 50% by weight of an ionizable lipid, 10 to 20% by weight of a phospholipid, 35 to 55% by weight of a cholesterol, and 0.1 to 10% by weight of a lipid-PEG conjugate based on the total weight of the nanoparticles ( Or 0.25 to 10% by weight, 0.5 to 5% by weight) may be included.
  • Lipid nanoparticles comprising ionizable lipids, cholesterol, phospholipids, and/or lipid-PEG conjugates in the above ranges (molar ratio, mid-range, and/or weight percent) are ionizable lipids, cholesterol, phospholipids, and/or lipids outside the above ranges. or (i) stability of the lipid nanoparticles over lipid nanoparticles comprising a lipid-PEG conjugate, (ii) encapsulation rate of the drug, and/or (iii) liver tissue, and/or cells (eg, hepatocytes and/or LSEC) may have good drug delivery efficiency.
  • Lipid nanoparticles according to an embodiment have an average diameter of 20 nm to 200 nm, 20 to 180 nm, 20 nm to 170 nm, 20 nm to 150 nm, so as to be easily introduced into liver tissue, hepatocytes, and / or liver sinusoidal endothelial cells (LSEC).
  • LSEC liver sinusoidal endothelial cells
  • the liver tissue, hepatocyte, and/or LSEC targeting effect (drug delivery effect) of the lipid nanoparticles may be dependent on the size of the lipid nanoparticles. For example, 40 to 120 nm, 30 to 100 nm, 35 to 95 nm, 40 to 90 nm, 45 to 90 nm, 50 to 90 nm, 55 to 85 nm, 60 to 80 nm, 70 to 90 nm, 70 to 80 nm, 50 to 70 nm, or In the case of lipid nanoparticles having a diameter of 60 to 70 nm, the targeting effect to hepatocytes may be superior (than nanoparticles having a diameter outside the above range).
  • the targeting effect with LSEC may be superior (than nanoparticles having a diameter outside the above range).
  • the lipid nanoparticles may specifically target liver tissue.
  • Lipid nanoparticles according to an embodiment can mimic the metabolic behavior of natural lipoproteins very similarly, and can be usefully applied to the lipid metabolism process by the liver and a therapeutic mechanism through it.
  • the lipid nanoparticles may target hepatocytes.
  • the content of the lipid-PEG conjugate contained in the lipid nanoparticles is 0.1 to 15 mol%, 0.25 to 15 mol%, 0.5 to 15 mol%, 1 to 15 mol%, 1.5 to 15 mol%, 2 to 15 mol%, 2.5 to 15 mol%, 0.1 to 12.5 mol%, 0.25 to 12.5 mol%, 0.5 to 12.5 mol%, 1 to 12.5 mol%, 1.5 to 12.5 mol%, 2 to 12.5 mol%, 2.5 to 12.5 mol%, 0.1 to 10 mol%, 0.25-10 mol%, 0.5-10 mol%, 1-10 mol%, 1.5-10 mol%, 2-10 mol%, 2.5-10 mol%, 0.1-7.5 mol%, 0.25-7.5 mol%%, 0.5 to 7.5 mol%, 1 to 7.5 mol%, 1.5 to 7.5 mol%, 2 to 7.5 mol%, 2.5 to 7.5 mol%,
  • the lipid nanoparticles may target LSEC (liver sinusoidal endothelial cells).
  • the content of the lipid-PEG conjugate contained in the lipid nanoparticles is 0.1 to 15 mol%, 0.25 to 15 mol%, 0.5 to 15 mol%, 1 to 15 mol%, 1.5 to 15 mol%, 2 to 15 mol%, 2.5 to 15 mol%, 0.1 to 12.5 mol%, 0.25 to 12.5 mol%, 0.5 to 12.5 mol%, 1 to 12.5 mol%, 1.5 to 12.5 mol%, 2 to 12.5 mol%, 2.5 to 12.5 mol%, 0.1 to 10 mol%, 0.25-10 mol%, 0.5-10 mol%, 1-10 mol%, 1.5-10 mol%, 2-10 mol%, 2.5-10 mol%, 0.1-7.5 mol%, 0.25-7.5 mol%%, 0.5 to 7.5 mol%, 1 to 7.5 mol%, 1.5 to 7.5 mol%, 2 to 7.5 mol%,
  • targeting localization (localization) of the lipid nanoparticles to liver tissue, hepatocytes, and / or LSEC may be internalization in tissues or cells, and the nuclear membrane is also It can permeate and can mean internalization within the nucleus.
  • the lipid nanoparticles in another aspect, (1) the lipid nanoparticles; and (2) an anionic drug, a nucleic acid, or a combination thereof (a combination of anionic drug and nucleic acid).
  • the drug may be an anionic drug, a nucleic acid, or a combination thereof (anionic drug and nucleic acid).
  • the composition for drug delivery may be one in which physiologically active substances such as anionic drugs and/or nucleic acids are encapsulated inside the lipid nanoparticles, and physiologically active substances such as anionic drugs and/or nucleic acids are stably and with high efficiency. It is encapsulated and can exhibit an excellent therapeutic effect by the composition for delivery. In addition, there is an advantage in that the type of drug encapsulated in the lipid nanoparticles can be variously controlled according to the purpose of treatment.
  • the lipid nanoparticles may have anionic drugs and/or nucleic acids encapsulated therein (of the lipid nanoparticles).
  • anionic drugs and/or nucleic acids are encapsulated (inside of lipid nanoparticles) are the same as for lipid nanoparticles described above.
  • the weight ratio of the ionizable lipid and drug (anionic drug, nucleic acid, or a combination thereof) contained in the lipid nanoparticles is 1 to 20: 1, 1 to 15: 1, 1 to 10: 1, 5 to 20:1, 5 to 15:1, 5 to 10:1, 7.5 to 20:1, 7.5 to 15:1, or 7.5 to 10:1.
  • ionizable lipids in a weight ratio within the above range (1) ionizable lipids; And (2) when the drug (anionic drug, nucleic acid, or a combination thereof) is included, the encapsulation rate and / or drug delivery efficiency of the drug (anionic drug, nucleic acid, or a combination thereof) inside the lipid nanoparticles is outside the above range.
  • the anionic drug and/or nucleic acid-encapsulated lipid nanoparticles have an average diameter of 20 nm to 200 nm, 20 to 180 nm, 20 nm to facilitate introduction into liver tissue, hepatocytes, and/or LSEC (liver sinusoidal endothelial cells).
  • the apolipoprotein eg, ApoE (eg, ApoE3) present in the blood when the lipid nanoparticles are in the systemic circulation
  • the apolipoprotein eg, ApoE (eg, ApoE3) present in the blood when the lipid nanoparticles are in the systemic circulation
  • the apolipoprotein may be decreased to reduce the number of lipid nanoparticles entering the cell and/or (ii) it is difficult to maintain stability as the surface area of the lipid nanoparticles is excessively increased, thus the drug into the target tissue (or target cell)
  • the delivery efficiency and/or the therapeutic effect of the drug delivered by the lipid nanoparticles may be reduced.
  • Lipid nanoparticles having a diameter within the above range have superior drug delivery efficiency to target organs and/or cells than lipid nanoparticles having a diameter exceeding the upper limit of the range.
  • (1) the lipid nanoparticles; And (2) an anionic drug, nucleic acid, or a composition for drug delivery comprising a combination thereof may be a composition for drug delivery to hepatocytes (hepatocyte).
  • the diameter of the lipid nanoparticles included in the composition for delivery of the drug (anionic drug, nucleic acid, or a combination thereof) to the hepatocytes is 40 to 120 nm, 30 to 100 nm, 35 to 95 nm, 40 to 90 nm, 45 to 90 nm, 50 to 90 nm, 55 to 85 nm, 60 to 80 nm, 70 to 90 nm, 70 to 80 nm, 50 to 70 nm, or 60 to 70 nm.
  • the composition for drug delivery having a diameter in the above range is suitable for delivery to hepatocytes.
  • the drug delivery efficiency may be superior to that of lipid nanoparticles having a diameter outside the above range.
  • the lipid nanoparticles included in the composition for drug delivery to hepatocytes contain 0.1 to 15 mol%, 0.25 to 15 mol%, 0.5 to 15 mol%, 1 to 15 mol%, 1.5 of the lipid-PEG conjugate.
  • the lipid nanoparticles included in the composition for drug delivery to hepatocytes are ionizable lipids: phospholipids: cholesterol: lipid-PEG conjugates in the above-mentioned range or 20 to 50: 10 to 30: 30 to 60 : 0.5 to 5 molar ratio, 25 to 45: 10 to 25: 40 to 50: 0.5 to 3 molar ratio, 25 to 45: 10 to 20: 40 to 55: 0.5 to 3 molar ratio, 25 to 45: 10 to 20 : 40 to 55: may be included in a molar ratio of 1.0 to 1.5.
  • the lipid nanoparticles including the components in a molar ratio within the above range may have excellent hepatocyte-specific (or hepatocyte-targeting) drug delivery efficiency.
  • the lipid nanoparticles (1) the lipid nanoparticles; and (2) an anionic drug, a nucleic acid, or a combination thereof.
  • the composition for drug delivery may be a composition for drug delivery to LSEC.
  • the diameter of the lipid nanoparticles included in the composition for drug delivery to the LSEC is 20 to 200 nm, 20 to 180 nm, 40 to 180 nm, 40 to 170 nm, 50 to 160 nm, 70 to 180 nm, 70 to 170 nm, 75 to 170 nm, 75 to 165 nm, 70 to 150 nm, 70 to 130 nm, 75 to 130 nm, 80 to 120 nm, 85 to 120 nm, about 90 to 120 nm, 90 to 110 nm, 80 to 110 nm, 80 to 100 nm, 85 to 95 nm, about 90 nm , or 90 nm.
  • the lipid nanoparticles included in the composition for drug delivery to the LSEC contain 0.1 to 15 mol%, 0.25 to 15 mol%, 0.5 to 15 mol%, 1 to 15 mol%, 1.5 of the lipid-PEG conjugate.
  • the lipid nanoparticles included in the composition for drug delivery to the LSEC include ionizable lipid: phospholipid: cholesterol: lipid-PEG conjugate in the above-mentioned range or 20 to 50: 10 to 30: 30 to 60 : 0.5 to 5 molar ratio, 25 to 45: 10 to 25: 40 to 50: 0.5 to 3 molar ratio, 25 to 45: 10 to 20: 40 to 55: 0.5 to 3 molar ratio, 25 to 45: 10 to 20 : 40 to 55: may be included in a molar ratio of 1.0 to 1.5.
  • Lipid nanoparticles including the components in a molar ratio within the above range may have excellent LSEC-specific (or LSEC-targeting) drug delivery efficiency.
  • Lipid nanoparticles according to one embodiment can efficiently deliver a therapeutic agent to the liver tissue inside, hepatocytes, and/or LSEC through liver tissue-specific properties, and such highly efficient liver tissue, hepatocyte, and/or LSEC-specific lipids Nanoparticle-mediated liver disease treatment drugs, methods of delivering therapeutic genes, etc., and therapeutic agents mediated through the liver, etc. can be usefully utilized.
  • the lipid nanoparticles according to an embodiment form a stable complex with a gene drug, such as a nucleic acid, and exhibit low cytotoxicity and effective cell uptake, and thus are effective in delivering a gene drug such as a nucleic acid.
  • the lipid nanoparticles are as described above.
  • Lipid nanoparticles exhibit a pKa of 5 to 8, 5.5 to 7.5, 6 to 7, or 6.5 to 7, thereby exhibiting a positive charge in acidic pH conditions to exhibit a negative charge for nucleic acids and anionic drugs (e.g., proteins ) can easily form a complex with a drug through electrostatic interaction with a therapeutic agent such as, and can encapsulate the drug with high efficiency, and is useful as a composition for intracellular or in vivo drug delivery of drugs (eg, nucleic acids) can be used
  • encapsulation refers to encapsulating a delivery material for efficient incorporation into the living body
  • drug encapsulation rate refers to the total drug content used for manufacturing. It means the content of the drug encapsulated in the particle.
  • the encapsulation rate of the anionic or nucleic acid drug of the composition for delivery is 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 94% or more, more than 80% 99% or less, 80% or more to 97% or less, 80% or more to 95% or less, 85% or more to 95% or less, 87% or more to 95% or less, 90% or more to 95% or less, 91% or more to 95% or less, 91% or more to 94% or less, more than 91% to 95% or less, 92% or more to 99% or less, 92% or more to 97% or less, or 92% or more to 95% or less.
  • the encapsulation rate can be calculated by a commonly used method, for example, the drug encapsulation rate is treated with Triton-X in the lipid nanoparticles according to an example, and Triton-X is treated And, the fluorescence intensity of the lipid nanoparticles not treated with Triton-X is measured by a specific wavelength bandwidth (eg, exitation: 480 ⁇ 490nm, emission: 520 ⁇ 530nm), and may be calculated by Equation 2 below. there is.
  • a specific wavelength bandwidth eg, exitation: 480 ⁇ 490nm, emission: 520 ⁇ 530nm
  • Drug encapsulation rate (%) (Fluorescence intensity (fluorescence intensity) of lipid nanoparticles treated with Triton-X- Fluorescence intensity (fluorescence intensity) of lipid nanoparticles not treated with Triton-X)/(Triton-X treatment Fluorescence intensity (fluorescence intensity) of lipid nanoparticles) X 100
  • the composition for drug delivery according to an embodiment may include Cas9 mRNA at a high encapsulation rate.
  • the previously known composition for delivery of Cas9 mRNA has a limitation in using it as a composition for delivery of Cas9 mRNA, including Cas9 mRNA at a low ratio.
  • the lipid nanoparticles according to an embodiment may include Cas9 mRNA with a high encapsulation rate, specifically, an encapsulation rate of 70% or more, and thus may be usefully utilized for gene editing therapy.
  • the anionic drug may be anionic biopolymers-drug conjugates such as various peptides having an anion, protein drugs, protein-nucleic acid constructs or hyaluronic acid-peptide conjugates, hyaluronic acid-protein conjugates, and the like.
  • the protein drug include gene editing proteins such as Cas 9 and cpf1, which are gene editing scissors, and apoptosis inducers (eg, cytocrome C, caspase 3/7/8/9, etc.) and various intracellular proteins. (eg, transcription factors) and the like.
  • the nucleic acid is small interfering ribonucleic acid (siRNA), ribosomal ribonucleic acid (rRNA), ribonucleic acid (RNA), deoxyribonucleic acid (DNA), complementary deoxyribonucleic acid (cDNA), aptamer (aptamer), messenger ribonucleic acid (mRNA), It may be one or more selected from the group consisting of transport ribonucleic acid (tRNA), antisense oligonucleotide, shRNA, miRNA, ribozyme, PNA, DNAzyme, and sgRNA for gene editing, but is not limited thereto.
  • tRNA transport ribonucleic acid
  • antisense oligonucleotide shRNA
  • miRNA miRNA
  • ribozyme ribozyme
  • PNA DNAzyme
  • sgRNA messenger ribonucleic acid
  • siRNA refers to double-stranded RNA (duplex RNA) capable of inducing RNA interference (RNAi) phenomenon through cleavage of specific mRNA, or single-stranded single-stranded RNA having a double-stranded form inside single-stranded RNA. refers to RNA. It is composed of a sense RNA strand having a sequence homologous to the mRNA of a target gene and an antisense RNA strand having a sequence complementary thereto. Since siRNA can suppress the expression of a target gene, it is provided as an efficient gene knock-down method or as a method of gene therapy. Bonding between double strands is achieved through hydrogen bonding between nucleotides, and not all nucleotides within the double strands must be complementary and completely bonded.
  • duplex RNA capable of inducing RNA interference (RNAi) phenomenon through cleavage of specific mRNA, or single-stranded single-stranded RNA having a double-stranded form inside single-
  • the length of the siRNA is about 15 to 60, specifically about 15 to 50, about 15 to 40, about 15 to 30, about 15 to 25, about 16 to 25, about 19 to 25, about 20 to 25, or about 20 to 23 nucleotides.
  • the siRNA length refers to the number of nucleotides on one side of the double-stranded RNA, that is, the number of base pairs, and in the case of single-stranded RNA, refers to the length of the double strand inside the single-stranded RNA.
  • siRNA may be composed of nucleotides introduced with various functional groups for the purpose of increasing blood stability or weakening an immune response.
  • antisense oligonucleotide may be modified at one or more bases, sugars or backbone positions to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3): 343-55, 1995).
  • the oligonucleotide backbone can be modified with phosphorothioates, phosphotriesters, methyl phosphonates, short chain alkyls, cycloalkyls, short chain heteroatoms, heterocyclic intersaccharide linkages, and the like.
  • Antisense oligonucleotides may also include one or more substituted sugar moieties.
  • Antisense oligonucleotides may include modified bases.
  • Modified bases include hypoxanthine, 6-methyladenine, 5-me pyrimidine (particularly 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, gentobiosyl HMC, 2-aminoadenine, 2-thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6-aminohexyl) adenine, 2,6-diaminopurine etc.
  • single-stranded deoxyribonucleic acid refers to a single-stranded oligonucleotide that selectively binds to a specific target DNA and induces an antigene effect.
  • aptamer refers to an oligonucleotide (generally, 20 to 80 nt DNA or RNA) that binds to a specific target.
  • oligonucleotide aptamer eg, DNA or RNA aptamer.
  • mRNA refers to a synthetic mRNA (in vitro transcribed mRNA) capable of expressing a gene.
  • RNA refers to a single strand consisting of 50 to 70 nucleotides, and forms a stem-loop structure in vivo.
  • a long RNA of 19 to 29 nucleotides is complementary to both sides of a loop region of 5 to 10 nucleotides to form a double-stranded stem.
  • miRNA refers to a single-stranded RNA molecule that regulates gene expression and consists of a full length of 21 to 23 nucleotides. miRNA is an oligonucleotide that is not expressed in cells and has a short stem-loop structure. The miRNA has full or partial homology with one or two or more mRNA (messenger RNA), and suppresses target gene expression through complementary binding to the mRNA.
  • miRNA miRNA
  • ribozyme is a type of RNA and is an RNA having the same function as an enzyme that recognizes the base sequence of a specific RNA and cuts it by itself.
  • a ribozyme is a complementary nucleotide sequence of a target messenger RNA strand and consists of a region that binds with specificity and a region that cuts the target RNA.
  • DNAzyme is a single-stranded DNA molecule having enzymatic activity, and a DNAzyme (10-23 DNAzyme) consisting of 10 to 23 nucleotides cuts an RNA strand at a specific position under physiologically similar conditions.
  • the 10-23 DNAzyme cleaves between any exposed purines and pyrimidines without base pairing.
  • 10-23 DNA enzyme (DNAzyme) consists of 15 conserved nucleotide sequences (eg, 5'-GGCTAGCTACAACGA-3') of an enzyme active site (catalytic domain) and an RNA substrate to the left and right of the active site of the above-mentioned enzyme. It consists of an RNA substrate binding domain consisting of 7 to 8 DNA sequences to be recognized.
  • PNA Protein nucleic acid
  • PNA protein nucleic acid
  • PNA was first reported in 1999 as nucleobase-like DNA linked by peptide bonds (Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine- substituted polyamide", Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500]). PNA is not found in nature and is artificially synthesized by chemical methods. PNA causes a hybridization reaction with a natural nucleic acid of a complementary base sequence to form a double strand.
  • PNA/DNA duplexes are more stable than DNA/DNA duplexes, and PNA/RNA duplexes are more stable than DNA/RNA duplexes for the same length.
  • N-(2-aminoethyl)glycine is most commonly linked by amide bonds.
  • the backbone of peptide nucleic acids is electrically different from the backbone of natural nucleic acids, which are negatively charged. is neutral with
  • the four nucleotides present in PNA have almost the same spatial size and distance between the nucleotides as in the case of natural nucleic acids.
  • PNA is not only chemically more stable than natural nucleic acids, but also biologically stable because it is not degraded by nucleases or proteases.
  • sgRNA refers to a complex single RNA molecule of crispr RNA (crRNA) and tracer (tracrRNA) as an oligonucleotide (generally, an RNA molecule) that binds to a specific DNA target.
  • crRNA crispr RNA
  • tracrRNA tracer oligonucleotide
  • gene editing protein refers to Cas9, spCas9, cjCas9, casX, CasY and Cpf1, and the like, and refers to a protein that recognizes a target DNA base sequence together with sgRNA to cause DNA cleavage.
  • the target cell to which the drug and/or nucleic acid is delivered by the lipid nanoparticles according to an embodiment may be a hepatocyte in vivo or isolated in vivo, and/or LSEC.
  • the composition for drug delivery and/or the drug (anionic drug, nucleic acid, or combination thereof) and the complex with the lipid nanoparticles according to an embodiment may target or specifically target hepatocytes and/or LSEC. Therefore, the composition for delivering lipid nanoparticles or lipid nanoparticles according to an embodiment is acute or chronic liver disease such as liver fibrosis, cirrhosis, hepatitis (eg, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, etc.). It may be for the treatment of a disease, and may also be utilized as a composition for delivery of a therapeutic agent (drug) absorbed through the liver.
  • a therapeutic agent drug
  • Another aspect is (1) the lipid nanoparticles; And (2) provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease, including an anionic drug, nucleic acid, or a combination thereof.
  • the lipid nanoparticles included in the pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease are the same as for the lipid nanoparticles included in the composition for drug delivery described above.
  • the anionic drug and nucleic acid contained in the pharmaceutical composition for preventing or treating epilepsy are the same as for the anionic drug and nucleic acid contained in the composition for drug delivery described above.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease may include lipid nanoparticles in which anionic drugs and/or nucleic acids are encapsulated therein.
