CN103974719A - 用于递送免疫原编码rna的聚乙二醇化脂质体 - Google Patents

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Abstract

通过递送包封在PEG化脂质体内的RNA来实现核酸免疫。所述RNA编码感兴趣的免疫原。所述PEG的平均分子量大于3kDa但小于11kDa。因此，本发明提供具有包封有水性核心的脂质双层的脂质体，其中：(i)所述脂质双层包含至少一种含聚乙二醇部分的脂质，使所述聚乙二醇呈现在脂质体的外部，其中所述聚乙二醇的平均分子量大于3kDa但小于11kDa；和(ii)所述水性核心包含编码免疫原的RNA。这些脂质体适于体内递送RNA至脊椎动物细胞，因此其可用作药物组合物的组分来免疫对象抵御不同疾病。

Description

用于递送免疫原编码RNA的聚乙二醇化脂质体
本申请要求2011年8月31日提交的美国临时申请号61/529,878的权益，其完整内容通过引用纳入本文以用于所有目的。技术领域
本发明处于免疫用RNA非病毒递送领域。
背景技术
用于免疫动物的核酸递送是多年来的目标。已经测试过多种方法，包括采用DNA或RNA、病毒或非病毒递送载剂(或甚至无递送载剂，以“裸”疫苗形式递送)、复制或非复制载体，或者病毒或非病毒载体。
仍需要更多且改善的核酸疫苗，并且，尤其需要改进的核酸疫苗递送方式。
发明内容
根据本发明，通过递送包封在脂质体内的RNA来实现核酸免疫。所述RNA编码感兴趣的免疫原。所述脂质体包括PEG化的脂质，即所述脂质通过共价结合聚乙二醇来修饰。PEG为脂质体提供可赋予有利药代动力学的包被，例如，其能增加稳定性且防止所述脂质体的非特异性吸附。发明人发现，PEG的长度能影响经包封RNA的体内表达，因此本发明采用所含PEG平均分子量大于3kDa但小于11kDa的脂质体。分子量低于1kDa(例如，500或750Da)的PEG不形成稳定脂质体，而由1～3kDa的PEG形成的脂质体在免疫原性实验中显示较低功效(见下文)。因此，本发明提供一种脂质体，所述脂质体中包封编码感兴趣免疫原的RNA，其中，所述脂质体包含至少一种含聚乙二醇部分的脂质，使所述聚乙二醇存在于脂质体的外部，其中所述聚乙二醇的平均分子量大于3kDa但小于11kDa。这些脂质体适于体内递送RNA至脊椎动物细胞，因此其可用作药物组合物的组分来免疫对象抵御不同疾病。
本发明还提供制备含RNA的脂质体的方法，所述方法包括使RNA与一种或多种脂质混合的步骤，该步骤的条件使所述脂质形成内部包封有RNA的脂质体，其中至少一种脂质包括聚乙二醇部分，该聚乙二醇部分在该方法过程中定位于所述脂质体的外部，并且其中所述聚乙二醇的平均分子量大于3kDa但小于11kDa。
脂质体
本发明使用内部包封有免疫原编码RNA的脂质体。因此，所述RNA(正如在天然病毒中)与任何外部介质相分离。已发现所述脂质体内的包封保护RNA免于RNA酶消化。所述脂质体可包含一些外部RNA(例如，在其表面上)，但在脂质体核心中包封至少一半的RNA(理想上为全部)。脂质体内的包封不同于，例如，参考文献1中公开的脂质/RNA复合物，其RNA是与预先形成的脂质体混合的。
各种两亲性脂质能在水环境下形成双层以包封含RNA的水核心，形成脂质体。这些脂质可具有阴离子、阳离子或两性离子亲水头部基团。从阴离子磷脂形成脂质体可追溯到上世纪六十年代，而形成阳离子脂质体的脂质从上世纪九十年代就已有研究。一些磷脂是阴离子型的，但是也有其它两性离子型的和其它阳离子型的。合适的磷脂类型包括但不限于：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油，一些有用的磷脂列于表1。有用的阳离子脂质包括但不限于：二油酰-三甲胺丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油氧基-N,N二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)，其它可用的阳离子脂质公开于参考文献2和3。两性离子脂质包括但不限于：酰基两性离子脂质和醚基两性离子脂质。可用的两性离子脂质的示例有DPPC、DSPC、DOPC、十二烷基磷酸胆碱、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸酰乙醇胺(DOPE)和1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸酰乙醇胺(DPyPE)。所述脂质可以是饱和或不饱和脂质。优选采用至少一种不饱和脂质来制备脂质体。若不饱和脂质有两个尾部，则这两个尾部都可以是不饱和的，或其可具有一个饱和尾部和一个不饱和尾部。脂质可在一个尾部包含类固醇基团，例如，正如RV05中。因此，在一个实施方式中，本发明提供具有包封有水性核心的脂质双层的脂质体，其中：(i)所述脂质双层包含至少一种含聚乙二醇部分的脂质，使聚乙二醇存在于所述脂质体的外部，其中所述聚乙二醇的平均分子量大于3kDa但小于11kDa；和(ii)所述水性核心包含编码免疫原的RNA。本发明的脂质体可由单一脂质或脂质混合物形成。混合物可包括(i)阴离子脂质混合物(ii)阳离子脂质混合物(iii)两性离子脂质混合物(iv)阴离子脂质和阳离子脂质混合物(v)阴离子脂质和两性离子脂质混合物(vi)两性离子脂质和阳离子脂质混合物或(vii)阴离子脂质、阳离子脂质和两性离子脂质混合物。类似地，混合物可包含饱和脂质和不饱和脂质。例如，混合物可包含DSPC(两性离子、饱和)、DlinDMA(阳离子、不饱和)和/或DMG(阴离子、饱和)。采用脂质混合物时，并非混合物中的所有脂质成分都需要是两亲性的，例如可使一种或多种两亲性脂质与胆固醇混合。
当由脂质混合物形成本发明脂质体时，优选本文所述那些PEG化脂质的部分低于脂质总量的10％，例如，0.5～5％，1～4％或约2％。例如，下文显示有用的脂质体，其中总脂质的2％是PEG-DMG。剩余部分可由，例如，胆固醇(例如，35～50％胆固醇)和/或阳离子脂质(例如，30～70％)和/或DSPC(例如，5～15％)组成。该混合物在下文使用。这些百分比值是摩尔百分比。
因此，脂质体可由阳离子脂质(例如，DlinDMA，RV05)、两性离子脂质(例如，DSPC，DPyPE)、胆固醇和PEG化的脂质形成。实施例中采用DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和胆固醇的混合物，以及若干其它混合物。
所述脂质体中至少一种脂质包含聚乙二醇部分。包含这些PEG化脂质的脂质体将具有PEG定向至少存在于所述脂质体的外部(但也可有一些PEG暴露至所述脂质体的内部，即，至所述水性核心)。该定向可通过使PEG连接至脂质的合适部分来实现。例如，在两亲性脂质中，可将PEG连接至亲水头部，因为该头部使其自身定向至所述脂质双层的面向水性的外部。这种方式的PEG化可通过使PEG共价连接至脂质来实现，例如，采用例如参考文献4和5中公开的那些技术。
因此，所述PEG化的脂质将包含如下PEG结构：
其中，n使PEG的分子量大于3kDa但小于11kDa，例如，就5kDa的PEG化而言，n是69或更大，或者70～240，或者约113。
所述PEG部分可以–O-甲基基团终止，因此PEG化的脂质可包含：
包括与脂质头部基团中的氮的连接，因此，可用于本发明的PEG化的脂质可包括：
用于本发明的一种合适的PEG化的脂质是PEG-DMG，其如实施例中所用。可采用其它PEG化的脂质，例如，式(X)的脂质：
其中：
Z是选自PEG和基于以下物质的聚合物的亲水性头部基团组分：聚(噁唑啉)、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]和聚(氨基酸)，其中，所述聚合物可以是直链或支链聚合物，并且其中所述聚合物可以任选地被取代；Z由n个亚单元聚合；
n是数平均聚合度，其为10～200个Z单元(并且可针对不同Z基团进行优化)。
L1是任选被取代的C1-10亚烷基或C1-10杂亚烷基接头，包括醚(例如，-O-)、酯(例如，-C(O)O-)、琥珀酸酯(例如，-O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-))、氨基甲酸酯(例如，-OC(O)-NR'-)、碳酸酯(例如，-OC(O)O-)、脲(例如，-NRC(O)NR'-)、胺(例如，-NR'-)、酰胺(例如，-C(O)NR'-)、亚胺(例如，-C(NR')-)、硫醚(例如，-S-)、黄原酸酯(例如，-OC(S)S-)和磷酸二酯(例如，-OP(O)2O-)中的零种、一种或两种，其中R'独立地选自-H、–NH-、-NH2、-O-、-S-、磷酸酯或任选被取代的C1-10亚烷基；
X1和X2独立地选自碳或选自–NH-、-O-、-S-或磷酸酯的杂原子；A1和A2独立地选自C6-30烷基、C6-30烯基和C6-30炔基，其中A1和A2可以相同或不同，或者A1和A2与其连接的碳原子一同形成任选被取代的类固醇。本发明的脂质体通常将包含大量的PEG部分，其可以相同或不同。本发明脂质体中的PEG的平均分子量大于3kDa但小于11kDa，例如，3.5～9kDa、4～7.5kDa、4.5～6kDa、4.8～5.5kDa或5kDa。因此，该PEG可以是通常称为“PEG5000”或“PEG5k”的PEG。在一些实施方式中，本发明不涵盖连接有PEG且其中所含的PEG平均分子量为8kDa的脂质；在一些实施方式中，本发明不涵盖连接有PEG且其中所含的PEG平均分子量为7.9～8.1kDa的脂质。
所述PEG通常包含直链聚合物链，但在一些实施方式中，所述PEG可包含支链聚合物链。
在一些实施方式中，PEG可以是经取代的PEG，例如其中所述聚合物的一个或多个碳原子被烷基、烷氧基、酰基或芳基基团中的一种或多种取代。
在一些实施方式中，PEG可包括共聚物基团，例如，一个或多个丙烯单体，以形成PEG聚丙烯聚合物。
作为PEG化的替代，脂质可通过共价连接不同于PEG的部分来修饰。例如，在一些实施方式中，脂质可包括聚磷腈。在一些实施方式中，脂质可包括聚(乙烯基吡咯烷酮)。在一些实施方式中，脂质可包括聚(丙烯酰胺)。在一些实施方式中，脂质可包括聚(2-甲基-2-噁唑啉)。在一些实施方式中，脂质可包括聚(2-乙基-2-噁唑啉)。在一些实施方式中，脂质可包括磷脂酰聚甘油。在一些实施方式中，脂质可包括聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]。在一些实施方式中，脂质可包括非PEG的聚烷撑醚聚合物。
脂质体通常分为3组：多层囊泡(MLV)；小单层囊泡(SUV)；和大单层囊泡(LUV)。MLV的各囊泡中具有多个双层，形成数个分开的水隔室。SUV和LUV具有包封水核心的单一双层；SUV通常直径≤50nm，且LUV直径>50nm。本发明的脂质体理想上是直径为60～180nm并优选为80～160nm的LUV。
本发明的脂质体可以是组合物的部分，所述组合物包含多种脂质体，并且所述多种脂质体中的脂质体的直径在一定范围内。就包含直径不同的脂质体群的组合物而言：(i)数量上至少80％的脂质体的直径应是60～180nm且优选地是80～160nm，和/或(ii)所述群的平均直径(通过强度，例如Z均值)理想上是60～180nm且优选地是80～160nm。理想上，所述多种脂质体中直径的多分散指数应<0.2。参考文献1中的脂质体/RNA复合物的预期直径是600～800nm并且多分散性高。
用于制备合适脂质体的技术是本领域熟知的，例如，参见参考文献6～8。参考文献9中描述了一种有用的方法，该方法涉及使(i)脂质的乙醇溶液(ii)核酸的水性溶液和(iii)缓冲液混合，然后混合、平衡、稀释并纯化。本发明脂质体优选可通过该混合方法获得。
为了获得具有所需直径的脂质体，可采用如下方法进行混合：使RNA水性溶液的两股进料流与一股乙醇脂质溶液在单一混合区域中混合，全部以相同流速进行，例如，在下文描述的微流体通道中进行。
RNA
本发明的脂质体包括编码免疫原的RNA分子(不同于siRNA，如参考文献4中所述)。在体内给予所述颗粒之后，RNA从所述颗粒释放并在细胞中翻译以原位提供免疫原。
该RNA为+-链，因而其无需任何干预性的复制步骤(例如逆转录)即可由细胞翻译。其还可结合至免疫细胞表达的TLR7受体，由此启动佐剂效应。
优选的+-链RNA是自复制RNA。自复制RNA分子(复制子)即使在无任何蛋白质的情况下递送至脊椎动物细胞时，能通过从其自身(通过从其自身产生的反义拷贝)转录而导致多种子RNA生成。因此，自复制RNA分子通常是+-链分子，其可在递送至细胞之后直接翻译，而该翻译提供RNA依赖性的RNA聚合酶，该酶随后从所述经递送的RNA产生反义转录本和正义转录本。因此，所递送的RNA导致多种子RNA的生成。这些子RNA以及共线的亚基因组转录本可进行自身翻译以提供所编码免疫原的原位表达，或可经转录以提供更多与所递送RNA同义的转录本，其经翻译以提供免疫原的原位表达。该序列转录的总体结果是引入的复制子RNA在数量上的大幅扩增，因此所编码的免疫原成为该细胞的主要多肽产物。
实现自复制的一种合适系统是使用基于α病毒的RNA复制子。这些+-链复制子在递送至细胞之后翻译以得到复制酶(或复制酶-转录酶)。所述复制酶翻译成多聚蛋白，其自动切割产生复制复合物，该复制复合物生成所述+-链经递送RNA的基因组–-链拷贝。这些–-链转录本可自身转录以产生所述+-链亲本RNA的更多拷贝，并且也产生编码所述免疫原的亚基因组转录本。因此，所述亚基因组转录本的翻译导致受感染细胞原位表达免疫原。合适的α病毒复制子可采用来自辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。可采用突变体或野生型病毒序列，例如，已用于复制子的VEEV减毒TC83突变体[10]。
因此，优选的自复制RNA分子编码(i)可从所述自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)免疫原。所述聚合酶可以是α病毒复制酶，例如包括α病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4中的一种或多种。
虽然天然α病毒基因组除编码非结构复制酶多聚蛋白以外还编码结构病毒体蛋白，但是优选本发明的自复制RNA分子不编码α病毒结构蛋白。因此，优选的自复制RNA可导致细胞中产生其自身的基因组RNA拷贝，但不产生含RNA的病毒体。无法生成这些病毒体说明不同于野生型α病毒，自复制RNA分子自身不能以感染形式永存。本发明的自复制RNA中缺失野生型病毒永存所必需的α病毒结构蛋白，并且其位置由编码感兴趣免疫原的一种或多种基因占据，从而亚基因组转录本编码所述免疫原而非所述结构α病毒病毒体蛋白。
因此，本发明可用的自复制RNA分子可具有两个开放阅读框。第一(5')开放阅读框编码复制酶；第二(3')开放阅读框编码免疫原。在一些实施方式中，所述RNA可具有额外的(例如，下游)开放阅读框用于例如编码其它免疫原(见下文)或编码辅助多肽。
自复制RNA分子可具有与所编码复制酶相适应的5'序列。
自复制RNA分子可具有各种长度，但其通常长5000～25000个核苷酸，如8000～15000个核苷酸或9000～12000个核苷酸。因此，该RNA比siRNA递送中所见的要长。
本发明可用的RNA分子可具有5'帽(例如7-甲基鸟甘)。该帽可增强所述RNA的体内翻译。
本发明可用的RNA分子的5'核苷酸可具有5'三磷酸基团。在加帽的RNA中，其可通过5'-至-5'桥连接至7-甲基鸟苷。5'三磷酸可增强RIG-I结合并因而促进佐剂效应。
RNA分子可具有3'聚A尾。其还可在其3'末端附近包括聚A聚合酶识别序列(如AAUAAA)。
