KR102549868B1 - 재조합 프로타민을 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents

재조합 프로타민을 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 프로타민을 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 지질 나노입자 기반 약물 전달체는 음이온성을 갖는 유전자와 복합체 형성 시 우수한 안정성을 갖는 재조합 프로타민 단백질을 이용함으로써, 체내에서 유전자를 안정적으로 표적 세포까지 전달할 수 있고, 또한 표적 세포 내에서 유전자 발현량을 향상시킬 수 있으므로, 지질 나노입자 매개 유전자 치료 등 관련 기술분야에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

재조합 프로타민을 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법 {Lipid nanoparticle-based drug carrier using recombinant protamine and manufacturing method thereof}
본 발명은 재조합 프로타민을 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
의약 제제 산업에 있어 약물의 부작용을 줄이고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 설계한 약물전달시스템(DDS; Drug Delivery System)은 신약개발과 맞먹는 경제적 이익을 창출할 수 있으면서 성공 가능성이 큰 고부가가치 핵심기술로서 약물투여를 효율화함으로서 환자 치료의 질을 높이는데 그 목적이 있다.
약물전달시스템의 핵심기술 중의 하나인 약물흡수 촉진 기술에 속하는 난용성 약물의 가용화 기술은 신약 물질의 개발비용을 줄일 수 있는 동시에 현재 출시되어 있는 의약품의 부가가치를 높일 수 있는 가장 합리적인 방법으로 여겨지고 있다. 특히, 우리나라와 같이 신약개발 여건이 열악한 상황에서 약물의 가용화 기술의 개발을 통한 개량 신약의 개발은 적은 비용으로 막대한 부가가치를 창출할 수 있는 분야이다.
유전자 약물전달시스템을 이용한 유전자 치료법은 유전적 결합을 수정하고 수많은 질병을 치료하는데 있어 커다란 희망으로 자리 잡고 있다. 이러한 유전자 치료법을 성공적이고 안전하게 수행함에 있어서, 효과적인 유전자 전달이 주요한 과제 중 하나이며, 바이러스 전달체가 유전자 전달에 있어 효과적임이 입증되었다. 그러나 면역원성, 종양 발생 가능성, 세포독성, 바이러스 벡터 내의 제한된 DNA 크기 및 복잡한 생산 공정, 면역반응으로 인한 반복적 투여의 제한과 같은 여러 문제점으로 인해 유전자 전달 시스템으로서 바이러스의 이용이 제한되고 있다. 따라서, 상기 문제점을 극복할 수 있는 양이온성 리포좀 및 중합체와 같은 비-바이러스성 유전자 담체가 바이러스성 시스템의 대체 수단으로서 주목을 받기 시작했다.
이상적인 비바이러스성 유전자 운반체는 유전 물질을 응축하여 세포의 흡수가 가능한 나노 크기의 복합체를 형성해야 하고, 세포에 전달이 용이할 수 있도록 안정적인 구조체를 유지해야 하며, 외부의 유전 물질이 세포핵으로 전달 될 때까지 체내 효소반응에 의한 분해 등으로부터 안정하게 유지되어야 한다. 이와 같이 이상적인 비바이러스성 유전자 운반체를 제조하기 위해 양이온성 고분자, 단백질 또는 펩타이드만으로 유전자 복합체를 형성하거나, 양이온성 지질 나노입자를 이용하는 등의 시도가 이루어지고 있다. 예를 들면, 세포 내 또는 체내에 핵산 전달을 용이하게 하기 위한 방안으로 핵산, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 입자의 응집을 억제하는 접합 지질을 포함하는 핵산-지질 입자를 채택할 수 있음이 보고되어 있고(특허문헌 0001), siRNA 등의 핵산을 효율적으로 표적 세포 내에 송달하기 위한 캐리어가 되는 지질 나노입자로서 pH 감수성 양이온성 지질을 구성 지질로서 포함하는 지질 나노입자가 보고되어 있다(특허문헌 0002).
한편, 비바이러스성 유전자 전달을 위해 연구자들이 사용하는 양이온성 펩타이드의 일종인 프로타민은 천연 DNA 축합제로서, DNA를 응축시켜 정자의 조밀한 구조를 형성하고 수정 후 정자 DNA를 난자의 핵으로 전달하는 독특한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 프로타민은 연어(salmon)의 고환에서 얻은 프로타민 설페이트 (protamine sulfate; PS)를 주로 사용하고 있으며, PS는 폴리-아르기닌의 구조를 갖고 있어서 양전하 비율이 매우 높다. 따라서 연구자들은 PS을 비바이러스 유전자 전달 시스템으로 자주 사용하고 있다. 그러나, 상용화된 PA의 경우 음이온성 유전자와 복합체를 이룰 경우, 수용액 안정성이 떨어지는 문제점이 있고, 지질 나노입자 내에 봉입 시에도 안정성이 떨어지는 단점이 존재하였다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 목적하는 기관 또는 세포에 음이온성 약물, 핵산 등을 효율적으로 전달할 수 있는 약물 전달체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 핵산과 복합체 형성 시에 안정성이 향상된 재조합 프로타민 단백질을 제조하였고, 재조합 프로타민 단백질과 핵산을 결합한 복합체를 봉입하고 있는 지질 나노입자의 안정성이 우수하고, 세포 수준에서 유전자 발현량이 현저히 높음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
미국 등록특허 제9404127호(등록일: 2016.08.02) 대한민국 공개특허 제10-2020-0018782호(공개일: 2020.02.20)
본 발명의 목적은 핵산 등 음이온성 약물을 기관 또는 세포 내에 안정적으로 전달하기 위해, 수용성 향상 태그 및 프로타민을 포함하는 재조합 프로타민 단백질을 포함하는 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 (a) 수용성 향상 태그 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 프로타민을 포함하는 재조합 프로타민 단백질 및 핵산을 결합한 복합체;
(b) 비양이온성 지질; 및
(c) PEG-변형 지질;을 포함하는 지질 나노입자 기반 약물 전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 수용성 향상 태그 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 프로타민을 포함하는 재조합 프로타민 단백질 용액을 핵산 용액과 혼합하여 프로타민-핵산 복합체를 제조하는 단계;
(b) 유기 용매, 비양이온성 지질 및 PEG-변형 지질을 포함하는 지질 용액을 반응기에 도입하고, 유기 용매를 제거하여 지질 필름을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 형성된 지질 필름에 상기 단계 (a)에서 제조된 복합체를 가하고, 분산시켜 지질 나노입자 분산액을 형성하는 단계;를 포함하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 지질 나노입자 기반 약물 전달체는 음이온성을 갖는 유전자와 복합체 형성 시 우수한 안정성을 갖는 재조합 프로타민 단백질을 이용함으로써, 체내에서 유전자를 안정적으로 표적 세포까지 전달할 수 있고, 또한 표적 세포 내에서 유전자 발현량을 향상시킬 수 있으므로, 지질 나노입자 매개 유전자 치료 등 관련 기술분야에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 프로타민 단백질과 핵산을 결합한 복합체를 봉입한 지질 나노입자의 구조를 나타낸 도이다.
