JP2014525461A - 免疫原をコードするｒｎａの送達のためのｐｅｇ化リポソーム - Google Patents

Abstract

核酸免疫化は、ＰＥＧ化リポソーム内で被包されたＲＮＡを送達することによって達成される。上記ＲＮＡは、目的の免疫原をコードする。上記ＰＥＧは、３ｋＤａより高いが１１ｋＤａより小さい平均分子量を有する。従って、本発明は、水性コアを被包する脂質二重層を有するリポソームを提供し、ここで：（ｉ）上記脂質二重層は、ポリエチレングリコールがリポソームの外側に存在するように、ポリエチレングリコール部分を含む少なくとも１種の脂質を含み、ここで上記上記ポリエチレングリコールの平均分子量は、３ｋＤａより高いが１１ｋＤａ未満であり；そして（ｉｉ）上記水性コアは、免疫原をコードするＲＮＡを含む。これらリポソームを、上記ＲＮＡを脊椎動物細胞にインビボ送達するために適しているので、それらは、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物における成分として有用である。

Description

本出願は、２０１１年８月３１日に出願された米国仮出願番号第６１／５２９，８７８号の利益を主張し、上記米国仮出願の全容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。

（技術分野）
本発明は、免疫化のためのＲＮＡの非ウイルス性送達の分野にある。

（背景技術）
動物を免疫化するための核酸の送達は、数年間にわたり目標であった。種々のアプローチが、試験されてきており、それらとしては、ＤＮＡもしくはＲＮＡの使用、ウイルスもしくは非ウイルス性送達ビヒクルの使用（またはさらには「裸の」ワクチンにおいて、送達ビヒクルなし）、複製もしくは非複製ベクターの使用、またはウイルスもしくは非ウイルス性ベクターの使用が挙げられる。

さらなる改善された核酸ワクチン、特に、核酸ワクチンの送達の改善された方法への必要性が存在している。

（発明の開示）
本発明によれば、核酸免疫化は、リポソーム内に被包されたＲＮＡを送達することによって達成される。上記ＲＮＡは、目的の免疫原をコードする。上記リポソームは、ＰＥＧ化脂質を含む。すなわち、上記脂質は、ポリエチレングリコールの共有結合によって改変される。ＰＥＧは、都合のよい薬物動態特性を付与し得る被膜を有するリポソームを提供する。例えば、それは、上記リポソームの安定性を増大させ得、かつ非特異的吸着を妨げ得る。本発明者らは、上記ＰＥＧの長さが、被包されたＲＮＡのインビボ発現に影響を及ぼし得ることを見いだしたので、本発明は、３ｋＤａより高いが１１ｋＤａ未満である平均分子量を有するＰＥＧを含むリポソームを使用する。１ｋＤａ未満の分子量（例えば、５００もしくは７５０Ｄａ）を有するＰＥＧは、安定なリポソームを形成せず、１〜３ｋＤａの範囲のＰＥＧで形成されるリポソームは、免疫原性実験においてより低い効力を示した（以下を参照のこと）。

従って、本発明は、目的の免疫原をコードするＲＮＡが被包されているリポソームを提供し、ここで上記リポソームは、ポリエチレングリコールが上記リポソームの外側に存在するようにポリエチレングリコール部分を含む少なくとも１種の脂質を含み、ここで上記ポリエチレングリコールの平均分子量は、３ｋＤａより高いが１１ｋＤａ未満である。これらリポソームは、脊椎動物細胞への上記ＲＮＡのインビボ送達に適しているので、それらは、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物中の成分として有用である。

本発明はまた、ＲＮＡ含有リポソームを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、ＲＮＡと１種以上の脂質とを、上記脂質が、ＲＮＡが中に被包されているリポソームを形成する条件下で混合する工程を包含し、ここで少なくとも１種の脂質は、上記プロセスの間に上記リポソームの外側に位置するようになるポリエチレングリコール部分を含み、上記ポリエチレングリコールの平均分子量が、３ｋＤａより高いが１１ｋＤａ未満である。

（リポソーム）
本発明は、免疫原コードＲＮＡを中に被包しているリポソームを利用する。従って、上記ＲＮＡは、いかなる外部媒体からも分離している（天然ウイルスにおけるように）。上記リポソーム内への被包は、ＲＮＡをＲＮａｓｅ消化から保護することが見いだされた。上記リポソームは、いくらかの外部ＲＮＡを（例えば、それらの表面に）含み得るが、上記ＲＮＡのうちの少なくとも半分（および理想的には、全て）は、上記リポソームのコア中に被包される。リポソーム内への被包は、例えば、参考文献１で開示される脂質／ＲＮＡ複合体とは異なる（ここでは、ＲＮＡは、予め形成されたリポソームと混合される）。

種々の両親媒性脂質は、水性環境中で二重層を形成して、ＲＮＡ含有水性コアをリポソームとして被包し得る。これら脂質は、アニオン性、カチオン性もしくは両性イオン性の親水性ヘッド基（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）を有し得る。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、１９６０年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、１９９０年代以来研究されてきた。あるリン脂質はアニオン性であるのに対して、他のものは両性イオン性であり、そして他のものはカチオン性である。リン脂質の適切なクラスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロール。そしていくつかの有用なリン脂質は、表１に列挙される。有用なカチオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤｌｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。さらに有用なカチオン性脂質は、参考文献２および３に開示されている。両性イオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質。有用な両性イオン性脂質の例は、以下である：ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ドデシルホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１，２−ジフィタノイル（ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）。上記脂質は、飽和であってもよいし、不飽和であってもよい。リポソームを調製するための少なくとも１種の不飽和脂質の使用が好ましい。不飽和脂質が２つのテールを有する場合、両方のテールが不飽和であり得、またはそれは、１つの飽和テールおよび１つの不飽和テールを有し得る。脂質は、例えば、ＲＶ０５におけるように、１つのテールにステロイド基を含み得る。

従って、一実施形態において、本発明は、水性コアを被包する脂質二重層を有するリポソームを提供し、ここで：（ｉ）上記脂質二重層は、ポリエチレングリコールが上記リポソームの外側に存在するように、ポリエチレングリコール部分を含む少なくとも１種の脂質を含み、ここで上記ポリエチレングリコールの平均分子量は、３ｋＤａより高いが１１ｋＤａ未満であり；そして（ｉｉ）上記水性コアは、免疫原をコードするＲＮＡを含む。

本発明のリポソームは、単一の脂質から、または脂質の混合物から形成され得る。混合物は、（ｉ）アニオン性脂質の混合物、（ｉｉ）カチオン性脂質の混合物、（ｉｉｉ）両性イオン性脂質の混合物、（ｉｖ）アニオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、（ｖ）アニオン性脂質と両性イオン性脂質との混合物、（ｉｖ）両性イオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質と、カチオン性脂質と、両性イオン性脂質との混合物を含み得る。同様に、混合物は、飽和脂質および不飽和脂質の両方を含み得る。例えば、混合物は、ＤＳＰＣ（両性イオン性，飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性，不飽和）、および／もしくはＤＭＧ（アニオン性，飽和）を含み得る。脂質の混合物が使用される場合、上記混合物中の成分の脂質の全てが、両親媒性である必要はない（例えば、１種以上の両親媒性脂質が、コレステロールと混合され得る）。

本発明のリポソームが脂質の混合物から形成される場合、本明細書に記載されるようにＰＥＧ化されるそれら脂質の割合が、脂質の全量のうちの１０％未満（例えば、０．５〜５％の間、１〜４％の間、もしくは約２％）であることは、好ましい。例えば、有用なリポソームが以下に示され、総脂質のうちの２％は、ＰＥＧ−ＤＭＧである。その残りは、例えば、コレステロール（例えば、３５〜５０％ コレステロール）および／もしくはカチオン性脂質（例えば、３０〜７０％）および／もしくはＤＳＰＣ（例えば、５〜１５％）から構成され得る。このような混合物は、以下で使用される。これらパーセンテージの値は、モルパーセンテージである。

従って、リポソームは、カチオン性脂質（例えば、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＲＶ０５）、両性イオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣ、ＤＰｙＰＥ）、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質から形成され得る。ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧおよびコレステロールの混合物は、実施例において使用され、いくつかのさらなる混合物もまた同様に使用される。

上記リポソーム内の少なくとも１種の脂質は、ポリエチレングリコール部分を含む。これらＰＥＧ化された脂質を含むリポソームは、上記リポソームの少なくとも外側に存在するように配向されたＰＥＧを有する（しかしある種のＰＥＧはまた、上記リポソームの内側に、すなわち、上記水性コアに曝されてもよい）。この配向は、上記ＰＥＧを、上記脂質のうちの適切な部分に結合させることによって達成され得る。例えば、両親媒性脂質において、上記ＰＥＧは、親水性ヘッド（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｈｅａｄ）に結合される。なぜなら、このヘッドが、上記脂質二重層の、水性に面している外側にそれ自体を配向するからである。この方法でのＰＥＧ化は、脂質へのＰＥＧの共有結合によって、例えば、参考文献４および５に開示されるもののような技術を使用して達成され得る。

従って、上記ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ構造：

を含み、
ここでｎは、３ｋＤａより高いが１１ｋＤａ未満のＰＥＧの分子量（例えば、６９以上、もしくは７０〜２４０の間、または５ｋＤａ ＰＥＧ化に関しては、約１１３）を提供する。