本发明可用的RNA分子通常为单链。单链RNA一般能结合至TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR，起始佐剂效应。以双链形式递送的RNA(dsRNA)可结合至TLR3，并且该受体还可被单链RNA复制过程中形成或在单链RNA的二级结构中形成的dsRNA触发。
本发明可用的RNA分子可通过体外转录(IVT)来方便地制备。IVT可使用细菌中以质粒形式产生和增殖，或合成(例如通过基因合成和/或聚合酶链式反应(PCR)工程方法)产生的(cDNA)模板。例如，可采用DNA依赖性RNA聚合酶(例如噬菌体T7、T3或SP6RNA聚合酶)来从DNA模板转录RNA。可按需采用合适的加帽和聚A加成反应(尽管所述复制子的聚A通常在DNA模板内编码)。这些RNA聚合酶可对转录的5'核苷酸有严格的要求，且在一些实施方式中这些要求必须与所编码复制酶的要求匹配，以确保IVT-转录的RNA能有效作为其自身编码复制酶的底物发挥作用。
如参考文献11中所述，自复制RNA可包括(在任何5'帽结构以外)具有经修饰核碱基的一个或多个核苷酸。例如，自复制RNA可包括一种或多种经修饰的嘧啶核碱基，例如假尿苷和/或5-甲基胞苷残基。然而，在一些实施方式中，所述RNA包含未经修饰的核碱基，并可包含未经修饰的核苷酸，即，所述RNA中所有核苷酸都是标准的A、C、G和U核糖核苷酸(除了任何5'帽结构，其可包含7'-甲基鸟苷)。在其它实施方式中，所述RNA可包括含7-甲基鸟苷的5'帽，并且起始1、2或3个5'个核糖核苷酸可在核糖的2'位置被甲基化。
本发明所用的RNA理想上仅包括核苷之间的磷酸二酯连接，但在一些实施方式中，其可包含氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或甲基磷酸酯连接。
理想上，脂质体包含少于10种不同种类的RNA，例如5、4、3或2种不同种类的RNA，最优选脂质体包含单一的RNA种类，即所述脂质体中所有的RNA分子都具有相同序列和相同长度。
各脂质体的RNA量可变化。各脂质体中的个体自复制RNA分子数目通常<50，例如各脂质体中<20、<10、<5或1～4。
免疫原
本发明所用的RNA分子编码多肽免疫原。给予脂质体后，所述RNA在体内翻译，随后该免疫原可引发受体中的免疫应答。该免疫原可引发针对细菌、病毒、真菌或寄生虫(或者在一些实施方式中针对变应原；并且在其它实施方式中针对肿瘤抗原)的免疫应答。所述免疫应答可包括抗体应答(通常包括IgG)和/或细胞介导的免疫应答。所述多肽免疫原通常会引发免疫应答，所述免疫应答识别对应的细菌、病毒、真菌或寄生虫(或变应原或肿瘤)多肽，但在一些实施方式中，所述多肽可作为模拟表位来引起识别细菌、病毒、真菌或寄生虫糖类的免疫应答。所述免疫原通常是表面多肽，例如粘附素、血凝素、包膜糖蛋白、突起糖蛋白等。
所述RNA分子可编码单一多肽免疫原或多种多肽。多种免疫原可作为单一多肽免疫原(融合多肽)或多个单独多肽的形式存在。如果免疫原自一个复制子表达为的多个单独多肽，那么这些多肽中的一个或多个可具有上游IRES或其它病毒启动子元件。或者，多种免疫原可表达自多聚蛋白，其编码多种个体免疫原融合至短自催化蛋白酶(例如，口蹄疫病毒2A蛋白)融合的的，或作为内含肽。
与参考文献1和12不同，所述RNA编码免疫原。为避免疑问，本发明不涵盖编码萤火虫荧光素酶的RNA或编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶的融合蛋白的RNA或编码绿色荧光蛋白(GFP)的RNA。此类多肽可作为标志物使用，或甚至可用于基因治疗方面，但本发明涉及用于引发免疫学应答系统的RNA递送。因此，所述免疫原也不是递送以补充或替代缺陷型宿主蛋白的自身蛋白(selfprotein)(如在基因治疗中)。并且，所述RNA不是全小鼠胸腺RNA。
在一些实施方式中，所述免疫原引发针对下列细菌之一的免疫应答：
脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)：有用的免疫原包括但不限于：膜蛋白，例如粘附素、自动转运蛋白(autotransporter)、毒素、铁获取蛋白(ironacquisition protein)和H因子结合蛋白。三种有用多肽的组合公开于参考文献13中。
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)：有用的多肽免疫原公开于参考文献14中。其包括但不限于RrgB菌毛亚基、β-N-乙酰-己糖胺酶前体(spr0057)、spr0096、一般应激蛋白GSP-781(spr2021、SP2216)、丝氨酸/苏氨酸激酶StkP(SP1732)和肺炎球菌表面粘附素PsaA。
酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)：有用的免疫原包括但不限于：参考文献15和16中公开的多肽。
粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)：
百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)：有用的百日咳免疫原包括但不限于：百日咳毒素或类毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)、百日咳菌粘附素和凝集原2和3。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：有用的免疫原包括但不限于：参考文献17中公开的多肽，例如溶血素、esxA、esxB、铁色素结合蛋白(sta006)和/或sta011脂蛋白。
破伤风梭菌(Clostridium tetani)：典型的免疫原是破伤风类毒素。
白喉棒状杆菌(Cornynebacterium diphtheriae)：典型的免疫原是白喉类毒素。
流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)：有用的免疫原包括但不限于：参考文献18和19中公开的多肽。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)：有用的免疫原包括但不限于：参考文献15中公开的多肽。
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)：有用的免疫原包括但不限于：PepA、LcrE、ArtJ、DnaK、CT398、OmpH-样、L7/L12、OmcA、AtoS、CT547、Eno、HtrA和MurG(例如参考文献20中公开的那些)。LcrE[21]和HtrA[22]是两种优选的免疫原。
肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)：有用的免疫原包括但不限于：参考文献23中公开的多肽。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)：有用的免疫原包括但不限于CagA、VacA、NAP和/或脲酶[24]。
大肠杆菌(Escherichia coli)：有用的免疫原包括但不限于源自以下大肠杆菌的免疫原：肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAggEC)、弥散粘附性大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)。ExPEC株包括尿致病性大肠杆菌(UPEC)和脑膜炎/败血症相关的大肠杆菌(MNEC)。有用的UPEC多肽免疫原在参考文献25和26中公开。有用的MNEC免疫原在参考文献27中公开。对几种大肠杆菌类型的有用免疫原是AcfD[28]。
炭疽杆菌(Bacillus anthracis)
鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)：有用的免疫原包括但不限于：参考文献29和30中公开的那些。
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或肉毒梭菌(Clostridium botulinums)
嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)
伯内特科克斯立克次体(Coxiella burnetti)
布鲁氏菌(Brucella)例如流产布鲁氏菌(B.abortus)、犬氏布鲁氏菌(B.canis)、羊布鲁氏菌(B.melitensis)、沙林鼠布鲁氏菌(B.neotomae)、绵羊布鲁氏菌(B.ovis)、猪布鲁氏菌(B.suis)、鳍脚类布鲁氏菌(B.pinnipediae)。
弗朗西斯氏菌(Francisella)，例如新凶手弗朗西斯氏菌(F.novicida)、蜃楼弗朗西斯氏菌(F.philomiragia)、土拉热弗朗西斯氏菌(F.tularensi)。
淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)
苍白密螺旋体(Treponema pallidum)
杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)
腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)
小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitic)
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
立克次体(Rickettsia)
单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)
鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhi)
布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)
牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)
克雷伯菌(Klebsiella)
在一些实施方式中，所述免疫原引发针对下列病毒之一的免疫应答：
正粘病毒(Orthomyxovirus)：有用的免疫原可来自甲型、乙型或丙型流感病毒，例如血凝素、神经氨酸酶或基质M2蛋白。免疫原为甲型流感病毒血凝素时，其可来自任何亚型，例如来自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。
副粘病毒(Paramyxoviridae)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自肺炎病毒(Pneumovirus)(例如，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)，RSV)、腮腺炎病毒(Rubulaviruses)(例如，流行性腮腺炎病毒(mumps virus))、副粘病毒(Paramyxoviruses)(例如，副流感病毒(parainfluenza virus))、偏肺病毒(Metapneumoviruses)和麻疹病毒(Morbilliviruses)(例如，麻疹病毒(measles virus))的那些。
痘病毒(Poxviridae)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自正痘病毒(Orthopoxvirus)如天花(Variola vera)的那些，该天花包括但不限于重型天花(Variola major)和轻型天花(Variola minor)。
小核糖核酸病毒(Picornavirus)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自小核糖核酸病毒，如肠道病毒(Enterovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)、心脏病毒(Cardiovirus)和口蹄疫病毒(Aphthovirus)的那些。在一个实施方式中，所述肠道病毒是脊髓灰质炎病毒(poliovirus)，如1型、2型和/或3型脊髓灰质炎病毒。在另一个实施方式中，所述肠道病毒是EV71肠道病毒。在另一个实施方式中，所述肠道病毒是甲型或乙型柯萨奇病毒(coxsackievirus)。
布尼亚病毒(Bunyavirus)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自正布尼亚病毒(Orthobunyavirus)如加利福尼亚脑炎病毒(California encephalitis virus)、白蛉病毒(Phlebovirus)如裂谷热病毒(Rift Valley Fever virus)或内罗病毒(Nairovirus)如克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)。
嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自嗜肝RNA病毒如甲型肝炎病毒(HAV)的那些。
纤丝病毒(Filovirus):病毒免疫原包括但不限于：衍生自纤丝病毒如埃博拉病毒(Ebola virus)(包括扎伊尔(Zaire)、象牙海岸(Ivory Coast)、莱斯顿(Reston)或苏丹(Sudan)纤丝病毒)或马尔堡病毒(Marburg virus)的那些。
披膜病毒(Togavirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自披膜病毒(Togavirus)，如风疹病毒(Rubivirus)、α病毒(Alphavirus)或动脉炎病毒(Arterivirus)的那些。其包括风疹病毒(rubella virus)。
黄病毒(Flavivirus)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自黄病毒(Flavivirus)，如蜱传脑炎(TBE)病毒、登革热(1、2、3或4型)病毒、黄热病毒(Yellow Fevervirus)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、开萨诺森林病毒(KyasanurForest Virus)、西尼罗河脑炎病毒(West Nile encephalitis virus)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus)、俄国春夏脑炎病毒(St.Louis encephalitisvirus)、波瓦生脑炎病毒(Powassan encephalitis virus)的那些。
瘟病毒(Pestivirus)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自瘟病毒，如牛病毒性腹泻(BVDV)、猪瘟(CSFV)或边界病(BDV)的那些。
嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus)如乙型肝炎病毒的那些。组合物可包含乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。
其它肝炎病毒：组合物可包含来自丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或庚型肝炎病毒的免疫原。
杆状病毒(Rhabdovirus)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自杆状病毒如恐水病病毒(Lyssavirus)(如狂犬病病毒(Rabies virus))和水泡病毒(VSV)的那些。
