KR20130049668A

KR20130049668A - 저밀도 지단백질 유사 양이온성 나노입자로 된 혈액 뇌 장벽（ｂｂｂ） 수송 벡터

Info

Publication number: KR20130049668A
Application number: KR1020110114817A
Authority: KR
Inventors: 남도현
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2011-11-04
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2013-05-14

Abstract

본 발명은 ApoE 부재 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 양이온성 나노입자로 된 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터와 핵산 약물이 결합된 결합체를, 유효성분으로 함유하는 뇌 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물; 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터는 핵산 약물을 표적 세포에 전달하여 줄 뿐만아니라 BBB를 관통할 수 있으므로, 뇌 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 핵산 약물의 수송 벡터로 유용한다.

Description

저밀도 지단백질 유사 양이온성 나노입자로 된 혈액 뇌 장벽（ＢＢＢ） 수송 벡터 {VECTOR CONSISTING OF LDL-LIKE CATIONIC NANOPARTICLE FOR DELIVERING ACROSS BLOOD BRAIN BARRIER}

본 발명은 ApoE 부재 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 양이온성 나노입자로 된 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터와 핵산 약물이 결합된 결합체를, 유효성분으로 함유하는 뇌 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물; 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

혈관 뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB)은 뇌 실질을 전신 순환으로부터 분리하는 물리적 및 기능적 장애물로 작용함으로써 순환 독소로부터 뇌를 효과적으로 보호하지만, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 및 뇌암과 같은 뇌질환의 약리학적 치료에 있어서 주요 장애가 된다.

하전된 분자 및 크기가 700돌턴을 초과하는 분자는 대부분 혈관 뇌 장벽을 통과할 수 없다. 뇌 및 CNS의 질환 및 장애를 치료하기 위한 많은 치료제는 BBB를 직접 통과하지 못할 정도로 친수성이다. 또한, 이들 약제 및 제제는 혈액 및 말초 조직에서 분해되기 쉽기 때문에 치료학적으로 유효한 혈청 농도를 성취하는데 필요한 양이 증가한다.

약물을 BBB를 통과시켜 전달하는 방법은 하기와 같이 크게 3개의 카테고리로 나눌 수 있다: (1) 약물이 운반체 내에 포집되는 리포좀 형성 (2) 합성 중합체를 사용하여 정확하게 한정된 입자 크기 특성을 갖도록 제조되는 합성 중합체 형성 및 (3) 인슐린, 양이온화된 알부민 또는 트랜스페린 수용체에 대한 OX26 모노클로날 항체과 같은 운반체에 약물이 공유결합시킨 접합체 형성.

양이온화된 알부민과 같은 단백질, 또는 트랜스페린 수용체에 대한 OX26 모노클로날 항체인 수송 벡터는 각각 흡착 매개 및 수용체 매개 트랜스사이토시스에 의해 BBB를 통과한다. 이들은 소량의 약제를 수송하는데 사용되어 왔다.

리포좀은 수용액 중에서 인지질이 초음파처리되는 경우 자발적으로 형성되는 소형 입자이고 수성 환경을 포위하는 속빈(hollow) 구형 구조를 갖는 대칭적 지질 이중층으로 이루어진다. 인지질은 세포질막에 흡수되어 자동적으로 리포좀세포 배양물에 광범위하게 사용되어 내용물을 세포질로 방출할 수 있기 때문에 리포좀은 세포막을 통해 수용성 약제를 수송하는 매력적인 수단이다. 막에 나노공극을 생성시킬 수 있는 양이온성 지질을 사용할 수도 있다. 양이온성 지질은 DNA 분자와 같은 수용성 물질을 배양된 세포로 도입시킬 수 있게 한다. 리포좀은 거대 운반 능력을 가지고 있으나, 일반적으로 너무 거대하여 효과적으로 BBB를 통과하지 못하고 본래 불안정하며 이의 구성 지질은 혈장내 지질 결합 단백질에 의해 흡수되어 점차 소멸된다. 또한, 대형 크기의 리포좀은 뇌 흡수에 비정상적인 영향을 주는 미세뇌색전증을 유발할 수도 있다.

몇몇 연구에서, 리포좀은 안정화제로서, BBB를 붕괴시킬 수 있는 세제인 폴리소르베이트 80과 동시 투여된다. 이들 연구에서 폴리소르베이트 80에 의한 BBB의 붕괴는 BBB를 통과하는 수송에 관여할 수 있다. 1997년에, 데훅크(Dehouck et al.)등은 ApoE에 결합하는 LDL 수용체가 BBB를 통과하는 LDL의 트랜스사이토시스에 관여함을 발견하였다.

다형교모세포종(GBM)은 악성 뇌종양으로서, 외과적 절제술, 방사선치료, 및 화학치료와 같은 다영역 치료 접근에도 불구하고 GBM 환자의 예후는 좋지 않다. 더욱이, 뇌는 혈관뇌장벽(BBB)에 의해 특유의 면역 환경이 부여되었기 때문에 GBM은 특히 치료하기 어렵다. 현재까지, 현존하는 종양 약물은 BBB에 거의 불투과적이어서, GMB 치료에 있어서 새로운 약물 전달 방법 개발이 요구되었다.

RNA 간섭 현상의 조정자인 21-25bp 길이의 합성 소간섭 RNA(siRNA) 이합체가 포유동물 세포질에 함유된 상동성 mRNA의 분할을 촉발(trigger)하여 특이 유전자 발현을 억제할 수 있다는 사실이 입증된 이래, mRNA 레벨에서 대상 유전자를 선택적으로 기능억제(knock-down)하는 siRNA의 능력 때문에, 유전자 치료법을 통한 선천적 혹은 후천적 질환의 치료에 관련하여 상기 siRNA에 대한 관심이 증폭되었다.

siRNA은 유전자 치료법에서 유망한 약물 후보이지만, 세포내 및 세포외 장벽이 실제의 치료에 제약이 된다. siRNA의 음전하는, 수동 확산 및 이에 따른 저트랜스팩션 효능 탓에 세포면 또는 세포막 단면에 결합할 수 없기 때문에 세포 흡수율 저하를 야기한다. 또한, 주요한 세포외적 장애는 혈청 핵산분해 효소에 의한 화학 분해성이며, 따라서 siRNA의 혈액내 불안정성은 특히 정맥투여에서 문제가 된다. 이러한 장애를 극복하기 위해, 양이온성 지질계 트랜스팩션제 또는 폴리양이온계 담체가 전하상보성을 통한 착염 형성에 따른 siRNA 전달에 이용되었다.

