WO2022255701A1 - 약물 전달을 위한 지단백 모방 고형 지질 나노입자 및 이의 용도 - Google Patents

약물 전달을 위한 지단백 모방 고형 지질 나노입자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따르면, 알부민이 접합된 콜레스테롤, 융합 유도성 지질, 양이온성 지질, 트리글리세라이드 및 콜레스테릴 에스테르를 구성으로 하는 코어-쉘 구조의 지단백 모방 고형 지질 나노입자를 제조함으로써 생체이용률이 우수하고 약물 봉입 효율이 향상된 약물전달체를 제공할 수 있다.

Description

약물 전달을 위한 지단백 모방 고형 지질 나노입자 및 이의 용도
본 발명은 약물 전달을 위한 지단백 모방 고형 지질 나노입자 및 이의 약물전달체로서의 용도에 관한 것이다.
K-ras 유전자(KRAS)는 여러 암종에서 흔히 돌연변이되는 ras 유전자 중 하나로, KRAS 유전자의 코돈 12 및 13에서의 돌연변이는 이 유전자의 산물인 p21-ras 단백질의 기능적 변화를 초래하게 되고, 그 결과 세포핵에 성장 신호를 필요 이상으로 전달함으로써 세포의 성장과 분열을 촉진하여 발암과정에 관여한다. KRAS의 돌연변이는 췌장암의 약 90%, 대장암의 약 50%, 비소세포폐암의 약 30%에서 나타나 사람의 암에서 매우 흔하게 발견되고 이들 돌연변이들의 대부분은 코돈 12 및 13에 집중되어 있음이 돌연변이 프로파일에서 확인되었다(비특허문헌 1).
이에, 여러 방법으로 KRAS와 관련된 항암제의 개발에 관한 연구가 수십년간 시도되어 왔으나, 임상으로까지 이어진 항암제는 없었기 때문에, KRAS는 “치료제로 발굴할 수 없는(undruggable)” 타겟으로 간주되어 왔다. KRAS는 GTP(guanosine triphosphate)와 결합하면 활성화하는데, GTP와 결합력이 아주 높고 표면에 결합할만한 포켓이 거의 없어서 이를 표적으로 신약 개발하기가 매우 어렵다. 또한, KRAS는 세포 내 단백질이기 때문에 분자량이 큰 항체를 사용할 수도 없는 문제가 있다.
또한 알부민의 다양한 결합능을 활용한 알부민 융합(Albumin-fusion) 기술을 응용하여 항암제인 파클리탁셀을 알부민에 부착한 약제인 나노입자 파클리탁셀, 상품명 아브락산(Abraxane)은 파클리탁셀의 종양 반응을 개선하는 것으로 나타났지만, 아브락산의 약동학적 특성과 생체내 분포(biodistribution)는 탁솔(Taxol) 제형의 것보다 효과가 낮은 문제가 있다.
따라서, 생체적합적이고 고효율의 약물 전달 효율을 가지면서도, KRAS를 직접적으로 표적하는 약물 전달체의 개발이 필요한 실정이다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
1. Samowitz WS, et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 9: 1193-7, 2000
본 발명의 목적은 생체이용률이 우수하고 고효율의 약물 전달 효과를 갖는 약물전달체로서 지단백 모방 고형 지질 나노입자 및 이의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명자들은 천연 지단백과 유사한 조성의 고형 지질 나노입자를 제조하면 약물을 고효율로 봉입할 수 있으면서도 생체이용률이 우수한 약물전달체로 활용 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 생체적합적이고 고효율로 약물을 전달하기 위한 지단백(lipoprotein) 모방 고형 지질 나노입자(solid lipid nanoparticle, SLN) 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 콜레스테릴 에스테르, 트리글리세라이드, 알부민이 접합된 콜레스테롤, 융합 유도성 지질 및 양이온성 지질을 구성으로 하는 코어-쉘 구조의 지단백 모방 고형 지질 나노입자를 제조함으로써, 입자간의 응집을 막고 구조적 안정성을 확보할 수 있다. 또한, 생체이용률이 우수하고 약물 봉입 효율이 향상된 약물전달체를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 제조 및 약물 전달체로서의 형태를 도식화한 것이다.
도 2는 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 구성성분들의 함량에 따른 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 Z-평균 값을 나타낸 것이다.
도 3a 및 3b는 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 TEM 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 모노머 siRNA를 환원가능한 다이머 siRNA로 합성하는 과정을 도식화한 것이다.
도 5는 환원가능한 다이머 siRNA의 환원성을 확인한 결과이다.
도 6은 siRNA/SLN 복합체의 세포 내 흡수를 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 7은 siRNA/SLN 복합체의 유전자 침묵 효과를 확인하기 위해, 역전사 효소-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 Kras mRNA 수준을 확인한 결과이다.
도 8은 siRNA/SLN 복합체의 유전자 침묵 효과를 확인하기 위해, Kras mRNA 수준을 정량화한 결과이다.
도 9는 동물 모델에서 siRNA/SLN 복합체의 유전자 침묵 효과를 확인하기 위해, 역전사 효소-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 Kras mRNA 수준을 확인한 결과이다.
도 10은 동물 모델에서 siRNA/SLN 복합체의 유전자 침묵 효과를 확인하기 위해, Kras mRNA 수준을 정량화한 결과이다.
도 11은 마우스 모델에서 다이머 siRNA에 의해 형성된 siRNA/SLN 복합체의 혈액 제거율을 확인한 결과이다.
도 12는 마우스 모델에서 다이머 siRNA에 의해 형성된 siRNA/SLN 복합체의 생체 분포를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명에서 수치의 한정은 별도의 기재가 없으면 이상 또는 이하를 나타낸다.
본 발명은 콜레스테릴 에스테르 및 트리글리세라이드를 포함하는 코어; 및
알부민이 접합된 콜레스테롤, 융합 유도성 지질 및 양이온성 지질을 포함하는 쉘을 포함하는 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자를 제공한다.
본 발명에 있어서, “고형 지질 나노입자(solid lipid nanoparticle, SLN)”는 형태적인 측면에서 나노미터(nm) 단위의 크기를 가지며, 리포좀(liposome)이나 에멀젼(emulsion) 제형과는 달리 고형 매트릭스 형태로 존재하는 입자를 의미한다. 본 발명의 고형 지질 나노입자는 코어-쉘 구조를 갖는 것이며, 예를들어, 구조적으로 중심부(코어) 혹은 표면부(쉘)에 비수용성 약물 및/또는 핵산을 포집하는 형태로 구성될 수 있다. 본 발명에 따른 고형 지질 나노입자는 비수용성 약물 및/또는 핵산을 포집함으로써 상기 비수용성 약물 및/또는 핵산의 생체 내 전달 효율을 크게 증가시킬 수 있다. 상기 고형 지질 나노입자는 통상적인 방법으로 제조될 수 있고, 필요에 따라 그 방법을 적절히 변형하여 수행할 수 있다.
천연 고밀도 지단백(HDL)은 크기가 5 내지 17nm이고, 지단백 중 단백질 조성이 가장 커서 1.063 내지 1.21 g/dL의 가장 높은 밀도를 갖는다. 고밀도 지단백은 전체 성분 중 단백질이 약 50%를 차지하며, 콜레스테롤이 약 17%, 인지질이 약 22%를 차지한다. 주요 단백질은 apoA-I과 apoA-II이다. 고밀도 지단백은 그 구조상 두 개의 지질상, 즉, 극성 지질상(인지질, 아포지단백 및 유리 콜레스테롤) 및, 비극성 지질상(콜레스테릴 에스테르 및 트리글리세라이드)으로 이루어져 있다. 인지질은 비극성 지질을 유화시켜 나노입자 표면을 안정화할 수 있는 이점이 있다.
본 발명에 따른 고형 지질 나노입자는 고밀도 지단백(HDL) 모방 고형 지질 나노입자(SLN)이다. 천연 고밀도 지단백과 달리, 본 발명에 따른 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자는 아포지단백을 실질적으로 미포함할 수 있다. 또한, 아포지단백을 포함하는 천연 고밀도 지단백과는 달리, 본 발명에 따른 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자는 아포지단백을 대체하여 양이온성 지질을 고함량으로 포함할 수 있다. 상기 양이온성 지질에 의해 고형 지질 나노입자의 표면에 양이온성을 부여함으로써 약물과 결합되어 약물 전달체로서 활용될 수 있다.
또한 본 발명의 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자는 천연 고밀도 지단백과는 달리, 유리 콜레스테롤을 알부민과 접합된 콜레스테롤 형태로 대체하여 포함할 수 있다. 상기와 같이 알부민이 접합된 콜레스테롤을 포함시킴으로써 상기 고형 지질 나노입자가 약물 전달체로 활용될 때 암 세포 표적능을 가지게 할 수 있다. 이러한 암 세포 표적능은 콜레스테롤에 접합된 알부민에 의한 것이며, 알부민에 의해 암 세포 표적능을 발휘하기 위해서는 입자 크기가 세포막을 통과할 수 있는 수준, 즉 20 내지 50 nm 수준이어야 한다. 이에, 본 발명에 따른 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 크기는 20 내지 50 nm일 수 있다.
한편, 천연 저밀도 지단백(LDL)은 두 개의 지질상, 즉, 극성 구성분(인지질 및 아포지질 단백질) 및 콜레스테롤 에스테르와 트리글리세라이드로 사전 구성된 비극성 중성 지질로 이루어지며, 크기는 약 18 내지 25 nm이고, 제타전위는 -11.4 ± 1.9 mV이다. 구체적으로, 코어부(core)는 콜레스테롤 에스테르 45% 및 트리글리세라이드 3%로 구성되고, 표면부(surface)는 콜레스테롤 10%, 인지질 22% 및 아포지질단백질(apoplipoprotein) B-100 20%로 구성된다.
본 발명에 따른 고형 지질 나노입자는 저밀도 지단백(LDL) 모방 고형 지질 나노입자(SLN)이다. 천연 저밀도 지단백과 달리, 본 발명에 따른 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자는 아포지단백을 실질적으로 미포함할 수 있다. 또한, 아포지단백을 포함하는 천연 저밀도 지단백과는 달리, 본 발명에 따른 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자는 인지질 및 아포지단백을 대체하여 융합 유도성 지질, 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 상기 양이온성 지질에 의해 고형 지질 나노입자의 표면에 양이온성을 부여함으로써 약물과 결합되어 약물 전달체로서 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자는 천연 저밀도 지단백과는 달리, 유리 콜레스테롤을 알부민과 접합된 콜레스테롤 형태로 대체하여 포함할 수 있다.