杯状病毒(Caliciviridae)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自杯状病毒，如诺沃克病毒(Norwalk virus)(诺如病毒(Norovirus))和诺沃克样病毒，如夏威夷病毒(Hawaii Virus)和雪山病毒(Snow Mountain Virus)的那些。
冠状病毒(Coronavirus)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自SARS冠状病毒(coronavirus)、禽传染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)的那些。该冠状病毒免疫原可为突起多肽。
逆转录病毒(Retrovirus)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自肿瘤病毒(Oncovirus)、慢病毒(Lentivirus)(例如HIV-1或HIV-2)或泡沫病毒(Spumavirus)。
呼肠病毒(Reovirus)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自正呼肠病毒(Orthoreovirus)、轮状病毒(Rotavirus)、环状病毒(Orbivirus)或科罗拉多蜱传热病毒(Coltivirus)的那些。
细小病毒(Parvovirus)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自细小病毒B19的那些。
疱疹病毒(Herpesvirus)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自人疱疹病毒，如仅为示例的单纯疱疹病毒(HSV)(例如1和2型HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV6)、人疱疹病毒7(HHV7)和人疱疹病毒8(HHV8)的那些。
乳头状多瘤空泡病毒(Papovaviruses)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自乳头瘤病毒(Papillomavirus)和多瘤病毒(Polyomavirus)的那些。(人)乳头瘤病毒可以是血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63或65，例如来自血清型6、11、16和/或18的一种或多种。
腺病毒(Adenovirus)：病毒免疫原包括但不限于：衍生自腺病毒血清型36(Ad-36)的那些。
在一些实施方式中，免疫原引发针对感染鱼的病毒的免疫应答，如：传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)、鲑鱼胰腺疾病病毒(SPDV)、传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、斑点叉尾鮰病毒(CCV)、鱼淋巴囊肿病毒(FLDV)、传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)、锦鲤疱疹病毒、鲑鱼小RNA样病毒(又称为大西洋鲑鱼小RNA样病毒)、陆封鲑鱼病毒(LSV)、大西洋鲑鱼轮状病毒(ASR)、鳟鱼草莓病病毒(TSD)、银鲑鱼肿瘤病毒(CSTV)、或病毒性出血性败血症病毒(VHSV)。
真菌免疫原可衍生自皮肤真菌，包括：絮状表皮霉菌(Epidermophytonfloccusum)，奥杜安氏小孢子菌(Microsporum audouini)，犬小孢子菌(Microsporum canis)，扭曲小孢子菌(Microsporum distortum)，马小孢子菌(Microsporum equinum)，石膏样小孢子菌(Microsporum gypsum)，矮小小孢子菌(Microsporum nanum)，同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum)，马毛癣菌(Trichophyton equinum)，鸡毛癣菌(Trichophyton gallinae)，石膏样毛癣菌(Trichophyton gypseum)，麦格尼毛癣菌(Trichophyton megnini)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，昆克毛癣菌(Trichophyton quinckeanum)，红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，许兰毛癣菌(Trichophyton schoenleini)，断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)，疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)，疣状毛癣菌(T.verrucosum)白变种(var.album)、盘状变种(var.discoides)、赭黄变种(var.ochraceum)，紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)和/或蜜块状毛癣菌(Trichophyton faviforme)；或来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黄曲菌(Aspergillusflavatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、头状芽裂殖菌(Blastoschizomycescapitatus)、白假丝酵母(Candida albicans)、烯醇酶假丝酵母(Candida enolase)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、克柔假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、克鲁斯假丝酵母(Candida kusei)、帕拉克斯假丝酵母(Candida parakwsei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、伪热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondi)、卡氏枝孢霉(Cladosporium carrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉(Geotrichum clavatum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、微孢子虫(Microsporidia)、脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon spp)、肠间隔微孢子虫(Septata intestinalis)和毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)；较不常见的有短粒虫属(Brachiola spp.)、微孢子虫属(Microsporidium spp.)、微孢子虫属(Nosema spp.)、皮里虫属(Pleistophora spp)、气管普孢虫属(Trachipleistophora spp.)、条孢虫属(Vittaforma spp.)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、苜蓿腐酶(Pythiumn insidiosum)、皮屑芽胞菌(Pityrosporum ovale)、酿酒酵母(Sacharomycescerevisae)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomycespombe)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiosperum)、申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)、白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、马拉色菌属(Malassezia spp.)、着色真菌属(Fonsecaea spp.)、王氏霉菌属(Wangiella spp.)、孢子丝菌属(Sporothrixspp.)、蛙粪霉属(Basidiobolus spp.)、耳霉属(Conidiobolus spp.)、根霉属(Rhizopusspp.)、毛霉属(Mucor spp.)、犁头霉属(Absidia spp.)、被孢霉属(Mortierella spp.)、小克银汉霉属(Cunninghamella spp.)、瓶霉属(Saksenaea spp.)、链格孢菌属(Alternaria spp.)、弯孢菌属(Curvularia spp.)、长蠕孢菌属(Helminthosporiumspp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Penicilliumspp.)、链核盘菌属(Monolinia spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、拟青霉属(Paecilomyces spp.)、皮司霉属(Pithomyces spp.)和枝孢属(Cladosporium spp.)。
在一些实施方式中，所述免疫原引发针对来自疟原虫(Plasmodium)属的寄生虫的免疫应答，所述寄生虫如恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)或卵圆疟原虫(P.ovale)。因此，本发明可用于针对疟疾的免疫。在一些实施方式中，该免疫原引发针对来自鱼虱科的寄生虫的免疫应答，特别是来自疮痂鱼虱属和鱼虱属的那些寄生虫，如海虱例如鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirus salmonis)或智利鱼虱(Caligus rogercresseyi)。
在一些实施方式中，所述免疫原引发针对以下物质的免疫应答：花粉变应原(树、草本、杂草和草花粉变应原)、昆虫或蜘蛛变应原(吸入、唾液和毒液变应原如螨虫变应原、蟑螂和蠓变应原、膜翅目昆虫毒液变应原)、动物毛发和皮屑变应原(来自例如狗、猫、马、大鼠、小鼠等)和食物变应原(如麸朊)。来自树、草和草本的重要花粉变应原是那些源自分类目壳斗目、木犀目、松杉目和悬铃木目的，包括但不限于白桦(桦属)，赤杨(桤木)，榛子(榛属)，鹅耳枥(鹅耳枥属)和橄榄(木犀榄属)，雪松(柳杉属和圆柏属)，法国梧桐(悬铃木)，禾本目包括黑麦属(Lolium)、猫尾属、早熟禾属、狗牙根属、鸭茅属、绒毛草属、子虉草属、黑麦属(Secale)和高粱属的草，菊目和荨麻目包括草本植物豚草属、蒿属和欧蓍草属。其它重要的吸入变应原是来自尘螨属和欧尘螨属的屋尘螨、仓储螨如害嗜鳞螨、食甜螨和食酪螨，来自蟑螂、蠓和跳蚤例如德国小蠊、大蠊、摇蚊和猫栉头蚤的那些，以及来自哺乳动物如猫、狗和马的那些，毒液变应原包括源自针昆虫或咬虫的那些如源自膜翅目的那些，包括蜜蜂(蜜蜂科(Apidae))、黄蜂(胡蜂科(Vespidea))和蚂蚁(蚁总科(Formicoidae))。
在一些实施方式中，该免疫原是选自以下的肿瘤抗原：(a)睾丸癌抗原如NY-ESO-1、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族多肽，如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12(例如，可用于检测黑色素瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、NSCLC瘤、乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤和膀胱肿瘤)，(b)突变抗原，例如p53(与各种实体瘤如结直肠癌、肺癌、头颈癌有关)、p21/Ras(例如，与黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌有关)、CDK4(例如，与黑色素瘤有关)、MUM1(例如，与黑色素瘤有关)、胱冬酶-8(例如，与头颈癌有关)、CIA0205(例如，与膀胱癌有关)、HLA-A2-R1701、β联蛋白(例如，与黑色素瘤有关)、TCR(例如，与T-细胞非霍奇金淋巴瘤有关)、BCR-abl(例如，与慢性髓细胞性白血病有关)、磷酸丙糖异构酶、KIA0205、CDC-27和LDLR-FUT，(c)过量表达抗原，例如半乳糖凝集素4(例如，与结直肠癌有关)、半乳糖凝集素9(例如，与霍奇金病有关)、蛋白酶3(例如，与慢性髓细胞性白血病有关)、WT1(例如，与多种白血病有关)、碳酸酐酶(例如，与肾癌有关)、醛缩酶A(例如，与肺癌有关)、PRAME(例如，与黑色素瘤有关)、HER-2/neu(例如，与乳腺癌、结肠癌、肺癌与卵巢癌有关)、乳腺珠蛋白(mammaglobin)、甲胎蛋白(例如，与肝细胞癌有关)、KSA(例如，与结直肠癌有关)、胃泌素(例如，与胰腺癌和胃癌有关)、端粒酶催化蛋白、MUC-1(例如，与乳腺癌和卵巢癌有关)、G-250(例如，与肾细胞癌有关)、p53(例如，与乳腺癌和结肠癌有关)和癌胚抗原(例如，与乳腺癌、肺癌和胃肠道癌如结直肠癌有关)，(d)共有抗原，例如黑色素瘤-黑素细胞分化抗原如MART-1/Melan A、gp100、MC1R、黑素细胞-刺激激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相关蛋白-2/TRP2(例如，与黑色素瘤有关)，(e)前列腺相关抗原如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，例如与前列腺癌有关，(f)免疫球蛋白独特型(例如，与骨髓瘤和B细胞淋巴瘤有关)。在某些实施方式中，肿瘤免疫原包括但不限于p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7、乙肝和丙肝病毒抗原、人T细胞嗜淋巴细胞病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3(CA27.29\BCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。
药物组合物
本发明的脂质体可用作药物组合物中的组分，来免疫对象抵御各种疾病。在脂质体以外，这些组合物通常包含药学上可接受的运载体。关于药学上可接受的运载体的全面讨论参见参考文献31。
本发明的药物组合物可包含一种或多种小分子免疫增强剂。例如，所述组合物可包含TLR2激动剂(例如Pam3CSK4)、TLR4激动剂(例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸，如E6020)、TLR7激动剂(例如咪喹莫特)、TLR8激动剂(例如雷西莫特)和/或TLR9激动剂(例如IC31)。理想上，任何此类激动剂的分子量<2000Da。在一些实施方式中，一种或多种所述激动剂还与RNA共同包封在脂质体中，但在其它实施方式中其未经包封。