上記ＰＥＧ部分は、−Ｏ−メチル基で終わり得るので、ＰＥＧ化脂質は、以下を含み得る：

脂質のヘッド基における窒素への結合を含め、従って、本発明で有用なＰＥＧ化脂質は、以下を含み得る：

本発明での使用のための１つの適切なＰＥＧ化脂質は、例において使用されるように、ＰＥＧ−ＤＭＧである。他のＰＥＧ化脂質、例えば、式（Ｘ）の脂質：

が使用され得、
ここで：
Ｚは、ＰＥＧならびにポリ（オキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］およびポリ（アミノ酸）に基づくポリマーから選択される親水性ヘッド基成分であり、ここで上記ポリマーは、直鎖状もしくは分枝状であり得、上記ポリマーは、以下で必要に応じて置換され得る；
Ｚは、ｎ個のサブユニットによって重合され；
ｎは、Ｚの１０〜２００ユニットの間での数平均重合度であり（異なるＺ基について最適化され得）；
Ｌ_１は、エーテル（例えば、−Ｏ−）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、スクシネート（例えば、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−））、カルバメート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＲ’−）、カーボネート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−）、ウレア（例えば、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ’−）、アミン（例えば、−ＮＲ’−）、アミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−）、イミン（例えば、−Ｃ（ＮＲ’）−）、チオエーテル（例えば、−Ｓ−）、キサンテート（例えば、−ＯＣ（Ｓ）Ｓ−）、およびホスホジエステル（例えば、−ＯＰ（Ｏ）_２Ｏ−）のうちの０、１もしくは２個を含む、必要に応じて置換されたＣ_１−１０アルキレンもしくはＣ_１−１０ヘテロアルキレンリンカーであり、ここでＲ’は、−Ｈ、−ＮＨ−、−ＮＨ_２、−Ｏ−、−Ｓ−、ホスフェートもしくは必要に応じて置換されたＣ_１−１０アルキレンから独立して選択され；
Ｘ_１およびＸ_２は、炭素または−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−もしくはホスフェートから選択されるヘテロ原子から独立して選択され；
Ａ_１およびＡ_２はいずれも、Ｃ_６−３０アルキル、Ｃ_６−３０アルケニル、およびＣ_６−３０アルキニルから独立して選択され、ここでＡ_１およびＡ_２は、同じであっても異なっていてもよいか、またはＡ_１およびＡ_２は、これらが結合される炭素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたステロイドを形成する。

本発明のリポソームは、代表的には、多くのＰＥＧ部分を含み、これらは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。本発明のリポソームにおけるＰＥＧの平均分子量は、３ｋＤａより高いが１１ｋＤａ未満（例えば、３．５〜９ｋＤａの間、４〜７．５ｋＤａの間、４．５〜６ｋＤａの間、４．８〜５．５ｋＤａの間、もしくは５ｋＤａ）である。従って、上記ＰＥＧは、「ＰＥＧ ５０００」もしくは「ＰＥＧ ５ｋ」として一般に既知のＰＥＧであり得る。いくつかの実施形態において、本発明は、上記ＰＥＧが平均分子量 ８ｋＤａを有するＰＥＧ結合体化脂質を含むリポソームを包含しない；いくつかの実施形態において、本発明は、上記ＰＥＧが平均分子量７．９〜８．１ｋＤａを有するＰＥＧ結合体化脂質を含むリポソームを包含しない。

上記ＰＥＧは、通常、直線状のポリマー鎖を含むが、いくつかの実施形態において、上記ＰＥＧは、分枝状ポリマー鎖を含み得る。

いくつかの実施形態において、上記ＰＥＧは、置換されたＰＥＧ（例えば、ここで上記ポリマーにおける１個以上の炭素原子は、１個以上のアルキル、アルコキシ、アシルもしくはアリール基によって置換される）であり得る。

いくつかの実施形態において、上記ＰＥＧは、ＰＥＧポリプロピレンポリマーを形成するために、コポリマー基（例えば、１個以上のプロピレンモノマー）を含み得る。

ＰＥＧ化の代替として、脂質は、ＰＥＧとは異なる部分の共有結合によって改変され得る。例えば、いくつかの実施形態において、脂質は、ポリホスファゼンを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、ポリ（ビニルピロリドン）を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、ポリ（アクリルアミド）を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、ホスファチジルポリグリセロールを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、ＰＥＧ以外のポリアルキレンエーテルポリマーを含み得る。

リポソームは、通常、３つの群に分けられる：多層小胞（ＭＬＶ）；小さな単層小胞（ＳＵＶ）；および大きな単層小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、各小胞において複数の二重層を有し、いくつかの別個の水性区画を形成する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアを被包する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、代表的には、直径≦５０ｎｍを有し、ＬＵＶは、直径＞５０ｎｍを有する。本発明のリポソームは、理想的には、６０〜１８０ｎｍの範囲、好ましくは、８０〜１６０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。

本発明のリポソームは、複数のリポソームを含む組成物の一部であり得、上記複数のリポソーム中のリポソームは、ある範囲の直径を有し得る。異なる直径を有するリポソームの集団を含む組成物に関して：（ｉ）上記リポソームの数で少なくとも８０％は、６０〜１８０ｎｍの範囲、および好ましくは、８０〜１６０ｎｍの範囲の直径を有するべきであり、そして／または（ｉｉ）上記集団の平均直径（強度で、例えば、Ｚ平均）は、理想的には、６０〜１８０ｎｍの範囲、および好ましくは、８０〜１６０ｎｍの範囲にある。上記複数のリポソーム内の直径は、理想的には、多分散性指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）＜０．２を有するべきである。参考文献１のリポソーム／ＲＮＡ複合体は、６００〜８００ｎｍの範囲の直径を有し、高い多分散性を有すると予測される。

適切なリポソームを調製するための技術は、当該分野で周知である（例えば、参考文献６〜８を参照のこと）。１つの有用な方法は、参考文献９に記載され、（ｉ）脂質のエタノール性溶液、（ｉｉ）核酸の水性溶液、および（ｉｉｉ）緩衝液を混合する工程、それに続く、混合、平衡化、希釈および精製を包含する。好ましい本発明のリポソームは、この混合プロセスによって得られ得る。

所望の直径を有するリポソームを得るために、混合は、水性ＲＮＡ溶液の２つの供給ストリームが、単一の混合ゾーンにおいて、エタノール性の脂質溶液の１つのストリームと、全て同じ流量において、例えば、以下に記載されるとおりのマイクロ流体チャネルにおいて、合わされるプロセスを使用して行われ得る。

（ＲＮＡ）
本発明のリポソームは、免疫原をコードするＲＮＡ分子（参考文献４におけるように、ｓｉＲＮＡとは異なる）を含む。上記粒子のインビボ投与後、ＲＮＡは、上記粒子から放出され、上記免疫原をインサイチュで提供するように、細胞の中で翻訳される。

上記ＲＮＡは、プラス鎖であるので、いかなる介在複製工程（例えば、逆転写）も必要とすることなく、細胞によって翻訳され得る。それはまた、免疫細胞によって発現されるＴＬＲ７レセプターに結合し得、それによって、アジュバント効果を開始する。

好ましいプラス鎖ＲＮＡは、自己複製性である。自己複製ＲＮＡ分子（レプリコン）は、あらゆるタンパク質なしで脊椎動物細胞に送達される場合でも、上記自己複製ＲＮＡ分子自体からの転写によって（上記自己複製ＲＮＡ分子自体から生成するアンチセンスコピーを介して）、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらし得る。自己複製ＲＮＡ分子は、従って、代表的には、細胞へ送達された後に直接翻訳され得るプラス鎖分子であり、この翻訳は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供し、次いで、これは、上記送達されたＲＮＡからアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を生成する。従って、上記送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらす。これら娘ＲＮＡ、ならびに同一線上（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）のサブゲノム転写物は、それ自体が翻訳されて、コードされた免疫原のインサイチュ発現を提供し得るか、または転写されて、上記送達されたＲＮＡと同じセンスのさらなる転写物（上記免疫原のインサイチュ発現を提供するように翻訳される）を提供し得る。この一連の転写の全体的な結果は、上記導入されたレプリコンＲＮＡの数における非常に多くの増幅であり、よって、上記コードされた免疫原は、上記細胞の主なポリペプチド生成物になる。

自己複製を達成するための１つの適切なシステムは、アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを使用することである。これらのプラス鎖レプリコンは、細胞への送達後に翻訳され、レプリカーゼ（もしくはレプリカーゼ−転写酵素）をもたらす。上記レプリカーゼは、上記送達されたプラス鎖ＲＮＡのゲノムマイナス鎖コピーを作り出す複製複合体を提供するように自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらマイナス鎖転写物は、これ自体が、上記プラス鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを与え、そしてまた、免疫原をコードするサブゲノム転写物を与えるように転写され得る。従って、上記サブゲノム転写物の翻訳は、感染した細胞による上記免疫原のインサイチュ発現をもたらす。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビス・ウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用し得る。変異型ウイルスもしくは野生型ウイルスの配列が使用され得る（例えば、ＶＥＥＶの弱毒化ＴＣ８３変異体は、レプリコンにおいて使用されてきた［１０］）。

好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、従って、（ｉ）上記自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）免疫原をコードする。上記ポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ（例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４のうちの１種以上を含む）であり得る。

天然のアルファウイルスゲノムが、上記非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて、構造的ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。従って、好ましい自己複製ＲＮＡは、細胞においてそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの生成をもたらし得るが、ＲＮＡ含有ビリオンの生成はもたらさない。これらのビリオンを生成できないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、上記自己複製ＲＮＡ分子が、感染性形態においてそれ自体を永続させられないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続に必要な上記アルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡには存在せず、それらの位置は、上記目的の免疫原をコードする遺伝子によってしめられている。その結果、上記サブゲノム転写物は、上記構造的アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく、上記免疫原をコードする。

従って、本発明で有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２個のオープンリーディングフレームを有し得る。第１の（５’側）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし；第２の（３’側）オープンリーディングフレームは、免疫原をコードする。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、例えば、さらなる免疫原（以下を参照のこと）をコードするために、もしくは補助ポリペプチドをコードするために、さらなる（例えば、下流の）オープンリーディングフレームを有し得る。

自己複製ＲＮＡ分子は、コードされたレプリカーゼとの適合性の５’配列を有し得る。

自己複製ＲＮＡ分子は、種々の長さを有し得るが、それらは、代表的には、５０００〜２５０００ヌクレオチド長（例えば、８０００〜１５０００ヌクレオチド、もしくは９０００〜１２０００ヌクレオチド）である。従って、上記ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ送達において認められるものより長い。

本発明で有用なＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、７−メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、上記ＲＮＡのインビボ翻訳を増強し得る。

本発明で有用なＲＮＡ分子の上記５’ヌクレオチドは、５’トリホスフェート基を有し得る。キャップされたＲＮＡにおいて、これは、５’から５’への架橋を介して、７−メチルグアノシンに連結され得る。５’トリホスフェートは、ＲＩＧ−Ｉ結合を増強し得るので、アジュバント効果を促進し得る。

ＲＮＡ分子は、３’ポリ−Ａテールを有し得る。それはまた、その３’末端付近にポリ−Ａポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。