  • the liver disease is ATTR amyloidosis (ATTR amyloidosis), dyslipidemia (Hypercholesterolemia), hepatitis B (Hepatitis B virus infection), acute liver failure (Acute liver failure), cirrhosis (Cirrhosis), and consisting of liver fibrosis (liver fibrosis) It may be one or more selected from the group.
  • the anionic drug may have a preventive or therapeutic effect on liver disease.
  • the nucleic acid may have a liver disease preventing or therapeutic effect, for example, (1) TTR (Transthyretin) ((eg, human TTR (protein: GenBank Accession Nos. NP_000362.1; gene: GenBank Accession Nos. NM_000371) .4, etc.), mouse TTR (protein: GenBank Accession No.; NP_038725.1; gene: GenBank Accession No. NM_013697.5, etc.)), (2) PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) ((eg, human PCSK9 (protein: GenBank Accession Nos. NP_777596.2; gene: GenBank Accession Nos.
  • TTR Transthyretin
  • PCSK9 Protein convertase subtilisin/kexin type 9
  • HBV genotype A eg, GenBank Accession No.: X02763, X51970, or AF090842
  • HBV genotype B eg, GenBank Accession No.: D00329, AF100309, or AB033554
  • HBV genotype E eg, GenBank Accession No.: X75657 or AB032431
  • HBV genotype F e.g., GenBank Accession No.: X69798, AB036910, or AF223965
  • HBV genotype G eg, GenBank Accession No.: AF160501, AB064310, or AF405706) HBV genotype HBV genotype HBV genotype A
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • NP_001020537.2, NP_001020538.2, NP_001020539.2, NP_001020540.2, NP_001020541.2 Genes: GenBank Accession Nos. NM_003376.6, NM_001025366.3, NM_001025367.3, NM_001025368.3, NM_00102536 3, etc.), mouse VEGFA (proteins: GenBank Accession No. NP_001020421.2, NP_001020428.2, NP_001103736.1, NP_001103737.1, NP_001103738.1; Gene: GenBank Accession No.
  • VE GFB (e.g., human VEGFB (protein: GenBank Accession Nos. NP_001230662.1, NP_003368.1; Gene: GenBank Accession Nos. NM_003377.5, NM_001243733.2, etc.), mouse VEGFB (protein: GenBank Accession No. NP_001172093.1, NP_035827.1; gene: GenBank Accession No. NM_001185164.1, NM_011697.3, etc.); VEGFC (eg, human VEGFC (protein: GenBank Accession Nos.
  • NP_005420.1 gene: GenBank Accession Nos. NM_005429.5, etc.
  • mouse VEGFC protein: GenBank Accession No.; NP_033532.1; gene: GenBank Accession No. NM_009506) .2, etc.
  • PDGF Plater-derived growth factor
  • PDGFA human PDGFA (protein: GenBank Accession Nos. NP_002598.4, NP_148983.1,; gene: GenBank Accession Nos. NM_002607.5, NM_033023.4, etc.)
  • mouse PDGFA Proteins: GenBank Accession No.
  • PDGFB (eg, human PDGFB (protein: GenBank Accession Nos. NP_002599.1, NP_148937.1; gene: GenBank Accession Nos. NM_033016.3, NM_002608.4, etc.), mouse PDGFB (protein: GenBank Accession No. NP_035187.2; gene) : GenBank Accession No. NM_011057.4, etc.)); PDGFC ((eg, human PDGFC (protein: GenBank Accession Nos. NP_057289.1; gene: GenBank Accession Nos.
  • mouse PDGFC protein: GenBank Accession No. NP_064355.1, NP_001344675.1; Gene: GenBank Accession No. NM_019971.3, NM_001357746.1, etc.
  • PDGFD eg, human PDGFD (protein : GenBank Accession Nos. NP_079484.1, NP_149126.1; Gene: GenBank Accession Nos. NM_033135.4, NM_025208.5, etc.)
  • mouse PDGFD protein: GenBank Accession No. NP_082200.1, NP_001344326.1, NP_001344327.1; gene: GenBank Accession No. NM_027924.3, NM_001357397.1, NM_001357398.1, etc.
  • NP_082200.1 NP_001344326.1, NP_001344327.1
  • the pharmaceutical composition may be administered to mammals including humans by various routes, including parenteral administration, and parenteral administration may be applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or locally, and the dosage may vary depending on the patient's condition. and body weight, disease severity, drug form, administration route and time, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition When formulating the pharmaceutical composition according to an example, it is prepared using a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, and a surfactant usually used.
  • a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, and a surfactant usually used.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspension solutions, emulsions, lyophilized formulations, suppositories, and the like.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • injectable esters such as ethyl oleate.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerol, gelatin, etc. may be used.
  • the pharmaceutical composition according to an embodiment is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type, severity, and drug activity of the patient. , sensitivity to drug, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to an embodiment may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the compound according to the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and may be administered daily or every other day, or divided into 1 to 3 times a day. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition is 0.1 to 100 mg/kg, 0.1 to 50 mg/kg, 1 to 10 mg/kg based on the concentration of the drug (anionic drug, nucleic acid, or a combination thereof) included in the pharmaceutical composition. kg, or at a dose of 1 to 5 mg/kg.
  • Another aspect is (1) the lipid nanoparticles; And (2) an anionic drug, nucleic acid, or a method for preventing or treating liver disease, comprising administering a composition (for example, the pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease) to a patient, comprising a combination thereof provides Lipid nanoparticles, anionic drugs, nucleic acids, pharmaceutical compositions, and liver diseases are the same as described above.
  • the method for preventing or treating liver disease may further include, prior to administering the composition, identifying (selecting) patients in need of prevention and/or treatment of the liver disease. there is.
  • the subject subject to which the treatment method is applied means, but is not limited to, mammals including rats, livestock, etc. including humans that have or may develop liver disease.
  • the pharmaceutical composition comprising the lipid nanoparticles according to an embodiment is an anionic drug and / or nucleic acid into the liver It can be delivered efficiently, so that the subject can be treated efficiently.
  • the lipid nanoparticles; and (2) an anionic drug, a nucleic acid, or a combination thereof, comprising administering to a patient a pharmaceutically effective amount of a composition (eg, the pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease), liver disease can provide a method for preventing or treating
  • a pharmaceutically effective amount is the same as described above, and a suitable total daily amount may be determined by treatment within the scope of correct medical judgment, and may be administered once or divided into several doses.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular patient depends on the type and extent of the response to be achieved, the specific composition, including whether other agents are used, if necessary, the patient's age, weight, general health, sex and diet, and administration time. , administration route and secretion rate of the composition, treatment period, and various factors including drugs used together or concurrently with a specific composition and similar factors well known in the pharmaceutical field can be applied differently.
  • the lipid nanoparticles are specific to liver tissue, have excellent biocompatibility, and can deliver gene therapy with high efficiency, and thus can be usefully used in related art fields such as lipid nanoparticle-mediated gene therapy.
  • FIG. 1a shows an exemplary structure of a lipid nanoparticle according to an example
  • FIG. 1b shows an image observed by a cryo-TEM of a nanoparticle according to an example.
  • FIG. 3a (241-C10 LNP to 243-C10 LNP) and FIG. 3b (244-C10 LNP to 246-C10 LNP) show the results of measuring the fluorescence intensity of each lipid nanoparticle in a solution having a pH of 4.1 to 9.6. indicates
  • FIG. 4A and 4B are results showing the intracellular gene transfer efficiency of each nanoparticle.
  • Fig. 4a shows the luminescence intensity measured by lysing LNPs encapsulated with luciferase-encoding mRNA (luc mRNA) into HeLa cells and then lysing the cells
  • Fig. 4b shows LNPs encapsulated with luc mRNA into hepatocytes. The luminescence intensity measured by lysing cells after transformation into (Hepatocyte) is shown.
  • +ApoE means a group treated with ApoE3
  • -ApoE means a group not treated with ApoE3.
  • Figure 5a shows the distribution of drug delivery in vivo in mice administered with 244-C10 LNP to 246-C10 LNP encapsulated with Luc mRNA
  • Fig. 5b is a mouse enucleated from mice administered with 246-C10 LNP encapsulated with Luc mRNA. represents the distribution of drug delivery to each organ of
  • Figure 6 shows the drug delivery efficiency of lipid nanoparticles and the size of nanoparticles according to the lipid-PEG content in the lipid nanoparticles in mice administered with 246-C10 LNP containing lipid-PEG at 1.0 to 2.5 mol%; indicates.
  • Figure 8 shows the size of the lipid nanoparticles and the PDI values of the lipid nanoparticles according to the lipid-PEG content contained in the lipid nanoparticles (left table), the drug delivery efficiency to hepatocytes in vivo, the expression amount of FVII The results (right graph) are shown.
  • FIG. 9 shows the size and PDI values of lipid nanoparticles according to the lipid-PEG content contained in the lipid nanoparticles (left table), and the results of confirming the drug delivery efficiency to LSEC in vivo through the expression amount of FVIII (right graph) ) is indicated.
  • Example 1-1 Preparation of ionizable lipids
  • An ionizable lipid was synthesized by reaction in a molar ratio of primary amine x 1).
  • n primary amine x 2 + secondary amine x 1
  • the molecular weight of each ionizable lipid generated by the reaction was calculated and stored at a concentration of 100 mg/ml using ethanol.
  • Ionizable lipids prepared using 241 amines and C10 are named '241-C10', and ionizable lipids prepared using other types of amines are also named as 'Amine names used (241 to 246)-C10' did.
  • Example 1-2 Identification of ionizable lipids produced
  • Example 1-1 In order to confirm the ionizable lipid prepared in Example 1-1, 1H NMR was performed. Specifically, 5 ⁇ g of the ionizable lipid (246-C10) synthesized in Example 1-1 was diluted in 0.5 ml of CDCl 3 (sigma, USA) to obtain a concentration of 100 mmole. Thereafter, 0.5 ml each was put into a 400 MHz NMR tube, the top was sealed, and then sealed with parafilm to obtain NMR spectra using Agilent 400 MHZ FT-NMR (Agilent, USA), and the results are shown in FIG. 2 . As shown in FIG. 2 , it was found that the signal representing each functional group of 246-C10 was saturated.
  • MS analysis was performed. Specifically, MS analysis was performed by diluting the ionizable lipids in ethanol to a concentration of 0.5 ppm or less.
  • the instrument used for the analysis was 6230 LC/MS from Agilent Technologies (Palo Alto, USA), and Agilent Technologies' Zorbax SB-C18 (100 mm ⁇ 2.1 mm id, 3.5 ⁇ m) was used for the separation tube, and 0.1% of the mobile phase was used. Two solvents of distilled water (A) and acetonitrile (B) containing formic acid were gradient eluted.
  • the solvent gradient of the mobile phase was maintained for 4 minutes until the ratio of the organic solvent acetonitrile (B) was initially increased from 30% to 80% for 2 minutes, then the ratio of the organic solvent was lowered to 30% again and stabilized.
  • the flow rate of the mobile phase was 300 ⁇ l/min, and the injection volume of the analyzer was 2 ⁇ l.
  • Table 2 The results of MS analysis are shown in Table 2 below. As shown in Table 2, it was confirmed that the measured m/z ratio of the ionizable lipid and the calculated m/z ratio were almost identical.
  • Ionizable lipids (241-C10 to 246-C10) prepared in Example 1-1, cholesterol (Cholesterol powder, BioReagent, suitable for cell culture, ⁇ 99%, sigma, Korea), phospholipids (DSPC) (Avanti, USA), and a lipid-PEG conjugate (ceramide-PEG conjugate; C16 PEG2000 Ceramide, Avanti, USA) were dissolved in ethanol at a molar ratio of 42.5:13:43:1.5.
  • Ethanol and acetate buffer in which ionizable lipids, cholesterol, phospholipids, and lipid-PEG are dissolved in a volume ratio of 1:3 were mixed through a microfluidic mixing device (Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada) at a flow rate of 12 ml/min, Lipid nanoparticles (LNPs) were prepared.
  • a microfluidic mixing device Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada
  • Example 2-2 Preparation of nucleic acid-encapsulated lipid nanoparticles
  • Ionizable lipids (241-C10 to 246-C10), cholesterol (Cholesterol powder, BioReagent, suitable for cell culture, ⁇ 99%, sigma, Korea), phospholipids (DSPC or DOPE) prepared in Example 1-1 ( 18:0 PC (DSPC), 18:1 ( ⁇ 9-Cis) PE (DOPE), Avanti, USA), and lipid-PEG conjugate (ceramide-PEG conjugate; C16 PEG2000 Ceramid, Avanti, USA) were dissolved in ethanol did it Dilute 30 ⁇ g of RNA therapeutic mRNA (luciferase mRNA; SEQ ID NO: 1) in 0.75 ml of sodium citrate, or mix siRNA (siFVII; SEQ ID NOs: 2 and 3 in the same molar ratio, or siFVIII; SEQ ID NO: 4 to 11 in the same molar ratio (or siLuc: SEQ ID NOs: 12 and 13 were mixed in the same molar ratio) were diluted in 0.75 ml of
  • siRNA sequences used are as follows: SEQ ID NO: 2 (FVII target siRNA_sense; 5'-GGAUCAUCUCAAGUCUUACdtdt-3'), SEQ ID NO: 3 (FVII target siRNA_antisense; 5'-GUAAGACUUGAGAUGAUCCdtdt-3'), SEQ ID NO: 4 (FVIII target siRNA_sense) ; 5'CUUAUAUCGUGGAGAAUUAdtdt-3') SEQ ID NO: 5 (FVIII target siRNA_antisense_1; 5'-UAAUUCUCCACGAUAUAAGdtdt-3'), SEQ ID NO: 6 (FVIII target siRNA_sense_2; 5'-UCAAAGGAUUCGAUGGUAU_dtdt-3'), SEQ ID NO: 7 (FVIII target siRNA_antisense_siRNA_dtdt-3'); 5'-AUACCAUCGAAUCCUUUGAdtdt-3'), SEQ ID
  • lipid-PEG lipid-PEG conjugate
  • aqueous phase sodium acetate or sodium citrate
  • an RNA therapeutic agent nucleic acid
  • lipid-PEG lipid-PEG conjugate
  • ionizable lipid phospholipid (DOPE): cholesterol: lipid-PEG (C16-PEG2000 ceramide) 26.5: 20: 52.5 to 51: 1.0 to 2.5 (molar ratio of It was dissolved in ethanol at a molar ratio of cholesterol and lipid-PEG content so that the total sum was 100), and the organic and aqueous phases were mixed so that the weight ratio of mRNA (luciferase mRNA; SEQ ID NO: 1): ionizable lipid was 1:10. to prepare lipid nanoparticles.
  • LNPs lipid nanoparticles
  • the prepared LNP was dialyzed against PBS for 16 hours using a 3500 MWCO dialysis cassette to remove ethanol and adjust the pH of the lipid nanoparticles to the body pH.
  • Lipid nanoparticles containing ionizable lipid '241-C10' were named '241-C10 LNP', and lipid nanoparticles prepared using ionizable lipids containing different types of amines (nucleic acid-encapsulated lipid nanoparticles particles) were named 'contained amine names (241 to 246)-C10 LNP'.
  • Lipid nanoparticles encapsulated with siLuc were prepared as in Example 2-2 using a ceramide-PEG conjugate (C16-PEG2000 ceramide). Load 60ug of the prepared lipid nanoparticles (contains 1.5 mol% of ceramide-PEG conjugate) on 200 mesh carbon lacey film Cu-grid based on siRNA concentration, immerse in ethane liquefied with vitrobot (about -170 degrees or less) and plunge freeze After preparation, it was observed with Cryo-TEM (Tecnai F20, FEI), and the results are shown in FIG. 1B. As shown in FIG. 1b , spherical particles with a solid shape were observed.
  • Cryo-TEM Tecnai F20, FEI
  • each lipid nanoparticle (LNP) formulated in Example 2-1 was calculated through an in vitro TNS assay.
  • Anionic TNS interacts with positively charged ionizable lipids to become lipophilic, and as the pH value approaches the pKa value of each LNP, the lipophilicity of the TNS decreases and more water molecules quench TNS fluorescence ( quenching), the lipid nanoparticles having a pKa of 6.0 to 7.0 have excellent in vivo drug delivery efficiency, and the lipid nanoparticles showing the "s-shaped curve" in the graph showing fluorescence according to pH are the endosomal membrane and It means that the interaction is easy, and can easily escape the endosomes during acidification.
  • the pH of a solution containing 20mM sodium phosphate, 25mM citrate, 20mM ammonium acetate, and 150mM NaCl is adjusted from pH 4.1 to pH 9.6 using 0.1N NaOH and/or 0.1N HCl in 0.5 steps to obtain various pH values.
  • a solution of the unit was prepared. 100 ⁇ l of each solution having each pH (pH with an interval of 0.5 from pH 4.1 to pH 9.6) was added to a black 96 well plate, and a TNS stock solution of 300 ⁇ M was used to obtain a final concentration of 6 ⁇ M. Each was added to a solution having a pH.
  • 241-C10 LNP to 246-C10 LNP were added to the mixed solution to a final concentration of 20 uM.
  • the fluorescence intensity was measured by excitation at 325 nm and emission at 435 nm through the Tecan instrument, and the fluorescence intensity for each lipid nanoparticle is shown in FIGS. 3A and 3B, and the pKa for each lipid nanoparticle reached half of the maximum fluorescence. It was calculated as the pH value and is shown in Table 3 below.
  • FIG. 3B it was found that 244-C10 LNP to 246-C10 LNP exhibited a fluorescence titration s-shaped curve through nonlinear regression.
  • nucleic acid-encapsulated LNP prepared as in Example 2-2 the same pattern was shown depending on the type of ionizable lipid contained (the type of amine contained in the ionizable lipid).
  • the size of the mRNA-encapsulated lipid nanoparticles (LNP; containing 1.5 mol% of lipid-PEG) prepared in Example 2-2 was measured.
  • the RNA (luciferase mRNA; SEQ ID NO: 1) contained in each lipid nanoparticle prepared in Example 2-2 was diluted with PBS so that the concentration was 1 ⁇ g/ml, and Malvern Zetasizer Nano (Malvern Instruments, UK)
  • the diameter and polydispersity index (PDI) of the LNPs were measured using dynamic light scattering (DLS), and the results are shown in Table 4 below.
  • Lipid nanoparticles Diameter (nm) PDI 241-C10 LNP 128 0.259 242-C10 LNP 77 0.210 243-C10 LNP 56 0.225 244-C10 LNP 66 0.149 245-C10 LNP 70 0.210 246-C10 LNP 68 0.143
  • the encapsulation efficiency (drug encapsulation rate, %) of each LNP (containing 1.5 mol% of lipid-PEG) encapsulated with siRNA (siFVII siRNA) as a nucleic acid drug was measured by Ribogreen analysis (Quant-iTTM RiboGreen® RNA, Invitrogen). did.
  • the LNP containing the nucleic acid drug prepared in Example 2-2 was diluted with 50 ⁇ l of 1xTE buffer so that the final concentration of siRNA was 4 to 7 ⁇ g/ml in a 96-well plate.
  • Triton-x LNP(-) For the group not treated with Triton-X (Triton-x LNP(-)), 50 ⁇ l of 1xTE buffer was added, and for the group treated with Triton-X (Triton-X LNP(+)), 2% Triton-X buffer 50 ⁇ l was added. After incubation at 37° C. for 10 minutes, LNPs were digested with Triton-X to release encapsulated nucleic acids. Then 100 ⁇ l of Ribogreen reagent was added to each well.
  • the fluorescence intensity (FL) of Triton LNP(-) and Triton LNP(+) was measured with a wavelength bandwidth (exitation: 485nm, emission: 528nm) in Infinite® 200 PRO NanoQuant (Tecan), and the drug encapsulation rate (encapsulation efficiency, %) ) was calculated as in Equation 3 below.
  • the drug encapsulation rate (%) for each LNP is shown in Table 5 below as the average value of the results measured repeatedly twice.
  • Drug encapsulation rate (%) (fluorescence of Triton LNP(+) - fluorescence of Triton LNP(-))/(fluorescence of Triton LNP(+)) X 100
  • Lipid nanoparticles inclusion rate (Encapsulation efficiency, %) 241-C10 LNP 84 242-C10 LNP 83 243-C10 LNP 91 244-C10 LNP 87 245-C10 LNP 91 246-C10 LNP 94
  • the lipid nanoparticles according to an example can encapsulate the drug with high efficiency.
  • Example 5-1 Nucleic acid delivery effect according to the type of ionizable lipid included in LNP
  • HeLa cells Karl Cell Line Bank
  • DMEM media SH30022, Hyclone, USA
  • LNPs (241-C10 LNPs to 246-C10 LNPs containing 1.5 mol% of lipid-PEG) encapsulated with mRNA (luc mRNA; SEQ ID NO: 1) encoding the luciferase gene, prepared in Example 2-2 ) was stirred with ApoE3 0.1 ⁇ g/ml and pipetting, incubated at room temperature for 10 minutes, and then treated with HeLa cells (100ng/well based on mRNA contained in lipid nanoparticles).
  • ApoE3 binds to the LNP surface and plays a role in allowing LNP to enter the cell through endocytosis through the LDL receptor expressed on the cell surface.
  • FIG. 4a As shown in Fig. 4a, in the case of 244-C10 LNP, 245-C10 LNP, and 246-C10 LNP with a pKa range of 6.0 to 7.0, strong luminescence intensity was exhibited, and among them, 246-C10 LNP showed luminescence intensity. The highest, it was found that 246-C10 LNP had the highest intracellular drug delivery efficiency.
  • the luc mRNA was delivered to hepatocytes using the 246-C10 lipid nanoparticles prepared in Example 2-2, and the luminescence intensity was measured to confirm the expression of the gene.
  • the lipid nanoparticles according to an embodiment are easily introduced into cells through binding to ApoE3, and the amount of drug (nucleic acid) delivery is increased in a concentration-dependent manner, and hepatocytes It was confirmed that the drug can be delivered with high efficiency.
