KR100986604B1 - 신규한 아미노지질을 함유하는 에스아이알엔에이 수송용 유전자 조성물 및 제조방법 - Google Patents

신규한 아미노지질을 함유하는 에스아이알엔에이 수송용 유전자 조성물 및 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜과 폴리-L-아르기닌으로 이루어진 아미노성 지질을 이용한 핵산 전달용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜과 폴리-L-아르기닌을 반응에 의해 형성시킨 접합체(conjugate)를 이용해서 만든 양이온성 리포좀에 핵산을 정전기적 결합을 통해 형성시킨 복합체(complex)를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물세포 내 핵산 전달용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 양이온성 리포좀을 이용한 핵산 전달 방법은 생리활성을 나타내는 siRNA(small interfering RNA), 안티센스 핵산 등의 올리고 핵산을 세포 내에 수송하는 효율을 현저히 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 전달체 자체에 의한 세포독성을 감소시킬 수 있으므로, 올리고 핵산의 전달을 목적으로 하는 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 아미노지질을 함유하는 에스아이알엔에이 수송용 유전자 조성물 및 제조방법 {Pharmaceutical composition of siRNA containing new amino-lipid and preparation thereof}
본 발명은 폴리-L-아르기닌(poly-L-arginine, PLR)과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜(distearoylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol, DSPE-PEG)의 접합체를 합성하여 제조된 새로운 아미노 지질을 포함하는 siRNA(small interfering RNA) 수송용 유전자 조성물에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명은 상기 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜의 접합체를 통해 수송된 siRNA가 세포 내에서 목적으로 하는 단백질의 발현을 효과적으로 저해할 수 있도록 제조된 조성물에 관한 것이다.
siRNA(small interfering RNA, 작은 간섭 리보핵산)는 21~23개의 핵산으로 이루어진 짧은 이중 나선 리보핵산으로 리보핵산 저해(RNAi) 과정에서 리보핵산-유도 억제 복합체(RISC)라는 단백질과 결합하게 된다. siRNA는 상보적인 메신저 RNA의 특정 염기서열에 대해 억제 조절(down-regulation)을 함으로써 특정 유효 유전자의 발현을 저해 또는 감소시키는 기능을 가지며(Milhavet et al., Pharmacol. Rev., 55, pp 629-648, 2003) 암, 유전병, 바이러스 감염 등 다양한 질병을 치료하기 위한 치료제로서 siRNA에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Akhtar and Benter, J. Clin. Invest., 117, pp 3623-3632, 2007). 그러나 효율적으로 siRNA를 표적 세포로 전달하기 위해서 세포내외의 여러 장벽을 극복해야만 한다(Pouton and Seymour, Adv. Drug Deliv. Rev., 46, pp 187-203, 2001). 따라서, 이를 위하여 siRNA 수송체가 꾸준히 개발되고 있는데, 근래에는 감염 및 변이 등의 우려가 있는 바이러스성 siRNA보다 비바이러스성 siRNA 수송체가 각광을 받고 있다.
siRNA를 전달하기 위해 사용된 비바이러스성의 양이온성 수송체는 양이온성 리포좀(Kim et al., Mol. Pharmacol., 5, pp 622-631, 2008), 키토산 나노입자(Liu et al., Biomaterials, 28, pp 1280-1288, 2007), 폴리에틸렌이민 나노입자(Werth et al., 2006) 등이 있다. 이들 비바이러스성 수송체 중, 양이온성 리포좀은 음하전된 유전자들과 전하복합체를 형성하여 유전자 수송에 흔히 사용된다(Simoes et al., 2005). 그러나, 양이온성 리포좀만으로 siRNA를 수송하는 경우, 혈중 안정성이 문제가 되며 이를 해결하기 위한 방법으로 지질에 폴리에틸렌글리콜이나 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜을 접합하여 수식하여 사용한다. 일반적으로 폴리에틸렌글리콜은 리포좀의 혈중 체류시간을 연장시키는 것으로 알려져 있으며, 이러한 작용은 리포좀 표면의 폴리에틸렌글리콜이 물 층(water shell)을 끌어당김으로써 옵소닌의 흡착과 탐식세포에 의한 리포좀 인식을 감소시키는 기전에 의한 것이다(Papahadjopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88, pp 11460-11464, 1991; Torchilin et al., Biochiim. Biophys. Acta, 1195, pp 11-20, 1994).