本発明で有用なＲＮＡ分子は、代表的には、一本鎖である。一本鎖ＲＮＡは、一般に、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＲＮＡヘリカーゼおよび／もしくはＰＫＲへの結合によって、アジュバント効果を開始し得る。二本鎖形態において送達されるＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＴＬＲ３に結合し得、このレセプターはまた、一本鎖ＲＮＡの複製の間もしくは一本鎖ＲＮＡの二次構造内のいずれかで形成されるｄｓＲＮＡによって駆動（ｔｒｉｇｇｅｒ）され得る。

本発明で有用なＲＮＡ分子は、便宜上、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって調製され得る。ＩＶＴは、細菌においてプラスミド形態において作られ、増やされたか、または合成で作製された（例えば、遺伝子合成および／もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操作法によって）（ｃＤＮＡ）テンプレートを使用し得る。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）は、ＤＮＡテンプレートからＲＮＡを転写するために使用され得る。適切なキャッピングおよびポリＡ付加反応は、必要時に使用され得る（しかし、上記レプリコンのポリＡは、通常、上記ＤＮＡテンプレート内にコードされる）。これらＲＮＡポリメラーゼは、転写される５’ヌクレオチドについてストリンジェントな要件を有し得、いくつかの実施形態において、これらの要件は、上記ＩＶＴ転写ＲＮＡが、自己がコードするレプリカーゼの基質として効率的に機能し得ることを確実にするために、上記コードされたレプリカーゼの要件とマッチしなければならない。

参考文献１１において考察されるように、上記自己複製ＲＮＡは、（任意の５’キャップ構造に加えて）改変された核酸塩基を有する１個以上のヌクレオチドを含み得る。例えば、自己複製ＲＮＡは、１つ以上の改変されたピリミジン核酸塩基（例えば、シュードウリジンおよび／もしくは５−メチルシトシン残基）を含み得る。しかし、いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、改変された核酸塩基を含まず、改変されたヌクレオチドを含まなくてもよい（すなわち、上記ＲＮＡ中のヌクレオチドのすべては、標準的なＡ、Ｃ、ＧおよびＵというリボヌクレオチドである（任意の５’キャップ構造を除く。これは、７’−メチルグアノシンを含み得る））。他の実施形態において、上記ＲＮＡは、７’−メチルグアノシンを含む５’キャップを含み得、最初の１個、２個もしくは３個の５’リボヌクレオチドは、リボースの２’位においてメチル化され得る。

本発明で使用されるＲＮＡは、理想的には、ヌクレオチド間にホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態において、それは、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、および／もしくはメチルホスホネート結合を含み得る。

理想的には、リポソームは、１０より少ない種の異なるＲＮＡ（例えば、５種、４種、３種、もしくは２種の異なる種）を含み；最も好ましくは、リポソームは、単一のＲＮＡ種を含み、すなわち、上記リポソーム中の全てのＲＮＡ分子は、同じ配列および同じ長さを有する。

リポソーム１つあたりのＲＮＡの量は、変動し得る。リポソーム１つあたりの個々の自己複製ＲＮＡ分子の数は、代表的には、リポソーム１つあたり≦５０（例えば、＜２０、＜１０、＜５、もしくは１〜４）である。

（免疫原）
本発明で使用されるＲＮＡ分子は、ポリペプチド免疫原をコードする。上記リポソームの投与後に、上記ＲＮＡは、インビボで翻訳され、上記免疫原はレシピエントにおける免疫応答を誘発し得る。上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対して（あるいは、いくつかの実施形態において、アレルゲンに対して；および他の実施形態において、腫瘍抗原に対して）免疫応答を誘発し得る。上記免疫応答は、抗体応答（通常は、ＩｇＧを含む）および／もしくは細胞媒介性免疫応答を含み得る。上記ポリペプチド免疫原は、代表的には、対応する細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物（またはアレルゲンもしくは腫瘍）ポリペプチドを認識する免疫応答を誘発するが、いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物のサッカリドを認識する免疫応答を誘発するように、ミモトープとして作用し得る。上記免疫原は、代表的には、表面ポリペプチド（例えば、アドヘシン、ヘマグルチニン、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質など）である。

上記ＲＮＡ分子は、単一のポリペプチド免疫原もしくは複数のポリペプチドをコードし得る。複数の免疫原は、単一のポリペプチド免疫原（融合ポリペプチド）として、または別個のポリペプチドとして提示され得る。免疫原が、レプリコンから別個のポリペプチドとして発現される場合、これらのうちの１種以上は、上流のＩＲＥＳもしくはさらなるウイルスプロモーターエレメントと共に提供され得る。あるいは、複数の免疫原は、短い自己触媒性プロテアーゼ（例えば、口蹄疫ウイルス２Ａタンパク質）に融合された個々の免疫原をコードするポリプロテインから、またはインテインとして発現され得る。

参考文献１および１２とは異なり、上記ＲＮＡは、免疫原をコードする。不確かさを避けるために、本発明は、ホタルルシフェラーゼをコードするＲＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼの融合タンパク質をコードするＲＮＡ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡを含まない。このようなポリペプチドは、マーカーとして、またはさらに遺伝子治療の状況においても有用であり得るが、本発明は、免疫学的応答系を誘発するためのＲＮＡの送達に関する。従って、上記免疫原はまた、防御的宿主タンパク質を補充するかもしくはその代わりになる（遺伝子治療におけるように）ように送達される自己タンパク質ではない。また、上記ＲＮＡは、全マウス胸腺ＲＮＡではない。

いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これら細菌のうちの１種に対して免疫応答を誘発する：
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ：有用な免疫原としては、膜タンパク質、例えば、アドヘシン、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、およびＨ因子結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。３種の有用なポリペプチドの組み合わせが、参考文献１３に開示される。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用なポリペプチド免疫原は、参考文献１４に開示される。これらとしては、ＲｒｇＢ線毛サブユニット、β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ前駆体（ｓｐｒ００５７）、ｓｐｒ００９６、一般的なストレスタンパク質（ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＧＳＰ−７８１（ｓｐｒ２０２１、ＳＰ２２１６）、セリン／スレオニンキナーゼＳｔｋＰ（ＳＰ１７３２）、および肺炎球菌表面アドヘシンＰｓａＡが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ：有用な免疫原としては、参考文献１５および１６に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：有用な百日咳免疫原としては、百日咳毒素もしくはトキソイド（ＰＴ）、線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、ペルタクチン、ならびに凝集原２および３が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：有用な免疫原としては、参考文献１７に開示されるポリペプチド（例えば、溶血素、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＢ、フェリクロム結合タンパク質（ｓｔａ００６）および／もしくはｓｔａ０１１リポプロテイン）が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ：代表的な免疫原は、破傷風トキソイドである。

Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ：代表的な免疫原は、ジフテリアトキソイドである。

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ：有用な免疫原としては、参考文献１８および１９に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献１５に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：有用な免疫原としては、ＰｅｐＡ、ＬｃｒＥ、ＡｒｔＪ、ＤｎａＫ、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様、Ｌ７／Ｌ１２、ＯｍｃＡ、ＡｔｏＳ、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ、ＨｔｒＡおよびＭｕｒＧ（例えば、参考文献２０に開示されるとおり）が挙げられるが、これらに限定されない。ＬｃｒＥ［２１］およびＨｔｒＡ［２２］は、２つの好ましい免疫原である。

Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献２３に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ：有用な免疫原としては、ＣａｇＡ、ＶａｃＡ、ＮＡＰ、および／もしくはウレアーゼ［２４］が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：有用な免疫原としては、腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性（ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ ａｄｈｅｒｉｎｇ）Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）および／もしくは腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）に由来する免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。ＥｘＰＥＣ株としては、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）および髄膜炎／敗血症関連Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＮＥＣ）が挙げられる。有用なＵＰＥＣポリペプチド免疫原は、参考文献２５および２６に開示される。有用なＭＮＥＣ免疫原は、参考文献２７に開示される。いくつかのＥ．ｃｏｌｉタイプに有用な免疫原は、ＡｃｆＤである［２８］。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ
Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ：有用な免疫原としては、参考文献２９および３０に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これらウイルスのうちの１種に対して免疫応答を誘発する：
オルソミクソウイルス：有用な免疫原は、インフルエンザＡ、ＢもしくはＣウイルスに由来し得る（例えば、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼもしくはマトリクスＭ２タンパク質）。上記免疫原がインフルエンザＡウイルスヘマグルチニンである場合、それは、任意のサブタイプ（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６）に由来し得る。

パラミクソウイルス科のウイルス：ウイルス免疫原としては、肺炎ウイルス（例えば、ＲＳウイルス、ＲＳＶ）、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザ・ウイルス）、メタニューモウイルスおよびモルビリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

ポックスウイルス科：ウイルス免疫原としては、オルトポックスウイルス（例えば、真正痘瘡（大痘瘡および小痘瘡が挙げられるが、これらに限定されない））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

ピコルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルスおよびアフトウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、上記エンテロウイルスは、ポリオウイルス（例えば、１型、２型、および／もしくは３型のポリオウイルス）である。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、ＥＶ７１エンテロウイルスである。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、コクサッキーＡもしくはＢウイルスである。

ブンヤウイルス：ウイルス免疫原としては、オルソブンヤウイルス（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス（例えば、リフトバレー熱ウイルス）、もしくはナイロウイルス（例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

ヘパルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパルナウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

フィロウイルス：ウイルス免疫原としては、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス（ザイールエボラウイルス、アイボリーコーストエボラウイルス、レストンエボラウイルスもしくはスーダンエボラウイルスを含む））またはマールブルグウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

トガウイルス：ウイルス免疫原としては、トガウイルス（例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、もしくはアルテリウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。これは、風疹ウイルスを含む。

フラビウイルス：ウイルス免疫原としては、フラビウイルス（例えば、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング（１、２、３もしくは４型）ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ウエストナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

ペスチウイルス：ウイルス免疫原としては、ペスチウイルス（例えば、牛ウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、豚コレラ（ＣＳＦＶ）もしくはボーダー病（ＢＤＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

ヘパドナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含み得る。

他の肝炎ウイルス：組成物は、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、もしくはＧ型肝炎ウイルスに由来する免疫原を含み得る。

ラブドウイルス：ウイルス免疫原としては、ラブドウイルス（例えば、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

カリシウイルス科：ウイルス免疫原としては、カリシウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）、およびノーウォーク様ウイルス（例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルス））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

コロナウイルス：ウイルス免疫原は、ＳＡＲＳコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチドであり得る。