  • Example 5-1 the in vivo drug delivery efficiency and biodistribution of 244-C10 LNP to 246-C10 LNP, which exhibit excellent gene expression effect (gene transfer effect) in vitro, were obtained in this Example wanted to check.
  • 244-C10 to 246-C10 LNPs (containing 1.5 mol% of lipid-PEG) encapsulated with luc mRNA (SEQ ID NO: 1) were prepared according to the method of Example 2-2, and each nanoparticle was incubated in PBS for 16 hours. Ethanol was removed by dialysis.
  • mice administered with 246-C10 LNP encapsulated with luc mRNA were sacrificed, organs were removed, and the biodistribution of lipid particles in each organ was confirmed through IVIS equipment, and the results are shown in FIG. 5B .
  • mice to which luc mRNA-encapsulated 244-C10 LNP to 246-C10 LNP were administered exhibited high luminescence intensity in vivo, which is consistent with the results of Example 5-1.
  • Figs. 5a and 5b it was confirmed that 246-C10 LNP encapsulated with luc mRNA exhibited high liver-specific luminescence intensity through whole-body imaging and ex vivo organ imaging. It was confirmed that the lipid nanoparticles according to the example exhibited high biodistribution to the liver.
  • lipid-PEG C16-PEG2000 ceramide
  • luc mRNA SEQ ID NO: 1
  • the ionizable lipid: mRNA weight ratio contained in the lipid nanoparticles was 10: 1, and the ionizable lipid (246-C10): phospholipid (DOPE): cholesterol: lipid-PEG (C16-PEG2000) contained in the LNP was
  • DOPE phospholipid
  • cholesterol lipid-PEG (C16-PEG2000) contained in the LNP
  • the molar ratio of ceramide) was 26.5: 20: 52.5 to 51: 1.0 to 2.5 (the content of cholesterol and lipid-PEG was adjusted so that the sum of the molar ratios was 100).
  • 246-C10 LNP containing lipid-PEG in 1.0 mol%, 1.5 mol%, or 2.5 mol% and encapsulated with luc mRNA was similar to the method of Example 6 above, based on the luc mRNA contained in the lipid nanoparticles.
  • iv intravenous injection of mRNA-encapsulated lipid nanoparticles into C57BL/6 Female 7-week-old mice (Orient Bio) at a dose of 0.1 mg/kg, 0.25 mg/kg of luciferin was intraperitoneally administered 3 hours after IVIS ( PerkinElmer, USA) equipment to confirm bioluminescence, the result is shown in FIG. 6, and the size of the lipid nanoparticles according to the lipid-PEG content was measured in the same manner as in Example 4-1. It is shown in Table 6 and FIG. 6 .
  • Lipid-PEG content in LNP Diameter (nm) 1.0 mol% 90 1.5 mol% 67 2.5 mol% 55
  • the drug delivery efficiency to the liver was excellent in the group administered with the lipid nanoparticles according to an example, and the size of the LNP containing 1.5 mol% of lipid-PEG was about 70 nm.
  • Example 8-1 Confirmation of knockout effect of FVII using lipid nanoparticles
  • FVII is specifically expressed in hepatocytes
  • the possibility of targeting the hepatocytes of the lipid nanoparticles according to an example was confirmed through the FVII (Factor VII) knockout effect using siFVII.
  • the FVII target siRNA (SEQ ID NO: 2 and 3) prepared in Example 2-2 was After intravenous injection of encapsulated 246-C10 lipid nanoparticles (containing 1.5 mol% of lipid-PEG) into C57BL/6 female 7-week-old 20 g mice, blood was collected through the tail vein 3 days later, and according to the protocol of the coaset FVII assay kit. According to the blood analysis, the expression level of FVII was measured by drawing a standard curve with the blood of mice administered with PBS, and the results are shown in FIG. 7 . As shown in FIG.
  • siRNA encapsulated in 246-C10 lipid nanoparticles inhibited FVII expression in vivo in a concentration-dependent manner, so it was confirmed that the lipid nanoparticles according to an example could deliver nucleic acids to hepatocytes.
  • Example 8-2 Effect of drug delivery to hepatocytes according to lipid-PEG content
  • the weight ratio of ionizable lipid: siRNA contained in the lipid nanoparticles was 7.5: 1, and the ionizable lipid (246-C10): phospholipid (DSPC): cholesterol: lipid-PEG (C16-PEG2000 ceramide) contained in the LNP was The molar ratio was 42.5:13:44 to 39.5:0.5 to 5.0 (the content of cholesterol and lipid-PEG was adjusted so that the sum of the molar ratios was 100).
  • the diameter and polydispersity index (PDI) of the lipid nanoparticles prepared above were measured in the same manner as in Example 4-1, and are shown in Tables 7 and 8 (left table).
  • Lipid-PEG (%) Average diameter (nm) PDI 0.5 120 0.018 One 78 0.106 1.5 52 0.159 3 42 0.152 5 37 0.226
  • siFVII-encapsulated lipid nanoparticles (containing lipid-PEG at 0.5 to 5 mol%) were intravenously injected into C57BL/6 female 7-week-old 20 g mice so that the dose was 0.2 mg/kg based on the siRNA contained in the lipid nanoparticles. After 3 days, blood was collected through the tail vein, and the expression level of FVII was measured using a coaset FVII assay kit similar to the method of Example 8-1, and the result is shown in FIG. 8 (right graph). indicated.
  • siFVIII SEQ ID NOs: 4 to 11 encapsulated nanoparticles (246-C10 LNP) were prepared as in Example 2 above.
  • the diameter and PDI of the lipid nanoparticles prepared above were measured in the same manner as in Example 4-1, and are shown in Tables 8 and 9 (left table) below.
  • Lipid-PEG (%) Average diameter (nm) PDI 0.5 166 0.018 One 87 0.106 1.5 78 0.159 3 42 0.152 5 35.6 0.226
  • siFVIII-encapsulated lipid nanoparticles (containing lipid-PEG at 0.5 to 5 mol%) were intravenously administered to C57BL/6 female 7-week-old 20 g mice. Two days after injection, blood was collected through the tail vein, and the expression level of FVIII was measured using a coaset FVIII assay kit similar to the method of Example 8-1, and the result is shown in FIG. 9 (right graph). It was. As shown in FIG.
  • Example 10 Drug delivery effect according to the type of lipid-PEG conjugate
  • lipid nanoparticles comprising a ceramide-PEG conjugate (C16-PEG 2000 ceramide; Avanti, USA) or PEG-DSPE (Avanti, USA) (containing 0.25 to 10.0 mol% of a lipid-PEG conjugate) lipid nanoparticles were prepared in the same manner as in Example 2-2.
  • siRNA siRNA
  • ionizable lipids 246-C10
  • LNP phospholipids
  • DSPC phospholipids
  • cholesterol lipid-PEG (ceramide-PEG) or PEG-DSPE)
  • SEQ ID NOs: 12 and 13 The sequence of the used siLuc (siRNA targeting the luciferase gene; SEQ ID NOs: 12 and 13) was described in Example 2-2 above.
  • HeLa cells Karl Cell Line Bank
  • DMEM media SH30022, Hyclone, USA
  • siLuc-encapsulated lipid nanoparticles in the HeLa-Luc cell line 100 ⁇ l/well of Bright-GloTM Luciferase Assay solution (promega, USA) was treated at room temperature for 10 minutes.
  • the lysed cells were measured for luminescence intensity using an Infinite M200 luminescence measuring instrument (Tecan, USA), and the results are shown in FIG. 10 .
  • the measured results were expressed as mean ⁇ SD.
  • the result value was statistically verified by the T-test method, and a case of p ⁇ 0.05 or more was defined as statistically significant.
  • the lipid nanoparticles according to one example had excellent nucleic acid delivery effects into cells, and in particular, when a ceramide-PEG conjugate was included as a lipid-PEG conjugate, the nucleic acid delivery effect was excellent.

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Abstract

본 발명은 생체 내 약물 전달을 위한 지질 나노입자 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 지질 나노입자는 간 조직 특이적이고 생체 친화도가 우수하며, 고효율로 유전자 치료제 등을 전달할 수 있어 지질 나노입자 매개 유전자 치료 등 관련 기술분야에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

생체 내 약물 전달을 위한 지질 나노입자 및 이의 용도
본 발명은 생체 내 약물 전달을 위한 지질 나노입자 및 이의 용도에 관한 것이다.
의약 제제 산업에 있어 약물의 부작용을 줄이고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 설계한 약물전달시스템(DDS; Drug Delivery System)은 신약개발과 맞먹는 경제적 이익을 창출할 수 있으면서 성공 가능성이 큰 고부가가치 핵심기술로서 약물투여를 효율화함으로서 환자 치료의 질을 높이는데 그 목적이 있다.
약물전달시스템의 핵심기술 중의 하나인 약물흡수 촉진 기술에 속하는 난용성 약물의 가용화 기술은 신약 물질의 개발비용을 줄일 수 있는 동시에 현재 출시되어 있는 의약품의 부가가치를 높일 수 있는 가장 합리적인 방법으로 여겨지고 있다. 특히, 우리나라와 같이 신약개발 여건이 열악한 상황에서 약물의 가용화 기술의 개발을 통한 개량 신약의 개발은 적은 비용으로 막대한 부가가치를 창출할 수 있는 분야이다.
유전자 약물전달시스템을 이용한 유전자 치료법은 유전적 결합을 수정하고 수많은 질병을 치료하는데 있어 커다란 희망으로 자리 잡고 있다. 이러한 유전자 치료법을 성공적이고 안전하게 수행함에 있어서, 효과적인 유전자 전달이 주요한 과제 중 하나이며, 바이러스 전달체가 유전자 전달에 있어 효과적임이 입증되었다. 그러나 면역원성(immunogenicity), 주입된 DNA 크기의 한계 및 대량 생산의 어려움과 같은 몇 가지 결점으로 인해 유전자 전달 시스템으로서 바이러스의 이용이 제한되고 있다. 양이온성 리포좀 및 중합체와 같은 비-바이러스성 유전자 담체가 바이러스성 시스템의 대체 수단으로서 주목을 받기 시작했다.
개선된 안정성 프로파일 및 중합체 전달체의 제조와 조작의 용이성이 효과적이고 안전한 유전자 전달용 비독성 및 생분해성 중합체 담체의 디자인 및 합성에 대한 연구를 촉발시켰다. 폴리(L-라이신), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 스타버스트(starburst), 폴리아미도아민(polyamidoamine) 덴드리머, 및 양이온성 리포좀 등이 자발적으로 자가 조립가능하고 플라스미드 DNA(pDNA)를 엔도사이토시스를 통해 세포로 진입시키기에 충분히 작은 구조로 압축할 수 있기 때문에 비-바이러스성 유전자 전달체로서 널리 연구되어 왔다.
Antisense RNA, siRNA 등의 핵산은 생체 내에서 특정 단백질의 발현을 억제할 수 있는 물질로, 암, 유전병, 감염질병, 자가면역 질환 등의 치료에 중요한 도구로 각광받고 있다(Novina and Sharp, Nature, 430, 161-164, 2004). 그러나 siRNA와 같은 핵산은 세포 내로 직접 전달이 어렵고, 혈액 내에서 효소에 의해 쉽게 분해되므로 이를 극복하기 위한 연구들이 많이 진행되고 있다. 현재까지 핵산을 세포 내로 운반하는 방법으로 양전하 지질 또는 중합체와 섞어 운반하는 방법(각각 지질-DNA 접합체(lipoplex) 및 폴리머-DNA 접합체(polyplex)라 명명함)이 주로 사용되고 있다(Hirko 등, Curr. Med. Chem., 10, 1185-93, 2003; Merdan 등, Adv. Drug. Deliv. Rev., 54, 715-58, 2002). 지질-DNA 접합체는 핵산과 결합하여 세포 내로 핵산을 잘 전달시켜 세포수준에서 많이 사용되고 있으나, 생체 내에서는 국부적으로 주사 시 많은 경우 체내에서 염증을 유발시키는(Filonand 및 Phillips, Biochim. Biophys. Acta, 1329, 345-56, 1997) 등의 단점이 있다.
또한 이러한 비-바이러스성 전달체는 트랜스펙션 효율이 낮은 문제점이 있다. 트랜스펙션 효율을 높이기 위해 많은 노력이 기울여져 왔으나, 이는 여전히 안정하다고 여겨지는 시스템과는 거리가 멀다. 또한, 비-바이러스성 유전자 전달체 담체는 열악한 생체적합성 및 비-생분해성으로 인해 현저하게 높은 세포독성을 나타낸다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 약물의 봉입률이 우수하며 목적하는 기관 또는 세포에 음이온성 약물, 핵산 등을 효율적으로 전달할 수 있는 신규 입자를 개발하고자 예의 노력한 결과, 이온화 가능한 지질; 인지질; 콜레스테롤; 및 지질-PEG(polyethyleneglycol) 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 제조하고, 상기 지질 나노입자가 간 조직에 특이적으로 전달되며 음이온성 화합물 또는 핵산 등의 약물이 높은 효율로 봉입될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 6원의 헤테로고리 아민 및 알킬-에폭시드가 결합된 이온화 가능한 지질, 인지질, 콜레스테롤, 및 지질-PEG(polyethyleneglycol) 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (1) 상기 지질 나노입자; 및 (2) 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 약물(음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합) 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) 상기 지질 나노입자; 및 (2) 음이온성 약물 핵산, 또는 이의 조합을 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태는, 6원의 헤테로고리 아민 및 알킬-에폭시드가 결합된 이온화 가능한 지질(ionizable lipid); 인지질; 콜레스테롤; 및 지질-PEG(polyethyleneglycol) 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 제공한다.
일 예에 따른 지질 나노입자는 간 조직 특이적이고 생체 친화도가 우수하며, 고효율로 유전자 치료제 등을 전달할 수 있어 지질 나노입자 매개 유전자 치료 및 영상 진단 기술 등 관련 기술분야에 유용하게 사용할 수 있다.
본 명세서에서, '이온화 가능한 지질(ionizable lipid)' 또는 '지질 유사체(lipidoid)'는 용이하게 양성자화될 수 있는 아민-함유 지질을 의미하고, 예를 들면, 주변 pH에 따라 전하상태가 변하는 지질일 수 있다. 상기 이온화 가능한 지질은 6원의 헤테로고리 아민 및 알킬-에폭시드가 결합된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 이온화 가능한 지질은 6원의 헤테로고리 아민 및 알킬-에폭시드가 반응하여 생성되는 지질과 유사한 특성을 갖는 화합물일 수 있으며, 보다 구체적으로, 6원의 헤테로고리 아민을 알킬-에폭시드와 반응시켜 에폭시드의 고리열림반응(ring opening reaction)에 의해 생성되는 화합물일 수 있다.
일 예에서, 상기 이온화 가능한 지질은 6원의 헤테로고리 아민 및 알킬-에폭시드는 1:n (n = 6원의 헤테로고리 아민에 포함된1차 아민의 갯수 x 2 + 2차 아민의 갯수 x 1)의 몰비로 반응시켜 결합된 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 246 아민 및 1,2-에폭시도데칸을 1: 4의 몰비로 혼합하여 700 내지 800rpm, 85 내지 95의 조건에서 2 내지 4일 동안 반응시켜 제조한 것일 수 있다.
상기 이온화 가능한 지질은 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서 양성자화(양으로 하전)될 수 있고, pKa 초과의 pH에서는 실질적으로 중성일 수 있다. 일 예에서, 상기 지질 나노입자는 양성자화된 이온화 가능한 지질 및/또는 중성을 나타내는 이온화 가능한 지질을 포함할 수 있다.
상기 이온화 가능한 지질은 지질과 유사한 특성을 갖는 이온화 가능한 화합물로서 약물(예를 들면, 음이온성 약물 및/또는 핵산)과의 정전기적 상호작용을 통하여 상기 약물이 지질 나노입자 내에 높은 효율로 봉입되도록 하는 역할을 수행할 수 있다.
상기 6원의 헤테로고리 아민은 피페라진(piperazine) 또는 피페리딘(piperidine) 구조를 포함하는 것일 수 있다.
상기 6원의 헤테로고리 아민은 3차 아민을 포함하는 사슬형 또는 비사슬형의 아민일 수 있고, 일 예에 따르면
Figure PCTKR2020019502-appb-I000001
,
Figure PCTKR2020019502-appb-I000002
,
Figure PCTKR2020019502-appb-I000003
,
Figure PCTKR2020019502-appb-I000004
,
Figure PCTKR2020019502-appb-I000005
, 및
Figure PCTKR2020019502-appb-I000006
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
일 예에서, 상기 6원의 헤테로고리 아민은 1,4-bis(3-aminopropyl)piperazine, N-(3-Aminopropyl)piperidine, (1-Methyl-4-piperidinyl)methanamine, 2-(4-Methyl-piperazin-1-yl)-ethylamine, 1-(2-Aminoethyl)piperazine, 및 1-(3-aminopropyl)piperazine으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 이온화 가능한 지질에 포함되는 아민의 종류에 따라, 지질 나노입자의 (i) 약물 봉입률, (ii) PDI(polydispersity index). 및/또는 (iii) 간 조직, 및/또는 간을 구성하는 세포(예를 들면, 간세포(hepatocyte) 및/또는 LSEC(liver sinusoidal endothelial cell; 간 혈관 내피세포))로의 약물 전달 효율이 상이할 수 있다.
상기 아민을 포함하는 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자는 하기 특징 중 1종 이상을 가질 수 있다:
(1) 높은 효율로 약물을 봉입;
(2) 제조된 입자의 크기가 균일(또는 낮은 PDI 수치를 가지며); 및/또는
(3) 간 조직, 및/또는 간을 구성하는 세포 (예를 들면, 간세포 및/또는 LSEC)로의 약물 전달 효율이 우수.
일 예에 따르면, 1,4-bis(3-aminopropyl)piperazine(예를 들면, Cas Nos. 7209-38-3)을 포함하는 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자는 다른 종류의 아민을 포함하는 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자 보다 하기 특징 중 1종 이상을 가질 수 있다:
(1) 높은 효율로 약물을 봉입;
(2) 제조된 입자의 크기가 균일(또는 낮은 PDI 수치를 가지며); 및/또는
(3) 간 조직, 및/또는 간을 구성하는 세포 (예를 들면, 간세포 및/또는 LSEC)로의 약물 전달 효율이 우수.
상기 알킬-에폭시드는 하기 화학식 1과 같은 구조를 가질 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2020019502-appb-I000007
상기 알킬-에폭시드는 C6 내지 C14, C6 내지 C12, C6 내지 C10, C8 내지 C14, C8 내지 C12, C8 내지 C10, C10 내지 C14, C10 내지 C12, 또는 C10의 탄소 길이를 갖는 것일 수 있고, 예를 들면, C10의 1,2-에폭시도데칸(1,2-epoxydodecane)일 수 있다. 이온화 가능한 지질에 포함되는 알킬-에폭시드의 탄소수를 상기 범위로 함으로써 지질 나노입자 내에 봉입되는 약물에 대한 높은 봉입률을 나타낼 수 있다.
일 예에서, 상기 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 2의 일반식을 가질 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2020019502-appb-I000008
상기 화학식 2의 구조는 일 예에 따른 이온화 가능한 지질이 갖는 구조의 일례로서, 이온화 가능한 지질의 구조는 6원의 헤테로고리 아민 및 알킬-에폭시드의 종류에 따라 상이할 수 있다.
일 예에 따르면, 화학시 2의 구조를 갖는 이온화 가능한 지질을 포함하는 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자는 다른 종류의 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자 보다 하기 특징 중 1종 이상을 가질 수 있다:
(1) 높은 효율로 약물을 봉입;
(2) 제조된 입자의 크기가 균일(또는 낮은 PDI 수치를 가지며); 및/또는
(3) 간 조직, 및/또는 간을 구성하는 세포 (예를 들면, 간세포 및/또는 LSEC)로의 약물 전달 효율이 우수.
일 예에 따르면, 상기 지질 나노 입자는 pKa가 5 내지 8, 5.5 내지 7.5, 6 내지 7, 또는 6.5 내지 7일 수 있다. pKa는 산 해리 상수로, 대상 물질의 산 강도를 나타내는 지표로서 일반적으로 사용되고 있는 것을 가리킨다. 상기 지질 나노입자가 갖는 pKa 값은 지질 나노입자의 생체 내 안정성 및 지질 나노입자의 약물 방출 측면에서 중요하다. 일 예에서 상기 범위의 pKa 값을 나타내는 지질 나노입자는 생체 내에서 안전하게 타겟 장기(예를 들면, 간) 및/또는 타겟 세포(간세포, 및/또는 LSEC)로 전달될 수 있고, 타겟 장기 및/또는 타겟 세포에 도달하여 엔도시토시스(endocytosis) 후에 양전하를 나타내어 엔도좀(endosome) 막의 음이온성 단백질과 정전기적 상호작용을 통해 봉입된 약물이 방출되도록 할 수 있다.
일 예에 따른 지질 나노입자의 구성요소 중 인지질은 지질 나노입자 내에서 이온화 가능한 지질 및 약물이 상호작용하여 형성된 코어를 감싸서 보호하는 역할을 수행하며, 타겟 세포의 인지질 이중층과 결합하여 약물의 세포 내 전달시 세포막 통과 및 엔도좀 탈출(endosomal escape)을 용이하게 할 수 있다.
상기 인지질은 일 예에 따른 지질 나노입자의 융합을 촉진할 수 있는 인지질을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면, 디올레일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 에그 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine, EPC), 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(POPE), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(POPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine](DOPS), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine] 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서 DOPE를 포함하는 지질 나노입자는 mRNA 전달에 효과적(mRNA에 대한 약물 전달 효율이 우수)일 수 있고, 다른 예에서, DSPE를 포함하는 지질 나노입자는 siRNA 전달에 효과적(siRNA에 대한 약물 전달 효율이 우수)일 수 있다.
