CN115487306B - 一种药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物 - Google Patents

Abstract

为克服现有技术中因脂质体的正电荷引起的细胞膜非特异性互作以及诱导细胞发生毒性活动的问题，本发明提供了一种肝靶向的药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物，其中，包括阳离子聚合物、脂质组合体和靶向分子，所述阳离子聚合物包括含咪唑阳离子聚合物，所述脂质组合体包括辅助电离脂质分子和连接脂质，所述靶向分子包括半乳糖修饰的胆固醇‑聚乙二醇。本发明提供的脂质体纳米颗粒用于递送siRNA药物，它能提高递送siRNA药物的效率；含咪唑的阳离子聚合物可与带负电的siRNA通过静电作用形成阳离子聚合物/siRNA复合物，减少了细胞膜的非特异性互作，提高了siRNA递送以及转染效率。

Description

一种药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物

技术领域

本发明属于siRNA靶向型药物载体技术领域，具体涉及一种肝靶向的药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物。

背景技术

小干扰RNA (Small interfering RNA , siRNA)是双链的小分子核酸，在转录后发挥RNA干扰作用（RNAi），可特异性抑制疾病相关靶基因的mRNA的表达从而发挥治疗效果，因此，体内应用RNAi的研究受到高度重视。随着siRNA生物学机制的阐明和siRNA合成方法的快速发展，绝大多数的基因可通过siRNA技术进行沉默。目前，国际上已有多个siRNA药物获批FDA上市许可，国内亦有多款siRNA药物处于不同研发阶段。目前siRNA体内应用面临的主要难题有：siRNA的稳定性较差，半衰期较短，需要提高靶向性，以达到高效递送，以及缺少细胞内涵体的逃逸能力等。

脂质纳米粒(LNP)是一种具有均匀脂质核心的脂质囊泡，具有很高的生物相容性和生物可降解性，因此被用来递送多种活性成分。脂质体的内部与外部均为亲水相，磷脂双分子层中为亲油相，药物可根据其极性包裹于磷脂双分子中或内外水相中。含有阳离子材料的纳米载体已在世界范围内广泛用于 siRNA 递送，因为这些载体可以通过静电相互作用保持带负电荷的 siRNA；此外，带正电的载体还与带负电的细胞表面相互作用，并将其siRNA 货物输送到细胞中。尽管带正电荷的脂质体能够在低浓度的 siRNA 下诱导高细胞溶质 siRNA 递送和高效的基因沉默，但它们的正电荷会引起与生理环境中细胞膜的非特异性相互作用并诱导细胞发生毒性活动，例如产生活性氧物种、能量代谢中断和细胞死亡，因此，开发pH 响应型聚合物对于减少非特异性互作及提高siRNA递送效率很重要。

糖尿病作为非传染性疾病，在自然病程中，胰岛β细胞功能随着病程的延长而逐渐下降，胰岛素分泌量日益减少，因而对降糖药物的需求和依赖程度会逐渐增大，长时间用药机体产生耐药性，加大用药剂量的同时，药物的毒副作用也增加，因此迫切需要开发能提高药效、毒副作用小且药物递送效率高的靶向递送载体。

发明内容

针对现有技术中脂质体的正电荷引起的细胞膜非特异性互作、诱导细胞发生毒性活动以及缺乏高效递送糖尿病药物的载体的问题，提供一种pH 响应型的肝靶向的药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种肝靶向的药物递送载体，包括阳离子聚合物、脂质组合体和靶向分子，所述阳离子聚合物包括含咪唑的阳离子聚合物，所述脂质组合体包括辅助电离脂质分子和连接脂质，所述靶向分子包括半乳糖修饰的胆固醇-聚乙二醇。