상기와 같이 알부민이 접합된 콜레스테롤을 포함시킴으로써 상기 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자가 약물 전달체로 활용될 때 암 세포 표적능을 가지게 할 수 있다. 또한 비극성 지질을 유화시켜 표면의 안정성을 제공여, 입자 간 응집을 막고 구조적으로 안정된 나노입자를 형성할 수 있다.
이러한 암 세포 표적능 및 투과력은 콜레스테롤에 접합된 알부민에 의한 것이며, 알부민에 의해 암 세포 표적능을 발휘하기 위해서는 입자 크기가 세포막을 통과할 수 있는 수준이 되야 한다. 즉 EPR (Enhanced permeability and retention) 효과로 종양조직의 신생혈관이 불완전하여 200 nm 정도로 틈새가 벌어져 200 nm 이내 입자는 정상조직에 들어가지 않고 종혈관을 침투할 수 있으며 (Enhanced permeability) 또는 종양조직은 림프계가 발달하지 않아 누출된 물질은 체류하기가 쉽다. 이에, 본 발명에 따른 고형 지질 나노입자의 크기는 60 내지 200 nm 로 EPR 효과로 암조직등에 약물을 안정적으로 운반 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 및/또는 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자는 양이온성 고형 지질 나노입자 형태의 고밀도 및/또는 저밀도 지단백 모방 양이온성 고형 지질 나노입자일 수 있다. 상기 나노입자는 천연 고밀도 및/또는 저밀도 지단백의 구성성분을 모방하여 재구성된 것으로, 단백질, 펩타이드, 앱타머 또는 siRNA와 같은 핵산 치료제는 물리 화학적 특성으로 인하여 순환계로의 흡수율이 매우 낮다. 또한, 고형 지질 나노입자는 단백질분해효소, 펩타이드분해효소, 또는 핵산분해효소 등에 의하여 분해되어 세망내피계 (Reticuleoendothelial system, RES) 등을 통하여 제거된 후 신장을 통하여 빠르게 배출되기 때문에 이를 개선한 천연 고밀도 지단백 모방 나노입자에 약물을 봉입하여 효소에 의한 분해를 저해하며, 표적 장기나 세포에 흡수를 촉진하고 세망내피계 (Reticuleoendothelial system, RES)에 의해 분해되는 것을 저해하고 혈중 체류시간을 연장시킬 수 있으며, 생체 내 천연 지단백을 모방했다는 점에서 생체 내 안정성 및 생체이용률이 우수하며, 고효율로 약물을 봉입하여 전달할 수 있다는 이점이 있다.
하기 실시예에서는, 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자와 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자를 제조하여, 상기 지단백 모방 나노입자가 우수한 약물 봉입률을 가짐을 확인하였다. 보다 구체적으로, 평균 입자 크기가 저밀도 지단백 고형 지질 나노입자의 경우 약 100 nm이고, 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 경우 약 30 nm였으며, 약물의 봉입률은 유사한 수준임을 확인하였다.
본 발명에서는 지단백 모방 고형 지질 나노입자를 고형 지질 나노입자로 언급할 수 있다. 또한, 별도의 기재가 없는 한, 개시된 내용은 저밀도 및/또는 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 모두에 적용되는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 있어서, 고형 지질 나노입자의의 코어는 상온 및 체온에서 고형 상태로 코어 내부에 비수용성 약물 및/또는 핵산 유전자의 소수성 상호작용을 통해 약물을 포집할 수 있다. 상기 고형 지질 나노입자의 코어는 콜레스테릴 에스테르 및 트리글리세라이드를 포함한다.
상기 나노입자의 코어를 이루는 성분 중 하나인 콜레스테릴 에스테르는 콜레스테롤에 탄소수 10 내지 24개의 포화 또는 불포화 지방산이 에스테르 결합된 것으로, 올레인산과 같은 탄소수 16 내지 18개의 불포화 지방산의 에스테르일 수 있다. 본 발명에 따른 고형 지질 나노입자는 단일 또는 여러 종류의 콜레스테릴 에스테르를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 콜레스테릴 에스테르는 콜레스테릴스테아레이트, 콜레스테릴팔미테이트, 콜레스테롤하이드록시스테아레이트, 소이빈스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상 또는 그 유도체일 수 있으며, 바람직하게는 콜레스테릴 올레이트일 수 있다.
상기 콜레스테릴 에스테르는 전체 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로, 5 내지 60 중량부일 수 있다.
예를 들어, 지단백 모방 고형 지질 나노입자가 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자일 경우, 상기 콜레스테릴 에스테르는 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로, 5 내지 30 중량부, 10 내지 25 중량부, 또는 15 내지 20 중량부로 포함될 수 있다. 콜레스테릴 에스테르가 상기와 같은 범위로 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 코어를 구성할 때, 많은 양의 약물을 봉입하면서도 세포막을 통과할 수 있어 세포 내 약물 전달 효율이 우수한 고형 지질 나노입자를 제조할 수 있다. 또한, 상기 함량의 콜레스테릴 에스테르를 포함함으로써, 천연 고밀도 지단백과 유사한 고형 지질 나노입자를 제조할 수 있다.
또한, 예를 들어, 지단백 모방 고형 지질 나노입자가 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자일 경우, 상기 콜레스테릴 에스테르는 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로, 30 내지 60 중량부, 30 중량부 초과 내지 50 중량부 이하, 40 내지 50 중량부로 포함될 수 있다. 콜레스테릴 에스테르가 상기와 같은 범위로 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 코어를 구성할 때, 많은 양의 약물을 봉입하면서도 세포막을 통과할 수 있어 세포 내 약물 전달 효율이 우수한 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자를 제조할 수 있다. 또한, 상기 함량의 콜레스테릴 에스테르를 포함함으로써, 천연 저밀도 지단백과 유사한 고형 지질 나노입자를 제조할 수 있다.
또한, 상기 나노입자의 코어를 이루는 성분 중 하나인 트리글리세라이드는 다양한 지방산의 조성을 가지는 정제 트리글리세라이드, 또는 다수의 지방산으로 구성된 트리글리세라이드를 주성분으로 하는 식물유일 수 있다. 예를 들어, 상기 트리글리세라이드는 동물성 또는 식물성 기름일 수 있으며, 대두유, 올리브유, 면실유, 참깨유 및 간유 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 트리글리세라이드는 글리세롤 1 분자에 탄소수 10 내지 24의 포화 또는 불포화 지방산 3 분자가 에스테르 결합된 것일 수 있다.
한 구체예에서, 상기 트리글리세라이드는 트리헵타노인, 트리미리스틴, 트리팔미틴, 트리스테아린, 트리리놀레인, 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상 또는 그 유도체일 수 있으며, 바람직하게는 트리올레인일 수 있다.
상기 트리글리세라이드는, 전체 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로, 0.01 내지 5 중량부, 0.05 내지 3.5 중량부, 0.1 내지 2.5 중량부, 0.5 내지 1.5 중량부로 포함될 수 있다. 트리글리세라이드가 상기와 같은 범위로 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 코어를 구성할 때, 상기 트리글리세라이드가 콜레스테릴 에스테르와 소수성 결합하여 세포막을 통과할 수 있는 크기를 가지는 나노입자를 형성할 수 있다.
상기 콜레스테릴 에스테르 및 트리글리세라이드는 소수성 결합을 통해 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 코어를 형성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 고형 지질 나노입자의 쉘은 코어의 상층면에 소수성 상호반응에 의해 결합되어 있으며, 쉘에는 약물, 특히 비수용성 약물 및/또는 핵산 유전자와 정전기적 상호 작용을 할 수 있는 양이온성 지질이 노출되어 있다. 본 발명에 따른 나노입자는 상기와 같은 쉘에 노출된 양이온성 지질을 통해 약물, 특히 비수용성 약물 및/또는 핵산 유전자와 정전기적 상호 작용에 의해 결합되어 복합체를 형성할 수 있으며, 약물, 특히 비수용성 약물 및/또는 핵산 유전자를 세포 내로 안정적으로 전달할 수 있다. 이에, 상기 나노입자의 쉘은 알부민이 접합된 콜레스테롤, 융합 유도성 지질 및 양이온성 지질을 포함한다.
본 발명에 있어서, 알부민이 접합된 콜레스테롤은 소수성을 갖는 모이어티로서 천연 지질인 콜레스테롤에 친수성 단백질인 알부민을 접합시켜 제조할 수 있다. 특히 본 발명은 콜레스테롤에 알부민을 공유결합시킴으로써 콜레스테롤과 알부민이 견고하게 결합시킬 수 있다. 이를 통해, 두 성분이 단순 혼합되어 상호작용에 의해 비특이적으로 결합한 복합체와는 달리 콜레스테롤에 알부민이 일정한 비율로 견고하게 결합된 콜레스테롤-알부민을 제공할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 알부민이 접합된 콜레스테롤은 용어 “콜레스테롤-알부민”과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민이 접합된 콜레스테롤은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조가능하다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 한 구체예에서, 상기 알부민이 접합된 콜레스테롤은 콜레스테롤 클로로포메이트와 알부민이 반응하여 형성된 것일 수 있다. 이는 콜레스테롤 클로로포메이트의 클로로포메이트기와 알부민의 아민기가 반응하여 결합된 것일 수 있다.
상기 “알부민”은 세포의 기본 물질을 구성하는 단백질의 하나로, 자연 상태에서 존재하는 단순 단백질 중 가장 분자량이 작은 단백질이다. 알부민은 수가용성(water-soluble)으로 혈장에서 흔히 발견되는 주된 단백질로, 물, 칼슘, 나트륨, 칼륨 등의 양이온, 지방산, 호르몬, 빌리루빈(bilirubin), 약물 등 다양한 리간드와 결합하여 혈액의 콜로이드 삼투압을 조절 및 전달하는 역할을 하기도 한다. 특히 약물과 알부민의 결합은 약물의 약효 발현에 크게 기여하기도 한다. 상기 알부민은 난백(egg white, 오브알부민; ovalbumin), 소혈청 또는 인간 혈청으로부터 상당량 수득할 수 있으며, 대두, 우유 및 곡물로부터도 추출할 수 있다. 또는 자연적으로 존재하는 알부민과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 발현하도록 제조된 형질전환체로부터 수득한 재조합 알부민을 이용할 수도 있다.
또한, 상기 “콜레스테롤”은 스테로이드와 알코올의 조합인 스테롤의 일종으로, 모든 동물세포의 세포막에 존재하는 지질이며, 혈액을 통해 운반되는 유기분자이다. 콜레스테롤은 음식을 통해 흡수되거나 체내에서 합성되고, 세포막이 많은 기관에 고농도로 존재하며, 세포에 적절한 막 투과성 및 유동성을 부여한다. 분자 내에 복수의 융합된 고리 구조를 포함하므로 고리 구조를 포함하는 물질과 향상된 상호작용을 나타낼 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명은 천연 지단백의 유리 콜레스테롤 대신 알부민이 접합된 콜레스테롤을 그 구성성분으로 포함할 수 있다.
