CN115487168A - 一种基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒及其应用 - Google Patents

一种基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒及其应用，属于医药技术领域。所述脂质纳米颗粒的组成包括可电离脂质、辅助脂质和含有氮杂环的胆固醇衍生物，上述脂质材料在含有核酸的缓冲液中自组装形成脂质纳米颗粒。相较于传统的基于胆固醇的脂质纳米颗粒，本发明提供的纳米材料可以高效装载如mRNA等核酸药物，并且能够提高内涵体逃逸效率，将核酸药物有效释放到细胞质中，提高药物胞内表达效率，增强了治疗效果，并且对细胞的毒性较小，具有较好的生物安全性。该纳米材料在核酸药物开发中具有潜在应用价值。

Description

一种基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒及其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒及其在制备递送核酸药物中的应用。
背景技术
核酸疗法在疾病的预防和治疗方面有着显著的优势，是一种极具发展前景的方案。其中，基于mRNA的核酸药物是一种新兴起的，将分子生物学与免疫学结合的技术。外源性的mRNA可以借助人体自身的表达系统，编码蛋白质，实现疾病的治疗和预防。与DNA药物相比，mRNA无需进入细胞核就能发挥作用，因此可以转染不分裂或分裂慢的细胞；与蛋白质或多肽药物相比，mRNA具有更高效的特点，此外，mRNA能够编码整个蛋白质结构，在疫苗的设计中，具有独特优势。生产方面，与基于培养基培养的DNA或蛋白质相比，mRNA的制造流程更稳定，易于实现放大生产。
尽管mRNA具有如此多的优点，mRNA药物设计领域仍然有很多问题亟需解决。其中，缺少安全高效的递送系统，是限制其应用的主要原因之一。
针对mRNA不稳定，带负电，易难以被细胞摄取的特点，科学家们开发出了一系列递送系统，包括基于脂质的递送系统、基于肽段的递送系统、基于聚合物的递送系统等等。其中基于脂质的脂质纳米颗粒(LNPs)由于具有良好的生物安全性和高效的递送能力，是最有潜力的载体材料之一。LNPs作为FDA批准的载体，现在被广泛用于递送包括流感、狂犬病、人类免疫缺陷病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)等病毒在内的编码抗原的mRNA。目前，US-FDA授予紧急使用权的两款mRNA疫苗BNT162b2(pfizer-biontech)和mRNA-1273(moderna)都采用脂质纳米颗粒为递送载体，临床三期有效率均超过94％(Amit Khurana,et al.Role ofnanotechnology behind the success of mRNA vaccines for COVID-19.NanoToday.2021Jun；38:101142.)。
胞内蛋白表达不足是限制mRNA药物临床转化的主要障碍。例如FDA批准的DLin-MC3-DMA LNPs，也只能介导1-4％的RNA释放到细胞质中(Shuai Liu,et al.Membrane-destabilizing ionizable phospholipids for organ-selective mRNA delivery andCRISPR-Cas gene editing.Nat Mater.2021May；20(5):701-710.)。如何通过构建合适的载体材料提高mRNA的胞内表达效率是亟需解决的科学问题。
研究表明，优化组分结构能够有效提高载体材料的转染效率。LNPs主要由可电离脂质、辅助脂质和胆固醇三个部分组成。其中，胆固醇是一种天然的环戊烷多氢菲的衍生物，是哺乳动物体内广泛存在的一种甾体化合物，它对于维持细胞膜的完整性至关重要。目前，在脂质纳米颗粒配方中加入胆固醇已被证明可通过增加膜融合，提高疗效。此外，也有研究认为胆固醇可能以晶体形式存在于LNPs的表面，与特殊的受体作用，促进内体逃逸。由于LNPs中含有较高含量的甾醇，优化胆固醇的结构将会为提高LNPs性能提供契机。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的纳米材料，该纳米材料作为药物递送载体可以高效装载如mRNA等核酸药物，并且能够提高药物的转染效率，进一步增强治疗效果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒的组成包括可电离脂质、辅助脂质和含有氮杂环的胆固醇衍生物。