可选的，所述阳离子聚合物的结构如下所示：

。

可选的，所述辅助电离脂质分子选自DSPC，所述连接脂质选自CHOL。

可选的，所述药物递送载体包括以下组分：

阳离子聚合物15.5~46份，脂质组合体 10~35.5份，靶向分子 2~18.5份

可选的，所述脂质组合体包括2.4~17.9重量份的辅助电离脂质分子和3.6~21.5重量份的连接脂质。

另一方面，本发明提供了上述药物递送载体在肝脏靶向药物中应用。

可选的，所述肝脏靶向药物还包括具有糖尿病预防或治疗作用的药物活性成分，所述药物活性成分包裹于所述药物递送载体中。

可选的，所述糖尿病包括II型糖尿病。

可选的，所述药物活性成分包括抑制肝脏细胞中LOC157273基因表达的siRNA。

另一方面，本发明还提供一种糖尿病治疗药物，包括药物活性成分和如上所述的药物递送载体，所述药物活性成分包裹于所述药物递送载体中。

可选的，所述药物活性成分包括抑制肝脏细胞中LOC157273基因表达的siRNA。

可选的，所述糖尿病治疗药物还包括药学上可接受的辅料。

可选的，所述辅料包括缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂和消泡剂中的一种或多种。

另一方面，本发明还提供一种药物递送载体的制备方法，包括以下操作步骤：

称取阳离子聚合物、辅助电离脂质分子、连接脂质和靶向分子，溶解分散于有机溶剂中，加入酸性缓冲液进行水化，去除有机溶剂得到药物递送载体。

可选的，所述有机溶剂为乙醇。

本发明提供的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒（药物递送载体）中，含咪唑的阳离子聚合物可与带负电的siRNA通过静电作用形成阳离子聚合物/siRNA复合物，减少了细胞膜的非特异性互作；另外，含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒可以通过网格蛋白和小窝介导的内吞途径进入肝脏癌细胞，这表明，由这种电荷可逆脂质组成的脂质体是一种稳定有效的siRNA 递送载体；Galactose化学修饰于PEG 化胆固醇后，易与肝实质细胞表面的ASGPR（半乳糖受体）特异性结合，提高了脂质体纳米颗粒的肝靶向性以及siRNA递送转染效率。

附图说明

图1为实施例1提供的四组分含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒粒径及表面电位检测结果；（A含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒粒径检测图；B 含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒表面电位测定图 ）

图2为实施例2提供的四组分含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒粒径及表面电位检测结果；（A含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒粒径检测图；B 含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒表面电位测定图 ）

图3为实施例3提供的四组分含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒粒径及表面电位检测结果；（A含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒粒径检测图；B 含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒表面电位测定图 ）

图4为实施例4提供的双组分含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒粒径及表面电位检测结果；（A含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒粒径检测图；B 含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒表面电位测定图 ）

图5为实施例5提供的三组分含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒粒径及表面电位检测结果；（A含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒粒径检测图；B 含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒表面电位测定图 ）

图6为本发明提供的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒与siRNA 吸附实验检测图；

图7为本发明提供的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒递送效果检测共聚焦荧光图；（A白光模式；B荧光模式）

图8为本发明提供的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒转染效果检测图；

图9为本发明提供的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒靶向效果检测图；

图10为本发明提供的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒结构示意图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图10所示，本发明实施例提供了一种肝靶向的药物递送载体，包括阳离子聚合物、脂质组合体和靶向分子，所述阳离子聚合物包括含咪唑的阳离子聚合物，所述脂质组合体包括辅助电离脂质分子和连接脂质，所述靶向分子包括半乳糖修饰的胆固醇-聚乙二醇。

具体的，所述阳离子聚合物是咪唑的阳离子聚合物，结构如下所示：

由含咪唑的阳离子聚合物组成的阳离子脂质体复合物纳米颗粒表面在pH 6.0时不断电离并带正电，在pH 7.4时几乎呈中性，在pH 8时带负电。阳离子脂质体复合物纳米颗粒通过网格蛋白以及小窝介导的内吞途径进入癌细胞。这些发现表明，由这种电荷可逆脂质组成的阳离子脂质体复合物纳米颗粒是一种高度稳定和有效的siRNA递送载体。