도 1b는 상기 지질 나노입자의 합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 재조합 프로타민 단백질을 코딩하는 유전자 서열을 대장균 발현 플라스미드(pET30a-PA)에 클로닝한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 재조합 프로타민 단백질의 정제 과정별 순도를 나타낸 도이다.
도 2c는 재조합 프로타민 단백질의 정제 과정에서 대장균의 RNA 오염이 있는지 여부를 확인한 도이다.
도 3은 재조합 프로타민 단백질과 플라스미드 DNA의 복합체를 형성하기 위한 최적의 농도를 아가로스겔 전기영동 분석을 통해 확인한 도이다.
도 4a는 UV-visible spectrometer를 이용하여, 재조합 프로타민 단백질 30 μM 또는 기존 프로타민 설페이트 30 μM을 각각 플라스미드 DNA 7.5 nM과 혼합하여 복합체를 형성하였을 때의 안정성을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 UV-visible spectrometer를 이용하여, 재조합 프로타민 단백질 30 μM 또는 기존 프로타민 설페이트 30 μM을 각각 플라스미드 DNA 15 nM과 혼합하여 복합체를 형성하였을 때의 안정성을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4c는 UV-visible spectrometer를 이용하여, 재조합 프로타민 단백질 30 μM 또는 기존 프로타민 설페이트 30 μM을 각각 플라스미드 DNA 30 nM과 혼합하여 복합체를 형성하였을 때의 안정성을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4d는 재조합 프로타민 단백질 30 μM을 플라스미드 DNA 0, 7.5, 15, 30 및 60 nM과 혼합하여 복합체를 형성하였을 때의 안정성을 육안으로 확인한 도이다.
도 4e는 기존 프로타민 설페이트 30 μM을 플라스미드 DNA 0, 7.5, 15, 30 및 60 nM과 혼합하여 복합체를 형성하였을 때의 안정성을 육안으로 확인한 도이다.
도 5a는 기존 프로타민 설페이트 30 μM을 플라스미드 DNA 0, 7.5, 15, 30 및 60 nM과 혼합하여 형성된 각각의 복합체를 이용하여 지질 나노입자를 합성한 후, 4 ℃ 조건에서 상기 지질 나노입자를 보관했을 때의 안정성을 육안으로 확인한 도이다.
도 5b는 재조합 프로타민 단백질 30 μM을 플라스미드 DNA 0, 7.5, 15, 30 및 60 nM과 혼합하여 형성된 각각의 복합체를 이용하여 지질 나노입자를 합성한 후, 4 ℃ 조건에서 상기 지질 나노입자를 보관했을 때의 안정성을 육안으로 확인한 도이다.
도 5c는 플라스미드 DNA가 존재하지 않는 조건에서 기존 프로타민 설페이트 30 μM을 이용하여 지질 나노입자를 합성한 후, 4 ℃ 조건에서 24시간이 경과하였을 때의 샘플 크기를 확인하기 위해 DLS(dynamic light scattering) 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5d는 기존 프로타민 설페이트 30 μM을 플라스미드 DNA 7.5 nM과 혼합하여 형성된 각각의 복합체를 이용하여 지질 나노입자를 합성한 후, 4 ℃ 조건에서 24시간이 경과하였을 때의 샘플 크기를 확인하기 위해 DLS(dynamic light scattering) 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5e는 기존 프로타민 설페이트 30 μM을 플라스미드 DNA 15 nM과 혼합하여 형성된 각각의 복합체를 이용하여 지질 나노입자를 합성한 후, 4 ℃ 조건에서 24시간이 경과하였을 때의 샘플 크기를 확인하기 위해 DLS(dynamic light scattering) 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5f는 기존 프로타민 설페이트 30 μM을 플라스미드 DNA 30 nM과 혼합하여 형성된 각각의 복합체를 이용하여 지질 나노입자를 합성한 후, 4 ℃ 조건에서 24시간이 경과하였을 때의 샘플 크기를 확인하기 위해 DLS(dynamic light scattering) 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5g는 기존 프로타민 설페이트 30 μM을 플라스미드 DNA 60 nM과 혼합하여 형성된 각각의 복합체를 이용하여 지질 나노입자를 합성한 후, 4 ℃ 조건에서 24시간이 경과하였을 때의 샘플 크기를 확인하기 위해 DLS(dynamic light scattering) 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5h는 플라스미드 DNA가 존재하지 않는 조건에서 재조합 프로타민 단백질 30 μM을 이용하여 지질 나노입자를 합성한 후, 4 ℃ 조건에서 24시간이 경과하였을 때의 샘플 크기를 확인하기 위해 DLS(dynamic light scattering) 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5i는 재조합 프로타민 단백질 30 μM을 플라스미드 DNA 7.5 nM과 혼합하여 형성된 각각의 복합체를 이용하여 지질 나노입자를 합성한 후, 4 ℃ 조건에서 24시간이 경과하였을 때의 샘플 크기를 확인하기 위해 DLS(dynamic light scattering) 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5j는 재조합 프로타민 단백질 30 μM을 플라스미드 DNA 15 nM과 혼합하여 형성된 각각의 복합체를 이용하여 지질 나노입자를 합성한 후, 4 ℃ 조건에서 24시간이 경과하였을 때의 샘플 크기를 확인하기 위해 DLS(dynamic light scattering) 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5k는 재조합 프로타민 단백질 30 μM을 플라스미드 DNA 30 nM과 혼합하여 형성된 각각의 복합체를 이용하여 지질 나노입자를 합성한 후, 4 ℃ 조건에서 24시간이 경과하였을 때의 샘플 크기를 확인하기 위해 DLS(dynamic light scattering) 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5l은 재조합 프로타민 단백질 30 μM을 플라스미드 DNA 60 nM과 혼합하여 형성된 각각의 복합체를 이용하여 지질 나노입자를 합성한 후, 4 ℃ 조건에서 24시간이 경과하였을 때의 샘플 크기를 확인하기 위해 DLS(dynamic light scattering) 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 재조합 프로타민 단백질 30 μM과 HIC1 유전자가 코딩된 플라스미드 DNA 30.82 nM의 복합체를 봉입한 지질 나노입자를 MDA-MB-468 세포에 처리한 지 24시간 경과한 후, 상기 세포 내 단백질 발현량을 웨스턴 블롯을 이용하여 확인한 도이다.