특히 아르기닌은 세포투과 펩티드(cell-penetrating peptides, CPPs)와 유사한 특징을 나타내므로(Derossi et al., J. Biol. Chem., 269, pp 10444-10450, 1994; Vives et al.,; J. Bio. Chem., 272, pp 16010-16017, 1997; Oehlke et al.,; Biochim. Biophys. Acta, 1414, pp 127-139 1998), 아르기닌으로 수식된 수송체는 siRNA 전달을 보다 효율적으로 개선해 줄 수 있다.
이에 본 발명자들은 폴리-L-아르기닌을 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜에 접합시켜 새로운 아미노지질을 합성하고, 이를 이용하여 양이온성 리포좀을 제조한 결과 siRNA의 전달효율은 증가시키면서 세포독성이 낮아지는 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 세포내로의 핵산 전달 효율이 높으면서도 세포독성이 낮은 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜(distearoylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol, DSPE-PEG)의 화학적 접합반응으로 제조된 새로운 아미노성 지질을 포함하는 양이온성 리포좀 및 이를 이용한 핵산 전달용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 양이온성 리포좀을 이용한 동물의 특정 장기내 세포로의 핵산 전달 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜(distearoylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol, DSPE-PEG) 또는 이의 유도체의 접합반응으로 형성된 하기 화학구조식의 아미노성 지질 구조를 제공한다.
상기 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜은 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-메톡시폴리에틸렌글리콜[distearoylphosphatidylethanolamine-methoxy(polyethyleneglycol)] DSPE-mPEG)과 결합된 물질일 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜을 접합반응으로 형성된 아미노성 지질을 포함하는 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)을 제공한다.
<화학구조식>
Figure 112010020881408-pat00001
상기 화학구조식에 m과 n은 독립적으로 1~70의 정수이다.
본 발명에 있어서, 핵산 전달체는, 음전하를 띤 핵산 서열과의 상호작용에 의해 통상적으로 핵산과 결합하여 세포 내로 유입될 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 핵산 운반 매개체를 말한다. 본 발명에 있어서, 핵산은 리보핵산(RNA), 작은 간섭 리보핵산(small interfering RNA), 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide), 데옥시리보 핵산(DNA), 앱타머(aptamer) 등을 포함하는 핵산의 세포 내 운반을 매개한다.
본 발명의 핵산전달체는 양이온성 리포좀, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼 및 나노입자로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형으로 이루어질 수 있다. 또한 상기 핵산전달체는 본 발명의 양이온성 지질 성분 외에도 갈락토오스 지질 유도체, 만노오스 지질유도체, 엽산 지질 유도체, 폴리틸렌 글리콜 지질 유도체, 바이오틴 지질 유도체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 조성물은 상기 양이온성 고분자 접합체를 다양한 핵산 물질의 전달체로 사용하여 동물 세포내 목적 단백질로의 siRNA 또는 안티센스 핵산 등의 수송 효율을 현저히 향상시킬 수 있다. 또한 상기 양이온성 리포좀은 핵산 물질과의 단순한 혼합(mix)에 의해 양이온성 고분자의 양하전과 핵산 물질의 음이온성 하전의 정전기적 결합을 통해 복합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜 접합체의 아미노성 지질을 포함하는 올리고핵산 전달체 조성물'에 있어서 '폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜 접합체 함유 양이온성 리포좀'과 '올리고핵산'의 바람직한 배합 몰비율 범위는 10:1~50:1이 적절하다.
또한, 양이온성 리포좀에 있어서 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜 접합체와 다른 종류의 양이온성 리포좀 구성성분과의 바람직한 배합 몰비율 범위는 80~99:1~20이 적절하다.
상기 양이온성 리포좀, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼은 이에 제한되는 것은 아니나,
1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE),
1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPhPE),
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DOPS),
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, DO-Ethyl-PC),
1,2-디올레일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, EDOPC),
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, EPOPC),
1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, EDMPC),
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, SPC),
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, EDPPC),
1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, DOTAP),
N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄(클로라이드(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride, DOTMA) 3ß-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(3ß-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol, DC-Cholesterol), 또는
콜레스테롤 등으로부터 선택되는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함할 수 있다.