本发明的药物组合物可包含淡水(例如w.f.i.)或缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液)中的脂质体。所含的缓冲盐浓度通常是5～20mM。本发明药物组合物的pH值通常可以是5.0～9.5，例如6.0～8.0。
本发明组合物可含有钠盐(如氯化钠)以产生张力。NaCl浓度通常为10±2mg/ml，例如约9mg/ml。
本发明的组合物可包含金属离子螯合剂。其可通过去除会加快磷酸二酯键水解的离子来延长RNA的稳定。因此，组合物可包含EDTA、EGTA、BAPTA、三胺五乙酸(pentetic acid)等中的一种或多种。此类螯合剂通常以10～500μM(例如0.1mM)存在。柠檬酸盐(如柠檬酸钠)也可以起螯合剂作用，同时也有利地提供缓冲活性。
本发明的药物组合物的渗透压可以是200mOsm/kg～400mOsm/kg，例如240～360mOsm/kg或290～310mOsm/kg。
本发明的药物组合物可包含一种或多种防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧乙醇。优选不含汞的组合物，而且可制备不含防腐剂的疫苗。
本发明的药物组合物优选是无菌的。
本发明的药物组合物优选无热原，如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。
本发明的药物组合物优选不含谷蛋白。
本发明的药物组合物可以单位剂量形式制备。在一些实施方式中，单位剂量的体积可以是0.1～1.0ml，例如约0.5ml。
可将所述组合物制备成溶液或悬浮液形式的注射剂。可制备所述组合物供肺部给药，例如，通过吸入器，采用细雾进行所述给药。可制备所述组合物供鼻部、耳部或眼部给药，例如，作为喷雾或滴剂进行所述给药。通常是供肌肉内给药的注射剂。
组合物包含免疫学有效量的脂质体，以及需要的任何其它成分。“免疫学有效量”指以单一剂量或一系列剂量的部分给予个体的对治疗或预防有效的量。该量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组(例如，非人的灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验测定的相对较宽范围内。本发明组合物的脂质体和RNA含量通常按每剂量的RNA量表示。优选的剂量含≤100μg RNA(例如，10～100μg，如约10μg、25μg、50μg、75μg或100μg)。尽管在低得多的水平(例如，≤1μg/剂量、≤100ng/剂量、≤10ng/剂量、≤1ng/剂量)能够观察到表达，仍优选最低剂量为0.1μg。
本发明还提供含有本发明药物组合物的递送装置(例如注射器、喷洒器(nebuliser)、喷雾器(sprayer)、吸入器、皮肤贴片等)。该装置可用于向脊椎动物对象给予所述组合物。
本发明的脂质体不含核糖体。
治疗方法和医学应用
与参考文献12公开的颗粒对比，本发明的脂质体和药物组合物用于体内应用以引发针对感兴趣免疫原的免疫应答。
本发明提供用于在脊椎动物中产生免疫应答的方法，所述方法包括给予有效量的本发明脂质体或药物组合物的步骤。所述免疫应答优选为保护性，并优选涉及抗体和/或细胞介导的免疫。所述方法可以产生加强的应答。
本发明还提供本发明的脂质体或药物组合物在用于在脊椎动物中产生免疫应答的方法中的应用。
本发明还提供本发明的脂质体在制备用于在脊椎动物中产生免疫应答的药物中的应用。
通过利用这些应用和方法在脊椎动物中产生免疫应答，该脊椎动物可受保护以抵御不同疾病和/或感染，例如，抵御上文所述的细菌性和/或病毒性疾病。所述脂质体和组合物具有免疫原性，并且更优选地是疫苗组合物。本发明的疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)疫苗，但通常是预防性疫苗。
所述脊椎动物优选哺乳动物，例如人或大型兽类哺乳动物(例如马、牛、鹿、羊、猪)。当所述疫苗用于预防性用途时，人优选是儿童(如幼童或婴儿)或青少年；当疫苗用于治疗用途时，人优选是青少年或成人。为儿童准备的疫苗也可给予成年人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。
根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。因此，人患者可以低于1岁、低于5岁、1～5岁、5～15岁、15～55岁或至少55岁。接受疫苗的患者优选老年人(如≥50岁、≥60岁并优选≥65岁)，幼儿(如≤5岁)，住院病人、保健护理人员、武装人员和军人、孕妇、慢性病人或免疫缺陷病人。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。
本发明的组合物通常直接给予患者。直接递送可通过胃肠道外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内、皮内或向组织间隙递送；不同于参考文献1，本发明通常不采用舌内注射)来完成。替代性的递送途径包括直肠、口服(例如片剂、喷雾)、口颊、舌下、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其它粘膜给予。皮内和肌内给予是两种优选途径。注射可以通过针头(例如皮下针头)进行，但也可以采用无针注射。肌内剂量通常是0.5ml。
本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫，优选引发增强的全身和/或粘膜免疫。
可通过单剂量方案或多剂量方案来进行给药。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强的免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径(如肠胃外初次和粘膜加强，粘膜初次和肠胃外加强等)给予多个剂量。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。在一个实施方式中，可在出生后约6周、10周和14周(例如在6周龄、10周龄和14周龄时，如世界卫生组织的免疫扩展计划(“EPI”)中所常用)给予多个剂量。在一个替代性实施方式中，间隔约两个月给予两个初次免疫剂量，例如间隔约7、8或9周，在给予第二个初次免疫剂量约6个月～1年后(例如给予第二个初次免疫剂量约6、8、10或12个月后)给予一个或多个加强免疫剂量。在另一个实施方式中，间隔约两个月给予三个初次免疫剂量，例如间隔约7、8或9周，在给予第三个初次免疫剂量约6个月～1年后(例如给予第三个初次免疫剂量约6、8、10或12个月后)给予一个或多个加强免疫剂量。
式(X)
式(X)的化合物包含连接至脂质部分的亲水性聚合物头部基团。可将其描述为“隐形脂质”且其具有下式：
其中：
Z是选自PEG和基于以下物质的聚合物的亲水性头部基团组分：聚(噁唑啉)、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]和聚(氨基酸)，其中，所述聚合物可以是直链或支链的，并且其中所述聚合物可以任选地被取代；
其中，Z由n个亚单元聚合；
n是数平均聚合度，其为10～200个Z单元，其中针对不同Z基团对n进行优化；
L1是任选被取代的C1-10亚烷基或C1-10杂亚烷基接头，包括醚(例如，-O-)、酯(例如，-C(O)O-)、琥珀酸酯(例如，-O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-))、氨基甲酸酯(例如，-OC(O)-NR'-)、碳酸酯(例如，-OC(O)O-)、脲(例如，-NRC(O)NR'-)、胺(例如，-NR'-)、酰胺(例如，-C(O)NR'-)、亚胺(例如，-C(NR')-)、硫醚(例如，-S-)、黄原酸酯(例如，-OC(S)S-)和磷酸二酯(例如，-OP(O)2O-)中的零种、一种或两种，
其中R'独立地选自-H、–NH-、-NH2、-O-、-S-、磷酸酯或任选被取代的C1-10亚烷基；
X1和X2独立地选自碳或选自–NH-、-O-、-S-或磷酸酯的杂原子；
A1和A2独立地选自C6-30烷基、C6-30烯基和C6-30炔基，其中A1和A2可以相同或不同，或者A1和A2与其连接的碳原子一同形成任选被取代的类固醇。
在一个实施方式中，式(X)的化合物具有式(X')
其中
PEG是聚(乙二醇)亚单元，其中所述PEG可以是直链或支链形式；
n是数平均聚合度，其为70～240单元的PEG；
L1是任选被取代的C1-10杂亚烷基接头，所述接头包含醚、酯、琥珀酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、胺、酰胺、亚胺、硫醚、黄原酸酯和磷酸二酯中的一种或两种；
X1和X2是氧；
A1和A2独立地选自C6-30烷基、C6-30烯基和C6-30炔基，其中A1和A2可以相同或不同，或者其中A1和A2与其连接的碳原子一同形成任选被取代的类固醇。
在本发明的含式X'脂质的一些实施方式中，本发明不涵盖数平均聚合度n是200个PEG单元的脂质。在本发明的含式X'脂质的其它实施方式中，本发明不涵盖数平均聚合度n是190～210个PEG单元的脂质。在本发明的含式X'脂质的其它实施方式中，本发明不涵盖数平均聚合度n是大于150个PEG单元或大于130个PEG单元的脂质。在本发明的含式X'脂质的一些实施方式中，本发明不涵盖数平均聚合度n是10～200个PEG单元的脂质。在一些实施方式中，本发明不涵盖包含具有式X'的脂质的脂质体。
在与阳离子脂质配制以形成脂质体时，式(X)和(X')的脂质能延长脂质体在体内(例如，在血液中)存在的时间。它们能够遮蔽脂质体表面，并由此减少血液蛋白的调理作用和备巨噬细胞摄入。更多详述参见参考文献32和33。在一个实施方式中，所述脂质包含选自下组的基团：PEG(有时称作聚(环氧乙烷))和基于聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]和聚(氨基酸)的聚合物。
合适用于本发明的PEG化的脂质包括：聚乙二醇-甘油二酯或聚乙二醇-二酰基甘油酰胺(polyethyleneglycol diacylglycamide)(PEG-DAG)偶联物，包括含有烷基链长独立地是约C4～约C40饱和或不饱和碳原子的二烷基甘油或二烷基甘酰胺的那些。所述二烷基甘油或二烷基甘酰胺基团还可包含一个或多个经取代的烷基基团。所述PEG化的脂质可选自：PEG-二月桂基甘油、PEG-二肉豆蔻基甘油(来自NOF，商品号#GM-020)、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二甾基甘油(disterylglycerol)、PEG-二月桂基甘酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘酰胺、PEG-二棕榈酰基-甘酰胺，和PEG-二甾基甘酰胺、PEG-胆固醇(1-[8’-(胆甾基-5-烯-3[β]-氧基)羰酰胺-3’,6’-二氧杂辛烷基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-双十四氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](来自阿凡提极性脂质制品公司(Avanti Polar Lipids)，商品号#880210P)。
化学术语和定义
卤素
术语“卤素”或“卤”包括氟、氯、溴和碘。
烷基、亚烷基、烯基、炔基、环烷基等。
本文所用的术语“烷基”、“亚烷基”、“烯基”和“炔基”是指直链和支链的非环形式。其环类似物指环烷基等。
术语“烷基”包括单价的、直链或支链的、饱和的、非环式的烃基基团。在一个实施方式中，烷基是C1-10烷基，在另一个实施方式中是C1-6烷基，在另一个实施方式中是C1-4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基或叔丁基基团。
术语“环烷基”包括单价的、饱和的、环式的烃基基团。在一个实施方式中，环烷基是C3-10环烷基，在另一个实施方式中是C3-6环烷基(例如环戊基和环己基)。
术语“烷氧基”指烷基-O-。
术语“烯基”包括单价、直链或支链、不饱和的、非环式的烃基基团，其具有至少一个碳-碳双键，在一个实施方式中，没有碳-碳三键。在一个实施方式中，烯基是C2-10烯基，在另一个实施方式中是C2-6烯基，在另一个实施方式中是C2-4烯基。
术语“环烯基”包括单价的、部分不饱和的、环式的烃基基团，其具有至少一个碳-碳双键，在一个实施方式中，没有碳-碳三键。在一个实施方式中，环烯基是C3-10环烯基，在另一个实施方式中是C5-10环烯基例如环己基或苯环己基(benzocyclohexyl)。
术语“炔基”包括单价的、直链或支链的、不饱和的、非环式的烃基基团，其具有至少一个碳-碳三键，在一个实施方式中，没有碳-碳双键。在一个实施方式中，炔基是C2-10炔基，在另一个实施方式中是C2-6炔基，在另一个实施方式中是C2-4炔基。
术语“环炔基”包括单价的、部分不饱和的、环式的烃基基团，其具有至少一个碳-碳三键，在一个实施方式中，没有碳-碳双键。在一个实施方式中，环炔基是C3-10环烯基，在另一实施方式中是C5-10环炔基。
术语“亚烷基”包括二价的、直链或支链的、饱和的、非环式的烃基基团。在一个实施方式中，亚烷基是C1-10亚烷基，在另一个实施方式中是C1-6亚烷基，在另一个实施方式中是C1-4亚烷基，例如亚甲基、乙烯、正丙烯、异丙烯或叔丁烯基团。
术语“亚烯基”包括二价的、直链或支链的、不饱和的、非环式的烃基基团，其具有至少一个碳-碳双键，在一个实施方式中，没有碳-碳三键。在一个实施方式中，亚烯基是C2-10亚烯基，在另一个实施方式中是C2-6亚烯基，在另一个实施方式中是C2-4亚烯基。
术语“亚炔基”包括二价的、直链或支链的、不饱和的、非环式的烃基基团，其具有至少一个碳-碳三键，在一个实施方式中，没有碳-碳双键。在一个实施方式中，亚炔基是C2-10亚炔基，在另一个实施方式中是C2-6亚炔基，在另一个实施方式中是C2-4亚炔基。
杂烷基等。
术语“杂烷基”包括烷基基团，其中有至多6个碳原子，在一个实施方式有至多5个碳原子，在另一个实施方式中有至多4个碳原子，在另一个实施方式中有至多3个碳原子，在另一个实施方式中有至多2个碳原子，在另一个实施方式中有1个碳原子各自独立地被被O、S(O)q、N、P(O)r或Si(且优选O、S(O)q或N)替代，限制条件是保留所述烷基碳原子中的至少一个。杂烷基基团可以碳连接或杂原子连接的，即，其可通过碳原子或通过O、S(O)q、N、P(O)r或Si连接至该分子的剩余部分。
术语“杂环烷基”包括环烷基基团，其中有至多6个碳原子，在一个实施方式中有至多5个碳原子，在另一个实施方式中有至多4个碳原子，在另一个实施方式中有至多3个碳原子，在另一个实施方式中有至多2个碳原子，在另一个实施方式中有1个碳原子各自独立地被O、S(O)q或N替代，限制条件是保留所述环烷基碳原子中的至少一个。杂环烷基基团的示例包括：环氧乙烷基(oxiranyl)、环硫乙烷基(thiaranyl)、氮丙啶基、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、硫杂环丁烷基(thiatanyl)、吖丁啶基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、1,4-二噁烷基、1,4-氧硫杂环丁烷基、吗啉基、1,4-二噻烷基、哌嗪基、1,4-氮噻烷基、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、氮杂环庚烷基(azepanyl)、1,4-二氧杂环庚烷基、1,4-氧硫杂环庚烷基、1,4-氧氮杂环庚烷基、1,4-二硫杂环庚烷基、1,4-硫氮杂环庚烷基和1,4-二氮杂环庚烷基。所述杂环烷基基团可以是碳连接或氮连接的，即，其可通过碳原子或氮原子连接至所述分子的剩余部分。