所述含咪唑的阳离子聚合物由以下方法制备得到：

取聚（马来酸酐-alt-1-十八烯）粉末、组胺二盐酸盐和4-二甲氨基吡啶置于样品瓶中（4-二甲氨基吡啶作为催化剂促进聚合物生成），在瓶中加入无水二甲基亚砜，超声破碎仪超声助溶；见部分聚合物溶解于无水二甲基亚砜后，在样品瓶中加入磁珠，并将样品瓶放置在磁力搅拌器上，搅拌过夜至聚合物全部溶解；将溶解后的溶液置于10KD透析袋内透析12~24h，除去4-二甲氨基吡啶、组胺二盐酸盐和溶剂；透析后，将透析袋中的液体转移至离心管中，4000rpm，30s；剩余液体冻干，得到产物含咪唑的阳离子聚合物。

本发明提供的所述药物递送载体通过对胆固醇-聚乙二醇进行Galactose修饰，形成所述Cholesterol-PEG-Galactose（胆固醇-聚乙二醇-半乳糖），结构如下：

修饰后的Cholesterol-PEG-Galactose改善了与肝细胞表面ASGPR结合的特异性，有利于提高脂质体纳米颗粒的肝靶向性，实现siRNA递送系统向肝脏的特异性递送，既减轻了对机体其他脏器的损伤又提高了siRNA药物疗效，为肝脏疾病临床药物应用提供更高效的治疗手段。

在一实施例中，所述辅助电离脂质分子选自DSPC。

所述DSPC结构如下：

DSPC常作用于脂质体微泡造影剂及药物脂微球，DSPC作用于膜材时，多应用于脂质体药物，稳定性较好。

在一实施例中，所述连接脂质选自CHOL。

所述CHOL结构如下：

所述CHOL是制备脂质体常用的正电荷脂质之一，CHOL在稳定脂质体膜结构的同时为粒子提供正电性，还可高效负载基因。

在一实施例中，以重量份计，所述药物递送载体包括以下组分：

阳离子聚合物 15.5~46份，脂质组合体 10~35.5份，靶向分子 2~18.5份。

在一实施例中，所述脂质组合体包括2.4~17.9重量份的辅助电离脂质分子和3.6~21.5重量份的连接脂质。

本发明一实施例提供了上述药物递送载体在肝脏靶向药物中应用。

所述阳离子脂质体复合物纳米颗粒在酸性环境下能够与氢离子结合呈正电，借助两者的静电吸附，将核酸包裹在阳离子脂质体复合物纳米颗粒中；包裹后的结构外部因阳离子聚合物的疏水端向外而呈疏水性，此时加入脂质体合成中常用的一端修饰有PEG的脂质，使PEG-脂质的疏水端与阳离子聚合物的疏水端结合，而PEG-脂质的亲水端（连有PEG）则向外形成核酸脂质纳米粒外壳；为了增加核酸脂质纳米粒的稳定性，还可以添加适量的Chol及DSPC等成分，使PEG-脂质的疏水端与阳离子聚合物的疏水端结合更为紧密，最终得到阳离子脂质体复合物纳米颗粒；具体的，含咪唑的阳离子聚合物可与带负电的siRNA 通过静电作用形成阳离子聚合物/siRNA 复合物， 通过网格蛋白和小窝介导的内吞途径进入肝脏细胞，实现siRNA递送系统向肝脏的特异性递送，有效提高递送siRNA药物靶向肝细胞的效率，所述既减轻了细胞膜的非特异性互作诱导的细胞毒性活动，也缓解了对机体其他脏器的损伤，提高了siRNA药物疗效，为肝脏疾病临床药物应用提供更高效的治疗手段。

在一实施例中，所述肝脏靶向药物还包括具有糖尿病预防或治疗作用的药物活性成分，所述药物活性成分包裹于所述药物递送载体中。

具体的，所述肝脏靶向药物中的药物活性成分包裹于药物递送载体中，能实现药物的高效转运，避免药物降解，减少毒副作用的发生。

在一实施例中，所述药物活性成分为siRNA，所述肝脏靶向药物的N/P摩尔比为（1:1）~（1:8）；其中，N代表含咪唑的阳离子聚合物中的总氮元素的物质的量，P代表siRNA中总磷元素的物质的量。