이하, 본 발명에 따른 재조합 프로타민을 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명은 (a) 수용성 향상 태그 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 프로타민을 포함하는 재조합 프로타민 단백질 및 핵산을 결합한 복합체;
(b) 비양이온성 지질; 및
(c) PEG-변형 지질;을 포함하는 지질 나노입자 기반 약물 전달체를 제공한다.
상기 프로타민(protamine; 서열번호 1)은 프로타민 유전자(서열번호 2)를 포함하는 재조합 발현 벡터에 의해 발현되는 단백질로, 양이온성을 띄고 있어 음전하를 나타내는 핵산 등의 치료제와 정전기적 상호작용을 통해 용이하게 약물과의 복합체를 형성하여 높은 효율로 지질 나노입자에 봉입될 수 있으며, 상기 복합체를 봉입한 지질 나노입자는 약물(예를 들면, 핵산)의 세포 내 또는 생체 내 약물 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "봉입(encapsulation)"은 전달물질을 둘러싸서 효율적으로 생체 내로 함입시키기 위해 캡슐화하는 것을 의미한다.
상기 수용성 향상 태그(solubility enhancing tag)는 상기 프로타민을 음이온성 핵산과 결합하여 복합체를 형성할 시에 상기 복합체의 수용액 안정성을 향상시킬 수 있는 표지물질(tag)를 의미하는 것으로, 상기 재조합 프로타민 단백질을 수용성 형태로 발현시킬 수 있는 것이면 어느 것이든 제한 없이 이용 가능하다. 예를 들어, 상기　수용성 향상 태그는 S-태그, 단백질 이황화물 이성질화효소의 b'a' 도메인(b'a' domain of PDI; PDIb'a'), 말토스 결합 단백질(Maltose Binding Protein; MBP), 헥사히스티딘(hexahistidine; His6), 티오레독신(thioredoxin; Trx), 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase; GST), N-이용 기질 단백질 A(N-utilization substance Protein A; NusA), 수모(small ubiquitin related modifier; SUMO) 및 단백질 이황화물 이성질화효소(protein disulfide isomerase; PDI)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 수용성 향상 태그는 상기 프로타민의 N-말단, C-말단 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 각각 결합된 것일 수 있고, 하나 또는 둘 이상 연속적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 수용성 향상 태그는 S-태그이고, 이는 상기 프로타민의 N-말단에 결합하여 재조합 프로타민 단백질(S-PA, 서열번호 3)을 형성할 수 있다. 상기 S-태그를 포함하는 재조합 프로타민 단백질의 경우, 핵산과 결합하여 복합체 형성 시, 복합체의 수용액 안정성을 향상시킬 수 있고, 지질 나노입자 내에 봉입되었을 때에도 상기 지질 나노입자의 안정성을 증대시킬 수 있다. 이를 통해, 표적 세포 내에 핵산을 안정적으로 전달할 수 있고, 높은 유전자 발현량에 기여할 수 있다.
Figure 112022067233414-pat00001
상기 핵산은 세포 내 또는 생체 내 전달하기 위한 치료제로써, 양이온성을 띄는 상기 프로타민과 정전기적 상호작용을 통해 복합체를 형성할 수 있고, 예를 들어, 플라스미드 DNA, 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, miRNA, siRNA, ssRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, 안티센스 RNA 및 LNA로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "miRNA(microRNA)"는 유전자 발현을 조절하며, 전장 21 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 RNA 분자를 의미한다. miRNA는 세포 내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오티드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2 이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.
본 명세서에서, 용어 "siRNA"란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중 가닥 RNA(duplex RNA), 혹은 단일 가닥 RNA 내부에서 이중 가닥의 형태를 띄는 단일 가닥 RNA를 지칭한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다. 이중 가닥 사이의 결합은 뉴클레오티드 간의 수소 결합을 통해 이루어지고, 이중 가닥 내부의 모든 뉴클레오티드가 상보적으로 완전 결합해야 하는 것은 아니다.
siRNA의 길이는 약 15 내지 60개, 구체적으로 약 15 내지 50개, 약 15 내지 40개, 약 15 내지 30개, 약 15 내지 25개, 약 16 내지 25개, 약 19 내지 25개, 약 20 내지 25개, 또는 약 20 내지 23개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 siRNA 길이는 이중 가닥 RNA의 한쪽 뉴클레오티드의 갯수, 즉, 염기쌍의 갯수를 의미하며, 단일 가닥 RNA인 경우에는 단일 가닥 RNA 내부의 이중 가닥의 길이를 의미한다. 또한 siRNA는 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반응을 약화시키는 등의 목적을 위해 다양한 작용기를 도입한 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "ssDNA"은 특정 타겟 DNA에 선택적으로 결합하여 안티진(antigene) 효과를 유도하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "shRNA"는 단일 가닥으로 50 내지 70개로 구성된 뉴클레오티드를 의미하며, in vivo 상에서 스템-루프(stemloop) 구조를 이루고 있다. 5 내지 10개의 뉴클레오티드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19 내지 29개의 뉴클레오티드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.