术语“杂烯基”包括烯基基团，其中有至多三个碳原子，在一个实施方式中有至多两个碳原子，在另一个实施方式中有一个碳原子各自独立地被O、S(O)q或N替代，限制条件是保留所述烯基碳原子中的至少一个。所述杂烯基基团可以是碳连接或杂原子连接的，即，其可通碳原子或通过O、S(O)q或N连接至所述分子的剩余部分。
术语“杂环烯基”包括环烯基基团，其有至多三个碳原子，在一个实施方式中有至多两个碳原子，在另一个实施方式中有一个碳原子各自独立地被O、S(O)q或N替代，限制条件是保留所述环烯基碳原子中的至少一个。杂环烯基基团的示例包括：3,4-二氢-2H-吡喃基、5-6-二氢-2H-吡喃、2H-吡喃、1,2,3,4-四氢吡啶基和1,2,5,6-四氢吡啶基。所述杂环烯基基团可以是碳连接或氮连接的，即，其可通过碳原子或通过氮原子连接至所述分子的剩余部分。
术语“杂炔基”包括炔基基团，其中有至多三个碳原子，在一个实施方式中有至多两个碳原子，在另一个实施方式中有一个碳原子中各自独立地被O、S(O)q或N替代，限制条件是保留所述炔基碳原子中的至少一个。所述杂炔基基团可以是碳连接或杂原子连接的，即，其可通过碳原子或通过O、S(O)q或N连接至所述分子的剩余部分。
术语“杂环炔基”包括环炔基基团，其中有至多三个碳原子，在一个实施方式中有至多两个碳原子，在另一个实施方式中有一个碳原子各自独立地被O、S(O)q或N替代，限制条件是保留所述环炔基碳原子中的至少一个。所述杂环烯基基团可以是碳连接或氮连接的，即，其可通过碳原子或通过氮原子连接至所述分子的剩余部分。
术语“杂亚烷基”包括亚烷烯基基团，其中有至多三个碳原子，在一个实施方式中有至多两个碳原子，在另一个实施方式中有一个碳原子各自独立地被O、S(O)q或N替代，限制条件是保留所述亚烷基碳原子中的至少一个。
术语“杂亚烯基”包括亚烯基基团，其中有至多三个碳原子，在一个实施方式中有至多两个碳原子，在另一个实施方式中有一个碳原子各自独立地被O、S(O)q或N替代，限制条件是保留该亚烯基碳原子中的至少一个。
术语“杂亚炔基”包括亚炔基基团，其中有至多三个碳原子，在一个实施方式中有至多两个碳原子，在另一个实施方式中有一个碳原子各自独立地被O、S(O)q或N替代，其限制条件是保留所述亚炔基碳原子中的至少一个。
芳基
术语“芳基”包括单价的、芳族的、环式烃基基团，例如苯基或萘基(例如1-萘基或2-萘基)。一般而言，所述芳基基团可以是单环或多环的稠环芳族基团。优选的芳基是C6-C14芳基。
芳基的其它示例是以下物质的单价衍生物：醋蒽烯(aceanthrylene)、苊烯、醋菲烯(acephenanthrylene)、蒽、柑菊环(azulene)、草屈(chrysene)、蒄(coronene)、萤蒽、芴、不对称-苯并二茚(as-indacene)、对称-苯并二茚(s-indacene)、茚、萘、卵苯、二萘嵌苯、非那烯(phenalene)、菲、苉、七曜烯(pleiadene)、芘、吡蒽(pyranthrene)和玉红省(rubicene)。
术语“芳基烷基”指被芳基基团取代的烷基，例如苄基。
术语“亚芳基”包括二价芳族的、环式的烃基基团，例如亚苯基。一般而言，所述亚芳基基团可以是单环或多环的稠环芳族基团。优选的亚芳基是C6-C14亚芳基。亚芳基基团的其它示例是以下物质的二价衍生物：醋蒽烯(aceanthrylene)、苊烯、醋菲烯(acephenanthrylene)、蒽、柑菊环(azulene)、草屈、蒄、萤蒽、芴、不对称-苯并二烯(as-indacene)、对称-苯并二烯(s-indacene)、茚、萘、卵苯、二萘嵌苯、非那烯、菲、苉、七曜烯(pleiadene)、芘、吡蒽(pyranthrene)和玉红省(rubicene)。
杂芳基
术语“杂芳基”包括单价的、杂芳族的、环式的烃基基团，所述基团还包含一个或多个独立地选自O、S、N和NRN的杂原子，其中RN在下文中有定义(且在一个实施方式中是H或烷基(例如C1-6烷基))。
一般而言，所述杂芳基基团可以是单环或多环(例如双环)的稠环杂芳族基团。在一个实施方式中，杂芳基基团包含5～13个环成员(优选5～10个成员)和1、2、3或4个独立地选自O、S、N和NRN的环杂原子。在一个实施方式中，杂芳基基团可以是5、6、9或10元环，例如5元单环、6元单环、9元稠环二环或10元稠环二环。
单环杂芳族基团包括含有5～6个环成员和选自O、S、N或NRN的1、2、3或4个杂原子的杂芳族基团。
在一个实施方式中，5元单环杂芳基基团包含是-NRN-基团、–O-原子或–S-原子的1个环成员，且可任选地包含是＝N-原子的1～3个环成员(例如，1或2个环成员)(所述5个环成员的剩余部分是碳原子)。
5元单环杂芳基基团的示例有：吡咯基、呋喃基、苯硫基、吡唑基、咪唑基、异噁唑基、噁唑基、异噻唑基、噻唑基、1,2,3三唑基、1,2,4三唑基、1,2,3噁二唑基、1,2,4噁二唑基、1,2,5噁二唑基、1,3,4噁二唑基、1,3,4噻二唑基、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、1,3,5三嗪基、1,2,4三嗪基、1,2,3三嗪基和四唑基。
6元单环杂芳基基团的示例有：吡啶基(pyridinyl)、哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。
在一个实施方式中，6元单环杂芳基基团包含是＝N-原子的1或2个环成员(6个环成员的剩余部分是碳原子)。
双环杂芳族基团包括含有9～13个环成员和选自O、S、N或NRN的1、2、3、4个或更多个杂原子的稠环杂芳族基团。
在一个实施方式中，9元双环杂芳基基团包含是-NRN-基团、-O-原子或-S-原子的1个环成员；以及可任选是＝N-原子的1～3个环成员(例如，1或2个环成员)，所述环成员(9个环成员的剩余部分是碳原子)。
9元稠环双环杂芳基基团的示例有：苯并呋喃基、苯并苯硫基、吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑剂、吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡咯并[2,3-c]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡咯并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[4,5-b]吡啶基、咪唑并[4,5-c]吡啶基、吡唑并[4,3-d]吡啶基、吡唑并[4,3-c]吡啶基、吡唑并[3,4-c]吡啶基、吡唑并[3,4-b]吡啶基、异吲哚基、吲唑基、嘌呤基、吲哚林基(indolininyl)、咪唑并[1,2-a]吡啶基、咪唑并[1,5-a]吡啶基、吡唑并[1,2-a]吡啶基、吡咯并[1,2-b]哒嗪基和咪唑并[1,2-c]嘧啶基。
在一个实施方式中，10元双环杂芳基基团包含1～3个环成员，所述环成员是＝N-原子(当10个环成员的剩余部分是碳原子时)。
10元稠环双环杂芳基基团的示例有喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、酞嗪基、1,6-萘啶基、1,7-萘啶基、1,8-萘啶基、1,5-萘啶基、2,6-萘啶基、2,7-萘啶基、吡啶并3,2-d]嘧啶基、吡啶并[4,3-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-b]吡嗪基、吡啶并[3,4-b]吡嗪基、嘧啶并[5,4-d]嘧啶基、吡嗪并[2,3-b]吡嗪基和嘧啶并[4,5-d]嘧啶基。
术语“杂芳基烷基”指被杂芳基基团取代的烷基。
术语“杂亚芳基”包括二价的、杂芳族的、环式的烃基基团，所述基团还包含独立地选自O、S、N和NRN的一个或多个杂原子，其中RN在下文有中定义(且在一个实施方式中是H或烷基(例如C1-6烷基))。一般而言，所述杂亚芳基基团可以是单环或多环(例如双环)的稠环杂芳族基团。在一个实施方式中，杂亚芳基基团包含5～13个环成员(优选5～10个成员)和独立地选自O、S、N和NRN的1、2、3或4个环杂原子。在一个实施方式中，杂亚芳基基团可以是5、6、9或10元的，例如5元单环、6元单环、9元稠环二环或10元稠环二环。术语“杂亚芳基”包括上述各杂芳基基团的二价衍生物。
术语“芳基”、“芳族”、“杂芳基”和“杂芳族”还包括部分被还原的基团。因此，例如，“杂芳基”包括其中的一个环被还原成饱和环的稠合类(例如1,2,3,4-四氢-1,8-萘啶-2-基)。
概述
除非另有说明，本文中提到的基团组合指作为一个部分(例如芳基烷基)，该部分通过最后提及的基团所含的原子连接至该分子剩余部分。
提及烷基基团或其它基团的碳原子被O、S(O)q、N或P(O)r替代时，意在说明：
或替代(其中E不能是H)；
–CH＝被–N＝或–P(O)r＝替代；
≡C-H被≡N或≡P(O)r替代；或
–CH2–被–O–、–S(O)q–、–NRN–或–P(O)rRN–替代，其中RN是H或任选地被以下基团取代：C1-6烷基、C1-6杂烷基、C3-6环烷基、C3-6杂环烷基、C2-6烯基、C2-6杂烯基、C3-6环烯基、C3-6杂环烯基、苯基或包含5或6个环成员的杂芳基。RN优选是H、C1-6烷基或C3-6环烷基。
q独立地是0、1或2。在一个实施方式中，q是0。
r独立地是0或1。在一个实施方式中，r是0。
提及碳原子被Si替代时，意在说明该碳原子被交换成了硅原子，但键仍保持不变。因此，例如，–CH2–被–SiH2–替代；–CH＝被–SiH＝替代；和≡C–H被≡Si–H替代。
需要说明的是，关于上述含杂原子的基团(例如杂烷基等)，当给出碳原子的计数时(例如C3-6杂烷基)，指示的是基于C3-6烷基的基团(其中3～6个链碳原子中的一个或多个被O、S(O)q或N替代)。因此，C3-6杂烷基基团将，例如，包含少于3～6个链碳原子。作为另一个示例，吡啶基将被分类为C6杂芳基基团，即便其包含5个碳原子。
取代
本发明化合物的基团(例如烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基、杂炔基、杂亚烷基、杂亚烯基芳基、芳基烷基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基或杂芳基杂烷基基团等)可以是经取代或未经取代的，在一个实施方式中是未经取代的。取代通常涉及氢原子被取代基团理论上替代，或在被＝O取代的情况中替代两个氢原子。
在取代时，各基团上一般会有1～5个取代基，在一个实施方式中，有1～3个取代基，在一个实施方式中，有1或2个取代基，在一个实施方式中，有1个取代基。在一个实施方式中，在相同原子上有多于一个取代基，例如乙缩醛基团。
在一个实施方式中，所述一个或多个取代基独立地是Sub1或Sub2(在一个实施方式中为Sub2)，其中：
Sub1独立地是卤素、三卤代甲基、三卤代乙基、-NO2、-CN、-N+(Rs)2O-、-CO2H、-CO2Rs、-SO3H、-SORs、-SO2Rs、-SO3Rs、-OC(＝O)ORs、-C(＝O)H、-C(＝O)Rs、-OC(＝O)Rs、＝O、-NRs 2、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NRs 2、-N(Rs)C(＝O)ORs、-N(Rs)C(＝O)NRs 2、-OC(＝O)NRs 2、-N(Rs)C(＝O)Rs、-C(＝S)NRs 2、-NRsC(＝S)Rs、-SO2NRs 2、-NRsSO2Rs、-N(Rs)C(＝S)NRs 2、-N(Rs)SO2NRs 2、-Rs或–ZsRs，其中；
Zs独立地是O、S或NRs；
Rs独立地是H或C1-6烷基、C1-6杂烷基、-(Alka)f-C3-6环烷基、-(Alka)f-C3-6杂环烷基、C2-6烯基、C2-6杂烯基、-(Alka)f-C3-6环烯基、-(Alka)f-C3-6杂环烯基、C2-6炔基、C2-6杂炔基、-(Alka)f-C6-14芳基、-(Alka)f-C6-14芳基或-(Alka)f-杂芳基(其中杂芳基含5-13个环成员)，其中
f是0或1；
Alka是C1-6亚烷基或C1-6杂亚烷基；且
Rs自身任选地被1～3个取代基Sub2取代(在一个实施方式中未经取代)；
Sub2独立地是卤素、三卤代甲基、三卤代乙基、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-CO2H、-CO2C1-6烷基、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-SO3C1-6烷基、-OC(＝O)OC1-6烷基、-C(＝O)H、-C(＝O)C1-6烷基、-OC(＝O)C1-6烷基、＝O、-N(C1-6烷基)2、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(＝O)O(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)C(＝O)N(C1-6烷基)2、-OC(＝O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(＝O)C1-6烷基、-C(＝S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(＝S)C1-6烷基、-SO2N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2C1-6烷基、-N(C1-6烷基)C(＝S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2N(C1-6烷基)2、-C1-6烷基、-C1-6杂烷基、-C3-6环烷基、-C3-6杂环烷基、-C2-6烯基、-C2-6杂烯基、-C3-6环烯基、-C3-6杂环烯基、-C2-6炔基、-C2-6杂炔基、-C6-14芳基、-C5-13杂芳基、-Zt-C1-6烷基、-Zt-C3-6环烷基、–Zt-C2-6烯基、–Zt-C3-6环烯基或–Zt-C2-6炔基；且
Zt独立地是O、S、NH或N(C1-6烷基)。
虽然Sub1中的Rs可任选地被1～3个取代基Sub2取代，但Sub2是未经取代的。然而，在一个实施方式中，Rs是未经取代的。
在一个实施方式中，Rs是H或C1-6烷基，任选地被1～3个取代基Sub2取代。
在一个实施方式中，Sub2独立地是卤素、三卤代甲基、三卤代乙基、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-CO2H、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-C(＝O)H、-C(＝O)C1-6烷基、＝O、-N(C1-6烷基)2、-C(＝O)NH2、-C1-6烷基、-C3-6环烷基、-C3-6杂环烷基、–Zt-C1-6烷基或–Zt-C3-6环烷基。
在一个实施方式中，当取代基团是非环式(例如烷基、杂烷基、烯基等)时，Sub1不是Rs且Sub2不是-C1-6烷基、-C1-6杂烷基、-C2-6烯基、-C2-6杂烯基、-C2-6炔基或-C2-6杂炔基。
当非Sub2基团具有至少2个可被取代的位置时，该基团可被亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基链(在一个实施方式中含1～6个原子、在另一个实施方式中含3～6个原子，且在另一个实施方式中含3或4个原子)的两端取代以形成环式部分。该链任选地被1～3个取代基Sub2取代。在一个实施方式中，该链是未经取代的。因此，术语任选地被取代的“环烷基”、“环烯基”、“环炔基”、“杂环烷基”、“杂环烯基”、“杂环炔基”、“芳基”和“杂芳基”包括稠合类。例如，“任选地被取代的环烷基”包括其中两个环烷基环为稠合式的种类，而“任选地被取代的杂芳基”包括其中杂环烷基环与芳族环稠合的种类(例如5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)。
