CN115087437A - 脂质组合物及其用于将治疗活性剂递送至内皮的用途 - Google Patents

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Abstract

本文本发明涉及包含脂质组合物、三羧酸和核酸分子的组合物，其中所述脂质组合物包含阳离子脂质、中性脂质和屏蔽脂质，其中由组合物中阳离子脂质分子提供的较大量的正电荷与组合物中核酸分子提供的较少量的负电荷相比而产生的正电荷过剩由三羧酸提供的电荷补偿；本发明还涉及使用这种组合物的方法。

Description

脂质组合物及其用于将治疗活性剂递送至内皮的用途
本发明涉及包含脂质组合物的组合物；包含脂质组合物的组合物用于疾病治疗方法中；包含脂质组合物的组合物用于制备用于治疗和/或预防疾病的药物的用途；包含含有脂质组合物的组合物的药物组合物；包含含有脂质组合物的组合物的试剂盒；用于治疗和/或预防疾病的方法，其中该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的包含脂质组合物的组合物，以及用于制备该组合物的方法。
分子生物学以及分子医学都严重依赖于将生物活性化合物引入细胞。此类生物活性化合物通常分别包括DNA、RNA以及肽和蛋白质等。必须克服的屏障通常是具有带负电荷的外表面的脂质双层。在本领域中，已经开发了许多技术来穿透细胞膜，从而引入生物活性化合物。然而，一些设想用于实验室的方法不能用于医学领域，尤其不适合药物递送。例如，本领域已知的电穿孔和冲击方法即便可行的话也将仅允许生物活性化合物的局部递送。除了所述脂双层细胞膜之外，还包含转运系统。因此，人们努力使用这种转运系统来将生物活性化合物转运穿过细胞膜。然而，由于此类转运系统的特异性或交叉反应性，它们的使用不是普遍适用的方法。
本领域描述的将生物活性化合物转移到细胞中的一种更普遍适用的方法是使用病毒载体。然而，病毒载体只能用于将基因高效地转移到一些细胞类型中；但是它们不能用于将化学合成的分子引入细胞。
另一种方法是使用所谓的脂质体(Bangham,J.Mol.Biol.13,238-252)。脂质体是两亲性脂质在水中缔合时产生的囊泡。脂质体通常包含同心排列的双层磷脂。根据层数，脂质体可分为小的单层囊泡、多层囊泡和大的多层囊泡。脂质体已被证明是有效的递送剂，因为它们允许将亲水性化合物掺入水性中间层，而将疏水性化合物掺入脂质层。本领域众所周知，脂质制剂的组成及其制备方法对所得脂质聚集体的结构和尺寸有影响，从而对脂质体有影响。还已知脂质体掺入了阳离子脂质。
阳离子脂质除了作为脂质体的组分之外，还吸引了相当多的关注，因为它们本身可以用于生物聚合物的细胞递送。通过使用阳离子脂质，由于静电相互作用，可以基本上以定量的方式包封任何阴离子性化合物。此外，据信阳离子脂质与带负电荷的细胞膜相互作用，启动细胞膜转运。已经发现，使用含有阳离子脂质的脂质体制剂或者将阳离子脂质本身与生物活性化合物一起使用需要探试性的方法，因为每种制剂的用途有限，其通常在血清不存在的情况下可以将质粒递送到一些而不是所有的细胞类型中。
脂质和由其转运的生物活性化合物的电荷和/或质量比率已被证明是递送不同类型的所述生物活性化合物的关键因素。例如，已经表明适用于包含5000至10000个碱基大小的质粒递送的脂质制剂通常对于递送寡核苷酸诸如通常包含约10至约50个碱基的siRNA分子、合成核酶或反义分子无效。另外，最近表明反义寡核苷酸和核酶的最佳递送条件是不同的，即使在相同的细胞类型中亦如此。
美国专利6,395,713公开了基于阳离子脂质的组合物(其中阳离子脂质由亲脂性基团、接头和头部基团组成)以及此类组合物用于将生物活性化合物转移到细胞中的用途。
国际专利申请WO 2005/105152公开了另一种基于阳离子脂质的组合物，其被证明在递送功能性核酸分子诸如siRNA分子中特别有效。
根据待治疗的疾病和待递送的药物，需要将药物递送至特定器官或特定细胞类型。一种这样的特定器官是肺，一种这样的特定细胞类型是肺内皮细胞。例如，靶向肺和肺内皮细胞在递送用于治疗诸如急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移、肺高压和肺动脉高压等疾病的药物中是有利的。
本发明的一个潜在问题是提供能够将药剂，优选治疗活性剂，更优选药物，递送至肺部的手段。本发明的另一潜在问题是提供能够将药剂，优选治疗活性剂，更优选药物，递送至肺组织的手段。本发明的又一潜在问题是提供能够将药剂，优选治疗活性剂，更优选药物，递送至肺内皮细胞的方法。与这些问题中的每一个相关，所述药剂和药物分别优选是mRNA。
本发明的另一个潜在问题是提供用于治疗肺病的方法，所述肺病优选选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移、肺高压和肺动脉高压的肺病。与该问题相关，所述剂和药物分别优选为mRNA。
本发明的另一个潜在问题是提供作为用于治疗肺疾病的手段的一部分的递送媒介物，所述肺疾病优选选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移、肺高压和肺动脉高压。与该问题相关，所述剂和药物分别优选为mRNA。
本发明的另一个潜在问题是提供药物组合物。优选地，该药物适合于将剂，优选治疗活性剂，更优选药物，递送至肺部。本发明的又一潜在问题是提供药物组合物，该药物组合物适用于向肺组织递送剂，优选治疗活性剂，更优选药物。本发明的又一潜在问题是提供药物组合物，该药物组合物适于将剂，优选治疗活性剂，更优选药物递送于肺内皮细胞。与这些问题中的每一个和任一个相关，所述剂和药物分别优选是mRNA。
本发明的另一个潜在问题是提供可用于制造药物的手段，其中所述药物适用于或用于治疗肺病，优选选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移、肺高压和肺动脉高压的肺病。与该问题相关，所述剂和药物分别优选为mRNA。
本发明的另一个潜在问题是提供用于治疗和/或预防疾病的方法，其中该方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，该组合物包含治疗或药物活性剂，优选药物。本发明的又一潜在问题是提供治疗和/或预防肺疾病的方法，其中该方法包括给有需要的受试者施用有效量的组合物，该组合物包含治疗或药物活性剂，优选药物。本发明的又一潜在问题是提供治疗和/或预防疾病，优选肺病的方法，其中治疗包括将治疗或药物活性剂递送至肺，优选递送至肺内皮细胞。与这些问题中的每一个和任一个相关，所述剂和药物分别优选是mRNA。
本发明的另一个潜在问题是提供试剂盒。优选地，该试剂盒适合于(a)用于治疗和/或预防疾病，优选肺病的方法中，(b)用于将生物活性剂、治疗活性剂和/或药物活性剂转移到细胞中或穿过细胞膜的方法中，其中优选地，这样的细胞是肺内皮细胞，并且/或者(c)用于制造药物，优选用于治疗和/或预防疾病的药物，更优选肺病，最优选选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移、肺高压和肺动脉高压的肺病。与这些问题中的每一个和任一个相关，所述剂和药物分别优选是mRNA。
本发明的另一个潜在问题是提供有效转染多种细胞，优选肺内皮细胞的手段，其中从给定量的脂质组合物和给定量的核酸诸如mRNA开始，所述量的核酸被转染到多种细胞的更大部分中。优选地，该手段是解决本发明潜在的另外问题的手段。
本发明的又一潜在问题是提供增加脂质纳米颗粒数量的手段，所述脂质纳米颗粒可以在给定的量，优选给定摩尔量的核酸诸如mRNA下产生，其中此类脂质纳米颗粒能够高效转染细胞并且/或者将有效量的核酸引入细胞，优选肺内皮细胞。
本发明的另一个潜在问题是提供产生具有单分散尺寸分布的脂质纳米颗粒的方法。
本发明的又一潜在问题是提供增加脂质纳米颗粒数量的手段，所述脂质纳米颗粒可以在给定的量，优选摩尔量的核酸诸如mRNA下产生，其中此类脂质纳米颗粒能够高效转染细胞并且/或者将有效量的核酸引入细胞，优选肺内皮细胞，由此该脂质纳米颗粒具有单分散尺寸分布。
本发明的又一潜在问题是提供允许核酸分子诸如mRNA从细胞的内体中释放增加的手段。优选地，这种手段是包含核酸(优选mRNA)的脂质制剂，更优选脂质纳米颗粒，其从内体的释放在体外或体内转染细胞时增加。
这些和其它问题由所附独立权利要求的主题解决。优选实施方案可以从所附的从属权利要求中获得。以下实施方案也解决了这些和其它问题。
实施方案1.一种包含脂质组合物、三羧酸和核酸分子的组合物，其中所述脂质组合物包含阳离子脂质、中性脂质和屏蔽脂质(shielding lipid)。
实施方案2.实施方案1的组合物，其中与由组合物中的核酸分子提供的较少数量的负电荷相比，由组合物中阳离子脂质分子提供的较多数量的正电荷引起的正电荷过量由三羧酸提供的电荷补偿。
实施方案3.实施方案1至2中任一项的组合物，其中所述核酸分子是mRNA分子。
实施方案4.实施方案1、2和3中任一项的组合物，其中所述组合物是单分散组合物。
实施方案5.实施方案4的组合物，其中所述组合物中三羧酸的量使得组合物是单分散组合物。
实施方案6.实施方案4和5中任一项的组合物，其中所述组合物中三羧酸的量高于组合物为多分散组合物时三羧酸的浓度。
实施方案7.实施方案1至6中任一项的组合物，其中制剂中总脂质的质量与组合物中核酸分子(优选mRNA分子)的质量之比(m/m比率(总脂质/mRNA))为10至140。
实施方案8.实施方案7的组合物，其中m/m比率(总脂质/mRNA)为10至20，优选为12至16，更优选为14。
实施方案9.实施方案8的组合物，其中所述组合物包含一定量的核酸分子，优选一定量的mRNA分子，其中组合物的核酸分子，优选mRNA分子的量为约0.01mg/ml至约1.5mg/ml，优选为约0.05mg/ml至约0.8mg/ml，更优选为约0.075mg/ml至约0.4mg/ml，最优选为约0.2mg/ml。
实施方案10.实施方案7的组合物，其中所述m/m比率(总脂质/mRNA)为20至40，优选为24至32，更优选为28。
实施方案11.实施方案10的组合物，其中所述组合物包含一定量的核酸分子，优选一定量的mRNA分子，其中组合物的核酸分子，优选mRNA分子的量为约0.01mg/ml至约1.5mg/ml，优选为约0.05mg/ml至约0.8mg/ml，更优选为约0.075mg/ml至约0.4mg/ml，最优选为约0.2mg/ml。
实施方案12.实施方案7的组合物，其中m/m比率(总脂质/mRNA)为40至80，优选为48至64，更优选为56。
实施方案13.实施方案12的组合物，其中所述组合物包含一定量的核酸分子，优选一定量的mRNA分子，其中组合物的核酸分子，优选mRNA分子的量为约0.01mg/ml至约1mg/ml，优选为约0.05mg/ml至约0.8mg/ml，更优选为约0.075mg/ml至约0.4mg/ml，最优选为约0.15mg/ml。
实施方案14.实施方案7的组合物，其中m/m比率(总脂质/mRNA)为80至140，优选为96至128，更优选为112。
实施方案15.实施方案14的组合物，其中所述组合物包含一定量的核酸分子，优选一定量的mRNA分子，其中组合物的核酸分子，优选mRNA分子的量为约0.01mg/ml至约0.65mg/ml，优选为约0.05mg/ml至约0.5mg/ml，更优选为约0.075mg/ml至约0.3mg/ml，最优选为约0.1mg/ml。
实施方案16.实施方案7至15中任一项、优选实施方案8和9中任一项的组合物，其中所述制剂中三羧酸的浓度为1.35μmol/ml至3.23μmol/ml，优选为1.72μmol/ml至2.86μmol/ml。
实施方案17.实施方案7至15中任一项、优选实施方案10和11中任一项的组合物，其中所述制剂中三羧酸的浓度为2.76μmol/ml至6.40μmol/ml，优选为3.55μmol/ml至5.73μmol/ml。
实施方案18.实施方案7至15中任一项、优选实施方案12和13中任一项的组合物，其中所述制剂中三羧酸的浓度为5.52μmol/ml至12.80μmol/ml,优选为6.87μmol/ml至11.45μmol/ml。
实施方案19.实施方案7至15中任一项、优选实施方案14和15中任一项的组合物，其中所述制剂中三羧酸的浓度为10.98μmol/ml至25.66μmol/ml，优选为13.64μmol/ml至22.90μmol/ml。
实施方案20.实施方案1至15中任一项，优选实施方案7至19中任一项、更优选实施方案16至19中任一项的组合物，其中所述组合物包含一定量的核酸分子，优选mRNA分子，其中所述组合物的mRNA分子的量为约0.01mg/ml至约1.5mg/ml，优选为0.05mg/ml至约0.8mg/ml，更优选为约0.075mg/ml至约0.4mg/ml，最优选为约0.2mg/ml。
实施方案21.实施方案1至20中任一项、优选实施方案7至20中任一项、更优选实施方案16至20中任一项的组合物，其中所述脂质组合物形成颗粒。
实施方案22.实施方案21的组合物，其中所述颗粒包含三羧酸。
实施方案23.实施方案22的组合物，其中所述三羧酸包含在颗粒中。
实施方案24.实施方案1至23中任一项的组合物，其中所述三羧酸与所述脂质组合物形成复合物。
实施方案25.实施方案22至24中任一项的组合物，其中所述三羧酸结合在颗粒中或结合至颗粒上。
实施方案26.实施方案25的组合物，其中在组合物和/或颗粒透析后，所述三羧酸被颗粒结合或结合至颗粒。
实施方案27.实施方案21的组合物，其中所述颗粒包含所述核酸分子，优选所述mRNA分子。
实施方案28.实施方案21至27中任一项的组合物，其中所述核酸分子，优选所述mRNA分子，形成颗粒的一部分。
实施方案29.实施方案1至28中任一项的组合物，其中所述核酸分子，优选mRNA分子，具有治疗活性。
实施方案30.实施方案1至29中任一项的组合物，其中粒径为30nm至200nm，优选为约40nm至约140nm，甚至更优选为约60nm至120nm。
实施方案31.实施方案30的组合物，其中粒度通过动态光散射测定。
实施方案32.实施方案21至31中任一项的组合物，其中所述颗粒具有ζ电势，其中所述颗粒的ζ电势为约+0mV至约+80mV，优选所述颗粒的ζ电势为约+0mV至约+45mV。
实施方案33.实施方案32的组合物，其中ζ电势通过激光多普勒电泳测量来测量。
实施方案34.实施方案1至33中任一项、优选实施方案7至20中任一项的组合物，其中所述三羧酸选自柠檬酸、异柠檬酸(1-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸)、顺乌头酸、反乌头酸、顺乌头酸和反乌头酸的混合物、丙烷-1,2,3-三羧酸(丙三酸)、松蕈酸、均苯三酸及其任意混合物。
实施方案35.实施方案34的组合物，其中所述三羧酸是柠檬酸。
实施方案36.实施方案1至35中任一项的组合物，其中所述组合物包含载体，优选药学上可接受的载体。
实施方案37.实施方案36的组合物，其中所述载体选自水、水性溶液、优选等渗水溶液、蔗糖溶液、优选等渗蔗糖溶液、盐溶液、优选等渗盐溶液、缓冲溶液、优选等渗缓冲溶液和水混溶性溶剂。
实施方案38.实施方案37的组合物，其中所述载体选自等渗水溶液、等渗水性溶液、等渗蔗糖溶液、等渗盐溶液和等渗缓冲溶液。
实施方案39.实施方案36至38中任一项的组合物，其中所述载体是蔗糖水溶液，优选270mM蔗糖水溶液或于缓冲液中的270mM蔗糖溶液，优选所述缓冲液是pH 7.4的10mMTRIS缓冲液。