특히, 폴리양이온성 폴리에틸렌이민(PEI)은 혈청 핵산분해 효소를 막기 위한 다합체(polyplex) 제형에 널리 이용되는 것으로서, 혈장막에 결합되어 세포이물질 흡수(endocytose)의 대상이 될 수 있다. 그럼에도 불구하고, PEI는 세포타살(necrosis) 또는 세포자살(apoptosis)을 통해 다수의 세포주에서 세포사멸을 촉발하고 이 세포독성은 분자량이 커질수록 및 분기화도(branching degree)가 커질수록 증가하는 것으로 밝혀졌다.

저분자량의 PEI 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)-그라프트 PEI 공중합체는 세포독성이 낮은 것으로 나타났으나, 양이온 고분자의 아민 밀도가 낮아 착염 응축이 적은 탓에 이들의 세포내 트랜스팩션은 활발치 않으며, 따라서 배지 내 효소 분해반응 및 불안정성이 증가하였다.

PEG 공액화된 siRNA 및 PEI(분자량 25K) 폴리전해질 착염(PEC) 마이셀은 원형의 siRNA보다 효소공격에 대한 안정성이 클 뿐만 아니라 유전자 침묵 효과도 훨씬 탁월함이 입증되었다.

천연 자원에서 유래된 비-합성 담체는 이의 세포독성을 낮출 수 있음과 동시에, 생체적합성 및 생분해성을 개선할 수 있기 때문에 siRNA 전달에 바람직하다.

자연계 담체의 구현예 중 하나는 면역반응을 촉발하지 않고 세망내피 체계(reticuloendothelial system: RES)가 인식하지 못하는 저밀도 지단백질(LDL)를 이용하는 것이다. 상기 LDL은 기본적으로 지질 및 단백질의 이동, 구체적으로는 계통순환 전체의 간외부 조직에 대한 콜레스테롤 전달에 관여한다.

실제로, 사이클로스포린 A 및 암포테리신 B 지질 착염(ABLC) 같은 비친수성 약물은 전임상(pre-clinical) 또는 임상(clinical) 치료시 LDL 입자와 결합함으로써 효과적으로 전달되었다. 또한 LDL은 스테아릴-폴리(L-리신)(스테아릴-PLL), 소위 TerplexDNA 체계와 결합함으로써 유전자 전달에 이용되었다. 상기 제형에서, 음전하 DNA와 상호반응한 PLL 성분 및 스테아릴기는 LDL과 소수성 상호반응을 일으킨다.

한편, 혈액에서 자연 LDL을 분리하는 방법은 너무 복잡하고 시간 소모가 크기 때문에, LDL 모방 모델인 재조합 LDL-유사 마이크로에멀전(LDE)은 아포지질 단백질이 함유되지 않은 콜레스테롤 에스테르 및 인지질로부터 개발되었다. LDE는 동물 연구 및 임상 치료에서 혈류 속에 주입시 자연 LDL처럼 작용하는 것으로 확인되었다.

본 발명자들은 한국 공개 특허 제10-2010-0085079호(한국 특허 출원 제 10-2010-7009411호)에 기재된 바와 같이, 암세포 표적화 부위들의 운송체 역할을 할 수 있는 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 고체 지질 나노입자(solid lipid nanoparticle , SLN)을 개발한 바 있다. 구체적으로, 상기 SLN은 siRNA를 운반하도록 고안되었다.

siRNA는 종양 세포들의 세포증식, 세포사멸, 혈관형성, 또는 이동을 조절하는 암유전자를 특이적으로 침묵시킬 수 있어서, 이를 위해 siRNA이 적절히 사용될 수 있는 것이 오랜 바램이었다. 그러나, 임상에서 siRNA의 적용은 생물학적 유체에서 siRNA의 불안정성 및 비특이적인 세포내 흡수로 인해 제한되어 왔다. 본 발명자들은 한국 특허 출원 제 10-2010-7009411호에 기재된 바와 같이, 체액 내 통상 존재하는 천연 저밀도 리포단백질 복합체들을 모방하여 표면개질 및 재구성한 양이온성 나노입자를 사용하여 시험관내에서 나노수준의 고분자 전해질(polyelectrolyte) 복합체 미셀을 형성하여 이러한 문제를 극복하였다. 이로 인해, siRNA 기반 치료법을 생체 내 전신 투여로 적용할 수 있게 되었으나, 이러한 siRNA-PEG/SLN이 세포에 트랜스펙션될 수 있음을 확인하였을 뿐, BBB도 효과적으로 통과할 수 있는지 확인하지는 않았다.

본 발명자들은 오르토토픽 인간 뇌 종양 마우스 모델에서 siRNA-PEG/SLN 전달 시스템이 BBB를 관통하여 종양부위로 전달되는지를 평가하기 위해, siRNA-PEG/SLN를 전신적 정맥 투여한 결과, 종양에 특이적으로 siRNA를 전달하였으며, 종양세포 증식 및 종양 유발(tumorigenicity)을 낮추었다는 것을 확인하였으며, 본 발명은 이에 기초한 것이다.

본 발명은 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터를 제공하는 것이 목적이다.

또한, 본 발명은 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터 및 핵산 약물이 결합된 결합체를 유효성분으로 함유하는 뇌 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이 다른 목적이다.

나아가, 본 발명은 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터를 사용하여 뇌 질환 예방 또는 치료용 약제를 제조하는 방법을 제공하는 것이 또다른 목적이다.

본 발명의 제1양태는, 콜레스테릴 에스테르 및 트리글리세라이드를 함유하는 코어지질부; 및 상기 코어지질부의 상층면에 소수성 상호반응에 의해 결합되어 있으며, 콜레스테롤, ApoE 없이 인지질 및 양이온성 지질을 함유하는 양이온성의 표면지질부;를 포함하는 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 양이온성 나노입자로 된 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터를 제공한다.

본 발명의 제2양태는, 콜레스테릴 에스테르 및 트리글리세라이드를 함유하는 코어지질부; 및 상기 코어지질부의 상층면에 소수성 상호반응에 의해 결합되어 있으며, 콜레스테롤, ApoE 없이 인지질 및 양이온성 지질을 함유하는 양이온성의 표면지질부;를 포함하는 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 양이온성 나노입자로 된 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터; 및 상기 수송 벡터 표면에 정전기력에 의해 핵산 약물이 결합된 결합체를, 유효성분으로 함유하는 뇌 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 제3양태는, 콜레스테릴 에스테르 및 트리글리세라이드를 함유하는 코어지질부; 및 상기 코어지질부의 상층면에 소수성 상호반응에 의해 결합되어 있으며, ApoE 없이 콜레스테롤, 인지질 및 양이온성 지질을 함유하는 양이온성의 표면지질부; 를 포함하는 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 양이온성 나노입자를 준비하는 제1단계; 및 상기 양이온성 나노입자 표면에 정전기력에 의해 뇌 질환 예방 또는 치료용핵산 약물을 결합시켜 결합체를 형성하는 제2단계를 포함하는, 뇌 질환 예방 또는 치료용 약제의 제조 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 자세히 설명한다.