在一实施例中，所述糖尿病包括II型糖尿病。

在一实施例中，所述药物活性成分包括抑制肝脏细胞中LOC157273基因表达的siRNA。

所述药物活性成分可特异性抑制肝脏细胞中LOC157273基因的mRNA的复制转录，从而发挥治疗效果。

本发明另一实施例还提供一种糖尿病治疗药物，包括药物活性成分和如上所述的药物递送载体，所述药物活性成分包裹于所述药物递送载体中。

具体的，采用靶向性的糖尿病治疗药物可以将药物定向递送到靶细胞，提高药物进入靶细胞的药效浓度，从而发挥治疗作用。

在一实施例中，所述糖尿病治疗药物还包括药学上可接受的辅料。

在一实施例中，所述辅料包括缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂和消泡剂中的一种或多种。

所述药物辅料除了赋形、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能。

本发明另一实施例还提供一种药物递送载体的制备方法，包括以下操作步骤：

称取阳离子聚合物、辅助电离脂质分子、连接脂质和靶向分子，溶解分散于有机溶剂中，加入酸性缓冲液进行水化，去除有机溶剂得到药物递送载体。

在一实施例中，所述有机溶剂为乙醇。

所述酸性缓冲液为Tris-HCl buffer。

以下通过实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1

本实施例用于说明本发明公开的一种肝靶向的药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物，包括以下步骤：

含咪唑的阳离子聚合物的制备

取聚（马来酸酐-alt-1-十八烯）粉末0.5g、组胺二盐酸盐1g和4-二甲氨基吡啶0.1g置于样品瓶中（4-二甲氨基吡啶作为催化剂促进聚合物生成），在瓶中加入20ml无水二甲基亚砜，超声破碎仪超声助溶；见部分聚合物溶解于无水二甲基亚砜后，在样品瓶中加入磁珠，并将样品瓶放置在磁力搅拌器上，1600rpm，0~100℃搅拌过夜至聚合物全部溶解；将溶解后的溶液置于10KD透析袋内透析12~24h，除去4-二甲氨基吡啶、组胺二盐酸盐和溶剂；透析后，将透析袋中的液体转移至离心管中，4000rpm，30s；剩余液体冻干，得到产物含咪唑的阳离子聚合物。

含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒（药物递送载体）的制备

精密称取45mg 含咪唑的阳离子聚合物，7.9mg DSPC，14.8mg Chol，2mgCholesterol-PEG-Galactose；

将上述称取的各组分溶于8mL乙醇，将siRNA溶解在DEPC水中后加入到上述有机溶液中，加入Tris-HCl buffer进行水化；

采用乙醇注射沉淀法组装负载siRNA的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒，该方法将溶解在乙醇溶液中的脂质组分与siRNA在Tris-HCl buffer中快速混合，然后将混合物用超纯水透析，除去乙醇，得到最终的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒。

实施例2

本实施例用于说明本发明公开的一种肝靶向的药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物，包括以下步骤：

含咪唑的阳离子聚合物的制备

取聚（马来酸酐-alt-1-十八烯）粉末0.5g、组胺二盐酸盐1g和4-二甲氨基吡啶0.1g置于样品瓶中（4-二甲氨基吡啶作为催化剂促进聚合物生成），在瓶中加入20ml无水二甲基亚砜，超声破碎仪超声助溶；见部分聚合物溶解于无水二甲基亚砜后，在样品瓶中加入磁珠，并将样品瓶放置在磁力搅拌器上，1600rpm，0~100℃搅拌过夜至聚合物全部溶解；将溶解后的溶液置于10KD透析袋内透析12~24h，除去4-二甲氨基吡啶、组胺二盐酸盐和溶剂；透析后，将透析袋中的液体转移至离心管中，4000rpm，30s；剩余液体冻干，得到产物含咪唑的阳离子聚合物。

