CN103623416A - 靶向配体-peg-胆固醇/生育酚衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属药物制剂领域，靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物及其制备方法和应用，具体其在复合机制介导肿瘤靶向药物传递系统中的应用，本发明以具有寻靶功能、长循功能和pH敏感功能的靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物为功能性材料，与阳离子脂质体和药物组成的递药系统，能同时运载抗癌多肽和基因/化疗药物。本系统利用组分间的理化性质差异，或通过在体内特异性靶向识别、信号传导阻断、pH触发PEG链断裂致电荷反转的方法，实现将不同药物共同包载到脂质纳米递药系统中递送入靶细胞内，从而提高肿瘤靶向治疗效果。本发明通过体内外活性评价，证明了了该系统在定向输送、共输送等方面的优势，显著提高抗癌活性，具有明确的协同治疗效果及免疫效果。

Description

靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属药物制剂领域，涉及一种靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物及其制备方法和应用，具体地涉及靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物在药物传递系统中同时运载抗癌多肽和基因/化疗药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病。癌症治疗是目前世界性难题。化疗作为临床治疗癌症的重要手段，已成为目前临床治疗恶性肿瘤最直接有效的方法之一。然而由于化疗药物的高毒性和重复使用易诱导肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药性（Multi-Drug Resistance，MDR），严重影响着临床化疗效果，90%以上肿瘤死亡患者都与不同程度的耐药相关。逆转肿瘤细胞的耐药性，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，对肿瘤治疗意义重大。

MDR的产生和多药耐药基因编码的P-gp（P-glycoprotein）膜蛋白等外排蛋白和Bcl-2等抗凋亡蛋白过度表达有关。有研究显示，下调或阻断MDR表达可显著增强肿瘤细胞的化疗敏感性，逆转多药耐药。针对肿瘤细胞耐药基因的siRNA干扰技术在体外细胞水平取得了较好的较果，RNA干扰技术具有高效、低毒、特异性强的特点，其中TKM-PLK1、ALN-VSP和Atu027的siRNA均已进入I期临床用于实体肿瘤治疗。利用siRNA技术沉默MDR耐药基因，抑制相关蛋白表达，联合化疗药物是提高肿瘤对化疗药物敏感性最有效的手段之一。

近年来，联合化疗药物/基因药物共输送（co-delivery）用于肿瘤治疗策略逐渐引起人们的关注。已有明确实验证据表明化疗药物与基因药物联合应用可以依据二者对肿瘤细胞作用部位和作用机制不同实现对肿瘤细胞协同杀伤和增殖抑制的功能，补充单纯化疗药物作用靶点单一的不足，减小化疗药物剂量，降低毒副作用。阳离子脂质体在所有已用于临床试验的基因载体中仅次于病毒载体居第二位，是最有发展前景的非病毒载体，特别适用于带负电荷的DNA/RNA和亲水性/或疏水性化疗药物的共输送。然而阳离子脂质体用于共输送传递载体在应用上仍面临问题，主要表现在：（1）对病灶部位微环境响应能力不强，影响药物递送效率。（2）组织选择性不理想，缺少只针对肿瘤细胞的特异性靶点。如何提高载体的靶向效率及其递送效率，探寻新型的特异性靶点，最终实现理想靶向药物传递，是肿瘤靶向共输送药物载体设计面临的重要科学问题。基于目前载体存在的关键问题，迫切需求新型靶向共输送药物传递载体。

采用同时具有PEG链的引入不影响共输送药物的包载、主动靶向至肿瘤组织、受肿瘤微环境触发脱去PEG长链、入胞前电荷反转为带正荷等多重功能于一身的共输送药物载体未见诸于国内外相关文献报道。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物。

本发明同时提供了靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物的制备方法和在靶向纳米递药系统中的应用。该系统通过复合机制介导，将具有特异靶向识别、信号传导阻断、pH触发断裂引起电荷反转、逆转MDR、能同时包载化疗药物或诊断药物和基因药物等复合机制介导自组装共输送药物传递纳米递药系统。

本发明的纳米递药系统能够将基因药物和化疗药物同时递送到靶细胞内，并通过静脉注射给药途径发挥协同治疗癌症的作用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物的结构式为R-PEG-Z–R₁，其中R代表甲基、anti-EphA10抗体、小分子配体、多肽配体和核酸适体中的一种,优选抗EphmAb、叶酸、甘草次酸、RGD、生物素；