当非Sub2基团具有可被取代两次的原子时，该原子可被亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基链(在一个实施方式中含2～8个原子、在另一个实施方式中含3～6个原子，而在另一个实施方式中含4或5个原子)的两端取代以形成环式部分。该链任选地被1～3个取代基Sub2取代。在一个实施方式中，该链是未经取代的。因此，术语任选地被取代的“环烷基”、“环烯基”、“环炔基”、“杂环烷基”、“杂环烯基”、“杂环炔基”、“芳基”和“杂芳基”包括螺式种类。
需要说明的是，当基团具有杂原子时，取代基可结合至该杂原子。因此，例如，“任选地被取代的杂烷基”包括CH2–N(Sub1)–CH2–、–CH(Sub1)–NH–CH2–和–CH(Sub1)–N(Sub1)–CH2–等。
修饰术语
当列前有修饰语时，应当理解为该修饰语应用于该列中的每一项。例如，短语“任选地被取代的C3-20-杂环烷基、C3-20-杂环烯基、C3-20-杂环炔基或C5-20-杂芳基基团”是指该列中四项中的每项，即C3-20-杂环烷基基团、C3-20-杂环烯基基团、C3-20-杂环炔基基团或C5-20-杂芳基基团可任选地被取代。
当基团被第一修饰语修饰，然后相同的基团被一个后续的修饰语修饰时，说明该基团被两个修饰语同时修饰。例如，如果基团被描述为“C3-20-杂环炔基”(第一修饰语)基团，随后该相同基团被描述为“C5-16”(后续的修饰语)基团，说明它是C5-16杂环炔基基团。
类固醇
如本文所用，术语“类固醇”指包含如下结构(该结构在本文中称作“类固醇骨架”)的任何基团。
仅以说明为目的，上方所示的类固醇骨架绘制为完全饱和的。然而，术语类固醇还意在涵盖含不饱和类固醇骨架的例子。例如，术语类固醇涵盖包含完全饱和的(满环(mancude))基础骨架的基团，15H-环戊二烯并[a]菲：
术语类固醇还涵盖含部分不饱和类固醇骨架的基团。
术语类固醇还涵盖：类固醇骨架的“断环(seco)”衍生物，即其中已发生环开裂的基团；分别含缩环和扩环的类固醇骨架的“失碳(nor)”和“增碳(homo)”衍生物(参见Systemic Nomenclature of Organic Chemistry(《有机化学系统命名法》)，D.Hellwinkel著，斯普林格公司(Springer)出版，ISBN:3-540-41138-0，第203页记载“seco(断环)”和第204页“nor(失碳)”和“homo(增碳)”)。然而，在一个实施方式中，术语“类固醇”不涵盖此类断裂衍生物。另在一个实施方式中，术语“类固醇”不包括此类失碳衍生物。在另一个实施方式中，术语“类固醇”不涵盖此类增碳衍生物。因此，在一个实施方式中，术语“类固醇”不涵盖此类断环、失碳和增碳衍生物。
术语类固醇还涵盖结构经标记的类固醇骨架上一个或多个碳原子被杂原子取代的情况。在一个这样的实施方式中有至多6个碳原子，在一个实施方式中有至多5个碳原子，在另一个实施方式中有至多4个碳原子，在另一个实施方式中有至多3个碳原子，在另一个实施方式中有至多2个碳原子，在另一个实施方式中有1个碳原子各自独立地被O、S(O)q、N、P(O)r或Si(且优选O、S(O)q或N)替代。然而，在一个实施方式中，术语“类固醇”包含“类固醇基础骨架”不含杂原子的种类。
类固醇环体系按如下惯例编号。
术语类固醇涵盖固醇、类固醇激素、胆汁酸和胆汁酸盐。固醇是在A环的第3位具有羟基基团的任何类固醇。
不饱和
根据标准用法，ω－3位指从链的(甲基)末端开始第三个键；ω－6位指从链的(甲基)末端开始第六个键；ω－9位指从链的(甲基)末端开始第九个键。
概述
除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，参考文献34～40等。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可包括其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是可任选的，并且表示，例如x±10％。
术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。如有需要，“基本上”一词可从本发明的定义中省略。
述及带电的、阳离子、阴离子、两性离子等，以pH7时为准。
TLR3是Toll样受体3。其是在先天性免疫系统中发挥重要作用的单跨膜受体。已知的TLR3激动剂包括聚(I:C)。“TLR3”是该受体的编码基因经核准的HGNC名称，其唯一的HGNC ID是HGNC:11849。人TLR3基因的RefSeq序列是GI:2459625。
TLR7是Toll样受体7。其是在先天性免疫系统中发挥重要作用的单跨膜受体。已知的TLR7激动剂包括，例如咪喹莫特。“TLR7”是该受体的编码基因的经核准HGNC名称，其唯一的HGNC ID是HGNC:15631。人TLR7基因的RefSeq序列是GI:67944638。
TLR8是Toll样受体8。其是在先天性免疫系统中发挥重要作用的单跨膜受体。已知的TLR8激动剂包括例如瑞喹莫德。“TLR8”是该受体的编码基因的核准HGNC名称，其唯一的HGNC ID是HGNC:15632。人TLR8基因的RefSeq序列是GI:20302165。
RIG-I-样受体(“RLR”)家族包括先天性免疫系统中发挥重要作用的各种RNA解旋酶[41]。RLR-1(也称为RIG-I或视黄酸诱导型基因I)在N末端附近含两个胱冬酶募集结构域。RLR-1解旋酶的编码基因的核准HGNC名称是“DDX58”(指DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)盒多肽58)，唯一的HGNC ID是HGNC:19102。人RLR-1基因的RefSeq序列是GI:77732514。RLR-2(也称为MDA5或黑素瘤分化相关基因5)也在N末端附近含两个胱冬酶募集结构域。RLR-2解旋酶的编码基因的核准HGNC名称是“IFIH1”(指干扰素诱导的含解旋酶C结构域1)，唯一的HGNC ID是HGNC:18873。人RLR-2基因的RefSeq序列是GI:27886567。RLR-3(也称为LGP2或遗传和生理学实验室2)没有胱冬酶募集结构域。RLR-3解旋酶的编码基因的核准HGNC名称是“DHX58”(指DEXH(Asp-Glu-X-His)盒多肽58)，唯一的HGNC ID是HGNC:29517。人RLR-3基因的RefSeq序列是GI:149408121。
PKR是双链RNA依赖性蛋白激酶。其在先天性免疫系统中发挥重要作用。“EIF2AK2”(关于真核翻译启动因子2-α激酶2)是该酶的编码基因的核准HGNC名称，其唯一的HGNC ID是HGNC:9437。人PKR基因的RefSeq序列是GI:208431825。
附图简述
图1显示含经染色RNA的凝胶。泳道显示：(1)标志物(2)裸复制子(3)经RNA酶处理的复制子(4)包埋在脂质体中的复制子(5)经RNA酶处理的脂质体(6)经RNA酶处理然后经苯酚/氯仿提取的脂质体。
图2显示含经染色RNA的凝胶。泳道显示：(1)标志物(2)裸复制子(3)包封在脂质体中的复制子(4)经RNA酶处理然后经苯酚/氯仿提取的脂质体。
图3显示在脂质体内递送RNA的后第1天、第3天和第6天的蛋白质表达(以相对光单位，RLU表示)，脂质体带有不同的PEG：1kDa(三角形)；2kDa(圆形)；3kDa(方形)。
图4显示在以病毒粒包装的复制子形式(方形)、以裸RNA形式(菱形)或在脂质体内(+＝0.1μg,x＝1μg)递送RNA之后第1天、第3天和第6天的蛋白质表达。
图5显示BALB/c小鼠内的log10F特异性IgG效价。所示五组具有的PEG长度由左至右为1、2、3、5或10kDa。圆圈显示一次注射后两周的效价；三角形显示第二次注射后两周的效价；短线显示两次效价的平均值。
具体实施方式
RNA复制子
使用以下各种复制子。一般而言，这些复制子基于杂交α病毒基因组，具有来自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的非结构蛋白、来自VEEV的包装信号和来自辛德毕斯病毒或VEEV突变体的3'UTR。所示复制子长约10kb并具有聚A尾。
采用编码α病毒复制子的质粒DNA(名为：pT7-mVEEV-FL.RSVF或A317；pT7-mVEEV-SEAP或A306；pSP6-VCR-GFP或A50)作为体外合成RNA的模板。所述复制子包含RNA复制所需的α病毒遗传元件，但缺少颗粒组装所需的基因产物的编码序列；结构蛋白由感兴趣的蛋白(报告子，例如SEAP或GFP，或免疫原例如全长RSVF蛋白)替代，从而所述复制子无法诱导产生感染性颗粒。α病毒cDNA上游的噬菌体(T7或SP6)启动子促进该复制子RNA体外合成，并且紧邻聚(A)尾下游的丁型肝炎病毒(HDV)核酶通过其自切割活性产生正确的3’端。
所述质粒DNA在HDV核酶下游用合适的限制性内切核酸酶线性化后，用T7或SP6噬菌体衍生的DNA依赖性RNA聚合酶体外合成失控(run-off)转录本。按照生产商(安碧公司(Ambion))提供的说明，在7.5mM(T7RNA聚合酶)或5mM(SP6RNA聚合酶)的各三磷酸核苷(ATP、CTP、GTP和UTP)存在下在37℃转录2小时。转录后，用TURBO DNA酶(安碧公司)消化模板DNA。用LiCl使所述复制子RNA沉淀，并重溶在无核酸酶的水中。按照使用手册采用ScriptCap m7G加帽系统(ScriptCap m7G Capping System)(艾比森得生物技术公司(Epicentre Biotechnologies))，用牛痘加帽酶(VCE)在转录后对未加帽的RNA加帽。用LiCl使转录后加帽的RNA沉淀并重溶在无核酸酶的水中。通过测试OD260nm来测定RNA样品的浓度。体外转录本的完整性通过变性琼脂糖凝胶电泳证实。
脂质体包封
将RNA包封于主要通过参考文献9和42的方法所制备的脂质体中。简言之，使脂质溶解于乙醇，使RNA复制子溶解于缓冲液，然后将这些与缓冲液混合，随后平衡。所述混合物用缓冲液稀释，然后过滤。所得产物包含脂质体，其具有高包封效率。脂质体由10％DSPC(两性离子)、40％DlinDMA(阳离子)、48％胆固醇和2％PEG-偶联的DMG制成。这些比例指总脂质体中的摩尔百分比％。采用参考文献4的方法合成DlinDMA(1,2-二油酰-N,N-二甲基-3-氨基丙烷)。DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)购自健赞公司(Genzyme)。胆固醇获自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。偶联有PEG的DMG(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)，铵盐)、DOTAP (1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷，氯盐)和DC-胆固醇(3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]盐酸胆固醇)来自阿凡提极性脂质制品公司(Avanti Polar Lipids)。
在一些脂质体中，采用阳离子脂质替代
DlinDMA，例如，RV05或RV17：
一般而言，采用了8种不同的方法来制备本发明的脂质体。这些方法在文中被称为方法(A)～(H)，并且它们的主要差别与过滤和TFF步骤相关。详细内容如下：
(A)在乙醇中配制新鲜脂质储液。称量37mg DlinDMA、11.8mg DSPC、27.8mg胆固醇和8.07mg PEG DMG2000并溶于7.55mL乙醇中。新鲜配制的脂质储液在37℃温和摇动约15分钟以形成均质混合物。然后，向1.245mL乙醇添加755μL所述储液，以获得2mL的工作脂质储液。使用该量的脂质以形成含250μg RNA的脂质体。还从内含约1μg/μL的100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)储液制备2mL的RNA工作溶液。使用前，3个20mL的玻璃瓶(配有搅拌棒)用RNA酶清除液(RNase Away solution，分子生物产品公司(Molecular BioProducts))冲洗，并用大量MilliQ水清洗，以去除所述瓶的RNA酶污染。所述瓶之一用于所述RNA工作溶液，其它的用于收集所述脂质和RNA混合物(如后文所述)。使工作脂质溶液和工作RNA溶液在37℃加热10分钟后装入3cc鲁尔接口(luer-lok)注射器。将2mL柠檬酸盐缓冲液(pH6)加载至另一个3cc注射器中。含有RNA和所述脂质的注射器采用FEP管(氟化乙烯-丙烯；al FEP管具有2mm内径×3mm外径，由艺达斯健康科学公司(Idex Health Science)提供)连接至T混合器(PEEKTM500μm ID接头，艺达斯健康科学公司)。T混合器的出口也装有FEP管。将包含柠檬酸盐缓冲液的第三个注射器连接至另一段FEP管。然后，采用注射泵以7mL/分钟的流速驱动所有注射器。设置该管出口以将混合物收集进入20mL的玻璃瓶中(搅拌中)。取出搅拌棒，并使乙醇/水性溶液平衡至室温1小时。将4mL混合物装载进入连接至一段FEP管的5cc注射器中，并在另一个连接至等长FEP管的5cc注射器中装载等量的100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)。用注射泵以7mL/分钟的流速驱动所述两个注射器，并将最终混合物收集至20mL玻璃瓶中(搅拌中)。之后，使第二混合步骤收集的混合物(脂质体)通过Mustang Q膜(结合并移除阴离子分子的阴离子交换支持物，获自波乐公司(Pall Corporation))。使所述脂质体通过前，用4mL的1M NaOH、4mL的1MNaCl和10mL的100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)依次通过所述Mustang膜。使所述脂质体在37℃温热10分钟后通过该膜。之后，使脂质体浓缩至2mL，并采用TFF用10～15体积的1X PBS透析，然后回收终产物。所述TFF系统和中空纤维素过滤膜购自仕必纯实验室公司(Spectrum Labs)并按照生产商指南使用。采用100kD孔径截止值和8cm2表面积的聚砜中空纤维素过滤膜。制剂用1X PBS稀释到所需的RNA浓度以供体外和体内实验。
(B)如方法(A)，不同之处在于，在摇动之后，向1.773mL乙醇添加226.7μL储液以制备2mL的工作脂质储液，由此改变脂质:RNA比。
(C)如方法(B)，不同之处在于，省去Mustang过滤，从而脂质体从20mL玻璃瓶进入TFF透析。
(D)如方法(C)，不同之处在于，采用100kD孔径截止值和20cm2表面积的聚醚砜(PES)中空纤维素膜(部件编号P-C1-100E-100-01N)。
(E)如方法(D)，不同之处在于，如方法(A)中使用Mustang膜。
(F)如方法(A)，不同之处在于，省去Mustang过滤，从而脂质体从20mL玻璃瓶进入TFF透析。