实施方案40.实施方案1至39中任一项的组合物，其中阳离子脂质选自包括β-(L-精氨酰)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、L-精氨酰基-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基氯化物)、DOTMA(1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(优选为氯化物盐)和DC-胆固醇(3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇)，优选地阳离子脂质是β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺或L-精氨酰基-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺。
实施方案41.实施方案1至40中任一项、优选实施方案40的组合物，其中所述中性脂质是
(a)两性离子磷脂，其选自二植烷酰基-PE(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DLPE(1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺))、POPE((1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺))和DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，或
(b)不带电荷的甾醇脂质，其选自胆固醇和豆甾醇，
优选地为磷脂二植烷酰基-PE。
实施方案42.实施方案1至41中任一项、优选实施方案41的组合物，其中所述屏蔽脂质是选自以下的聚乙二醇化脂质：甲氧基PEG-DSPE((1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)](优选为铵盐或钠盐)、甲氧基PEG-DLG(1,2-二月桂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DMG(1,2-二月桂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-c-DMA(N-[(甲氧基聚(乙二醇))氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰氧丙基-3-胺)、甲氧基PEG-C8-神经酰胺(N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]})和甲氧基PEG-C16-神经酰胺(N-棕榈酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]})。
实施方案43.实施方案1至42中任一项、优选实施方案40至42中任一项、更优选实施方案42的组合物，其中所述屏蔽脂质是聚乙二醇化脂质，优选所述聚乙二醇化脂质是甲氧基PEG2000-DSPE。
实施方案44.实施方案1至43中任一项的组合物，其中所述脂质组合物中脂质的摩尔比为
-约20mol％至约80mol％的阳离子脂质，
-约10mol％至约70mol％的中性脂质，和
-约0.1mol％至10mol％，优选约1mol％至约10mol％的屏蔽脂质，其中优选屏蔽脂质是聚乙二醇化脂质，
其中所述总脂质含量为100％。
实施方案45.实施方案44的组合物，其中所述聚乙二醇化脂质的PEG的分子量为约750Da至约5000Da，优选为约1500Da至3000Da。
实施方案46.实施方案45的组合物，其中所述脂质组合物中脂质的摩尔比为
-约35mol-％至约65mol-％的阳离子脂质，
-约35mol-％至约65mol-％的中性脂质，和
-约0.1mol-％至5mol-％的屏蔽脂质，优选为聚乙二醇化脂质，
其中总脂质含量为100％，
优选地，所述组合物中脂质的摩尔比为
-约45mol-％至约55mol-％的阳离子脂质，
-约45mol-％至约55mol-％的中性脂质，和
-约0.5mol-％至2mol-％，
其中总脂质含量为100％。
实施方案47.实施方案1至46中任一项、优选实施方案44至46中任一项的组合物，其中所述脂质组合物的摩尔比为
-50mol-％的阳离子脂质，其中所述阳离子脂质是β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺或L-精氨酰-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺，
-49mol-％的中性脂质，其中所述中性脂质是二植烷酰基-PE(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，和
-1mol-％的屏蔽脂质，其中所述屏蔽脂质是mPEG-2000-DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](优选为钠盐))。
实施方案48.实施方案47的组合物，其中所述制剂中总脂质的质量与所述组合物中核酸分子(优选mRNA分子)的质量的比率(m/m比率(总脂质/mRNA))为10至140。
实施方案49.实施方案48的组合物，其中m/m比率(总脂质/mRNA)为10至20，优选为12至16，更优选为14。
实施方案50.实施方案49的组合物，其中所述组合物包含一定量的核酸分子，优选一定量的mRNA分子，其中所述组合物的核酸分子，优选mRNA分子的量为约0.01mg/ml至约1.5mg/ml，优选为约0.05mg/ml至约0.8mg/ml，更优选为约0.075mg/ml至约0.4mg/ml；最优选为约0.2mg/ml。
实施方案51.实施方案48的组合物，其中m/m比率(总脂质/mRNA)为20至40，优选为24至32，更优选为28。
实施方案52.实施方案51的组合物，其中所述组合物包含一定量的核酸分子，优选一定量的mRNA分子，其中所述组合物的核酸分子，优选mRNA分子的量为约0.01mg/ml至约1.5mg/ml，优选为约0.05mg/ml至约0.8mg/ml，更优选为约0.075mg/ml至约0.4mg/ml；最优选为约0.2mg/ml。
实施方案53.实施方案48的组合物，其中m/m比率(总脂质/mRNA)为40至80，优选为48至64，更优选为56。
实施方案54.实施方案53的组合物，其中所述组合物包含一定量的核酸分子，优选一定量的mRNA分子，其中所述组合物的核酸分子，优选mRNA分子的量为约0.01mg/ml至约1mg/ml，优选为约0.05mg/ml至约0.8mg/ml，更优选为约0.075mg/ml至约0.4mg/ml；最优选为约0.15mg/ml。
实施方案55.实施方案48的组合物，其中m/m比率(总脂质/mRNA)为80至140，优选为96至128，更优选为112。
实施方案56.实施方案55的组合物，其中所述组合物包含一定量的核酸分子，优选一定量的mRNA分子，其中所述组合物的核酸分子，优选mRNA分子的量为约0.01mg/ml至约0.65mg/ml，优选为约0.05mg/ml至约0.5mg/ml，更优选为约0.075mg/ml至约0.3mg/ml；最优选为约0.1mg/ml。
实施方案57.实施方案48至56中任一项、优选实施方案49和50中任一项的组合物，其中所述制剂中三羧酸的浓度为1.35μmol/ml至3.23μmol/ml，优选为1.72μmol/ml至2.86μmol/ml。
实施方案58.实施方案48至56中任一项、优选实施方案51和52中任一项的组合物，其中所述制剂中三羧酸的浓度为2.76μmol/ml至6.40μmol/ml，优选为3.55μmol/ml至5.73μmol/ml。
实施方案59.实施方案48至56中任一项、优选实施方案53和54中任一项的组合物，其中所述制剂中三羧酸的浓度为5.52μmol/ml至12.80μmol/ml，优选为6.87μmol/ml至11.45μmol/ml。
实施方案60.实施方案48至56中任一项、优选实施方案55和56中任一项的组合物，其中所述制剂中三羧酸的浓度为10.98μmol/ml至25.66μmol/ml，优选为13.64μmol/ml至22.90μmol/ml。
实施方案61.实施方案44至60中任一项、优选实施方案47至60中任一项、更优选实施方案57至60中任一项的组合物，其中所述组合物包含一定量的核酸分子，优选mRNA分子，其中所述组合物中核酸分子，优选mRNA分子的量为约0.01mg/ml至约1.5mg/ml，优选为约0.05mg/ml至约0.8mg/ml，更优选为约0.075mg/ml至约0.4mg/ml，以及最优选为约0.2mg/ml。
实施方案62.实施方案1至61中任一项的组合物，其中所述组合物适于将治疗活性剂递送至内皮细胞。
实施方案63.实施方案62的组合物，其中所述内皮细胞是肺内皮细胞。
实施方案64.实施方案1至63中任一项的组合物，其中所述组合物适于将治疗活性剂递送至脉管系统，优选肺脉管系统，更优选人肺脉管系统。
实施方案65.一种包含脂质组合物的组合物，其中所述脂质组合物包含阳离子脂质、中性脂质和屏蔽脂质，
其中所述阳离子脂质选自β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、L-精氨酰基-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基氯化物)、DOTMA(1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(优选为氯化物盐))和DC-胆固醇(3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇)，
其中所述中性脂质是选自二植烷酰-PE(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DLPE(1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺))、POPE((1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺))和DSPE(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸)的两性离子性磷脂，或
选自胆固醇和豆甾醇的不带电荷的甾醇脂质，
其中所述屏蔽脂质是选自以下的聚乙二醇化脂质：甲氧基PEG-DSPE((1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)](优选为铵盐或钠盐)、甲氧基PEG-DLG(1,2-二月桂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-rac-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-c-DMA(N-[(甲氧基聚乙二醇))氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰基氧丙基-3-胺)、甲氧基PEG-C8-神经酰胺(N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]})、甲氧基PEG-C16-神经酰胺(N-棕榈酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]})，和
其中该组合物包含mRNA。
实施方案66.一种包含脂质组合物的组合物，其中所述脂质组合物包含阳离子脂质、中性脂质和屏蔽脂质，
其中所述阳离子脂质选自β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、L-精氨酰基-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基氯)、DOTMA(1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(优选为氯化物盐))和DC-胆固醇(3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇)，
其中所述中性脂质是
选自二植烷酰基-PE(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DLPE(1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺))、POPE((1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺))和DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)的两性离子性磷脂，或
选自胆固醇和豆甾醇的不带电荷的甾醇脂质，并且
其中所述屏蔽脂质是选自以下的聚乙二醇化脂质：甲氧基PEG-DSPE((1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)](优选为铵盐或钠盐)、甲氧基PEG-DLG(1,2-二月桂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-c-DMA(N-[(甲氧基聚(乙二醇))氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰基氧丙基-3-胺)、甲氧基PEG-C8-神经酰胺(N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]})和甲氧基PEG-C16-神经酰胺(N-棕榈酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]})，和
其中所述脂质组合物形成颗粒，其中所述粒度为(a)30nm至200nm，优选为约40nm至约140nm，甚至更优选为约60nm至120nm，或为(b)约30nm至约100nm，优选为约30nm至约60nm。
实施方案67：实施方案66的组合物，其中所述组合物包含mRNA。
实施方案68：实施方案65的组合物，其中所述脂质组合物形成颗粒，其中粒度为约30nm至约200nm，优选粒度为约40nm至约140nm，甚至更优选为约60nm至120nm，或(b)为约30nm至约100nm，优选为约30nm至约60nm。
实施方案69：实施方案66至68中任一项的组合物，其中所述颗粒包含mRNA。
实施方案70：实施方案65至69中任一项的组合物，其中粒度通过动态光散射测定。
实施方案71：实施方案1至70中任一项的组合物，其中颗粒的ζ电势为约+0mV至约+80mV，优选颗粒的ζ电势为约+0mV至约+45mV。
实施方案72：实施方案71的组合物，其中ζ电势通过激光多普勒电泳测量来测量。
实施方案73：实施方案65和67至72中任一项的组合物，其中mRNA形成颗粒的一部分。
实施方案74：实施方案65和66至73中任一项的组合物，其中所述组合物的总脂质含量的质量与所述组合物的mRNA的质量的比率为约2至约50，优选为约5至40，更优选为约10至约30。
实施方案75：实施方案65至74中任一项的组合物，其中所述组合物适于将治疗活性剂递送至内皮细胞。