상기 알부민이 접합된 콜레스테롤은, 전체 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로, 1 내지 20 중량부일 수 있다.
예를 들어, 지단백 모방 고형 지질 나노입자가 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자일 경우, 상기 알부민이 접합된 콜레스테롤은 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로, 1.5 내지 8 중량부, 2 내지 5 중량부, 3.5 내지 4.5 중량부로 포함될 수 있다. 또한, 예를 들어, 지단백 모방 고형 지질 나노입자가 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자일 경우, 상기 알부민이 접합된 콜레스테롤은 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로, 3 내지 15 중량부, 5 내지 12 중량부, 9 내지 11 중량부로 포함될 수 있다. 알부민이 접합된 콜레스테롤이 상기와 같은 범위로 고형 지질 나노입자를 구성할 때, 천연 지단백을 모방하면서도 입자 간 응집을 막고, 약물 봉입율이 우수한 고형 지질 나노입자를 형성할 수 있다. 상기와 같은 고형 지질 나노입자에서 많은 양의 약물을 봉입하면서도 대식작용(Phagocytosis)에 의한 나노입자의 분해를 방지하여 표적 부위로의 약물 전달 효율을 극대화시킬 수 있다. 더욱이, 알부민이 접합된 콜레스테롤을 상기 함량으로 포함시킴으로써, 알부민이 접합된 콜레스테롤에 의해 고형 지질 나노입자의 쉘이 견고하게 형성될 수 있고, 유전자 전달을 위한 유전자 형질 감염의 효율이 향상될 수 있으며, 후술되는 양이온성 지질의 세포 독성이 감소되는 이점이 있고, 대식작용(Phargocytosis)이 억제되어 고형 지질 나노입자의 약물 전달 효율이 향상될 수 있다.
알부민은 엔도좀-리소좀 구획에서 나노입자의 방출을 촉진할 수 있는 엔도좀 용해 활성을 가지므로, 약물 전달 효율 향상에 기여할 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예에서는 이러한 엔도좀 용해 활성에 의해 고형 지질 나노입자와 siRNA의 복합체(albumin_SLN/siRNA 복합체)가 생체 내 유전자 전달(침묵) 효율 향상에 기여함을 보여준다. 또한, 상기 나노입자는 혈관 순환 중에도 나노 구조를 유지할 수 있기 때문에, 종양 조직에 우선적으로 분포되어 부작용을 최소화하면서 약물의 치료 효능을 극대화할 수 있는 이점이 있다.
상기 융합 유도성 지질은 고형 지질 나노입자를 형성할 수 있는 모든 종류의 중성, 양이온성, 또는 음이온성 지질일 수 있으며, 단일 또는 2종 이상의 인지질의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 융합 유도성 지질로는 융합 유도 가능한 모든 종류의 인지질을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine, DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylethanolamine, POPC), 에그 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine, EPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitorylphosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS), 및 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린]으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, 상기 융합 유도성 지질은 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(DOPE)일 수 있다.
상기 융합 유도성 지질은, 전체 고형 지질 나노입자 중량을 기준으로, 5 내지 40 중량부, 15 내지 40 중량부, 20 내지 35 중량부, 20 내지 30 중량부로 포함될 수 있다. 융합 유도성 지질이 상기와 같은 범위로 고형 지질 나노입자를 구성할 때, 유전자 형질감염의 효율을 향상시키고, 후술되는 양이온성 지질의 세포독성을 감소시키는 이점이 있다. 또한, 융합 유도성 지질은 고형 지질 나노입자의 세포막 통과 및 엔도좀 탈출(endosomal escape)을 도와 세포 내 약물 전달이 용이하도록 한다.
상기 양이온성 지질은 생리학적 pH와 같이 특정 pH에서 순 음전하를 띠는 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 양이온성 지질은 3-베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (MC-콜레스테롤), 3베타[N- (아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (AC-콜레스테롤), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤 (AC-토코페롤), N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤 (MC-토코페롤), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드 (DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 (DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민 (DODMA), N-(1-(2,3-디올레일)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), 1,2-디올레일-3-디메틸암모늄-프로판 (DODAP), 1,2-디올레일카바밀-3-디메틸암모늄-프로판 (DOCDAP), 1,2-디리네오일-3-디메틸암모늄프로판(Dilineoyl-3-Dimethylammonium-propane, DLINDAP), 디올레오일옥시-N-[2-스퍼민카복사미도)에틸}-N,N-디메틸-1-프로판아미늄트리플루오로아세테이트(DOSPA), 디옥타데실아미도글리실 스퍼민 (DOGS), 1,2-디미리스트릴옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE), 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디에녹시)프로판 (CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시]-3-다메틸-1-(시스,시스-9',12'-옥타데카디에녹시)프로판 (CpLinDMA), N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민 (DMOBA), 1,2-N,N'-디올레일카바밀-3-디메틸아미노프로판 (DOcarbDAP), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 1,2-디-O-옥타데세일-3-트리메틸암모늄프로판, 및 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, 상기 양이온성 지질은 3-베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤)일 수 있다. 상기 DC-콜레스테롤은 다른 양이온성 지질보다 그 독성이 약하며, DC-콜레스테롤 계열의 유전자 담체가 흑색종, 낭포성 섬유종, 자궁경부암, 유방암 또는 난소암 등 여러 질환의 임상 치료에 사용 승인을 받았다는 점에서 특히 바람직할 수 있다.
상기 양이온성 지질은, 전체 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로, 10 내지 60 중량부로 포함될 수 있다.
예를 들어, 지단백 모방 고형 지질 나노입자가 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자일 경우, 상기 양이온성 지질은 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로, 10 내지 60 중량부, 35 내지 58 중량부, 40 내지 50 중량부로 포함될 수 있다. 양이온성 지질이 상기와 같은 함량 범위로 고형 지질 나노입자의 쉘을 구성할 때, 고형 지질 나노입자가 많은 양의 약물을 봉입하면서도 세포막을 통과할 수 있는 크기로 형성되어 효율적으로 약물을 전달할 수 있다.
또한, 예를 들어, 지단백 모방 고형 지질 나노입자가 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자일 경우, 상기 양이온성 지질은 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로, 10 내지 40 중량부, 10내지 30 중량부, 12 내지 28 중량부로 포함될 수 있다. 양이온성 지질이 상기와 같은 함량 범위로 고형 지질 나노입자의 쉘을 구성할 때, 고형 지질 나노입자가 많은 양의 약물을 봉입하면서도 세포막을 통과할 수 있는 크기로 형성되어 효율적으로 약물을 전달할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 쉘은 알부민이 접합된 콜레스테롤을 포함함으로써 쉘의 표면에 알부민이 노출되도록 하여 세포 내 약물 전달 효율을 극대화시킬 수 있다. 또한, 상기 쉘은 아포지단백을 실질적으로 포함하지 않는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 고형 지질 나노입자는 종래의 고형 지질 나노입자와 달리 아포지단백을 대체하여 양이온성 지질을 고형 지질 나노입자의 구성으로 포함함으로써, 상기 양이온성 지질에 의해 고형 지질 나노입자의 표면부(쉘)에 양이온 특성이 부여되어 약물을 결합시킬 수 있고, 세포막을 통과할 수 있는 크기로 고형 지질 나노입자를 형성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “실질적으로 포함하지 않는다”는 것은 고형 지질 나노입자의 전체 100 중량부를 기준으로 3 중량부 미만, 1 중량부 미만으로 포함되는 것을 의미한다.
또한, 상기 고형 지질 나노입자는 세포 내 약물 전달이 용이하도록 평균 입자 직경이 20 내지 200 nm일 수 있다.
예를 들어, 지단백 모방 고형 지질 나노입자가 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자일 경우, 평균 입자 직경은 20 내지 50 nm, 20 내지 45 nm, 25 내지 40 nm, 20 내지 40 nm 일 수 있다.
또한, 예를 들어, 지단백 모방 고형 지질 나노입자가 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자일 경우, 평균 입자 직경은 60 내지 200 nm, 60 내지 150 nm, 25 내지 40 nm, 20 내지 40 nm일 수 있다.
상기 고형 지질 나노입자는 균일한 입도 분포를 가질 수 있다. 상기와 같은 범위의 직경 및 균일한 입도 분포를 갖는 고형 지질 나노입자는 전신약물전달(systemic drug delivery)에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에서, 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자는 전체 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로,
콜레스테릴 에스테르 5 내지 30 중량부, 트리글리세라이드 0.01 내지 5 중량부, 알부민이 접합된 콜레스테롤 1 내지 20 중량부, 융합 유도성 지질 5 내지 40 중량부 및 양이온성 지질 10 내지 60 중량부를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자는 전체 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로,
콜레스테릴 에스테르 30 내지 60 중량부, 트리글리세라이드 0.01 내지 5 중량부, 알부민이 접합된 콜레스테롤 1 내지 20 중량부, 융합 유도성 지질 5 내지 40 중량부 및 양이온성 지질 10 내지 40 중량부를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 지단백 고형 지질 나노입자의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 유기용매에서 콜레스테릴 에스테르, 트리글리세라이드, 알부민이 접합된 콜레스테롤, 융합 유도성 지질 및 양이온성 지질을 혼합하여 지단백 모방 고형 지질 나노입자가 분산된 수성 분산액을 제조하는 단계를 포함한다.
또한, 상기 제조방법은 알부민이 접합된 콜레스테롤을 제조하는 단계; 및/또는 상기 수성 분산액을 투석하여 정제하고 농축시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 콜레스테릴 에스테르, 트리글리세라이드, 알부민이 접합된 콜레스테롤, 융합 유도성 지질 및 양이온성 지질 및 상기 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 모든 설명은 앞서 기술한 모든 내용을 그대로 적용할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 제조방법은,
i) 알부민이 접합된 콜레스테롤을 제조하는 단계;
ii) 유기용매에 콜레스테릴 에스테르, 트리글리세라이드, 알부민이 접합된 콜레스테롤, 융합 유도성 지질 및 양이온성 지질을 혼합하여 고형 지질 나노입자가 분산된 수성 분산액을 제조하는 단계; 및
iii) 상기 수성 분산액을 증류수로 일정 시간 간격으로 12 내지 36시간 동안 투석한 후 투석액을 농축시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 i) 단계는, 콜레스테롤 클로로포메이트를 유기용매에 용해한 후, 이 용액을 알부민 용액에 떨어뜨려 반응시키는 단계; 및 상기 반응용액을 증류수로 12 내지 36시간동안 투석한 후 동결건조시키는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 콜레스테롤 클로로포메이트와 알부민은 1:1 내지 5:1의 몰비로 사용되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 ii) 단계에서, 유기용매는 디메틸포름아마이드, 테트라하이드로퓨란, C1 내지 C4의 저급 알코올, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 아세톤, 디메틸설폭사이드, N-메틸피롤리돈, 다이옥산, 에틸아세테이트, 메틸에틸케톤, 아세토나이트릴 및 이들의 혼합물에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 유기용매는 고형 지질 나노입자의 제조 단계에서 모두 제거되기 때문에 유기용매로 인한 독성은 고려되지 않을 수 있다.