含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒（药物递送载体）的制备

精密称取35mg 含咪唑的阳离子聚合物，7.9mg DSPC，15mg Chol，1.8mgCholesterol-PEG-Galactose；

将上述称取的各组分溶于8mL乙醇，将siRNA溶解在DEPC水中后加入到上述有机溶液中，加入Tris-HCl buffer进行水化；

采用乙醇注射沉淀法组装负载siRNA的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒，该方法将溶解在乙醇溶液中的脂质组分与siRNA在Tris-HCl buffer中快速混合，然后将混合物用超纯水透析，除去乙醇，得到最终的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒。

实施例3

本实施例用于说明本发明公开的一种肝靶向的药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物，包括以下步骤：

含咪唑的阳离子聚合物的制备

取聚（马来酸酐-alt-1-十八烯）粉末0.5g、组胺二盐酸盐1g和4-二甲氨基吡啶0.1g置于样品瓶中（4-二甲氨基吡啶作为催化剂促进聚合物生成），在瓶中加入20ml无水二甲基亚砜，超声破碎仪超声助溶；见部分聚合物溶解于无水二甲基亚砜后，在样品瓶中加入磁珠，并将样品瓶放置在磁力搅拌器上，1600rpm，0~100℃搅拌过夜至聚合物全部溶解；将溶解后的溶液置于10KD透析袋内透析12~24h，除去4-二甲氨基吡啶、组胺二盐酸盐和溶剂；透析后，将透析袋中的液体转移至离心管中，4000rpm，30s；剩余液体冻干，得到产物含咪唑的阳离子聚合物。

含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒（药物递送载体）的制备

精密称取40mg 含咪唑的阳离子聚合物，7.9mg DSPC，14.3mg Chol，3.2mgCholesterol-PEG-Galactose；

将上述称取的各组分溶于8mL乙醇，将siRNA溶解在DEPC水中后加入到上述有机溶液中，加入Tris-HCl buffer进行水化；

采用乙醇注射沉淀法组装负载siRNA的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒，该方法将溶解在乙醇溶液中的脂质组分与siRNA在Tris-HCl buffer中快速混合，然后将混合物用超纯水透析，除去乙醇，得到最终的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒。

实施例4

本实施例用于对比说明本发明公开的一种肝靶向的药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物，包括实施例1中大部分操作步骤，其不同之处在于：

脂质体制备中不添加DSPC和Chol，其余组分溶于乙醇中。

实施例5

本实施例用于对比说明本发明公开的一种肝靶向的药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物，包括实施例1中大部分操作步骤，其不同之处在于：

脂质体制备中不添加DSPC，其余组分溶于乙醇中。

性能测试

一、含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒的粒径和表面电位（Zeta potential）的测定

对实施例1-5得到的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒进行粒径和表面电位检测，测试结果如图1-5所示。

由图1-5的测试结果可知，实施例4和实施例5纳米颗粒的Zeta电位都在50mV左右，在体内易与带负电荷的生物大分子发生吸附反应，容易引发免疫相关反应，且不利于纳米颗粒进入细胞，另外双组份和三组份的纳米颗粒粒径较大，可能对药物通过细胞膜进入细胞和药物代谢有一定的影响；实施例1-3制备的纳米颗粒的Zeta电位相较于实施例4和实施例5的纳米颗粒降低了10mV左右，既满足了电位＞30mV又确保了纳米颗粒的稳定性要求，相应的又可减少体内吸附反应的发生。

二、含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒与siRNA吸附实验检测

步骤一：将含咪唑的阳离子聚合物与一段乱序siRNA分别按照一定的N/P摩尔比进行混合，分别为1：1、1：2、1：4、1：8、1：10，N代表含咪唑的阳离子聚合物中的总氮元素的物质的量，P代表乱序siRNA中总磷元素的物质的量；