实施方案76：实施方案75的组合物，其中所述内皮细胞是肺内皮细胞。
实施方案77：实施方案65至76中任一项的组合物，其中所述组合物适于将治疗活性剂递送至脉管系统，优选肺脉管系统，更优选人肺脉管系统。
实施方案78：实施方案65至77中任一项的组合物，其中所述治疗活性剂是mRNA，优选所述治疗活性剂是所述组合物包含的mRNA。
实施方案79：实施方案65至78中任一项的组合物，其中mRNA与脂质组合物形成复合物。
实施方案80：实施方案65至79中任一项的组合物，其中所述组合物包含载体，优选药学上可接受的载体。
实施方案81：实施方案80的组合物，其中所述载体选自水、水溶液、优选等渗水溶液、蔗糖溶液、优选等渗蔗糖溶液、盐溶液、优选等渗盐溶液、缓冲溶液、优选等渗缓冲溶液和水混溶性溶剂。
实施方案82：实施方案81的组合物，其中所述载体选自等渗水溶液、等渗水溶液、等渗蔗糖溶液、等渗盐溶液和等渗缓冲溶液。
实施方案83：实施方案80至82中任一项的组合物，其中所述载体是蔗糖水溶液，优选270mM蔗糖水溶液或于缓冲液中的270mM蔗糖溶液，优选缓冲液是pH 7.4的10mM TRIS缓冲液。
实施方案84：实施方案65至83中任一项的组合物，其中聚乙二醇化脂质的PEG的分子量为约750Da至约5000Da，优选为约1500Da至3000Da。
实施方案85：实施方案65至84中任一项的组合物，其中所述脂质组合物中脂质的摩尔比为
-约20mol-％至约80mol-％的阳离子脂质，
-约10mol-％至约70mol-％的中性脂质，和
-约0.1mol-％至10mol-％的聚乙二醇化脂质，
其中总脂质含量为100％。
实施方案86.实施方案85的组合物，其中所述脂质组合物中脂质的摩尔比为
-约35mol-％至约65mol-％的阳离子脂质，
-约35mol-％至约65mol-％的中性脂质，和
-约0.1mol-％至5mol-％的聚乙二醇化脂质，
其中总脂质含量为100％。
实施方案87：实施方案65至86中任一项的组合物，其中阳离子脂质是β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺或L-精氨酰基-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺。
实施方案88：实施方案65至87中任一项、优选实施方案84的组合物，其中所述中性脂质是磷脂二植烷酰基-PE。
实施方案89：实施方案65至88中任一项、优选实施方案87和88中任一项、更优选实施方案88的组合物，其中聚乙二醇化脂质是甲氧基PEG2000-DSPE。
实施方案90：实施方案65至89中任一项的组合物，其中所述脂质组合物的摩尔比为
-50mol-％的阳离子脂质，其中阳离子脂质是β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺或L-精氨酰基-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺，
-9mol-％的中性脂质，其中所述中性脂质是二植烷酰基-PE(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，和
-1mol-％的屏蔽脂质，其中所述屏蔽脂质是mPEG-2000-DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](优选为钠盐))。
实施方案91：实施方案1至90中任一项的组合物用于治疗和/或预防疾病的方法中。
实施方案92：实施方案91使用的组合物，其中所述治疗和/或预防包括向内皮细胞，优选脉管系统的内皮细胞，更优选肺脉管系统的内皮细胞施用所述组合物或所述组合物的mRNA。
实施方案93：实施例92使用的组合物，其中所述内皮是人内皮。
实施方案94：实施方案92至93中任一项使用的组合物，其中所述疾病是其中参与所述疾病潜在病理机制的靶分子存在于肺脉管系统的内皮细胞中并且所述mRNA的提供产生治疗效果的疾病。
实施方案95：实施方案91至94中任一项使用的组合物，其中所述疾病选自急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、肺癌、肺转移、肺高血压和肺动脉高血压。
实施方案96：实施方案91至95中任一项的组合物，其中所述组合物用于静脉内、肌内、皮下、皮内、玻璃体内、鞘内、血管周、鼻内施用，并且/或者用于通过吸入施用，优选地，所述组合物用于静脉内施用。
实施方案97：实施方案1至90中任一项的组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
实施方案98：实施方案97的用途，其中疾病的治疗和/或预防包括将组合物或核酸分子，优选组合物的mRNA分子施用至内皮细胞，优选脉管系统的内皮细胞，更优选肺脉管系统的内皮细胞。
实施方案99：实施例98的用途，其中所述内皮是人内皮。
实施方案100：实施方案98至99中任一项的用途，其中所述疾病是其中参与所述疾病潜在病理机制的靶分子存在于肺脉管系统的内皮细胞中、并且所述核酸分子、优选mRNA分子的提供产生治疗效果的疾病。
实施方案101：实施方案97至100中任一项的用途，其中所述疾病选自急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、肺癌、肺转移、肺高血压和肺动脉高血压。
实施方案102：实施方案97至101中任一项的用途，其中所述药物用于静脉内、肌内、皮下、皮内、玻璃体内、鞘内、血管周、鼻内施用，并且/或者用于通过吸入施用，优选所述药物用于静脉内施用。
实施方案103：一种药物组合物，其包含实施方案1至90中任一项的组合物和药物活性剂。
实施方案104：实施方案103的药物组合物，其中实施方案1至90中任一项的组合物的核酸分子、优选mRNA是治疗活性剂。
实施方案105：实施方案103至104中任一项的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病，其中所述疾病优选选自急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、肺癌、肺转移、肺高血压和肺动脉高血压。
实施方案106：一种试剂盒，其包括实施方案1至90中任一项的组合物和使用说明。
实施方案107：一种用于治疗和/或预防疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用实施方案1至90中任一项的组合物，其中所述组合物的核酸分子、优选mRNA分子具有治疗活性，更优选地，所述核酸分子、更优选地mRNA分子适于治疗所述疾病。
实施方案108：实施方案107的方法，其中所述疾病优选选自急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、肺癌、肺转移、肺高血压和肺动脉高血压。
实施方案109：实施方案107至108中任一项的方法，其中所述受试者选自人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猴、狗、猫、猪、绵羊、山羊、牛和马，优选所述受试者是人。
实施方案110：一种用于制备实施方案1至90中任一项的组合物的方法，其中所述方法包括将包含所述脂质组合物的脂质组分的溶液与包含核酸分子、优选mRNA分子的溶液混合，其中更优选所述混合是在线混合。
实施方案111：实施方案111的方法，其中所述混合是非湍流和基于扩散的混合，优选是快速非湍流和基于扩散的混合。
实施方案112：实施方案110至111中任一项的方法，其中所述混合是微流体混合，优选使用微流体混合装置的微流体混合。
实施方案113：根据实施例112所述的方法，其中所述微流体混合装置选自交错的人字形混合器、微流体动力混合装置或Dean涡旋分叉混合装置。
实施方案114：实施方案110至113中任一项的方法，其中包含脂质组分的溶液包含在水混溶性有机溶剂中的脂质组合物的组分。
实施方案115：实施方案114的方法，其中水混溶性有机溶剂选自乙醇、丙酮、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、1-丙醇、2-丙醇、二甲基亚砜，优选地，水混溶性溶剂选自乙醇、叔丁醇和1-丁醇。
实施方案116：实施方案110至115中任一项的方法，其中包含核酸分子、优选mRNA分子的溶液包含在水或水性缓冲液中的核酸分子、优选mRNA分子。
实施方案117：实施例116所述的方法，其中
(a)如果所述组合物是实施方案1至64中任一项的组合物，则所述水性缓冲液是三羧酸的缓冲液；以及
(b)如果所述组合物是实施方案65至90中任一项的组合物，则所述缓冲剂是乙酸盐缓冲剂、TRIS缓冲剂(2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇)或HEPES缓冲剂(2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)。
实施方案118.实施方案117的方法，其中所述缓冲液选自柠檬酸、异柠檬酸(1-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸)、顺乌头酸、反乌头酸、顺乌头酸和反乌头酸的混合物、丙烷-1,2,3-三羧酸(丙三羧酸)、松蕈酸、均苯三酸及其任意混合物的缓冲液，优选柠檬酸盐缓冲液。
实施方案119.实施方案117至118中任一项的方法，其中所述缓冲液为三羧酸的缓冲液，优选为柠檬酸盐缓冲液，其中所述缓冲液为0.1mM至300mM，优选1mM至150mM，更优选10mM至80mM。
实施方案120.实施方案117至119中任一项的方法，其中所述缓冲液为三羧酸的缓冲液，优选柠檬酸盐缓冲液，其中所述缓冲液的pH为3至7，优选为4至6，更优选为4.5至5.7。
实施方案121：实施方案110至120中任一项的方法，其中包含核酸分子(优选mRNA分子)的溶液与包含脂质组合物的脂质组分的溶液的体积混合比率为约1∶1至约6∶1，优选为约2∶1至约4∶1。
实施方案122：实施方案110至121中任一项的方法，其中在混合后从所述混合物中除去有机溶剂。
实施方案123：实施方案122的方法，其中在混合后通过透析、切向流过滤和/或渗滤从所述混合物中除去有机溶剂。
实施方案124：实施方案123的方法，其中透析、切向流过滤和/或渗滤从组合物中，优选从脂质组合物中，更优选从由脂质组合物形成的颗粒中除去少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％或0％的三羧酸。
实施方案125：实施方案123至124中任一项的方法，其中用于切向流过滤、渗滤和/或透析的超滤膜具有约1,500Da至约500,000Da，优选约1,500Da至约100,000Da，更优选约1,500Da至约30,000Da的截留分子量。
实施方案126：实施方案110至125中任一项的方法，其中所述反应混合物在混合后，优选在除去有机溶剂后浓缩。
实施方案127：实施方案126的方法，其中通过切向流过滤和/或渗滤浓缩所述反应混合物。
实施方案128：实施方案126至127中任一项的方法，其中浓缩后的反应混合物是即用型组合物。
根据本发明，本发明潜在的问题通过包含脂质组合物、三羧酸和mRNA的组合物来解决，其中所述脂质组合物包含阳离子脂质、中性脂质和屏蔽脂质；涉及如上所述的实施方案1的这种组合物以及其他也称为(本)发明的第一方面。
根据本发明，本发明潜在的问题也通过包含脂质组合物的组合物来解决，其中所述脂质组合物包含阳离子脂质、中性脂质和屏蔽脂质，
其中所述阳离子脂质选自β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、L-精氨酰基-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基氯化物)、DOTMA(1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(优选为氯化物盐))和DC-胆固醇(3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇)，
其中所述中性脂质是选自二植烷酰-PE(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DLPE(1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺))、POPE((1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺))和DSPE(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸)的两亲离子性磷脂，或
选自胆固醇和豆甾醇的不带电荷的甾醇脂质，
其中所述屏蔽脂质是选自以下的聚乙二醇化脂质：甲氧基PEG-DSPE((1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)](优选为铵盐或钠盐)、甲氧基PEG-DLG(1,2-二月桂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-rac-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-c-DMA(N-[(甲氧基聚乙二醇))氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰基氧丙基-3-胺)、甲氧基PEG-C8-神经酰胺(N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]})、甲氧基PEG-C16-神经酰胺(N-棕榈酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]})，并且其中该组合物包含mRNA；涉及如上所述的实施方案65的这种组合物也被称为(本)发明的第二方面。
根据本发明，本发明潜在的问题也通过包含脂质组合物的组合物来解决，其中所述脂质组合物包含阳离子脂质、中性脂质和屏蔽脂质，
其中所述阳离子脂质选自β-(L-精氨酰)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、L-精氨酰基-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基氯化物)、DOTMA(1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(优选为氯化物盐))和DC-胆固醇(3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇)，
其中所述中性脂质是
选自二植烷酰基-PE(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DLPE(1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺))、POPE((1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺))和DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)的两性离子性磷脂，或