본 발명의 동물세포 내 핵산 전달용 조성물에서, 상기 동물세포는 세포 내로 전달할 목적으로 사용된 siRNA 또는 안티센스 핵산 등이 도입되기 원하는 어떠한 동물세포도 가능하나, 바람직하게는 종양세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 동물세포내 핵산 전달용 조성물은 양이온성 리포좀을 안정성을 높이기 위해 사용되는 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜에 아미노산인 폴리-L-아르기닌을 접합시킴으로써, 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜의 양이온성 리포좀을 스텔스(stealth) 리포좀으로 만들어주는 기능과 폴리-L-아르기닌의 생체 적합성이 보강되는 장점이 있다. 즉, 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜의 접합반응으로 형성된 아미노성 지질을 이용한 양이온성 리포좀은 기존의 양이온성 리포좀에 비하여 세포 독성이 적은 장점이 있다. 또한, 기존의 세포 내로 siRNA 등의 핵산 의약을 전달하는 데 있어서도 높은 전달 효율을 나타낸다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은,
폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜의 화학적 접합반응으로 새로운 아미노성 지질을 제조하는 제 1단계;
상기 아미노성 지질을 이용해서 만든 양이온성 리포좀과 핵산을 실온에서 혼합하여 정전기적 결합에 의해 복합체를 형성시키는 제 2단계; 및
상기 복합체를 동물세포에 투여하는 제 3단계;
를 포함하는 동물세포 내 핵산 전달방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 제 3단계에서 상기 리포좀은 양전하를 띄고 있으므로, 세포막의 음전하와 인력이 작용하여 세포막에 부착되어 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 세포 내부로 유입될 수 있다. 다시 말해, 양이온성 리포좀 자체가 전달체 역할을 하는 것이므로 복합체를 동물세포에 가하여 배양하면 세포 내로 들어가게 된다.
본 발명에서 기술된 양이온성 리포좀을 이용한 핵산 전달방법은 다양한 세포들에서 핵산 전달 효율을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 siRNA 또는 siRNA와 핵산 전달체와의 복합체 외에 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 적당한 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 투여될 조성물의 유효농도에 영향을 미치는 인자들로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 투여 방식, 투여 빈도, 치료가 진행 중인 특정 질병, 질병의 심각성, 질병의 병력, 개체가 다른 치료제와 함께 협력 치료법이 진행중인지의 여부, 치료가 진행 중인 개체의 연령, 키, 체중, 건강 및 신체 조건을 포함한다. 일반적으로 치료가 진행 중인 환자의 체중이 증가할수록 이 제제를 더 많은 양으로 투약하는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜(distearoylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol, DSPE-PEG)의 화학적 접합반응에 의해 제조된 새로운 아미노성 지질을 이용해서 만든 양이온성 리포좀은 siRNA, 안티센스 핵산 등과 복합체를 형성하여 상기 핵산 물질의 세포내 전달 효율을 기존의 전달체들에 비하여 향상시켰으며, 세포독성도 기존보다 현저하게 낮아졌다. 따라서 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜의 화학적 접합반응에 의해 생성된 새로운 아미노성 지질을 이용해서 만든 양이온성 리포좀은 siRNA 등의 핵산 의약을 안전하고 효과적으로 다양한 세포 내로 수송하는 전달체로서 산업적 이용 가치가 높을 것으로 기대된다.
도 1은 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜 접합체의 프로톤 1H-NMR 결과를 나타내는 스펙트럼이다.
도 2는 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜 접합체의 겔투과크로마토그래피를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 siRNA를 처리하지 않은 대조군 세포에서의 GFP 발현 사진이다.
도 3b는 siRNA 단독으로 사용한 세포에서의 GFP 발현 사진이다.
도 3c는 리포펙타민® siRNA 복합조성물을 처리한 세포에서의 GFP 발현 사진이다.
도 3d는 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜로 수식한 비교예 1의 양이온성 리포솜과 siRNA 복합조성물을 처리한 세포에서의 GFP 발현 사진이다.
도 3e는 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜을 수식하지 않은 비교예 2의 종래의 양이온성 리포솜과 siRNA 복합조성물을 처리한 세포에서의 GFP 발현 사진이다.
도 3f는 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜에 폴리-L-아르기닌이 접합되어 수식된 실시예 2의 양이온성 리포솜과 siRNA 복합조성물을 처리한 세포에서의 GFP 발현 사진이다.