본 명세서에서, 용어 "mRNA"는 유전자를 발현 가능한 합성 mRNA(in vitro transcribed mRNA)를 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "ncRNA"는 단백질로 번역되지 않고 RNA자체로서 기능을 수행하게 된다. ncRNA에는 우리가 흔히 알고있는 tRNA, rRNA부터 snoRNA, miRNA, lncRNA까지 포함되며 세포 내 곳곳에서 전사, splicing, 번역 등에 관여한다.
본 명세서에서, 용어 "안티센스 RNA"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 RNA 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 RNA의 길이는 6 내지 100 염기, 구체적으로 8 내지 60 염기, 보다 구체적으로, 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 RNA는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서, 용어 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 왓슨-크릭 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
상기 비양이온성 지질은 중성 지질, 음이온성 지질 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 중성 지질은 pH 4.0 내지 8.0의 범위 내에서 전하되지 않거나(uncharged) 중성 양성 이온성(zwitterion) 형태를 갖는 지질을 의미한다.
상기 중성 지질은 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 어떠한 중성 지질을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 중성 지질은 DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), SM(N-palmitoyl-D-erythro-sphingosylphosphorylcholine), DLPE(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DiPPE(1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine), 테트라에테르 리피드(tetraether lipid), 세라마이드(ceramide), 스핑고리피드(sphigolipid), 디아크릴 글리세롤(diacryl glycerol) 및 글리세리드(glyceride)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 중성 지질은 DSPC이다.
상기 음이온성 지질은 pH 4.0 내지 pH 8.0의 범위 내에서 최소 하나의 음전하를 갖는 어떠한 양친매성 지질을 의미한다.
상기　음이온성 지질은 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 어떠한　음이온성 지질을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 음이온성 지질은 DOPS(Dioleoylphosphatidylserine), DMPG(dimyristoylphosphatidylglycerol), DPPG(dipalmitoylphosphatidylglycerol), DTPA(diethylenetriamine pentaacetic acid), DPTGA(1,4-dipalmitoyl-tartarate-2,3-diglutaric acid), DSTSA(1,4-disteroyl-tartarate-2,3-disuccinic acid), CHHDA(2-carboxyheptadecanoyl heptadecylamide), DMPS(Dimyristoylphosphatidylserine), DPPS(Dipalmitoylphosphatidylserine), POPS(Palmitoyloleoylphosphatidylserine), DOPG(Dioleoylphosphatidylglycerol), POPG(Palmitoyloleoylphosphatidylglycerol), DMPA(Dimyristoylphosphatidic acid), DPPA(Dipalmitoylphosphatidic acid), DOPA(Dioleoylphosphatidic acid), POPA(Palmitoyl-oleoylphosphatidic acid), CetylP(Cetyl phosphate) 및 CHEMS(cholesterol hemisuccinate)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 음이온성 지질은 DOPS이다.
상기 콜레스테롤은 상기 지질 나노입자 내에서 지질 충전에 형태적 측면에서 견고성을 부여하며, 나노입자의 코어 및 표면에 분산되어 나노입자의 안정성을 향상시키는 역할을 한다.
상기 PEG-변형 지질은 지질과 PEG가 컨쥬게이트된(conjugated) 형태를 지칭하는 것으로, 일측 단부에 친수성 중합체인 폴리에틸렌글리콜(PEG) 중합체가 결합된 지질을 의미한다. 상기 PEG-변형 지질은 지질 나노입자 내에서 나노입자의 혈청 내 입자 안정성에 기여하며, 지질 나노입자 간 응집을 막는 안정화제 지질(stabilizer lipid) 역할을 수행한다. 또한, 상기 PEG-변형 지질은 핵산의 생체 내 전달시 분해효소로부터 핵산을 보호하여 핵산의 체내 안정성을 강화시키며, 상기 지질 나노입자 내 봉입된 약물의 반감기를 증가시킬 수 있다.
상기 PEG-변형 지질에서 PEG는 지질에 직접 접합될 수 있거나 또는 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG를 지질에 결합시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 예를 들면, 에스테르-비함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티가 포함된다. 상기 에스테르-비함유 링커 모이어티는 아미도(-C(O)NH-), 아미노(-NR-), 카르보닐(-C(O)-), 카르바메이트(-NHC(O)O-), 우레아(-NHC(O)NH-), 다이설파이드(-S-S-), 에테르(-O-), 석시닐(-(O)CCH2CH2C(O)-), 석신아미딜(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), 에테르, 다이설파이드뿐만 아니라 이들의 조합(예컨대, 카르바메이트 링커 모이어티 및아미도 링커 모이어티 둘 모두를 함유하는 링커)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 에스테르-함유 링커 모이어티는, 예를 들면 카르보네이트(-OC(O)O-), 석시노일, 포스페이트 에스테르(-O-(O)POH-O-), 설포네이트 에스테르, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
상기 PEG-변형 지질 내 지질은 폴리에틸렌글리콜과 결합할 수 있는 지질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 상기 PEG-변형 지질은 지질 나노입자의 다른 구성요소인 비양이온성 지질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 PEG-변형 지질은 DSPC-PEG이다.