レトロウイルス：ウイルス免疫原としては、オンコウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２）またはスプマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

レオウイルス：ウイルス免疫原としては、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、もしくはコルチウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

パルボウイルス：ウイルス免疫原としては、パルボウイルスＢ１９に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

ヘルペスウイルス：ウイルス免疫原としては、ヒトヘルペスウイルス（例えば、例示に過ぎないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

パポバウイルス：ウイルス免疫原としては、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記（ヒト）パピローマウイルスは、血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３もしくは６５のもの（例えば、血清型６、１１、１６および／もしくは１８のうちの１種以上に由来する）であり得る。

アデノウイルス：ウイルス免疫原としては、アデノウイルス血清型３６（Ａｄ−３６）に由来するものが挙げられる。

いくつかの実施形態において、上記免疫原は、魚類に感染するウイルス（例えば：伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、アメリカナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（大西洋サケピコルナ様ウイルスとしても公知）、ヤマメウイルス（ＬＳＶ）、大西洋サケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（ＴＳＤ）、銀ザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、もしくはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ））に対する免疫応答を誘発する。

真菌免疫原は、皮膚糸状菌類（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）（以下が挙げられる：

に由来し得る。

いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅもしくはＰ．ｏｖａｌｅ）に由来する寄生生物に対する免疫応答を誘発する。従って、本発明は、マラリアに対して免疫化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科に由来する寄生生物、特に、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属およびＣａｌｉｇｕｓ属に由来する寄生生物（例えば、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ ｓａｌｍｏｎｉｓもしくはＣａｌｉｇｕｓ ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉのようなウオジラミ（ｓｅａ ｌｉｃｅ））に対する免疫応答を誘発する。

いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下に対する免疫応答を誘発する：花粉アレルゲン（樹木花粉、草本花粉、雑草の花粉、および草の花粉のアレルゲン）；昆虫もしくは蛛形類のアレルゲン（吸入、唾液および毒液のアレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲンおよび小虫アレルゲン、膜翅類毒液アレルゲン（ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ ｖｅｎｏｍ ａｌｌｅｒｇｅｎ））；動物の毛およびふけのアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどに由来する）；ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）。樹木、草および草本に由来する重要な花粉アレルゲンは、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓの分類学上の目およびスズカケノキ科（ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）（カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、シーダー（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない）、Ｐｏａｌｅｓの目（属Ｌｏｌｉｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ、およびＳｏｒｇｈｕｍの草が挙げられる）、ＡｓｔｅｒａｌｅｓおよびＵｒｔｉｃａｌｅｓの目（属Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、およびＰａｒｉｅｔａｒｉａの草本が挙げられる）から由来するそのようなものである。他の重要な吸入アレルゲンは、属ＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓおよびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓのチリダニ類、コナダニ類（ｓｔｏｒａｇｅ ｍｉｔｅ）（例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、ＧｌｙｃｙｐｈａｇｕｓおよびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓ）、ゴキブリ、小虫およびノミに由来するもの（例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、ＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓおよびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ）、ならびに哺乳動物（例えば、ネコ、イヌおよびウマ）に由来するもの、毒液のアレルゲン（刺咬昆虫（ｓｔｉｎｇｉｎｇ ｏｒ ｂｉｔｉｎｇ ｉｎｓｅｃｔ）に由来するようなもの、例えば、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａの分類学上の目（蜂（Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）が挙げられる）が挙げられる）に由来するものである。

いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下から選択される腫瘍抗原である：（ａ）がん−精巣（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ）抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＭＡＧＥファミリーのポリペプチド（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２）、これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用され得る；（ｂ）変異した抗原、例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍（例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん）と関連）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓がんおよび結腸直腸がんと関連）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫と関連）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫と関連）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部がんと関連）、ＣＩＡ ０２０５（例えば、膀胱がんと関連）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、β−カテニン（例えば、黒色腫と関連）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫と関連）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＫＩＡ ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病と関連）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、ＷＴ １（例えば、種々の白血病と関連）、炭酸脱水酵素（例えば、腎がんと関連）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんと関連）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫と関連）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんと関連）、マンマグロビン、α−フェトプロテイン（例えば、肝がんと関連）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガストリン（例えば、膵臓がんおよび胃がんと関連）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳がんおよび卵巣がんと関連）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞がんと関連）、ｐ５３（例えば、乳がん、結腸がんと関連）、ならびにがん胎児性抗原（例えば、乳がん、肺がん、および胃腸管のがん（例えば、結腸直腸がん）と関連）；（ｄ）共通抗原（ｓｈａｒｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫と関連）；（ｅ）前立腺関連抗原（例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２（例えば、前立腺がんと関連））；（ｆ）イムノグロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫と関連）。特定の実施形態において、腫瘍免疫原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バー・ウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原（Ｅ６およびＥ７を含む）、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの抗原、ヒトＴリンパ球向性ウイルス抗原、

（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなど。

（薬学的組成物）
本発明のリポソームは、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物中の成分として有用である。これらの組成物は、代表的には、上記リポソームに加えて、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアの詳細な考察は、参考文献３１において入手可能である。

本発明の薬学的組成物は、１種以上の低分子免疫強化因子を含み得る。例えば、上記組成物は、ＴＬＲ２アゴニスト（例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（例えば、Ｅ６０２０））、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、イミキモド）、ＴＬＲ８アゴニスト（例えば、レシキモド）および／もしくはＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＩＣ３１）を含み得る。任意のこのようなアゴニストは、理想的には、分子量＜２０００Ｄａを有する。いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、上記ＲＮＡと共リポソーム内に被包されるが、他の実施形態において、それらは、被包されない。

本発明の薬学的組成物は、上記リポソームを、ただの水（ｐｌａｉｎ ｗａｔｅｒ）（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）もしくは緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、もしくはクエン酸緩衝液）中に含み得る。緩衝塩は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲において含まれる。

本発明の薬学的組成物は、５．０〜９．５（例えば、６．０〜８．０）のｐＨを有し得る。

本発明の組成物は、張度を与えるために、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌの濃度が代表的である（例えば、約９ｍｇ／ｍｌ）。

本発明の組成物は、金属イオンキレート化剤を含み得る。これらは、ホスホジエステル加水分解を加速し得るイオンを除去することによって、ＲＮＡ安定性を延長し得る。従って、組成物は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ペンテト酸などのうちの１種以上を含み得る。このようなキレート化剤は、代表的には、１０〜５００μＭ（例えば、０．１ｍＭ）で存在する。クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）はまた、キレート化剤として作用し得るのと同時に、有利なことには、緩衝化活性も提供し得る。

本発明の薬学的組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、もしくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の質量オスモル濃度を有し得る。

本発明の薬学的組成物は、１種以上の保存剤（例えば、チオメルサールもしくは２−フェノキシエタノール）を含み得る。水銀非含有組成物が好ましく、保存剤非含有ワクチンが調製され得る。

本発明の薬学的組成物は、好ましくは、無菌である。

本発明の薬学的組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準尺度）、および好ましくは、１用量あたり＜０．１
ＥＵを含む）。

本発明の薬学的組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。

本発明の薬学的組成物は、単位用量形態において調製され得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、０．１〜１．０ｍｌ（例えば、約０．５ｍｌ）の容積を有し得る。

上記組成物は、注射物として調製され得る（溶液もしくは懸濁物のいずれかとして）。上記組成物は、微細スプレーを使用する、肺投与（例えば、吸入器による）のために調製され得る。上記組成物は、鼻、耳もしくは眼への投与（例えば、スプレーもしくは滴剤として）のために調製され得る。筋肉内投与のための注射物が、代表的である。

組成物は、免疫学的に有効量のリポソーム、ならびに任意の他の成分（必要であれば）を含む。「免疫学的に有効な量」とは、個体への投与量が、単一用量においてもしくはシリーズのうちの一部としてのいずれかで、処置もしくは予防に有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康状態および身体的状態、処置されるべき個体の年齢、分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、上記個体が抗体を合成する免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、その処置している医師の医学的状況の評価、および他の関連因子に依存して変動する。上記量は、慣用的な治験を通じて決定され得る比較的広い範囲に入ると予測される。本発明の組成物のリポソームおよびＲＮＡ含有量は、一般に、１用量あたりのＲＮＡの量に関して表される。好ましい用量は、≦１００μｇ ＲＮＡ（例えば、１０〜１００μｇ（例えば、約１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇもしくは１００μｇ））を有する。発現は、遙かに低いレベル（例えば、≦１μｇ／用量、≦１００ｎｇ／用量、≦１０ｎｇ／用量、≦１ｎｇ／用量）においてみられ得るが、０．１μｇの最小用量が好ましい。

本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含む送達デバイス（例えば、シリンジ、ネブライザ、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなど）を提供する。このデバイスは、上記組成物を脊椎動物被験体に投与するために使用され得る。

本発明のリポソームは、リボソームを含まない。

（処置方法および医学的使用）
参考文献１２で開示される粒子とは対照的に、本発明のリポソームおよび薬学的組成物は、目的の免疫原に対する免疫応答を誘発するためのインビボでの使用のためのものである。

本発明は、本発明のリポソームもしくは薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、脊椎動物において免疫応答を惹起するための方法を提供する。上記免疫応答は、好ましくは、防御的であり、好ましくは、抗体および／もしくは細胞媒介性免疫を含む。上記方法は、ブースター応答を惹起し得る。

本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための方法において使用するための本発明のリポソームもしくは薬学的組成物を提供する。

本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明のリポソームの使用を提供する。

これら使用および方法により上記脊椎動物における免疫応答を惹起することによって、上記脊椎動物は、上記で考察されるように、種々の疾患および／もしくは感染から（例えば、細菌疾患および／もしくはウイルス疾患から）防御され得る。上記リポソームおよび組成物は、免疫原性であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従うワクチンは、予防的である（すなわち、感染を妨ぐ）か、もしくは治療的である（すなわち、感染を処置する）のいずれかであり得るが、代表的には、予防的である。

上記脊椎動物は、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトもしくは大型の獣医学的哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ）である。上記ワクチンが予防的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、小児（例えば、幼児もしくは乳児）またはティーンエイジャーである；上記ワクチンが治療的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、ティーンエイジャーもしくは成人である。小児用に意図されたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。