<실시예 1. 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜의 접합체 합성>
폴리-L-아르기닌(평균분자량 13,000달톤)과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜(distearoylphosphatidylethanolamine-polyethyleneglycol, DSPE-PEG, 평균분자량 2,800달톤)의 접합체 합성은 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜을 정량적으로 혼합하여 실시하였다. 폴리-L-아르기닌 1g당 50mM 소디움 테트라보레이트 완충액(sodium tetraborate buffer, STBB, pH 8.5) 25㎖에 녹인 후 0.22μm 멤브레인에 여과하였다. 이 후, 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜 분말을 위의 용액에 천천히 가해주면서 교반하였다. 6시간 동안 실온에서 교반한 후, 투석용 튜브(분자량컷오프 6~8킬로달톤, Spectrum Laboratories사)에 옮겨 담고 10mM 인산완충액(phosphate-buffered saline, PBS)에서 24시간 동안 투석하였다. 이 후, 증류수에서 24시간 동안 추가로 투석한 다음, 결과물을 -70℃에서 48시간 동안 동결건조하였고, NMR과 겔투과크로마토그래피로 물질성분을 확인하였다. 도 1은 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜 접합체의 프로톤 1H-NMR이고, 도 2는 폴리-L-아르기닌과 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜 접합체의 겔투과크로마토그래피이다.
<실시예 2. 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜과 폴리-L-아르기닌의 접합체를 이용한 양이온성 리포좀의 제조>
본 발명의 양이온성 리포좀은 지질 필름법으로 제조하였다. 디아실트리메틸암모늄프로판(dioleoyl diacyltrimethylammonium propane, DOTAP), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 콜레스테롤과 상기 실시예 1에서 합성한 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜과 폴리-L-아르기닌의 접합체를 70:20:5:5의 몰비율로 하여 혼합하여 클로로포름과 메탄올 3:1의 혼합액에 넣어 녹인 후, 전체 지질 20μM 당 2㎖의 PBS를 가하여 분산하였다.
유기용매는 감압하에서 회전증발기로 제거하였고, 리포좀을 수화시키기 위해 PBS를 가하여 준 후 격렬하게 볼텍싱하였다. 조분산된 리포좀은 압출기(extruder, Northern Lipids사)를 이용하여 0.2μm 멤브레인을 통과시켜 입자 크기를 조절하였다. 제조된 리포좀의 입자크기와 제타 전위는 광산란스펙트럼법으로 ELS-8000(Photal사)을 이용하여 측정하였다. 상기 방법으로 제조된 리포좀의 입자 크기는 148.6±8.5㎚였으며, 제타전위는 32.2±3.7㎷였다.
<비교예 1. 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜을 이용한 양이온성 리포좀의 제조>
상기 실시예 2와 동일하게 양이온성 리포좀을 제조하되 디아실트리메틸암모늄프로판(dioleoyl diacyltrimethylammonium propane, DOTAP), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 콜레스테롤에 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜을 70:20:5:5의 몰비율로 하여 혼합하여 양이온성 리포좀을 제조하였다. 상기 방법으로 제조된 리포좀의 입자 크기는 143.9±7.5㎚였으며, 제타전위는 25.3±5.7㎷였다.
<비교예 2. 일반 양이온성 리포좀의 제조>
상기 실시예 2와 동일하게 양이온성 리포좀을 제조하되 디아실트리메틸암모늄프로판(dioleoyl diacyltrimethylammonium propane, DOTAP), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 콜레스테롤을 75:20:5의 몰비율로 혼합하여 양이온성 리포좀을 제조하였다. 상기 방법으로 제조된 리포좀의 입자 크기는 188.7±19.3㎚였으며, 제타전위는 15.4±7.5㎷였다.
<실험예 1. 세포내 GFP(green fluorescent protein) 발현 저해 효율 측정>
GFP siRNA에 대한 양이온성 리포좀 복합 조성물을 제조하여 GFP를 발현하는 배양세포에 넣어 GFP 발현이 감소되는 정도를 측정하였다.
20pM의 siRNA에 N/P 비율(cationic polymer의 positively charged nitrogen과 negatively charged phosphate backbone의 몰비율)이 20이 되도록 실시예 2, 비교예 1 내지 비교예 2의 리포좀을 가하여 각각 siRNA와 복합 조성물을 제조하였고, 다른 비교대상으로, siRNA도 양이온성 리포좀도 모두 처리하지 않은 대조군을 두었으며, siRNA만 단독으로 처리한 군과 siRNA와 리포펙타민®을 처리한 비교군을 두었다. siRNA와 리포좀 복합조성물은 siRNA의 양을 20pM로 고정한 상태에서 리포좀의 비율을 달리하여 제조하였다.