자연 LDL은 두 개의 지질상 즉, 극성 구성성분(인지질 및 아포지질 단백질) 및, 콜레스테롤 에스테르와 트리글리세라이드로 사전 구성된 비극성 중성 지질로 이루어지며, 조성 및 물리화학적 특성은 표 1과 같다. 인지질 및 아포지질 단백질은 비극성 지질을 유화시켜 표면의 안정성을 제공하며 따라서, 안정된 생물학적 마이크로에멀전을 형성할 수 있다.

리포좀은 일반적으로 BBB를 통과하지 못한다. LDL의 transcytosis에는 ApoE에 결합하는 LDL 수용체가 관여하므로, 종래 개발된 인공 LDL 입자는 표면층에 ApoE를 포함하고 있어서, BBB를 통과할 수 있었다.

그러나, 본 발명에 따라 제조된 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 양이온성 나노입자는 표면지질부에 ApoE를 포함하고 있지 않음에도 불구하고 BBB를 통과하여 뇌로 핵산 물질을 전달할 수 있음을 확인하였다.

또한, 일실시예에서 siRNA-PEG 복합체가 시험관에서 암세포에 특이적으로 전달되는 표적화 능력을 증명하였으며, 처음으로 이들 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 양이온성 나노입자가 생체 내에서 비독성 및 혈청-안정성이면서 siRNA를 종양 부위에 특이적으로 전달하는데 매우 효과적인 운반체로서 사용될 수 있다는 것을 보여주었다.

따라서, 본 발명은 본 발명에 따라 표면지질부가 ApoE 없이 제조된 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 양이온성 나노입자를 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터로 사용하는 것을 특징으로 한다.

혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터는 양이온성의 표면지질부가 아포지질 단백질(Apolipoprotein)을 함유하고 있지 아니할 수도 있다. 또한, 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터는 아포지질 단백질을 갖고 있는 천연 저밀도 리포단백질과 다르게, BBB 관통 수송 벡터로서의 기능을 위하여 표면지질부가 변화될 수도 있다.

본 발명의 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터는 핵산 운반용으로 사용될 수 있다. 본 발명의 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터 중 양이온성 지질은 핵산과 정전기적 결합을 통하여 결합하여 핵산/지질 복합체를 형성할 수 있다.

본 발명의 핵산은 소간섭 리보핵산(siRNA), 리보좀 리보핵산(rRNA), 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 상보성 디옥시리보핵산(cDNA), aptamer, 전령 리보핵산(mRNA), 운반 리보핵산(tRNA) 및 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(AS-ODN)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

특히 siRNA는 이중 가닥 RNA (duplex RNA), 혹은 단일 가닥 RNA 내부에서 이중 가닥의 형태를 띄는 단일 가닥 RNA를 지칭한다. 이중 가닥 사이의 결합은 뉴클레오티드 간의 수소 결합을 통해 이루어지고, 이중 가닥 내부의 모든 뉴클레오티드가 상보적으로 완전 결합해야 하는 것은 아니다. siRNA의 길이는 약 15 내지 60, 15 내지 50 또는 15 내지 40 (이중 가닥 RNA의 한쪽 뉴클레오티드의 갯수, 즉, 염기쌍의 갯수를 의미하며, 단일 가닥 RNA인 경우에는 단일 가닥 RNA 내부의 이중 가닥의 길이를 의미한다.) 뉴클레오티드이며, 전형적으로 약, 15 내지 30, 15 내지 25 또는 16 내지 25개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 19 내지 25, 21 내지 25 또는 21 내지 23 개인 뉴클레오티드인 siRNA를 포함한다. 또한 siRNA는 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반응을 약화시키는 등의 목적을 위해 다양한 작용기를 도입한 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.

따라서, 본 발명의 siRNA는 전형적인 siRNA로부터 비변형 또는 변형된 형태일 수 있다. 예를 들어, siRNA의 한쪽 말단이 폴리에틸렌글리콜로 수식될 수 있다. 폴리에틸렌글리콜(PEG)는 친수성, 유연성 및 비이온성 고분자이므로 단분자형 대식세포계(MPS)의 마크로파지가 인식하지 않도록, 입상계를 개질시키고 담체에 대해 장기순환성을 부여하는 가장 일반적인 재료 중 하나이다. 본 발명의 일실시예에서 PEG의 분자량이 5000달톤인 경우 RNase 소화에 대해 siRNA를 충분히 보호하는 동시에 siRNA의 효과적인 트랜스팩션 성능을 계속 유지할 수 있다.

RNA 간섭은 특이적 mRNA 분해를 통해 유전자 발현을 저해하는 강력한 도구이다. 그러나, 생체 내 siRNA 적용시 siRNA의 불안정성 및 표적 세포 및 조직으로의 전달 문제점으로 인해 상당히 제한을 받는다. 특히, 뇌종양 중 가장 흔하면서 악성 형태인 교모세포종(GBMs)의 경우, 혈액 뇌 장벽(blood-brain barrier)의 불투과성 문제로 인해 치료에 제한을 받아 왔다.

siRNA는 유전자 치료에서 유망한 핵산 약물임에도 불구하고, 다양한 세포내 및 세포외 장벽들이 siRNA의 치료적 적용을 방해한다. 음전하를 띠는 siRNAs는 지극히 낮은 세포 내로의 섭취 및 형질전환 효율을 가지며, 정맥으로 투여시 신속하게 화학적으로 분해된다.

그러나, 본 발명의 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터는 siRNA의 생체 내 안정성 문제를 해결할 뿐만아니라, BBB를 관통할 수 있는 siRNA용 전달 시스템으로 사용될 수 있다.

