CN111617265A - 一种二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属药学领域，涉及一种二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统及应用；所述纳米给药系统由(2，3‑二油酰基‑丙基)三甲基氯化铵和胆固醇制备的阳离子脂质体为载体，包裹表达肝细胞靶向蛋白载脂蛋白AI的治疗质粒pVAX1‑治疗基因‑载脂蛋白AI基因，通过后插入具有肝细胞靶向性的脂质材料二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇34000‑半乳糖，建立二级肝细胞靶向递送的基因药物纳米给药系统。经体内外评价实验证明，本纳米给药系统可长效、安全、稳定、高效地对肝细胞进行靶向发挥高效持久的肝保护作用，提高药物的治疗指数并降低其毒副作用；具有良好的应用前景。

Description

一种二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统及用途
技术领域
本发明属药学技术领域，涉及纳米给药系统，具体涉及一种二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统及制备方法和用途，该纳米给药系统可用于治疗非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝病、肝癌、病毒性肝炎等肝脏疾病。
背景技术
有统计显示，我国肝病负担异常严重；根据2018年最新统计数据显示，中国肝病患者占全世界肝病患者的比例高达30％；然而对慢性病毒性肝炎以及非病毒性肝病如非酒精性脂肪肝和药物性肝损伤等疾病的治疗仍然是当今医药科学的一大难题，迄今尚未见有确切特效的治疗药物。实践显示，目前市场中的一些药物存在入下缺陷：即使有部分疗效但因无组织和器官选择性、肝药浓度不高、对其他脏器的毒副作用，或在体内不稳定等，使其临床应用受到极大限制；因此，将药物选择性靶向肝脏以提高药物治疗指数并降低对其它组织的毒副作用，已经成为业内改善肝脏疾病治疗的重要发展方向。
资料公开了基因治疗是通过一定方式将目的基因递送到患者的病变组织或细胞中进行治疗，在降低对正常组织的毒副作用的同时提高了药物的生物利用度；但实践显示，治疗基因(DNA、RNA以及反义寡核苷酸等)稳定性差，在递送的过程中易被血液、组织或者胞浆中的酶所降解，而且由于治疗基因是亲水性的、负电荷大分子物质，很难穿透细胞膜进入靶细胞进行治疗；因此，研发安全、稳定、高效的肝细胞靶向基因递送系统具有重要的现实意义。
有研究公开了在肝细胞膜上有去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)、转铁蛋白受体、甘露糖受体、清道夫受体等，其中ASGPR是一种高效的内吞受体，且仅存在于哺乳动物肝实质细胞表面，具有高度组织特异性、高亲和力和高容量的特征，与去唾液酸糖蛋白、半乳糖(galactose)、半乳糖胺等糖蛋白具有高度亲和力，因而被认为是肝细胞定向递送药物的理想受体，但是研究还显示，直接将药物连接到半乳糖分子上存在如下若干缺点，包括结构不稳定、载药量小、药物分子干扰半乳糖与肝细胞受体的结合等。
基于现有技术的现状及存在的缺陷或不足，本申请的发明人拟提供一种长效、安全、稳定、高效的二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统，以更好地解决肝细胞靶向递送基因药物中存在的靶向效率低的问题。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状及存在的缺陷或不足，提供一种长效、安全、稳定、高效的二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统，以更好地解决肝细胞靶向递送基因药物中存在的靶向效率低的问题。
具体而言，本发明公开了一种二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统，其特征在于，由脂质材料(2，3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、胆固醇(cholesterol)、具有肝细胞靶向性的脂质材料二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇34000-半乳糖(DSPE-PEG-Galactose)和表达肝细胞靶向蛋白载脂蛋白AI的治疗质粒pVAX1-治疗基因-载脂蛋白AI基因组成纳米递药系统；
其中，以所述(2，3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵和胆固醇制备的阳离子脂质体为载体，包载阴离子的pVAX1-治疗基因-载脂蛋白AI基因，通过后插入具有肝细胞靶向性的脂质材料二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇34000-半乳糖，制成二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统。