选自胆固醇和豆甾醇的不带电荷的甾醇脂质，并且
其中所述屏蔽脂质是选自以下的聚乙二醇化脂质：甲氧基PEG-DSPE((1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)](优选为铵盐或钠盐)、甲氧基PEG-DLG(1,2-二月桂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-c-DMA(N-[(甲氧基聚(乙二醇))氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰氧丙基-3-胺)、甲氧基PEG-C8-神经酰胺(N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]})和甲氧基PEG-C16-神经酰胺(N-棕榈酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]})，和
并且其中所述脂质组合物形成颗粒，其中颗度为(a)30nm至200nm，优选约40nm至约140nm，更优选约60nm至约120nm；或为(b)约30nm至约100nm，优选约30nm至约60nm；涉及如上所述的实施方案66的这种组合物等也被称为(本)发明的第三方面。
根据本发明，本发明潜在的问题通过根据第一、第二和第三方面的组合物(包括其任何实施方案)解决，所述组合物用于治疗和/或预防疾病的方法中；涉及如上所述的实施方案91的这种组合物等也被称为(本)发明的第四方面。
应当承认，只要没有相反地指出，本发明的第一方面的任何实施方案同样是本发明的第二和第三实施方案的实施方案，反之亦然。
根据本发明，本发明潜在的问题通过将第一、第二和第三方面的组合物(包括其任何实施方案)用于制备用于治疗和/或预防疾病的药物来解决；涉及上述实施方案97的这种组合物的用途等也被称为(本)发明的第五方面。
根据本发明，本发明潜在的问题通过药物组合物来解决，该药物组合物包含根据第一、第二和第三方面的组合物(包括其任何实施方案)和药物活性剂；涉及如上所述的实施方案103等的药物组合物也称为(本)发明的第六方面。根据第六方面的药物组合物也是包含根据第一、第二和第三方面的组合物(包括其任何实施方案)的药物组合物，其中核酸(优选mRNA)是药物组合物的治疗剂，并且根据第一、第二和第三方面的这种组合物的其余部分(包括其任何实施方案或其部分)形成所述药物组合物中包含的药学上可接受的赋形剂。优选地，根据第一、第二和第三方面的这种组合物的剩余部分，包括除脂质组合物(优选其脂质)之外的其任何实施方案，形成所述药物组合物中包含的赋形剂或药学上可接受的赋形剂。
根据本发明，本发明潜在的问题通过试剂盒来解决，该试剂盒包含根据第一、第二和第三方面的组合物(包括其任何实施方案)和使用说明；涉及如上所述的实施方案106等的这种试剂盒也称为(本)发明的第七方面。
根据本发明，本发明潜在的问题通过用于治疗和/或预防疾病的方法来解决，其中所述方法包括向有需要的受试者施用根据第一、第二和第三方面的组合物(包括其任何实施方案)，其中所述组合物的核酸分子、优选mRNA具有治疗活性，优选所述核酸分子、更优选所述mRNA适用于疾病的治疗；涉及如上所述的实施方案107等的方法也称为(本发明)的第八方面。
根据本发明，本发明潜在的问题通过用于制备根据第一、第二和第三方面的组合物(包括其任何实施方案)的方法来解决，其中该方法包括将包含脂质组合物的脂质组分的溶液与包含核酸分子、优选mRNA分子的溶液混合，其中优选该混合是在线混合；涉及如上所述的实施方案110等的方法也称为(本)发明的第九方面。
根据本发明，根据第一、第二和第三方面的组合物也被称为(本)发明的组合物或根据(本)发明的组合物。
应当承认，如果提及现有技术的脂质纳米颗粒，特别地结合本发明的第一方面，则现有技术的此类脂质纳米颗粒是不包含三羧酸作为本发明的组合物和脂质纳米颗粒的脂质纳米颗粒。
本发明、尤其是其第一方面(包括其任何实施方案)基于的是如下令人惊讶的发现：包含脂质组合物和三羧酸诸如柠檬酸的组合物在给定的恒定量的所述核酸分子下提供了增加数量的由脂质组合物形成的脂质颗粒，同时伴随地保持了单分散的粒度分布。如果组合物包含核酸分子诸如mRNA，则后者更是如此。换句话说，如果提供给定量的脂质组合物和给定量的核酸以形成包含脂质颗粒、特别是脂质纳米颗粒(LNP)的组合物，则三羧酸允许核酸分子在形成的脂质颗粒上均匀分布，另外，甚至在其中在三羧酸不存在的情况下组合物将显示多分散的粒度分布的总脂质与核酸分子的摩尔质量比下，所述脂质颗粒显示单分散的粒度分布。如此产生的脂质纳米粒通常具有增加的质量比，其中本文所用的质量比定义为组合物中总脂质的质量与组合物中核酸、特别是mRNA的质量的比率(例如m/m比率(总脂质/mRNA))。在核酸分子的量、因此核酸分子的负电荷数量低于、优选显著低于组合物中脂质的正电荷总数的情况下，特别地观察到上述发现。这种情况有时也被称为核酸分子的量在组合物中有限。
不希望受任何理论的束缚，本发明人假设三羧酸作为填充分子起作用，并且可以在此范围内使用，以便在大量脂质颗粒、特别是脂质纳米颗粒上均匀分布给定的—有限量的--核酸分子。如果三羧酸无毒和/或无免疫原性，则这是特别有利的。
本发明人还惊奇地发现，向包含脂质组合物和核酸分子的组合物中加入三羧酸避免了组合物从具有单分散颗粒分布的组合物转变为具有多分散颗粒分布的组合物，其中所述脂质组合物包含阳离子脂质、中性脂质和屏蔽脂质，并且其中与组合物中核酸分子和屏蔽脂质(如果有的话)提供的较少量负电荷相比，组合物中阳离子脂质分子提供的较大量正电荷导致组合物显示出正电荷过剩。
在一个实施方案中，特别是在本发明的组合物中，三羧酸和柠檬酸的含量可以通过实施方案6(其公开内容通过引用并入说明书的概述部分)中公开的测定手段来测定。
在本发明的第一、第二和第三方面的一个实施方案中，包括其任何实施方案，并且如本文中优选使用的，电荷是带电的电荷。据此，负电荷是带负电的电荷，正电荷是带正电的电荷。
关于本发明组合物的单分散粒度分布，应该承认这种单分散粒度分布优于多分散粒度分布。这种有利方面尤其存在于，在向受试者施用，优选为了治疗、诊断和/或诊疗目的而向受试者施用时，组合物和这种组合物的颗粒在受试者中的更加均匀的分布。受试者中的这种更均匀的分布使得靶细胞的转染更受控制且更有效，从而分别提高了组合物和颗粒的有效载荷(特别是诸如核酸和mRNA)的递送效率。通常，受试者中靶细胞的更可控和更有效的转染伴随着受试者中更少的副作用。此外，更均匀的颗粒分布允许纳米颗粒制造过程中更可靠的批次间可比性。
本发明，尤其是其第一方面，包括其任何实施方案，是基于进一步令人惊讶的发现，即在脂质组合物中使用三羧酸诸如柠檬酸，在用所述组合物转染细胞时，增加了核酸分子从这种包含三羧酸的脂质组合物中的释放。不希望受任何理论的束缚，本发明人假设这种增加的核酸分子的释放是由三羧酸在内体pH(其通常约为6)下的高缓冲能力导致的。由于这种高缓冲能力，可以防止内体酸化，从而防止内体成熟，结果增加了完整核酸分子向细胞质的内体释放。如果核酸分子是治疗活性分子，则这种增加的完整核酸分子的释放伴随着核酸分子的更快和更全面的效果，诸如治疗效果。
本发明人惊奇地发现如下包含脂质组合物的组合物在靶向内皮细胞、优选脉管系统的内皮细胞、更优选肺脉管系统的内皮细胞中特别有效，其中所述脂质组合物包含阳离子脂质、中性脂质和屏蔽脂质，
其中所述阳离子脂质选自β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰-N-油酰-酰胺、L-精氨酰-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]N,N,N-三甲基铵甲基氯化物)、DOTMA(1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(氯化物盐))和DC-胆固醇(3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇)，
其中所述中性脂质是：
选自二植烷酰基-PE(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DLPE(1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺))、POPE((1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺))和DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)的两性离子性磷脂，或
选自胆固醇和豆甾醇的不带电荷的甾醇脂质，
其中所述屏蔽脂质是选自以下的聚乙二醇化脂质：
甲氧基PEG-DSPE((1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)](铵盐或钠盐)、甲氧基PEG-DLG(1,2-二月桂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、甲氧基PEG-c-DMA(N-[(甲氧基聚(乙二醇))氨甲酰基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、甲氧基PEG-C8-神经酰胺(N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]})、甲氧基PEG-C16-神经酰胺(N-棕榈酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]})。
关于由肺脉管系统的内皮细胞形成的内皮，本领域技术人员公认脉管系统内皮是覆盖动脉、毛细血管和静脉的内壁的最内层结构。内皮细胞(EC)被描述为锚定至80-nm厚的基底层(BL)。EC和BL两者构成了血管内膜，形成了血液相容的表面，估计在人体中总表面积为3000-6000m2，包含1-6×1013个内皮细胞(Krüger-Genge,A.,Blocki,A.,Franke,R.-P.&Jung,F.Vascular Endothelial Cell Biology:An Update.Int J Mol Sci 20,4411(2019))。
此外，本发明人令人惊奇地发现，这种靶向允许将mRNA递送至所述内皮细胞，由此这种mRNA是本发明组合物的一部分，优选这种mRNA与本发明组合物的脂质组合物缔合。更优选地，这种mRNA是由本发明组合物的脂质组合物形成的颗粒的一部分。
同样，不希望受任何理论的束缚，本发明人假设所述mRNA向内皮细胞的递送部分是由本发明组合物的脂质组合物形成的颗粒的大小分布引起的。
上述发现令人惊讶，因为这与阳离子脂质纳米复合物的典型系统行为形成对比，所述阳离子脂质纳米复合物通常在肝组织中显示普遍的基因敲低，而siRNA在肺中仅短暂累积(Polach,Kj等人(2012),Mol Ther 20:91-100；Schroeder,A等人(2010),J InternMed 267:9-21；Tao,W等人(2010),Mol Ther 18:1657-1666)。
如本文中优选使用的，递送剂或递送媒介物是包含本发明脂质组合物的组合物。同样在本文中优选使用的，递送剂或递送媒介物是本发明的组合物。本文中优选使用的递送剂或递送媒介物是适于将化合物递送至结构的试剂或媒介物诸如组合物；优选地，这种结构是器官、组织或细胞；更优选地，这种结构是器官、组织或细胞。在一个优选实施方案中，这种化合物是治疗活性剂、生物活性剂或药物活性剂。
如本文中优选使用的，治疗活性剂是适于在宿主生物体中引发治疗效果或治疗上有益的效果的化合物。在一个优选实施方案中，治疗活性剂是核酸分子，更优选是mRNA。
在本发明的每个和任何方面(包括其任何实施方案)的一个实施方案中，核酸分子是mRNA分子。
在本发明的第一、第二和第三方面(包括其任何实施方案)的一个实施方案中，三羧酸结合在或结合到由本发明组合物中的脂质组合物形成的颗粒中。这种结合是稳定的；更具体地说，这样结合的三羧酸不能通过透析手段除去。这种透析的条件优选如下：在一个实施方案中，本发明的组合物和本发明的脂质组合物可以分别使用具有3.5kD的截留分子量的透析膜针对于10mM TRIS/9％蔗糖来进行透析。优选地，进行这种透析，直至在这种透析条件下尽可能除去所有不需要的成分。在一个替代实施方案中，本发明的组合物和本发明的脂质组合物可以分别使用标准透析盒在下列条件下进行透析：将分别含有本发明的组合物和本发明的脂质组合物的样品在漂浮透析盒中在室温或4℃下透析2小时，同时轻轻搅拌透析缓冲液；更换透析缓冲液并继续透析另外2小时；随后，更换透析缓冲液并继续透析过夜；所有单次透析步骤应在室温或4℃下进行；在透析程序过程中，应使用总量至少为样品体积300倍的透析缓冲液。优选地，这种透析步骤的目的是除去脂质组合物的制备中使用的一种或多种溶剂。本领域技术人员将会承认，其它透析条件也可能用于同一目的，更具体地说，用于达到相同的结果，特别是除去脂质组合物的制备中使用的一种或多种溶剂。
在本发明的第一、第二和第三方面(包括其任何实施方案)的一个实施方案中，就脂质种类而言，所述脂质组合物至少包含阳离子脂质、中性脂质和屏蔽脂质。本领域技术人员将理解，本发明组合物的脂质组合物包含所述三种脂质种类中的每一种的多种单独的脂质分子。
脂质组合物包含两种或更多种不同种类的中性脂质在本发明的范围内，并且在本发明的每个和任何方面(包括其任何实施方案)的实施方案的范围内。
脂质组合物包含两种或更多种不同种类的阳离子脂质在本发明的范围内，并且在本发明的每个和任何方面(包括其任何实施方案)的实施方案的范围内。
脂质组合物包含两种或更多种不同种类的屏蔽脂质在本发明的范围内，并且在本发明的每个和任何方面(包括其任何实施方案)的实施方案的范围内。
组合物包含两种或更多种不同种类的核酸分子在本发明的范围内，并且在本发明的每个和任何方面(包括其任何实施方案)的实施方案的范围内。
在由各个方面(包括其任何实施方案)定义的本发明的实施方案中，术语核酸和核酸分子可互换使用。
在由各个方面(包括其任何实施方案)定义的本发明的实施方案中，术语mRNA和mRNA分子可互换使用。
在由各个方面(包括其任何实施方案)定义的本发明的实施方案中，如果提及，特别是结合任何质量比提及总脂质，则总脂质是指脂质组合物中所有脂质的质量总和，以及相应地包含在本发明组合物中的脂质的质量总和。
在由各个方面(包括其任何实施方案)定义的本发明的实施方案中，如果提及，特别是结合任何质量比提及本发明组合物中包含的核酸或核酸分子的质量，则所述核酸和核酸分子的质量分别是本发明组合物中包含的全部核酸的所有质量的总和和所述核酸分子的所有质量的总和。
在由各个方面(包括其任何实施方案)定义的本发明的实施方案中，如果提及，特别是结合任何质量比提及本发明组合物中包含的mRNA或mRNA分子的质量，则所述mRNA和mRNA分子的质量分别是本发明组合物中包含的全部mRNA的所有质量的总和和mRNA分子的所有质量的总和。
在由各个方面(包括其任何实施方案)定义的本发明的实施方案中，并且如本文中优选使用的，表述m/m比率(总脂质/mRNA)与m/m比率(总脂质/mRNA分子)、m/m比率(总脂质/核酸)和m/m比率(总脂质/核酸分子)相同。因此，术语m/m比率(总脂质/mRNA)优选以通用方式使用，而不管核酸分别地是mRNA还是任何其它核酸和核酸分子。然而，在一个更优选的实施方案中，术语m/m比率(总脂质/mRNA)实际上是指本发明组合物中分别包含的mRNA和mRNA分子的质量。