한 구체예에서, 상기 ii) 단계에서 유기용매는 클로로포름과 메탄올의 혼합물일 수 있다.
또한, 상기 ii) 단계에서, 유기용매에 콜레스테릴 에스테르, 트리글리세라이드, 알부민이 접합된 콜레스테롤, 융합 유도성 지질 및 양이온성 지질을 혼합하는 과정에서 상기 혼합물을 초음파 처리 및/또는 감압건조하는 과정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 지단백 모방 고형 지질 나노입자는 쉘의 표면에 노출된 양이온성 지질과의 정전기적 상호작용에 의해 각종 비수용성 약물 및/또는 핵산 유전자와 같은 약물의 전달체로서 사용될 수 있다. 이에, 본 발명은 상기 지단백 모방 고형 지질 나노입자를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 약물은 비수용성 약물, 핵산, 또는 비수용성 약물과 핵산을 동시에 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 비수용성 약물은 난용성 약물, 음이온을 띠는 펩타이드, 단백질, 히알루로닉산-펩타이드 접합체 또는 히알루로닉산-단백질 접합체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 난용성 약물은 파클리탁셀, 도세탁셀, 암포테리신, 독소루비신, 니페디핀, 프로포폴, 디아제팜, 에스트라디올, 사이클로스포린, 리토바비어, 사퀴나비어, 비페닐디메틸디카르복실레이트, 코엔자임 큐텐, 우루소데옥시콜린산, 일라프라졸, 이마티닙, 메실레이트, 아시클로비어, 알로퓨리놀, 아미오다론, 아자티오프린, 베나제프릴, 칼시트리올, 칸데살탄, 에프로사탄, 카르비도파/레비도파, 클라리쓰로마이신, 클로자핀, 데스모프레신 아세테이트, 디클로로페낙, 에날라프릴, 파모티딘, 펠로디핀, 페노피브레이트, 펜타닐, 펙소페나딘, 포시노프릴, 푸로세미드, 글리부라이드, 하이오스사이아민, 이미프라민, 이트라코나졸, 레보타이록신, 아토르바스타틴, 로바스타틴, 메클리진, 메게스테롤, 머캅토퓨린, 메톨라존, 모메타손, 나부메타손, 오메프라졸, 파록세틴, 프로파페논, 퀴나프릴, 심바스타틴, 시롤리무스, 타크롤리무스, 티자니딘, 플루바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 에피루비신 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, 상기 비수용성 약물은 난용성 약물일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 비수용성 약물 및/또는 핵산과 고형 지질 나노입자는 1:1 내지 1:10, 1:3 내지 1:8의 중량비로 복합체를 형성할 수 있다.
상기 복합체는 고형 지질 나노입자의 쉘에 비수용성 약물 및/또는 핵산이 상호작용에 의해 결합되어 있거나, 코어에 비수용성 약물 및/또는 핵산을 포집하는 형태를 모두 포함할 수 있다.
상기 핵산은 작은간섭리보핵산(siRNA), 리보좀 리보핵산(rRNA), 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 상보성 디옥시리보핵산(cDNA), 앱타머(aptamer), 전령 리보핵산(mRNA), 운반 리보핵산(tRNA) 및 안티센스 올리고디옥시뉴클레오타이드(AS-ODN)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, 상기 핵산은 siRNA일 수 있다.
특히 siRNA는 이중가닥 RNA(duplex RNA), 또는 단일가닥 RNA 내부에서 이중가닥의 형태를 띄는 단일가닥 RNA를 의미한다. 이중가닥 사이의 결합은 뉴클레오타이드 간의 수소결합을 통해 이루어지며, 이중가닥 내부의 모든 뉴클레오타이드가 상보적으로 완전히 결합해야 하는 것은 아니다. siRNA의 길이는 약 15 내지 60, 약 15 내지 50개, 약 15 내지 40개, 약 15 내지 30개, 약 15 내지 25개, 16 내지 25개, 19 내지 25개, 20 내지 25개, 또는 20 내지 23개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 siRNA 길이는 이중 가닥 RNA의 한쪽 뉴클레오타이드의 갯수, 즉, 염기쌍의 갯수를 의미하며, 단일 가닥 RNA인 경우에는 단일 가닥 RNA 내부의 이중 가닥의 길이를 의미한다. 또한 siRNA는 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반응을 약화시키는 등의 목적을 위해 다양한 작용기를 도입한 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다.
따라서, 본 발명의 siRNA는 전형적인 siRNA로부터 비변형 또는 변형된 형태 모두를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 지단백 모방 고형 지질 나노입자를 이용하여 표적세포에 비수용성 약물 및/또는 핵산을 전달하는 방법을 제공한다.
상기 방법은,
i) 비수용성 약물 및/또는 핵산과 상기 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 복합체를 형성하는 단계; 및
ii) 상기 복합체를 표적 세포에 형질감염시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 i) 단계에서, 복합체는, 예를 들어 인산완충식염수(PBS) 또는 탈염수 내에서 비수용성 약물 및/또는 핵산의 존재 하에 상기 지단백 모방 고형 지질 나노입자를 혼합하여 형성되는 것을 특징으로 하는데, 이때 상기 PBS는 pH 7.0 내지 8.0이며, NaCl을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 i) 단계에서, 비수용성 약물 및/또는 핵산과 고형 지질 나노입자는 1:1 내지 1:10, 1:3 내지 1:8의 중량비로 복합체를 형성할 수 있다.
또한, 본 발명은 KRAS를 표적으로 하는 비수용성 약물 또는 핵산이 포집된, 상기 지단백 모방 고형 지질 나노입자를 포함하는 KRAS 유전자 변이에 의해 유발되는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물에서, 비수용성 약물, 핵산 및 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자는 앞서 기술한 내용을 그대로 적용 또는 준용할 수 있다.
상기 KRAS 유전자 변이에 의해 유발되는 암은 예를 들어, 비소세포폐암, 대장암 또는 췌장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물에 있어서, KRAS를 표적으로 하는 비수용성 약물 또는 핵산이 포집된 지단백 모방 고형 지질 나노입자는 비수용성 약물 또는 핵산과 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 복합체 형태일 수 있다.
상기 복합체에 포함되는 비수용성 약물은 난용성 약물일 수 있다.
또한, 상기 복합체에 포함되는 KRAS를 표적으로 하는 핵산은 환원 가능한 핵산 다이머일 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예
지단백 모방 고형 지질 나노입자의 제조 과정 및 약물 전달체로서의 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 형태를 도식화하여 도 1에 나타내었다.
[제조예 1] 알부민이 접합된 콜레스테롤(콜레스테롤-알부민)의 제조
알부인이 접합된 콜레스테롤을 제조하기 위해, 인간 혈청 알부민(Human serum albumin(HSA), Sigma-Aldrich, Germany)과 콜레스테릴 클로로포메이트(Sigma-Aldrich, Germany)를 사용하였다.
먼저, 인간 혈청 알부민 0.5 mmol을 인산염완충식염수(PBS, pH 8.0) 2 mL에 용해시켰다. 1 mL의 DMF에 콜레스테롤 클로로포메이트 1.5 mmol를 용해하고, 이 용액을 인간 혈청 알부민 용액에 떨어뜨렸다. 이때, 콜레스테릴 클로로포르메이트와 인간 혈청 알부민은 3:1의 몰비로 사용되었다. 이후, 상온에서 밤새 약하게 흔들어 반응시킨 후, 반응 용액을 분자 컷오프 12000 g/mol 투석 튜브를 이용하여 3L의 증류수에 대해 3 시간동안 투석하고 증류수는 24 시간동안 3~4 시간 간격으로 교환하였다. 그 후, 생성물 용액을 동결건조하여 알부민이 접합된 콜레스테롤(이하, 콜레스테롤-알부민이라 함)을 제조하였다.
[제조예 2] 고밀도 지단백(HDL) 모방 고형 지질 나노입자(SLN)의 제조
HDL 모방 모방 SLN는 용매-유화법(solvent-emulsification method)을 일부 변형하여 제조하였다.
코어 구조 지질로 콜레스테릴 올레이트 및 트리올레인을 사용하였고, 표면(쉘) 구조 지질로 DOPE, 상기 제조예 1에서 제조된 콜레스테롤-알부민 및 DC-콜레스테롤을 사용하였다. 하기 표 1 및 2의 성분들을 2 mL의 클로로포름/메탄올 혼합물(2:1, v/v)에 용해시켰다. 여기에 10 mL의 탈이온수를 첨가하고 혼합물을 완전히 볼텍싱시켰다. 현탁액은 Branson Sonifier®(20 kHz, 듀티 사이클(duty cycle) = 40, 출력 제어 = 3.5)을 사용하여 5분동안 초음파 처리하였다. 유화된 용액을 회전 증발기로 옮기고, 용매는 콜레스테릴 올레에이트의 융점인 52℃ 이상의 온도에서 증발시켜 제거하였다. 마지막으로, HDL 모방 모방 SLN의 수성 분산액을 밤새 투석(MWCO: 5,000)하여 정제하고, 진공 증발을 통해 최대 5 mg particle/mL로 농축시켰다.
　 구성성분 (%) 실시예1-1 실시예1-2 실시예1-3 실시예1-4 실시예1-5 실시예1-6
코어 콜레스테릴
올레이트		 15 18 20 22.5 22.5 22.5
트리올레인 1 1 1 3 1.5 1.5
쉘 DOPE 28 28 28 14 14 7
콜레스테롤_알부민 3 4 5 10 10 10
DC-Chol 50 40 30 28 28 28
Z-평균 (Z-Ave) (d.nm) 40 36.7 ± 0.2 50.00 75.5 ± 0.06 75.04 ± 0.11 81.46 ± 0.18
다분산지수 (PdI) 0.21 0.279 0.2 0.191 0.198 0.207
제타-전위 (ZP) (mV) 85 66.3 65 88.25 ± 6.58 63.7 ± 3.82 77.75 ± 4.31
　 구성성분 (%) 실시예1-7 실시예1-8 실시예1-9 실시예1-10 실시예1-11 실시예1-12
코어 콜레스테릴
올레이트		 22.5 22.5 22.5 22.5 22.5 22.5
트리올레인 1.5 3 3 3 3 1.5
쉘 DOPE 14 7 7 14 7 7
콜레스테롤_알부민 5 5 10 5 5 5
DC-Chol 28 28 14 14 14 14
Z-평균 (Z-Ave) (d.nm) 68.07 ± 0.18 73.13 ± 2.21 116.4 ± 0.85 100.95 ± 0.49 101.25 ± 0.21 86.89 ± 1.01
다분산지수 (PdI) 0.200 0.216 0.193 0.190 0.201 0.170
제타-전위 (ZP) (mV) 97 ± 7.07 85.85 ± 6.15 72.7 ± 0.99 84.5 ± 7.92 81.15 ± 2.47 88.7 ± 3.25
또한, 제조된 HDL 모방 모방 SLN(실시예 1-1 내지 1-12)의 조성에 따른 입자 크기 및 제타 전위값을 비교하였다.