상기 PEG-변형 지질 내 PEG는 친수성 고분자로 혈장 단백질들의 흡착을 억제하는 능력을 가지고 있어서 지질 나노입자의 체내 순환시간을 증가시키며, 나노입자 간의 응집현상을 막는 역할을 한다. 또한, PEG-변형 지질은 생체 내에서 스텔스(stealth) 기능을 나타내어 나노입자의 분해를 방지할 수 있다.
상기 PEG는 지질과 결합하지 않은 쪽에 관능기가 결합된 것(functionalized PEG)일 수 있다. 이 때 사용 가능한 관능기는 숙시닐기(succinyl), 카르복시산(carboxylic acid), 말레이미드(maleimide), 아민기, 바이오틴, 시아누르기(cyanur), 및 폴레이트(folate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 지질 나노입자의 평균 입자 크기는 10 내지 2,000 nm일 수 있다. 지질 나노입자의 크기가 10 nm 미만일 경우, 상기 복합체가 지질 나노입자에 봉입되기 어려울 수 있으며, 체내로 주입될 경우에 안정성이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다. 또한 2,000 nm를 초과할 경우에도 상기 지질 나노입자가 포함된 조성물이 체내로 주입될 경우에 안정성이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다.
또한, 본 발명은 (a) 수용성 향상 태그 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 프로타민을 포함하는 재조합 프로타민 단백질 용액을 핵산 용액과 혼합하여 프로타민-핵산 복합체를 제조하는 단계;
(b) 유기 용매, 비양이온성 지질 및 PEG-변형 지질을 포함하는 지질 용액을 반응기에 도입하고, 유기 용매를 제거하여 지질 필름을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 형성된 지질 필름에 상기 단계 (a)에서 제조된 복합체를 가하고, 분산시켜 지질 나노입자 분산액을 형성하는 단계;를 포함하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명의 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명의 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법에 있어서, 단계 (a)는 수용성 향상 태그 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 프로타민을 포함하는 재조합 프로타민 단백질 용액을 핵산 용액과 혼합하여 프로타민-핵산 복합체를 제조하는 단계이다.
상기 수용성 향상 태그, 프로타민 및 핵산에 대해서는 전술한 바와 같으므로, 여기서의 기재는 생략한다.
상기 재조합 프로타민 단백질 용액 및 핵산 용액을 혼합할 경우, 양이온성을 갖는 재조합 프로타민 단백질과 음이온성 핵산은 정전기적 상호작용을 통해 용이하게 복합체를 형성할 수 있다.
상기 재조합 프로타민 단백질은 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있다.
(1) 수용성 향상 태그를 코딩하는 유전자, 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프로타민 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 형성하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 형성된 벡터를 세포주에 삽입하여 형질 전환시키는 단계; 및
(3) 상기 단계 (2)의 세포주에서 재조합 프로타민 단백질을 발현하는 단계.
본 명세서에서, 용어 "세포주"는 목적 단백질을 생산하기 위해, 유전자 또는 재조합 벡터 등이 도입된 발현용 세포를 의미한다. 상기 세포주는 당쇄화된 인터페론 람다를 발현할 수 있는 세포라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질의 발현에 주로 사용되는 CHO 세포주 또는 HEK 세포주 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 세포주는 대장균(E.coli)이다.
상기 단계 (3)은 발현된 재조합 프로타민 단백질을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 정제 단계는 발현된 단백질을 정제하기 위한 방법이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 1회 또는 2회 이상 수행할 수 있다.
본 발명의 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법에 있어서, 단계 (b)는 유기 용매, 비양이온성 지질 및 PEG-변형 지질을 포함하는 지질 용액을 반응기에 도입하고, 유기 용매를 제거하여 지질 필름을 형성하는 단계이다.
상기 비양이온성 지질 및 PEG-변형 지질에 대해서는 전술한 바와 같으므로, 여기서의 기재는 생략한다.
상기 유기 용매를 제거하는 단계는, 상기 반응기의 내부를 진공 상태로 유지하고, 상기 반응기 내에 도입된 지질 용액 중 유기 용매를 증발시키는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 반응기 내 온도를 고온으로 설정해 유기 용매만을 증발시킬 수 있다. 이와 같이, 유기 용매를 증발시켜 제거함으로써, 상기 지질 용액 중 유기 용매를 제외한 나머지 지질 성분은 상기 반응기의 내벽 및 바닥부에 지질 필름을 형성하게 된다.
상기 유기 용매의 종류는 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 지질 나노입자 기반 약물 전달체 제조에 이용되는 지질을 용해할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 상기 유기 용매는 바람직하게는, 비극성 또는 저극성 유기 용매일 수 있고, 벤젠, 부탄올, 부틸 아세테이트, 카본 테트라클로라이드, 클로로포름, 사이클로헥세인, 디클로로에테인, 디클로로메테인, 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 에틸 아세테이트, 헵테인, 헥세인, 이소옥테인, 메틸 에틸 케톤(MEK), 메틸 t-부틸 에테르(MTBE), 펜테인, 톨루엔, 트리클로로에틸렌, 자일렌 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법에 있어서, 단계 (c)는 상기 단계 (b)에서 형성된 지질 필름에 상기 단계 (a)에서 제조된 복합체를 가하고, 분산시켜 지질 나노입자 분산액을 형성하는 단계이다.