(G)如方法(D)，不同之处在于，从内含约1μg/μL的100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)储液制备4mL RNA工作溶液。然后，以相同的方式制备四个20mL玻璃瓶。其中两个玻璃瓶用于RNA工作溶液(每瓶2mL)，其它的玻璃瓶用于收集脂质和RNA混合物，正如(C)中。不使用T混合器，而是将含有RNA和脂质的注射器通过采用PTFE管(0.03英寸内径×1/16英寸外径)的4-通道边缘连接件(4-way edge connector)(Syrris公司)，连接至Mitos液滴接口芯片(MitosDroplet junction Chip)(获自Syrris公司的玻璃微流体装置，产品编号：3000158)。通过注射泵驱动两股RNA流和一股脂质流，在芯片的X接口(100μmx105μm)处完成乙醇和水相的混合。所有三股流的流速都保持在1.5mL/分钟，因此总水流与乙醇流的流速之比是2:1。设置所述管出口以将所述混合物收集至20mL玻璃瓶(搅拌中)。取出搅拌棒，并使乙醇/水溶液平衡至室温一小时。然后，将所述混合物加载进入与另一段PTFE管相匹配的5cc注射器；在另一个具有等长PTFE管的5cc注射器中加载等体积的100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)。用注射泵以7mL/分钟的流速驱动所述两个注射器，并将最终混合物收集至20mL玻璃瓶中(搅拌中)。之后，使脂质体浓缩至2mL并采用TFF用10-15体积的1X PBS透析，如(D)中所述。
(H)如方法(A)，不同之处在于，通过混合120.9μL的脂质储液和1.879mL乙醇来制备2mL的工作脂质储液。另外，在T混合器中进行混合之后，将来自20mL瓶的脂质体加载至皮尔斯Slide-A-Lyzer透析盒(Pierce Slide-A-Lyzer DialysisCassette)(热科学公司(Thermo Scientific)，超强，0.5～3mL容量)中，于4℃下在高压灭菌的塑料容器中用400～500mL的1X PBS透析过夜，然后回收终产物。
脂质体形成之后，可通过Quant-iT RiboGreen RNA试剂盒(英杰公司(Invitrogen))按照生产商的说明，采用该试剂盒中提供的核糖体RNA标准生成标准曲线，来测定经包封的RNA与RNA浓度的百分比。例如，脂质体以10x或100x稀释入1X TE缓冲液(来自试剂盒)中之后加入染料。另外，使脂质体以10x或100x稀释入含0.5％曲通X的1X TE缓冲液中之后添加染料(以破坏脂质体并由此测定总RNA)。此后，向各溶液添加等量的染料，然后在添加染料后将约180μL的各溶液以双份重复加载至96孔组织培养板上。在酶标仪上读取荧光值(激发485nm，发射528nm)。脂质体制剂可基于RNA的包封量来体内给药。
显示脂质体内的包封保护RNA免于RNA酶的消化。实验采用3.8mAU的RNA酶A/微克RNA，在室温下孵育30分钟。用蛋白水解酶K在55℃下处理10分钟使RNA酶失活。然后，向25:24:1v/v/v的苯酚:氯仿:异戊醇添加1:1v/v样品混合物以从所述脂质提取RNA至水相中。使样品涡旋混合数秒，然后置于离心机上以12k RPM离心15分钟。水相(含RNA)被取出并用于RNA分析。在上样(400ng RNA/孔)之前，所有样品用甲醛上样染料孵育，65℃变性10分钟并冷却至室温。采用安碧Millennium标志物来估计RNA构建体的分子量。在90V跑胶。按照生产商指导用0.1％SYBR金通过在水中室温摇晃1小时来对凝胶染色。图1显示在无包封的情况下，RNA被RNA酶完全消化(泳道3)。包封后检测不到RNA(泳道4)，而这些脂质体经RNA酶处理后没有显示变化(泳道4)。对RNA酶处理后的脂质体进行苯酚提取，观察到未消化的RNA(泳道6)。甚至在4℃下保持一周之后，所述RNA仍未见任何片段化(图2，箭头)。在4℃下保持6周并经过一个冻融循环之后，体内蛋白质表达无变化。因此，经脂质体包封的RNA是稳定的。
报告基因的表达
为评估体内RNA表达，在复制子中编码报告酶(SEAP，分泌型碱性磷酸酶)而非免疫原。血清1:4稀释在1X Phospha-Light稀释缓冲液中，采用化学发光的碱金属磷酸盐底物来测定表达水平。在第0天，采用0.1μg或1μg RNA剂量，以50μl/腿对8～10周龄的BALB/c小鼠(5只/组)进行肌内注射。也给予无脂质体的1μg相同载体(在无RNA酶的1X PBS中)。还测试病毒粒包装的复制子。通过参考文献43的方法获得本文中所用的病毒颗粒包装的复制子(称为“VRP”)，其中α病毒复制子衍生自突变体VEEV或源自VEEV基因组经工程改造以含有辛德毕斯病毒的3'UTR和辛德比斯病毒包装信号(PS)的嵌合体，并通过将其与编码辛德毕斯病毒衣壳和糖蛋白基因的缺陷型辅助RNA共同电穿孔进入BHK细胞来进行包装。
如图4所示，就1μg剂量而言，包封使SEAP水平增加约1/2log，而在第6天，0.1μg包封剂量的表达接近1μg未包封剂量的水平。截至第3天，表达水平增长至VRP(方形)所达的水平。因此，相较于裸RNA对照而言，将RNA配制在脂质体中时增加SEAP的表达，即使剂量低10x。表达也高于VRP对照，但表达动力学差异很大(参见图4)。采用电穿孔的RNA递送导致相对于裸对照的表达水平增加，但该水平低于采用脂质体递送时的表达水平。
为评估脂质体组中所见的效果是否仅归因于脂质体成分，还是与包封相关，将所述复制子以包封形式(采用两种纯化方法，0.1μg RNA)或在脂质体形成后混合的形式(非包封的“脂质复合体(lipoplex)”，0.1μg RNA)，或以裸RNA形式(1μg)给予。所述脂质复合体给出最低水平的表达，显示包封对于有力表达而言是必需的。
进一步SEAP实验显示以少至1ng RNA递送之后有明显的体内剂量应答。进一步实验比较了经包封的复制子和裸复制子的表达，指示0.01μg经包封的RNA相当于1μg的裸RNA。在第6天，0.5μg RNA剂量的经包封的物质获得高出12倍的表达；在第6天，0.1μg剂量的表达水平高出24倍。
除了观察组内平均水平以外，还研究了个体动物。虽然数只动物对裸复制子无应答，但是包封消除了无应答。
免疫原的体内表达
为了评估体内免疫原性，构建复制子以表达来自呼吸道合胞病毒(RSV)的全长F蛋白。在第0天和第21天递送裸复制子(1μg)、包封在脂质体中的复制子(0.1或1μg)、或包装在病毒粒中(106IU；“VRP”)的复制子。脂质体明显提高了免疫原性，并且所述RNA引发强健的CD8T细胞反应。进一步实验比较了接受VRP、0.1μg经脂质体包封的RNA或1μg经脂质体包封的RNA的小鼠中的F特异性IgG效价。经脂质体包封的RNA诱导与病毒粒递送所见基本相同量级的免疫应答。
进一步研究证实，0.1μg的经脂质体包封的RNA给出比递送0.1μg DNA高得多的抗F IgG应答(第二次给药后15天)，甚至比通过电穿孔递送20μg编码F抗原的质粒DNA更具免疫原性。
为了研究RSV F蛋白免疫原性，制备编码RSV F蛋白的自复制复制子"vA317"。在第0天和第21天，采用1μg单独复制子或如上所述用DLinDMA制成脂质体的形式，通过双侧肌内免疫接种(50μL/腿)将其给予BALB/c小鼠，每组4或8只动物。这些脂质中的PEG-DMG包括PEG-2000。为了比较，采用电穿孔来递送表达相同RSV-F抗原的裸质粒DNA(20μg)或与脂质体一起递送(0.1μg DNA)。采用4只小鼠作为未处理对照组。在第14天和第36天收集血清以供抗体分析。在第49天获取脾脏以供T细胞分析。
F特异性的血清IgG效价(GMT)如下，显示四种不同含RNA的脂质体制备物的数据以及含DNA的脂质体的数据供比较：
RV 第14天 第36天
裸DNA质粒 439 6712
裸A317RNA 78 2291
脂质体#1 3020 26170
脂质体#2 2326 9720
脂质体#3 5352 54907
脂质体#4 4428 51316
脂质体#5(DNA) 5 13
因此，通过增加的F特异性IgG效价(以及T细胞频率；数据未显示)确定，相较于裸RNA对照而言，脂质体制剂显著增强了免疫原性。用脂质体配制的质粒DNA，或采用电穿孔递送的裸RNA，其免疫原性显著低于脂质体配制的自复制RNA。
较长PEG长度
为了比较PEG长度对体内免疫原性的影响，采用方法(H)制备两组不同的脂质体，其含150μg RNA或不含RNA(以制备空脂质体)。采用两种不同脂质混合物，其皆具有40％DlinDMA、10％DSPC、48％胆固醇和2％PEG-DMG，但这两种组合物采用PEG2000或PEG5000。所述RNA复制子是编码RSV表面融合糖蛋白的vA375。
下表显示脂质体的大小(Z均值和多分散性指数)以及其各自的RNA包封率％：
组合物 PEG Zav(nm) pdI RNA 包封率
A 2000 152.1 0.053 + 92.5％
B 2000 144 0.13 - -
C 5000 134 0.136 + 71.6％
D 5000 130.3 0.178. - -
在第0天和第21天通过双侧肌内注射(50μl/腿)将脂质体给予BALB/c小鼠(10只/组)。剂量是0.01、0.03、0.1、0.3或1μg。第一次和第二次注射后两周的F特异性血清IgG和PRNT60效价(GMT)如下：
脂质体 RNA(μg) 2wp1 2wp2 PRNT60(2wp2)
缓冲液对照 0 - - 10
B 0 - - 10
D 0 - - 10
A 0.01 3399 50691 37
C 0.01 3959 37025 51
A 0.03 3446 53463 83
C 0.03 5842 50763 180
A 0.1 8262 76808 238
C 0.1 7559 122555 314
A 0.3 5913 82599 512
C 0.3 5712 126619 689
A 1 8213 85138 441
C 1 9434 199991 1055
两次给予0.1(1.6x)、0.3(1.5x)或1μg(2.4x)RNA之后，包含PEG5000引发的F特异性效价高于PEG2000。统计学分析(T检验)显示，就0.01、0.1、0.3和1μg RNA剂量而言，PEG5000和PEG2000组之间的F特异性效价(2wp2)有统计学差异(P<0.05)。就1μg RNA而言，PEG5000给出较高中和效价(2.4x)，P<0.05。
类似的比较实验采用vA317复制子进行。通过方法(H)，采用40％DlinDMA、10％DSPC、48％胆固醇和2％PEG DMG(PEG2000或PEG5000)来制备脂质体。其特征如下：
名称 PEG Zav(nm) pdI 包封率
2k 2000 122.3 0.068 95.23％
5k 5000 106.1 0.136 61.61％
在第0天和第21天采用裸(1μg)RNA或脂质体包封的(0.1μg)RNA对BALB/c小鼠(8只/组)给予双侧肌内免疫接种(50μL/腿)。在第14天和第35天收集血清，在第49天获取脾脏。
第一次和第二次注射后两周的F特异性血清IgG(GMT)如下：
组 第14天 第35天
裸RNA 28 721
2k 2237 12407
5k 5654 39927
以下是平均净F特异性细胞因子阳性T细胞频率(CD4+或CD8+)，其中只显示统计学上显著大于0的数值(特定地，RSV肽F51-66、F164-178、F309-323针对CD4+，或肽F85-93和F249-258针对CD8+)：
因此，通过将PEG头部基团的分子量从2000增加至5000，F特异性IgG效价增加至2.5倍(2wp1)和3倍(2wp2)。对T细胞反应也有积极效果。
PEG长至10kDa的效果
采用BALB/c小鼠来研究1～10kDa范围内不同PEG长度的效果。五组小鼠接受两次给药(第0天和第21天)，给予内含编码RSV F蛋白的0.1μg RNA(vA375复制子)的脂质体，该脂质体由DLinDMA阳离子脂质和不同长度的PEG-DMG(1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、10kDa)形成。在第一次和第二次给药之后14天检测F特异性IgG效价，结果示于图5。数据显示2、3、5和10kDa的PEG长度在两个时间点获得基本相同的效价，而这些都高于采用1kDa PEG所获的效价。
对照动物接受采用2kDa PEG-DMG形成但无RNA的脂质体。这些动物还显示在第二次给药之后抗F IgG效价增加(但水平比接受经包封RNA的动物低得多)。来自该组的血清样品在gp140或PBS被覆的ELISA平板上没有显示非特异性反应。
在注射脂质体之后5小时检测血清细胞因子。总体而言，在任何小鼠中未观察到IL-1β或TNF-α反应，而就所有PEG长度而言，对IL-12/p70、IL-6、IL-10、IFN-γ和IP-10的反应相当。接受含5kDa或10kDa PEG-DMG的脂质体的小鼠中的KC/GRO反应显著低于接受无PEG化的脂质体的小鼠。采用RSV的PEG5000研究
四种不同的复制子用于该研究，所述复制子全部编码RSV的全长野生型F糖蛋白，并且删去了融合肽。vA372复制子通过失控转录形成。vA142复制子的3'端通过核糖体介导的切割形成。在vA368中，蛋白质的表达由EV71内部核糖体进入位点(IRES)驱动。在vA369复制子中，表达由EMCV IRES驱动。
脂质体采用40％RV17阳离子脂质、10％DSPC、49.5％胆固醇、0.5％PEGDMG5000，以及175μg RNA批量规模，使用方法(H)形成。
在第0天和第21天采用对BALB/c小鼠(7只/组)双侧肌内疫苗接种(50μL/腿)给予：
组1制于脂质体内的自复制RNA(vA372，1.0μg)组2制于脂质体内的自复制RNA(vA142，1.0μg)
组3包含vA142RNA的VRP(1x106IU)
组4制于脂质体内的自复制RNA(vA368，1.0μg)
组5包含vA368的VRP RNA(1x106IU)
组6制于脂质体内的自复制RNA(vA369，1.0μg)组7包含vA369的VRPRNA(1x106IU)
组8未处理对照(4只动物)
在第0天、第20天、第35天收集血清供抗体分析。在第35天收集脾脏供T细胞分析。F特异性血清IgG效价和中和效价(GMT)如下：
因此，所有四种复制子都具有免疫原性，并且在第一次免疫接种之后各自引发血清F特异性IgG抗体，在第二次免疫接种有效加强所述应答。在第二次免疫接种之后检测RSV中和抗体。其中3'端通过核糖体介导的切割形成的复制子(vA142)和其中3'端通过失控转录形成的复制子(vA372)在第二次免疫接种后诱导相似的抗体效价。F抗原的EV71或EMCV驱动的表达没有增强对所述复制子的抗体反应(vA368或vA369对比vA142)。相似地，T细胞反应(未显示)没有区分3'端通过核糖体介导的切割形成的复制子(vA142)或通过失控转录形成的复制子(vA372)，并且未显示EV71或EMCV驱动的F抗原表达的益处(vA238或vA369对比vA142)。
还采用由以下物质形成的脂质体在棉鼠(Sigmodon hispidis)中测试vA142复制子。
(a)40％DlinDMA、10％DPSC、48％胆固醇和2％PEG DMG2000，通过方法(D)采用175μg RNA批量规模制成。
(b)40％RV17、10％DSPC、49.5％胆固醇和0.5％PEG DMG5000，通过方法(H)采用200μg RNA批量规模制成。
(c)40％RV05、30％DLoPE(18:2PE)、28％胆固醇和2％PEG DMG2000，通过方法(H)采用200μg RNA批量规模制成。
在第0天和第21天对棉鼠(4～8只动物/组)肌内免疫接种以下物质(100μL/腿)：
组1制于脂质体(a)内的自复制RNA(vA142，1μg，RSV-F)组2制于脂质体(a)内的自复制RNA(vA142，0.1μg，RSV-F)
组3制于脂质体(b)内的自复制RNA(vA142，1μg，RSV-F)组4制于脂质体(b)内的自复制RNA(vA142，0.1μg，RSV-F)