Z代表各种pH敏感键，主要为腙键、乙烯醚键、二硫键、酯键、原酸酯键、缩酮键、酰胺键，为以下结构中的一种：

R₁胆固醇、α-生育酚的一种，为以下结构的一种：

其中PEG分子量范围2000-5000。

本发明分三步合成了靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物：

①靶向配体-PEG衍生物的合成。

靶向配体-PEG衍生物包括：“anti-EphA10抗体-PEG衍生物”、“小分子配体-PEG衍生物”、“多肽配体-PEG衍生物”、“核酸适体-PEG衍生物”。其结构式为R-PEG-X，其中R代表甲基、anti-EphA10抗体、小分子配体、多肽配体和核酸适体中的一种。X代表功能基团，具体是指羟基、巯基、羧基、磺酸基、氨基、酰氯、酸酐、醛基和马来酰亚胺等中的一种。

R-PEG-X的结构制备：在容器中将50mg双功能的PEG用无水二氯甲烷溶解，加入定量的催化剂（HATU和/或EDCI），将按摩尔量的0.9倍的靶向分子加入反应液中，室温反应，制得靶向分子-PEG-X，产物倒入水中，用乙酸乙酯萃取，将有机层旋蒸干燥即得产物。

②可断裂脂质衍生物的合成，可断裂的脂质衍生物包括“可断裂胆固醇衍生物”、“可断裂生育酚衍生物”。其结构式为R1-Z-Y，其中R1为胆固醇、α-生育酚衍生物的一种：

Z代表各种pH敏感键，主要为酰胺键、席夫碱键、乙烯醚键、二硫键、金酯键、原酸酯键、缩酮键、酰胺键等，其中Z可以存在可断裂脂质衍生物中，也可通过与R-PEG-X反应后生成。

Y为功能基团，可与R-PEG-X中X反应形成靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物。

R1-Z-Y的制备方法如下：在密闭容器中，取适量的R1的酰氯化物于过量二氯甲烷中，将Z的四氢呋喃溶液加入上述溶液中，加入二环己基碳二亚胺（EDC）/N-羟基琥珀亚胺（NHS），室温或加热搅拌反应1-72h，用二氯甲烷/水萃取有机相，然后过硅胶柱分离，减压除去溶剂，加入无水二氯甲烷溶解，与过量Y反应。产物经过柱分离即得到终产物。

③靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物的制备：R-PEG-X与R1-Z-Y之间可在室温/加热/低温条件下形成靶向分子-PEG-可断裂键-胆固醇/生育酚衍生物，此衍生物既可在制剂过程中直接加入也可将在制剂完成后同通过功能基团之间反应形成。

该靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物也可通过如下方法制备：在一密闭容器中，R-PEG-X与R1的摩尔比为0.2-1，在氦气的保护下，以二氯甲烷为反应溶剂，加入适量催化剂，室温/加热反应1-72h，得到粗产物经分离纯化后得到终产物。

本发明还提供了该靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物在复合机制介导的靶向药物递送系统构建中的应用。

复合机制介导自组装共输送药物传递载体的构建

将药物、中性脂质材料、阳离子脂质、功能性胆固醇/或α-生育酚按照摩尔比1：（10～40）：（10～40）:（5～10），优选1:10～:30：10～30：5～7的比例在溶剂中混合采用薄膜分散法，逆相蒸发法、溶剂注入法、表面活性剂去除法、冻干再水化法、pH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法等方法制备脂质体。此时可以充分利用组分间的物理化学性质的差异，或通过静电复合进行载药，或通过主/被动结合的方法，实现放化疗药物/蛋白药物/基因药物在纳米药物传递系统上的包载，脂质体表面上功能性脂质材料与功能性聚乙二醇一侧通过PH敏感键连接，聚乙二醇的另一侧功能性基团与寻靶材料相连，所述药物与具有抗癌活性的多肽/基因药物通过静电吸附包载或被动结合载药方式共同包载到脂质纳米递药系统中后同时递送至靶细胞，即通过载体的靶向分子或被动靶向将药物定向输送到靶细胞内部，达到协同治疗的的目的。

本发明靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物中的PEG和胆固醇/α-生育酚衍生物通过在肿瘤微环境的酸性条件发生断裂的腙键、乙烯醚键、二硫键、金属蛋白酶键、酯键、原酸酯键、缩酮键相连。

所述的中性脂质材料包括：所述的中性脂质为二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE），磷脂酰胆碱（PC），磷脂酰丝氨酸（PS），二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC），1,2-二油酰甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC），胆固醇（chol）中的一种或几种。

所述的阳离子脂质包括：2,3-二油酰氧丙基-1-三甲胺(DOTAM)，[1-（2,3-二油酰基）]-N,N,N-三甲胺丙烷(DOTAP)，3β-[N-（N’,N’-二甲氨基乙基）]-胆固醇（DC-chol），N-（2-羟乙基）-N,N-二甲基-1,3-双（十四烷氧基-1-丙铵）（DMRIE），双十八烷氨酰精胺（DOGS），二胍胆固醇（BGTC），十八胺中的一种或几种。