일 예에 따른 지질 나노입자의 구성요소 중 콜레스테롤은 지질 나노입자 내에서 지질 충전에 형태적 측면에서 견고성을 부여하며, 나노입자의 코어 및 표면에 분산되어 나노입자의 안정성을 향상시키는 역할을 할 수 있다.
본 명세서에서 "지질-PEG(polyethyleneglycol) 접합체", "지질-PEG", “PEG-지질”, "PEG-lipid", 또는 "lipid-PEG"는 지질과 PEG가 컨쥬게이트된 형태를 지칭하는 것으로, 일측 단부에 친수성 중합체인 폴리에틸렌글리콜(PEG) 중합체가 결합된 지질을 의미한다. 상기 지질-PEG 접합체는 지질 나노입자 내에서 나노입자의 혈청 내 입자 안정성에 기여하며, 나노입자 간 응집을 막는 역할을 수행한다. 또한, 지질-PEG 접합체는 핵산의 생체 내 전달시 분해효소로부터 핵산을 보호하여 핵산의 체내 안정성을 강화시키며, 나노입자 내 봉입된 약물의 반감기를 증가시킬 수 있다.
상기 지질-PEG 접합체에서 PEG는 지질에 직접 접합될 수 있거나 또는 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG를 지질에 결합시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 예를 들면, 에스테르-비함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티가 포함된다. 상기 에스테르-비함유 링커 모이어티는 아미도(-C(O)NH-), 아미노(-NR-), 카르보닐(-C(O)-), 카르바메이트(-NHC(O)O-), 우레아(-NHC(O)NH-), 다이설파이드(-S-S-), 에테르(-O-), 석시닐(-(O)CCH2CH2C(O)-), 석신아미딜(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), 에테르, 다이설파이드뿐만 아니라 이들의 조합(예컨대, 카르바메이트 링커 모이어티 및아미도 링커 모이어티 둘 모두를 함유하는 링커)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 에스테르-함유 링커 모이어티는, 예를 들면 카르보네이트(-OC(O)O-), 석시노일, 포스페이트 에스테르(-O-(O)POH-O-), 설포네이트 에스테르, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 지질-PEG 접합체의 평균 분자량은 100 달톤 내지 10,000달톤, 200 달톤 내지 8,000달톤, 500 달톤 내지 5,000달톤, 1,000 달톤 내지 3,000달톤, 1,000 달톤 내지 2,600달톤, 1,500 달톤 내지 2,600달톤, 1,500 달톤 내지 2,500달톤, 2,000 달톤 내지 2,600달톤, 2,000 달톤 내지 2,500달톤, 또는 2,000달톤일 수 있다.
상기 지질-PEG 접합체 내 지질은 폴리에틸렌글리콜과 결합할 수 있는 지질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 상기 지질 나노입자의 다른 구성요소인 인지질 및/또는 콜레스테롤 또한 사용할 수 있다. 구체적으로, 지질-PEG 접합체 내 지질은 세라마이드(ceramide), 디미리스톨글리세롤(dimyristoylglycerol, DMG), 석시노일 디아글리세롤(succinoyl-diacylglycerol, s-DAG), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 또는 콜레스테롤일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 지질-PEG 접합체는 다이알킬옥시프로필에 결합된 PEG(PEG-DAA), 다이아실글리세롤에 결합된 PEG(PEG-DAG), 포스파티딜에탄올아민과 같은 인지질에 결합된 PEG(PEG-PE), 세라마이드에 접합된 PEG(PEG-CER, 세라마이드-PEG 접합체, 세라마이드-PEG, PEG-세라마이드 접합체, 또는 PEG-세라마이드), 콜레스테롤 또는 이의 유도체에 접합된 PEG, PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, PEG-DSPE(DSPE-PEG), 및 이들의 혼합물일 수 있고 예를 들면, C16-PEG2000 세라마이드(N-palmitoyl-sphingosine-1-{succinyl[methoxy(polyethylene glycol)2000]}), DMG-PEG 2000, 14:0 PEG2000 PE 일 수 있다.
일 예에 따르면, 세라마이드-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 경우 다른 종류의 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 경우 보다 하기 특징 중 1종 이상을 가질 수 있다:
(1) 높은 효율로 약물을 봉입;
(2) 제조된 입자의 크기가 균일(또는 낮은 PDI 수치를 가지며); 및/또는
(3) 간 조직, 및/또는 간을 구성하는 세포 (예를 들면, 간세포 및/또는 LSEC)로의 약물 전달 효율이 우수.
상기 지질-PEG 접합체 내 PEG는 친수성 고분자로 혈장 단백질들의 흡착을 억제하는 능력을 가지고 있어서 지질 나노입자의 체내 순환시간을 증가시키며, 나노입자 간의 응집현상을 막는 역할을 할 수 있다. 또한, 지질-PEG 접합체는 생체 내에서 스텔스(stealth) 기능을 나타내어 나노입자의 분해를 방지할 수 있다.
상기 PEG는 지질과 결합하지 않은 쪽에 관능기가 결합된 것(functionalized PEG)일 수 있다. 이 때 사용 가능한 관능기는 숙시닐기(succinyl), 카르복시산(carboxylic acid), 말레이미드(maleimide), 아민기, 바이오틴, 시아누르기(cyanur), 및 폴레이트(folate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 예에 따르면, 상기 지질-PEG 접합체는 0.1 내지 15몰%, 0.25 내지 15몰%, 0.5 내지 15몰%, 1 내지 15몰%, 1.5 내지 15몰%, 2 내지 15몰%, 2.5 내지 15몰%, 0.1 내지 12.5몰%, 0.25 내지 12.5몰%, 0.5 내지 12.5몰%, 1 내지 12.5몰%, 1.5 내지 12.5몰%, 2 내지 12.5몰%, 2.5 내지 12.5몰%, 0.1 내지 10몰%, 0.25 내지 10몰%, 0.5 내지 10몰%, 1 내지 10몰%, 1.5 내지 10몰%, 2 내지 10몰%, 2.5 내지 10몰%, 0.1 내지 7.5몰%, 0.25 내지 7.5몰%, 0.5 내지 7.5몰%, 1 내지 7.5몰%, 1.5 내지 7.5몰%, 2 내지 7.5몰%, 2.5 내지 7.5몰%, 0.1 내지 5몰%, 0.25 내지 5몰%, 0.5 내지 5몰%, 1 내지 5몰%, 1.5 내지 5몰%, 2 내지 5몰%, 2.5 내지 5몰%, 0.1 내지 3몰%, 0.25 내지 3몰%, 0.5 내지 3몰%, 1 내지 3몰%, 1.5 내지 3몰%, 2 내지 3몰%, 2.5 내지 3몰%, 0.1 내지 2.5몰%, 0.25 내지 2.5몰%, 0.5 내지 2.5몰%, 1 내지 2.5몰%, 1.5 내지 2.5몰%, 2 내지 2.5몰%, 0.1 내지 4.5몰%, 0.25 내지 4.5몰%, 0.5 내지 4.5몰%, 1 내지 4.5몰%, 1.5 내지 4.5몰%, 2 내지 4.5몰%, 2.5 내지 4.5몰%, 0.1 내지 4몰%, 0.25 내지 4몰%, 0.5 내지 4몰%, 1 내지 4몰%, 1.5 내지 4몰%, 2 내지 4몰%, 2.5 내지 4몰%, 0.1 내지 3.5몰%, 0.25 내지 3.5몰%, 0.5 내지 3.5몰%, 1 내지 3.5몰%, 1.5 내지 3.5몰%, 2 내지 3.5몰%, 2.5 내지 3.5몰%, 0.1 내지 2.0몰%, 0.1 내지 1.5몰%, 0.1 내지 1.0몰%, 0.5 내지 2.0몰%, 0.5 내지 1.5몰%, 0.5 내지 1.0몰%, 1.0 내지 2.0몰%, 1.0 내지 1.5몰%, 1.5 내지 2.0몰%, 1.0몰%, 또는 1.5몰%로 상기 지질 나노입자에 포함되는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 지질 나노입자의 간조직, 간세포, 및/또는 LSEC 타겟팅 효과(약물 전달 효과)는 지질 나노입자에 포함되는 지질-PEG 접합체의 함량에 의존적일 수 있다.
예를 들면, 지질-PEG 접합체를 0.1 내지 15몰%, 0.25 내지 15몰%, 0.5 내지 15몰%, 1 내지 15몰%, 1.5 내지 15몰%, 2 내지 15몰%, 2.5 내지 15몰%, 0.1 내지 12.5몰%, 0.25 내지 12.5몰%, 0.5 내지 12.5몰%, 1 내지 12.5몰%, 1.5 내지 12.5몰%, 2 내지 12.5몰%, 2.5 내지 12.5몰%, 0.1 내지 10몰%, 0.25 내지 10몰%, 0.5 내지 10몰%, 1 내지 10몰%, 1.5 내지 10몰%, 2 내지 10몰%, 2.5 내지 10몰%, 0.1 내지 7.5몰%, 0.25 내지 7.5몰%, 0.5 내지 7.5몰%, 1 내지 7.5몰%, 1.5 내지 7.5몰%, 2 내지 7.5몰%, 2.5 내지 7.5몰%, 0.1 내지 5몰%, 0.25 내지 5몰%, 0.5 내지 5몰%, 1 내지 5몰%, 1.5 내지 5몰%, 2 내지 5몰%, 2.5 내지 5몰%, 0.1 내지 3몰%, 0.25 내지 3몰%, 0.5 내지 3몰%, 1 내지 3몰%, 1.5 내지 3몰%, 2 내지 3몰%, 2.5 내지 3몰%, 0.1 내지 2.5몰%, 0.25 내지 2.5몰%, 0.5 내지 2.5몰%, 1 내지 2.5몰%, 1.5 내지 2.5몰%, 2 내지 2.5몰%, 0.1 내지 4.5몰%, 0.25 내지 4.5몰%, 0.5 내지 4.5몰%, 1 내지 4.5몰%, 1.5 내지 4.5몰%, 2 내지 4.5몰%, 2.5 내지 4.5몰%, 0.1 내지 4몰%, 0.25 내지 4몰%, 0.5 내지 4몰%, 1 내지 4몰%, 1.5 내지 4몰%, 2 내지 4몰%, 2.5 내지 4몰%, 0.1 내지 3.5몰%, 0.25 내지 3.5몰%, 0.5 내지 3.5몰%, 1 내지 3.5몰%, 1.5 내지 3.5몰%, 2 내지 3.5몰%, 2.5 내지 3.5몰%, 0.1 내지 10몰%, 0.1 내지 5.0몰%, 0.1 내지 4.5몰%, 0.1 내지 4.0몰%, 0.1 내지 3.5몰%, 0.1 내지 3.0몰%, 0.1 내지 2.5몰%, 0.1 내지 2.0몰%, 0.1 내지 1.5몰%, 0.1 내지 1.0몰%, 0.5 내지 10몰%, 0.5 내지 5.0몰%, 0.5 내지 4.5몰%, 0.5 내지 4.0몰%, 0.5 내지 3.5몰%, 0.5 내지 3.0몰%, 0.5 내지 2.5몰%, 0.5 내지 2.0몰%, 0.5 내지 1.5몰%, 0.5 내지 1.0몰%, 1.0 내지 10몰%, 1.0 내지 5.0몰%, 1.0 내지 4.5몰%, 1.0 내지 4.0몰%, 1.0 내지 3.5몰%, 1.0 내지 3.0몰%, 1.0 내지 2.5몰%, 1.0 내지 2.0몰%, 1.0 내지 1.5몰%, 1.5 내지 10몰%, 1.5 내지 5.0몰%, 1.5 내지 4.5몰%, 1.5 내지 4.0몰%, 1.5 내지 3.5몰%, 1.5 내지 3.0몰%, 1.5 내지 2.5몰%, 1.5 내지 2.0몰%, 1.0몰%, 또는 1.5몰%로 포함하는 지질 나노입자는 (상기 범위 외의 함량으로 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자 보다) 간세포로의 타겟팅 효과가 우수한 것일 수 있다.
또 다른 예를 들면, 지질-PEG 접합체를 0.1 내지 15몰%, 0.25 내지 15몰%, 0.5 내지 15몰%, 1 내지 15몰%, 1.5 내지 15몰%, 2 내지 15몰%, 2.5 내지 15몰%, 0.1 내지 12.5몰%, 0.25 내지 12.5몰%, 0.5 내지 12.5몰%, 1 내지 12.5몰%, 1.5 내지 12.5몰%, 2 내지 12.5몰%, 2.5 내지 12.5몰%, 0.1 내지 10몰%, 0.25 내지 10몰%, 0.5 내지 10몰%, 1 내지 10몰%, 1.5 내지 10몰%, 2 내지 10몰%, 2.5 내지 10몰%, 0.1 내지 7.5몰%, 0.25 내지 7.5몰%, 0.5 내지 7.5몰%, 1 내지 7.5몰%, 1.5 내지 7.5몰%, 2 내지 7.5몰%, 2.5 내지 7.5몰%, 0.1 내지 5몰%, 0.25 내지 5몰%, 0.5 내지 5몰%, 1 내지 5몰%, 1.5 내지 5몰%, 2 내지 5몰%, 2.5 내지 5몰%, 0.1 내지 3몰%, 0.25 내지 3몰%, 0.5 내지 3몰%, 1 내지 3몰%, 1.5 내지 3몰%, 2 내지 3몰%, 2.5 내지 3몰%, 0.1 내지 2.5몰%, 0.25 내지 2.5몰%, 0.5 내지 2.5몰%, 1 내지 2.5몰%, 1.5 내지 2.5몰%, 2 내지 2.5몰%, 0.1 내지 4.5몰%, 0.25 내지 4.5몰%, 0.5 내지 4.5몰%, 1 내지 4.5몰%, 1.5 내지 4.5몰%, 2 내지 4.5몰%, 2.5 내지 4.5몰%, 0.1 내지 4몰%, 0.25 내지 4몰%, 0.5 내지 4몰%, 1 내지 4몰%, 1.5 내지 4몰%, 2 내지 4몰%, 2.5 내지 4몰%, 0.1 내지 3.5몰%, 0.25 내지 3.5몰%, 0.5 내지 3.5몰%, 1 내지 3.5몰%, 1.5 내지 3.5몰%, 2 내지 3.5몰%, 2.5 내지 3.5몰%, 0.1 내지 10몰%, 0.1 내지 5.0몰%, 0.1 내지 4.5몰%, 0.1 내지 4.0몰%, 0.1 내지 3.5몰%, 0.1 내지 3.0몰%, 0.1 내지 2.5몰%, 0.1 내지 2.0몰%, 0.1 내지 1.5몰%, 0.1 내지 1.0몰%, 0.5 내지 10몰%, 0.5 내지 5.0몰%, 0.5 내지 4.5몰%, 0.5 내지 4.0몰%, 0.5 내지 3.5몰%, 0.5 내지 3.0몰%, 0.5 내지 2.5몰%, 0.5 내지 2.0몰%, 0.5 내지 1.5몰%, 0.5 내지 1.0몰%, 1.0 내지 10몰%, 1.0 내지 5.0몰%, 1.0 내지 4.5몰%, 1.0 내지 4.0몰%, 1.0 내지 3.5몰%, 1.0 내지 3.0몰%, 1.0 내지 2.5몰%, 1.0 내지 2.0몰%, 1.0 내지 1.5몰%, 1.5 내지 10몰%, 1.5 내지 5.0몰%, 1.5 내지 4.5몰%, 1.5 내지 4.0몰%, 1.5 내지 3.5몰%, 1.5 내지 3.0몰%, 1.5 내지 2.5몰%, 1.5 내지 2.0몰%, 1.0몰%, 또는 1.5몰%로 포함하는 지질 나노입자는 (상기 범위 외의 함량으로 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자 보다) LSEC으로의 타겟팅 효과가 우수한 것일 수 있다.
일 예에 따르면, 상기 콜레스테롤은 10 내지 60몰%, 20 내지 60몰%, 30 내지 60몰%, 30 내지 55몰%, 30 내지 52.5몰%, 30 내지 52몰%, 30 내지 51몰%, 30 내지 50몰%, 30 내지 47.5몰%, 30 내지 45몰%, 30 내지 44몰%, 30 내지 43.5몰%, 30 내지 43몰%, 30 내지 41.5몰%, 30 내지 40몰%, 30 내지 39.5몰%, 35 내지 60몰%, 35 내지 55몰%, 35 내지 52.5몰%, 35 내지 52몰%, 35 내지 51몰%, 35 내지 50몰%, 35 내지 47.5몰%, 35 내지 45몰%, 35 내지 44몰%, 35 내지 43.5몰%, 35 내지 43몰%, 35 내지 41.5몰%, 35 내지 40몰%, 35 내지 39.5몰%, 37 내지 60몰%, 37 내지 55몰%, 37 내지 52.5몰%, 37 내지 52몰%, 37 내지 51몰%, 37.5 내지 50몰%, 37.5 내지 47.5몰%, 37.5 내지 45몰%, 37.5 내지 44몰%, 37.5 내지 43.5몰%, 37.5 내지 43몰%, 37.5 내지 41.5몰%, 37.5 내지 40몰%, 37.5 내지 39.5몰%, 39.5 내지 60몰%, 39.5 내지 55몰%, 39.5 내지 52.5몰%, 39.5 내지 52몰%, 39.5 내지 51몰%, 39.5 내지 50몰%, 39.5 내지 47.5몰%, 39.5 내지 45몰%, 39.5 내지 44몰%, 39.5 내지 43.5몰%, 39.5 내지 43몰%, 39.5 내지 41.5몰%, 39.5 내지 40몰%, 40 내지 60몰%, 40 내지 55몰%, 40 내지 52.5몰%, 40 내지 52몰%, 40 내지 51몰%, 40 내지 50몰%, 40 내지 47.5몰%, 40 내지 45몰%, 40 내지 44몰%, 40 내지 43.5몰%, 40 내지 43몰%, 40 내지 41.5몰%, 41.5 내지 60몰%, 41.5 내지 55몰%, 41.5 내지 52.5몰%, 41.5 내지 52몰%, 41.5 내지 51몰%, 41.5 내지 50몰%, 41.5 내지 47.5몰%, 41.5 내지 45몰%, 41.5 내지 44몰%, 41.5 내지 43.5몰%, 41.5 내지 43몰%, 43 내지 60몰%, 43 내지 55몰%, 43 내지 52.5몰%, 43 내지 52몰%, 43 내지 51몰%, 43 내지 50몰%, 43 내지 47.5몰%, 43 내지 45몰%, 43 내지 44몰%, 43 내지 43.5몰%, 43.5 내지 60몰%, 43.5 내지 55몰%, 43.5 내지 52.5몰%, 43.5 내지 52몰%, 43.5 내지 51몰%, 43.5 내지 50몰%, 43.5 내지 47.5몰%, 43.5 내지 45몰%, 43.5 내지 44몰%, 45 내지 60몰%, 45 내지 55몰%, 45 내지 52.5몰%, 45 내지 52몰%, 45 내지 51몰%, 45 내지 50몰%, 45 내지 47.5몰%, 47.5 내지 60몰%, 47.5 내지 55몰%, 47.5 내지 52.5몰%, 47.5 내지 52몰%, 47.5 내지 51몰%, 47.5 내지 50몰%,%, 50 내지 60몰%, 50 내지 55몰%, 50 내지 52.5몰%, 50 내지 52몰%, 50 내지 52.5몰% 50 내지 51.5몰%, 51 내지 60몰%, 51 내지 55몰%, 51 내지 52.5몰%, 또는 51 내지 52몰%, %, 51 내지 60몰%, 51 내지 55몰%, 51 내지 52.5몰%, 또는 51 내지 52몰%로 상기 지질 나노입자에 포함되는 것일 수 있다.
일 예에 따르면, 상기 지질-PEG접합체와 콜레스테롤의 합은 30 내지 70몰%, 40 내지 70몰%, 40 내지 60몰%, 40 내지 55몰%, 40 내지 53.5몰%, 40 내지 50몰%, 40 내지 47.5몰%, 40 내지 45몰%, 40 내지 44,5몰%, 42 내지 60몰%, 42 내지 55몰%, 42 내지 53.5몰%, 42 내지 50몰%, 42 내지 47.5몰%, 42 내지 45몰%, 42 내지 44,5몰%, 44 내지 60몰%, 44 내지 55몰%, 44 내지 53.5몰%, 44 내지 50몰%, 44 내지 47.5몰%, 44 내지 45몰%, 44 내지 44.5몰%, 44.5 내지 60몰%, 44.5 내지 55몰%, 44.5 내지 53.5몰%, 44.5 내지 50몰%, 44.5 내지 47.5몰%, 또는 44.5 내지 45몰%로 상기 지질 나노입자에 포함되는 것일 수 있다.