组5制于脂质体(c)内的自复制RNA(vA142，1μg，RSV-F)
组6制于脂质体(c)内的自复制RNA(vA142，0.1μg，RSV-F)
组7表达RSV的全长野生型表面F糖蛋白的VRP(1x106IU)组8采用氢氧化铝作为佐剂的RSV-F亚基蛋白疫苗(5μg)组9未处理对照(3只动物)
在第49天(第二次免疫接种4周后)用5μg F亚基+氢氧化铝对所有棉鼠(除组9以外)免疫接种。
在第0天、21天、35天、49天、64天收集血清供抗体分析。
F特异性血清IgG效价(GMT)如下：
组 第21天 第35天 第49天 第64天
1 558 3938 2383 16563
2 112 1403 943 15123
3 330 2927 2239 25900
4 51 503 503 20821
5 342 3207 2151 24494
6 49 1008 513 15308
7 1555 7448 4023 25777
8 8425 81297 54776 82911
9 5 5 5 5
RSV血清中和抗体效价如下：
组 第21天 第35天 第49天 第64天
1 66 788 306 161
2 26 162 58 1772
3 69 291 198 3221
4 24 72 43 1135
5 75 448 201 5733
6 27 371 163 2449
7 137 2879 1029 1920
8 307 2570 1124 2897
9 10 - - 10
蛋白质免疫接种没有在先前用蛋白质接种过的棉鼠中加强抗体效价，但其使先前用RNA免疫接种过的棉鼠中的效价大幅增强。在大多数情况中，在两次免疫接种RNA后接种蛋白质的RSV血清中和效价等同于两到三次连续的带佐剂蛋白质免疫接种所诱导的效价。
CMV免疫原性
脂质体用于递送编码巨细胞病毒(CMV)糖蛋白的RNA复制子。“vA160”复制子编码全长糖蛋白H和L(gH/gL)，而“vA322”复制子编码可溶形式(gHsol/gL)。这两种蛋白质在单一复制子中受分离的亚基因组启动子控制；共同给予两种分开的载体(一种编码gH且另一种编码gL)没有获得良好结果。
在第0天、第21天和第42天用表达gH/gL的VRP(1x106IU)、表达gHsol/gL的VRP(1x106IU)和作为对照的PBS对BALB/c小鼠(10/组)双侧肌内免疫接种(50μL/腿)。两个测试组接受制于脂质体(40％DlinDMA、10％DSPC、48％胆固醇、2％PEG-DMG2000；采用方法(D)但用150μg RNA批量规模制成)内的1μgvA160或vA322复制子。
vA160脂质体的Zav(Z均)直径是168nm，pdI(多分散性指数)是0.144，且包封率为87.4％。vA322脂质体的Zav直径是162nm，pdI是0.131，且包封率为90％。
所述复制子都能够从单一载体表达两种蛋白质。
在第63天收集血清供免疫学分析(3wp3)。CMV中和效价(的每孔阳性病毒灶点(virus foci)数量相对于对照减少50％的血清稀释度的倒数)如下：
gH/gL VRP gHsol/gL VRP gH/gL脂质体 gHsol/gL脂质体
4576 2393 4240 10062
因此，通过在上皮细胞上的试验显示，表达CMV gH/gL复合物的全长形式或可溶形式的RNA引发中和抗体的高效价。由经脂质体包封的RNA引发的平均效价至少与对应的VRP等高。
重复试验证实，所述复制子能够从单一载体表达两种蛋白质。相比于VRP获得的效价5516，RNA复制子获得的3wp3效价为11457。
进一步试验采用vA160以外的不同复制子，并且在脂质体中采用较长的PEG。所述vA526复制子表达CMV五聚体复合物(gH-gL-UL128-UL130-UL-131)，该表达受三个亚基因组启动子控制：第一个启动子驱动gH表达；第二个启动子驱动gL表达；第三个启动子驱动UL128-2A-UL130-2A-UL131多聚蛋白的表达，其在三个UL基因间包含两个2A切割位点。所述vA527复制子通过三个亚基因组启动子和两个IRES表达CMV五聚体复合物：第一个亚基因组启动子驱动gH表达；第二个亚基因组启动子驱动gL表达；第三个亚基因组启动子驱动UL128表达；UL130受EMCV IRES控制；UL131受EV71IRES控制。这三种复制子由脂质体(通过方法(H)，采用150μg批量规模；40％DlinDMA、10％DSPC、48％胆固醇、2％PEG DMG5000制备)或由VRP递送。
在第0天、第21天和第42天对BALB/c小鼠(10组10只动物)双侧肌内免疫接种(50μL/腿)给予以下物质：
组1表达gH FL/gL的VRP(1x106IU)
组2五聚体，2A VRP(1x105IU)
组3五聚体，2A VRP(1x106IU)
组4五聚体，IRES VRP(1x105IU)
组5制于脂质体内的自复制RNA vA160(1μg)组6制于脂质体内的自复制RNA vA526(1μg)组7制于脂质体内的自复制RNA vA527(1μg)组8制于阳离子纳米乳液内的RNA vA160(1μg)组9制于阳离子纳米乳液内的自复制RNAvA526(1μg)组10制于阳离子纳米乳液内的自复制RNA vA527(1μg)。在第21天(3wp1)、第42天(3wp2)和第63天(3wp3)收集血清供免疫学分析。
在第21天、第42天和第63天的CMV血清中和效价是：
疫苗组 3wp1 3wp2 3wp3
1 126 6296 26525
2 N/A N/A 6769
3 N/A 3442 7348
4 N/A N/A 2265
5 347 9848 42319
6 179 12210 80000
7 1510 51200 130000
8 N/A N/A 845
9 N/A N/A 228
10 N/A N/A 413
因此，可采用自复制RNA来从单一载体表达多种抗体以产生有力且特异性的免疫应答。所述复制子可表达五种抗原(CMV五聚体复合物(gH-gL-UL128-UL130-UL-131)并产生有力的免疫应答。通过在内皮细胞上的试验显示，在含PEG5000的脂质体内递送自复制RNA能够在所有试验时间点(3wp1、3wp2和3wp3)引发中和抗体的高效价。这些响应高于对应的VRP和阳离子纳米乳液。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，在本发明的范围和构思内可对之进行修改。
表1：有用的磷脂
DDPC1,2-二癸酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DEPA1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸酯
DEPC1,2-芥酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DEPE1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DEPG1,2-二芥酰-sn-甘油-3[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DLOPC1,2-亚麻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DLPA1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸酯
DLPC1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DLPE1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DLPG1,2-二月桂酰-sn-甘油-3[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DLPS1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
DMG1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DMPA1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸酯
DMPC1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DMPE1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DMPG1,2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DMPS1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
DOPA1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸酯
DOPC1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DOPE1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DOPG1,2-二油酰-sn-甘油-3[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DOPS1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
DPPA1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸酯
DPPC1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DPPE1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DPPG1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DPPS1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
DPyPE1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DSPA1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸酯
DSPC1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DSPE1,2-二硬脂酰(Diostearpyl)-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DSPG1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DSPS1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
EPC蛋-PC
HEPC氢化蛋PC
HSPC高纯度氢化大豆PC
HSPC氢化大豆PC
LYSOPC MYRISTIC1-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
LYSOPC PALMITIC1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
LYSOPC STEARIC1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
Milk Sphingomyelin MPPC1-肉豆蔻酰,2-棕榈酰-sn-甘油3-磷脂酰胆碱
MSPC1-肉豆蔻酰,2-硬酯酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
PMPC1-棕榈酰,2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
POPC1-棕榈酰,2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
POPE1-棕榈酰,2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
POPG1,2-二油酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油)...]
PSPC1-棕榈酰,2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
SMPC1-硬脂酰,2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
SOPC1-硬脂酰,2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
SPPC1-硬脂酰,2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
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Claims (12)

1.一种脂质体，所述脂质体中包封有编码感兴趣免疫原的RNA，其中，所述脂质体包含至少一种含聚乙二醇部分的脂质，使聚乙二醇存在于所述脂质体的外部，其中所述聚乙二醇的平均分子量大于3kDa但小于11kDa。
2.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体包含PEG-DMG和/或式(X)的脂质。
3.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体的直径是80～160nm。
4.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体包含具有阳离子头部基团的脂质。
5.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体包含具有两性离子头部基团的脂质。
6.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述RNA是自复制RNA。
7.如权利要求6所述的脂质体，其特征在于，所述自复制RNA分子编码(i)能够从所述自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶，和(ii)免疫原。
8.如权利要求7所述的脂质体，其特征在于，所述RNA分子具有两个开放阅读框，其中第一个开放阅读框编码α病毒复制酶并且其中第二个开放阅读框编码所述免疫原。
9.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述RNA分子长9000～12000个核苷酸。
10.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述免疫原能引发针对细菌、病毒、真菌或寄生虫的体内免疫应答。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含前述权利要求中任一项所述的脂质体。
12.一种在脊椎动物内产生保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述脊椎动物给予有效量的如权利要求1～10所述的脂质体或如权利要求11所述的药物组合物的步骤。
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