本发明中所述PEG分子量为2000-5000。

所述的药物为基因药物、蛋白多肽药物、化疗药物或放疗药物；所述的基因药物选自肿瘤特异性凋亡基因、逆转肿瘤多药耐药基因、编码肿瘤凋亡基因的反义RNA或引起肿瘤凋亡的小干扰siRNA或发卡shRNA或microRNA；所述蛋白多肽类药主要包括酶和辅酶类药物、细胞生长因子和核酸及其降解产物等；所述的化疗药物是：烷化剂类药物、抗代谢类药物、抗生素类药物、生物碱类药物、免疫制剂、激素类药物或金属类药物以及诊断类药物；

所述药物传递系统其中脂质体通过其表面功能性脂质与功能性聚乙二醇的功能性官能团缩合连接形成具有PH敏感功能的键；

靶材料中的巯基或胺基或羧基或氨基与功能性聚乙二醇末端的巯基或马来酰亚胺基或酰肼或生物素-亲和素等相连接。

该衍生物可用于制备脂质体、囊泡、胶束、乳剂、纳米脂质载体等液体微粒制剂，含有靶向分子或甲氧基的聚乙二醇分子在液体微粒制剂体内循环过程中或到达靶部位后从制剂表面脱落。

该衍生物既可用于被动靶向制剂也可用于主动靶向制剂：所述被动靶向制剂主要为聚乙二醇端为甲氧基修饰的液体微粒制剂；所述主动靶向制剂包括由靶向分子修饰的液体微粒制剂。靶向分子包括anti-EphA10抗体、小分子配体、多肽配体或核酸适体等。

本发明中，所述的靶向分子是能同肿瘤细胞或靶细胞特异性结合分子，与PEG-可断裂-脂质衍生物偶联成的主动靶向复合物。所述靶向分子既可以为单一PEG-可断裂-脂质衍生物材料，如PEG-腙键-胆固醇，聚乙二醇-乙烯基醚键-生育酚等，也可以是多种衍生物的混合材料。所制备的脂质衍生物材料的聚乙二醇的一端可以是甲氧基也可以是马来酰亚胺基、巯基、酰胺基、氨基、羧基、生物素或亲和素中的一种，该活性基团可与靶向分子通过共价键相连。

本发明中，特异性结合肿瘤细胞或靶细胞的分子包括：特异性结合癌细胞或靶细胞的抗体如anti-EphA10抗体、小分子配体为叶酸，甘草次酸、半乳糖、多肽配体为RGD环肽或多肽。

本发明中采用多脂质材料组成脂质膜，采用薄膜分散法，逆相蒸发法、溶剂注入法、表面活性剂去除法、冻干法、pH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法等方法制备制备脂质体。详细制备方法如下：

（1）制备脂质体，按摩尔比1:（10～40）:（10～40）:（5～10）将药物、中性脂质材料、阳离子脂质、靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物混合，按薄膜分散法，逆相蒸发法、溶剂注入法、表面活性剂去除法、冻干再水化法、PH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法中的一种制备脂质体；

（2）将功能化PEG与脂质体中的功能性脂质缩合，形成具有PH敏感功能的长循环脂质体；

（3）利用功能化PEG的另一端与靶材料相连接，形成复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统。

本发明中的自组装共输送药物传递系统中，主要通过以下方式进行载药：①脂质成分与药物之间静电相互作用②根据药物的性质采用主动或被动或主被动相结合的方式。

低pH值是肿瘤组织微环境中广泛存在的一种现象，这主要是由肿瘤组织的快速增值与供氧不足的矛盾，葡萄糖的过度酵解以及淋巴循环不畅导致酸性物质积累所导致的。本发明中当可断裂PEG脂质衍生物修饰的微粒制剂注射入血后，到达酸性环境时，在H+作用下PEG与脂质衍生物之间化学键发生断裂，PEG脱离制剂表面，表面不含聚乙二醇的液体微粒制剂可与病变组织细胞结合，通过内吞、胞饮等方式将药物或诊断试剂递送入细胞，达到杀死杀伤或改变细胞基因表达或产生细胞免疫以及诊断的作用。

附图说明

图1为复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统与siRNA复合后的凝胶阻滞实验考察载体与siRNA的结合能力。分别用阳离子脂质与siRNA的质量比为1、3、5、7、10和15考察结合能力，如图所示，当阳离子脂质与siRNA的比例5时，在电泳所在条件下，载体与siRNA紧密结合。

图2为复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统细胞毒作用。采用复合机制介导的载体在低pH条件下释放药物量增加，对细胞毒性增强。