采用本发明的的纳米基因药物可通过ASGPR的内吞作用将脂质体摄取到肝细胞内释放药物，被摄取到肝细胞核内的pVAX1-治疗基因-载脂蛋白AI基因转录、翻译、表达出治疗基因表达蛋白-载脂蛋白AI的融合蛋白；利用载脂蛋白AI与肝细胞上的清道夫受体特异性结合的性质，实现对治疗基因表达蛋白的第二次肝细胞靶向，从而在肝脏部位发挥长效稳定的治疗作用。
本发明中，所述的表达肝细胞靶向蛋白载脂蛋白AI的治疗质粒和具有肝细胞靶向性的脂质材料可实现对药物分子的二次肝细胞靶向；
本发明中，所述的二表达肝细胞靶向蛋白载脂蛋白AI的治疗基因是将治疗基因序列后增加了载脂蛋白AI的基因序列；
本发明所述的表达肝细胞靶向蛋白载脂蛋白AI的治疗基因中，所述治疗基因-载脂蛋白AI基因序列上游增加了Kozak增强子序列；
本发明所述的表达肝细胞靶向蛋白载脂蛋白AI的治疗基因中，所述治疗基因载体为真核表达质粒pVAX1；
本发明中，所述的具有肝细胞靶向性的脂质材料DSPE-PEG-Galactose占整个系统脂质材料的1mol％；
本发明中，所述的DOTAP和cholesterol制备的阳离子脂质体和阴离子pVAX1-治疗基因-载脂蛋白AI基因的重量比为1：1至28：1；
本发明中，所述的治疗基因包括RNA、DNA或反义寡核苷酸；
本发明的二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统，可用于治疗包括非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝病、肝癌、病毒性肝炎等肝脏疾病。
本发明的肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统具有如下优点：
1)本二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统，可实现肝细胞的二次靶向，避免对正常组织的损伤，提高药物的利用度，有利于基因药物在肝细胞内发挥长效稳定的治疗作用；
2)本二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统，可广泛应用于治疗非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝病、肝癌和病毒性肝炎等多种肝脏疾病；
3)本二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统，具有安全性高、稳定性好和质量可控的特点；
4)本二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统的制备方法简单易行，便于后续开发和产业化。
附图说明
图1：基因药物pVAX1-IA(pVAX1-IL-1Ra-ApoAI)的设计以及在小鼠体内肝脏靶向性评价，
A：pVAX1-IA和pVAX1-IL-1Ra质粒设计图；
B、C：pVAX1-IA转染HEK-293T细胞后，使用Western blot和ELISA检测胞内和胞外融合蛋白IL-1Ra-ApoAI的表达水平；
D：检测pVAX1-IA在A549细胞上对IL-1β的功能抑制；
E-G：肌肉注射PBS、pVAX1-IA和pVAX1-IL-1Ra质粒不同时间点，检测血清和肝脏中IL-1Ra的水平。
图2：纳米脂质材料DSPE-PEG-Galactose的核磁共振氢谱和质谱表征，
A-C：核磁共振氢谱表征NHS-PEG-Galactose、DSPE和DSPE-PEG-Galactose；
D：MALDI-TOF质谱表征DSPE-PEG-Galactose。
图3：二级肝细胞靶向递送的纳米基因药物Glipo-pVAX1-IA(DSPE-PEG-Galactose-modified liposome-pVAX1-IA)的制备及表征，
A：DSPE-PEG-Galactose的合成；
B：Glipo-pVAX1-IA的结构图；
C：liposome/pVAX1-IA在不同重量比下Glipo-pVAX1-IA的包封率；Lane 1：DNAmarker，Lane 2：裸质粒pVAX1-IA，Lane 3-11：不同重量比下的Glipo-pVAX1-IA；
D：liposome/DNA在不同重量比下制得的Glipo-pVAX1-IA转染HEK-293T细胞24小时后，上清中IL-1Ra的水平；
E-G：liposome/DNA在不同重量比下制得的Glipo-pVAX1-IA的粒径、电位和粒径多分散指数(PDI)；
H：liposome/DNA在重量比为20：1时Glipo-pVAX1-IA的粒径分布图和透射电子显微镜图；
I：liposome/DNA在重量比为20：1时Glipo-pVAX1-IA在血清中的稳定性检测。
图4：Glipo-pVAX1-IA体外肝细胞的靶向性评价，
A-B：荧光染料TOTO-3标记pVAX1-IA后，使用流式细胞仪检测Glipo-pVAX1-IA转染HepG2和Huh7细胞3小时后的摄取效率，并统计；
C-D：荧光染料TOTO-3标记pVAX1-IA后，使用激光共聚焦观察Glipo-pVAX1-IA转染HepG2和Huh7细胞0.5、1和4小时后的摄取效率和溶酶体逃逸情况，并用Image J软件做共定位分析.