在一个实施方案中并且如本文中优选使用的，即用型组合物是可以立即用于预期目的、优选用于预期目的而不必对组合物施加任何进一步的措施的组合物，所述措施对组合物的物理特性(例如固态或液态)、化学特性(例如定量和/或定性化学组成、纯度或无菌性)以及活性和/或生物特性和活性(诸如治疗功效)具有影响或可能具有影响。在一个优选实施方案中，本发明的组合物是用于向受试者施用(优选治疗、诊断和/或诊疗应用的施用)的即用型组合物。
在制备根据本发明第一、第二和第三方面的组合物(包括其任何实施方案)的方法的一个实施方案中，获得了即用型组合物。在本发明中，这种即用型组合物是在一个或多个进一步的反应步骤诸如透析步骤和/或渗滤步骤之后获得的。然而，在一个或另一个反应步骤之后，优选在透析步骤和/或渗滤步骤之后进行的浓缩步骤之后，获得这种即用型组合物也在本发明的范围内。
在本发明中，将包含脂质组合物的脂质成分的溶液与包含mRNA的溶液在三羧酸缓冲液中混合而获得的反应混合物进行一个或多个进一步的反应步骤。优选地，这种反应步骤是透析步骤或渗滤步骤。此类进一步的反应步骤和透析步骤和/或渗滤步骤的目的是除去用于本发明组合物的脂质组合物的制备或在所述制备中使用的所有有机溶剂，除去所使用的水性缓冲液并用适合预期用途并提供合适的pH和张力的缓冲液替换所用的水性缓冲液。在本发明中，进一步的反应步骤和透析步骤、渗滤步骤或两者之后是另一个反应步骤，优选这种另一个反应步骤是浓缩步骤。这种浓缩步骤的目的优选地分别将核酸分子和mRNA的最终浓度调节到适合预期应用和用途的数值。
关于本发明，疗法和治疗也分别包括预防。据此，在一个实施方案中，治疗活性剂也是在预防疾病中有活性的试剂。在另一个实施方案中，治疗活性剂在疾病的预防中没有活性。
本发明的组合物包含阳离子脂质。本领域技术人员将认识到，所述脂质中存在的任何一个或多个NH或NH2基团优选以质子化形式存在。典型地，所述脂质的任何正电荷被阴离子的存在所补偿。这种阴离子可以是单价或多价阴离子。优选的阴离子是卤化物、乙酸根和三氟乙酸根。本文使用的卤化物优选为氯化物、氟化物、碘化物和溴化物。最优选的是氯化物。当阳离子脂质与待转移到细胞中的治疗活性或药物活性或生物活性化合物缔合时，卤素阴离子被所述活性化合物取代，所述活性化合物优选显示一个或几个负电荷，尽管必须承认生物活性化合物的总电荷不一定是负电荷。同样的考虑同样适用于本发明组合物的其它化合物。如果这种化合物是阴离子化合物或带有一个或几个负电荷，则这样的负电荷可以通过阳离子的存在来补偿。这种阳离子可以是单价或多价阳离子。优选阳离子是铵、钠或钾。
本发明组合物的甾醇化合物可以是合成的，也可以从天然来源诸如绵羊毛或植物中获得。
本发明组合物的聚乙二醇化脂质可从商业来源诸如例如NOF Corporation,Japan；Avanti Polar Lipids,US；或Cordon Pharma,Switzerland获得。
在一个实施方案中，化合物β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺)具有下式：
Figure BDA0003790370020000311
在一个实施方案中，化合物L-精氨酰基-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺具有下式：
Figure BDA0003790370020000321
在一个实施方案中，化合物DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基氯化物)具有下式：
Figure BDA0003790370020000322
在一个实施方案中，化合物DOTMA(1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(优选为氯化物盐))具有下式：
Figure BDA0003790370020000323
在一个实施方案中，化合物DC-胆固醇(3β-[N-N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐)具有下式：
Figure BDA0003790370020000324
在一个实施方案中，化合物DPhyPE(1,2-(7R,11R)二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)具有下式：
Figure BDA0003790370020000331
在一个实施方案中，化合物DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)具有下式：
Figure BDA0003790370020000332
在一个实施方案中，化合物DLPE(1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)具有下式：
Figure BDA0003790370020000333
在一个实施方案中，化合物DMPE(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)具有下式：
Figure BDA0003790370020000334
在一个实施方案中，化合物POPE((1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)具有下式：
Figure BDA0003790370020000341
在一个实施方案中，化合物DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)具有下式：
Figure BDA0003790370020000342
在一个实施方案中，化合物胆固醇具有下式：
Figure BDA0003790370020000343
在一个实施方案中，化合物豆甾醇(豆甾醇-5,22-二烯-3-醇)具有下式：
Figure BDA0003790370020000344
在一个实施方案中，化合物mPEG-500-DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-500](优选为铵盐)具有下式：
Figure BDA0003790370020000351
在一个实施方案中，化合物mPEG-1000-DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000](优选为铵盐)具有下式：
Figure BDA0003790370020000352
在一个实施方案中，化合物mPEG-2000-DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](优选为铵盐)具有下式：
Figure BDA0003790370020000353
在一个实施方案中，化合物mPEG-5000-DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](优选为铵盐)具有下式：
Figure BDA0003790370020000354
在一个实施方案中，化合物mPEG-DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)](优选为铵盐)具有下式：
Figure BDA0003790370020000361
在一个实施方案中，化合物mPEG-2000-DPG(1,2-二棕榈酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000)具有下式：
Figure BDA0003790370020000362
在一个实施方案中，化合物mPEG-2000-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000)具有下式：
Figure BDA0003790370020000363
在一个实施方案中，化合物mPEG-2000-DLG(1,2-二月桂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000)具有下式：
Figure BDA0003790370020000364
在一个实施方案中，化合物mPEG-2000-C8-神经酰胺(N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]})具有下式：
Figure BDA0003790370020000371
在一个实施方案中，化合物mPEG-2000-C16-神经酰胺(N-棕榈酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]})具有下式：
Figure BDA0003790370020000372
在一个实施方案中，化合物mPEG-2000-C-DMA(N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰基氧代丙基-3-胺)具有下式：
Figure BDA0003790370020000373
在本发明的第一、第二和第三方面(包括其任何实施方案)的一个实施方案中，并且如本文中优选使用的，单分散组合物是其中由组合物的脂质组合物形成的颗粒显示单分散颗粒分布的组合物。在本发明第一、第二和第三方面(包括其任何实施方案)的一个实施方案中，并且如本文中优选使用的，多分散组合物是其中由组合物的脂质组合物形成的颗粒显示多分散颗粒分布的组合物。
在一个实施方案中，并且如本文中优选使用的，如果使用标准动态光散射方法，测量到多分散指数(PDI)为约0.005至约0.17，优选为约0.01至约0.10的单峰，则粒度分布是单分散的。相应的方法描述于例如Stetfeld等人(同上)和Thomas Jc等人(同上)中。在一个实施方案中，并且如本文中优选使用的，如果使用动态光散射，测量到不止一个峰和/或多分散指数(PDI)大于0.17，则粒度分布是多分散的。相应的方法描述于例如Stetfeld等人(下文)。
在一个实施方案中，由本发明组合物的脂质组合物形成的颗粒的粒度使用Zetasizer Ultra(Malvern Panalytical Ltd,Malvern,UK)通过动态光散射来测定。所有测量优选在作为分散剂的含水缓冲液中进行，该缓冲液是用10mM TRIS pH 7.4缓冲的270mM蔗糖溶液。动态光散射更详细地描述于例如Stetefeld,J.,McKenna,S.A.&Patel,T.R.“Dynamic light scattering:a practical guide and applications inbiomedical sciences”Biophys Rev 8,409–427(2016)；和Thomas,J.C.“Thedetermination of log normal particle size distributions by dynamic lightscattering”.Journal of Colloid and Interface Science 117,187–192(1987)中；所述文献的公开内容通过引用并入本文。
更具体地说，即在一个更优选的实施方案中，粒度被确定为“强度平均峰”，其通过测量和分析软件ZX Explorer(Malvern Panalytical Ltd,Malvern,UK)来计算。根据动态光散射测量的包含mRNA的本发明组合物的“强度平均峰”在(a)约30nm至约200nm，优选约40nm至约140nm，更优选约60nm至约120nm，或(b)约30nm至约100nm，优选约30nm至60nm的范围内。
在一个实施方案中，由本发明的组合物的脂质组合物形成的颗粒的ζ电势通过使用Zetasizer Ultra(Malvern Panalytical Ltd,Malvern,UK)经激光多普勒电泳来测定。所有测量优选在作为分散剂的含水缓冲液中进行，所述缓冲液是用10mM TRIS pH 7.4缓冲的270mM蔗糖溶液。例如，激光多普勒电泳更详细地描述于Clogston,J.D.&Patri,A.K.in“Characterization of Nanoparticles Intended for Drug Delivery”697,63–70(Humana Press,2011)；和Sze,A.,Erickson,D.,Ren,L.&Li,D.“Zeta-potentialmeasurement using the Smoluchowski equation and the slope of the current–timerelationship in electroosmotic flow”,Journal of Colloid and Interface Science261,402–410(2003)中，这些文献的公开内容通过引用并入本文。
更具体地，即在一个更优选的实施方案中，ζ电势被测定为“ζ平均峰”。这两个表述都是由测量和分析软件ZX Explorer(Malvern Panalytical Ltd,Malvern,UK)计算的。根据激光多普勒电泳测量，包含mRNA的本发明组合物的“ζ平均峰”在约+0mV至约+80mV的范围内，优选在约+0mV至约+45mV的范围内。
在一个实施方案中，以及如本文中优选使用的，mRNA是优选包含约200至约100.000个核苷酸，优选约750至约5000个核苷酸，更优选包含约1000至3000个核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，mRNA是单链核酸，其中其一些区段可以是多核苷酸中的一个或几个双链结构的一部分。这种双链结构通常由其核苷酸序列彼此至少部分互补的多核苷酸的两个或更多个区段形成。双链结构优选通过Watson-Crick碱基配对形成或稳定。
在又一实施方案中，mRNA在真核细胞中显示出非常基本的设计，并且通常以5’->3’方向包含帽结构、5’非翻译区(5’UTR)、通常以AUG密码子开始并与终止于终止密码子的编码序列(CDS)连接的编码序列、3’非翻译区(3’UTR)和poly-A尾。
在又一实施方案中，mRNA是可以形成二级和/或三级结构的单链分子，其中mRNA折叠回自身。
根据本发明，在一个实施方案中，mRNA是治疗活性剂。可用于治疗和/或预防疾病。原则上，施用的mRNA序列可以导致细胞产生蛋白质，这继而可以直接治疗疾病或可用作疫苗；更间接地，该蛋白质可以干扰途径中的元件，使得该途径被抑制或刺激，从而治疗或改善疾病。
在本发明的一个实施方案中，mRNA不同于以5’->3’方向包含以下序列的重组核酸构建体：
-5’UTR，
-编码效应分子的编码区，和
-3’UTR，