图3为复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统有/无叶酸配体与低表达/高表达受体，表现的RNAi所产生的蛋白表达抑制作用。在叶酸受体的介导下，载体表面的配体分子同细胞表面受体结合通过受体介导的内吞作用进入细胞，入胞量显著增加，产生的蛋白表达抑制作用增强。

图4为RGD复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统细胞内，FAM-siRNA荧光强度。在4℃条件下，细胞膜流动性下降，内吞作用降低，细胞摄取量减少；在37℃，膜流动能力强，摄取量随时间延长增加。

图5为复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统在不同pH条件下，阿霉素的释放量和与载体结合的量。由于PEG等与载体通过pH敏感键连接，在酸性条件下化学键发生断裂，脱去PEG等大分子使载体不稳定，从而释放药物分子。

图6为复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统在递送siRNA后产生蛋白表达抑制作用效果。不同N/P介导的MDR1的siRNA转染HepG2细胞24h后测定细胞内表达p-gp的量。

图7为复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统MDR1siRNA/PTX共输送对

MCF-1/Adr细胞的杀伤作用。抗Surivivin的siRNA与PTX联合作用对

MDA-MB-468细胞的增值抑制作用。

具体实施方案

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但方法不仅局限于所给出的实施例。

实施例1：抗EphmAb-聚乙二醇-胆固醇的合成与DOX/siRNA阳离子脂质体的制备与制剂学/生物学考察

1)Ep10mAb-PEG₂₀₀₀-SH的合成

将双功能PEG₂₀₀₀用水溶解，加入一定量的EDC和S-NHS，室温反应，透析出去过量产物，将一定量的Ep10mAb加入反应液中，避光反应，制备Ep10mAb-PEG₂₀₀₀-SH透析除去过量反应物，冷冻干燥即得。产物纯化后，使用红外光谱、核磁共振光谱对产物的结构确定。然后分别采用电泳和ELISA方法考察抗体与PEG连接后对其活性的影响及连接后的抗体对肿瘤细胞增殖的影响。

2）pH敏感胆固醇衍生物的合成

取适量胆固醇氯甲酸酯溶于过量乙二胺中，室温搅拌反应18h，用二氯甲烷/水萃取有机相，然后将有机相过硅胶柱分离，减压除去有机溶剂，得产物A（IR:3337.9,2940.4,2867.4,1696,1470.4;1H NMR:δ=0.66(S,3H),085(d,6H),1.01(S,3H),3.226(q,2H),5.363(d,1H)）。然后将产物溶于二氯甲烷，加入过量的戊二醛，室温反应12h，再次分离纯化得产物B(IR:2886.1，1759.3，1623;1H NMR:δ=7.96(S,1H))。将产物B与4-马来酰亚胺乙酰肼溶于二氯甲烷中反应8h，分离纯化即得pH敏感胆固醇衍生物C。

3）复合机制介导的自组装共输送药物传递载体的制备及表征

采用薄膜分散-超声法/挤出法制备紫杉醇（PTX）阳离子脂质体，按照处方比例（30～40）：（30～40）：（5～10）：（1～5）将DOPE、DOTAP、功能性胆固醇衍生物和PTX溶于二氯甲烷中，旋转蒸发形成脂质膜，加入0.1M PBS水化，然后采用超声/挤出制备脂质体，除去游离PTX后即得PTX阳离子脂质体。将得到的DOX阳离子脂质体与siRNA按照N/P=7.5在室温下孵育复合，形成siRNA/DOX/阳离子脂质体复合物。然后将上述合成的Ep10mAb-PEG₂₀₀₀-SH在室温条件下加入反应形成共价键，构建成复合机制介导的自组装共输送药物载体。进一步通过优化处方、改变比例、反应时间、温度考察载体的形成/载药的影响。进行凝胶阻滞实验，考察脂质体体与siRNA的结合能力，考察结果如图1所示。采用人乳腺癌MCF-7、MCF/Adr考察复合机制介导的自组装载体靶向效率、细胞摄取、基因沉默、PTX诱导凋亡逆转多药耐药等方面作用，并采用裸鼠荷瘤的方法考察了载体的体内分布验证了载体的靶向性。如图2所示，在不同pH条件下，包含PTX的载体的细胞毒性，在低pH条件下，毒性显著高于高pH条件下的毒性，而游离PTX组合普通制剂组在两个pH条件下差别不大。