이때 음성 비교군으로는 실시예 1-2의 조성으로 제조하되, 콜레스테롤-알부민이 아닌 콜레스테롤을 사용하여 제조한 고형 지질 나노입자(SLN)를 사용하였다. 상기 SLN은 하기 실험예 1 내지 5에서의 HDL 음성 비교군으로 사용되었다.
그 결과, 상기 표 1 내지 2에서 보는 바와 같이, 콜레스테릴 올레이트 및 알부민이 접합된 콜레스테롤(콜레스테롤_알부민)의 양이 감소할수록 HDL 모방 모방 SLN의 크기가 감소하는 경향을 보였다. 또한, DC-Chol의 양이 증가할수록 HDL 모방 모방 SLN의 크기가 감소하는 경향을 도 2에서 확인하였다.
도 2의 결과에서는, 콜레스테릴 올레이트 및 콜레스테롤(콜레스테롤_알부민)의 함량이 클수록, DC-Chol의 함량이 적을수록 HDL 모방 모방 SLN의 Z-평균 값이 증가하는 경향을 확인할 수 있다.
이를 기반으로 실시예 1-2를 최적의 HDL 모방 모방 SLN의 조성으로 선정하였다.
[제조예 3] 저밀도 지단백(LDL) 모방 고형 지질 나노입자(SLN)의 제조
하기 표 3 내지 4의 성분 및 조성을 사용한 것을 제외하고는, 제조예 2와 같은 방법으로 LDL 모방 SLN를 제조하였다.
　 구성성분(%) 실시예2-1 실시예2-2 실시예2-3 실시예2-4 실시예2-5
코어 콜레스테릴
올레이트		 45 45 45 45 45
트리올레인 3 3 3 1.5 3
쉘 DOPE 14 7 14 7 22
콜레스테롤-알부민 10 10 5 5 10
DC-Chol 28 28 28 28 20
Z-평균 (Z-Ave) (d.nm) 68.27 ± 0.71 93.72 ± 0.10 85.36 ± 0.98 84.75 ± 0.24 101.2 ± 0.8
다분산지수 (PdI) 0.204 0.190 0.208 0.182 0.163
제타-전위 (ZP) (mV) 105.5 ± 2.12 42.3 ± 5.37 92.5 ± 6.51 32.6 ± 0.00 65.7
　 구성성분 (%) 실시예2-6 실시예2-7 실시예2-8 실시예2-9 실시예2-10
코어 콜레스테릴
올레이트		 45 45 45 45 45
트리올레인 1.5 1.5 1.5 3 1.5
쉘 DOPE 7 14 7 14 14
콜레스테롤-알부민 10 5 5 10 10
DC-Chol 14 14 14 14 14
Z-평균 (Z-Ave) (d.nm) 115.65 ± 0.78 108.85 ± 1.20 105.7 ± 1.13 116.1 ± 0.99 154.7±
1.27
다분산지수 (PdI) 0.169 0.148 0.166 0.174 0.166
제타-전위 (ZP) (mV) 80.15 ± 0.64 84.65 ± 4.74 81.5 ± 0.85 85.4 ± 1.41 73.1±2.69
또한, 제조된 LDL 모방 SLN(실시예 2-1 내지 2-10)의 조성에 따른 입자 크기 및 제타 전위값을 비교하였다.
이때 음성 비교군으로는 실시예 2-5의 조성으로 제조하되, 콜레스테롤-알부민이 아닌 콜레스테롤을 사용하여 제조한 고형 지질 나노입자(SLN)를 사용하였다. 상기 SLN은 하기 실험예 1 내지 5에서의 LDL 음성 비교군으로 사용되었다.
그 결과, 상기 표 3 내지 4에서 보는 바와 같이, 콜레스테릴 올레이트 및 알부민이 접합된 콜레스테롤(콜레스테롤-알부민)의 양이 감소할수록 LDL 모방 SLN의 크기가 감소하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있다. 또한, DC-Chol의 양이 증가할수록 LDL 모방 SLN의 크기가 감소하는 것을 확인할 수 있다(도 2).
도 2의 결과에서는, 콜레스테릴 올레이트 및 콜레스테롤(콜레스테롤-알부민)의 함량이 클수록, DC-Chol의 함량이 적을수록 LDL 모방 SLN의 Z-평균 값이 증가하는 경향을 확인할 수 있다.
이를 기반으로 실시예 2-5를 최적의 LDL 모방 SLN의 조성으로 선정하였다.
[실험예 1] 최적의 HDL 모방 SLN와 최적의 LDL 모방 SLN의 약물 봉입률 비교
하기 표 5 및 6의 조성으로 구성된 HDL 모방 SLN(실시예 1-2의 조성)와 LDL 모방 SLN(실시예 2-5의 조성)의 약물 봉입률을 비교하였다.
SLN (HDL 모방)
구성성분 비율 (%) (w/w) 함량 (mg)
코어(중심부) 콜레스테릴 올레이트 18 4.75
트리글리세라이드 1 0.26
쉘(표면부) 콜레스테롤(콜레스테롤_알부민) 4 1.05
DOPE 28 7.39
DC-chol 49 12.93
SLN (LDL 모방)
구성성분 비율 (%) (w/w) 함량 (mg)
코어(중심부) 콜레스테릴 올레이트 45 8.43
트리글리세라이드 3 0.56
쉘(표면부) 콜레스테롤(콜레스테롤_알부민) 10 1.87
DOPE 22 5.25
DC-chol 20 10.5
제제 유형 평균 직경 (nm) 다분산도 ζ-전위
LDL 음성 비교군 92.5 ± 1.6 0.187 69.0
LDL 모방 SLN 101.2 ± 0.8 0.163 65.7
HDL 음성 비교군 32.0 ± 0.3 0.276 70.7
HDL 모방 SLN 36.7 ± 0.2 0.279 66.3
입자 제제 단백질의 양 (nmol/mg)
LDL 음성 비교군 n.a
LDL 모방 SLN 7.29 ± 0.66
HDL 음성 비교군 n.a
HDL 모방 SLN 6.28 ± 0.13
그 결과, 상기 표 7 및 8에서 보는 바와 같이, HDL 모방 SLN 및 LDL 모방 SLN는 모두 우수한 약물 봉입율을 가지는 것을 확인할 수 있다.
보다 구체적으로, LDL 모방 SLN의 경우, HDL 모방 SLN에 비해 나노입자의 평균 입경이 2.5배 이상 큰 것으로 측정되었으나, 약물 봉입률은 유사한 수준인 것으로 나타났다. 이를 통해 HDL 모방 SLN가 보다 우수한 약물 봉입 효과를 갖는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 3a는 표 5의 조성을 가지는 SLN으로, LDL 음성 비교균(왼쪽 사진) 및 LDL 모방 SLN(오른쪽 사진)의 TEM 사진을 나타낸다. 또한, 도 3b는 표 6의 조성을 가지는 SLN으로, HDL 음성 비교균(왼쪽 사진) 및 HDL 모방 SLN(오른쪽 사진)의 TEM 사진을 나타낸다. 상기 도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 HDL 모방 SLN 및 LDL 모방 SLN 는 입자간 응집 없이 우수한 분산도를 가진 균일한 나노 입자임을 확인할 수 있다.
[제조예 4] 다이머 siRNA 제조
1) Kras siRNA 선정
Kras siRNA 서열은 3가지 라이브러리를 선정하여 연구를 진행하였다. 상기 3가지 서열은 공개되지 않은 것으로, Kras 자체는 자연적인 유전자이지만 Kras 유전자를 구성하는 전체 염기서열 중에 어떤 서열을 siRNA의 타겟 서열로 사용하는지는 연구자의 선택이다. 본 발명자들은 하기 표 9의 서열을 사용하였다. 본 실험에 사용된 모든 이중가닥 모노머 siRNA는 바이오니아(대전, 한국)에 합성 의뢰하여 구입하였다.
SEQ ID NO. 명칭 서열(5'->3')
1 Kras siRNA_#1_sense UGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGG
2 Kras siRNA_#1_antisense UUGACGAUACAGCUAAUUCAUA
3 Kras siRNA_#2_sense ACUGUACUCCUCUUGACCUGCU
4 Kras siRNA_#2_antisense CAGGUCAAGAGGAGUACAGUUA
5 Kras siRNA_#3_sense UAUAAUGGUGAAUAUCUUCAAA
6 Kras siRNA_#3_antisense UGAAGAUAUUCACCAUUAUAUA
7 Control siRNA_sense UGUGGUAGCUAUACGGAUAdTdT
8 Control siRNA_antisense UAUCCGUAUAGCUACCACAdTdT
2) siRNA 다이머 합성
절단 가능한 커플링제를 통해 연결된 환원성 다이머 siRNA를 합성하기 위해, 3'-말단(sense)에서 티올기로 변경된 이중가닥 모노머 siRNA(anti-Kras, 스크램블됨)를 사용하였다.
간단히 말해, 500 ㎕의 디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리된 탈이온수(DW)에서 50 nmol의 이중가닥 모노머 siRNA는 디메틸설폭사이드에 포함된 50 nmol의 절단 가능한 커플링제인 디티오-비스-말레이도에탄(DTME, 15.6㎍)으로 활성화되었다(siRNA:DTME의 몰 농도는 1:1). 음이온성이 높은 이중가닥 siRNA 사이의 전하 반발을 최소화하기 위해, 750 mM NaCl을 용액에 첨가하였다(최적 용액 pH 범위, 6.5 ~ 7.5). 상온에서 약하게 흔들면서 밤새 배양한 후, 생성된 다이머 siRNA를 DW에 대해 밤새 투석(MWCO: 10 kDa)하여 정제하고 진공 증발을 통해 1 nmol/㎕까지 농축하였다. 모노머 siRNA를 환원가능한 다이머 siRNA로 합성하는 과정을 도 4에 도식화하였다.