구체적인 실시예에서, 본 발명의 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터가 BBB를 쉽게 통과할 수 있어서 GBM의 표적화된 치료가 가능함을 입증하였다. GBM 환자에서 c-Met 과발현이 나쁜 예후 및 종양 침습성과 관련이 있기 때문에, c-Met을 표적화하려고 선택하였고, 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터로 아포지질 단백질을 제외한 저밀도 리포단백질의 천연 성분들을 재구성하여 제조된 양이온성 고체 지질 나노입자(SLN)을 사용하였고, 페길화된 c-Met siRNA에 결합시켜, c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체를 제조하였다. 또한, c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체가 c-Met 발현 레벨을 효율적으로 하강 조절할 뿐만 아니라 시험관내에서 U-87MG에서 세포의 증식을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 오르토토픽(orthotopic) U-87MG 이종이식 종양 모델에서, 상기 복합체를 정맥 투여한 경우, 종양 조직에서 c-Met 발현이 현저하게 억제되었고, 마우스에서 전신 독성 없이 종양 성장이 억제되었다. 또한, Cy5.5이 결합된 SLN 사용시, 뇌종양에 특히 siRNA-PEG/SLN 복합체의 축적이 강화된 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 결과들은 siRNA 치료제가 본 발명에 따른 혈액 뇌 장벽(BBB) 수송 벡터와 함께 사용되면 GBM의 전신 치료와 같은 뇌질환 전신 치료(systemic treatment)가 가능함을 뒷받침해준다.

본 발명에 따른 혈액 뇌 장벽(BBB) 수송 벡터를 구성하는 콜레스테릴 에스테르는 콜레스테롤에 탄소수 10 내지 24개의 포화 또는 불포화 지방산이 에스테르 결합된 것이다. 바람직하기는, 올레인산 같은 탄소수 16 내지 18개의 불포화지방산의 에스테르일 수 있다. 또한, 단일 또는 여러 종류의 콜레스테릴 에스테르를 포함할 수 있다.

본 발명에서, 트리글리세라이드는 다양한 지방산의 조성을 가지는 정제 트리글리세라이드이거나, 다수 지방산으로 구성된 트리글리세라이드를 주성분으로 하는 식물유일 수 있다. 바람직하게는, 트리글리세라이드 동물성 또는 식물성 기름(oil)일 수 있으며, 대두유, 올리브유, 면실유, 참깨유, 간유 등을 포함한다. 상기 기름은 단독 또는 여러 종류의 기름이 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명에서, 콜레스테릴 에스테르 및 트리글리세라이드는 소수성 결합을 통해 저밀도 지단백질 유사 양이온성 나노입자의 코어 지질부를 형성한다.

본 발명에서, 인지질은 나노입자를 형성할 수 있는 어떠한 종류의 중성, 양이온성, 음이온성일 수 있으며, 단일 또는 다수 종류의 인지질의 혼합물일 수 있다. 상기 인지질은 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 이들의 lyso형태, 탄소수 6 내지 24의 지방족 쇄를 가지는 완전히 포화된 또는 부분 경화된 형태일 수 있다. 본 발명의 인지질은 이에 한정되지는 않지만, dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC), egg phosphatidylcholine (EPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), 및 dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG)으로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택된다.

본 발명의 인지질 및 콜레스테롤은 핵산의 트랜스팩션 효율을 향상시키고, 조합된 양이온성 지질의 세포독성을 감소시키는 헬퍼 지질의 역할을 한다. 엔도솜(endosome) 파괴에 수반되는 세포간막 및 세포내막을 가진 양이온성 지질의 융해를 촉진하는 역상 육각형 구성을 채택함으로써, 인지질의 융해성은 높은 탈안정화 효과를 층상구조에 부여하여 헬퍼의 활성에 기여한다. 또한, 콜레스테롤은 지질 충전에 형태적 측면에서 견고성을 부여하며, 따라서 헬퍼의 활성과 함께 나노입자의 안정성도 향상시킨다.

본 발명의 양이온성 지질은 생리학적 pH와 같이 특정 pH에서 순 음전하를 띠는 양이온성 지질을 포함한다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 양이온성 지질은 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (MC-콜레스테롤), 3베타[N- (아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (AC-콜레스테롤), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤 (AC-토코페롤), N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤 (MC-토코페롤), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드 (DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 (DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민 (DODMA), N-(1-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA), 1,2-Dioleoyl-3-Dimethylammonium-propane (DODAP), 1,2-Dioleoylcarbamyl-3-Dimethylammonium-propane(DOCDAP), 1,2-Dilineoyl-3-Dimethylammonium-propane (DLINDAP), Dioleoyloxy-N-[2-sperminecarboxamido)ethyl}-N,N-dimethyl-1-propanaminiumt-rifluoroacetate (DOSPA), Dioctadecylamidoglycyl spermine (DOGS), 1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide (DMRIE), 3-Dimethylamino-2-(Cholest-5-en-3-beta-oxybutan-4-oxy)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxy) propane (CLinDMA), 2-[5'-(cholest-5-en-3.beta.-oxy)-3'-oxapentoxy)-3-dimethyl-1-(cis,cis-9',12'-octadecadienoxy)propane (CpLinDMA), N,N-Dimethyl-3,4-dioleyloxybenzylamine (DMOBA), 1,2-N,N'-Dioleylcarbamyl-3-dimethylaminopropane (DOcarbDAP), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 및 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP)으로 이루어지는 군에서 하나이상 선택된다.

특히 DC-콜은 기타 양이온성 지질보다 그 독성이 약하며, DC-콜 계열의 유전자 담체가 흑색종, 낭포성 섬유종, 자궁경부암, 유방암 및 난소암 등 여러 질환의 임상 치료에 사용 승인을 받은 만큼, DC-콜을 포함하는 것이 바람직하다.

바람직하게는 본 발명의 일실시예에서, 콜레스테릴 에스테르 및 트리글리세라이드를 함유하는 코어지질부; 및 상기 코어지질부의 상층면에 소수성 상호반응에 의해 결합되어 있으며, 콜레스테롤, 디올레오일포스페파티딜에 탄올아민(DOPE) 및 3β[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]-콜레스테롤(DC-콜)을 함유하는 양이온성의 표면지질부; 를 포함한다.

본 발명에 의한 상기 핵산 전달용 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 양이온성 나노입자는 콜레스테릴 에스테르 30 내지 60 중량％, 트리글리세라이드 0.1 내지 10 중량％, 콜레스테롤 5 내지 20 중량％, 인지질 5 내지 30 중량％, 및 양이온성 지질 10 내지 50중량％를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 콜레스테릴 에스테르 40 내지 50 중량％, 트리글리세라이드 1 내지 5 중량％, 콜레스테롤 8 내지 12 중량％, 인지질 12 내지 16 중량％, 및 양이온성 지질 25 내지 30 중량％를 함유한다.

또한, 본 발명의 코어 지질부와 표면 지질부의 중량비는 나노 입자의 중량을 기준으로 30:70 내지 70:30, 바람직하게는 40:60 내지 60:40, 더 바람직하게는 45:55 내지 55:45이다.