实施例2：叶酸-PEG-胆固醇衍生物的合成及自组装载体的构建和制剂学与生物学研究。

500mg叶酸与NHS溶于10ml的DMSO中，过量的DCC加入溶液中室温下搅拌过夜，抽滤除去不溶性二环己脲。将叶酸-NHS与双氨基PEG溶于DMSO室温下避光孵育过夜。将上述产物过二乙胺基乙基-Tris阴离子交换柱，采用NH₄HCO₃梯度洗脱。将过量的胆固醇氯甲酸酯与叶酸-PEG-NH₂溶于氯仿中按照上述反应条件室温过夜反应，并且通过茚三酮反应检测反映的进行程度。反应产物在真空条件下干燥，乙醚洗涤除去未反应的胆固醇氯甲酸酯，以二氯甲烷/甲醇为流动相通过硅胶柱分析产物的纯度。1H-NMR（DMSO-de）表征产物的合成，波谱显示：δ8.65、7.68、6.56是叶酸上相应基团的化学位移，δ3.54是PEG质子化学位移峰，δ0.91、δ1.68～0.96为胆固醇氢化学位移以及δ8.03酰胺键，证明了叶酸-PEG-胆固醇衍生物的合成。

将上述得到的叶酸-PEG-胆固醇衍生物、DOPE和DOTAP按照实施例1中比例溶于成膜溶剂中，旋转蒸发除去成膜溶剂。将脂质混合物重新溶于含有少量甲醇的3ml乙醚中。加入溶解0.1mg盐酸阿霉素的PBS1ml，放置水浴超声中直至混合物变为有乳光的均匀分散体为止。将分散体置于旋转蒸发仪中，室温，减压除去有机溶剂。当达到一临界点时，混合物变为水混悬液，进一步减压旋蒸15min,探头超声过滤膜后即得脂质体。进转染时，将阳脂质体与siRNA按照N/P=7.5复合，进行转染即可。用HePG2和KB细胞考察载体的靶向性，在KB中随着叶酸-PEG-胆固醇的摩尔比的增多，细胞摄取增加为普通脂质体摄取的12倍，而普通隐形脂质体随着PEG量增加，摄取量显著下降。而在HePG2中叶酸-PEG-胆固醇增加对摄取量无明显影响，这证明了载体通过叶酸介导的内吞作用进入细胞。而叶酸介导的包载siRNA转染实验也印证了上述结论，如图3所示，无叶酸受体表达HePG2蛋白表达量无明显差异，而高叶酸受体表达KB，蛋白表达量显著降低。

实施例3：甘草次酸-PEG-生育酚衍生物的合成及其自组装载体的构建与制剂及生物学研究

适量α-生育酚琥珀酸酯溶于二氯甲烷中，依次加入功能性HO-PEG-OH、二甲氨基吡啶、N-（3-二甲基氨基丙）-N’-乙基碳化二亚胺酸盐室温下搅拌反应16h。采用硅胶柱对产物予以分离纯化。使甘草次酸与PEG化-生育酚琥珀酸酯发生化学反应通过酯键相连。1H-NMR（CDCl3）表征产物的合成，δ5.69、5.6是甘草次酸烯键（-（C=O）-CH=C-）氢原子的化学位移，δ3.52～3.76是PEG分子的化学位移，δ2.58～2.66是琥珀酸连接键基团的化学位移，δ0.63和0.83～1.31是α-生育酚的甲基和亚甲基的化学位移，表明了甘草次酸-PEG-生育酚衍生物的合成。按照摩尔比4:4:1比例分别称取处方量的DC-chol、DPPC和甘草次酸-PEG-生育酚衍生物完全溶于10ml乙醚中；加入pH7.4的磷酸缓冲液3ml，常温下旋转至白色悬液形成。将表达IL-2基因的质粒型真和表达载体和空白载体扩增、纯化和鉴定。体外转染HepG2细胞，吸出培养液并用加入适量无血清培养基后，普通阳离子脂质体、PEG阳离子脂质体、含1%甘草次酸-PEG-生育酚阳离子脂质体和含5%甘草次酸-PEG-生育酚阳离子脂质体和质粒DNA按照相同比例复合后加入无血清无抗生素培养液中，在人工气候箱中孵育24h后，更换完全培养液，继续孵育24h。结果显示，PEG阳离子脂质体的传染率低于普通脂质体一倍，引入甘草次酸-PEG-生育酚后，转染效率增加，当甘草次酸-PEG-生育酚增加到5%后，转染效率与普通阳离子脂质体相当。当用不同浓度的甘草次酸处理HePG2后，用5%甘草次酸-PEG-生育酚转染细胞，当甘草次酸的浓度为2.58～10.32μM，转染效率下降一半。对肿瘤细胞培养液上清进行分泌IL-2水平进行检测，甘草次酸-PEG-生育酚脂质体组的分泌IL-2量与普通阳离子脂质体组相当，明显高于PEG组。