일 예에 따르면, 상기 이온화 가능한 지질은 10 내지 70몰%, 10 내지 60몰%, 10 내지 55몰%, 10 내지 50몰%, 10 내지 45몰%, 10 내지 42.5몰%, 10 내지 40몰%, 10 내지 35몰%, 10 내지 30몰%, 10 내지 26.5몰%, 10 내지 25몰%, 10 내지 20몰%, 15 내지 60몰%, 15 내지 55몰%, 15 내지 50몰%, 15 내지 45몰%, 15 내지 42.5몰%, 15 내지 40몰%, 15 내지 35몰%, 15 내지 30몰%, 15 내지 26.5몰%, 15 내지 25몰%, 15 내지 20몰%, 20 내지 60몰%, 20 내지 55몰%, 20 내지 50몰%, 20 내지 45몰%, 20 내지 42.5몰%, 20 내지 40몰%, 20 내지 35몰%, 20 내지 30몰%, 20 내지 26.5몰%, 20 내지 25몰%, 25 내지 60몰%, 25 내지 55몰%, 25 내지 50몰%, 25 내지 45몰%, 25 내지 42.5몰%, 25 내지 40몰%, 25 내지 35몰%, 25 내지 30몰%, 25 내지 26.5몰%, 26.5 내지 60몰%, 26.5 내지 55몰%, 26.5 내지 50몰%, 26.5 내지 45몰%, 26.5 내지 42.5몰%, 26.5 내지 40몰%, 26.5 내지 35몰%, 26.5 내지 30몰%, 30 내지 60몰%, 30 내지 55몰%, 30 내지 50몰%, 30 내지 45몰%, 30 내지 42.5몰%, 30 내지 40몰%, 30 내지 35몰%, 35 내지 60몰%, 35 내지 55몰%, 35 내지 50몰%, 35 내지 45몰%, 35 내지 42.5몰%, 35 내지 40몰%, 40 내지 60몰%, 40 내지 55몰%, 40 내지 50몰%, 40 내지 45몰%, 40 내지 42.5몰%, 42.5 내지 60몰%, 42.5 내지 55몰%, 42.5 내지 50몰%, 또는 42.5 내지 45몰%로 상기 지질 나노입자에 포함되는 것일 수 있다.
일 예에 따르면, 상기 인지질은 1 내지 50몰%, 5 내지 50몰%, 5 내지 40몰%, 5 내지 30몰%, 5 내지 25몰%, 5 내지 20몰%, 5 내지 15몰%, 5 내지 13몰%, 5 내지 10몰%, 10 내지 30몰%, 10 내지 25몰%, 10 내지 20몰%, 10 내지 15몰%, 10 내지 13몰%, 15 내지 30몰%, 15 내지 25몰%, 15 내지 20몰%, 20 내지 30몰%, 또는 20 내지 25몰%로 상기 지질 나노입자에 포함되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "몰%(mol%, 몰퍼센트)"는 특정 구성성분의 몰수를 전체 구성성분의 몰수의 합으로 나눈 후 100을 곱하여 퍼센트로 나타낸 것이고, 수식으로 표현하여 예를 들면, 하기 수학식 1과 같을 수 있다.
(수학식 1)
몰% = (특정 구성성분의 몰수) / (전체 구성성분의 몰수의 합) x 100
상기 지질 나노입자는 이온화 가능한 지질 : 인지질 : 콜레스테롤 : 지질-PEG 접합체를 20 내지 50 : 10 내지 30 : 20 내지 60 : 0.1 내지 10의 몰비, 20 내지 50 : 10 내지 30 : 20 내지 60 : 0.25 내지 10의 몰비, 20 내지 50 : 10 내지 30 : 30 내지 60 : 0.25 내지 10의 몰비, 20 내지 50 : 10 내지 30 : 30 내지 60 : 0.1 내지 5 의 몰비, 20 내지 50 : 10 내지 30 : 30 내지 60 : 0.5 내지 5 의 몰비, 25 내지 45 : 10 내지 25 : 40 내지 50 : 0.5 내지 3의 몰비, 25 내지 45 : 10 내지 20 : 40 내지 55 : 0.5 내지 3 의 몰비, 25 내지 45 : 10 내지 20 : 40 내지 55 : 1.0 내지 1.5 의 몰비, 40 내지 45 : 10 내지 15 : 40 내지 45 : 0.5 내지 3.0의 몰비, 40 내지 45 : 10 내지 15 : 40 내지 45 : 0.5 내지 3의 몰비, 40 내지 45 : 10 내지 15 : 40 내지 45 : 1 내지 1.5의 몰비, 25 내지 30: 17 내지 22; 50 내지 55 : 0.5 내지 3.0의 몰비, 25 내지 30: 17 내지 22; 50 내지 55 : 1.0 내지 2.5의 몰비, 또는 25 내지 30: 17 내지 22; 50 내지 55 : 1.5 내지 2.5의 몰비로 포함하는 것일 수 있다. 일 예에 따르면, 상기 지질 나노입자에 포함되는 구성성분 중 지질-PEG 접합체 및 콜레스테롤의 몰수의 합을 일정하게 유지하면서 지질-PEG 접합체의 몰수를 증가시킨 만큼 콜레스테롤의 몰수를 감소시켜, 상기 구성성분의 몰비를 유지시킬 수 있다.
본 명세서에서, 몰비는 몰수 비를 의미하고, "중량부"는 각 성분이 포함된 중량 비율을 의미한다.
일 예에서, 상기 지질 나노입자는 이온화 가능한 지질 20 내지 50 중량부, 인지질 10 내지 30 중량부, 콜레스테롤 20 내지 60 중량부(또는 20 내지 60 중량부), 및 지질-PEG 접합체 0.1 내지 10 중량부(또는 0.25 내지 10 중량부, 0.5 내지 5 중량부)를 포함할 수 있다. 상기 지질 나노입자는 전체 나노입자 중량을 기준으로 이온화 가능한 지질 20 내지 50 중량%, 인지질 10 내지 30 중량%, 콜레스테롤 20 내지 60 중량％(또는 30 내지 60 중량%), 및 지질-PEG 접합체를 0.1 내지 10 중량%(또는 0.25 내지 10 중량%, 0.5 내지 5 중량%)를 포함할 수 있다. 다른 예에서 상기 지질 나노입자는 전체 나노입자 중량을 기준으로 이온화 가능한 지질 25 내지 50 중량%, 인지질 10 내지 20 중량%, 콜레스테롤 35 내지 55 중량％, 및 지질-PEG 접합체를 0.1 내지 10 중량%(또는 0.25 내지 10 중량%, 0.5 내지 5 중량%)로 포함할 수 있다.
상기 범위(몰비, 중랑부, 및/또는 중량%)로 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및/또는 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자는 상기 범위 외로 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및/또는 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자 보다 (i) 지질 나노입자의 안정도 (ii) 약물의 봉입률, 및/또는 (iii) 간 조직, 및/또는 세포(예를 들면, 간세포 및/또는 LSEC)를 타겟하는 약물 전달 효율이 우수할 수 있다.
일 예에 따른 지질 나노입자는 간조직, 간세포(hepatocyte), 및/또는 LSEC(liver sinusoidal endothelial cells) 내 도입이 용이하도록 평균 지름이 20nm 내지 200nm, 20 내지 180nm, 20nm 내지 170nm, 20nm 내지 150nm, 20nm 내지 120nm, 20nm 내지 100nm, 20nm 내지 90nm, 30nm 내지 200nm, 30 내지 180nm, 30nm 내지 170nm, 30nm 내지 150nm, 30nm 내지 120nm, 30nm 내지 100nm, 30nm 내지 90nm, 40nm 내지 200nm, 40 내지 180nm, 40nm 내지 170nm, 40nm 내지 150nm, 40nm 내지 120nm, 40nm 내지 100nm, 40nm 내지 90nm, 50nm 내지 200nm, 50 내지 180nm, 50nm 내지 170nm, 50nm 내지 150nm, 50nm 내지 120nm, 50nm 내지 100nm, 50nm 내지 90nm, 60nm 내지 200nm, 60 내지 180nm, 60nm 내지 170nm, 60nm 내지 150nm, 60nm 내지 120nm, 60nm 내지 100nm, 60nm 내지 90nm, 70nm 내지 200nm, 70 내지 180nm, 70nm 내지 170nm, 70nm 내지 150nm, 70nm 내지 120nm, 70nm 내지 100nm, 70nm 내지 90nm, 80nm 내지 200nm, 80 내지 180nm, 80nm 내지 170nm, 80nm 내지 150nm, 80nm 내지 120nm, 80nm 내지 100nm, 80nm 내지 90nm, 90nm 내지 200nm, 90 내지 180nm, 90nm 내지 170nm, 90nm 내지 150nm, 90nm 내지 120nm, 또는 90nm 내지 100nm일 수 있다. 지질 나노입자 크기가 상기 범위 보다 작은 경우, 지질 나노입자의 표면적이 과대하게 증가됨으로서 안정성 유지가 어렵고, 이에 따라 표적 조직으로의 전달 및/또는 약물 효과가 감소될 수 있다.
일 예에 따른 지질 나노입자의 간조직, 간세포, 및/또는 LSEC 타겟팅 효과(약물 전달 효과)는 지질 나노입자의 크기에 의존적일 수 있다. 예를 들면, 40 내지 120nm, 30 내지 100nm, 35 내지 95 nm, 40 내지 90nm, 45 내지 90nm, 50 내지 90nm, 55 내지 85nm, 60 내지 80nm, 70 내지 90nm, 70 내지 80nm, 50 내지 70nm, 또는 60 내지 70nm의 지름을 갖는 지질 나노입자의 경우 간세포로의 타겟팅 효과가 (상기 범위 외의 지름을 갖는 나노입자 보다) 우수한 것일 수 있다. 다른 예를 들면, 20 내지 200nm, 20내지 180 nm, 40 내지 180nm, 40 내지 170nm, 50 내지 160nm, 70 내지 180nm, 70 내지 170nm, 75 내지 170nm, 75 내지 165nm, 70 내지 150nm, 70 내지 130nm, 75 내지 130nm, 80 내지 120nm, 85 내지 120nm, 약 90 내지 120nm, 90 내지 110nm, 90 내지 100nm, 80 내지 110nm, 80 내지 100nm, 85 내지 95nm, 약 90nm, 또는 90nm 의 지름을 갖는 지질 나노입자의 경우 LSEC으로의 타겟팅 효과가 (상기 범위 외의 지름을 갖는 나노입자 보다) 우수한 것일 수 있다.
상기 지질 나노입자는 간 조직을 특이적으로 표적화하는 것일 수 있다. 일 예에 따른 지질 나노입자는 천연 지단백질의 대사 거동을 매우 유사하게 모방할 수 있으며, 간에 의한 지질 대사 과정 및 이를 통한 치료 메커니즘에 유용하게 적용될 수 있다.
상기 지질 나노입자는 간세포(hepatocyte)를 표적화하는 것일 수 있다. 상기 지질 나노 입자에 포함된 지질-PEG 접합체의 함량이 0.1 내지 15몰%, 0.25 내지 15몰%, 0.5 내지 15몰%, 1 내지 15몰%, 1.5 내지 15몰%, 2 내지 15몰%, 2.5 내지 15몰%, 0.1 내지 12.5몰%, 0.25 내지 12.5몰%, 0.5 내지 12.5몰%, 1 내지 12.5몰%, 1.5 내지 12.5몰%, 2 내지 12.5몰%, 2.5 내지 12.5몰%, 0.1 내지 10몰%, 0.25 내지 10몰%, 0.5 내지 10몰%, 1 내지 10몰%, 1.5 내지 10몰%, 2 내지 10몰%, 2.5 내지 10몰%, 0.1 내지 7.5몰%, 0.25 내지 7.5몰%, 0.5 내지 7.5몰%, 1 내지 7.5몰%, 1.5 내지 7.5몰%, 2 내지 7.5몰%, 2.5 내지 7.5몰%, 0.1 내지 5몰%, 0.25 내지 5몰%, 0.5 내지 5몰%, 1 내지 5몰%, 1.5 내지 5몰%, 2 내지 5몰%, 2.5 내지 5몰%, 0.1 내지 3몰%, 0.25 내지 3몰%, 0.5 내지 3몰%, 1 내지 3몰%, 1.5 내지 3몰%, 2 내지 3몰%, 2.5 내지 3몰%, 0.1 내지 2.5몰%, 0.25 내지 2.5몰%, 0.5 내지 2.5몰%, 1 내지 2.5몰%, 1.5 내지 2.5몰%, 2 내지 2.5몰%, 0.1 내지 4.5몰%, 0.25 내지 4.5몰%, 0.5 내지 4.5몰%, 1 내지 4.5몰%, 1.5 내지 4.5몰%, 2 내지 4.5몰%, 2.5 내지 4.5몰%, 0.1 내지 4몰%, 0.25 내지 4몰%, 0.5 내지 4몰%, 1 내지 4몰%, 1.5 내지 4몰%, 2 내지 4몰%, 2.5 내지 4몰%, 0.1 내지 3.5몰%, 0.25 내지 3.5몰%, 0.5 내지 3.5몰%, 1 내지 3.5몰%, 1.5 내지 3.5몰%, 2 내지 3.5몰%, 2.5 내지 3.5몰%, 0.1 내지 2.0몰%, 0.1 내지 1.5몰%, 0.1 내지 1.0몰%, 0.5 내지 2.0몰%, 0.5 내지 1.5몰%, 0.5 내지 1.0몰%, 1.0 내지 2.0몰%, 1.0 내지 1.5몰%, 1.5 내지 2.0몰%, 1.0몰%, 또는 1.5몰%인 경우 상기 지질 나노입자의 간세포로의 약물 전달 효율(간세포 타겟 효율)이 우수해질 수 있다.
상기 지질 나노입자는 LSEC(liver sinusoidal endothelial cell)을 표적화하는 것일 수 있다. 상기 지질 나노 입자에 포함된 지질-PEG 접합체의 함량이0.1 내지 15몰%, 0.25 내지 15몰%, 0.5 내지 15몰%, 1 내지 15몰%, 1.5 내지 15몰%, 2 내지 15몰%, 2.5 내지 15몰%, 0.1 내지 12.5몰%, 0.25 내지 12.5몰%, 0.5 내지 12.5몰%, 1 내지 12.5몰%, 1.5 내지 12.5몰%, 2 내지 12.5몰%, 2.5 내지 12.5몰%, 0.1 내지 10몰%, 0.25 내지 10몰%, 0.5 내지 10몰%, 1 내지 10몰%, 1.5 내지 10몰%, 2 내지 10몰%, 2.5 내지 10몰%, 0.1 내지 7.5몰%, 0.25 내지 7.5몰%, 0.5 내지 7.5몰%, 1 내지 7.5몰%, 1.5 내지 7.5몰%, 2 내지 7.5몰%, 2.5 내지 7.5몰%, 0.1 내지 5몰%, 0.25 내지 5몰%, 0.5 내지 5몰%, 1 내지 5몰%, 1.5 내지 5몰%, 2 내지 5몰%, 2.5 내지 5몰%, 0.1 내지 3몰%, 0.25 내지 3몰%, 0.5 내지 3몰%, 1 내지 3몰%, 1.5 내지 3몰%, 2 내지 3몰%, 2.5 내지 3몰%, 0.1 내지 2.5몰%, 0.25 내지 2.5몰%, 0.5 내지 2.5몰%, 1 내지 2.5몰%, 1.5 내지 2.5몰%, 2 내지 2.5몰%, 0.1 내지 4.5몰%, 0.25 내지 4.5몰%, 0.5 내지 4.5몰%, 1 내지 4.5몰%, 1.5 내지 4.5몰%, 2 내지 4.5몰%, 2.5 내지 4.5몰%, 0.1 내지 4몰%, 0.25 내지 4몰%, 0.5 내지 4몰%, 1 내지 4몰%, 1.5 내지 4몰%, 2 내지 4몰%, 2.5 내지 4몰%, 0.1 내지 3.5몰%, 0.25 내지 3.5몰%, 0.5 내지 3.5몰%, 1 내지 3.5몰%, 1.5 내지 3.5몰%, 2 내지 3.5몰%, 2.5 내지 3.5몰%, 0.1 내지 2.0몰%, 0.1 내지 1.5몰%, 0.1 내지 1.0몰%, 0.5 내지 2.0몰%, 0.5 내지 1.5몰%, 0.5 내지 1.0몰%, 1.0 내지 2.0몰%, 1.0 내지 1.5몰%, 1.5 내지 2.0몰%, 1.0몰%, 또는 1.5몰%인 경우 상기 지질 나노입자의 LSEC 로의 약물 전달 효율(LSEC 타겟 효율) 이 우수해질 수 있다.
본 명세서에서, 상기 지질 나노입자가 간조직, 간세포, 및/또는 LSEC으로 "표적화(targeting)", 위치화(localization)"한다는 것은 조직 내 또는 세포 내에 내재화(internalization)하는 것일 수 있고, 핵막도 투과할 수 있어 핵 내부에 내재화하는 것을 의미할 수 있다.
다른 양태로서, (1) 상기 지질 나노입자; 및 (2) 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합(음이온성 약물 및 핵산의 조합)을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다. 상기 약물은 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합(음이온성 약물 및 핵산)일 수 있다.
상기 약물 전달용 조성물은 상기 지질 나노입자 내부에 음이온성 약물 및/또는 핵산 등의 생리활성물질이 봉입되어 있는 것일 수 있으며, 음이온성 약물 및/또는 핵산 등의 생리활성물질이 안정적이고 높은 효율로 봉입되어 상기 전달용 조성물에 의해 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 상기 지질 나노입자 내부에 봉입되는 약물의 종류를 치료 목적에 따라 다양하게 조절할 수 있는 장점이 있다.
상기 지질 나노입자는 음이온성 약물 및/또는 핵산이 (지질 나노입자의) 내부에 봉입된 것일 수 있다. 음이온성 약물 및/또는 핵산이 (지질 나노입자의 내부에) 봉입된 지질 나노입자에 대한 것은 전술한 지질 나노입자에 대한 것과 동일하다.
일 예에서, 상기 지질 나노입자에 포함된 이온화 가능한 지질 및 약물(음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합)의 중량비는 1 내지 20 : 1, 1 내지 15 : 1, 1 내지 10 : 1, 5 내지 20 : 1, 5 내지 15 : 1, 5 내지 10 : 1, 7.5 내지 20 : 1, 7.5 내지 15 : 1, 또는 7.5 내지 10 : 1 일 수 있다.
일 예에서, 상기 범위 내의 중량비로 (1) 이온화 가능한 지질; 및 (2) 약물(음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합)을 포함하면, 지질 나노입자 내부에 약물(음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합)의 봉입률 및/또는 약물 전달 효율이 상기 범위 밖의 중량비로 (1) 이온화 가능한 지질; 및 (2) 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 지질 나노입자 보다 높을 수 있다.
상기 음이온성 약물 및/또는 핵산이 봉입된 지질 나노입자는 간조직, 간세포(hepatocyte), 및/또는 LSEC(liver sinusoidal endothelial cells) 내 도입이 용이하도록 평균 지름이 20nm 내지 200nm, 20 내지 180nm, 20nm 내지 170nm, 20nm 내지 150nm, 20nm 내지 120nm, 20nm 내지 100nm, 20nm 내지 90nm, 30nm 내지 200nm, 30 내지 180nm, 30nm 내지 170nm, 30nm 내지 150nm, 30nm 내지 120nm, 30nm 내지 100nm, 30nm 내지 90nm, 40nm 내지 200nm, 40 내지 180nm, 40nm 내지 170nm, 40nm 내지 150nm, 40nm 내지 120nm, 40nm 내지 100nm, 40nm 내지 90nm, 50nm 내지 200nm, 50 내지 180nm, 50nm 내지 170nm, 50nm 내지 150nm, 50nm 내지 120nm, 50nm 내지 100nm, 50nm 내지 90nm, 60nm 내지 200nm, 60 내지 180nm, 60nm 내지 170nm, 60nm 내지 150nm, 60nm 내지 120nm, 60nm 내지 100nm, 60nm 내지 90nm, 70nm 내지 200nm, 70 내지 180nm, 70nm 내지 170nm, 70nm 내지 150nm, 70nm 내지 120nm, 70nm 내지 100nm, 70nm 내지 90nm, 80nm 내지 200nm, 80 내지 180nm, 80nm 내지 170nm, 80nm 내지 150nm, 80nm 내지 120nm, 80nm 내지 100nm, 80nm 내지 90nm, 90nm 내지 200nm, 90 내지 180nm, 90nm 내지 170nm, 90nm 내지 150nm, 90nm 내지 120nm, 또는 90nm 내지 100nm 일 수 있다.
상기 범위의 하한 값 보다 지질 나노입자의 크기가 작은 경우, (i) 지질 나노입자가 체순환(systemic circulation)시 혈액 내에 존재하는 아포지단백(apolipoprotein)(예를 들면, ApoE(예를 들면, ApoE3))의 결합이 감소되어 세포 안으로 들어가는 지질 나노입자의 수가 감소될 수 있고/있거나 (ii) 지질 나노입자의 표면적이 과대하게 증가됨으로서 안정성 유지가 어려워, 이에 따라 표적 조직(또는 표적 세포)으로의 약물 전달 효율 및/또는 지질 나노입자가 운반하는 약물의 치료 효과가 감소될 수 있다.
상기 범위 내의 지름을 갖는 지질 나노입자는 상기 범위의 상한 값을 초과하는 지름을 갖는 지질 나노입자 보다 타겟 장기 및/또는 세포로의 약물 전달 효율이 우수하다.
일 예에서, (1) 상기 지질 나노입자; 및 (2) 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 약물 전달용 조성물은 간세포(hepatocyte)로의 약물 전달용 조성물일 수 있다.
일 예에 따르면, 상기 간세포로의 약물(음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합) 전달용 조성물에 포함되는 지질 나노입자의 지름은 40 내지 120nm, 30 내지 100nm, 35내지 95 nm, 40 내지 90nm, 45 내지 90nm, 50 내지 90nm, 55 내지 85nm, 60 내지 80nm, 70 내지 90nm, 70 내지 80nm, 50 내지 70nm, 또는 60 내지 70nm일 수 있다. 간세포로의 약물 전달시 sinusoidal lumen에서 간세포로 이어지는 천공(fenestrae)의 지름은 포유동물의 경우 약 140 nm, 사람의 경우 약100nm 이므로, 상기 범위의 지름을 갖는 약물 전달용 조성물은 간세포(hepatocyte)로의 약물 전달 효율이 상기 범위 외의 지름을 갖는 지질 나노입자보다 우수할 수 있다.