本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。従って、ヒト患者は、１歳未満、５歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院患者、ヘルスケアワーカー、軍隊および軍の職員、妊婦、慢性疾患患者、もしくは免疫不全患者である。しかし、上記ワクチンは、これらの群にのみ適切であるわけではなく、より一般に、集団において使用され得る。

本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射によって達成され得る（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、もしくは組織の間隙空間に；参考文献１とは異なり、舌内（ｉｎｔｒａｇｌｏｓｓａｌ）注射は、代表的には、本発明で使用されない）。代替の送達経路としては、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、口内、舌下、膣、局所、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻内、眼、耳、肺もしくは他の粘膜投与が挙げられる。皮内および筋肉内投与は、２つの好ましい経路である。注射は、針を介してであってもよい（例えば、皮下針）が、針なしの注射が、代わりに使用され得る。代表的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。

本発明は、全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、好ましくは、増強された全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、使用され得る。

投与量は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、一次免疫スケジュールにおいて、および／もしくはブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同じ経路もしくは異なる経路（例えば、非経口の一次と粘膜のブースト、粘膜の一次と非経口のブーストなど）によって与えられ得る。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間間隔を空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。一実施形態において、複数用量は、生後約６週間、１０週間、および１４週間で（例えば、世界保健機関のＥｘｐａｎｄｅｄ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ（「ＥＰＩ」）においてしばしば使用されるように、６週齢、１０週齢および１４週齢において）投与され得る。代替の実施形態において、２回の一次用量が、約２ヶ月間間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター用量が、２回目の一次用量の約６ヶ月から１年後に（例えば、２回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後）投与される。さらなる実施形態において、３回の一次用量が、約２ヶ月間間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター用量が、３回目の一次用量の約６ヶ月後から１年後に（例えば、３回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後）投与される。

式（Ｘ）
式（Ｘ）の化合物は、脂質部分に連結された親水性ポリマーヘッド基成分を含む。それらは、「ステルス脂質（ｓｔｅａｌｔｈ ｌｉｐｉｄ）」として記載され得、それらは以下の式：

を有し、ここで：
Ｚは、ＰＥＧ、ならびにポリ（オキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］およびポリ（アミノ酸）に基づくポリマーから選択される親水性ヘッド基成分であり、ここで上記ポリマーは、直線状であっても分枝状であってもよく、上記ポリマーは、必要に応じて置換され得；
ここでＺは、ｎ個のサブユニットによって重合され；
ｎは、１０〜２００個のＺのユニット間の数平均重合度であり、ここでｎは、異なるポリマータイプのために最適化され；
Ｌ_１は、エーテル（例えば、−Ｏ−）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、スクシネート（例えば、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−））、カルバメート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＲ’−）、カーボネート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−）、ウレア（例えば、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ’−）、アミン（例えば、−ＮＲ’−）、アミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−）、イミン（例えば、−Ｃ（ＮＲ’）−）、チオエーテル（例えば、−Ｓ−）、キサンテート（例えば、−ＯＣ（Ｓ）Ｓ−）、およびホスホジエステル（例えば、−ＯＰ（Ｏ）_２Ｏ−）のうちの０個、１個もしくは２個を含む、必要に応じて置換されたＣ_１−１０アルキレンもしくはＣ_１−１０ヘテロアルキレンリンカーであり、
ここでＲ’は、−Ｈ、−ＮＨ−、−ＮＨ_２、−Ｏ−、−Ｓ−、ホスフェートもしくは必要に応じて置換されたＣ_１−１０アルキレンから独立して選択され；
Ｘ_１およびＸ_２は、炭素、または−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−もしくはホスフェートから選択されるヘテロ原子から独立して選択され；
Ａ_１およびＡ_２は、Ｃ_６−３０アルキル、Ｃ_６−３０アルケニル、およびＣ_６−３０アルキニルから独立して選択され、ここでＡ_１およびＡ_２は、同じであっても異なっていてもよいか、またはＡ_１およびＡ_２は、これらが結合される炭素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたステロイドを形成する。

一実施形態において、式（Ｘ）の化合物は、式（Ｘ’）：

を有し、ここで
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）サブユニットであり、ここで上記ＰＥＧは、直線状であっても分枝状であってもよく；
ｎは、７０〜２４０ユニットのＰＥＧの数平均重合度であり；
Ｌ_１は、エーテル、エステル、スクシネート、カルバメート、カーボネート、ウレア、アミン、アミド、イミン、チオエーテル、キサンテート、およびホスホジエステルのうちの１個もしくは２個を含む、必要に応じて置換されたＣ_１−１０ヘテロアルキレンリンカーであり；
Ｘ_１およびＸ_２は、酸素であり；
Ａ_１およびＡ_２は、Ｃ_６−３０アルキル、Ｃ_６−３０アルケニル、およびＣ_６−３０アルキニルから独立して選択され、ここでＡ_１およびＡ_２は、同じであっても異なっていてもよいか、またはここでＡ_１およびＡ_２は、これらが結合される炭素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたステロイドを形成する。

脂質が式Ｘ’を有する本発明のいくつかの実施形態において、本発明は、ｎが２００ユニットのＰＥＧの数平均重合度である脂質を包含しない。脂質が式Ｘ’を有する他の実施形態において、本発明は、ｎが１９０〜２１０ユニットのＰＥＧの数平均重合度である脂質を包含しない。脂質が式Ｘ’を有する他の実施形態において、本発明は、１５０ユニットのＰＥＧを超えるもしくは１３０ユニットのＰＥＧを超える数平均重合度である脂質を包含しない。脂質が式Ｘ’を有する本発明のいくつかの実施形態において、本発明は、ｎが１０〜２００ユニットのＰＥＧの数平均重合度である脂質を包含しない。いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｘ’を有する脂質を含むリポソームを包含しない。

式（Ｘ）および（Ｘ’）の脂質は、リポソームを形成するためにカチオン性脂質とともに処方される場合、リポソームがインビボで（例えば、血中に）存在し得る時間の長さを増大し得る。それらは、リポソーム表面を保護し得、それによって、血液タンパク質によるオプソニン作用およびマクロファージによる取り込みを低下させ得る。さらなる詳細は、参考文献３２および３３にある。一実施形態において、上記脂質は、ＰＥＧ（ときおり、ポリ（エチレンオキシド）といわれる）、ならびにポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］およびポリ（アミノ酸）に基づくポリマーから選択される基を含む。

本発明での使用に適したＰＥＧ化脂質は、ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロールもしくはポリエチレングリコール−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）結合体（約Ｃ４〜約Ｃ４０の飽和もしくは不飽和炭素原子を独立して含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールもしくはジアルキルグリカミド基を含むものが挙げられる）を含む。上記ジアルキルグリセロールもしくはジアルキルグリカミド基は、１個以上の置換されたアルキル基をさらに含み得る。上記ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（ＮＯＦのカタログ＃ＧＭ−０２０）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイル−グリカミド、およびＰＥＧ−ジステリルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスト−５−エン−３［β］−オキシ）カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［ω］−メチル−ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル（ｄｉｔｅｔｒａｄｅｃｏｘｙｌｂｅｎｚｙｌ）−［ω］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓのカタログ＃８８０２１０Ｐ）から選択され得る。

化学用語および定義
ハロ
用語「ハロゲン」（もしくは「ハロ」）は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を含む。

アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルなど
用語「アルキル」、「アルキレン」、「アルケニル」および「アルキニル」は、直鎖および分枝鎖両方の非環式形態をいうために、本明細書で使用される。その環式アナログは、シクロアルキルなどといわれる。

用語「アルキル」とは、一価の、直線状もしくは分枝状の、飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルキルは、Ｃ_１−１０アルキルであり、別の実施形態において、Ｃ_１−６アルキルであり、別の実施形態において、Ｃ_１−４アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピルもしくはｔ−ブチル基）である。

用語「シクロアルキル」は、一価の飽和環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、シクロアルキルは、Ｃ_３−１０シクロアルキルであり、別の実施形態において、Ｃ_３−６シクロアルキル（例えば、シクロペンチルおよびシクロヘキシル）である。

用語「アルコキシ」は、アルキル−Ｏ−を意味する。

用語「アルケニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有する、および一実施形態において、炭素−炭素三重結合を有しない、一価の、直線状もしくは分枝状の、不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルケニルは、Ｃ_２−１０アルケニルであり、別の実施形態において、Ｃ_２−６アルケニルであり、別の実施形態において、Ｃ_２−４アルケニルである。

用語「シクロアルケニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有する、および一実施形態において、炭素−炭素三重結合を有しない、一価の、部分不飽和の環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、シクロアルケニルは、Ｃ_３−１０シクロアルケニルであり、別の実施形態において、Ｃ_５−１０シクロアルケニル（例えば、シクロヘキセニルもしくはベンゾシクロヘキシル）である。

用語「アルキニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する、および一実施形態において、炭素−炭素二重結合を有しない、一価の、直線状もしくは分枝状の、不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルキニルは、Ｃ_２−１０アルキニルであり、別の実施形態において、Ｃ_２−６アルキニルであり、別の実施形態において、Ｃ_２−４アルキニルである。

用語「シクロアルキニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する、および一実施形態において、炭素−炭素二重結合を有しない、一価の部分不飽和の環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、シクロアルキニルは、Ｃ_３−１０シクロアルケニルであり、別の実施形態において、Ｃ_５−１０シクロアルキニルである。

用語「アルキレン」とは、二価の、直線状もしくは分枝状の飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルキレンは、Ｃ_１−１０アルキレンであり、別の実施形態において、Ｃ_１−６アルキレンであり、別の実施形態において、Ｃ_１−４アルキレン（例えば、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、ｉ−プロピレンもしくはｔ−ブチレン基）である。

用語「アルケニレン」とは、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有する、および一実施形態において、炭素−炭素三重結合を有しない、二価の、直線状もしくは分枝状の不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルケニレンは、Ｃ_２−１０アルケニレンであり、別の実施形態において、Ｃ_２−６アルケニレンであり、別の実施形態において、Ｃ_２−４アルケニレンである。

用語「アルキニレン」とは、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する、および一実施形態において、炭素−炭素二重結合を有しない、二価の、直線状もしくは分枝状の不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルキニレンは、Ｃ_２−１０アルキニレンであり、別の実施形態において、Ｃ_２−６アルキニレンであり、別の実施形態において、Ｃ_２−４アルキニレンである。