所述可电离脂质、辅助脂质和含有氮杂环的胆固醇衍生物可以发生自组装形成脂质纳米颗粒。该纳米材料作为载体可以包载带负电荷的药物，具体的，在低pH值条件下，可电离脂质的叔胺质子化形成带正电的亲水端，通过静电相互作用结合带负电荷的药物，由于亲疏水的超分子作用力，脂质材料发生自组装，从而制得包载药物的脂质纳米颗粒。
本发明研究表明，利用含有氮杂环的胆固醇衍生物替代传统脂质纳米颗粒配方中的胆固醇成分，可以提升脂质纳米颗粒的转染效率。
进一步的，所述氮杂环可以为五元杂环，如吡咯基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、咪唑基；也可以为六元杂环，如吡啶基、嘧啶基；也可以为七元杂环或其他更高或更低元数的杂环。
所述含有氮杂环的胆固醇衍生物可以通过酯化反应人工合成。本发明提供了所述含有氮杂环的胆固醇衍生物的制备方法，包括：在催化剂作用下，含氮杂环的酸或醇分别与胆固醇或胆固醇琥珀酸单酯通过酯化反应制备得到所述的含有氮杂环的胆固醇衍生物。
优选的，所述含氮杂环的酸包括但不限于：1-哌啶基乙酸、2-(1-吡咯烷基)乙酸。
优选的，所述含氮杂环的醇包括但不限于：N-(2-羟乙基)-吡咯烷、1-(2-羟乙基)哌啶、2-(六甲撑亚胺)乙醇。
优选的，所述催化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
进一步的，通过柱层析法纯化上述产物，目标产物的洗脱剂为：乙酸乙酯：正己烷＝1：2。
所述脂质纳米颗粒的制备方法可以采用但不限于：乙醇注入法、薄膜法、超声法。具体的，制备包载药物的脂质纳米颗粒时，采用上述方法使脂质材料与带负电荷的药物在酸性缓冲液中通过超分子作用力和静电相互作用，自组装形成纳米颗粒。
其中，乙醇注入法是将可电离脂质、辅助脂质、含氮杂环的胆固醇衍生物按照一定量的比例溶于适当的乙醇中，再将含有脂质材料的乙醇溶液注入含有药物的缓冲液中，自组装形成纳米粒子，再通过透析除去乙醇得到稳定的纳米颗粒。
优选的，所述可电离脂质为SM-102(CAS:2089251-47-6)、DOTAP(CAS:132172-61-3)、DLin-MC3-DMA(CAS:1224606-06-7)。
优选的，所述辅助脂质包括磷脂和含有聚乙二醇的脂质，所述磷脂为DSPC(CAS：816-94-4)或DOPE(CAS：4004-05-1)，所述含有聚乙二醇的脂质为DMG-PEG2000(CAS：160743-62-4)。
优选的，可电离脂质、磷脂、胆固醇衍生物、含聚乙二醇辅助脂质的摩尔比为5-50：10-40：15-40：0.5-2.5。
更为优选，可电离脂质、磷脂、胆固醇衍生物、含聚乙二醇辅助脂质的摩尔比为50：10：38.5：1.5。
本发明的另一个目的是提供基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒作为载体在制备递送核酸药物中的应用。
进一步的，所述应用包括：将可电离脂质、辅助脂质和含有氮杂环的胆固醇衍生物加入到含有核酸的酸性缓冲液中，自组装形成包载核酸的脂质纳米颗粒，制得所述递送核酸药物。
优选的，可电离脂质、辅助脂质和含有氮杂环的胆固醇衍生物通过乙醇注入法在含有核酸的缓冲液中自组装形成脂质纳米颗粒。
相较于传统的基于胆固醇的脂质纳米颗粒，本发明提供的基于含氮杂环的胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒能够显著提高转染效率，将核酸药物有效释放到细胞质中，从而发挥其药效。
优选的，所述核酸为mRNA。
优选的，脂质材料总质量与mRNA质量比为20-160：1。在合适的质量比范围内，能保证较好的包封率和转染率。mRNA分子较大，脂质材料过少时，难以有效包裹保护mRNA，导致转染效率降低，脂质材料过多时，可能会降低内涵体逃逸效率，从而降低转染效率。
本发明具备的有益效果：
相较于传统的基于胆固醇的脂质纳米颗粒，本发明提供的纳米材料可以高效装载如mRNA等核酸药物，并且能够提高内涵体逃逸效率，将mRNA有效释放到细胞质中，提高mRNA的胞内表达效率，增强了治疗效果，并且对细胞的毒性较小，具有较好的生物安全性。因此，该纳米材料在核酸药物开发中具有潜在应用价值。
附图说明