图5：Glipo-pVAX1-IA在小鼠体内的分布评价，
A-B：荧光染料TOTO-3标记pVAX1-IA后，使用小动物活体成像仪器检测静脉注射的lipo-pVAX1-IA(liposome-pVAX1-IA)，Plipo-pVAX1-IA(DSPE-PEG-modified liposome-pVAX1-IA)和Glipo-pVAX1-IA在各脏器的分布情况，并统计；
C：荧光染料TOTO-3标记pVAX1-IA后，使用流式细胞仪检测静脉注射的lipo-pVAX1-IA，Plipo-pVAX1-IA和Glipo-pVAX1-IA在肝细胞和枯否细胞中的分布情况，并做统计；
D：使用ELISA检测静脉注射的lipo-pVAX1-IA，Plipo-pVAX1-IA和Glipo-pVAX1-IA在肝实质细胞和非实质细胞中的IL-1Ra含量。
图6：Glipo-pVAX1-IA对酒精性脂肪肝小鼠的疗效评价，
A：lipo-pVAX1-IA，Plipo-pVAX1-IA和Glipo-pVAX1-IA分别治疗以后，酒精性脂肪肝小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和肝脏中甘油三酯(TG)的水平；
B：lipo-pVAX1-IA，Plipo-pVAX1-IA和Glipo-pVAX1-IA分别治疗以后，酒精性脂肪肝小鼠血清和肝脏中IL-1β的水平；
C：lipo-pVAX1-IA，Plipo-pVAX1-IA和Glipo-pVAX1-IA分别治疗以后，使用H&E和油红染色观察酒精性脂肪肝小鼠肝脏的脂肪堆积和病理损伤情况；
D：lipo-pVAX1-IA，Plipo-pVAX1-IA和Glipo-pVAX1-IA分别治疗以后，酒精性脂肪肝小鼠血清和肝脏中IL-17A的水平；
E-F：lipo-pVAX1-IA，Plipo-pVAX1-IA和Glipo-pVAX1-IA分别治疗以后，使用流式细胞仪检测酒精性脂肪肝小鼠肝脏中Th17细胞数量，并统计。
图7：Glipo-pVAX1-IA的小鼠体内安全性评价，
A：Glipo-pVAX1-IA干预后的小鼠血清ALT、谷草转氨酶(AST)、尿素(BUN)和肌酐(creatinine)水平；
B：ELISA检测Glipo-pVAX1-IA干预后的小鼠血清中炎症因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β水平
C：H&E染色观察Glipo-pVAX1-IA干预后的小鼠各脏器的损伤情况。
以下结合实施例和附图，对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
具体实施方式
本发明所用试剂盒、原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按照常规条件如《分子克隆：实验室指南》(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1制备白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)和载脂蛋白AI(ApoAI)融合基因表 达载体pVAX1-IL-1Ra-ApoAI(pVAX1-IA)
IL-1Ra和ApoAI的基因序列分别来源于GeneBank accession no.NM_173842.2和GeneBank accession no.X07496，IL-1Ra与ApoAI的基因序列中间增加的蛋白序列为GGGGS(基因序列：GGCGGAGGCGGATCC)的柔性短肽进行连接；IL-1Ra上游序列中增加了Kozak序列作为增强子；IL-1Ra-GGGGS和ApoAI的基因序列均由金斯瑞生物技术公司合成到pMD19-Tsimple载体上，IL-1Ra-GGGGS两端设计了HindIII和BamHI的限制性核酸内切酶酶切位点，ApoAI两端设计了BamHI和XhoI的限制性核酸内切酶酶切位点；
取pVAX1表达载体及pMD19-T simple-IL-1Ra-GGGGS编码基因质粒，采用HindIII和BamHI限制性核酸内切酶进行双酶切，酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，采用胶回收试剂盒回收目的基因，通过T4DNA连接酶连接获得pVAX1-IL-1Ra-GGGGS；