ヘテロアルキルなど
用語「ヘテロアルキル」とは、最大６個までの炭素原子、一実施形態において、最大５個までの炭素原子、別の実施形態において、最大４個までの炭素原子、別の実施形態において、最大３個までの炭素原子、別の実施形態において、最大２個までの炭素原子、別の実施形態において、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｑ、Ｎ、Ｐ（Ｏ）_ｒもしくはＳｉ（および好ましくは、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｑもしくはＮ）によって独立して各々置換されるが、ただし、上記アルキル炭素原子のうちの少なくとも１個は残っているアルキル基を含む。上記ヘテロアルキル基は、Ｃ連結もしくはヘテロ連結であり得る（すなわち、それは、炭素原子を介して、またはＯ、Ｓ（Ｏ）_ｑ、Ｎ、Ｐ（Ｏ）_ｒもしくはＳｉを介して上記分子の残りに連結され得る。

用語「ヘテロシクロアルキル」とは、最大６個までの炭素原子、一実施形態において、最大５個までの炭素原子、別の実施形態において、最大４個までの炭素原子、別の実施形態において、最大３個までの炭素原子、別の実施形態において、最大２個までの炭素原子、別の実施形態において、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｑもしくはＮによって独立して各々置換されるが、ただし上記シクロアルキル炭素原子のうちの少なくとも１個が残っているシクロアルキル基を含む。ヘテロシクロアルキル基の例としては、オキシラニル、チアラニル、アジリジニル、オキセタニル、チアタニル、アゼチジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジニル、１，４−ジオキサニル、１，４−オキサチアニル、モルホリニル、１，４−ジチアニル、ピペラジニル、１，４−アザチアニル、オキセパニル、チエパニル、アゼパニル、１，４−ジオキセパニル、１，４−オキサチエパニル、１，４−オキサアゼパニル、１，４−ジチエパニル、１，４−チエアゼパニルおよび１，４−ジアゼパニルが挙げられる。上記ヘテロシクロアルキル基は、Ｃ連結もしくはＮ連結され得る。すなわち、それは、炭素原子を介して、もしくは窒素原子を介して、上記分子の残りに連結され得る。

用語「ヘテロアルケニル」とは、最大３個までの炭素原子、一実施形態において、最大２個までの炭素原子、別の実施形態において、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｑもしくはＮによって独立して各々置換されるが、ただし上記アルケニル炭素原子のうちの少なくとも１個が残っているアルケニル基を含む。上記ヘテロアルケニル基は、Ｃ連結もしくはヘテロ連結であり得る。すなわち、それは、炭素原子を介して、またはＯ、Ｓ（Ｏ）_ｑもしくはＮを介して、上記分子の残りに連結され得る。

用語「ヘテロシクロアルケニル」とは、最大３個までの炭素原子、一実施形態において、最大２個までの炭素原子、別の実施形態において、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｑもしくはＮによって独立して各々置換されるが、ただし上記シクロアルケニル炭素原子のうちの少なくとも１個が残っているシクロアルケニル基を含む。ヘテロシクロアルケニル基の例としては、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、５−６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、２Ｈ−ピラニル、１，２，３，４−テトラヒドロピリジニルおよび１，２，５，６−テトラヒドロピリジニルが挙げられる。上記ヘテロシクロアルケニル基は、Ｃ連結もしくはＮ連結であり得る。すなわち、それは、炭素原子を介して、もしくは窒素原子を介して、上記分子の残りに連結され得る。

用語「ヘテロアルキニル」とは、最大３個までの炭素原子、一実施形態において、最大２個までの炭素原子、別の実施形態において、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｑもしくはＮによって独立して各々置換されるが、ただし上記アルキニル炭素原子のうちの少なくとも１個が残っているアルキニル基を含む。上記ヘテロアルキニル基は、Ｃ連結もしくはヘテロ連結であり得る。すなわち、それは、炭素原子を介して、またはＯ、Ｓ（Ｏ）_ｑもしくはＮを介して、上記分子の残りに連結され得る。

用語「ヘテロシクロアルキニル」とは、最大３個までの炭素原子、一実施形態において、最大２個までの炭素原子、別の実施形態において、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｑもしくはＮによって独立して各々置換されるが、ただし上記シクロアルキニル炭素原子のうちの少なくとも１個が残っているシクロアルキニル基を含む。上記ヘテロシクロアルケニル基は、Ｃ連結もしくはＮ連結であり得る。すなわち、それは、炭素原子を介して、もしくは窒素原子を介して、上記分子の残りに連結され得る。

用語「ヘテロアルキレン」とは、最大３個までの炭素原子、一実施形態において、最大２個までの炭素原子、別の実施形態において、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｑもしくはＮによって独立して各々置換されるが、ただし上記アルキレン炭素原子のうちの少なくとも１個が残っているアルキレン基を含む。

用語「ヘテロアルケニレン」とは、最大３個までの炭素原子、一実施形態において、最大２個までの炭素原子、別の実施形態において、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｑもしくはＮによって独立して各々置換されるが、上記アルケニレン炭素原子のうちの少なくとも１個が残っているアルケニレン基を含む。

用語「ヘテロアルキニレン」とは、最大３個までの炭素原子、一実施形態において、最大２個までの炭素原子、別の実施形態において、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｑもしくはＮによって独立して各々置換されるが、ただし上記アルキニレン炭素原子のうちの少なくとも１個が残っているアルキニレン基を含む。

アリール
用語「アリール」とは、一価の、芳香族の環式ヒドロカルビル基（例えば、フェニルもしくはナフチル（例えば、１−ナフチルもしくは２−ナフチル））を含む。一般に、上記アリール基は、単環式もしくは多環式の縮合環芳香族基であり得る。好ましいアリールは、Ｃ_６−Ｃ_１４アリールである。

アリール基の他の例は、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インデン、ナフタレン、オバレン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレンおよびルビセンの一価誘導体である。

用語「アリールアルキル」とは、アリール基、例えば、ベンジルで置換されたアルキルを意味する。

用語「アリーレン」とは、二価の芳香族環式ヒドロカルビル基（例えば、フェニレン）を含む。一般に、上記アリーレン基は、単環式もしくは多環式の縮合環芳香族基であり得る。好ましいアリーレンは、Ｃ_６−Ｃ_１４アリーレンである。アリーレン基の他の例は、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インデン、ナフタレン、オバレン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレンおよびルビセンの二価誘導体である。

ヘテロアリール
用語「ヘテロアリール」とは、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＮＲ^Ｎ（ここでＲ^Ｎは、以下で定義され（そして一実施形態において、Ｈもしくはアルキル（例えば、Ｃ_１−６アルキル）である））から独立して選択される１個以上のヘテロ原子をさらに含む、一価のヘテロ芳香族の環式ヒドロカルビル基を含む。

一般に、上記ヘテロアリール基は、単環式もしくは多環式の（例えば、二環式の）縮合環ヘテロ芳香族基であり得る。一実施形態において、ヘテロアリール基は、５〜１３個の環員（好ましくは、５〜１０員）ならびにＯ、Ｓ、ＮおよびＮＲ^Ｎから独立して選択される１個、２個、３個もしくは４個の環ヘテロ原子を含む。一実施形態において、ヘテロアリール基は、５員、６員、９員もしくは１０員の、例えば、５員の単環式、６員の単環式、９員の縮合環二環式もしくは１０員の縮合環二環式であり得る。

単環式ヘテロ芳香族基は、５〜６個の環員およびＯ、Ｓ、ＮもしくはＮＲ^Ｎから選択される１個、２個、３個もしくは４個のヘテロ原子を含むヘテロ芳香族基を含む。

一実施形態において、５員の単環式ヘテロアリール基は、−ＮＲ^Ｎ−基、−Ｏ−原子もしくは−Ｓ−原子である１個の環員、ならびに必要に応じて、＝Ｎ−原子である１〜３個の環員（例えば、１個もしくは２個の環員）（上記５個の環員のうちの残りは、炭素原子である）を含む。

５員の単環式ヘテロアリール基の例は、ピロリル、フラニル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、１，２，３ トリアゾリル、１，２，４ トリアゾリル、１，２，３ オキサジアゾリル、１，２，４ オキサジアゾリル、１，２，５ オキサジアゾリル、１，３，４ オキサジアゾリル、１，３，４ チアジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、１，３，５ トリアジニル、１，２，４ トリアジニル、１，２，３ トリアジニルおよびテトラゾリルである。

６員の単環式ヘテロアリール基の例は、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニルおよびピラジニルである。

一実施形態において、６員の単環式ヘテロアリール基は、＝Ｎ−原子である１個もしくは２個の環員（ここで上記６個の環員の残りは、炭素原子である）を含む。

二環式ヘテロ芳香族基は、９〜１３個の環員およびＯ、Ｓ、ＮもしくはＮＲ^Ｎから選択される１個、２個、３個、４個以上のヘテロ原子を含む縮合環ヘテロ芳香族基を含む。

一実施形態において、９員の二環式ヘテロアリール基は、−ＮＲ^Ｎ−基、−Ｏ−原子もしくは−Ｓ−原子である１個の環員、および必要に応じて、＝Ｎ−原子である１〜３個の環員（例えば、１個もしくは２個の環員）（ここで上記９個の環員の残りは、炭素原子である）を含む。

９員の縮合環二環式ヘテロアリール基の例は、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニル、ピロロ［２，３−ｃ］ピリジニル、ピロロ［３，２−ｃ］ピリジニル、ピロロ［３，２−ｂ］ピリジニル、イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジニル、イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジニル、ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリジニル、ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジニル、ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジニル、ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジニル、イソインドリル、インダゾリル、プリニル、インドリニニル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、イミダゾ［１，５−ａ］ピリジニル、ピラゾロ［１，２−ａ］ピリジニル、ピロロ［１，２−ｂ］ピリダジニルおよびイミダゾ［１，２−ｃ］ピリミジニルである。

一実施形態において、１０員の二環式ヘテロアリール基は、＝Ｎ−原子である１〜３個の環員（ここで上記１０個の環員の残りは、炭素原子である）を含む。

１０員の縮合環二環式ヘテロアリール基の例は、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、１，６−ナフチリジニル、１，７−ナフチリジニル、１，８−ナフチリジニル、１，５−ナフチリジニル、２，６−ナフチリジニル、２，７−ナフチリジニル、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジニル、ピリド［４，３−ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピリド［２，３−ｄ］ピリミジニル、ピリド［２，３−ｂ］ピラジニル、ピリド［３，４−ｂ］ピラジニル、ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジニル、ピラジノ［２，３−ｂ］ピラジニルおよびピリミド［４，５−ｄ］ピリミジニルである。