일 예에 따르면, 상기 간세포로의 약물 전달용 조성물에 포함되는 지질 나노입자는 지질-PEG 접합체를 0.1 내지 15몰%, 0.25 내지 15몰%, 0.5 내지 15몰%, 1 내지 15몰%, 1.5 내지 15몰%, 2 내지 15몰%, 2.5 내지 15몰%, 0.1 내지 12.5몰%, 0.25 내지 12.5몰%, 0.5 내지 12.5몰%, 1 내지 12.5몰%, 1.5 내지 12.5몰%, 2 내지 12.5몰%, 2.5 내지 12.5몰%, 0.1 내지 10몰%, 0.25 내지 10몰%, 0.5 내지 10몰%, 1 내지 10몰%, 1.5 내지 10몰%, 2 내지 10몰%, 2.5 내지 10몰%, 0.1 내지 7.5몰%, 0.25 내지 7.5몰%, 0.5 내지 7.5몰%, 1 내지 7.5몰%, 1.5 내지 7.5몰%, 2 내지 7.5몰%, 2.5 내지 7.5몰%, 0.1 내지 5몰%, 0.25 내지 5몰%, 0.5 내지 5몰%, 1 내지 5몰%, 1.5 내지 5몰%, 2 내지 5몰%, 2.5 내지 5몰%, 0.1 내지 3몰%, 0.25 내지 3몰%, 0.5 내지 3몰%, 1 내지 3몰%, 1.5 내지 3몰%, 2 내지 3몰%, 2.5 내지 3몰%, 0.1 내지 2.5몰%, 0.25 내지 2.5몰%, 0.5 내지 2.5몰%, 1 내지 2.5몰%, 1.5 내지 2.5몰%, 2 내지 2.5몰%, 0.1 내지 4.5몰%, 0.25 내지 4.5몰%, 0.5 내지 4.5몰%, 1 내지 4.5몰%, 1.5 내지 4.5몰%, 2 내지 4.5몰%, 2.5 내지 4.5몰%, 0.1 내지 4몰%, 0.25 내지 4몰%, 0.5 내지 4몰%, 1 내지 4몰%, 1.5 내지 4몰%, 2 내지 4몰%, 2.5 내지 4몰%, 0.1 내지 3.5몰%, 0.25 내지 3.5몰%, 0.5 내지 3.5몰%, 1 내지 3.5몰%, 1.5 내지 3.5몰%, 2 내지 3.5몰%, 2.5 내지 3.5몰%, 0.1 내지 2.0몰%, 0.1 내지 1.5몰%, 0.1 내지 1.0몰%, 0.5 내지 2.0몰%, 0.5 내지 1.5몰%, 0.5 내지 1.0몰%, 1.0 내지 2.0몰%, 1.0 내지 1.5몰%, 1.5 내지 2.0몰%, 1.0몰%, 또는 1.5몰%로 포함할 수 있고, 상기 범위로 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자는 간세포 특이적인(또는 간세포를 타겟하는) 약물 전달 효율이 우수한 것일 수 있다.
일 예에 따르면, 상기 간세포로의 약물 전달용 조성물에 포함되는 지질 나노입자는 이온화 가능한 지질: 인지질 : 콜레스테롤 : 지질-PEG 접합체를 상기에서 전술한 범위 또는 20 내지 50 : 10 내지 30 : 30 내지 60 : 0.5 내지 5 의 몰비, 25 내지 45 : 10 내지 25 : 40 내지 50 : 0.5 내지 3의 몰비, 25내지 45 : 10 내지 20 : 40 내지 55 : 0.5 내지 3 의 몰비, 25 내지 45 : 10 내지 20 : 40 내지 55 : 1.0 내지 1.5 의 몰비로 포함할 수 있다. 상기 범위의 몰비로 구성성분을 포함하는 지질 나노입자는 간세포 특이적인(또는 간세포를 타겟하는) 약물 전달 효율이 우수한 것일 수 있다.
일 예에서, (1) 상기 지질 나노입자; 및 (2) 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 약물 전달용 조성물은 LSEC으로의 약물 전달용 조성물일 수 있다.
상기 LSEC으로의 약물 전달용 조성물에 포함되는 지질 나노입자의 지름은 상기 천공(fenestrae)의 지름과 유사하거나 약간 작은 경우에 LSEC으로의 약물 전달 효과가 우수할 수 있다. 일 예에서, 상기 LSEC로의 약물 전달용 조성물에 포함되는 지질 나노입자의 지름은 20 내지 200nm, 20내지 180 nm, 40 내지 180nm, 40 내지 170nm, 50 내지 160nm, 70 내지 180nm, 70 내지 170nm, 75 내지 170nm, 75 내지 165nm, 70 내지 150nm, 70 내지 130nm, 75 내지 130nm, 80 내지 120nm, 85 내지 120nm, 약 90 내지 120nm, 90 내지 110nm, 80 내지 110nm, 80 내지 100nm, 85 내지 95nm, 약 90nm, 또는 90nm일 수 있다.
일 예에 따르면, 상기 LSEC으로의 약물 전달용 조성물에 포함되는 지질 나노입자는 지질-PEG 접합체를 0.1 내지 15몰%, 0.25 내지 15몰%, 0.5 내지 15몰%, 1 내지 15몰%, 1.5 내지 15몰%, 2 내지 15몰%, 2.5 내지 15몰%, 0.1 내지 12.5몰%, 0.25 내지 12.5몰%, 0.5 내지 12.5몰%, 1 내지 12.5몰%, 1.5 내지 12.5몰%, 2 내지 12.5몰%, 2.5 내지 12.5몰%, 0.1 내지 10몰%, 0.25 내지 10몰%, 0.5 내지 10몰%, 1 내지 10몰%, 1.5 내지 10몰%, 2 내지 10몰%, 2.5 내지 10몰%, 0.1 내지 7.5몰%, 0.25 내지 7.5몰%, 0.5 내지 7.5몰%, 1 내지 7.5몰%, 1.5 내지 7.5몰%, 2 내지 7.5몰%, 2.5 내지 7.5몰%, 0.1 내지 5몰%, 0.25 내지 5몰%, 0.5 내지 5몰%, 1 내지 5몰%, 1.5 내지 5몰%, 2 내지 5몰%, 2.5 내지 5몰%, 0.1 내지 3몰%, 0.25 내지 3몰%, 0.5 내지 3몰%, 1 내지 3몰%, 1.5 내지 3몰%, 2 내지 3몰%, 2.5 내지 3몰%, 0.1 내지 2.5몰%, 0.25 내지 2.5몰%, 0.5 내지 2.5몰%, 1 내지 2.5몰%, 1.5 내지 2.5몰%, 2 내지 2.5몰%, 0.1 내지 4.5몰%, 0.25 내지 4.5몰%, 0.5 내지 4.5몰%, 1 내지 4.5몰%, 1.5 내지 4.5몰%, 2 내지 4.5몰%, 2.5 내지 4.5몰%, 0.1 내지 4몰%, 0.25 내지 4몰%, 0.5 내지 4몰%, 1 내지 4몰%, 1.5 내지 4몰%, 2 내지 4몰%, 2.5 내지 4몰%, 0.1 내지 3.5몰%, 0.25 내지 3.5몰%, 0.5 내지 3.5몰%, 1 내지 3.5몰%, 1.5 내지 3.5몰%, 2 내지 3.5몰%, 2.5 내지 3.5몰%, 0.1 내지 2.0몰%, 0.1 내지 1.5몰%, 0.1 내지 1.0몰%, 0.5 내지 2.0몰%, 0.5 내지 1.5몰%, 0.5 내지 1.0몰%, 1.0 내지 2.0몰%, 1.0 내지 1.5몰%, 1.5 내지 2.0몰%, 1.0몰%, 또는 1.5몰%로 포함할 수 있고, 상기 범위로 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자는 LSEC 특이적인(또는 LSEC을 타겟하는) 약물 전달 효율이 우수한 것일 수 있다.
일 예에 따르면, 상기 LSEC으로의 약물 전달용 조성물에 포함되는 지질 나노입자는 이온화 가능한 지질 : 인지질 : 콜레스테롤 : 지질-PEG 접합체를 상기에서 전술한 범위 또는 20 내지 50 : 10 내지 30 : 30 내지 60 : 0.5 내지 5 의 몰비, 25 내지 45 : 10 내지 25 : 40 내지 50 : 0.5 내지 3의 몰비, 25내지 45 : 10 내지 20 : 40 내지 55 : 0.5 내지 3 의 몰비, 25 내지 45 : 10 내지 20 : 40 내지 55 : 1.0 내지 1.5 의 몰비로 포함할 수 있다. 상기 범위의 몰비로 구성성분을 포함하는 지질 나노입자는 LSEC 특이적인(또는 LSEC을 타겟하는) 약물 전달 효율이 우수한 것일 수 있다.
일 예에 따른 지질 나노입자는 간 조직 특이적인 특성을 통해 고효율적으로 치료제를 간 조직 내부, 간세포, 및/또는 LSEC으로 전달할 수 있으며, 이러한 고효율의 간 조직, 간세포, 및/또는 LSEC특이적 지질 나노입자를 매개한 간질환 치료용 약물, 치료용 유전자 등의 전달 방법 및 간을 통해 매개되는 치료제 등에 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 일 예에 따른 지질 나노입자는 핵산 등의 유전자 약물과 안정된 복합체를 형성하고 낮은 세포독성 및 효과적인 세포 흡수성을 나타내므로, 핵산 등의 유전자 약물을 전달하는데 효과적이다.
상기 지질 나노입자는 상기에서 설명한 바와 같다.
일 예에 따른 지질 나노입자는 5 내지 8, 5.5 내지 7.5, 6 내지 7, 또는 6.5 내지 7의 pKa를 나타냄으로써 산성 pH 조건에서 양전하를 나타내어 음전하를 나타내는 핵산 및 음이온성 약물(예를 들면, 단백질) 등의 치료제와 정전기적 상호작용을 통해 용이하게 약물과의 복합체를 형성하여 높은 효율로 약물을 봉입할 수 있으며, 약물(예를 들면, 핵산)의 세포 내 또는 생체 내 약물 전달용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서, "봉입(encapsulation)"은 전달물질을 둘러싸서 효율적으로 생체 내로 함입시키기 위해 캡슐화하는 것을 말하고, 약물 봉입률(캡슐화 효율, Encapsulation efficiency)은 제조에 사용된 전체 약물 함량에 대하여 지질 나노입자 내에 봉입된 약물의 함량을 의미한다.
상기 전달용 조성물의 음이온성 또는 핵산 약물의 봉입률은 70% 이상, 75%이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 80% 초과 내지 99% 이하, 80% 초과 내지 97% 이하, 80% 초과 내지 95% 이하, 85% 이상 내지 95% 이하, 87% 이상 내지 95% 이하, 90% 이상 내지 95% 이하, 91% 이상 내지 95% 이하, 91% 이상 내지 94% 이하, 91% 초과 내지 95% 이하, 92% 이상 내지 99% 이하, 92% 이상 내지 97% 이하, 또는 92% 이상 내지 95% 이하일 수 있다.
일 예에 따르면, 상기 봉입률은 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 계산될 수 있으며, 예를 들면, 상기 약물 봉입률은 일 예에 따른 지질 나노입자에 Triton-X를 처리하고, Triton-X가 처리되고, Triton-X가 처리되지 않은 지질 나노입자의 형광강도를 특정 파장 대역폭(예를 들면, exitation : 480 ~ 490nm, emission : 520 ~ 530nm)를 측정하고, 하기 수학식 2에 의해 계산된 것일 수 있다.
(수학식 2)
약물 봉입률(%)=(Triton-X가 처리된 지질 나노입자의 형광강도(형광도)- Triton-X가 처리되지 않은 지질 나노입자의 형광강도(형광도))/(Triton-X가 처리된 지질 나노입자의 형광강도(형광도)) X 100
일 예에 따른 약물 전달용 조성물은 Cas9 mRNA를 높은 봉입률로 포함할 수 있다. 기존에 알려진 Cas9 mRNA 전달용 조성물은 낮은 비율로 Cas9 mRNA를 포함하여 Cas9 mRNA 전달용 조성물로 활용하는데 한계가 있었다. 이와 달리, 일 예에 따른 지질 나노입자는 높은 봉입률로, 구체적으로 70% 이상의 봉입률로 Cas9 mRNA를 포함할 수 있으며, 이에 따라 유전자 교정치료에 유용하게 활용될 수 있다.
상기 음이온성 약물은 음이온을 띠는 각종 펩타이드, 단백질 약물, 단백질-핵산 구조체 또는 히알루로닉산-펩타이드 접합체, 히알루로닉산-단백질 접합체 등의 음이온성 생체고분자-약물 접합체 등일 수 있다. 상기 단백질 약물의 비제한적인 예로는, 유전자 교정가위인 Cas 9, cpf1 등의 유전자 교정 단백질을 비롯하여 세포사멸 유도인자(예컨대, cytocrome C, caspase 3/7/8/9 등) 및 다양한 세포내 단백질(예컨대, 전사인자) 등일 수 있다.
상기 핵산은 소간섭리보핵산(siRNA), 리보좀 리보핵산(rRNA), 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 상보성 디옥시리보핵산(cDNA), 앱타머(aptamer), 전령 리보핵산(mRNA), 운반 리보핵산(tRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA, DNAzyme, 및 유전자교정을 위한 sgRNA 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "siRNA"란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중 가닥 RNA(duplex RNA), 혹은 단일 가닥 RNA 내부에서 이중 가닥의 형태를 띄는 단일 가닥 RNA를 지칭한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다. 이중 가닥 사이의 결합은 뉴클레오티드 간의 수소 결합을 통해 이루어지고, 이중 가닥 내부의 모든 뉴클레오티드가 상보적으로 완전 결합해야 하는 것은 아니다.
siRNA의 길이는 약 15 내지 60개, 구체적으로 약 15 내지 50개, 약 15 내지 40개, 약 15 내지 30개, 약 15 내지 25개, 약 16 내지 25개, 약 19 내지 25개, 약 20 내지 25개, 또는 약 20 내지 23개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 siRNA 길이는 이중 가닥 RNA의 한쪽 뉴클레오티드의 갯수, 즉, 염기쌍의 갯수를 의미하며, 단일 가닥 RNA인 경우에는 단일 가닥 RNA 내부의 이중 가닥의 길이를 의미한다. 또한 siRNA는 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반응을 약화시키는 등의 목적을 위해 다양한 작용기를 도입한 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오티드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히, 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다.
본 명세서에서, "단일가닥 디옥시리보핵산(ssDNA)"은 특정 타겟 DNA에 선택적으로 결합하여 안티진(antigene) 효과를 유도하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 명세서에서, "앱타머(aptamer)"는 특정 타겟에 결합하는 올리고뉴클레오티드(일반적으로, 20 ~ 80 nt DNA 혹은 RNA)를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에서 "앱타머"는 올리고뉴클레오티드 앱타머(예컨대, DNA 혹은 RNA aptamer)를 의미한다.
본 명세서에서, "mRNA"는 유전자를 발현 가능한 합성 mRNA(in vitro transcribed mRNA)를 의미한다.
본 명세서에서, "shRNA"는 단일 가닥으로 50 내지 70개로 구성된 뉴클레오티드를 의미하며, in vivo 상에서 스템-루프(stemloop) 구조를 이루고 있다. 5 내지 10개의 뉴클레오티드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19 내지 29개의 뉴클레오티드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.
본 명세서에서, "miRNA(microRNA)"는 유전자 발현을 조절하며, 전장 21 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 RNA 분자를 의미한다. miRNA는 세포 내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오티드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2 이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.
본 명세서에서, "리보자임(ribozyme)"은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA이다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 되어 있다.
본 명세서에서, "DNAzyme"은 효소 활성을 가지는 단일 가닥 DNA 분자로, 10 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성된 DNAzyme(10-23 DNAzyme)은 생리적으로 유사한 조건 하에서 RNA가닥을 특정위치에서 절단한다. 10-23 DNAzyme은 염기쌍을 이루지 않고 노출된 어떠한 퓨린 및 피리미딘 사이를 절단한다. 10-23 DNA효소(DNAzyme)는 15개의 보존된 염기 서열(예를 들면, 5'-GGCTAGCTACAACGA-3')로 이루어진 효소의 활성부위(catalytic domain) 및 상술한 효소의 활성부위 좌우로 RNA 기질을 인식하는 7 ~ 8개의 DNA 염기서열로 이루어진 기질인식 자리(RNA substrate binding domain)로 구성된다.
본 명세서에서, "PNA(Peptide nucleic acid)"는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지고 있는 분자로서, DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 핵산염기(nucleobase)가 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1999년에 처음 보고되었다(문헌 [Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide", Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500]). PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 펩티드 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이며, 이 경우 펩티드 핵산의 기본골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산염기는 공간적 크기와 핵산염기 사이의 거리가 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다.
본 명세서에서, "sgRNA"는 특정 DNA 타겟에 결합하는 올리고뉴클레오티드(일반적으로, RNA 분자)로 crispr RNA(crRNA)와 tracer(tracrRNA)의 복합 단일 RNA 분자를 의미한다. CRISPR system에서 Cas9 nuclease와 함께 특정 DNA 서열을 인식하는데 이용이 되며 선택적인 유전자 절단을 가능케 하는 RNA분자로서, 대략 DNA와 상보적으로 결합이 가능한 20-nt 서열을 포함하며, 총 길이는 100 nt이다.
본 명세서에서, "유전자 교정 단백질"은 Cas9, spCas9, cjCas9, casX, CasY 및 Cpf1 등을 일컬으며, sgRNA와 함께 타겟 DNA 염기 배열을 인식하여 DNA 절단을 일으키는 단백질을 말한다.
일 예에 따른 지질 나노입자에 의하여 약물 및/또는 핵산이 전달되는 표적 세포는 생체 내의 또는 생체에서 분리된 간세포(hepatocyte), 및/또는 LSEC일 수 있다. 일 예에 따른 약물 전달용 조성물 및/또는 약물(음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합) 및 지질 나노입자와의 복합체는 간세포, 및/또는 LSEC를 타겟팅하거나 특이적으로 표적화하는 것일 수 있다. 따라서, 일 예에 따른 지질 나노입자 또는 상기 지질 나노입자를 포함하는 약물 핵산 전달용 조성물은 간 섬유화, 간경변, 간염(예컨대, A형 간염, B형 간염, C 간염 등) 등의 급성 또는 만성 간질환 치료를 위한 것일 수 있으며, 또한 간을 통해 흡수되는 치료제(약물)의 전달용 조성물로서 활용될 수 있다.
또 다른 양태는 (1) 상기 지질 나노입자; 및 (2) 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는, 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 포함되는 지질 나노입자에 대해서는 전술한 약물 전달용 조성물에 포함되는 지질 나노입자에 대한 것과 동일하다.
상기 간질화 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 포함되는 음이온성 약물 및 핵산에 대해서는 전술한 약물 전달용 조성물에 포함되는 음이온성 약물 및 핵산에 대한 것과 동일하다.
일 예에 따른 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 내부에 음이온성 약물 및/또는 핵산이 봉입된 지질 나노입자를 포함할 수 있다.
상기 간질환은 ATTR 아밀로이드증(ATTR amyloidosis), 이상지질혈증(Hypercholesterolemia), B형 간염(Hepatitis B virus infection), 급성 간부전(Acute liver failure), 간경변(Cirrhosis), 및 간섬유화(liver fibrosis)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 음이온성 약물은 간질환 예방 또는 치료 효과를 갖는 것일 수 있다.