본 발명의 일실시예에서, CLM에서 인지질 : 콜레스테롤 : 양이온성 지질 간의 몰비는 9.4 : 13 : 26 이며 양이온성 지질/헬퍼 지질의 몰비는 등몰비를 제공하는 값인 1.16일 수 있다.

본 발명에서 양이온성 지질과 핵산의 N/P 비율은 약 0.1 내지 128, 바람직하게는 0.5 내지 32, 보다 바람직하게는 1 내지 16일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 양이온성 지질과 핵산의 중량비는 1.4 내지 32, 바람직하게는 2.8 내지 16.8이다.

본 발명의 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터를 사용하여 예방 또는 치료할 수 있는 질환의 비제한적인 예로는 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 세균성 및 바이러스성 감염 및 암과 같은 뇌 질환 및 중추 신경계(CNS) 질환이 있다. 본 발명에서 뇌 질환에는 중추 신경계(CNS) 질환도 포함한다.

본 발명의 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터는 뇌에서 생체내 생리학적 효과를 발휘할 수 있는 핵산을 뇌의 표적 세포에 접근하게 할 수 있다.

뇌 세포의 예로는 뉴런, 아교세포(성상세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포), 뇌혈관세포(근육세포, 내피세포), 및 수막을 구성하는 세포가 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 뇌 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 아울러, 상기 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체를 추가로 포함할수 있다. 상기 담체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 적소두 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 뇌 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, siRNA와 같은 핵산 약물을 포함하는 본 발명의 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10mg/kg로 투여함이 바람직하고, 상기 벡터를 포함하는 본 발명의 조성물은 성인 1인당 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1 mg/kg으로 투여함이 바람직하며, 본 발명의 뇌 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

본 발명의 뇌 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여 대상인 환자는 포유 동물, 바람직하게는 사람, 원숭이, 설치류 (마우스, 래트 등) 등일 수 있다.

본 발명에 따른 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터는 핵산 약물을 표적 세포에 전달하여 줄 뿐만아니라 BBB를 관통할 수 있으므로, 뇌 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 핵산 약물의 수송 벡터로 유용하다.

본 발명에 따른 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터는 RNAi-기반 유전자 표적화를 위한 실행가능한 플랫폼으로 제공하면서, 주어진 종양의 최적화된 타겟에 대한 siRNAs의 사용 시 임상학적 원리(clinical rationale)를 제공한다.

도 1은 고체 지질 나노입자(SLN)의 특징을 보여주는 도면이다. 도 1A는 SLN의 크기 분포를 도시한 그래프이고, 도 1B는 동적 광산란(DLS)에 의해 측정된 SLN의 제타 전위 값이며, 도 1C는 SLN의 TEM 사진이고, 도 1D는 SLN의 AFM 이미지이다.(스케일 바는 500 nm임).
도 2는 U87MG 세포 증식에 있어서 MET 방해 효과를 나타내는 도면이다.
도 2A는 비표적화된(NT) siRNA-PEG/SLN 복합체 또는 c-Met (Met) siRNA-PEG/SLN 복합체로 형질전환된 U87MG의 웨스턴 블롯팅 분석 결과이다. 내재적인 인간 β-액틴을 대조군으로 사용하였으며, c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체는 효율적으로 c-Met 단백질 레벨을 감소시켰다.
도 2B는 c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체의 형질전환에 의한 세포 증식의 저해를 보여주는 그래프이다.
값은 평균값 ± SEM 을 의미한다(대조군 대비 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 3은 이종 이식 종양에서 생체 내 c-Met 표적화를 보여주는 도면이다.
도 3A는 오르토토픽 이종이식 모델에서 c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체의 생체 내 항-종양 활성 평가를 위한 시간 스케쥴이다.
도 3B에 따르면, c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체는 투여량 의존 방식으로 U-87MG 종양 부피를 감소시켰다.
데이터는 평균값 ± SE 로 표시하였다.
도 3C는 대조군 siRNA 또는 MET siRNA 처리 마우스 뇌에서 MET 발현을 확인하는 면역 조직학적 현미경사진이다. 면역-양성인 세포를 갈색 DAB 염색으로 시각화하였다.
값은 평균값 ± SEM 을 의미한다(대조군 대비 *p<0.05, **p<0.01).
도 4는 종양을 가진 마우스에서 c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체의 생체 내 광학 이미징을 보여주는 도면이다.
도 4A는 교모세포종 동물 모델을 사용한 세부 실험 스케쥴이 도시되어 있다.
도 4B는 교모세포종 세포를 가진 뇌에서 Cy5.5로 라벨된 c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체의 분포를 생체 내 형광 광학 이미징에 의해 시각화한 것이다.
값은 평균값 ± SEM을 의미한다(대조군 대비 **p<0.01).
도 5는 고체 지질 나노입자(SLN)의 제조를 위한 저밀도 지단백(LDL), DOPE 및 DC-콜의 지질 부분 배열에 관한 개략도로서, 양전하 SLN 표면 및 음전하 siRNA 간의 정전기 상호작용에 의한 siRNA-PEG/SLN 착염의 제형화 과정도 도시되었다.

실시예 1: 고체 지질 나노입자( SLN ) 준비

실시예에서 사용되는 고체 지질 나노입자(SLN)는 한국 특허출원 10-2010-7009411호에 기재된 방법에 따라 제조된 것(도 5 참조)을 사용하였다. 이의 제조 공정은 하기와 같다.

콜레스테릴 올레이트, 글리세릴 트리올레이트(트리글리세라이드), 에스테르화 되지 않은 콜레스테롤은 각각 Sigma사에서 구입한 것이다. L-알파-디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE) 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]-콜레스테롤 히드로클로라이드는 Avanti Polar lipids사의 제품이었다.

고체 지질 나노입자(SLN)을 변형 용매 유화법으로 조제하였다. 즉, 22.5mg(45중량％)의 콜레스테릴 올레이트, 1.5mg(3중량％)의 글리세릴 트리올레이트, 7mg(14중량％)의 DOPE, 5mg(10중량％)의 에스테르화 되지 않은 콜레스테롤 및 14mg(28중량％)의 DC-콜레스테롤을 유리병에 담긴 2mL의 클로로포름 : 메탄올(2:1) 용액에 용해시켰다. CLM에서 DOPE : 콜레스테롤 : DC-콜 간의 몰비는 9.4 : 13 : 26 이며 양이온성 지질/헬퍼 지질의 몰비는 유효 조성물에 대해 거의 이상에 가까운 등몰비를 제공하는 값인 1.16 였다.