图1为实施例1制备的含氮杂环的胆固醇衍生物的波谱分析图，其中左上角结构式为对应的结构式。
图2为实施例2制备的含氮杂环的胆固醇衍生物的波谱分析图，其中左上角结构式为对应的结构式。
图3为实施例3制备的含氮杂环的胆固醇衍生物的波谱分析图，其中左上角结构式为对应的结构式。
图4为各实施例制备的纳米药物LNPs的动态光散射粒径图，其中sample1是甾醇为胆固醇的对照组，sample2-4分别对应实施例1-3。
图5为各实施例纳米药物LNPs动态光散射多分散系数图。
图6为各实施例纳米药物LNPs的zeta电位图。
图7为实施例1中纳米药物LNPs透射电镜图。
图8为各实施例纳米药物LNPs的体外转染效果评估图，其中sample1为胆固醇对照组，sample2-4对应实施例1-3。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
GFP mRNA购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司。
实施例中涉及的化合物以及英文缩写说明如下：
2-(1-吡咯烷基)乙酸，CAS号：37386-15-5；
1-哌啶基乙酸，CAS号：3235-67-4；
2-(六甲撑亚胺)乙醇，CAS号：20603-00-3；
胆固醇，CAS号：57-88-5；
胆固醇琥珀酸单酯，CAS号：1510-21-0；
SM-102脂质，CAS号：2089251-47-6，结构式如下：
Figure BDA0003867088130000051
DSPC磷脂，CAS号：816-94-4，结构式如下：
Figure BDA0003867088130000061
DMG-PEG2000脂质，结构式如下：
Figure BDA0003867088130000062
DCM——二氯甲烷；EDC——1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；DMAP——4-二甲氨基吡啶。
实施例1
1、一种基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒制备方法
(1)将2-(六甲撑亚胺)乙醇(500mg,3.49mmol)、胆固醇琥珀酸单酯(2.039g,4.19mmol)、EDC(963.7g，5.03mmol)和DMAP(102.4mg,0.84mmol)溶解在二氯甲烷(DCM,10mL)，将混合物搅拌一整夜，然后依次用饱和碳酸氢钠溶液、盐酸、蒸馏水和饱和氯化钠溶液洗涤反应后的溶液，通过旋转蒸发除去溶剂，分离得到初产物，并用硅胶色谱法(正己烷:乙酸乙酯＝2:1)纯化。真空干燥后的最终产物。其反应过程为：
Figure BDA0003867088130000071
(2)首先将SM-102(79.4μg)、DSPC(23.3μg)、DMG-PEG2000(8.5μg)和步骤(1)制备的胆固醇衍生物(48.8μg)溶于15μL乙醇中；在涡旋的条件下，将该乙醇溶液快速注入45μL含有2μg GFP(绿色荧光蛋白)mRNA的20mM醋酸钠缓冲液中，剧烈搅拌20s，然后静置10分钟，制得纳米颗粒。
(3)将(2)制得的含有纳米颗粒的乙醇醋酸钠混合溶液，用10mM的PBS溶液(透析袋Mw＝100kDa)透析2～4小时除去乙醇，得到最终产品。
2、含氮杂环的胆固醇衍生物的波谱分析
如图1所示，核磁共振(NMR)谱图显示步骤(1)制得产物的峰，5.25-5.50(d,1H,CR2＝CH-)，4.50-4.70(m,1H,-COO-CH(CH2)2-)，4.15-4.30t,2H,-COO-CH2CH2-)，2.50-2.80(m,10H,-COO-(CH2)2-COO-,-N(CH2)3)，与目标产物的峰一致。
3、脂质纳米颗粒的粒径和电位分析
如图4和图5所示，动态光散射(DLS)测得本实施例制备的纳米材料LNPs的平均粒径是210nm，分布系数PDI＝0.17。对照组以甾醇为胆固醇制备的纳米材料的平均粒径是184.6nm，分布系数PDI＝0.11。
如图6所示，测得本实施例制备的纳米材料LNPs的ζ电位是0.02mv，在生理条件下基本呈电中性。
如图7所示，透射电镜(TEM)观察到本实施例制备的纳米材料LNPs的粒径为170nm左右，与DLS测得的粒径结果相符。
4、脂质纳米颗粒的体外转染实验