其中5’UTR选自编码MCP-1的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码RPL12s.c.的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码Ang-2基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码HSP70的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码H3.3的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码半乳凝集素-9的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码GADD34的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码EDN1的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码HSP70m5的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码E-选择素的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码ICAM-1的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码IL-6的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR和编码vWF的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR；
其中3’UTR选自编码vWF的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR、编码MCP-1的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR、编码RPL12s.c.的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR、编码HSP70的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR、编码H3.3的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR、编码GADD34的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR、编码EDN1的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR和编码IL-6的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR，
其中所述效应分子在恢复细胞的细胞功能方面是有效的，或者在细胞中或细胞上发挥治疗作用方面是有效的，并且
其中所述重组核酸构建体不同于编码效应分子的野生型mRNA。
在本发明的一个实施方案中，mRNA是以5’->3’方向包含以下序列的重组核酸构建体：
-5’UTR，
-编码效应分子的编码区，和
-3’UTR，
其中5’UTR选自编码MCP-1的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码RPL12s.c.的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码Ang-2基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码HSP70的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码H3.3的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码半乳凝集素-9的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码GADD34的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码EDN1的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码HSP70m5的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码E-选择素的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码ICAM-1的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR、编码IL-6的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR和编码vWF的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的5’UTR；
其中3’UTR选自编码vWF的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR、编码MCP-1的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR、编码RPL12s.c.的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR、编码HSP70的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR、编码H3.3的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR、编码GADD34的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR、编码EDN1的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR和编码IL-6的基因或其具有至少85％的核苷酸同一性的衍生物的3’UTR，
其中所述效应分子在恢复细胞的细胞功能方面是有效的或者在细胞中或细胞上发挥治疗作用方面是有效的，
其中所述效应分子是突变型效应分子，其中所述突变型效应分子是功能获得性突变型效应分子和/或超等位基因(hypermorphic)突变型效应分子，并且
其中所述重组核酸构建体不同于编码所述效应分子的野生型mRNA。
在一个实施方案中，本发明的组合物，特别是本发明的脂质组合物可以包含运载体。这种运载体优选是液体运载体。优选的液体运载体是水性运载体和非水性运载体。优选的水性运载体是水、水性盐溶液、水性缓冲系统，更优选缓冲系统和/或水性盐溶液具有生理缓冲强度和生理盐浓度。优选的非水性运载体是溶剂，优选为有机溶剂诸如乙醇、叔丁醇。不希望受任何理论的束缚，原则上可使用任何水混溶性有机溶剂。应当承认，该组合物，更特别地脂质组合物因此可以作为脂质体存在或形成脂质体；当与总体上带负电荷的化合物，优选待由本发明的脂质组合物递送的化合物、特别是mRNA和/或本发明的组合物接触时，本发明的脂质组合物和本发明的组合物形成脂复合物，即通过静电相互作用和熵效应形成的复合物，所述熵效应基于当聚阴离子诸如核酸分子与阳离子脂质或脂质系统相互作用时抗衡离子和水的释放，所述脂质系统除了其它脂质组分之外还包含至少一种阳离子脂质组分。
在另外一个实施方案中，本发明的脂质组合物和/或本发明的组合物以冻干组合物的形式存在。这样冻干的组合物允许组合物在室温下有效地长期储存。
根据本发明，药物组合物包含本发明的组合物。本发明的药物组合物包含药物活性化合物和任选地药学上可接受的运载体。这种药学上可接受的运载体可以优选选自本文结合根据本发明的组合物所定义的运载体的组。本领域技术人员将理解，原则上，本文所述的任何组合物也可用作药物组合物，只要其成分及其任意组合是药学上可接受的。药物组合物包含药学活性化合物。在一个实施方案中，这种药学活性化合物是本发明的组合物所涵盖或包含的mRNA。
在本领域技术人员的普通技能范围内，该组合物，特别是根据本发明的药物组合物可以用于各种形式的施用，由此该组合物适合于此类施用形式。
用于制备包含mRNA的本发明组合物的本发明方法依赖于将包含脂质组合物的脂质组分的溶液与包含mRNA的溶液混合，其中该混合是在线混合。混合步骤通过应用微流体混合装置来进行，并且特别地可通过使用交错的人字形混合装置、Dean涡旋分叉混合装置或微流体流体动力混合装置来进行。由于其特殊设计的微通道，这些装置允许快速、非湍流和基于扩散的混合过程。例如，交错的人字形混合器及其在制备颗粒、优选包含在本发明组合物中的颗粒中的用途描述于Zhigaltsev,I.V.等人“Bottom-Up Design and Synthesisof Limit Size Lipid Nanoparticle Systems with Aqueous and Triglyceride CoresUsing Millisecond Microfluidic Mixing”.Langmuir 28，3633–3640(2012)中，所述文献的公开内容通过引用并入本文。例如，微流体流体动力混合及其在制备颗粒、例如优选包含在本发明组合物中的颗粒中的用途描述于Krzysztoń,R.等人“Microfluidic self-assembly of folate-targeted monomolecular siRNA-lipid nanoparticles.”Nanoscale 9,7442–7453(2017)(其公开内容通过引用并入本文)中。最后，例如，Dean涡旋分叉混合及其在制备颗粒、如优选包含在本发明组合物中的颗粒中的用途描述于Chen,J.J.,Chen,C.H.&Shie,S.R.“Optimal designs of staggered dean vortexmicromixers.”Int J Mol Sci 12,3500–3524(2011)(其公开内容通过引用并入本文)中。
本发明通过以下实施例和附图来进一步说明，由所述实施例和附图可以得到本发明的其它特征、实施方案和有利方面，其中
图1表示一组四个图，其显示在总脂质与mRNA的质量比为5、7、14和28时，具有不同大小(nm)(表示为“大小(d.nm)”)(如通过多角度动态光散射(MADLS)所测定的)的脂质组合物的颗粒的大小分布(表示为“强度(百分比)”)；
图2表示一组三幅图，其显示在总脂质与mRNA的质量比为28时，各种脂质组合物的具有不同大小(nm)(表示为“大小(d.nm)”)的颗粒的大小分布(表示为“强度(百分比)”)，其中当与脂质组合物混合时，mRNA溶解在50mM乙酸盐缓冲液(图2A)、包含0.1mM EDTA的50mM乙酸盐缓冲液(图2B)或50mM柠檬酸盐缓冲液(图2C)中；通过多角度动态光散射(MADLS)测定粒度；
图3A是显示两种不同脂质组合物的具有不同大小(nm)(表示为“大小(d.nm)”)的颗粒的大小分布(表示为“强度(百分比)”)的图，其中第一脂质组合物的总脂质与mRNA的质量比为5，第二总脂质与mRNA的质量比为28；通过多角度动态光散射(MADLS)测定粒度；
图3B是显示用于图3A的两种不同组合物的颗粒数的图；
图4显示了用于评估在总脂质与mRNA的质量比分别为28和5时，尾静脉注射2mg/kg根据本发明的组合物后6小时COMP-Ang1蛋白表达的蛋白质印迹分析的结果，其中组合物的mRNA含量为0.2mg/ml；该mRNA编码COMP-Ang1或COMP不相关的红细胞生成素；CD31用作加载对照；
图5显示了编码COMP-Ang 1(SEQ ID NO:1)的mRNA序列的核苷酸序列，其中mRNA包含来自MCP-1的5’-UTR序列、MCP-1的信号序列、编码COMP-Ang1的序列和von Willebrand因子(vWF)的3’-UTR，其中COMP-Ang1是血管生成素-1(Ang1)的设计变体；
图6显示了编码人红细胞生成素(EPO)的mRNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，其中所述mRNA包含来自MCP-1的5’-UTR序列、MCP-1的信号序列、编码EPO的序列和vonWillebrand因子(vW)的3’-UTR；
图7显示了Cleancap EGFP-mRNA(可从Trilink Biotechnologies,USA获得)的开放阅读框的核苷酸序列；和
图8显示了指示本发明组合物的各种实施方案的表格，其中组合物中总脂质与总核酸分子(优选mRNA)的质量比(“制剂中mRNA的m/m比率(总脂质/mRNA)”)、组合物中核酸分子(优选mRNA)的浓度(“制剂中mRNA的浓度”)、组合物中柠檬酸的浓度(mg/ml)(制剂中柠檬酸的浓度)，以及组合物中柠檬酸的摩尔浓度(制剂中柠檬酸的摩尔浓度)；就具有指示的m/m比率、mRNA浓度和柠檬酸浓度的组合物的脂质组成而言，这种脂质组合物是本文结合根据第一、第二和第三方面的组合物公开的脂质组合物，包括其任何实施方案，优选其中脂质组合物中脂质的摩尔比为以下摩尔比的组合物：
-约35mol-％至约65mol-％的阳离子脂质，
-约35mol-％至约65mol-％的中性脂质，和
-约0.1mol-％至5mol-％的屏蔽脂质，优选为聚乙二醇化脂质，
其中总脂质含量为100％，
优选其中脂质组合物中脂质的摩尔比为以下摩尔比的组合物：
-约45mol-％至约55mol-％的阳离子脂质，
-约45mol-％至约55mol-％的中性脂质，和
-约0.5mol-％至2mol-％，
其中总脂质含量为100％；以及
更优选其中脂质组合物中脂质的摩尔比为以下摩尔比的组合物：
-50mol-％的阳离子脂质，其中阳离子脂质是β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺或L-精氨酰基-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺，
-49mol-％的中性脂质，其中所述中性脂质是二植烷酰基-PE(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，和
-1mol-％的屏蔽脂质，其中所述屏蔽脂质是mPEG-2000-DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](优选为钠盐))。
实施例1：用于通过静脉内施用的体内应用的阳离子脂质纳米颗粒(LNP)中的mRNA制剂
对于体内实验，在配制过程中用β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺作为阳离子脂质制备mRNA-LNP。或者，可将阳离子脂质L-精氨酰基-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺在相同的程序中用于制备mRNA-LNP。
将脂质以适当的摩尔比(例如50∶49∶1β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺∶DPyPE∶mPEG-2000-DSPE)溶解在乙醇中。使用微流体混合器(
Figure BDA0003790370020000461
Precision Nanosystems,Vancouver,BC)以18ml/min的流速将脂质混合物与mRNA的水溶液以2:1(水:乙醇)的体积比组合。类似地，可以使用柠檬酸盐或乙酸盐缓冲的mRNA溶液(pH 3-4)获得LNP制剂。最终总脂质与mRNA的质量比率为28。
混合过程后，使用3.5kDa MWCO Slide-A-Lyzer透析盒(Thermo FisherScientific)将制剂对10mM HEPES或TRIS缓冲的等渗蔗糖溶液透析。将漂浮透析盒中的制剂在室温下透析2小时，同时轻轻搅拌透析缓冲液；更换透析缓冲液，并在室温下再透析2小时。再次更换透析缓冲液，并在4℃透析过夜。在透析程序的过程中，总共使用至少300倍样品体积的透析缓冲液。除了蔗糖，其它糖类如海藻糖或葡萄糖同样可以用于配制过程中。