10mL의 증류수를 상기 병에 첨가하여 충분히 저어 주었다. 상기 현탁액을 Branson 초음파 처리기 450 (20kHz, 듀티 주기= 40, 출력 제어=3.5)로 3분간 초음파 처리하였다.

마이크로에멀전을 회전식 증발기로 옮기고, 용매는 콜레스테릴 올레이트의 융점보다 높은 60℃의 온도에서 제거하여, 상기 조제된 마이크로에멀전을 4℃에서 보관하였다.

전술한 바와 같이, 동적광산란법 장치(Zeta-Plus, Brookhaven Instrument Co., 뉴욕)를 사용하여 직경 및 표면 제타 전위를 측정하였다.

상기 SLN은 원자력 현미경(AFM; PSIA XE-100, Park Systems, Santa Clara, CA) 및 투과 전자 현미경(TEM; Zeiss Omega 912, Carl Zeiss, Oberkochen ,Germany)으로 관찰하였다.

레이져 광산란에 의해 측정된 SLN의 평균 직경은 117.4 ± 11.7 nm (도 1A)였고, SLN의 제타 전위값은 37.3±2.3 mV이었으며, 이는 상기 복합체가 양호한 안정성을 가질 수 있다는 것을 의미한다(도 1B). TEM(도 1C) 및 AFM(도 1D)으로 관찰하여 SLN의 크기와 구형 모양을 확인하였다.

실시예 2: siRNA - PEG / SLN 복합체의 형성

센스 가닥을 3′-헥실아민으로 변형시킨, 인간 c-Met 표적화 siRNA (센스; 5′- GUGCAGUAUCCUCUGACAGUU-(CH₂)₆ NH₂-3', 안티센스; 5′- CUG UCA GAG GAU ACU GCA CUU-3′) 및 비표적화(NT) siRNA (센스; 5′- GUUCAGCGUGUCCGGCGAGTT-(CH₂)₆-NH₂-3′, 안티센스; 5′-CUCGCCGGACACGCUGCUGAACTT-3′)를 Samchunlly 회사로부터 입수하였다.

상기 siRNA-PEG는 이황화물 결합을 이용하여 결합 반응시켰다. 즉, 감지 스트랜드(strand)(20nmol 의 VEGF 또는 GFP siRNA)의 3'에 있는 헥실아민기에 의해 개질된 300μg의 siRNA를 PBS(pH7.5)에 용해하였다.

이어서, DMSO에 녹인 20μL(400nmol)의 SPDP 원액(20mM)을 상기 siRNA 용액에 첨가하였다. 실온에서 3시간 반응 후, 겔투과 크로마토그래피(D-SaltTM 덱스트란 탈염 컬럼, Pierce, 록포드, IL)에 의해 과량의 SPDP가 제거되었다.

4μmol의 mPEG-SH를 PBS(pH7.5)에 용해하여 정제된 siRNA-SPDP 용액에 첨가하였는데, 이때 반응은 실온에서 3일간 진행하였다. 미반응된 PEG를 탈염수에 대한 투석처리(MWCO 10,000)로 분리하였다.

탈이온수에서 15분간 상온에서 항온처리하여, 페길화된 c-Met siRNA 또는 NT siRNA를 SLN과 결합시켰다.

생체 내 이미징 시 자기발광으로부터의 간섭을 최소화하고자, siRNA-PEG/SLN 복합체를 근적외선 Cy5.5.로 라벨링하였다.

실시예 3: c- Met siRNA - PEG / SLN 복합체는 c- Met 단백질 및 종양 세포 증식을 하강 조절함.

10% FBS, 2mM L-글루타민, 페니실린 (100 유닛/ml), 및 스트렙토마이신 (100 μg/ml)를 첨가한 EMEM에서 U-87MG 인간 GBM 세포(ATCC)를 성장시켰다. siRNA-PEG/SLN 형질전환을 위해, c-Met를 발현하는 U-87MG 세포를 6웰 플레이트에 2.5×10⁵ 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 항온처리 24시간 후, 0.5% FBS 함유 신선한 배지로 배지를 교체하였고, 20 nM NT siRNA-PEG/SLN 복합체 또는 40 nM c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체를 세포에 첨가하였다. 37 ℃에서 항온처리 6시간 후, 형질 전환 배지를 버리고 0.5 % FBS 함유 배지로 보충하였다. 추가적으로 24시간 항온처리 후, 웨스턴 블롯팅을 위해 상기 세포들을 수거하였다.

90% 컨플루언트 10 cm 접시를 긁어 일시적으로 형질전환된 U-87MG 세포를 준비하고, 프로티아제 저해제 칵테일 타블릿(Roche, Laval, QC)을 함유하는 NP40 세포 용해 완충액(50 mM Tris, pH 7.4, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 1% NP40, 0.02% NaN₃) (Invitrogen Corporation, Camarillo, CA)에 옮겨 세포 용해물을 제조하였다.

Bradford 단백질 검사법(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 단백질 농도를 측정하였다.

SDS-PAGE로 단백질들을 분리시키고, PVDF 맴브레인(GE Healthcare, Piscataway, NJ)에 옮긴 후, 4℃에서 밤새 1차 항체로 면역블롯팅하였다. 인간 c-Met의 C-말단 세포질 도메인에 대해 유도된 토끼 다클론 항체(1:200; Abcam, San Francisco, CA) 를 사용하였다. β-액틴 (1:5000; Sigma, Saint Louis, MO)에 대한 마우스 단클론 항체를 내부 대조군(internal control)으로 사용하였다. 결합된 항체들은 고추냉이(horse radish) 과산화효소-결합 염소 항-토끼 IgG(1:5000, Invitrogen) 또는 염소 항-마우스 IgG(1:5000, Zymed, San Francisco, CA)를 사용하여 검출하였고, 강화된 화학발광법(GE Healthcare)을 통해 시각화하였다.

타겟팅 방법의 효율성 및 특이성을 확립하려고, c-Met 발현에 양성인 U-87MG 교모세포종 세포주를 사용하였다. c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체(비처리 대조군과 비교시, 32.5±1.9% 감소)는 NT siRNA-PEG/SLN 복합체(비처리 대조군과 비교시, 2.9±3.0% 감소) 보다 c-Met 발현 억제 정도가 현저하였다(P<0.01; 도 2A).

한편, 96웰 플레이트에 세포들을 0.5×10⁴ 세포/웰의 밀도로 접종(seeding)하였고 전술한 바와 같이 NT 또는 c-Met siRNA-PEG/SLN으로 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 HGF 200 ng/ml로 24시간, 48시간, 72시간, 또는 96시간 동안 처리하였다.