取构建成功的pVAX1-IL-1Ra-GGGGS和pMD19-T simple-ApoAI编码基因质粒，采用BamHI和XhoI限制性核酸内切酶进行双酶切，酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，采用胶回收试剂盒回收目的基因，通过T4DNA连接酶连接获得pVAX1-IA(图1A)。
实施例2、基因药物pVAX1-IA在体内外的表达水平
将HEK-293T细胞种于六孔板中，待细胞融合率达到70-80％时，用lipofectamine2000转染5μg的pVAX1-IA，细胞继续培养24小时，Western blot和ELISA分别检测细胞内和分泌到上清中的IL-1Ra含量，结果证实IL-1Ra-ApoAI融合蛋白的成功表达和分泌(图1B-C)；为进一步验证pVAX1-IA在小鼠体内的表达，C57BL/6小鼠被分为三组，分别肌肉注射PBS、pVAX1-IL-1Ra和pVAX1-IA(质粒重量为50μg)，并在指定的时间检测小鼠的血液和肝脏中IL-1Ra的含量(图1E-G)；如图所示，pVAX1-IA延长了pVAX1-IL-1Ra在小鼠体内的半衰期，同时也增加了肝脏内IL-1Ra的含量。
实施例3、基因药物pVAX1-IA在体外活性评价
将HEK-293T细胞种于六孔板中，待细胞融合率达到70-80％时，用lipofectamine2000转染5μg的pVAX1-IA。继续培养24小时后，收集pVAX1-IA转染后的HEK-293T细胞上清作用于A549细胞，100pg/ml IL-1β引起的A549细胞中IL-6的升高被明显抑制，证明pVAX1-IA表达的IL-1Ra-ApoAI融合蛋白拮抗了IL-1β的活性(图1D)。
实施例4、制备二级肝细胞靶向递送的纳米基因药物Glipo-pVAX1-IA
首先，将15mg的DSPE和170mg的NHS-PEG-Galactose溶解于氯仿中，加入80μl的三乙胺作为催化剂，室温反应24小时后，将氯仿蒸馏去除，收集浓缩的薄膜用DMF重悬后透析纯化，制得具有肝细胞靶向功能的脂质材料DSPE-PEG-Galactose，该脂质材料的大小和结构由核磁共振氢谱和MALDI-TOF质谱进行验证(图2A-D，3A)；
二级肝细胞靶向递送的纳米基因药物Glipo-pVAX1-IA的组分及结构如图3B所示；首先，称取20mg的DOTAP和11mg的cholesterol溶解于氯仿中，室温旋蒸形成薄膜，向该薄膜中加入5％的葡萄糖溶液，使最终浓度为5mg/mL，然后将混合物进行超声并通过孔径大小为0.22μm的滤膜过滤，获得由DOTAP和cholesterol制成的阳离子脂质体(liposome)，接着，按不同重量比将liposome与pVAX1-IA混合，涡旋30秒后室温放置30分钟，加入1mol％的DSPE-PEG-Galactose涡旋30秒后50℃孵育15分钟，得到Glipo-pVAX1-IA，不同重量比下制得的Glipo-pVAX1-IA的凝胶电泳图，上清中IL-1Ra的表达水平，以及马尔文粒径仪测量的粒径、电位和PDI值，如图3C-G所示，结果证明liposome与pVAX1-IA在重量比为20：1可完全包裹治疗基因，IL-1Ra的表达水平最高，透射电子显微镜和粒径分布图进一步验证该浓度下Glipo-pVAX1-IA为圆形结构且粒径均一，因而选择该浓度为制备二级肝细胞靶向递送的纳米基因药物的最终浓度。
实施例5、二级肝细胞靶向递送的纳米基因药物Glipo-pVAX1-IA的血清稳定性
为了评价该纳米基因药物的血清稳定性，分别取Glipo-pVAX1-IA和pVAX1-IA(pVAX1-IA重量为5μg)在50℃与含有50％的胎牛血清(FBS)进行孵育，不同时间点收样检测其稳定性，如图3I所示，Glipo-pVAX1-IA呈现出良好的血清稳定性。
实施例6、二级肝细胞靶向递送的纳米基因药物Glipo-pVAX1-IA在肝细胞中的摄取情况
首先用荧光染料TOTO-3标记治疗基因pVAX1-IA，通过上述方法制备具有荧光染料标记的纳米基因药物(Glipo-pVAX1-IA)。向汇合度达70-80％的HepG2和Huh7细胞中加入带荧光标记的pVAX1-IA、lipo-pVAX1-IA、Plipo-pVAX1-IA和Glipo-pVAX1-IA(pVAX1-IA重量为5μg)作用3小时，PBS洗涤3遍后，使用流式细胞仪检测肝细胞中各纳米粒的摄取情况，如图4A-B所示，肝细胞对Glipo-pVAX1-IA的摄取率最高，而未加入半乳糖修饰的纳米基因药物(lipo-pVAX1-IA和Plipo-pVAX1-IA)的摄取率则相对较低。