상기 핵산은 간질환 예방 또는 치료 효과를 갖는 것일 수 있으며, 예를 들면, (1) TTR(Transthyretin)((e.g., 인간 TTR(단백질: GenBank Accession Nos. NP_000362.1; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_000371.4등), 마우스 TTR(단백질: GenBank Accession No.; NP_038725.1; 유전자: GenBank Accession No. NM_013697.5 등)), (2) PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)((e.g., 인간 PCSK9 (단백질: GenBank Accession Nos. NP_777596.2; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_174936.4등), 마우스 PCSK9(단백질: GenBank Accession No. NP_705793.1; 유전자: GenBank Accession No. NM_153565.2 등)), (3) HBV(Hepatitis B Virus)(예를 들면, HBV genotype A (e.g., GenBank Accession No.: X02763, X51970, 또는 AF090842); HBV genotype B(e.g., GenBank Accession No.: D00329, AF100309, 또는AB033554); HBV genotype C(e.g., GenBank Accession No.: X04615, M12906, AB014381, AB042285, AB042284, AB042283, AB042282, AB026815, AB026814, AB026813, AB026812, 또는 AB026811); HBV genotype D(e.g., GenBank Accession No.: X65259, M32138, 또는 X85254); HBV genotype E(e.g., GenBank Accession No.: X75657 또는 AB032431); HBV genotype F(e.g., GenBank Accession No.: X69798, AB036910, 또는 AF223965); HBV genotype G(e.g., GenBank Accession No.: AF160501, AB064310, 또는AF405706) HBV genotype H(e.g., AY090454, AY090457, 또는 AY090460) (4) Bax(BCL2 associated X))((e.g., 인간 Bax (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001278357.1, NP_001278358.1, NP_001278359.1, NP_001278360.1, NP_004315.1 ; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_001291428.2, NM_001291429.2, NM_001291430.1, NM_001291431.2, NM_004324.4 등), 마우스 Bax (단백질: GenBank Accession No. NP_031553.1; 유전자: GenBank Accession No. NM_007527.3 등), (5) VEGF(Vascular endothelial growth factor) (예를 들면, VEGFA((e.g., 인간 VEGFA (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001020537.2, NP_001020538.2, NP_001020539.2, NP_001020540.2, NP_001020541.2; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_003376.6, NM_001025366.3, NM_001025367.3, NM_001025368.3, NM_001025369.3 등), 마우스 VEGFA(단백질: GenBank Accession No. NP_001020421.2, NP_001020428.2, NP_001103736.1, NP_001103737.1, NP_001103738.1; 유전자: GenBank Accession No. NM_001025250.3, NM_001025257.3, NM_001110266.1, NM_001110267.1, NM_001110268.1 등); VEGFB((e.g., 인간 VEGFB(단백질: GenBank Accession Nos. NP_001230662.1, NP_003368.1; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_003377.5, NM_001243733.2 등), 마우스 VEGFB(단백질: GenBank Accession No. NP_001172093.1, NP_035827.1; 유전자: GenBank Accession No. NM_001185164.1, NM_011697.3 등); VEGFC(e.g., 인간 VEGFC(단백질: GenBank Accession Nos. NP_005420.1; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_005429.5 등), 마우스 VEGFC(단백질: GenBank Accession No.; NP_033532.1; 유전자: GenBank Accession No. NM_009506.2 등)), 및/또는 (6) PDGF(Platelet-derived growth factor)(예를 들면, PDGFA((e.g., 인간 PDGFA (단백질: GenBank Accession Nos. NP_002598.4, NP_148983.1,; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_002607.5, NM_033023.4 등), 마우스 PDGFA(단백질: GenBank Accession No. NP_032834.1, NP_001350200.1; 유전자: GenBank Accession No. NM_008808.4, NM_001363271.1 등)); PDGFB((e.g., 인간 PDGFB(단백질: GenBank Accession Nos. NP_002599.1, NP_148937.1; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_033016.3, NM_002608.4 등), 마우스 PDGFB(단백질: GenBank Accession No. NP_035187.2; 유전자: GenBank Accession No. NM_011057.4 등)); PDGFC((e.g., 인간 PDGFC (단백질: GenBank Accession Nos. NP_057289.1; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_016205.3 등), 마우스 PDGFC(단백질: GenBank Accession No. NP_064355.1, NP_001344675.1; 유전자: GenBank Accession No. NM_019971.3, NM_001357746.1 등)); PDGFD(e.g., 인간 PDGFD(단백질: GenBank Accession Nos. NP_079484.1, NP_149126.1; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_033135.4, NM_025208.5 등), 마우스 PDGFD(단백질: GenBank Accession No. NP_082200.1, NP_001344326.1, NP_001344327.1; 유전자: GenBank Accession No. NM_027924.3, NM_001357397.1, NM_001357398.1 등))의 발현을 억제할 수 있는 siRNA 및/또는 miRNA일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 비경구 투여를 포함한 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 비경구 투여는 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
일 예에 따른 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
일 예에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 예에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 약학적 조성물에 포함된 약물(음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합)의 농도를 기준으로 0.1 내지 100mg/kg, 0.1 내지 50mg/kg, 1 내지 10mg/kg, 또는 1 내지 5mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
또 다른 양태는 (1) 상기 지질 나노입자; 및 (2) 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는, 조성물 (예를 들면, 상기 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물)을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 간질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 지질 나노입자, 음이온성 약물, 핵산, 약학적 조성물, 및 간질환에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 예에 따르면, 상기 간질환의 예방 또는 치료방법은 상기 조성물을 투여하는 단계 이전에, 상기 간질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인(선별)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 치료방법이 적용되는 대상 개체는 간질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나 이에 한정되지 않는다. 일 예에 따른 지질 나노입자를 포함하는 상기 약학적 조성물은 간으로 음이온성 약물 및/또는 핵산을 효율적으로 전달할 수 있어, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다.
일 예에 따르면, (1) 상기 지질 나노입자; 및 (2) 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는, 조성물 (예를 들면, 상기 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물)의 약학적 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 간질환의 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있다. 약학적 유효량에 대해서는 전술한 바와 같고 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용할 수 있다.
일 예에 따른, 지질 나노입자는 간 조직 특이적이고 생체 친화도가 우수하며, 고효율로 유전자 치료제 등을 전달할 수 있어 지질 나노입자 매개 유전자 치료 등 관련 기술분야에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a는 일 예에 따른 지질 나노입자의 예시적인 구조를 나타낸 것이고, 도 1b는 일 예에 따른 나노입자를 Cryo-TEM으로 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 2는 CDCl3에서 246-C10의 1H NMR (실온, 400MHz) 결과를 나타낸다.
도 3a(241-C10 LNP 내지 243-C10 LNP) 및 도 3b(244-C10 LNP 내지 246-C10 LNP)는 각 지질 나노입자가 pH 4.1 내지 pH 9.6 범위를 갖는 용액에서 나타나는 형광 강도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 각 나노입자의 세포 내 유전자 전달 효율을 나타내는 결과이다. 구체적으로, 도 4a는 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA(luc mRNA)를 봉입한 LNP를 HeLa cell에 형질전환 시킨 후 세포를 용해시켜 측정한 발광 강도를 나타내고, 도 4b는 luc mRNA를 봉입한 LNP를 간세포(Hepatocyte) 에 형질전환 시킨 후 세포를 용해시켜 측정한 발광 강도를 나타낸다. 도 4b에서 +ApoE는 ApoE3을 처리한 군을 의미하고, -ApoE는 ApoE3을 처리하지 않은 군을 의미한다.
도 5a는 Luc mRNA가 봉입된 244-C10 LNP 내지 246-C10 LNP가 투여된 마우스에서 생체 내 약물전달 분포를 나타내고, 도 5b는 Luc mRNA가 봉입된 246-C10 LNP 가 투여된 마우스에서 적출된 마우스의 각 기관에 대한 약물전달 분포를 나타낸다.
도 6은 1.0 내지 2.5몰%로 지질-PEG를 포함하는 246-C10 LNP가 투여된 마우스에서 지질 나노입자에 포함된 지질-PEG함량에 따른, 지질 나노입자의 약물전달 효율 및 나노입자의 크기를 나타낸다.
도 7은 지질 나노입자에 봉입되어 투여된 siFⅦ의 농도에 따른 간세포(hepatocyte) 타겟 가능성을 FⅦ의 발현양을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 지질 나노입자에 포함된 지질-PEG 함량에 따른 지질 나노입자의 지질 나노입자의 크기와 PDI 수치를 나타내고(좌측 표), 생체 내 간세포(hepatocyte)로의 약물 전달 효율을 FⅦ의 발현양을 통해 확인한 결과(우측 그래프)를 나타낸다.
도 9는 지질 나노입자에 포함된 지질-PEG 함량에 따른 지질 나노입자의 크기와 PDI 수치를 나타내고(좌측 표), 생체 내 LSEC으로의 약물 전달 효율을 FVIII의 발현양을 통해 확인한 결과(우측 그래프)를 나타낸다.
도 10은 세라마이드-PEG 또는 DSPE-PEG를 포함하는 지질 나노입자의 세포 내 siRNA 전달 효율을 측정한 결과를 나타낸다.
본 발명은 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예로 권리범위가 한정되는 의도는 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 이온화 가능한 지질(ionizable lipid)의 제조
실시예 1-1. 이온화 가능한 지질의 제조
6원의 헤테로고리 3차 아민을 포함하는 하기 표 1의 아민계 화합물 및 1,2-epoxidodecane(이하, C10)(Sigma-Aldrich, USA)을 1:n (n = 1차 아민 x 2 +2차 아민 x 1)의 몰비로 반응시켜 이온화 가능한 지질을 합성하였다.
Figure PCTKR2020019502-appb-T000001
구체적으로, 5㎖ 바이알에 상기 표 1의 241 내지 246 아민 각각과 에폭시드(C10)를 1:n (n = 1차 아민 x 2 + 2차 아민 x 1)의 몰비로 마그네틱바와 함께 첨가하여 교반기에서 750rpm, 90℃로 3일 동안 반응시켰다. 이후 WELUX fine silica column(Intertec, 한국)으로 정제 후 상기 반응에 의해 생성된 각 이온화 가능한 지질의 분자량을 계산하고 에탄올을 사용하여 100mg/㎖의 농도로 맞춰 보관하였다. 241 아민과 C10을 이용하여 제조한 이온화 가능한 지질을'241-C10'으로 명명하고, 다른 종류의 아민을 사용하여 제조한 이온화 가능한 지질도 마찬가지로 '사용된 아민 이름(241 내지 246)-C10'으로 명명하였다.
실시예 1-2. 생성된 이온화 가능한 지질의 확인
상기 실시예 1-1에서 제조한 이온화 가능한 지질을 확인하기 위하여, 1H NMR을 수행하였다. 구체적으로, 실시예 1-1에서 합성된 이온화 가능한 지질(246-C10) 5㎍을 CDCl3(sigma, USA) 0.5㎖에 희석하여 100mmole 농도가 되도록 준비하였다. 이후 400MHz NMR 전용 튜브에 0.5㎖씩 넣고 상부를 막은 후 파라필름으로 실링하여 Agilent 400MHZ FT-NMR(Agilent, USA)을 이용하여 NMR spectra을 얻었고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 246-C10의 각 작용기를 나타내는 신호가 포화된 것을 알 수 있었다.
또한, 실시예 1-1에서 제조한 이온화 가능한 지질(241-C10 내지 246-C10)을 확인하기 위하여, MS분석을 수행하였다. 구체적으로, 이온화 가능한 지질은 0.5ppm 이하 농도로 에탄올에 희석하여 MS 분석을 수행하였다. 분석에 사용된 기기는 Agilent Technologies사 (Palo Alto,USA)의 6230 LC/MS로 분리관은 Agilent Technologies사 Zorbax SB-C18(100 mmХ2.1 mm i.d., 3.5 μm)를 사용하였고, 이동상으로 0.1% 개미산이 포함된 증류수(A)와 아세토니트릴(B)의 두 가지 용매를 기울기 용리하였다. 이동상의 용매 기울기는 처음 유기용매 아세토니트릴(B)의 비율을 30% 에서 시작하여 2분까지 80%까지 올린 후 다시 유기용매의 비율이 30%까지 낮추고 안정화될 때까지 4분간 유지하였다. 이동상의 유속은 300㎕/min이며, 이때 분석기기 주입량은 2㎕였다. MS분석을 수행한 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타난 바와 같이 이온화 가능한 지질의 측정된 m/z ratio와 계산된 m/z ratio가 거의 일치하는 것을 확인할 수 있었다.
Chemical formula Calculated
m/z ratio 		Observed
m/z ratio
241-C10 C32H66N2O2 510.87864 511.5201
242-C10 C31H64N2O2 496.85206 497.5043
243-C10 C31H65N3O2 511.8667 513.5186
244-C10 C42H87N3O3 682.15848 682.6821
245-C10 C43H89N3O3 696.18506 696.7045
246-C10 C58H120N4O4 937.5978 937.9383
상기 결과로부터 실시예 1-1에서 이온화 가능한 지질이 잘 만들어진 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 지질 나노입자의 제조
실시예 2-1. 지질 나노입자 제조
상기 실시예 1-1에서 제조한 이온화 가능한 지질(241-C10 내지 246-C10), 콜레스테롤(Cholesterol powder, BioReagent, suitable for cell culture, ≥99%, sigma, 한국), 인지질(DSPC)(Avanti, 미국), 및 지질-PEG 접합체(세라마이드-PEG 접합체; C16 PEG2000 Ceramide, Avanti, 미국)를 에탄올에 42.5:13:43:1.5의 몰비로 용해시켰다.
이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및 지질-PEG가 용해된 에탄올 및 아세테이트 버퍼를 1:3의 부피비로 12㎖/min의 유속으로 미세 유체 혼합 장치(Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada)를 통해 혼합하여, 지질 나노입자(LNP)를 제조하였다.
실시예 2-2. 핵산이 봉입된 지질 나노입자의 제조
상기 실시예 1-1에서 제조한 이온화 가능한 지질(241-C10 내지 246-C10), 콜레스테롤(Cholesterol powder, BioReagent, suitable for cell culture, ≥99%, sigma, 한국), 인지질(DSPC 또는 DOPE) (18:0 PC (DSPC), 18:1 (△9-Cis) PE (DOPE), Avanti, 미국), 및 지질-PEG 접합체(세라마이드-PEG 접합체; C16 PEG2000 Ceramid, Avanti, 미국)를 에탄올에 용해시켰다. RNA 치료제인 mRNA(luciferase mRNA; 서열번호 1) 30㎍을 시트르산 나트륨 0.75㎖에 희석시키거나, siRNA(siFⅦ; 서열번호 2 및 3를 동일 몰비로 혼합, 또는 siFVIII; 서열번호 4 내지 11를 동일 몰비로 혼합, 또는 siLuc: 서열번호 12 및 13를 동일 몰비로 혼합) 30㎍을 50mM의 아세트산 나트륨 0.75㎖에 희석시켜 수성상을 제조하였다.
사용된 siRNA 서열은 다음과 같다: 서열번호 2 (FVII target siRNA_sense; 5'-GGAUCAUCUCAAGUCUUACdtdt-3'), 서열번호 3 (FVII target siRNA_antisense; 5'-GUAAGACUUGAGAUGAUCCdtdt-3'), 서열번호 4 (FVIII target siRNA_sense_1; 5'CUUAUAUCGUGGAGAAUUAdtdt-3') 서열번호 5 (FVIII target siRNA_antisense_1; 5'-UAAUUCUCCACGAUAUAAGdtdt-3'), 서열번호 6 (FVIII target siRNA_sense_2; 5'-UCAAAGGAUUCGAUGGUAUdtdt-3'), 서열번호 7 (FVIII target siRNA_antisense_2; 5'-AUACCAUCGAAUCCUUUGAdtdt-3'), 서열번호 8(FVIII target siRNA_sense_3; 5'-CAAGAGCACUAGUGAUUAUdtdt-3'), 서열번호 9(FVIII target siRNA_antisense_3; 5'-AUAAUCACUAGUGCUCUUGdtdt-3'), 서열번호 10(FVIII target siRNA_sense_4; 5'-GGGCACCACUCCUGAAAUAdtdt-3'), 서열번호 11(FVIII target siRNA_antisense_4; 5'-UAUUUCAGGAGUGGUGCCCdtdt-3'), 서열번호 12(siLuc_sense; 5'-AACGCUGGGCGUUAAUCAAdtdt-3'), 서열번호 13(siLuc_antisense; 5'- UUGAUUAACGCCCAGCGUUdtdt-3').
이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및 지질-PEG 접합체(이하, 지질-PEG)가 용해된 유기상(에탄올) 및 RNA 치료제(핵산)이 용해된 수성상(아세트산 나트륨 또는 시트르산 나트륨)을 12㎖/min의 유속으로 미세 유체 혼합 장치(Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada)를 통해 혼합하여, 핵산이 봉입된 지질 나노입자(LNP)를 제조하였다. (i) mRNA 가 봉입된 지질 나노입자를 제조하기 위하여, 이온화 가능한 지질 : 인지질(DOPE) : 콜레스테롤 : 지질-PEG(C16-PEG2000 세라마이드)를 26.5 : 20 : 52.5 내지 51 : 1.0 내지 2.5 (몰비의 총 합이 100이 되도록 콜레스테롤과 지질-PEG 함량을 조절)의 몰비로 에탄올에 용해시켰고, mRNA(luciferase mRNA; 서열번호 1) : 이온화 가능한 지질이 1:10의 중량비가 되도록 유기상 및 수성상을 혼합하여 지질 나노입자를 제조하였다. (ii) siRNA 가 봉입된 지질 나노입자를 제조하기 위하여 이온화 가능한 지질 : 인지질(DSPC) : 콜레스테롤 : 지질-PEG(C16-PEG2000 세라마이드)를 42.5 : 13 : 44 내지 39.5 : 0.5 내지 5.0 (몰비의 총 합이 100이 되도록 콜레스테롤과 지질-PEG 함량을 조절)의 몰비로 에탄올에 용해시켰고, siRNA(siFⅦ; 서열번호 2 및 3를 동일 몰비로 혼합, 또는 siFVIII; 서열번호 4 내지 11를 동일 몰비로 혼합, 또는 siLuc: 서열번호 12 및 13를 동일 몰비로 혼합): 이온화 가능한 지질이 1 : 7.5의 중량비가 되도록 유기상 및 수성상을 혼합하여 지질 나노입자(lipid nanoparticle; LNP)를 제조하였다.
제조된 LNP를 에탄올 제거 및 체내의 pH와 지질 나노입자의 pH를 맞추기 위해서, 3500 MWCO 투석 카세트를 사용하여 16 시간 동안 PBS에 대해 투석하였다.
이온화 가능한 지질 '241-C10'를 포함하는 지질 나노입자를 '241-C10 LNP'로 명명하고, 다른 종류의 아민을 포함하는 이온화 가능한 지질을 사용하여 제조한 지질 나노입자(핵산이 봉입된 지질 나노입자 포함)를 '포함된 아민 이름(241 내지 246)-C10 LNP'로 명명하였다.
실시예 2-3. 핵산이 봉입된 지질 나노입자의 관찰
siLuc (서열번호 12 및 13)가 봉입된 지질 나노입자를 세라마이드-PEG 접합체(C16-PEG2000 세라마이드)를 사용하여 실시예 2-2 와 같이 제조하였다. 제조된 지질 나노입자(세라마이드-PEG 접합체를 1.5몰% 포함)를 200 mesh carbon lacey film Cu-grid에 siRNA 농도 기준으로 60ug 로딩하여 vitrobot으로 액화된 (약 -170도 이하) Ethane 에 담구어 plunge freeze 시켜 준비한 후 Cryo-TEM (Tecnai F20, FEI)으로 관찰하고, 그 결과를 도 1b에 나타내었다. 도 1b에 나타난 바와 같이, 속이 꽉찬 형태의 구모양의 입자가 관찰되었다.
실시예 3. 지질 나노입자의 pKa
본 실시예에서 인비트로 TNS 분석(In vitro TNS assay)을 통하여 상기 실시예 2-1에서 제형화된 각 지질 나노입자(LNP)의 pKa를 계산하였다. 음이온성 TNS는 양으로 하전된 이온화 가능한 지질과 상호 작용하여 친유성이 되고, pH값이 각각의 LNP의 pKa값에 근접함에 따라 TNS의 친유성이 낮아지고 더 많은 물분자가 TNS 형광을 퀀칭(quenching)시키므로, 6.0 내지 7.0의 pKa를 갖는 지질 나노입자는 생체 내 약물전달 효율이 우수하고, pH에 따른 형광(fluorescence)를 나타내는 그래프에서"s형 곡선"을 나타내는 지질 나노입자는 엔도좀 막과 상호작용이 용이하고, 산성화시에 용이하게 엔도좀을 탈출할 수 있는 것을 의미한다.
구체적으로, 20mM sodium phosphate, 25mM citrate, 20mM ammonium acetate, 및 150mM NaCl를 포함하는 용액의 pH를 0.1N NaOH 및/또는 0.1N HCl를 이용하여 pH 4.1에서 pH 9.6까지 0.5의 간격으로 조정하여 다양한 pH단위의 용액을 제조하였다. 각각의 pH(pH 4.1에서 pH 9.6까지 0.5의 간격의 pH)를 갖는 용액을 100㎕씩 black 96well plate에 첨가하고, 300uM의 TNS 스톡(stock) 용액을 이용하여 6uM의 최종 농도가 되도록 상기 범위의 pH를 갖는 용액에 각각 첨가하였다. 241-C10 LNP 내지 246-C10 LNP를 최종 농도가 20uM가 되도록 혼합용액에 첨가하였다. 형광강도는 Tecan 기기를 통해 325nm의 excitation, 435nm의 emission으로 측정하여, 각 지질 나노입자에 대한 형광강도를 도 3a 및 도 3b에 나타내었고, 각 지질 나노입자에 대한 pKa는 최대형광의 절반에 도달하는 pH값으로 계산하여 하기 표 3에 기재하였다. 도 3b에 나타난 바와 같이, 244-C10 LNP 내지 246-C10 LNP는 비선형 회귀분석(nonlinear regression)을 통해 형광적정 s형 곡선을 나타내는 것을 알 수 있었다.
지질 나노입자 pKa
241-C10 LNP 7.7
242-C10 LNP 8.7
243-C10 LNP 8.2
244-C10 LNP 6.8
245-C10 LNP 6.9
246-C10 LNP 7
상기 표 3에서 확인되는 바와 같이, 일 예에 따른 지질 나노 입자는 생체 내 안전성 및 약물 방출이 우수한 pKa 6.0 내지 7.0범위를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 2-2의 방법과 같이 제조한, 핵산이 봉입된 LNP의 경우에도 포함된 이온화 가능한 지질의 종류(이온화 가능한 지질에 포함된 아민의 종류)에 따라 동일한 양상을 보였다.
실시예 4. 지질 나노입자의 특성 확인
실시예 4-1. 입자크기 측정
본 실시예에서 상기 실시예 2-2에서 제조된 mRNA가 봉입된 지질 나노입자(LNP; 지질-PEG를 1.5몰% 포함)의 크기를 측정하고자 하였다. 상기 실시예 2-2에서 제조한 각 지질 나노입자에 포함된 RNA(luciferase mRNA; 서열번호 1)의 농도가 1㎍/㎖가 되도록 PBS를 사용하여 희석하고, Malvern Zetasizer Nano(Malvern Instruments, UK)에서 동적 광산란(DLS)을 사용하여 LNP의 지름 및 다분산도(PDI; polydispersity index)를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 기재하였다.
지질 나노입자 지름(nm) PDI
241-C10 LNP 128 0.259
242-C10 LNP 77 0.210
243-C10 LNP 56 0.225
244-C10 LNP 66 0.149
245-C10 LNP 70 0.210
246-C10 LNP 68 0.143
상기 표 4에서 확인되는 바와 같이, 일 예에 따른 지질 나노 입자는 간세포 내 도입이 용이하고 약물 방출이 우수한 입자크기를 나타내었고, 241-C10 LNP > 243-C10 LNP > 242-C10 LNP = 245-C10 LNP > 244-C10 LNP > 246-C10 LNP 순서대로 PDI 수치가 작고, 입자가 균일한 것을 알 수 있었다.