步骤二：称取1g琼脂糖，加入10mL 10x电泳缓冲液，再加入90mL蒸馏水，加热溶解，配制成1%琼脂糖凝胶，稍凉后加入显色荧光核酸染色剂GelStain，将琼脂糖凝胶放置在电泳槽中，电泳槽加入新配置的电泳缓冲液；

步骤三：将DNA marker与样品滴加至琼脂糖凝胶泳道中，220V，120A电泳30分钟，凝胶显影仪显影检测。

由图6可知，在N/P为1：8左右时，含咪唑的阳离子聚合物与siRNA的结合率是最高的。

三、含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒递送效果检测

步骤一：选取染料cy3修饰一段乱序siRNA，利用本发明实施例1制备的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒，将乱序siRNA包裹在内，向人肝癌细胞HepG2中转染；

步骤二：将生长状态良好的人肝癌细胞系HepG2用胰蛋白酶消化，以1×10⁴cells/孔的密度接种于8孔板，添加含有10% 胎牛血清和1%双抗（青霉素与链霉素）的DMEM培养基，37℃，5% CO₂过夜培养，培养24 h细胞贴壁后，更换含有步骤一制备的包含siRNA的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒的DMEM培养基，温育24 h；

步骤三：在siRNA转染HepG2细胞24 h后，利用共聚焦激光扫描显微镜观测。

由图7的共聚焦荧光图可知，利用本发明制备的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒，向人肝癌细胞HepG2中转染，在siRNA转染HepG2细胞24 h后，采用共聚焦激光扫描显微镜观测到 cy3 分布在细胞质中，说明本发明的纳米颗粒负载 siRNA 后，成功将siRNA 递送至靶细胞，并进入细胞膜，完成靶向递送。

四、含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒转染效果检测

步骤一：GFP标记人肝癌细胞系HepG2

选取所述美国维多利亚西海岸的绿色水母荧光蛋白（GFP）的mRNA作为靶基因，所述利用慢病毒颗粒使人肝癌细胞系HepG2稳定表达GFP，再利用本发明实施例2制备的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒，向HepG2中转染靶向GFP的siRNA，5’-3’的序列为：GCACCAUCUUCUUCAAGGAdTdT。

步骤二：检测HepG2细胞中GFP表达水平

所述HepG2细胞按照 1×10⁴ cells/孔的密度接种于96孔板，每孔添加100 µL含10%胎牛血清和1%双抗（青霉素和链霉素）的DMEM培养基，37℃、5% CO₂条件培养箱培养24 h后，弃去培养基，PBS清洗两次，加入无血清的DMEM，一组为实验组（Inp），每孔加入20µL 本发明制备的实施例三的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒（含siRNA（序列5’-3’为：GCACCAUCUUCUUCAAGGAdTdT）；另一组为对照组（裸siRNA），以无脂质体载体的裸siRNA在其他条件相同情况下进行转染，另一组为空白对照组，即不添加脂质体载体和siRNA在其他条件相同情况下进行转染；继续在培养箱中培养5 h后吸去培养液，用PBS洗两次，加入预热的含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基；所述37℃、5% CO₂条件培养箱分别培养24 h、48 h后，放入多功能酶标仪BioTek中，振板10s后，设置激发488nm，发射510nm检测荧光强度。

由图8结果可知，培养24 h后，实验组（Inp）荧光强度最弱，空白对照组次之，对照组（裸siRNA）荧光强度最强；培养48 h后，实验组（Inp）荧光强度最弱，空白对照组荧光强度最强，对照组（裸siRNA）荧光强度略低于空白对照组；培养24 h 、48 h后测得的实验组（Inp）荧光强度均最弱，即表明利用本发明实施例3制备的纳米颗粒能将 siRNA 包裹递送至人肝癌细胞，并成功进入细胞，实现siRNA 的内涵体逃逸，实现了良好的递送及释放效果。