进一步考察Glipo-pVAX1-IA在肝细胞内的亚细胞定位及溶酶体逃逸能力，用TOTO-3染料标记pVAX1-IA，Lysotracker Green染料标记溶酶体，Hoechst 33342标记细胞核，利用激光共聚焦仪器观察Glipo-pVAX1-IA和溶酶体及细胞核的共定位情况，如图4C-D所示，Glipo-pVAX1-IA在1小时被肝细胞摄取且部分纳米粒和溶酶体共定位(呈现黄色)，4小时后红色的纳米基因药物和绿色的溶酶体分离，与蓝色的细胞核发生了共定位，证明Glipo-pVAX1-IA顺利从溶酶体中逃逸出来，进入到肝细胞核内。
实施例7、二级肝细胞靶向递送的纳米基因药物Glipo-pVAX1-IA在小鼠体内的肝细胞靶向能力评价
纳米基因药物在体内的分布情况直接决定了该药物的治疗效果，首先使用TOTO-3标记治疗基因pVAX1-IA(pVAX1-IA剂量为50μg每只小鼠)后，通过小动物活体成像系统观察Glipo-pVAX1-IA在小鼠体内的分布情况，如图5A-B所示，尾静脉注射Glipo-pVAX1-IA纳米粒12小时后，肝脏开始摄取，并在24小时达到最大浓度，36小时仍可以观察到肝脏中Glipo-pVAX1-IA的存在，与其他器官相比，Glipo-pVAX1-IA具有明显的肝脏靶向性；
尾静脉注射12小时后，分离出肝脏中的肝实质细胞和枯否细胞(流式抗体标记F4/80以区分)进行流式分析，如图5C所示，肝实质细胞摄取的Glipo-pVAX1-IA的数量远远多于lipo-pVAX1-IA和Plipo-pVAX1-IA，且Glipo-pVAX1-IA在枯否细胞中的摄取率较低，这一现象进一步在ELISA测得的肝实质细胞和非实质细胞中IL-1Ra的水平中得到验证，如图5D所示，Glipo-pVAX1-IA组在肝实质细胞中的表达量明显高于其他组，结果证实Glipo-pVAX1-IA在小鼠体内可高效地靶向肝细胞。
实施例8、二级肝细胞靶向递送的纳米基因药物Glipo-pVAX1-IA在酒精性脂肪肝小鼠中的药效评价
验证Glipo-pVAX1-IA对酒精性脂肪肝小鼠的保护作用：首先，建立小鼠酒精性脂肪肝模型，用含酒精的Lieber-DeCarli饮食喂养9-10周龄的C57BL/6小鼠10天后，用酒精灌胃(5g/kg体重)1次，导致小鼠血清中的ALT和肝脏中的TG明显升高，H&E和油红染色显示肝细胞脂肪变性和气球样变，炎症细胞Th17升高和炎症因子IL-1β和IL-17A增加，作为对照组，pVAX1-IA、lipo-pVAX1-IA和Plipo-pVAX1-IA治疗(三天注射一次，pVAX1-IA剂量为50μg每只小鼠)后没有显著的治疗效果，Glipo-pVAX1-IA治疗(三天注射一次，pVAX1-IA剂量为50μg每只小鼠)小鼠后，可以检测到ALT和TG水平显著降低(图6A)，H&E和油红染色结果显示出明显降低的肝组织内脂肪堆积及肝细胞气球样变性(图6C)，流式和ELISA细胞因子的检测证明Th17细胞数量减少(图6E-F)，炎症因子IL-1β和IL-17A浓度降低(图6B,D)；结果证明Glipo-pVAX1-IA在小鼠体内显著减轻酒精诱导的脂肪变性和炎症反应。
实施例9、二级肝细胞靶向递送的纳米基因药物Glipo-pVAX1-IA的小鼠体内安全性评价
副作用的发生和全身性的系统毒性是阻碍纳米基因药物进入临床的最大障碍之一；进一步研究静脉注射Glipo-pVAX1-IA后是否能引起副作用和全身系统毒性，如图7A所示，Glipo-pVAX1-IA未见引起ALT、AST、BUN、Creatine水平的升高，说明该纳米几乎没有肝和肾毒性，同时，小鼠血清中的炎症因子也未见升高(图7B)，H&E染色结果进一步证明Glipo-pVAX1-IA对小鼠的各主要脏器均没有损伤。

Claims (8)

1.一种二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统，其特征在于，其特征在于，由脂质材料(2，3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵、胆固醇、具有肝细胞靶向性的脂质材料二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇34000-半乳糖和表达肝细胞靶向蛋白载脂蛋白AI的治疗质粒pVAX1-治疗基因-载脂蛋白AI基因组成纳米递药系统；