세포 증식은 세포 계수 키트-8(Cell Counting Kit-8; CCK-8) (Dojindo Molecular Technology, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 정량화하였으며 이때 세포 생존율의 척도로서 세포의 미토콘드리아 디하이드로게나제 활성을 검사하였다.

증식 분석법에서, c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체로 처리한 경우, 투여량 의존 방식으로 종양 세포 증식을 현저하게 감소시켰다; NT siRNA-PEG/SLN 복합체 그룹과 비교하여 20 nM 및 40 nM 처리 그룹은 각각 13.1 및 23.4 %의 종양 세포 증식 감소를 나타내었다. 대조군과 비교하여 NT siRNA-PEG/SLN 복합체의 처리시 상기의 감소는 관찰되지 않았다(도 2B).

이들 결과는 본 발명에 따른 c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체가 시험관내에서 c-Met 발현을 조절하여 교모세포종 세포의 증식을 특이적으로 감소시킴을 의미한다.

실시예 4: 신경교종( glioma ) 이종이식 오르토토픽 모델에 있어서 c- Met siRNA-PEG/SLN 복합체의 항-종양 효과

동물 실험은 삼성 병원(서울, 한국)의 해당 임상시험심사위원회에서 승인받았으며, '실험동물 보호 및 사용을 위한 미 국립보건원 지침'(NIH publication No. 80-23, 1996년 수정)에 따라 수행하였다.

오르토토픽 GBM 동물 모델을 만들기 위해, 마취된 6주령 수컷 Balb/c-nu 마우스를 설치류 정위고정성 프레임(stereotactic frame)에 고정시키고, 브레그머(bregma) 왼쪽 2mm 앞쪽 1mm에 작은 드릴 구멍을 만들고 중공 가이드 스크류를 이식하였다. 5 μl HBSS 중의 2 x 10⁵ U-87MG 세포를 이 가이드 스크류를 통해 깊이 2mm의 백색질 내로 주입하였다[앞쪽/뒤쪽 (AP) +0.5 mm, 중간/측면 (ML) +1.7 mm, 등/배 (DV) -3.2 mm].

종양세포 이식 2주 후, 마우스들을 임의로 4그룹(각 그룹당 n=7)으로 나누고, SLN 단독(대조군), c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체 0.125 mg/kg, 0.5 mg/kg, 또는 2 mg/kg을 일주일에 3번 정맥주사하였다(도 3A). 뇌를 수거하고, 최종 주사 후 6시간에 파라핀 고정하였다. 종양 질량 부피 정량화를 위해, 표준 H&E 염색을 파라핀 절편에서 실시하여 광학 현미경으로 관찰하였다.

종양 부피는 가장 큰 종양 부분을 가진 섹션을 측정하고 공식: (폭)² x 길이 x 0.5를 적용하여 계산하였다. 종양 내 c-Met의 발현은 마우스 항-인간 c-Met 단클론 항체(Zymed)를 사용하여 면역조직염색법으로 측정하였다. 과산화수소-결합 2차 항체들을 사용하고, 안정된 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)로 10분 내지 20분간 슬라이드를 처리하여 시각화하였다.

상기 섹션들을 증류수로 헹군 후 Gill의 헤마토자일린 용액으로 1분간 대비염색(counterstain)하고 Universal Mount (Research Genetics, Huntsville, AL)에 탑재하였다.

c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체 전신 투여의 항-종양 효과를 U-87MG 오르토토픽 모델에서 상기 복합체를 정맥 주사하여 평가하였다.

종양 세포 이식 후 2주일째에, 마우스를 무작위로 4그룹(각 그룹당 n=7)으로 나누고 SLN 단독(대조군)을, c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체의 0.125 mg/kg, 0.5 mg/kg, 또는 2 mg/kg을 일주일에 3번 정맥주사하였다(도 3A). 종양 부피는 c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체의 마지막 주사 날에 측정하였다.

c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체를 처리한 결과, U-87MG 종양 성장을 투여량 의존 방식으로 현저하게 저해하였다; 0.125 mg/kg, 0.5 mg/kg, 및 2 mg/kg 투여 그룹은 대조군 그룹과 비교하여 각각 50%, 62%, 및 91% 종양 부피 감소를 나타내었다(*P < 0.05 및 **P < 0.01 vs. 대조군, 도 3B).

도 3C에 도시된 바와 같이, 종양 절편의 면역 조직학적 염색을 통해, c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체 투여에 의해 c-Met이 하강 조절되었다는 것이 입증되었다.

이는 SLN-기반 siRNA 전달 시스템이 siRNA 치료가 당면한 현재의 과제, 즉 BBB불투과성 문제를 극복할 수 있음을 의미한다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 GBM 종양 부피 감소가 c-Met의 RNAi-매개 하강 조절을 통해 효과적으로 이루어질 수 있음을 보여주었다.

더욱 중요하게는, 본 발명에서 사용한 SLN 복합체는, 교모세포종 오르토토픽 모델에서, 종양 성장을 효과적으로 조절할 수 있는 c-Met siRNAs가 전신적 생체 내 적용될 수 있도록 한다는 것을 보여주었다.

표기된 실험 기간 동안 siRNA-PEG/SLN 복합체를 처리한 마우스 및 처리하지 않은 마우스 사이 체중 변화의 현저한 차이가 없다는 것이 관찰되었다(데이터 보여지지 않음). 이것은 상기 제형에 의하여 치명적인 전신 독성이 야기되지 않았다는 것을 의미한다. c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체는 혈관-종양 장벽을 관통할 수 있으며, 종양부위에 특이적으로 표적화할 수 있다.

c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체의 생체 내 BBB-투과성을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 U-87MG 종양을 가진 마우스에 Cy5.5로 라벨된 c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체를 정맥 투여하였다(도 4A).

주사 후 48시간에, Cy5.5로 라벨된 c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체는 비처리 대조군과 비교하여 뇌에서 보다 높은 형광 강도를 보여주었다(도 4 B, C). Grzelinski 등은 이전에 유전자 침묵과 관련하여 유사한 전달 시스템을 보고했으나 피하 U-87MG 모델에서 siRNA/폴리에틸렌이민 복합체의 종양 내 국부 주사하였다. 본 발명은 오르토토픽 모델에서 RNAi/나노파티클 복합체의 전신적 정맥 투여에서도 BBB를 관통하여 뇌 종양세포에 효과적으로 전달됨을 제시한 것이다.

본 발명자들은 오르토토픽 모델에서 siRNA-기반 치료는 BBB를 통과하는데 어려움 때문에 과거에는 그 가치를 평가하기가 어려웠다고 생각한다.