3) 다이머 siRNA의 해리
앞서 2)에서 합성한 다이머 siRNA는 세포 내에서 모노머의 형태로 작용하기 때문에, 모노머 siRNA로 다시 분리될 수 있어야 세포 내에서의 siRNA의 작용을 수행할 수 있다. 이에, 환원제인 디티오트레이톨(DTT)을 사용하여 환원성 다이머 siRNA인지 증명하기 위한 실험을 수행하였다.
다이머 siRNA에 대한 이황화 결합의 절단을 확인하기 위해, 100 nmol의 다이머 siRNA 샘플(100 ㎕)을 2 μmol의 디티오트레이톨(DTT, 100 ㎕)에서 밤새 상온에서 배양하였다. 용액의 최종 pH는 5M NaOH를 사용하여 8.0으로 조정하였다. 생성된 절단된 모노머 siRNA를 DW에 대해 밤새 투석(MWCO: 10 kDa)하여 정제하고 진공 증발을 통해 최대 1 nmol/㎕까지 농축하였다.
또한, 스크램블된 모노머 siRNA에 대한 서열을 갖는 비-커플링 연결된 다이머 siRNA를 바이오니아(대전, 한국)로부터 얻었다.
모든 결과 생성물, 모노머 siRNA, 절단 가능한 이황화 결합을 통해 연결된 다이머 siRNA, 절단된 모노머 siRNA 및 결합되지 않은 다이머 siRNA는 10% 폴리아크릴아마이드겔 전기영동(PAGE)로 분석하였다.
그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 다이머 siRNA가 모노머 siRNA로 절단되었음을 확인할 수 있었다.
[제조예 5] 다이머 siRNA와 지단백 모방 SLN의 복합체 제조
모노머, 절단 가능한 이황화 결합을 통해 연결된 다이머 siRNA 및 비-커플링 연결된 다이머 siRNA의 복합체들은 지단백 모방 SLN(실시예 1-2 및 실시예 2-5)를 사용하여 형성되었다. 각 siRNA(1.5 ㎍, 100 pmol)는 10분 동안 6의 중량비(siRNA/SLN)로 고형 지질 나노입자(SLN)와 복합체화되었다(siRNA/SLN 복합체).
복합체의 안정성을 조사하기 위해, 복합체에 다양한 헤파린/siRNA의 중량비(0, 1, 2, 5, 10, 20 및 50)로 헤파린을 첨가하고 37℃에서 30분동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 분해된 siRNA의 양을 1% 아가로스겔 전기영동으로 분석하였다.
혈청 안정성을 분석하기 위해, 복합체를 미리 결정된 시간(0, 2, 4, 8, 12, 24 및 48시간)동안 37℃, 50% v/v 혈청에서 배양하고, 생성된 샘플을 추가로 헤파린(100 ㎍) 및 DTT 용액(100 mM)으로 처리한 다음, 방출된 siRNA 분획을 대상으로 아가로스겔 전기영동을 수행하였다.
siRNA/SLN 복합체의 유체역학적 직경 및 표면 ζ-전위 값은 He-Ne 레이저 빔이 장착된 Zetasizer nano-series nano-ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK)를 사용하여 663 nm의 파장, 90°의 고정된 산란 각도에서 측정되었다. 측정은 모든 샘플에 대해 25℃에서 3회 수행되었다.
siRNA/SLN 복합체의 형태와 크기는 AFM(XE-100, Park Systems, Korea)으로 관찰하였다. AFM 분석을 위해, siRNA/SLN 복합체를 새로운 운모 표면에 두고 공기 중에서 건조시킨 다음 이미지를 312 kHz의 획득 주파수로 비접촉 모드로 기록하였다.
[실험예 2] siRNA/SLN 복합체의 세포 내 흡수 확인
제조예 5에서 제조한 siRNA/SLN 복합체의 세포 내 흡수를 확인하고 비교하기 위해, FITC 표지된 siRNA를 복합체화에 사용하고 세포 내 흡수를 유세포분석기(FACSCalibur, USA)로 분석하였다. 이때 세포는 H441 세포주를 사용하였다.
FITC-표지된 모노머 siRNA의 경우, 모노머 siRNA는 스크램블된 모노머 siRNA에 대한 서열로 3'-말단(sense)에서 티올기 변형과 함께 5'-말단(sense)에서 FITC에 의해 말단 표지되었고, 바이오니아(대전, 한국)에 합성 의뢰하여 구입하였다. FITC 표지된 다이머 siRNA는 다이머 siRNA 합성 섹션에 설명된대로 합성하였으며, 10% PAGE로 분석하였다.
세포를 웰당 2*104 세포수의 밀도로 6-웰 플레이트에 24시간동안 접종한 다음, 다이머 siRNA/SLN 복합체를 미리 정해진 시간(30분) 동안 37℃에서 각각 형질감염시켰다(128 nM의 siRNA). 배양 배지를 제거하여 세포 흡수를 중단시키고, 형질감염된 세포를 PBS로 3회 부드럽게 세척한 후 PBS에 분산시켰다. 세포의 형광은 FACSCalibur 유세포분석 시스템(BD Bioscience) 및 CellQuest 소프트웨어(PharMinutesgen)를 사용하여 측정되었다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 dimeric siRNA/albumin HDL은 실시예 1-2에 따른 HDL 모방 SLN를 사용한 경우이고, dimeric siRNA/LDL은 HDL 음성 비교군을 사용한 경우를 나타낸다. 또한, dimeric siRNA/albumin LDL은 실시예 2-5에 따른 LDL 모방 SLN를 사용한 경우이고, dimeric siRNA/LDL은 LDL 음성 비교군을 사용한 경우를 나타낸다.
그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, dimeric siRNA/albumin HDL 및 dimeric siRNA/albumin LDL에서 우수한 세포 내 흡수 정도를 보였으며, dimeric siRNA/albumin HDL에서 가장 높은 세포 내 흡수 정도를 보였다.
이러한 데이터는 알부민 융합된 HDL 모방 siRNA/SLN 복합체가 약 50 nm 크기의 나노입자 사이즈로 형성되어 세포내 흡수성이 가장 우수하여 효과적인 약물전달체로 사용될 수 있음을 시사한다.
[실험예 3] siRNA/SLN 복합체의 시험관 내 활성 확인
2가지 유형의 다이머 siRNA, Kras(내인성) 및 스크램블(대조군)에 의해 형성된 siRNA/SLN 복합체의 유전자 침묵 효과를 확인하고 비교하였다.
먼저, 실시예 1-2 및 실시예 2-5에서 제조된 지단백 모방 SLN과 복합체를 형성한 후 세포에 처리하고, Kras mRNA의 세포 수준에서 역전사 효소-중합 효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하여 유전자 침묵 효과를 확인하였다. 이때 세포는 H441 세포주를 사용하였다.
간단히 말해, 세포를 웰당 2*104 세포수의 밀도로 6-웰 플레이트에 24시간동안 파종한 다음 다양한 siRNA 농도에서 다이머 siRNA/SLN 복합체로 형질감염시켰다(각 그룹당 n=3). 3일간 배양한 후, 세포를 수거하고 제조사의 프로토콜에 따라 Trizol 시약을 사용하여 총 RNA를 분리하였다.
cDNA 합성은 제조사의 프로토콜에 따라 High Capacity RNA-to-cDNA 키트를 사용하여 수행되었다.
표적 유전자(인간 Kras) 및 대조군 유전자(인간 β-액틴)에 대한 DNA 증폭은 2분동안 94℃의 1 사이클; 및 30초동안 94℃, 30초동안 57℃, 1분동안 72℃의 30 사이클; 5분동안 72℃의 1 사이클의 열 순환 조건에서 프라이머 및 Prime Taq Premix로 수행되었다.
프라이머 서열은 하기 표 10의 서열을 사용하였다.
SEQ ID NO. 명칭 서열(5'->3')
9 Human_Kras_Primer_F AATTGTCCATCTACCATGG
10 Human_Kras_Primer_R GAGGTCAGCTGAAGCAAATCCAA
11 Human_β-actin_Primer_F CCCAAAGTTCACAATGTGGC
12 Human_β-actin_Primer_R AGGGAGACCAAAAGCCTTCA
PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분석하고, ImageJ 프로그램을 사용하여 각 밴드 강도를 정량화하였다.
그 결과를 도 7 및 8에 나타내었다. 도 7 및 8 (및 후술할 도 9 내지 12)에서 albumin HDL은 실시예 1-2에 따른 LDL 모방 SLN를 사용한 경우(즉, HDL 모방 siRNA/SLN 복합체 사용)이고, HDL은 HDL 음성 비교군을 사용한 경우를 나타낸다. 또한, albumin LDL은 실시예 2-5에 따른 LDL 모방 SLN를 사용한 경우(즉, LDL 모방 siRNA/SLN 복합체 사용)이고, LDL은 LDL 음성 비교군을 사용한 경우를 나타낸다.
그 결과, 도 7 및 도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 HDL 모방 siRNA/SLN 복합체에서 가장 우수한 kras 침묵 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, HDL 모방 siRNA/SLN 복합체의 우수한 약물 전달 효과를 확인할 수 있다.
[실험예 4] siRNA/SLN 복합체의 생체 내 활성 확인
1) 동물 모델 구축
이종이식 마우스 모델을 구축하기 위해 암컷 SPF BALB/C-nu 마우스(8주령)의 옆구리에 암세포(5*105 세포)를 피하주사하였다. 종양이 평균 부피가 50 내지 100 mm3에 도달하면 치료를 시작하였다.
2가지 유형의 모노머 또는 다이머 siRNA, Kras(내인성) 및 스크램블(대조군)의 유전자 침묵 효과를 조사하고 비교하기 위해, 실시예 1-2 및 실시예 2-5에서 제조된 지단백 모방 SLN과 복합체를 형성한 후 암컷 C57BL/6 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥으로 투여하고 종양 조직에서 마우스 Kras mRNA의 유전자 침묵 효과는 RT-PCR로 평가하였다.
간단히 말해, 제형은 각 마우스에 투여되도록 siRNA 농도로 PBS에 희석되었다. 24시간 처리 후, 종양 조직을 분쇄하고 균질화기(Tissuelyser, QIAGEN, Germany)로 조직 용해물을 제조하였다. 바로 제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA를 분리하고, β-액틴에 대해 정규화된 Kras mRNA 수준을 측정하였다.
RT-PCR의 경우, 표적 유전자(마우스 Kras) 및 대조군 유전자(마우스 β-액틴)에 대한 DNA 증폭을 프라이머 및 Primer Taq Premix로 2분동안 94℃의 1 사이클; 및 30초동안 94℃, 30초동안 57℃, 1분동안 72℃의 26 사이클; 5분동안 72℃의 1 사이클의 열 순환 조건에서 수행하였다.