상기 단계 (c)에 있어서, 상기 분산액을 동결시키고, 동결된 분산액을 융해시키는 동결/융해 과정을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 분산액을 액화 질소에 5분간 노출시켜 동결시키고, 재차 온수에 노출하여 융해시키는 과정을 반복할 수 있다. 이때, 상기 동결/융해 과정을 1 내지 12회 반복할 수 있고, 이와 같이 지질 필름 조성물을 동결하고 융해하는 단계를 반복함으로써 보다 균일한 크기의 지질 나노입자 분산액이 형성될 수 있고, 지질 나노입자의 약물 봉입 효율을 높일 수 있다. 단, 12회를 초과할 경우에는 지질 나노입자의 봉입 효율이 오히려 줄어들 수 있기 때문에 12회 이내가 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해서 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예> 재조합 프로타민 단백질 발현 및 정제
먼저, S-태그를 코팅하는 유전자 및 프로타민을 코딩하는 DNA 염기서열(서열번호 2)을 대장균 발현 플라스미드 pET30a에 클로닝하여 pET30a-PA 벡터를 합성하였다. 구체적으로, pET30a-PA 유전자는 NCBI(#NP_002752.1)의 인간의 프로타민 아미노산 서열(서열번호 1)을 기반으로 합성하였고, 재조합 S-PA 단백질은 N- 및 C-말단에 6개의 히스티딘을 추가하여 대장균(E.coli)에서 발현 및 정제를 용이하게 하였다. 또한, 폴리-아르기닌 잔기를 가진 단백질임에도 대장균에서의 재조합 S-PA 단백질 발현량을 증가시키고 S-PA/pDNA 복합체 안정성을 향상시키기 위해 친수성 서열을 추가하였다(도 2a).
그 다음, 재조합 S-PA 단백질 발현을 위해 대장균 BL21 StarTM(DE3)(Thermo Fisher)를 pET30a-PA로 형질 전환시켰고, 상기 형질 전환된 세포를 600 nm에서 광학 밀도가 0.4 - 0.5가 될 때까지 배양하였다. 그 후, 상기 세포를 1mM 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도하였고, 25℃에서 18시간 동안 배양하였다.
상기 발현된 S-PA 단백질을 정제하기 위해, 배양된 세포를 용해 완충액(100 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 20 mM 이미다졸 및 0.5 mM PMSF, pH 7.5)을 이용하여 용해시켰다. 용해된 세포 용액을 프로브 초음파 처리하고, 4℃에서 20분 동안 15,000g에서 원심 분리하였다. 그 후, 상등액을 HisPur™ Cobalt Resin(Thermo Fisher)과 반응시키고 세척 완충액(100 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl 및 60 mM 이미다졸, pH 7.5)으로 세척한 후 용출용 완충액(100 mM Tris-HCl, 0.3 M NaCl 및 300 mM 이미다졸, pH 7.5)을 이용하여 S-PA를 용출하였다. 상기 용출된 단백질을 Strong Cation Exchange Column(Thermo Fisher)에서 추가로 정제하고(도 2b), 상기 정제 과정에서 대장균의 RNA 오염이 없음을 확인하였다(도 2c). 그 후, 저장 완충액(100 mM Tris-HCl, 0.2 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF 및 20 % 글리세롤, pH 7.5)을 이용하여 투석한 후 -80 ℃에서 보관하였다.
<실험예 1> 재조합 프로타민 단백질 및 플라스미드 DNA 결합 복합체 형성 및 결합 확인
상기 실시예 1에서 정제된 재조합 프로타민 단백질(S-PA)의 농도(1, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 및 120 μM)를 각각 달리하고, 이를 30 nM 플라스미드 DNA(pDNA)와 1 mL 포스페이트 완충 식염수(PBS, pH 7.2)에서 반응시켜 S-PA/pDNA 복합체를 형성하였다. 여기에서 사용한 플라스미드 DNA(#HG18546-UT, Sinobiological)는 HIC1 유전자를 코딩하고 있다. 그 다음, 상기 형성된 복합체의 최적화된 농도를 확인하기 위해 아가로스겔 전기영동 분석을 수행하였다.
전기영동 분석 결과, 재조합 프로타민 단백질(S-PA)의 농도가 20 μM 이상일 때, 30 nM 플라스미드 DNA와 복합체가 형성되는 것을 확인하였다(도 3). 따라서, S-PA의 농도가 30 μM일 때, 30 nM 플라스미드 DNA와 효율적으로 복합체가 형성되는 것을 확인하였다(도 3).
<실험예 2> 재조합 프로타민 단백질 및 플라스미드 DNA 결합 복합체의 안정성 평가
재조합 프로타민 단백질와 핵산 서열이 결합한 복합체의 안정성을 평가하기 위해, 상온의 PBS (pH 7.2)에서 상기 실시예 1에서 정제된 재조합 S-PA 단백질 30 μM과 농도가 상이한 pDNA 5종(0, 7.5, 15, 30 및 60 nM)을 정전기적 상호작용에 의한 결합 반응시켜 S-PA/pDNA 복합체를 제조하였다. 대조군으로는 프로타민 설페이트(protamine sulfate, PS) 30 μM을 상기와 동일한 조건에서 0, 7.5, 15, 30 및 60 nM의 pDNA와 각각 반응시켜 PS/pDNA 복합체를 제조하였다. 그 다음, UV-visible spectrometer 및 육안으로 상기 제조한 복합체 샘플의 안정성을 평가하였다.
UV-visible spectrometer를 이용한 흡광도 측정 결과, S-PA/pDNA 복합체 샘플은 여러 농도의 플라스미드와 반응하였을 때, 280 nm에서의 피크가 플라스미드만을 측정한 흡광도 결과와 유사하게 측정되는 것을 확인함으로써 플라스미드만 존재하였을 때와 유사한 수준의 안정성을 나타내는 것을 확인하였다. 반면, PS/pDNA 복합체 샘플은 해당 파장에서의 피크가 상대적으로 낮게 측정되어, 상대적으로 낮은 결합 안정성을 가지는 것을 확인하였다(도 4a 내지 4c).
또한, 각 샘플을 육안으로 관찰했을 때에는, S-PA/pDNA 복합체 샘플의 경우 모든 농도에서 응집 현상이 관찰되지 않은 반면, 대조군인 PS/pDNA 복합체 샘플은 pDNA 0 nM를 제외한 모든 농도 조건에서 응집 현상이 일어나는 것을 확인하였다(도 4d 및 4e). 이 결과를 통해, 플라스미드와 복합체를 형성할 시 재조합 S-PA 단백질이 PS 보다 결합 안정성이 뛰어나다는 것을 확인하였다.