用語「ヘテロアリールアルキル」とは、ヘテロアリール基で置換されたアルキルを意味する。

用語「ヘテロアリーレン」とは、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＮＲ^Ｎ（ここでＲ^Ｎは、以下で定義される（および一実施形態において、Ｈもしくはアルキル（例えば、Ｃ_１−６アルキル）である））から独立して選択される１個以上のヘテロ原子をさらに含む、二価のヘテロ芳香族環式ヒドロカルビル基を含む。一般に、上記ヘテロアリーレン基は、単環式もしくは多環式（例えば、二環式）の縮合環ヘテロ芳香族基であり得る。一実施形態において、ヘテロアリーレン基は、５〜１３個の環員（好ましくは、５〜１０員）ならびにＯ、Ｓ、ＮおよびＮＲ^Ｎから独立して選択される１個、２個、３個もしくは４個の環ヘテロ原子を含む。一実施形態において、ヘテロアリーレン基は、５員、６員、９員もしくは１０員の（例えば、５員の単環式、６員の単環式、９員の縮合環二環式もしくは１０員の縮合環二環式）であり得る。用語「ヘテロアリーレン」とは、上記で考察されるヘテロアリール基の各々の二価誘導体を含む。

用語「アリール」、「芳香族」、「ヘテロアリール」および「ヘテロ芳香族」はまた、部分的に還元された基を含む。従って、例えば、「ヘテロアリール」は、上記環のうちの１個が飽和環に還元された縮合種（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）を含む。

一般
別段明確に示されなければ、基の組み合わせが１つの部分（例えば、アリールアルキル）として本明細書で言及される場合、最後の言及された基は、上記部分が上記分子の残りに結合される原子を含む。

Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｑ、ＮもしくはＰ（Ｏ）_ｒによって置換されるアルキル基もしくは他の基の炭素原子に対して言及がなされる場合、意図されるものは、以下である：

−ＣＨ＝は、−Ｎ＝もしくは−Ｐ（Ｏ）_ｒ＝によって置換されるか；
≡Ｃ−Ｈは、≡Ｎもしくは≡Ｐ（Ｏ）_ｒによって置換されるか；または
−ＣＨ_２−は、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）_ｑ−、−ＮＲ^Ｎ−もしくは−Ｐ（Ｏ）_ｒＲ^Ｎ−によって置換され、ここでＲ^Ｎは、Ｈ、あるいは必要に応じて置換されたＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６ヘテロアルキル、Ｃ_３−６シクロアルキル、Ｃ_３−６ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６ヘテロアルケニル、Ｃ_３−６シクロアルケニル、Ｃ_３−６ヘテロシクロアルケニル、フェニル、または５個もしくは６個の環員を含むヘテロアリールである。Ｒ^Ｎは、好ましくは、Ｈ、Ｃ_１−６アルキルもしくはＣ_３−６シクロアルキルである。

ｑは、独立して、０、１もしくは２である。一実施形態において、ｑは、０である。

ｒは、独立して、０もしくは１である。一実施形態において、ｒは、０である。

Ｓｉによって置換される炭素原子に対して言及がなされる場合、意図されるものは、上記炭素原子がケイ素原子と交換されるが、結合が別の点で同じままであることである。従って、例えば、−ＣＨ_２−は、−ＳｉＨ_２−によって置換され；−ＣＨ＝は、−ＳｉＨ＝によって置換され；そして≡Ｃ−Ｈは、≡Ｓｉ−Ｈによって置換される。

明瞭化によって、上記のヘテロ原子含有基（例えば、ヘテロアルキルなど）に関連して、炭素原子の数字が与えられる場合（例えば、Ｃ_３−６ヘテロアルキル）、意図されるものは、上記３〜６個の鎖炭素原子のうちの１個以上がＯ、Ｓ（Ｏ）_ｑもしくはＮによって置換されるＣ_３−６アルキルに基づく基である。よって、Ｃ_３−６ヘテロアルキル基は、例えば、３〜６個未満の鎖炭素原子を含む。別の例として、ピリジル基は、５個の炭素原子を含むとしても、Ｃ_６ヘテロアリール基として分類される。

置換
本発明の化合物の基（例えば、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンアリール、アリールアルキル、アリールヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキルもしくはヘテロアリールヘテロアルキル基など）は、置換されていても置換されていなくてもよく、一実施形態においては、置換されていない。代表的には、置換は、水素原子を置換基で概念的に置換すること、または＝Ｏによる置換の場合には、２個の水素原子を概念的に置換することを含む。

置換される場合、一般に、各基上に１〜５個の置換基があり、一実施形態において、１〜３個の置換基、一実施形態において、１個もしくは２個の置換基、一実施形態において、１個の置換基がある。一実施形態は、同じ原子上に１個より多くの置換基、例えば、アセタール基を含む。

一実施形態において、上記置換基は、独立して、Ｓｕｂ^１もしくはＳｕｂ^２（一実施形態において、Ｓｕｂ^２）であり、ここで：
Ｓｕｂ^１は、独立して、ハロゲン、トリハロメチル、トリハロエチル、−ＮＯ_２、−ＣＮ、−Ｎ^＋（Ｒ^ｓ）_２Ｏ⁻、−ＣＯ_２Ｈ、−ＣＯ_２Ｒ^ｓ、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯＲ^ｓ、−ＳＯ_２Ｒ^ｓ、−ＳＯ_３Ｒ^ｓ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ^ｓ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｓ，−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｓ，＝Ｏ、−ＮＲ^ｓ _２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｓ _２、−Ｎ（Ｒ^ｓ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｓ、−Ｎ（Ｒ^ｓ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｓ _２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｓ _２、−Ｎ（Ｒ^ｓ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｓ、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ^ｓ _２、−ＮＲ^ｓＣ（＝Ｓ）Ｒ^ｓ、−ＳＯ_２ＮＲ^ｓ _２、−ＮＲ^ｓＳＯ_２Ｒ^ｓ、−Ｎ（Ｒ^ｓ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ^ｓ _２、−Ｎ（Ｒ^ｓ）ＳＯ_２ＮＲ^ｓ _２、−Ｒ^ｓもしくは−Ｚ^ｓＲ^ｓであり、ここで；
Ｚ^ｓは、独立して、Ｏ、ＳもしくはＮＲ^ｓであり；
Ｒ^ｓは、独立して、ＨまたはＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６ヘテロアルキル、−（Ａｌｋ^ａ）_ｆ−Ｃ_３−６シクロアルキル、−（Ａｌｋ^ａ）_ｆ−Ｃ_３−６ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６ヘテロアルケニル、−（Ａｌｋ^ａ）_ｆ−Ｃ_３−６シクロアルケニル、−（Ａｌｋ^ａ）_ｆ−Ｃ_３−６ヘテロシクロアルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、Ｃ_２−６ヘテロアルキニル、−（Ａｌｋ^ａ）_ｆ−Ｃ_６−１４アリール、−（Ａｌｋ^ａ）_ｆ−Ｃ_６−１４アリールもしくは−（Ａｌｋ^ａ）_ｆ−ヘテロアリール（ここでヘテロアリールは、５〜１３個の環員を含む）であり、ここで
ｆは、０もしくは１であり；
Ａｌｋ^ａは、Ｃ_１−６アルキレンもしくはＣ_１−６ヘテロアルキレンであり；そして
Ｒ^ｓは、それ自体、１〜３個の置換基Ｓｕｂ^２によって必要に応じて置換され（一実施形態においては、置換されない）、
Ｓｕｂ^２は、独立して、ハロゲン、トリハロメチル、トリハロエチル、−ＮＯ_２、−ＣＮ、−Ｎ^＋（Ｃ_１−６アルキル）_２Ｏ⁻、−ＣＯ_２Ｈ、−ＣＯ_２Ｃ_１−６アルキル、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯＣ_１−６アルキル、−ＳＯ_２Ｃ_１−６アルキル、−ＳＯ_３Ｃ_１−６アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＣ_１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ_１−６アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ_１−６アルキル、＝Ｏ、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ_１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｓ）Ｃ_１−６アルキル、−ＳＯ_２Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）ＳＯ_２Ｃ_１−６アルキル、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）ＳＯ_２Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ_１−６ヘテロアルキル、−Ｃ_３−６シクロアルキル、−Ｃ_３−６ヘテロシクロアルキル、−Ｃ_２−６アルケニル、−Ｃ_２−６ヘテロアルケニル、−Ｃ_３−６シクロアルケニル、−Ｃ_３−６ヘテロシクロアルケニル、−Ｃ_２−６アルキニル、−Ｃ_２−６ヘテロアルキニル、−Ｃ_{６−１４-}アリール、−Ｃ_５−１３ヘテロアリール、−Ｚ^ｔ−Ｃ_１−６アルキル、−Ｚ^ｔ−Ｃ_３−６シクロアルキル、−Ｚ^ｔ−Ｃ_２−６アルケニル、−Ｚ^ｔ−Ｃ_３−６シクロアルケニル、もしくは−Ｚ^ｔ−Ｃ_２−６アルキニルであり；そして
Ｚ^ｔは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨもしくはＮ（Ｃ_１−６アルキル）である。

Ｓｕｂ^１におけるＲ^ｓが、１〜３個の置換基Ｓｕｂ^２によって必要に応じて置換される場合、Ｓｕｂ^２は、置換されていない。しかし、一実施形態において、Ｒ^ｓは、置換されていない。

一実施形態において、Ｒ^ｓは、ＨもしくはＣ_１−６アルキルであり、必要に応じて、１〜３個の置換基Ｓｕｂ^２によって置換される。

一実施形態において、Ｓｕｂ^２は、独立して、ハロゲン、トリハロメチル、トリハロエチル、−ＮＯ_２、−ＣＮ、−Ｎ^＋（Ｃ_１−６アルキル）_２Ｏ⁻、−ＣＯ_２Ｈ、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯＣ_１−６アルキル、−ＳＯ_２Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ_１−６アルキル、＝Ｏ、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、−Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ_３−６シクロアルキル、−Ｃ_３−６ヘテロシクロアルキル、−Ｚ^ｔ−Ｃ_１−６アルキルもしくは−Ｚ^ｔ−Ｃ_３−６シクロアルキルである。