实施4：胆固醇-PEG-RGD的合成及其自组装载体的构建与制剂及生物学研究

胆固醇、琥珀酸酐和四甲氨基吡啶（DMAP）溶于100ml二氯甲烷，室温下搅拌16h。用旋转蒸发除去部分反应溶液，用冰醋酸重结晶获得胆固醇琥珀酸酯的白色粉末。将上述白色粉末、PEG、DMAP和DCC溶于50ml二氯甲烷中，室温搅拌反应24h。抽滤除去不溶物，浓缩滤液，在乙醚中沉淀，用硅胶柱纯化后获得胆固醇-PEG-OH。将chol-PEG–OH、琥珀酸酐、DMAP、三乙胺在溶于二氯甲烷，加热回流反应，将产物分离纯化后得到chol-PEG–COOH。RGD、EDC、chol-PEG-COOH和NHS反应，经分离纯化后即可得到产物chol-PEG-RGD。用1H-NMR表征合成产物，δ5.3的单峰是胆固醇双键的化学位移，δ2.56～2.64是琥珀酸中基团的化学位移，3.52～3.68归属于PEG中氢原子，δ8.03、11.0是RGD多肽基团的特征峰，表明了胆固醇-PEG-RGD的合成。

将摩尔比1:11:8胆固醇-PEG-RGD、DOTAP、DOPE和普通胆固醇混合溶解在氯仿中，按照以上方法中的一种制备阳离子脂质体。如同4所示含有RGD载体与游离药物的细胞摄取实验，随着温度与摄取时间的变化摄取量出现差异，在37℃、6h时包载药物的载体的细胞摄取效率显著明显高于其他组。将脂质体和端粒酶反义核苷酸分别在PBS中稀释，然后按照不同电荷比将两者复合---即在室温下将两者混合后，涡旋5min后，在常温孵育25min。将得到比同比例的复合物对HUVEC细胞转染。培养4h后除去培养基，更换为含血清的完全培养基继续培养24h后，收集细胞。以β-actin蛋白为内参，采用酶联免疫印记（westernblot）检测人端粒酶逆转录酶蛋白（hTERT）表达，胆固醇-PEG-RGD修饰的脂质体组的hTERT表达明显低于长循环脂质体组，高于Lipofectamine2000组。对端粒酶的活性进行检测，胆固醇-PEG-RGD组与Lipofectamine2000组端粒酶活性都降低，但胆固醇-PEG-RGD组的细胞毒性更小。

实施例5：胆固醇-乙烯基醚键-PEG-叶酸的合成及脂质体的制备和生物学考察

1.73g叔丁基二甲基氯硅溶解在5mlTHF中，于0℃逐滴滴加到1,4-丁二醇和咪唑的20mlTHF溶液中，待溶液变浑浊后，持续搅拌反应1h。此时在室温条件下加入60ml乙醚，溶液分别用饱和NH₄Cl和NaCl溶液冲洗，除去乙醚，得到黄色油状物A。将A和四辛基溴化铵的苯溶液滴加到冷却到0℃的0.404MKMnO4溶液，室温下搅拌3h，过量的KMnO₄用NaHSO₃还原。用苯和50%乙酸溶液对对混合物进行萃取。苯层用饱和NaCl润洗，通过抽滤、旋蒸和真空干燥对其进行干燥，并用硅胶柱对其进行分离纯化得到产物B。胆固醇、产物B和四甲氨基吡啶溶于二氯甲烷中，在0℃条件下加入适量EDCI，在室温条件下搅拌10d。将反应产物倒入水中并用二氯甲烷萃取，除尽溶剂后，纯化后得产物C。低温条件下，将丁基锂滴加到二异丙胺THF溶液中，持续搅拌30min。产物C的THF溶液滴加到上述溶液中，加入二乙基氯代磷酸酯的六甲基磷酸酰胺溶液，低温条件下搅拌1h，室温下再搅拌1h。加入乙醚，过滤，出去溶剂，复溶，用NaHCO₃冲洗有机层。将乙醚层干燥除尽溶剂后，过硅胶柱分离纯化得到产物D。产物D和催化剂溶于二氯甲烷，冷却到0℃，滴加三乙基铝，搅拌1h。在室温搅拌1h，过硅胶柱分离纯化得产物E。四丁基氟化铵和四丁基氢氧化铵THF溶液滴加到产物E溶液中，室温下反应12h，分离纯化得产物F。产物F与叶酸-PEG-COOH，在DCC和DMAP催化下，室温反应4d。低温条件下除去不溶物，纯化分离即得产物叶酸-PEG-乙烯基醚键-胆固醇。1H-NMR(CDCl3)表征合成产物，δ5.95和4.92分别是乙烯基醚键αβ氢原子的特征峰，δ3.3～3.9归属于PEG上基团，δ8.65、7.68、6.56叶酸特征氢原子的化学位移，δ5.37为胆固醇C6特征峰，证实了叶酸-PEG-乙烯基醚键-胆固醇的合成。按照上述方法中的一种或几种制备包含阿霉素的阳离子脂质体，同样采用复合的方法将bcl-2包载脂质体上，考察转染与细胞凋亡等。Dox释放曲线如图5所示，在不同pH条件下的Dox释放实验，随着pH降低，乙烯基醚键发生断裂增多，脱去PEG长链引发脂质体不稳定释放药物增多。细胞增殖与生存率检测结果是，胆固醇-乙烯基醚键-PEG-叶酸修饰的脂质体和叶酸-PEG-DSPE修饰的脂质体的IC50分别为6.54μM和8.16μM，这可能与乙烯基醚键在内含体酸性条件中断裂，脱去PEG长链利于内含体逃逸，使胞质内Dox增多相关。细胞内载体的定位实验也验证了上述推论，即乙烯基醚键断裂促进了内含体膜与脂质体膜的融合，接着内容物释放进胞质。细胞周期分析表明，用胆固醇-乙烯基醚键-PEG-叶酸修饰的脂质体包载bcl-2siRNA和Dox处理KB细胞，凋亡细胞的数量高于其他各组。