<실험예 3> 재조합 프로타민/pDNA 복합체를 봉입한 지질 나노입자의 안정성 평가
재조합 프로타민과 플라스미드 DNA의 복합체를 봉입한 지질 나노입자의 분산 안정성을 확인하기 위해, 상기 실험예 2에서 제조한 S-PA/pDNA 복합체를 이용하여, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)과 콜레스테롤 조성의 지질 필름을 수화시켜 지질 나노입자(lipid nanoparticle, LNP)를 합성하였다. 지질 나노입자는 박막 수화 방법을 사용하여 준비하였다. 간단히 말해서, DSPC : DSPC-PEG : 콜레스테롤 (몰% = 58 : 2 : 40)을 클로로포름 1 mL에 용해시키고 용매를 증발시켜 지질 필름을 형성하였다. 그 후, 형성된 지질 필름을 1 ml의 S-PA/pDNA 복합체로 수화하였다. 그 다음, 동결-해동 절차를 거쳐, LNP 용액을 CL4B size extraction column으로 정제한 다음 0.2 μm 주사기 필터를 통해 여과함으로써, S-PA/pDNA 복합체가 봉입된 지질 나노입자를 제조하였다. 대조군으로는 상기 실험예 2에서 제조한 PS/pDNA 복합체를 이용하여, 상기와 동일한 방식을 통해 PS/pDNA 복합체가 봉입된 지질 나노입자를 준비하였다. 상기 합성된 지질 나노입자 샘플은 합성 직후, 3 시간 후(4 ℃에서 보관) 및 24 시간 후(4 ℃에서 보관)에 육안 및 0.3 nm - 10 μm 크기의 입자 측정이 가능한 DLS(dynamic light scattering) 분석을 통해 안정성을 평가하였다.
각 샘플을 육안으로 관찰한 결과, PS/pDNA 복합체로 합성된 지질 나노입자의 경우 보관 3 시간 만에 대부분의 입자가 응집되어 가라앉는 것을 확인하였다(도 5a). 반면, 재조합 S-PA/pDNA 복합체로 합성된 지질 나노입자는 4 ℃에서 보관한 지 24 시간이 지난 후에도 응집되어 가라앉은 입자가 확인되지 않았다(도 5b).
다음으로, DLS 분석 결과, PS/pDNA 복합체로 합성된 지질 나노입자는 pDNA 0 nM을 제외한 모든 농도에서 분산도를 의미하는 PDI(polydispersity index)가 0.5 이상이고 입자 크기가 측정 가능 범위를 벗어나는 것으로 확인되어 분산 안정성이 떨어지는 것을 확인하였다(도 5c 내지 5g). 반면, 재조합 S-PA/pDNA 복합체로 합성된 지질 나노입자는 모든 샘플에서 PDI가 0.2 - 0.3으로 측정되었고 110 - 150 nm의 평균 입자 크기를 갖는 것으로 확인되었다(도 5h 내지 5l). 이 결과를 통해 재조합 S-PA 단백질/플라스미드 복합체로 합성된 지질 나노입자의 보관 안정성이 우수함을 확인하였다.
<실험예 4> 합성된 지질 나노입자를 세포에 전달한 후 세포 내에서의 유전자 발현 정도 확인
본 발명의 지질 나노입자에 의해 세포로 전달된 유전자의 발현 정도를 확인하기 위하여, 30 μM S-PA 단백질과 30.82 nM 플라스미드 DNA를 이용하여 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 지질 나노입자를 합성하고, 상기 지질 나노입자를 MDA-MB-468 세포에 2.48 x 1011± 2.75 x 1010 LNP 입자/1.3 x 106 세포를 처리하였다. 24 시간이 지난 후, 상기 세포를 수집하여 웨스턴 블롯으로 단백질 발현량을 확인하였다. 이 때, 마찬가지로 HIC1(Human hypermethylated in cancer 1, NCBI number : NM_006497.3) 유전자가 코딩된 플라스미드 DNA (pCMV-HIC1, #HG18546-UT, Sinobiological)를 사용하였다.
구체적으로, 실험에 사용한 MDA-MB-468 세포는 5 % CO2 하에서 37 ℃에서 10% 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 ATCC modified RPMI medium (Gibco) 에서 배양하였다. MDA-MB-468 세포는 LNP 처리 24시간 전에 60 mm2 세포 배양 플레이트 (1.3 x 106 세포/플레이트)에 접종한 다음, LNP(S-PA/pDNA) (2.48 x 1011± 2.75 x 1010 LNP 입자/2.5 mL opti-MEM)를 첨가하고 37 ℃에서 24 시간 배양하였다.
상기 LNP 처리된 MDA-MB-468 세포를 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제 (Sigma)가 포함된 RIPA 버퍼에서 용해하였고, 전체 세포 용해물은 BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Scientific)를 사용하여 정량하였다. 그 다음, 세포 용해물 (50 μg)을 변성 조건 하에서 4-15 % gradient SDS-PAGE 겔 (Biorad)에 로딩하고 PVDF 막 (iBlot2 Dry Blotting System, Thermo Scientific)으로 이동하였다. 막을 5 % 탈지우유로 실온에서 1 시간 동안 차단하고 HIC1 (Proteintech) 및 액틴 (Santa Cruz)의 1 차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 그 후, HRP가 접합된 2차 항체를 실온에서 2 시간 동안 반응시킨 후 멤브레인에 웨스턴 ECL 처리한 다음, 발광 이미지를 LAS500 (GE Healthcare)을 사용하여 분석을 수행하였다.
웨스턴 블롯 수행 결과, S-PA/pDNA 복합체가 봉입된 지질 나노입자가 처리된 실험군은 무처리군(non-treated)과 대비하여, HIC1 단백질의 발현량이 6.26 배 높은 것으로 확인되었고, S-PA/pDNA 복합체만 처리된 실험군과 비교하였을 때에는 HIC1 단백질의 발현량이 2.62 배 증가하였음을 확인하였다(도 6).