将小鼠肾细胞铺在白色、透明的48孔板中。在LNP转染细胞前，细胞粘附并生长，达到1×105/孔。转染前，将含有2μg mRNA的LNPs加入到300μL Opti-MEM中孵育10min；将细胞用1mL的Opti-MEM洗一次。然后将转染混合液滴注到介质之上。16-24小时后观察转染情况(荧光显微镜)。
如图8所示，在绿色荧光通道下，采用本实施例制备的胆固醇衍生物(sample2)替代胆固醇(sample1)的组别，在24h内有了更强的绿色荧光信号，说明该组表达了更多的绿色荧光蛋白。说明与胆固醇相比，含氮杂环胆固醇衍生物更大程度促进了mRNA转染进入细胞质中翻译成蛋白，发挥效用。
实施例2
1、一种基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒制备方法
(1)将2-(1-吡咯烷基)乙酸(500mg,3.9mmol)、胆固醇(1.796g,4.7mmol)、EDC(891mg，4.7mmol)和DMAP(94.6mg,0.77mmol)溶解在二氯甲烷(DCM,10mL)，将混合物搅拌一整夜，然后依次用饱和碳酸氢钠溶液、盐酸、蒸馏水和饱和氯化钠溶液洗涤反应后的溶液，通过旋转蒸发除去溶剂，分离得到初产物，并用硅胶色谱法(正己烷:乙酸乙酯＝2:1)纯化。真空干燥后的最终产物。其反应过程为：
Figure BDA0003867088130000081
(2)首先将SM-102(84μg)、DSPC(24.6μg)、DMG-PEG2000(9μg)和步骤(1)制备的胆固醇衍生物(42.55μg)溶于15μL乙醇中；在涡旋的条件下，将该乙醇溶液快速注入45μL含有2μg GFP(绿色荧光蛋白)mRNA的20mM醋酸钠缓冲液中，剧烈搅拌20s，然后静置10分钟，制得纳米颗粒。
(3)将(2)制得的含有纳米颗粒的乙醇醋酸钠混合溶液，用10mM的PBS溶液(透析袋Mw＝100kDa)透析2～4小时除去乙醇，得到最终产品。
2、含氮杂环的胆固醇衍生物的波谱分析
如图2所示，核磁共振(NMR)谱图显示步骤(1)制得产物的峰，5.25-5.50(d,1H,CR2＝CH-)，4.50-4.70(m,1H,-COO-CH(CH2)2-)，3.25-3.50(s,2H,-COO-CH2N(CH2)2-)，2.50-2.80(s,4H,-COO-CH2N(CH2)2-)，与目标产物的峰一致。
3、脂质纳米颗粒的粒径和电位分析
如图4和图5所示，动态光散射(DLS)测得本实施例制备的纳米材料LNPs的平均粒径是149.9nm，分布系数PDI＝0.27。
如图6所示，测得本实施例制备的纳米材料LNPs的ζ电位是-0.511mv，在生理条件下基本呈电中性。
4、脂质纳米颗粒的体外转染实验
将小鼠肾细胞铺在白色、透明的48孔板中。在LNP转染细胞前，细胞粘附并生长，达到1×105/孔。转染前，将含有2μg mRNA的LNPs加入到300μL Opti-MEM中孵育10min；将细胞用1mL的Opti-MEM洗一次。然后将转染混合液滴注到介质之上。16-24小时后观察转染情况(荧光显微镜)。
如图8所示，在绿色荧光通道下，采用本实施例制备的胆固醇衍生物(sample3)替代胆固醇(sample1)的组别，在24h内有了更强的绿色荧光信号，说明该组表达了更多的绿色荧光蛋白。说明与胆固醇相比，该材料更大程度促进了mRNA转染进入细胞质中翻译成蛋白，发挥效用。
实施例3
1、一种基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒制备方法
(1)将1-哌啶基乙酸(500mg,3.5mmol)、胆固醇(1.620g,4.2mmol)、EDC(803mg，4.2mmol)和DMAP(85.3mg,0.698mmol)溶解在二氯甲烷(DCM,10mL)，将混合物搅拌一整夜，然后依次用饱和碳酸氢钠溶液、盐酸、蒸馏水和饱和氯化钠溶液洗涤反应后的溶液，通过旋转蒸发除去溶剂，分离得到初产物，并用硅胶色谱法(正己烷:乙酸乙酯＝2:1)纯化。真空干燥后的最终产物。其反应过程为：
Figure BDA0003867088130000101
(2)首先将SM-102(83μg)、DSPC(24.4μg)、DMG-PEG2000(9.0μg)和步骤(1)制备的胆固醇衍生物(43.52μg)溶于15μL乙醇中；在涡旋的条件下，将该乙醇溶液快速注入45μL含有2μg GFP(绿色荧光蛋白)mRNA的20mM醋酸钠缓冲液中，剧烈搅拌20s，然后静置10分钟，制得纳米颗粒。