实施例6：生物素-PEG-二硫键-胆固醇的合成和载体制备及生物学考察

取适量胆固醇氯甲酸酯溶于过量乙二胺中，室温搅拌反应18h，用二氯甲烷/水萃取有机相，并将有机相过柱分离，加压除去溶剂，即得产物胆固醇甲酰胺衍生物A。取产物A50mg溶于含三乙胺5ml氯仿中，加入适量3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，室温搅拌反应5h，采用硅胶薄层色谱法对反应过程进行监测。旋蒸除去溶剂后，用5ml氯仿进行复溶，过硅胶柱分离纯化产物。减压除去溶剂后，将产物再次用氯仿复溶，加入适量的DTT和生物素-PEG-SH，室温搅拌反应48h。产物用乙醚重结晶两次，减压出去溶剂，得到产物。1H-NMR（CDCl3）表征产物的合成，δ5.38、0.7分别为胆固醇C6、C18的氢原子的化学位移，δ8.03为酰胺键氢原子化学位移，δ3.55～3.78是PEG基团的特征峰，δ4.59、4.60是生物素特征峰，证明了生物素-PEG-二硫键-胆固醇的合成。将DOPE、DC胆固醇、紫杉醇和生物素-PEG-胆固醇按照摩尔比4：3：1：0.5比例溶于氯仿，旋转蒸发除去氯仿形成薄膜，加入一定量的HEPES水化30min后，探头超声后过膜挤出，得到粒径为100nm，ζ为+23.8mV的脂质体。脂质体表面的PEG脱离实验，即向脂质体悬液中加入二硫苏糖醇（DTT），加入后二硫键发生断裂，PEG脱出，ζ变为35.1mV，粒径分布变为双峰。取定量脂质体按照N/P7.65的比例与surviving siRNA复合。采用人肝癌细胞HepG2和耐药肝癌细胞进行细胞毒性研究。结果显示，生物素-PEG-胆固醇组肿瘤抑制作用较好。

实施例7：PEG-席夫碱键-胆固醇衍生物的合成和载体制备及生物学考察

取5β-胆酸（600mg）溶于二氯甲烷/二甲基甲酰胺1：1中，加入SOCl₂1.45ml，在氮气保护下反应3h。蒸馏除去未反应SOCl₂，旋转蒸发除去溶剂。取胆酰氯溶于过量乙二胺中，室温搅拌反应24h，萃取有机相并将有机相硅胶柱分离，除去溶剂即得产物A。

取10g PEG-OH溶解在250ml二氧六环中，共沸除水。溶液冷却到室温，在氮气保护条件下加入3.8ml氯乙醛二乙醇，加入NaOH粉末2.0g，混悬液回流反应24h。蒸馏除去80ml溶剂，继续回流24h。冷却至室温后，抽滤除去不溶物，真空条件下干燥滤液。加入100ml水用HCl调节pH至7.0。用二氯甲烷萃取溶液，旋转蒸发出去溶剂至10ml，冷乙醚沉淀后过滤得PEG-CH₂CH(OEt)₂。将PEG-CH₂CH(OEt)₂在50mlpH2.6的柠檬酸缓冲液中在65℃加热1h。将上述反应得到的胆固醇衍生物加入上述溶液，冷却至室温，调节pH，加入Na(CN)BH3，室温搅拌反应21h，冻干后得到产物。1H-NMR（CDCl3）表征产物的合成，δ1.04～1.68为胆固醇集团特征峰，δ3.38～3.54是PEG氢原子的化学位移，δ8.03是酰胺基团的化学位移，δ7.50是碳氮双键氢原子的特征峰，表明PEG-席夫碱键-胆固醇衍生物的合成。同样按照上述方法制备脂质体，采用被动和复合载药将紫杉醇和survivin载至脂质体上，考察效果。如图6所示，在不同N/P比，载体介导的survivin蛋白沉默实验，含有席夫碱键和N/P=7条件下，RNAi干扰效果好于其他。如图7所示，比较了不同载体在共输送PTX和survivin在杀伤肿瘤细胞的效果，复合机制介导的载体表现较好。