각 복합 조성물은 랫드 간암세포주 H4II-E에 가하고 37℃, 5% CO2 조건에서 우혈청(fetal bovine serum, FBS)을 함유하지 않은 세포배양배지 DMEM(Gibco BRL사, 미국)에서 4시간 반응시킨 다음, 세포를 수 회 배양배지로 수세하여 세포 내로 탐식(endocytosis)되지 않은 세포 표면상의 siRNA를 제거하였다. 10% FBS를 함유한 세포배양배지 DMEM을 가하여 2일간 반응시켰다. 세포 내로 수송된 siRNA의 발현 저해 효과는 공초점레이져주사현미경(confocal laser scanning microscopy)법과 유세포분류기(flow cytometry)법을 사용하여 평가하였다. 상기 결과는 표 1에 나타내었다.
Figure 112010020881408-pat00002
siRNA 단독, 수송체, 리포좀과 siRNA의 복합 조성물에 대하여 세포생존율을 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)법을 이용하여 측정하고 이로써 수송체의 독성을 확인하였다. 리포좀과 siRNA의 복합 조성물의 비율은 실험예 1에서 전반적으로 가장 효과가 좋은 30:1의 비율을 사용하였고, 랫드 간암세포주 H4II-E와 사람 간암세포주 HepG2에 독성을 평가할 물질들을 가하여 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 5㎎/㎖의 MTT를 100㎕ 가하여 4시간 동안 방치하였다. 배지를 다시 제거한 후 포마잔(formazan) 결정을 녹인 후 마이크로플레이트 리더(Tecan Trading사, 스위스)를 이용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다.
표 2는 랫드 간암세포주 H4II-E와 사람 간암세포주 HepG2에서 양이온성 리포좀 또는 양이온성 리포좀과 siRNA 복합조성물의 세포독성 결과를 나타낸 것이다. 세포독성은 리포좀의 조성에 따라 변화되었으며, siRNA 단독보다는 리포좀과의 복합 조성물의 세포독성이 더 낮았으며, 세 가지 리포좀 중 폴리-L-아르기닌-디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜을 함유하는 양이온성 리포좀과 siRNA의 복합 조성물의 세포독성이 가장 낮은 것으로 나타났다.
Figure 112010020881408-pat00003

Claims (9)

  1. (a) 하기 화학식의 폴리-L-아르기닌이 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜(distearoylphosphatidylethanolamine-polyethyleneglycol, DSPE-PEG)에 화학적 접합(conjugate)되어 형성된 아미노성 지질을 포함하고,
    (b) 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EPOPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDMPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(SPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDPPC), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-Cholesterol), 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DO-Ethyl-PC), 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고핵산 전달체.
    [화학식]
    Figure 112010050993922-pat00004

    (상기 식에서 m과 n은 독립적으로 1~70 정수이다.)
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고핵산 전달체가 siRNA(small interfering RNA)의 세포 내 운반을 위한 것을 특징으로 하는 올리고핵산 전달체.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고핵산 전달체가 안티센스(antisense)의 세포 내 운반을 위한 것을 특징으로 하는 올리고핵산 전달체.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고핵산 전달체가 앱타머(aptamer)의 세포 내 운반을 위한 것을 특징으로 하는 올리고핵산 전달체.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고핵산 전달체는 리포좀인 것을 특징으로 하는 올리고핵산 전달체.
  6. 삭제
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 리포좀은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 콜레스테롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고핵산 전달체.
  8. (a) 폴리-L-아르기닌이 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜(distearoylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol, DSPE-PEG)에 화학적 접합(conjugate)된 아미노성 지질을 제조하는 단계;
    (b) 상기 아미노성 지질과, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EPOPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDMPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(SPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDPPC), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-Cholesterol), 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DO-Ethyl-PC), 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 이용해서 만든 양이온성 리포좀에 올리고핵산과 실온에서 혼합하여 정전기적 결합에 의해 복합체를 형성시키는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 전달용 복합체의 제조방법.
  9. 제 1항의 올리고핵산 전달체와 올리고 핵산의 복합체.
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