프라이머 서열은 하기 표 11의 서열을 사용하였다.
SEQ ID NO. 명칭 서열(5'->3')
13 mouse_Kras_Primer_F TCCAACGATCATGGACTTCA
14 mouse_Kras_Primer_R CAGGACTTGGAGGTCTTGGA
15 mouse_β-actin_Primer_F TGTTACCAACTGGGACGACA
16 mouse_β-actin_Primer_R AAGGAAGGCTGGAAAA
PCR 산물은 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분석하고 ImageJ 프로그램을 사용하여 각 밴드 강도를 정량화하였다.
도 9 및 10의 결과에서도 볼 수 있듯이, 동물 모델에서도 앞선 결과(도 7 및 8)와 마찬가지로 본 발명에 따른 HDL 모방 siRNA/SLN 복합체에서 가장 우수한 유전자 전달 효과를 보였음을 확인할 수 있다.
[실험예 5] siRNA의 조직 분포 및 약동학적 프로파일 확인
마우스에서 다이머 siRNA에 의해 형성된 siRNA/SLN 복합체의 생체 분포 및 혈액 제거율(blood clearance)을 확인하고 비교하기 위해, 125I-표지된 siRNA를 Bolton-Hunter 방법을 사용하여 제조하고, 복합체화에 사용하였다.
먼저, 방사성-표지된 모노머 siRNA의 합성을 위해, Bolton-Hunter 시약인 N-숙신이미딜-3-(4-하이드록시페닐)프로피오네이트(N-succinimidyl-3-(4-hydroxyphenyl)propionate, SHPP)를 DMSO에 10 mg/ml의 농도로 용해시키고, 10 ㎕의 125I 용액(1 mCi)를 10 ㎕의 SHPP 용액에 첨가하였다. 클로라민-T를 10 mg/ml의 농도로 PBS에 용해시키고, 50 ㎕의 클로라민-T 용액을 SHPP의 요오드화를 위해 15초동안 격렬하게 혼합하면서 준비된 20 ㎕의 SHPP/125I 혼합물에 즉시 첨가하였다. 요오드화된 SHPP 용액을 벤젠/DMF 혼합물 1 mL(40:1, v/v)로 추출한 다음, 유기상을 깨끗한 튜브로 옮겼다. 유기용매를 증발하여 제거하고, 건조된 요오드화된 SHPP를 용해시키며, 4℃에서 2시간동안 10 nmol의 아민 작용화된 모노머 siRNA(100 ㎕)에 반응시켜 요오드화된 SHPP 상의 NHS기와 모노머 siRNA의 5'-말단에서 변형된 아민기를 공유 결합하였다. 125I-표지된 모노머 siRNA를 밤새 투석(MWCO: 5 kDa)하여 정제하였다(NHS기의 몰비, SHPP의 NHS기/모노머 siRNA의 아민기).
아민 작용화된 모노머 siRNA의 경우, 모노머 siRNA는 스크램블된 siRNA에 대한 서열을 갖는 3'-말단(sense)에서 티올기 변형과 함께 5'-말단(sense)에서 아민기에 의해 말단-표지되었고, 바이오니아(대전, 한국)에 합성 의뢰하여 구매하였다. 125I-표지된 다이머 siRNA는 다이머 siRNA 합성 섹션에 기술된 대로 합성되었고, 10% PAGE로 분석되었다.
주사 시점까지 방사성 붕괴에 대해 수정된 약동학적 프로파일은 암컷 SPC C57BL/6 마우스 그룹에서 혈액 샘플을 수집하여 측정되었다. 125I 표지된 모노머 또는 다이머 siRNA에 의해 형성된 siRNA/SLN 복합체를 정맥 내(iv) 주사한 후, 지정된 시간에 샘플링을 수행하였고, 수확된 샘플의 방사능은 γ 카운터(1470 자동 감마 카운터, Perkin Elmer, USA)를 사용하여 측정되었다. 실험에 사용된 시점은 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 24 및 48시간이었으며, 마우스 꼬리 정맥에서 약 2 ㎕의 혈액을 수집하여 혈액 응고를 방지하기 위해 8 ㎕의 EDTA 용액에 저장하였다(각 그룹에 대해 n=3).
생체 내 siRNA 조직 분포를 평가하기 위해, 125I 표지 된 다이머 siRNA에 의해 형성된 siRNA/SLN 복합체를 암컷 SPF C57BL/6 마우스에 정맥(iv) 주입을 통해 주사하였다. 주사 후 특정 시점(1, 4, 24 및 48 시간)에 마우스(n=3 마우스/시점)를 희생시키고 샘플 장기를 수확하여 무게를 쟀다. 생체 내 siRNA 조직 분포는 γ-카운터를 사용하여 측정된 각 조직의 방사능 수치로부터, 최초 주사 투여 시의 방사능 수치 대비 계산되었다(% of injection dose/gram).
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 모든 실험군 중 HDL 모방 siRNA/SLN 복합체(albumin HDL)에서 가장 우수한 혈액 안정성을 나타내어 가장 높은 혈중 반감기를 보였으며, 이로 인하여 시간이 경과할수록 암 조직에 siRNA가 많이 분포되어 있음을 확인할 수 있었다(도 12). 이를 통해, 본 발명에 따른 HDL 모방 siRNA/SLN 복합체가 암 조직으로의 약물 전달 효율이 가장 우수함을 확인하였다.
[실험예 6] 비수용성 약물 전달체의 제조
1) 비수용성 약물로 파클리탁셀(Taxol)이 봉입된 지단백 모방 SLN의 제조 (Taxol이 봉입된 SLN)
하기 표 12 및 13에 나타난 바와 같이 구성성분을 유리병에 담긴 2 mL의 클로로포름:메탄올(2:1) 용액에 용해시켰다. 10 mL의 증류수를 상기 유리병에 첨가하여 1분간 교반(vortexing)하여 섞어 주었고, 그 후 용액을 Branson 초음파 처리기 450(20kHz, 듀티 주기= 40, 출력 제어=3.5)으로 3분간 초음파 처리하였다. 용액을 회전식 증발기로 옮겼고, 용매인 클로로포름:메탄올 (2:1, v/v) 용액을 콜레스테릴 올레이트의 융점인 60℃ 이상의 온도에서 제거하였다. 증류수 안에서 하룻밤 동안 분획분자량(Molecular weight of cut-off, MWCO) 5000의 투석 막(dialysis membrane)을 이용하여 정제하였고, 정제된 비수용성 약물(taxol)이 봉입된 고형 지질 나노입자 용액은 4℃에서 보관하여 비수용성 약물(taxol)이 봉입된 고형 지질 나노입자(Taxol containing SLN)를 제조하였다.
여기서, HDL 모방 SLN을 사용한 경우 Taxol이 봉입된 HDL 모방 SLN로, LDL 모방 SLN 사용한 경우 Taxol이 봉입된 LDL 모방 SLN로 표현하였다.
구분 구성성분 함량 함량 비율 (%)
표면 지질부
(Surface lipid)		 DOPE 5.2 16.6
콜레스테롤 1.8 5.7
DC-콜레스테롤 10.5 33.4
코어 지질부
(Core lipid)		 콜레스테롤 올레이트 8.4 26.8
트리올레인 0.5 1.6
약물 (Core) 탁솔(파클리탁셀) 5 15.9
구분 구성성분 함량 함량 비율 (%)
표면 지질부
(Surface lipid)		 DOPE 245 15.2
콜레스테롤-알부민 206.25 12.8
DC-콜레스테롤 490 30.4
코어 지질부
(Core lipid)		 콜레스테롤 올레이트 618.75 38.4
트리올레인 41.25 2.6
약물 (Core) 탁솔(파클리탁셀) 10 0.6
2) Taxol이 봉입된 SLN의 물리화학적 특성 확인
실험예 6-1)에서 제조된 Taxol이 봉입된 HDL 모방 SLN 및 Taxol이 봉입된 LDL 모방 SLN의 평균 크기 및 제타 전위 측정은 레이저광 산란법으로 측정하였으며, 파장 632nm 및 검출각도 90°의 He-Ne 레이저가 탑재된 동적 광산란기(DSL)(Zeta-Plus, 브룩헤븐인스트루먼트사, NY)를 사용하여 측정하였다. 25℃의 증류수 내에 분산된 Taxol이 봉입된 HDL 모방 SLN 및 Taxol이 봉입된 LDL 모방 SLN의 농도가 5 mg/ml일 때, 크기를 3회 측정하였으며, 상기 Taxol이 봉입된 HDL 모방 SLN 및 Taxol이 봉입된 LDL 모방 SLN에 포함된 약물의 함량 및 봉입율을 평가하기 위해 고성능 액체 크로마토크래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 사용하였다. 상기 Taxol이 봉입된 HDL 모방 SLN 및 Taxol이 봉입된 LDL 모방 SLN 용액을 동결건조(Freeze drying)하여 증류수를 제거하였다. 동결건조된 비수용성 약물(taxol)이 봉입된 고형 지질 나노입자를 메탄올 20 ml에 분산시켜 완전히 녹인 후 필터(Millex SR 0.45um filter unit)를 통해 비수용성 약물을 추출한 후 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 봉입된 비수용성 약물의 양을 분석하였고, 그 결과를 아래의 표 14 및 15에 나타내었다. 이 때 약물의 농도에 따른 검량선(calibration curve)과 함께 비교하여 비수용성 약물의 양을 정량 분석하였고, 봉입된 비수용성 약물의 양(%, w/w) 및 봉입율(%)은 아래의 수학식 1 및 2를 사용하여 같이 분석하였다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2022007299-appb-img-000001
[수학식 2]
Figure PCTKR2022007299-appb-img-000002
크기 (nm) 표면전하 (mV) 약물 봉입 효율 (%) 약물 함량
(%, w/w)
120.1±2.4 76.1±8.4 69 11
크기 (nm) 표면전하 (mV) 약물 봉입 효율 (%) 약물 함량
(%, w/w)
115.1±2.4 76.1±8.4 93.2 14.9
상기 표 14는 Taxol이 봉입된 HDL 모방 SLN의 결과이고, 표 15는 Taxol이 봉입된 LDL 모방 SLN의 결과이다.
표 14 및 표 15에 나타난 바와 같이, Taxol이 봉입된 HDL 모방 SLN 및 Taxol이 봉입된 LDL 모방 SLN가 수용액 상에서 안정적인 물리화학적 특성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
보다 구체적으로, Taxol이 봉입된 HDL 모방 SLN의 경우, 입자의 무게 대비 11% (w/w)의 효율로 약물을 봉입하고 있었고, 115 내지 125nm 수준의 크기와 65 내지 85mV 수준의 표면전하를 가지는 Taxol이 봉입된 HDL 모방 SLN임을 확인하였다.