随后，测试制剂的粒度(Zeta sizer Ultra仪(Malvern Instruments Ltd,Malvern,UK)、RNA包封(Quant-iT RiboGreen RNA测定试剂盒，遵循制造商(Thermo FisherScientific)的方案)和内毒素，发现其大小在80至120nm之间，ζ电势>0mV，显示大于90％的mRNA包封和<1EU/ml的内毒素。
将由此获得的mRNA-LNP制剂在-80℃下储存直至进一步体外或体内使用。
实施例2：小鼠研究中mRNA的肺特异性递送
将实施例1中制备的组合物作为制剂用于小鼠研究。组合物中包含的mRNA编码萤光素酶。
将制剂分别以1mg mRNA/kg体重的剂量通过大剂量尾静脉注射进行静脉内施用。注射后4小时，处死小鼠，收集器官(例如肝、肺、脾、心、脑、肾)的组织样品。按照供应商的方案(Promega GmbH,Walldorf,Germany)，通过萤光素酶测定系统测量组织样品中的萤光素酶活性。
与脾组织、心脏组织、脑组织、肾组织和肝组织相比，萤光素酶活性在肺组织中得到显著增强。
实施例3：食蟹猴研究中mRNA的脉管系统特异性递送
将如实施例1所述制备的配制在脂质系统β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺/DPhyPE/mPEG-2000-DSPE(50mol％:49mol％:1mol％)内的编码人COMP-促血管生成素-1的mRNA(PTX_RNA)的单次静脉输注以不同剂量向食蟹猴施用(每剂量组4只猴，1小时输注)。在给药前和给药后时间点(给药前：第1天、第0天，给药后：t＝0.5h、1h、2h、4h、8h、24h、48h)采集血液样品，并等分用于药效学(PD)和细胞因子分析。
通过标准化的和商购可得的ELISA测定法或通过检测目标分泌蛋白的定制ELISA来测量这些不同时间点上的血管生成素1和血管生成素2水平。分析了相应的药效学参数。
可以在经治疗的动物的血清样品中以剂量和时间依赖的方式测量分泌的蛋白质。在输注后2小时开始表达，大约6-10小时时达到表达峰值。蛋白质的清除取决于分泌的蛋白质的血清半衰期和/或蛋白质的稳定性。
该数据表明，本发明的制剂是用于在非人灵长类动物(NHP)和人的脉管系统中进行蛋白质表达的合适的mRNA制剂。
实施例4：用于通过静脉内施用进行体内应用的阳离子脂质纳米颗粒(LNP)中的mRNA制剂的m/m比率(总脂质/mRNA)＝28
对于体内实验，在配制过程中以β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺作为阳离子脂质、以二植烷酰基-PE(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)作为共脂质以及以甲氧基PEG(2000)-DSPE作为PEG-脂质来制备mRNA-LNP。
在第一步骤中，将所有三种脂质以50mol％β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、49mol％DPyPE和1mol％mPEG-2000-DSPE的摩尔比溶解在乙醇中，产生为18.47mg/ml的总的预混合脂质浓度。同时，将mRNA(COMP-Ang1-mRNA；1273nt；SEQID NO:1)溶解在柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH 5.5)中，产生为0.33mg/ml的预混合mRNA浓度。
随后，使用微流体混合器(
Figure BDA0003790370020000481
Precision Nanosystems,Vancouver,BC)，以18ml/min的流速以1:2的体积比将预混合脂质溶液与预混合mRNA溶液混合。由于确定的脂质和mRNA溶液的预混合浓度以及混合程序过程中应用的体积比，所得mRNA-脂质纳米颗粒(LNP)制剂的特征在于总脂质与mRNA的质量比为28(m/m比率(总脂质/mRNA)＝28)等。
混合过程后，立即使用3.5kDa MWCO Slide-A-Lyzer透析盒(Thermo FisherScientific)将制剂对TRIS缓冲的等渗蔗糖溶液(10mM TRIS，9％蔗糖，pH 7.5)透析。在室温下将漂浮的透析盒中的制剂透析2小时，同时轻轻搅拌透析缓冲液；更换透析缓冲液，并在室温下再透析2小时。再次更换透析缓冲液，并在4℃透析过夜。在透析程序的过程中，总共使用至少为样品体积300倍的透析缓冲液。
按照制造商的方案(Thermo Fisher Scientific)，通过Quant-iT RiboGreen RNAAssay试剂盒定量透析程序后制剂的总mRNA浓度，并且通过用TRIS缓冲的等渗蔗糖溶液(10mM TRIS，9％蔗糖，pH 7.5)稀释来调整LNP制剂的适当终mRNA浓度(调整至0.2mg/mlmRNA)。
随后，测试制剂的粒度(Zetasizer Ultra仪(Malvern Instruments Ltd,Malvern,UK)、RNA包封和总RNA浓度(Quant-iT RiboGreen RNA Assay试剂盒，遵循制造商(Thermo Fisher Scientific)的方案)和内毒素，发现其大小在80与120nm之间，显示大于90％的mRNA包封和<1EU/ml的内毒素。
将由此获得的mRNA-LNP制剂于-80℃下储存直至进一步体外或体内使用。
实施例5：用于通过静脉内施用进行体内应用的阳离子脂质纳米颗粒(LNP)中的mRNA制剂m/m比率(脂质/mRNA)＝5
对于体内实验，在配制过程中以β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺作为阳离子脂质、以二植烷酰基-PE(1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)作为共脂质以及以甲氧基PEG(2000)-DSPE作为PEG-脂质来制备mRNA-LNP。
在第一步骤中，将所有三种脂质以50mol％β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、49mol％DPyPE和1mol％mPEG-2000-DSPE的摩尔比溶解在乙醇中，产生3.32mg/ml的总预混合脂质浓度。同时，将mRNA COMP-Ang1-mRNA；1273nt；SEQ IDNO:1)溶解在柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH 5.5)中，产生0.33mg/ml的预混合mRNA浓度。
随后，使用微流体混合器(
Figure BDA0003790370020000491
Precision Nanosystems,Vancouver,BC)，以18ml/min的流速以1:2的体积比将预混合脂质溶液与预混合mRNA溶液混合。由于确定的脂质和mRNA溶液的预混合浓度以及混合程序过程中应用的体积比，所得mRNA-LNP制剂的特征在于总脂质与mRNA的质量比为5(m/m比率(总脂质/mRNA)＝5)等。
混合过程后，立即使用3.5kDa MWCO Slide-A-Lyzer透析盒(Thermo FisherScientific)将制剂对TRIS缓冲的等渗蔗糖溶液(10mM TRIS，9％蔗糖，pH 7.5)透析。将漂浮透析盒中的制剂在室温下透析2小时，同时轻轻搅拌透析缓冲液；更换透析缓冲液，并在室温下再透析2小时。再次更换透析缓冲液，并在4℃透析过夜。在透析程序的过程中，总共使用至少300倍样品体积的透析缓冲液。
按照制造商的方案(Thermo Fisher Scientific)，通过Quant-iT RiboGreen RNAAssay试剂盒定量透析程序后制剂的总mRNA浓度，并且通过用TRIS缓冲的等渗蔗糖溶液(10mM TRIS，9％蔗糖，pH 7.5)稀释来调整LNP制剂的适当终mRNA浓度(调整至0.2mg/mlmRNA)。
随后，测试制剂的粒度(Zetasizer Ultra仪(Malvern Instruments Ltd,Malvern,UK)、并遵循制造商(Thermo Fisher Scientific)的方案测定RNA包封和总RNA浓度(Quant-iT RiboGreen RNA Assay试剂盒)，以及测定内毒素，发现其大小在70与100nm之间，显示大于90％的mRNA包封和<1EU/ml的内毒素。
将由此获得的mRNA-LNP制剂于-80℃下储存直至进一步体外或体内使用。
实施例6：使用基于柠檬酸裂合酶的酶反应定量阳离子脂质纳米颗粒(LNP)中的柠檬酸。
为了定量如实施例4中所述产生的mRNA-脂质纳米颗粒中的柠檬酸含量，按照制造商的操作说明使用来自Megazyme的基于柠檬酸盐-裂解酶的酶试剂盒(K-CITR；Megazyme,Ireland)。因此，将实施例4中制备的50μl LNP样品(0.2mg/ml COMP-Ang1-mRNA)稀释在950μl 2％Triton X 100水溶液中以破坏纳米颗粒。随后，将250μl缓冲液(试剂盒中提供的)、100μl NADH溶液以及试剂盒中提供的L苹果酸脱氢酶和D乳酸脱氢酶的混合物10μl加入到稀释的样品中。5min后，相对于水空白样品，在340nm处读取由此获得的混合物的光密度。此后，将试剂盒中提供的10μl柠檬酸裂解酶加入混合物中，5分钟后再次读取OD340nm。将两次测量的吸光度差值使用以下公式计算样品中的柠檬酸含量：
Figure BDA0003790370020000501
其中V为最终体积(1.37ml)，MW为柠檬酸的分子量(192.1g/mol)，ε为NADH在340nm处的消光系数(6300L*mol-1*cm-1)，d为光路(1cm)，v为样品体积(50μl)，ΔA为测得的吸光度差值(ΔOD(340)＝1.065)。利用这种计算，测得柠檬酸含量约为4.6μmol/ml(0.88mg/ml)。
实施例7：尾静脉i.v.注射包含编码COMP-Ang1或促红细胞生成素的mRNA的阳离子LNP(m/m＝28和m/m＝5)后，COMP-Ang1和促红细胞生成素的体内蛋白质表达。
如实施例4和实施5中所述，以28的m/m比率(高颗粒浓度)和5的m/m比率(低颗粒浓度)(m/m＝总脂质质量/mRNA质量)制备包含编码COMP-Ang1蛋白[SEQ ID No:1]或人促红细胞生成素[SEQ ID NO:2]的mRNA的LNP。将LNP在-80℃下储存，直至进一步使用。随后，对8-10周龄的雄性小鼠(品系C57Bl/6)尾静脉注射制备的LNP制剂300μl/小鼠(相当于2mg/kgmRNA)。注射后6小时处死动物，并立即速冻经处理的动物的肺组织样品。对于蛋白质免疫印迹分析，使用50Hz的珠磨机(TissueLyser LT,Qiagen,Germany)在T-PER组织蛋白提取试剂(20μl/mg组织)((Thermo Scientific,USA)中匀浆20-80mg冷冻肺组织样品。
随后使用SDS-PAGE(4-12％凝胶)分离肺组织蛋白质裂解物，并使用抗Ang1抗体(重组抗血管生成素1抗体[EPR2888(N)](ab183701)，Abcam,Cambridge,UK)和抗CD31抗体(CD31(PECAM-1)(D8V9E)
Figure BDA0003790370020000511
兔mAb#77699；Cell Signaling Technologies,Danvers,MA,USA)作为加载对照，通过免疫印迹分析评估蛋白质水平。结果如图4所示。尾静脉注射LNP制剂后6小时，对于m/m为28的LNP，在肺组织样品中可检测到非常强的COMP-Ang1蛋白表达，而m/m为5的LNP未显示任何COMP-Ang1表达。
实施例8：总脂质/mRNA的质量比率对脂质组合物粒度分布的影响
为了评估质量比率[总脂质/mRNA]的影响，在配制过程中以β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺作为阳离子脂质、以二植烷酰基-PE(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)作为共脂质以及以甲氧基PEG(2000)-DSPE作为PEG-脂质来制备mRNA-LNP。
在第一步骤中，将所有三种脂质以50mol％β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺、49mol％DPyPE和1mol％mPEG-2000-DSPE的摩尔比溶解在乙醇中，得到总脂质浓度为0.5mg/ml、0.7mg/ml、1.4mg/ml和2.8mg/ml的4种不同的预混合脂质溶液。同时，将mRNA(CleanCap EGFP,Trilink Biotechnologies,San Diego,CA,USA,SEQID NO:3)溶解在水中，得到0.15mg/ml的预混合mRNA浓度。
随后，使用微流体混合器(
Figure BDA0003790370020000521
Precision Nanosystems,Vancouver,BC)，以18ml/min的流速，以1:2的体积比将所有4种预混合脂质溶液与预混合mRNA溶液混合。由于确定的脂质和mRNA溶液的预混合浓度以及混合程序过程中应用的体积比，所得mRNA-LNP制剂的特征在于总脂质与mRNA的质量比为5、7、14和28等。
混合过程后，立即使用3.5kDa MWCO Slide-A-Lyzer透析盒(Thermo FisherScientific)将制剂对TRIS缓冲的等渗蔗糖溶液(10mM TRIS，9％蔗糖，pH 7.5)透析。在室温下将漂浮的透析盒中的制剂透析2小时，同时轻轻搅拌透析缓冲液；更换透析缓冲液，并在室温下再透析2小时。再次更换透析缓冲液，并在4℃透析过夜。在透析程序的过程中，必须使用总量至少为样品体积的300倍的透析缓冲液。这种脂质组合物形成被称为脂质纳米颗粒(LNP)的颗粒。
使用该脂质组合物实现了总脂质与mRNA的各种质量比率，并通过多角度动态光散射(MADLS)进行测定。质量比率m/m为5、7、14和28。
结果如图1所示。从图1可以看出，如通过多角度动态光散射(MADLS)所测量的，m/m比率＝5时为单分散颗粒分布，更大的m/m比率7、14、28时变成多分散分布。这些变化的原因似乎在于越来越多的不含核酸(mRNA)的“空”异质脂质聚集体。
在进一步的实验中，总脂质与mRNA的质量比率为28，将mRNA溶解在(a)50mM乙酸盐缓冲液、(b)含有0.1mM EDTA的50mM乙酸盐缓冲液或(c)50mM柠檬酸盐缓冲液中以用于制备LNP的方法。使用多角度动态光散射(MADLS)来测定粒度。
结果如图2A、图2B和图2C所示。
如果将mRNA在微流体混合步骤中与脂质的有机溶液一起溶解在50mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝5.5)中，得到的粒度分布保持强烈的单分散性，即使对于28的总脂质/mRNA的高m/m比率亦如此。用其它有机酸缓冲液例如乙酸盐缓冲液不能达到这种效果。另外，这种作用仅限于使用多价阳离子脂质，诸如β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺。