본 발명에서 사용된 시스템은 siRNA-PEG/SLN이 전신 독성없이 BBB를 통해 종양 부위로 특이적으로 이동할 수 있다는 것을 보여주었다. 이는, 생체 내 진단 또한 본 발명의 기술이 적용될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.

실시예 5: 뇌 안으로의 c- Met siRNA - PEG / SLN 종양-굴성( tropism )의 생체 내 정량

U-87MG 종양을 갖는 마우스에서 c-Met siRNA-PEG/SLN 복합체의 종양 타겟팅을 평가하기 위해, Cy5.5가 결합된 siRNA-PEG/SLN 복합체를 사용하였다.

종양세포 이식 3주 후에, 마우스를 2그룹(각 그룹 당 n=3)으로 무작위로 나누고, SLN 단독(대조군) 또는 0.5 mg/kg의 c-Met siRNA-PEG/SLN-Cy5.5 복합체를 정맥주사하였다(도 4A). 주사 후 2일째에, 상기 마우스를 2 ~ 3%의 이소플루란으로 마취시켰다. 프로토타입 Xenogen IVIS　 스펙트럼 생체내 이미징 시스템(Caliper Life Science)을 사용하여 뇌 부위에서 Cy5.5의 신호를 검출하였다. 형광 강도는 Living Image 3.1 소프트웨어(Caliper Life Science)를 사용하여 초당 광자(p/s)로서 분석하였다.

오르토토픽 GBM 이종이식 종양 모델에서 siRNA 복합체의 정맥 투여를 통해 성공적인 종양조절이 있었으며, 생체 내 이미징을 통해 확인한 바와 같이 SLN은 특이적 종양-굴성 국지화를 나타내었다.

이와 같이, BBB를 관통하는 siRNAs의 종양-굴성의 전달 및 본 시스템에 의해 달성되는 현저한 종양 부피 감소는 머지않은 미래에 임상학적 적용에 밝은 전망을 제공한다.

Claims

콜레스테릴 에스테르 및 트리글리세라이드를 함유하는 코어지질부; 및
상기 코어지질부의 상층면에 소수성 상호반응에 의해 결합되어 있으며, 콜레스테롤, ApoE 없이 인지질 및 양이온성 지질을 함유하는 양이온성의 표면지질부;
를 포함하는 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 양이온성 나노입자로 된 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터.
제1항에 있어서, 양이온성의 표면지질부는 아포지질 단백질(Apolipoprotein)을 함유하고 있지 아니한 것이 특징인 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터.
제1항에 있어서, 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 양이온성 나노입자는 상기 콜레스테릴 에스테르 30 내지 60 중량％, 트리글리세라이드 0.1 내지 10 중량％, 콜레스테롤 5 내지 20 중량％, 인지질 5 내지 30 중량％, 및 양이온성 지질 10 내지 50중량％를 함유하는 것이 특징인 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터.
제1항에 있어서, 코어 지질부와 표면 지질부의 중량비는 30:70 내지 70:30인 것이 특징인 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터.
제1항에 있어서, 상기 인지질은 dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC), egg phosphatidylcholine (EPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), 및 dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG)으로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택된 것이 특징인 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터.
제1항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (MC-콜레스테롤), 3베타[N- (아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (AC-콜레스테롤), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤 (AC-토코페롤), N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤 (MC-토코페롤), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드 (DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 (DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민 (DODMA), N-(1-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA), 1,2-Dioleoyl-3-Dimethylammonium-propane (DODAP), 1,2-Dioleoylcarbamyl-3-Dimethylammonium-propane(DOCDAP), 1,2-Dilineoyl-3-Dimethylammonium-propane (DLINDAP), Dioleoyloxy-N-[2-sperminecarboxamido)ethyl}-N,N-dimethyl-1-propanaminiumt- rifluoroacetate (DOSPA), Dioctadecylamidoglycyl spermine (DOGS), 1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide (DMRIE), 3-Dimethylamino-2-(Cholest-5-en-3-beta-oxybutan-4-oxy)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxy)propane (CLinDMA), 2-[5'-(cholest-5-en-3.beta.-oxy)-3'-oxapentoxy)-3-dimethyl-1-(cis,cis-9',12'-octadecadienoxy)propane (CpLinDMA), N,N-Dimethyl-3,4-dioleyloxybenzylamine (DMOBA), 1,2-N,N'-Dioleylcarbamyl-3-dimethylaminopropane (DOcarbDAP), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판 (TAP), 및 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP)으로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택되는 것이 특징인 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터.
제1항에 있어서, 핵산을 수송하는 것이 특징인 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터.
제7항에 있어서, 핵산은 소간섭 리보핵산(siRNA), 리보좀 리보핵산(rRNA), 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 상보성 디옥시리보핵산(cDNA), 앱타머(aptamer), 전령 리보핵산(mRNA), 운반리보핵산(tRNA) 및 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(AS-ODN)로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터.
콜레스테릴 에스테르 및 트리글리세라이드를 함유하는 코어지질부; 및 상기 코어지질부의 상층면에 소수성 상호반응에 의해 결합되어 있으며, 콜레스테롤, ApoE 없이 인지질 및 양이온성 지질을 함유하는 양이온성의 표면지질부; 를 포함하는 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 양이온성 나노입자로 된 혈액 뇌 장벽(BBB) 관통 수송 벡터; 및 상기 수송 벡터 표면에 정전기력에 의해 핵산 약물이 결합된 결합체를, 유효성분으로 함유하는 뇌 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 핵산은 dsRNA인 것이 특징인 조성물.
제10항에 있어서, 상기 dsRNA는 siRNA인 것이 특징인 조성물.
제9항에 있어서, 핵산 약물은 PEG 결합된 복합체인 것이 특징인 조성물.
제9항에 있어서, 상기 뇌 질환은 뇌종양, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 세균성 감염, 바이러스성 감염 및 중추 신경계(CNS) 질환으로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 조성물.
콜레스테릴 에스테르 및 트리글리세라이드를 함유하는 코어지질부; 및 상기 코어지질부의 상층면에 소수성 상호반응에 의해 결합되어 있으며, ApoE 없이 콜레스테롤, 인지질 및 양이온성 지질을 함유하는 양이온성의 표면지질부; 를 포함하는 저밀도 지단백질 유사(LDL-like) 양이온성 나노입자를 준비하는 제1단계; 및
상기 양이온성 나노입자 표면에 정전기력에 의해 뇌 질환 예방 또는 치료용핵산 약물을 결합시켜 결합체를 형성하는 제2단계를 포함하는,
뇌 질환 예방 또는 치료용 약제의 제조 방법.