이상과 같은 결과를 통해, 재조합 S-PA 단백질과 플라스미드 DNA 복합체를 봉입하고 있는 지질 나노입자가 세포에 효과적으로 플라스미드 DNA를 전달하기 위한 전달체가 될 수 있음을 입증하였다.
이상과 같이 특정된 사항들과 한정된 실시예를 통해 본 발명이 설명되었으나, 이는 본 발명의 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.
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Claims (20)

  1. (a) S-태그 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 프로타민을 포함하는 재조합 프로타민 단백질 및 핵산을 결합한 복합체;
    (b) 비양이온성 지질; 및
    (c) PEG-변형 지질;을 포함하는 지질 나노입자 기반 약물 전달체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 PEG-변형 지질은 비양이온성 지질 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합된 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 S-태그는 상기 프로타민의 N-말단, C-말단 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 각각 결합된 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 플라스미드 DNA, 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, miRNA, siRNA, ssRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, 안티센스 RNA 및 LNA로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체.
  6. 제1항 또한 제2항에 있어서,
    상기 비양이온성 지질은 중성 지질, 음이온성 지질 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 중성 지질은 DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), SM(N-palmitoyl-D-erythro-sphingosylphosphorylcholine), DLPE(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DiPPE(1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine), 테트라에테르 리피드(tetraether lipid), 세라마이드(ceramide), 스핑고리피드(sphigolipid), 디아크릴 글리세롤(diacryl glycerol) 및 글리세리드(glyceride)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 음이온성 지질은 DOPS(Dioleoylphosphatidylserine), DMPG(dimyristoylphosphatidylglycerol), DPPG(dipalmitoylphosphatidylglycerol), DTPA(diethylenetriamine pentaacetic acid), DPTGA(1,4-dipalmitoyl-tartarate-2,3-diglutaric acid), DSTSA(1,4-disteroyl-tartarate-2,3-disuccinic acid), CHHDA(2-carboxyheptadecanoyl heptadecylamide), DMPS(Dimyristoylphosphatidylserine), DPPS(Dipalmitoylphosphatidylserine), POPS(Palmitoyloleoylphosphatidylserine), DOPG(Dioleoylphosphatidylglycerol), POPG(Palmitoyloleoylphosphatidylglycerol), DMPA(Dimyristoylphosphatidic acid), DPPA(Dipalmitoylphosphatidic acid), DOPA(Dioleoylphosphatidic acid), POPA(Palmitoyl-oleoylphosphatidic acid), CetylP(Cetyl phosphate) 및 CHEMS(cholesterol hemisuccinate)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 지질 나노입자의 평균 입자 크기는 10 내지 2,000 nm인 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체.
  10. (a) S-태그 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 프로타민을 포함하는 재조합 프로타민 단백질 용액을 핵산 용액과 혼합하여 프로타민-핵산 복합체를 제조하는 단계;
    (b) 유기 용매, 비양이온성 지질 및 PEG-변형 지질을 포함하는 지질 용액을 반응기에 도입하고, 유기 용매를 제거하여 지질 필름을 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 형성된 지질 필름에 상기 단계 (a)에서 제조된 복합체를 가하고, 분산시켜 지질 나노입자 분산액을 형성하는 단계;를 포함하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 PEG-변형 지질은 비양이온성 지질 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합된 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 S-태그는 상기 프로타민의 N-말단, C-말단 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 각각 결합된 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법.
  13. 삭제
  14. 제10항에 있어서,
    상기 핵산은 플라스미드 DNA, 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, miRNA, siRNA, ssRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, 안티센스 RNA 및 LNA로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법.
  15. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 비양이온성 지질은 중성 지질, 음이온성 지질 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 중성 지질은 DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), SM(N-palmitoyl-D-erythro-sphingosylphosphorylcholine), DLPE(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DiPPE(1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine), 테트라에테르 리피드(tetraether lipid), 세라마이드(ceramide), 스핑고리피드(sphigolipid), 디아크릴 글리세롤(diacryl glycerol) 및 글리세리드(glyceride)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 음이온성 지질은 DOPS(Dioleoylphosphatidylserine), DMPG(dimyristoylphosphatidylglycerol), DPPG(dipalmitoylphosphatidylglycerol), DTPA(diethylenetriamine pentaacetic acid), DPTGA(1,4-dipalmitoyl-tartarate-2,3-diglutaric acid), DSTSA(1,4-disteroyl-tartarate-2,3-disuccinic acid), CHHDA(2-carboxyheptadecanoyl heptadecylamide), DMPS(Dimyristoylphosphatidylserine), DPPS(Dipalmitoylphosphatidylserine), POPS(Palmitoyloleoylphosphatidylserine), DOPG(Dioleoylphosphatidylglycerol), POPG(Palmitoyloleoylphosphatidylglycerol), DMPA(Dimyristoylphosphatidic acid), DPPA(Dipalmitoylphosphatidic acid), DOPA(Dioleoylphosphatidic acid), POPA(Palmitoyl-oleoylphosphatidic acid), CetylP(Cetyl phosphate) 및 CHEMS(cholesterol hemisuccinate)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법.
  18. 제10항에 있어서,
    상기 단계 (c)는 상기 분산액을 동결시키고, 동결된 분산액을 융해시키는 동결/융해를 1 내지 12회 반복하는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법.
  19. 제10항에 있어서,
    상기 재조합 프로타민 단백질은 하기와 같은 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법,
    (1) S-태그를 코딩하는 유전자, 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프로타민 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 형성하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)에서 형성된 벡터를 세포주에 삽입하여 형질 전환시키는 단계; 및
    (3) 상기 단계 (2)의 세포주에서 재조합 프로타민 단백질을 발현하는 단계.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 단계 (3)은 발현된 재조합 프로타민 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법.
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