其中，以所述(2，3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵和胆固醇制备的阳离子脂质体为载体，包载阴离子的pVAX1-治疗基因-载脂蛋白AI基因，通过后插入具有肝细胞靶向性的脂质材料二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇34000-半乳糖，制成二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统。
2.根据权利要求1所述的二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统，其特征在于，所述的表达肝细胞靶向蛋白载脂蛋白AI的治疗质粒和具有肝细胞靶向性的脂质材料实现对药物分子的二级肝细胞靶向。
3.根据权利要求1所述的二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统，其特征在于，所述表达肝细胞靶向蛋白载脂蛋白AI的治疗基因为治疗基因序列后增加载脂蛋白AI的基因序列；所述的治疗基因-载脂蛋白AI基因序列上游增加Kozak增强子序列；所述治疗基因载体为真核表达质粒pVAX1。
4.根据权利要求1所述的二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统，其特征在于，所述具有肝细胞靶向性的脂质材料二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇34000-半乳糖占所述的整个系统脂质材料的1mol％。
5.根据权利要求1所述的二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统，其特征在于，所述的(2，3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵和胆固醇制备的阳离子脂质体和阴离子pVAX1-治疗基因-载脂蛋白AI基因的重量比为1：1至28：1。
6.根据权利要求1所述的二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统，其特征在于，所述的治疗基因选自RNA、DNA或反义寡核苷酸。
7.权利要求1所述的二级肝细胞靶向递送基因药物的纳米给药系统在制备治疗肝脏疾病药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肝脏疾病是非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝病、肝癌或病毒性肝炎。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112263565A (zh) * 2020-09-21 2021-01-26 浙江大学 一种用于癌症治疗的索拉非尼-基因共载纳米药物及其制备方法和应用
CN114469861A (zh) * 2022-02-10 2022-05-13 浙江大学 一种可逆转酒精性肝病的维生素e纳米载体的构建与应用
CN115245572A (zh) * 2022-07-28 2022-10-28 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 靶向抑制肝细胞pcsk9降低ldlc的仿生纳米颗粒材料及其应用
CN115487306A (zh) * 2022-11-18 2022-12-20 深圳市华元生物技术股份有限公司 一种药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物
CN115487150A (zh) * 2022-11-18 2022-12-20 深圳市华元生物技术股份有限公司 一种肝靶向的可示踪药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030203865A1 (en) * 2001-04-30 2003-10-30 Pierrot Harvie Lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US20040142475A1 (en) * 2000-06-02 2004-07-22 Barman Shikha P. Delivery systems for bioactive agents