실시예 4-2. 약물 봉입률 측정
핵산 약물로서 siRNA(siFⅦ siRNA)를 봉입한 각 LNP(지질-PEG를 1.5몰% 포함)의 캡슐화 효율(약물 봉입률, %)을 Ribogreen 분석 (Quant-iT™ RiboGreen® RNA, Invitrogen)을 통해 측정하였다. 상기 실시예 2-2에서 제조한 핵산 약물을 봉입한 LNP를 96 웰 플레이트에서 siRNA의 최종 농도가 4 ~ 7 ㎍/㎖이 되도록 1xTE 완충액 50㎕로 희석하였다. Triton-X를 처리하지 않은 그룹(Triton-x LNP(-))은 1xTE 버퍼 50㎕를 첨가하고, Triton-X를 처리한 그룹(Triton-X LNP(+))은 2% Triton-X 버퍼 50 ㎕를 첨가하였다. 37℃에서 10분간 인큐베이션하여, Triton-X로 LNP를 분해하여 캡슐화된 핵산을 방출시켰다. 그 후 Ribogreen 시약 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. Triton LNP(-)와 Triton LNP(+)의 형광 강도(FL)는 Infinite® 200 PRO NanoQuant(Tecan)에서 파장 대역폭(exitation : 485nm, emission : 528nm)으로 측정하였으며, 약물 봉입률(캡슐화 효율, %)은 하기 수학식 3과 같이 계산하였다. 각 LNP에 대한 약물 봉입률(%)은 2회 반복하여 측정된 결과값의 평균값으로 하기 표 5에 나타내었다.
(수학식 3)
약물 봉입률(%)=(Triton LNP(+)의 형광도 - Triton LNP(-)의 형광도)/(Triton LNP(+)의 형광도) X 100
지질 나노입자 봉입률
(Encapsulation efficiency, %)
241-C10 LNP 84
242-C10 LNP 83
243-C10 LNP 91
244-C10 LNP 87
245-C10 LNP 91
246-C10 LNP 94
상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 일 예에 따른 지질 나노입자는 높은 효율로 약물을 봉입할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 지질 나노입자를 이용한 세포 내 핵산 전달 확인
실시예 5-1. LNP에 포함되는 이온화 가능한 지질의 종류에 따른 핵산 전달 효과
일 예에 따른 LNP를 세포에 형질 전환(transfection)시키기 하루 전에 HeLa 세포를(한국 세포주 은행)을 white plate(96well)에 0.01x106 cells/well 로 분주하여 DMEM media(SH30022, Hyclone, USA)에서 37℃, 0.5~3% CO2 조건으로 배양하였다. 실시예 2-2에서 제조된, 루시퍼라제(luciferase) 유전자를 코딩하는 mRNA(luc mRNA; 서열번호 1)가 봉입된 LNP(지질-PEG를 1.5몰% 포함하는 241-C10 LNP 내지 246-C10 LNP)를 ApoE3 0.1㎍/㎖와 파이펫팅으로 교반 후 상온에서 10분 동안 인큐베이션 후 HeLa cell에 처리(지질 나노입자에 포함된 mRNA 기준으로 100ng/well) 하였다. ApoE3는 LNP 표면에 결합하여 세포 표면에 발현된 LDL 수용체를 통해 LNP가 세포 안으로 엔도시토시스(endocytosis)를 통해 들어갈 수 있도록 하는 역할을 한다.
24시간 후 Bright-Glo™ Luciferase Assay 용액(promega, USA)을 100㎕/well씩 처리하여 10분간 상온에 둔 후 용해된 세포를 Infinite M200 발광 측정기기(Tecan, USA)를 이용하여 발광 강도(luminescence intensity)를 측정하고, 그 결과를 도 4a에 나타내었다. 도 4a에 나타난 바와 같이, pKa 범위가 6.0 내지 7.0인 244-C10 LNP, 245-C10 LNP, 및 246-C10 LNP의 경우, 강한 발광 강도를 나타내었고, 그 중에서도 246-C10 LNP의 경우 발광 강도가 가장 높아, 246-C10 LNP가 세포 내 약물 전달 효율이 가장 높은 것을 알 수 있었다.
실시예 5-2. 간세포 내 핵산 전달 확인
실시예 2-2에서 제조한 246-C10 지질 나노입자를 이용하여 간세포(Hepatocyte)에 luc mRNA를 전달하여 발광 강도를 측정하여 상기 유전자의 발현을 확인하였다.
구체적으로, luc mRNA(서열번호 1)가 봉입된 246-C10 LNP(지질-PEG를 1.5몰% 포함)를 ApoE3 5㎍/㎖와 결합시킨 뒤, 나노입자에 포함된 mRNA 농도를 기준으로 0.2㎍/well, 0.5㎍/well, 또는 1㎍/well로 1x105cells/well로 분주된 간세포(Hepatocyte) 세포주(Nexel, Korea)에 LNP를 처리하였다. 6시간 후 Bright-Glo™ Luciferase Assay 용액(promega, USA)을 100㎕/well 처리하여 10분간 상온에 둔 후 용해된 세포를 Infinite M200 발광 측정기(Tecan, US)을 이용하여 발광 강도(luminescence intensity)를 측정하여 그 결과를 도 4b에 나타내었다.
도 4b에서 확인되는 바와 같이, 일 예에 따른 지질 나노입자는 지질 나노입자는 ApoE3과의 결합을 통해 세포 안으로 도입이 용이하고, 농도 의존적으로 약물(핵산) 전달양이 증가하였으며, 간세포(hepatocyte)에 약물을 높은 효율로 전달할 수 있는 것을 확인하였다.
실시예 6. 지질 나노입자를 이용한 생체 내 발현 확인
상기 실시예 5-1에서 확인한 바와 같이, 인비트로에서 우수한 유전자 발현 효과(유전자 전달 효과)를 나타내는 244-C10 LNP 내지 246-C10 LNP의 생체 내 약물전달 효율 및 생체 분포(biodistribution)를 본 실시예에서 확인하고자 하였다.
상기 실시예 2-2의 방법대로 luc mRNA(서열 번호 1)가 봉입된 244-C10 내지 246-C10 LNP(지질-PEG를 1.5몰% 포함)를 제조하고, 각 나노입자를 PBS에서 16시간 동안 투석하여 에탄올을 제거하였다. 지질 나노입자에 포함된 mRNA를 기준으로 0.1mg/kg 용량으로 C57BL/6 Female 7주령 마우스(오리엔트 바이오)에 mRNA가 봉입된 지질 나노입자를 정맥(i.v) 주사 후 3시간 뒤에 루시페린(luciferin) 0.25 mg/kg을 복강 투여하여 IVIS(PerkinElmer, USA) 장비를 통해 생체발광(bioluminescence)을 확인하여, 그 결과를 도 5a에 나타내었다.
luc mRNA가 봉입된 246-C10 LNP가 투여된 마우스를 희생시키고 장기를 적출하여 각 장기에서 지질입자의 생체 분포(biodistribution)를 IVIS 장비를 통해 확인하고 그 결과를 도 5b에 나타내었다.
도 5a에 나타난 바와 같이, luc mRNA가 봉입된 244-C10 LNP 내지 246-C10 LNP가 투여된 마우스의 생체 내에서 높은 발광 강도를 나타내며, 이는 상기 실시예 5-1의 결과와도 일치한다. 특히, 도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이, 전신 이미징과 탈체 기관 이미징(ex vivo organ imaging)을 통해 luc mRNA가 봉입된 246-C10 LNP의 경우 간 특이적으로 높은 발광 강도를 나타내는 것을 확인하여 일 예에 따른 지질 나노입자는 간으로의 높은 생체 분포를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7. 핵산 전달에 최적인 지질 나노입자의 조성비 확인
본 실시예에서, 생체 내에서 간 특이적으로 약물 전달 효율이 가장 우수한 지질 나노입자의 조성비를 확인하고자 하였다.
지질 나노입자 제조에 있어, 지질-PEG(C16-PEG2000 세라마이드)를 1.0 내지 2.5 몰%로 혼합하여 상기 실시예 2-2의 방법과 같이 luc mRNA(서열 번호 1)가 봉입된 지질 나노입자(246-C10 LNP)를 제조하였다. 지질 나노입자에 포함된 이온화 가능한 지질(Ionizable lipid): mRNA의 중량비는 10 : 1 였고, LNP에 포함되는 이온화 가능한 지질(246-C10): 인지질(DOPE) : 콜레스테롤 : 지질-PEG(C16-PEG2000 세라마이드)의 몰비는 26.5 : 20 : 52.5 내지 51 : 1.0 내지 2.5(몰비의 총 합이 100이 되도록 콜레스테롤과 지질-PEG 함량을 조절)이었다.
지질-PEG를 1.0몰%, 1.5몰%, 또는 2.5 몰%로 함유하고, luc mRNA가 봉입된 246-C10 LNP을 상기 실시예 6의 방법과 유사하게, 지질 나노입자에 포함된 luc mRNA를 기준으로 0.1mg/kg 용량으로 C57BL/6 Female 7주령 마우스(오리엔트 바이오)에 mRNA가 봉입된 지질 나노입자를 정맥(i.v) 주사 후 3시간 뒤에 루시페린(luciferin) 0.25 mg/kg을 복강 투여하여 IVIS(PerkinElmer, USA) 장비를 통해 생체발광(bioluminescence)을 확인하여, 그 결과를 도 6에 나타내었고, 지질-PEG 함량에 따른 지질 나노입자의 크기를 실시예 4-1의 방법과 동일하게 측정하여 하기 표 6 및 도 6에 기재하였다.
LNP에 포함된 지질-PEG 함량 지름(nm)
1.0 몰% 90
1.5 몰% 67
2.5 몰% 55
도 6에 나타난 바와 같이, 일 예에 따른 지질 나노입자를 투여한 군에서 간으로의 약물전달 효율이 우수한 것을 확인할 수 있었고, 지질-PEG를 1.5몰%로 포함하는 LNP 크기는 약 70nm 정도였다.
실시예 8. 간세포(hepatocyte) 특이적인 약물전달 효과 확인
실시예 8-1. 지질 나노입자를 이용한 FⅦ의 녹아웃(knockout) 효과 확인
FⅦ은 간세포(hepatocyte)에서 특이적으로 발현되므로 본 실시예에서 일 예에 따른 지질 나노입자의 간세포 타겟 가능성을 siFⅦ를 이용한 FⅦ(Factor Ⅶ) 녹아웃 효과를 통하여 확인하고자 하였다.
지질 나노입자에 포함된 siRNA의 농도를 기준으로 0.03mg/kg, 0.1mg/kg, 또는 0.3mg/kg 농도로, 상기 실시예 2-2에서 제조한 FⅦ target siRNA(서열번호 2 및 3)가 봉입된 246-C10 지질 나노입자(지질-PEG를 1.5몰% 포함)를 C57BL/6 암컷 7주령 20g 마우스에 정맥주사 후 3일 후 꼬리 정맥을 통해 혈액을 수집하고, coaset FⅦ assay kit의 프로토콜에 따라 혈액 분석하고, PBS가 투여된 마우스의 혈액으로 표준 곡선(standard curve)를 도시하여 FⅦ 발현양을 측정하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 246-C10 지질 나노입자에 봉입된 siRNA 농도 의존적으로 생체 내에서 FⅦ 발현을 억제하였으므로, 일 예에 따른 지질 나노입자가 간세포를 타겟으로 핵산을 전달할 수 있는 것을 확인하였다.
실시예 8-2. 지질-PEG 함량에 따른 간세포로의 약물전달 효과
지질 나노입자에 포함되는 지질-PEG의 함량을 0.5 내지 5.0몰%로 변경하여 상기 실시예 2-2의 방법대로 siFⅦ(서열 번호 2 및 3)가 봉입된 지질 나노입자(246-C10 LNP)를 제조하였다. 지질 나노입자에 포함된 이온화 가능한 지질: siRNA의 중량비는 7.5 : 1 이였고, LNP에 포함되는 이온화 가능한 지질(246-C10): 인지질(DSPC): 콜레스테롤 : 지질-PEG(C16-PEG2000 세라마이드)의 몰비는 42.5 :13 : 44 내지 39.5 : 0.5 내지 5.0 (몰비의 총 합이 100이 되도록 콜레스테롤과 지질-PEG 함량을 조절)이었다.
상기에서 제조한 지질 나노입자의 지름 및 다분산도(PDI; polydispersity index)를 상기 실시예 4-1의 방법과 동일하게 측정하여 하기 표 7 및 도 8(좌측 표)에 나타내었다.
지질-PEG (%) 평균 지름(nm) PDI
0.5 120 0.018
1 78 0.106
1.5 52 0.159
3 42 0.152
5 37 0.226
지질 나노입자에 포함된 siRNA를 기준으로 0.2mg/kg 용량이 되도록, siFⅦ가 봉입된 지질 나노입자(0.5 내지 5몰%로 지질-PEG를 포함)를 C57BL/6 female 7주령 20g 마우스에 정맥주사 후 3일 뒤 꼬리 정맥을 통해 혈액을 수집하여, 상기 실시예 8-1의 방법과 유사하게 coaset FⅦ assay kit를 이용하여, FⅦ의 발현양을 측정하고, 그 결과를 도 8(우측 그래프)에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, 일 예에 따른 지질 나노입자를 투여시 생체 내의 FⅦ의 발현이 감소하였고, 일 예에 따라 0.5 내지 5.0몰%의 지질-PEG함량을 갖는 지질 나노입자를 투여한 경우, 우수하게 FⅦ 발현을 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 9. LSEC 특이적인 약물전달 효과
FVIII은 LSEC(liver sinusoidal endothelial cells)에서 특이적으로 발현되므로 본 실시예에서 일 예에 따른 지질 나노입자의 LSEC 타겟 가능성을 siFVIII를 이용한 FVIII(Factor VIII)의 녹아웃 효과를 통하여 확인하고자 하였고, 지질-PEG 함량에 따른 약물전달 효과를 살펴보았다.
지질 나노입자에 포함되는 지질-PEG의 함량을 0.5 내지 5.0 몰%로 변경하여 상기 실시예 2의 방법대로 siFVIII(서열 번호 4 내지 11)가 봉입된 나노입자(246-C10 LNP)를 제조하였다. 지질 나노입자에 포함된 이온화 가능한 지질: siRNA의 중량비는 7.5 : 1 이었고, LNP에 포함되는 이온화 가능한 지질(246-C10): 인지질(DSPC) : 콜레스테롤 : 지질-PEG(C16-PEG2000 세라마이드) = 42.5 : 13 : 44 내지 39.5 : 0.5 내지 5.0 (몰비의 총 합이 100이 되도록 콜레스테롤과 지질-PEG 함량을 조절)이었다.
상기에서 제조한 지질 나노입자의 지름 및 PDI를 상기 실시예 4-1의 방법과 동일하게 측정하여 하기 표 8 및 도 9(좌측 표)에 나타내었다.
지질-PEG (%) 평균 지름(nm) PDI
0.5 166 0.018
1 87 0.106
1.5 78 0.159
3 42 0.152
5 35.6 0.226
지질 나노입자에 포함된 siRNA를 기준으로 0.5mg/kg 의 용량이 되도록, siFVIII가 봉입된 지질 나노입자(0.5 내지 5몰%로 지질-PEG를 포함)를 C57BL/6 암컷 7주령 20g 마우스에 정맥주사 후 2일뒤 꼬리 정맥을 통해 혈액을 수집하여, 상기 실시예 8-1의 방법과 유사하게 coaset FVIII assay kit를 이용하여, FVIII의 발현양을 측정하여 그 결과를 도 9(우측 그래프)에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, 일 예에 따른 지질 나노입자를 투여시 생체 내의 FVIII의 발현이 감소하였고, 일 예에 따른 지질 나노입자가 LSEC을 타겟할 수 있는 것을 확인하였고, 일 예에 따라 0.5 내지 5.0몰%의 지질-PEG 함량을 갖는 지질 나노입자를 투여한 경우, 우수하게 FVIII 발현을 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 10. 지질-PEG 접합체의 종류에 따른 약물전달 효과
지질-PEG 접합체로서, 세라마이드-PEG 접합체(C16-PEG 2000 세라마이드; Avanti, 미국) 또는 PEG-DSPE(Avanti, 미국)를 포함하는 지질 나노입자 (지질-PEG 접합체를 0.25 내지 10.0 몰%로 포함)를 상기 실시예 2-2의 방법과 유사하게 지질 나노입자를 제조하였다.
지질 나노입자에 포함된 이온화 가능한 지질: siRNA(siLuc)의 중량비는 7.5 : 1 이였고, LNP에 포함되는 이온화 가능한 지질(246-C10): 인지질(DSPC): 콜레스테롤: 지질-PEG(세라마이드-PEG 또는 PEG-DSPE)의 몰비는 42.5 : 13 : 44.25 내지 34.5 : 0.25 내지 10 (몰비의 총 합이 100이 되도록 콜레스테롤과 지질-PEG 함량을 조절)이었다. 사용된 siLuc (루시퍼라제 (luciferase) 유전자를 타겟하는 siRNA; 서열번호 12 및 13)의 서열은 상기 실시예 2-2에 기재하였다.
일 예에 따른 LNP를 세포에 형질 전환(transfection)시키기 하루 전에 HeLa 세포를(한국 세포주 은행)을 white plate(96well)에 0.01x106 cells/well 로 분주하여 DMEM media(SH30022, Hyclone, USA)에서 37℃, 0.5~3% CO2 조건으로 배양하였다. siLuc가 봉입된 지질 나노입자를 siRNA 농도를 기준으로 10 nM 로 HeLa-Luc 세포주에 처리 24시간 후 Bright-Glo™ Luciferase Assay 용액(promega, USA)을 100㎕/well씩 처리하여 10분간 상온에 둔 후 용해된 세포를 Infinite M200 발광 측정기기(Tecan, USA)를 이용하여 발광 강도(luminescence intensity)를 측정하여 그 결과를 도 10에 나타내었다. 측정된 결과는 평균±SD로 표현되었다. 결과값은 T-test를 통한 방법으로 통계 검증하였고, p<0.05 이상일 경우를 통계적으로 유의하다고 정의하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 일 예에 따른 지질 나노입자는 세포로의 핵산 전달 효과가 우수하였고, 특히 지질-PEG 접합체로서 세라마이드-PEG 접합체를 포함하는 경우 핵산 전달 효과가 우수하였다.

Claims (20)

  1. 6원의 헤테로고리 아민 및 알킬-에폭시드가 결합된 이온화 가능한 지질 (ionizable lipid); 인지질; 콜레스테롤; 및 지질-PEG(polyethyleneglycol) 접합체를 포함하는 지질 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 6원의 헤테로고리 아민은 3차 아민을 포함하는 사슬형 또는 비사슬형의 아민인, 지질 나노입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 6원의 헤테로고리 아민은
    Figure PCTKR2020019502-appb-I000009
    ,
    Figure PCTKR2020019502-appb-I000010
    ,
    Figure PCTKR2020019502-appb-I000011
    ,
    Figure PCTKR2020019502-appb-I000012
    ,
    Figure PCTKR2020019502-appb-I000013
    , 및
    Figure PCTKR2020019502-appb-I000014
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 지질 나노입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 알킬-에폭시드는 1,2-에폭시도데칸(1,2-epoxydodecane)인, 지질 나노입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인지질은 DOPE, DSPC, POPC, EPC, DOPC, DPPC, DOPG, DPPG, DSPE, Phosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, POPE, POPC, DOPS, 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine]으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 지질 나노입자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 지질-PEG 접합체 내 지질은 세라마이드(ceramide), 디미리스톨글리세롤(dimyristoylglycerol, DMG), 석시노일 디아글리세롤(succinoyl-diacylglycerol, s-DAG), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 지질 나노입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 지질-PEG 접합체는 0.25 내지 10 몰%로 포함되는 것인, 지질 나노입자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 이온화 가능한 지질 : 인지질 : 콜레스테롤 : 지질-PEG 접합체를 20 내지 50 : 10 내지 30 : 30 내지 60 : 0.25 내지 10 의 몰비로 포함하는, 지질 나노입자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 pKa가 6.0 내지 7.0인, 지질 나노입자.
  10. 제1항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 간 조직을 특이적으로 표적화하는 것인, 지질 나노입자.
  11. 제1항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 간세포(hepatocyte)를 표적화하는 것인, 지질 나노입자.
  12. 제1항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 LSEC(liver sinusoidal endothelial cell)을 표적화하는 것인, 지질 나노입자.
  13. (1) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 지질 나노입자; 및 (2) 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는, 약물 전달용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합은 상기 지질 나노입자 내부에 봉입되어 있는, 약물 전달용 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 평균 지름이 30nm 내지 150nm인, 약물 전달용 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 음이온성 약물은 펩타이드, 단백질 약물, 단백질-핵산 구조체, 및 음이온성 생체고분자-약물 접합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 약물 전달용 조성물.
  17. 제13항에 있어서, 상기 핵산은 소간섭리보핵산(siRNA), 리보좀 리보핵산(rRNA), 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 상보성 디옥시리보핵산(cDNA), 앱타머(aptamer), 전령 리보핵산(mRNA), 운반 리보핵산(tRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA, 및 DNAzyme로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 약물 전달용 조성물.
  18. (1) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 지질 나노입자; 및 (2) 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는, 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 간질환은 ATTR 아밀로이드증(ATTR amyloidosis), 이상지질혈증(Hypercholesterolemia), B형 간염(Hepatitis B virus infection), 급성 간부전(Acute liver failure), 간경변(Cirrhosis), 및 간 섬유화(liver fibrosis)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 약학적 조성물.
  20. 18항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 평균 지름이 30nm 내지 150nm 인, 약학적 조성물.
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