Claims (10)

1.靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物，其特征在于，其结构式为：R-PEG-Z–R₁，

其中R代表甲基、anti-EphA10抗体、小分子配体、多肽配体和核酸适体中的一种,优选抗EphAb、叶酸、甘草次酸、RGD、生物素；

Z代表pH敏感键，主要为腙键、乙烯基醚键、二硫键、酯键、原酸酯键、缩酮键、酰胺键，为以下结构中的一种：

R₁胆固醇、α-生育酚的一种，为以下结构的一种：

其中PEG分子量范围2000-5000。

2.根据权利要求1所述的靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物，其特征在于，所述的靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物为：抗EphmAb-聚乙二醇-胆固醇衍生物、叶酸-PEG-胆固醇衍生物、甘草次酸-PEG-生育酚衍生物、RGD-PEG-胆固醇、叶酸-PEG-乙烯基醚键-胆固醇、叶酸-PEG-金属蛋白酶键-chol衍生物、生物素-PEG-二硫键-胆固醇、PEG-席夫碱键-胆固醇衍生物。

3.根据权利要求1所述的靶向配体-PEG-胆固醇/生育酚衍生物，其特征在于，所述的小分子配体为叶酸，甘草次酸、半乳糖；所述的多肽配体为RGD环肽或多肽。

4.一种复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统，其特征在于，采用脂质体作为药物载体包载药物，所述脂质体由中性脂质材料、阳离子脂质材料和功能性胆固醇衍/α-生育酚衍生物组成。

5.按权利要求4所述的复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统，其特征在于，所述的药物为基因药物、蛋白多肽类药物或化疗药物；所述的基因药物选自肿瘤特异性凋亡基因、逆转肿瘤多药耐药基因、编码肿瘤凋亡基因的反义RNA或引起肿瘤凋亡的小干扰siRNA或发卡shRNA或microRNA；所述蛋白多肽类药选自酶和辅酶类药物、细胞生长因子和核酸及其降解产物；所述的化疗药物是：烷化剂类药物、抗代谢类药物、抗生素类药物、生物碱类药物、免疫制剂、激素类药物或金属类药物以及诊断类药物；选自阿霉素、紫杉醇、多西他赛、柔红霉素、环磷酰胺、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、长春新碱、葫芦素B、米托蒽醌、阿糖胞苷、替尼泊苷、吉非替尼、顺铂、奥沙利铂或抗癌锑。

6.根据权利要求4所述的复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统，其特征在于，所述中性脂质材料为二油酰磷脂酰乙醇胺，磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，二棕榈酰磷脂酰胆碱，1,2-二油酰甘油-3-磷脂酰胆碱或胆固醇中的一种或几种，优选二油酰磷脂酰乙醇胺与胆固醇。

7.根据权利要求4所述的复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统，其特征在于，所述的阳离子脂质为2,3-二油酰氧丙基-1-三甲胺，[1-（2,3-二油酰基）]-N,N,N-三甲胺丙烷，3β-[N-（N’,N’-二甲氨基乙基）]-胆固醇，N-（2-羟乙基）-N,N-二甲基-1,3-双（十四烷氧基-1-丙铵），双十八烷氨酰精胺，二胍胆固醇或十八胺中的一种或几种，优选[1-（2,3-二油酰基）]-N,N,N-三甲胺丙烷。

8.权利要求4-7任何一项所述的复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统的制备方法，其特征在于，按处方量将药物、中性脂质、功能性胆固醇/生育酚、阳离子脂质混合，按薄膜分散法，逆相蒸发法、溶剂注入法、表面活性剂去除法、冻干再水化法、pH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法中的一种制备脂质体。

9.根据权利要求8所述的复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统的制备方法，其特征在于，药物、中性脂质、阳离子脂质和功能性胆固醇/α-生育酚的摩尔比例为1：10～40：10～40:5～10，优选1:10～:30：10～30：5～7。

10.按照权利要求8所述的复合机制介导的肿瘤靶向药物传递系统，所述的递药系统粒径为1-1000nm，优选值为50-500。

Images