五、Galactose修饰的靶向效果验证

步骤一：选取所述美国维多利亚西海岸的绿色水母荧光蛋白（GFP）的mRNA作为靶基因，所述利用慢病毒颗粒使人肝癌细胞系HepG2和HUV人脐静脉内皮细胞稳定表达GFP，将HepG2人肝癌细胞和HUV人脐静脉内皮细胞分别按照1×10⁴ cells/孔的密度接种于96孔板，每孔加100 μL含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基，37℃、5%CO₂条件下培养箱培养24h；取上述HepG2和HUV，弃去培养基，PBS清洗两次加入无血清的DMEM，不添加含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒的HepG2（HepG2-blank）和HUV（HUV-blank），作为空白对照组；向HepG2细胞中添加负载GFP-siRNA的实施例2提供的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒（HepG2+LNP）,向HUV细胞中添加负载GFP-siRNA的实施例2提供的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒（HUV+LNP）作为实验组。

步骤二：将上述不同处理的实验样品继续培养5h后吸去培养液，PBS清洗两次，加入预热的含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基，37℃、5%CO₂条件下培养箱分别培养24 h、48h后；上述待测样品置于酶标仪BioTek中，振板10s后，设置激发488nm，发射510nm检测荧光强度。

由图9的测试结果可知，实验组HepG2+LNP荧光强度最弱，HUV+LNP次之，空白组HepG2-blank及HUV-blank检测荧光强度较强，但两空白对照组荧光强度差距不显著；即相比于HUV人脐静脉内皮细胞，本发明制备的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒对于人肝癌细胞系HepG2的转染效果更好，说明其具有较好的肝脏靶向性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种肝靶向的药物递送载体，其特征在于，以重量份计，由阳离子聚合物 15.5~46份，脂质组合体 10~35.5份和靶向分子 2~18.5份组成，所述阳离子聚合物为含咪唑的阳离子聚合物，所述脂质组合体由辅助电离脂质分子和连接脂质组成，所述辅助电离脂质分子选自DSPC，所述连接脂质选自CHOL，所述靶向分子为半乳糖修饰的胆固醇-聚乙二醇，即Cholesterol-PEG-Galactose，所述含咪唑阳离子聚合物由以下方法制备得到：

取聚（马来酸酐-alt-1-十八烯）粉末、组胺二盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，加入无水二甲基亚砜，反应，除去4-二甲氨基吡啶、组胺二盐酸盐和溶剂，透析，离心，得到产物含咪唑的阳离子聚合物。

2.根据权利要求1所述的一种肝靶向的药物递送载体，其特征在于，所述脂质组合体由2.4~17.9重量份的辅助电离脂质分子和3.6~21.5重量份的连接脂质组成。

3.如权利要求1或2所述的药物递送载体在制备肝脏靶向药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的药物递送载体在制备肝脏靶向药物中的应用，其特征在于，所述肝脏靶向药物还包括具有糖尿病预防或治疗作用的药物活性成分，所述药物活性成分包裹于所述药物递送载体中。

5.根据权利要求4所述的药物递送载体在制备肝脏靶向药物中的应用，其特征在于，所述糖尿病包括II型糖尿病。

6.根据权利要求4所述的药物递送载体在制备肝脏靶向药物中的应用，其特征在于，所述药物活性成分包括抑制肝脏细胞中LOC157273基因表达的siRNA。

7.一种糖尿病治疗药物，其特征在于，包括药物活性成分和如权利要求1或2所述的药物递送载体，所述药物活性成分包裹于所述药物递送载体中，所述药物活性成分包括抑制肝脏细胞中LOC157273基因表达的siRNA。

8.根据权利要求7所述的糖尿病治疗药物，其特征在于，所述糖尿病治疗药物还包括药学上可接受的辅料。

9.根据权利要求8所述的糖尿病治疗药物，其特征在于，所述辅料包括缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、凝结剂、扩散剂和消泡剂中的一种或多种。

10.如权利要求1或2所述的药物递送载体的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

称取阳离子聚合物、辅助电离脂质分子、连接脂质和靶向分子，溶解分散于有机溶剂中，加入酸性缓冲液进行水化，去除有机溶剂得到药物递送载体。

11.根据权利要求10所述的药物递送载体的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇。

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