또한, Taxol이 봉입된 LDL 모방 SLN의 경우, 입자의 무게 대비 14.9% (w/w)의 효율로 약물을 봉입하고 있었고, 100 내지 130nm 수준의 크기와 65 내지 85mV 수준의 표면전하를 가지는 Taxol이 봉입된 LDL 모방 SLN임을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 콜레스테릴 에스테르, 트리글리세라이드, 알부민이 접합된 콜레스테롤, 융합 유도성 지질 및 양이온성 지질을 구성으로 하는 코어-쉘 구조의 지단백 모방 고형 지질 나노입자를 제조함으로써, 입자간의 응집을 막고 구조적 안정성을 확보할 수 있다. 또한, 생체이용률이 우수하고 약물 봉입 효율이 향상된 약물전달체를 제공할 수 있다.

Claims (24)

  1. 트리글리세라이드 및 콜레스테릴 에스테르를 포함하는 코어; 및
    알부민이 접합된 콜레스테롤, 융합 유도성 지질 및 양이온성 지질을 포함하는 쉘;을 포함하는
    지단백 모방 고형 지질 나노입자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    콜레스테릴 에스테르는 콜레스테롤에 탄소수 10 내지 24의 포화 또는 불포화 지방산이 에스테르 결합된 것인 지단백 모방 고형 지질 나노입자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    트리글리세라이드는 글리세롤 1 분자에 탄소수 10 내지 24의 포화 또는 불포화 지방산 3 분자가 에스테르 결합된 것인 지단백 모방 고형 지질 나노입자.
  4. 제 1 항에 있어서,
    알부민이 접합된 콜레스테롤은 콜레스테릴 클로로포메이트와 알부민의 반응물로,
    상기 콜레스테릴 클로로포메이트의 클로로포메이트기와 알부민의 아민기가 결합된 것인 지단백 모방 고형 지질 나노입자.
  5. 제 4 항에 있어서,
    알부민이 접합된 콜레스테롤에서 콜레스테릴 클로로포메이트와 알부민의 몰비는 1:1 내지 5:1인 지단백 모방 고형 지질 나노입자.
  6. 제 1 항에 있어서,
    융합 유도성 지질은 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine, DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylethanolamine, POPC), 에그 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine, EPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitorylphosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS), 및 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린]으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 지단백 모방 고형 지질 나노입자.
  7. 제 1 항에 있어서,
    양이온성 지질은 3-베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (MC-콜레스테롤), 3베타[N- (아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (AC-콜레스테롤), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤 (AC-토코페롤), N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤 (MC-토코페롤), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드 (DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 (DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민 (DODMA), N-(1-(2,3-디올레일)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), 1,2-디올레일-3-디메틸암모늄-프로판 (DODAP), 1,2-디올레일카바밀-3-디메틸암모늄-프로판 (DOCDAP), 1,2-디리네오일-3-디메틸암모늄프로판(Dilineoyl-3-Dimethylammonium-propane, DLINDAP), 디올레오일옥시-N-[2-스퍼민카복사미도)에틸}-N,N-디메틸-1-프로판아미늄트리플루오로아세테이트(DOSPA), 디옥타데실아미도글리실 스퍼민 (DOGS), 1,2-디미리스트릴옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE), 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디에녹시)프로판 (CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시]-3-다메틸-1-(시스,시스-9',12'-옥타데카디에녹시)프로판 (CpLinDMA), N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민 (DMOBA), 1,2-N,N'-디올레일카바밀-3-디메틸아미노프로판 (DOcarbDAP), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 1,2-디-O-옥타데세일-3-트리메틸암모늄프로판, 및 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 지단백 모방 고형 지질 나노입자.
  8. 제 1 항에 있어서,
    지단백 모방 고형 지질 나노입자는 20 내지 200 nm의 직경을 갖는 것인 지단백 모방 고형 지질 나노입자.
  9. 제 1 항에 있어서,
    지단백 모방 고형 지질 나노입자는 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자이고,
    전체 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로,
    콜레스테릴 에스테르 5 내지 30 중량부, 트리글리세라이드 0.01 내지 5 중량부, 알부민이 접합된 콜레스테롤 1 내지 20 중량부, 융합 유도성 지질 5 내지 40 중량부 및 양이온성 지질 10 내지 60 중량부를 포함하는 것인 지단백 모방 고형 지질 나노입자.
  10. 제 1 항에 있어서,
    지단백 모방 고형 지질 나노입자는 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자이고,
    전체 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로,
    콜레스테릴 에스테르 30 내지 60 중량부, 트리글리세라이드 0.01 내지 5 중량부, 알부민이 접합된 콜레스테롤 1 내지 20 중량부, 융합 유도성 지질 5 내지 40 중량부 및 양이온성 지질 10 내지 40 중량부를 포함하는 것인 지단백 모방 고형 지질 나노입자.
  11. 유기용매에서 콜레스테릴 에스테르, 트리글리세라이드, 알부민이 접합된 콜레스테롤, 융합 유도성 지질 및 양이온성 지질을 혼합하여, 지단백 모방 고형 지질 나노입자가 분산된 수성 분산액을 제조하는 단계를 포함하는,
    지단백 모방 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    제조된 수성 분산액을 투석하여 정제하고 농축시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    알부민이 접합된 콜레스테롤은 유기용매에 용해된 콜레스테릴 클로로포메이트와 알부민 수용액을 혼합하여 제조된 것인 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  14. 제 12 항에 있어서,
    알부민이 접합된 콜레스테롤에서 콜레스테롤과 알부민의 몰비는 1:1 내지 5:1인 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  15. 제 11 항에 있어서,
    유기용매는 디메틸포름아마이드, 테트라하이드로퓨란, C1 내지 C4의 저급 알코올, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 아세톤, 디메틸설폭사이드, N-메틸피롤리돈, 다이옥산, 에틸아세테이트, 메틸에틸케톤, 아세토나이트릴 및 이들의 혼합물에서 선택되는 것인 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  16. 제 11 항에 있어서,
    지단백 모방 고형 지질 나노입자의 직경은 20 내지 200 nm인 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  17. 제 11 항에 있어서,
    지단백 모방 고형 지질 나노입자는 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자이고,
    전체 고밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로,
    콜레스테릴 에스테르 5 내지 30 중량부, 트리글리세라이드 0.01 내지 5 중량부, 알부민이 접합된 콜레스테롤 1 내지 20 중량부, 융합 유도성 지질 5 내지 40 중량부 및 양이온성 지질 10 내지 60 중량부를 포함하는 것인 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  18. 제 11 항에 있어서,
    지단백 모방 고형 지질 나노입자는 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자이고,
    전체 저밀도 지단백 모방 고형 지질 나노입자 100 중량부를 기준으로,
    콜레스테릴 에스테르 30 내지 60 중량부, 트리글리세라이드 0.01 내지 5 중량부, 알부민이 접합된 콜레스테롤 1 내지 20 중량부, 융합 유도성 지질 5 내지 40 중량부 및 양이온성 지질 10 내지 40 중량부를 포함하는 것인 지단백 모방 고형 지질 나노입자의 제조방법.
  19. 제 1 항에 따른 지단백 모방 고형 지질 나노입자를 포함하는, 약물 전달용 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서,
    약물은 핵산 및 비수용성 약물 중 하나 이상을 포함하는 것인 약물 전달용 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    핵산은 siRNA, rRNA, RNA, DNA, cDNA, 앱타머, mRNA, tRNA 및 안티센스-올리고데옥시뉴클레오타이드(AS-ODN)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이고,
    상기 핵산은 상기 고형 지질 나노입자의 쉘의 양이온성 지질과 정전기적 상호작용에 의해 결합된 것인, 약물 전달용 조성물.
  22. 제 20 항에 있어서,
    비수용성 약물은 난용성 약물, 음이온을 띠는 펩타이드, 단백질, 히알루로닉산-펩타이드 접합체, 또는 히알루로닉산-단백질 접합체인, 약물 전달용 조성물.
  23. KRAS를 표적으로 하는 핵산 및 비수용성 약물 중 하나 이상; 및
    제1항에 따른 지단백 모방 고형 지질 나노입자를 포함하는,
    KRAS 유전자 변이에 의해 유발되는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    KRAS를 표적으로 하는 핵산은 환원가능한 핵산 다이머(dimer)인 KRAS 유전자 변이에 의해 유발되는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100085079A (ko) * 2007-10-17 2010-07-28 한국과학기술원 핵산 유전자 전달용 저밀도 지단백질 유사(ＬＤＬ―ｌｉｋｅ) 양이온성 나노입자, 그의 제조방법 및 이를 이용한 핵산 유전자의 전달 방법
KR20130049668A (ko) * 2011-11-04 2013-05-14 사회복지법인 삼성생명공익재단 저밀도 지단백질 유사 양이온성 나노입자로 된 혈액 뇌 장벽（ｂｂｂ） 수송 벡터
US20140094383A1 (en) * 2012-10-02 2014-04-03 Ohio State Innovation Foundation Tethered Lipoplex nanoparticle Biochips And Methods Of Use
CN107802508A (zh) * 2017-11-01 2018-03-16 武汉百思凯瑞纳米科技有限公司 一种阳离子脂质体纳米组合物及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100085079A (ko) * 2007-10-17 2010-07-28 한국과학기술원 핵산 유전자 전달용 저밀도 지단백질 유사(ＬＤＬ―ｌｉｋｅ) 양이온성 나노입자, 그의 제조방법 및 이를 이용한 핵산 유전자의 전달 방법
KR20130049668A (ko) * 2011-11-04 2013-05-14 사회복지법인 삼성생명공익재단 저밀도 지단백질 유사 양이온성 나노입자로 된 혈액 뇌 장벽（ｂｂｂ） 수송 벡터
US20140094383A1 (en) * 2012-10-02 2014-04-03 Ohio State Innovation Foundation Tethered Lipoplex nanoparticle Biochips And Methods Of Use
CN107802508A (zh) * 2017-11-01 2018-03-16 武汉百思凯瑞纳米科技有限公司 一种阳离子脂质体纳米组合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BATTOGTOKH GANTUMUR, KANG JI HEE, KO YOUNG TAG: "Long-circulating self-assembled cholesteryl albumin nanoparticles enhance tumor accumulation of hydrophobic anticancer drug", EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACEUTICS AND BIOPHARMACEUTICS, vol. 96, 1 October 2015 (2015-10-01), NL , pages 96 - 105, XP093009359, ISSN: 0939-6411, DOI: 10.1016/j.ejpb.2015.07.013 *
SAMOWITZ WS ET AL.: "Cancer Epidemiol", BIOMARKERS PREV, vol. 9, 2000, pages 1193 - 7

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