对如此制备的LNP的进一步表征显示，柠檬酸盐被稳定地截留在LNP中，并且在针对用于去除脂质的有机溶剂的10mM TRIS/9％蔗糖的透析步骤(MW截断值3.5kDa)中不可去除。可如实施例6中所述，使用基于柠檬酸裂解酶的酶试剂盒(K-CITR；Megazyme,Ireland)在最终的经透析的LNP中进一步定量截留的柠檬酸盐的量。
如图3所示，本发明人还发现，与总脂质/mRNA的m/m比率为5相比，通过使用总脂质/mRNA m/m比率28，获得了>10倍的更大的高度单分散的脂质纳米颗粒数量。
说明书、权利要求书和/或实施例中公开的本发明的特征可以单独地，也可以以其任意组合成为以各种形式实现本发明的材料。
序列表
<110> Pantherna Therapeutics GmbH
<120> 脂质组合物及其用于将治疗活性剂递送至内皮的用途
<130> P 10049 PCT
<150> EP 20 000 065.1
<151> 2020-02-11
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1273
<212> RNA
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<223> 所有的u均为5-甲氧基-假尿苷
<400> 1
ggggaggaac cgagaggcug agacuaaccc agaaacaucc aauucucaaa cugaagcucg 60
cacucucgcc uccagcauga aggugagcgc cgcccugcug ugccugcugc ugaucgccgc 120
caccuucauc ccccagggcc uggccggcau ccuggaccug ggcccccaga ugcugcgcga 180
gcugcaggag accaacgccg cccugcagga cgugcgcgag cugcugcgcc agcaggugcg 240
cgagaucacc uuccugaaga acaccgugau ggagugcgac gccugcggcg gcagccuggu 300
gaaccugugc accaaggagg gcgugcugcu gaagggcggc aagcgcgagg aggagaagcc 360
cuuccgcgac ugcgccgacg uguaccaggc cggcuucaac aagagcggca ucuacaccau 420
cuacaucaac aacaugcccg agcccaagaa gguguucugc aacauggacg ugaacggcgg 480
cggcuggacc gugauccagc accgcgagga cggcagccug gacuuccagc gcggcuggaa 540
ggaguacaag augggcuucg gcaaccccag cggcgaguac uggcugggca acgaguucau 600
cuucgccauc accagccagc gccaguacau gcugcgcauc gagcugaugg acugggaggg 660
caaccgcgcc uacagccagu acgaccgcuu ccacaucggc aacgagaagc agaacuaccg 720
ccuguaccug aagggccaca ccggcaccgc cggcaagcag agcagccuga uccugcacgg 780
cgccgacuuc agcaccaagg acgccgacaa cgacaacugc augugcaagu gcgcccugau 840
gcugaccggc ggcugguggu ucgacgccug cggccccagc aaccugaacg gcauguucua 900
caccgccggc cagaaccacg gcaagcugaa cggcaucaag uggcacuacu ucaagggccc 960
cagcuacagc cugcgcagca ccaccaugau gauccgcccc cuggacuucu aaggcugcug 1020
cagcugcaug ggugccugcu gcugccugcc uuggccugau ggccaggcca gagugcugcc 1080
aguccucugc auguucugcu cuugugcccu ucugagccca caauaaaggc ugagcucuua 1140
ucuugcaaaa ggcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaa 1273
<210> 2
<211> 907
<212> RNA
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<223> 所有的u均为5-甲氧基-假尿苷
<400> 2
ggggaggaac cgagaggcug agacuaaccc agaaacaucc aauucucaaa cugaagcucg 60
cacucucgcc uccagcauga aagucucugc cgcccuucug ugccugcugc ucauagcagc 120
caccuucauu ccccaagggc ucgcugcccc cccccggcug aucugcgaca gccgggugcu 180
ggagcgguac cugcuggagg ccaaggaggc cgagaacauc accaccggcu gcgccgagca 240
cugcagccug aacgagaaca ucaccgugcc cgacaccaag gugaacuucu acgccuggaa 300
gcggauggag gugggccagc aggccgugga gguguggcag ggccuggccc ugcugagcga 360
ggccgugcug cggggccagg cccugcuggu gaacagcagc cagcccuggg agccccugca 420
gcugcacgug gacaaggccg ugagcggccu gcggagccug accacccugc ugcgggcccu 480
gggcgcccag aaggaggcca ucagcccccc cgacgccgcc agcgccgccc cccugcggac 540
caucaccgcc gacaccuucc ggaagcuguu ccggguguac agcaacuucc ugcggggcaa 600
gcugaagcug uacaccggcg aggccugccg gaccggcgac cggugaggcu gcugcagcug 660
caugggugcc ugcugcugcc ugccuuggcc ugauggccag gccagagugc ugccaguccu 720
cugcauguuc ugcucuugug cccuucugag cccacaauaa aggcugagcu cuuaucuugc 780
aaaaggcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaa 907
<210> 3
<211> 720
<212> RNA
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<223> 所有的u均为5-甲氧基-假尿苷
<400> 3
auggugagca agggcgagga gcuguucacc gggguggugc ccauccuggu cgagcuggac 60
ggcgacguaa acggccacaa guucagcgug uccggcgagg gcgagggcga ugccaccuac 120
ggcaagcuga cccugaaguu caucugcacc accggcaagc ugcccgugcc cuggcccacc 180
cucgugacca cccugaccua cggcgugcag ugcuucagcc gcuaccccga ccacaugaag 240
cagcacgacu ucuucaaguc cgccaugccc gaaggcuacg uccaggagcg caccaucuuc 300
uucaaggacg acggcaacua caagacccgc gccgagguga aguucgaggg cgacacccug 360
gugaaccgca ucgagcugaa gggcaucgac uucaaggagg acggcaacau ccuggggcac 420
aagcuggagu acaacuacaa cagccacaac gucuauauca uggccgacaa gcagaagaac 480
ggcaucaagg ugaacuucaa gauccgccac aacaucgagg acggcagcgu gcagcucgcc 540
gaccacuacc agcagaacac ccccaucggc gacggccccg ugcugcugcc cgacaaccac 600
uaccugagca cccaguccgc ccugagcaaa gaccccaacg agaagcgcga ucacaugguc 660
cugcuggagu ucgugaccgc cgccgggauc acucucggca uggacgagcu guacaaguaa 720

Claims (19)

1.一种包含脂质组合物、三羧酸和核酸分子，优选mRNA分子的组合物，其中所述脂质组合物包含阳离子脂质、中性脂质和屏蔽脂质，其中由所述组合物中阳离子脂质分子提供的较大量的正电荷与所述组合物中核酸分子提供的较少量负电荷相比而产生的正电荷过剩由所述三羧酸提供的电荷补偿。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是单分散组合物，优选所述组合物中所述三羧酸的量使得所述组合物是单分散组合物。
3.如权利要求1和2中任一项所述的组合物，其中所述组合物中三羧酸的量高于所述组合物为多分散组合物时所述三羧酸的浓度。
4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述制剂中总脂质的质量与所述组合物中核酸分子、优选mRNA分子的质量的比率(m/m比率(总脂质/mRNA))为10至140。
5.如权利要求4所述的组合物，其中
(a)所述m/m比率(总脂质/(核酸或mRNA))为10至20，优选为12至16，更优选为14，
(b)所述m/m比率(总脂质/(核酸或mRNA))为20至40，优选为24至32，更优选为28，
(c)所述m/m比率(总脂质/(核酸或mRNA))为40至80，优选为48至64，更优选为56，或
(d)所述m/m比率(总脂质/(核酸或mRNA))为80至140，优选为96至128，更优选为112。
6.如权利要求4和5中任一项所述的组合物，其中所述制剂中三羧酸的浓度为
(a)1.35μmol/ml至3.23μmol/ml，优选1.72μmol/ml至2.86μmol/ml；
(b)2.76μmol/ml至6.40μmol/ml，优选3.55μmol/ml至5.73μmol/ml；
(c)5.52μmol/ml至12.80μmol/ml，优选6.87μmol/ml至11.45μmol/ml；或
(d)10.98μmol/ml至25.66μmol/ml，优选13.64μmol/ml至22.90μmol/ml。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含一定量的核酸分子，优选mRNA分子，其中所述组合物的所述核酸分子、优选mRNA分子的量为约0.01mg/ml至约1.5mg/ml，优选为约0.05mg/ml至0.8mg/ml，更优选为约0.075mg/ml至约0.4mg/ml，最优选为约0.2mg/ml。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述脂质组合物形成颗粒。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述颗粒包含三羧酸，优选所述三羧酸与所述脂质组合物形成复合物，或者所述三羧酸被所述颗粒结合、结合在颗粒中或结合至颗粒上。
10.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中粒度为30nm至200nm，优选为约40nm至约140nm，甚至更优选为约60nm至120nm。
11.如权利要求10中任一项所述的组合物，其中所述三羧酸选自柠檬酸、异柠檬酸(1-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸)、顺乌头酸、反乌头酸、顺乌头酸和反乌头酸的混合物、丙烷-1,2,3-羧酸(丙三羧酸)、松蕈酸、均苯三酸及其任意混合物。
12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述脂质组合物中所述脂质的摩尔比为-约20mol-％至约80mol-％的阳离子脂质，
-约10mol-％至约70mol-％的中性脂质，和
-约0.1mol-％至约10mol-％的聚乙二醇化脂质，优选约1mol-％至约10mol-％，
其中总脂质含量为100％。
13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述脂质组合物的摩尔比为：
-50mol-％的阳离子脂质，其中阳离子脂质是β-(L-精氨酰基)-L-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺或L-精氨酰-β-丙氨酸-N-棕榈酰基-N-油酰基-酰胺，
-49mol-％的中性脂质，其中所述中性脂质是二植烷酰基-PE(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，和
-1mol-％的屏蔽脂质，其中所述屏蔽脂质是mPEG-2000-DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](优选为钠盐))。
14.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述核酸分子是mRNA分子。
15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其用于治疗和/或预防疾病的方法中，优选所述疾病选自急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、肺癌、肺转移、肺高血压和肺动脉高血压。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1至15中任一项的组合物和药物活性剂。
17.一种方法，其用于制备权利要求1至16中任一项的组合物，其中所述方法包括将包含所述脂质组合物的脂质组分的溶液与包含所述核酸分子，优选mRNA分子的溶液在三羧酸的缓冲液中混合，其中优选所述混合为在线混合。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述混合是非湍流和基于扩散的混合，优选为快速非湍流和基于扩散的混合。
19.如权利要求17至18中任一项所述的方法，其中对混合后获得的所述反应混合物进行(a)透析步骤、(b)渗滤步骤和/或(c)切向流过滤步骤，其中所述透析步骤、所述渗滤步骤和/或所述切向流过滤步骤任选地跟随有后续浓缩步骤，从而提供终反应混合物，其中所述终反应混合物是即用型组合物。
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