CN103721271A (zh) * 2013-12-17 2014-04-16 福州市传染病医院 用于肝癌多模态影像和光热治疗的多功能纳米探针及应用
CN109224066A (zh) * 2017-07-10 2019-01-18 复旦大学 一种基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物
CN109350598A (zh) * 2018-09-12 2019-02-19 哈尔滨医科大学 糖-聚乙二醇-dspe偶联化合物及其制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040142475A1 (en) * 2000-06-02 2004-07-22 Barman Shikha P. Delivery systems for bioactive agents
US20030203865A1 (en) * 2001-04-30 2003-10-30 Pierrot Harvie Lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
CN103721271A (zh) * 2013-12-17 2014-04-16 福州市传染病医院 用于肝癌多模态影像和光热治疗的多功能纳米探针及应用
CN109224066A (zh) * 2017-07-10 2019-01-18 复旦大学 一种基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物
CN109350598A (zh) * 2018-09-12 2019-02-19 哈尔滨医科大学 糖-聚乙二醇-dspe偶联化合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M. MORILLE等: "Galactosylated DNA lipid nanocapsules for efficient hepatocyte targeting", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS》 *
莫丽英等: "基于糖基化修饰的靶向药物传递系统研究概况", 《中国实验方剂学杂志》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112263565A (zh) * 2020-09-21 2021-01-26 浙江大学 一种用于癌症治疗的索拉非尼-基因共载纳米药物及其制备方法和应用
CN112263565B (zh) * 2020-09-21 2021-08-17 浙江大学 一种用于癌症治疗的索拉非尼-基因共载纳米药物及其制备方法和应用
CN114469861A (zh) * 2022-02-10 2022-05-13 浙江大学 一种可逆转酒精性肝病的维生素e纳米载体的构建与应用
CN114469861B (zh) * 2022-02-10 2023-02-03 浙江大学 一种可逆转酒精性肝病的维生素e纳米载体的构建与应用
CN115245572A (zh) * 2022-07-28 2022-10-28 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 靶向抑制肝细胞pcsk9降低ldlc的仿生纳米颗粒材料及其应用
CN115487306A (zh) * 2022-11-18 2022-12-20 深圳市华元生物技术股份有限公司 一种药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物
CN115487150A (zh) * 2022-11-18 2022-12-20 深圳市华元生物技术股份有限公司 一种肝靶向的可示踪药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物
CN115487306B (zh) * 2022-11-18 2023-03-17 深圳市华元生物技术股份有限公司 一种药物递送载体及其制备方法、应用、糖尿病治疗药物

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