(3)将(2)制得的含有纳米颗粒的乙醇醋酸钠混合溶液，用10mM的PBS溶液(透析袋Mw＝100kDa)透析2～4小时除去乙醇，得到最终产品。
2、含氮杂环的胆固醇衍生物的波谱分析
如图3所示，核磁共振(NMR)谱图显示步骤(1)制得产物的峰，5.25-5.50(d,1H,CR2＝CH-)，4.50-4.70(m,1H,-COO-CH(CH2)2-)，3.25-3.50(s,2H,-COO-CH2N(CH2)2-)，2.50-2.80(s,4H,-COO-CH2N(CH2)2-)，与目标产物的峰一致。
3、脂质纳米颗粒的粒径和电位分析
结果如图4和图5所示，动态光散射(DLS)测得本实施例制备的纳米材料LNPs的平均粒径是300nm，分布系数PDI＝0.17。
如图6所示，测得本实施例制备的纳米材料LNPs的ζ电位是0.025mv，在生理条件下基本呈电中性。
4、脂质纳米颗粒的体外转染实验
将小鼠肾细胞铺在白色、透明的48孔板中。在LNP转染细胞前，细胞粘附并生长，达到1×105/孔。转染前，将含有2μg mRNA的LNPs加入到300μL Opti-MEM中孵育10min；将细胞用1mL的Opti-MEM洗一次。然后将转染混合液滴注到介质之上。16-24小时后观察转染情况(荧光显微镜)。
如图8所示，在绿色荧光通道下，采用本实施例制备的胆固醇衍生物(sample4)替代胆固醇(sample1)的组别，在24h内有了更强的绿色荧光信号，说明该组表达了更多的绿色荧光蛋白。说明与胆固醇相比，该材料更大程度促进了mRNA转染进入细胞质中翻译成蛋白，发挥效用。
实施例4
本实施例调整实施例1中各脂质材料的用量制备脂质纳米颗粒，具体的，SM-102(40μg)、DSPC(12μg)、DMG-PEG2000(4μg)、实施例1制备的胆固醇衍生物(25μg)，其他同实施例1，制得纳米颗粒。
本实施例制备的纳米材料粒径、电位分析结果与实施例1相似，体外转染实验显示该材料具有较好的转染效率。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质纳米颗粒的组成包括可电离脂质、辅助脂质和含有氮杂环的胆固醇衍生物。
2.如权利要求1所述的基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述含有氮杂环的胆固醇衍生物的制备方法包括：在催化剂作用下，含氮杂环的酸或醇分别与胆固醇或胆固醇琥珀酸单酯通过酯化反应制备得到所述的含有氮杂环的胆固醇衍生物。
3.如权利要求2所述的基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述含氮杂环的酸为1-哌啶基乙酸或2-(1-吡咯烷基)乙酸；所述含氮杂环的醇为N-(2-羟乙基)-吡咯烷、1-(2-羟乙基)哌啶或2-(六甲撑亚胺)乙醇。
4.如权利要求1所述的基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述可电离脂质为SM-102、DOTAP、DLin-MC3-DMA。
5.如权利要求1所述的基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述辅助脂质包括磷脂和含有聚乙二醇的脂质，所述磷脂为DSPC或DOPE，所述含有聚乙二醇的脂质为DMG-PEG2000。
6.如权利要求5所述的基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒，其特征在于，可电离脂质、磷脂、胆固醇衍生物、含聚乙二醇辅助脂质的摩尔比为5-50：10-40：15-40：0.5-2.5。
7.如权利要求1-6任一项所述的基于含氮杂环胆固醇衍生物的脂质纳米颗粒作为载体在制备递送核酸药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将可电离脂质、辅助脂质和含有氮杂环的胆固醇衍生物加入到含有核酸的酸性缓冲液中，自组装形成包载核酸的脂质纳米颗粒，制得所述递送核酸药物。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述核酸为mRNA。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，脂质材料总质量与mRNA质量比为20-160：1。
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