一実施形態において、上記置換された基が、非環式（例えば、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニルなど）である場合、Ｓｕｂ^１は−Ｒ^ｓでなく、かつＳｕｂ^２は、−Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ_１−６ヘテロアルキル、−Ｃ_２−６アルケニル、−Ｃ_２−６ヘテロアルケニル、−Ｃ_２−６アルキニルもしくは−Ｃ_２−６ヘテロアルキニルでない。

Ｓｕｂ^２以外の基が置換され得る少なくとも２つの位置を有する場合、上記基は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンもしくはヘテロアルキニレン鎖（一実施形態において、１〜６個の原子を含み、さらなる実施形態において、３〜６個の原子、およびさらなる実施形態において、３個もしくは４個の原子を含む）の両端によって置換されて、環式部分を形成し得る。その鎖は、１〜３個の置換基Ｓｕｂ^２によって必要に応じて置換される。一実施形態において、その鎖は、置換されない。従って、用語、必要に応じて置換された「シクロアルキル」、「シクロアルケニル」、「シクロアルキニル」、「ヘテロシクロアルキル」、「ヘテロシクロアルケニル」、「ヘテロシクロアルキニル」、「アリール」および「ヘテロアリール」は、縮合種を含む。例えば、「必要に応じて置換されたシクロアルキル」は、２個のシクロアルキル環が縮合される種を含み、「必要に応じて置換されたヘテロアリール」は、ヘテロシクロアルキル環が芳香族環に縮合される種（例えば、５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）を含む。

Ｓｕｂ^２以外の基が、２回置換され得る原子を有する場合、その原子は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンもしくはヘテロアルキニレン鎖（一実施形態において、２〜８個の原子、さらなる実施形態において、３〜６個の原子、およびさらなる実施形態において４個もしくは５個の原子を含む）の両方の末端によって置換されて、環式部分を形成し得る。その鎖は、必要に応じて、１〜３個の置換基Ｓｕｂ^２によって置換される。一実施形態において、その鎖は、置換されない。従って、用語必要に応じて置換された「シクロアルキル」、「シクロアルケニル」、「シクロアルキニル」、「ヘテロシクロアルキル」、「ヘテロシクロアルケニル」、「ヘテロシクロアルキニル」、「アリール」および「ヘテロアリール」とは、スピロ種を含む。

明瞭化によって、基がヘテロ原子を有する場合、置換基は、上記ヘテロ原子に結合され得る。従って、例えば、「必要に応じて置換されたヘテロアルキル」は、−ＣＨ_２−Ｎ（Ｓｕｂ^１）−ＣＨ_２−、−ＣＨ（Ｓｕｂ^１）−ＮＨ−ＣＨ_２−および−ＣＨ（Ｓｕｂ^１）−Ｎ（Ｓｕｂ^１）−ＣＨ_２−等を含む。

修飾子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）用語
列挙の前に修飾子がある場合、上記修飾子が、上記列挙中の項目の各々に適用されると理解されるべきであることが意図される。例えば、語句「必要に応じて置換されたＣ_３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ_３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ_３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ_５−２０−ヘテロアリール基」とは、上記列挙中の４個の項目の各々（すなわち、上記Ｃ_３−２０−ヘテロシクロアルキル基、上記Ｃ_３−２０−ヘテロシクロアルケニル基、上記Ｃ_３−２０−ヘテロシクロアルキニル基および上記Ｃ_６−２０−ヘテロアリール基）が、必要に応じて置換され得ることを意味する。

基が、第１の修飾子によって特徴付けられ、次いで、その後、その同じ基が次の修飾子によって特徴付けられる場合、意味されることは、上記基が、両方の修飾子によって同時に特徴付けられることである。例えば、基が、「Ｃ_３−２０−ヘテロシクロアルキニル」（第１の修飾子）基として記載され、次に、その同じ基が「Ｃ_５−１６」（次の修飾子）基として記載される場合、意味されることは、Ｃ_５−１６ヘテロシクロアルキニル基である。

ステロイド
本明細書で使用される場合、用語「ステロイド」とは、以下の構造（その構造は、「ステロイド骨格」と本明細書でいわれる）：

を含む任意の基をいう。

純粋に例示目的で、上記ステロイド骨格は、完全に飽和として上記で記載した。しかし、用語ステロイドはまた、上記ステロイド骨格中に不飽和が存在する場合を網羅すると意図される。例えば、用語ステロイドは、完全に不飽和の（マンキュード）基本骨格、１５Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン：

を含む基を網羅する。

用語ステロイドはまた、部分不飽和のステロイド骨格を含む基を網羅する。

用語ステロイドはまた、上記ステロイド骨格の「セコ」誘導体、すなわち、環切断がもたらされた基；環の縮小および拡大をそれぞれ含む上記ステロイド骨格の「ノル」および「ホモ」誘導体（Ｄ．ＨｅｌｌｗｉｎｋｅｌによるＳｙｓｔｅｍｉｃ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒによって刊行、２００１、ＩＳＢＮ：３−５４０−４１１３８−０、「セコ」については２０３頁、ならびに「ノル」および「ホモ」については２０４頁を参照のこと）を網羅する。しかし、一実施形態において、このようなセコ誘導体は、用語「ステロイド」によって包含されない。別の実施形態において、このようなノル誘導体は、用語「ステロイド」によって包含されない。別の実施形態において、このようなホモ誘導体は、用語「ステロイド」によって包含されない。従って、一実施形態において、このようなセコ、ノルおよびホモ誘導体は、用語「ステロイド」によって包含されない。

用語ステロイドはまた、ステロイド骨格と表示された上記構造中の炭素原子のうちの１個以上が、ヘテロ原子によって置換される例を網羅する。１つのこのような実施形態において、最大６個までの炭素原子、一実施形態において、最大５個までの炭素原子、別の実施形態において、最大４個までの炭素原子、別の実施形態において、最大３個までの炭素原子、別の実施形態において、最大２個までの炭素原子、別の実施形態において、１個の炭素原子は、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｑ、Ｎ、Ｐ（Ｏ）_ｒもしくはＳｉ（および好ましくは、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｑもしくはＮ）によって独立して各々置換される。しかし、一実施形態において、用語「ステロイド」は、上記「ステロイド基本骨格」がヘテロ原子を含まない種を包含する。

ステロイド環系は、以下に示される慣例に従って番号付けされる：

用語ステロイドは、ステロール、ステロイドホルモン、胆汁酸および胆汁酸の塩を包含する。ステロールは、Ａ環の３位においてヒドロキシル基を有する任意のステロイドである。

不飽和
標準的使用によれば、ω−３位は、上記鎖の（メチル）末端から３番目の結合をいう；ω−６位とは、上記鎖の（メチル）末端から６番目の結合をいい、ω−９位とは、上記鎖の（メチル）末端から９番目の結合をいう。

一般
本発明の実施は、別段示されなければ、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の当該分野の技術範囲内の従来の方法を使用する。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、参考文献３４〜４０などを参照のこと。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから専らなってもよいし、何かさらなるものを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

数値ｘに関して用語「約」とは、選択的であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。

語「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。必要な場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。

電荷、カチオン、アニオン、両性イオンなどへの言及は、ｐＨ７において取り扱われる。

ＴＬＲ３は、Ｔｏｌｌ様レセプター３である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ３アゴニストは、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。「ＴＬＲ３」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１１８４９である。ヒトＴＬＲ３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２４５９６２５である。

ＴＬＲ７は、Ｔｏｌｌ様レセプター７である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ７アゴニストは、例えば、イミキモドを含む。「ＴＬＲ７」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３１である。ヒトＴＬＲ７遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：６７９４４６３８である。

ＴＬＲ８は、Ｔｏｌｌ様レセプター８である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ８アゴニストは、例えば、レシキモドを含む。「ＴＬＲ８」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３２である。ヒトＴＬＲ８遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０３０２１６５である。

ＲＩＧ−Ｉ様レセプター（「ＲＬＲ」）ファミリーは、先天的免疫系において重要な役割を果たす種々のＲＮＡヘリカーゼを含む［４１］。ＲＬＲ−１（ＲＩＧ−Ｉもしくはレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉとしても公知）は、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。上記ＲＬＲ−１ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＤＤＸ５８」（ＤＥＡＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）ボックスポリペプチド５８（ＤＥＡＤ （Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ） ｂｏｘ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ５８）について）であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１９１０２である。ヒトＲＬＲ−１遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：７７７３２５１４である。ＲＬＲ−２（ＭＤＡ５もしくは黒色腫分化関連遺伝子５（ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ５）としても公知）はまた、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。ＲＬＲ−２ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＩＦＩＨ１」（ヘリカーゼＣドメイン１で誘導されるインターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｌｉｃａｓｅ Ｃ ｄｏｍａｉｎ １）について）であり、特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１８８７３である。ヒトＲＬＲ−２遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２７８８６５６７である。ＲＬＲ−３（ＬＧＰ２もしくは遺伝学および生理学研究室２（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２）としても公知）は、カスパーゼリクルートドメインを有さない。ＲＬＲ−３ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＤＨＸ５８」（ＤＥＸＨ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｈｉｓ）ボックスポリペプチド５８について）であり、特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：２９５１７である。ヒトＲＬＲ−３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：１４９４０８１２１である。

ＰＫＲは、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼである。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす。「ＥＩＦ２ＡＫ２」（真核生物翻訳開始因子２−αキナーゼ２（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ａｌｐｈａ ｋｉｎａｓｅ ２）について）は、この酵素をコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：９４３７である。ヒトＰＫＲ遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０８４３１８２５である。

図１は、染色されたＲＮＡを有するゲルを示す。レーンは、（１）マーカー、（２）裸のレプリコン、（３）ＲＮａｓｅ処理後のレプリコン、（４）リポソームに被包されたレプリコン、（５）ＲＮａｓｅ処理後のリポソーム、（６）ＲＮａｓｅで処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出に供したリポソーム、を示す。 図２は、染色されたＲＮＡを有するゲルを示す。レーンは、（１）マーカー、（２）裸のレプリコン、（３）リポソームに被包されたレプリコン、（４）ＲＮａｓｅで処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出に供したリポソーム、を示す。 図３は、異なる長さのＰＥＧを有するリポソーム中のＲＮＡを送達した後、１日目、３日目および６日目のタンパク質発現（相対的光単位、ＲＬＵとして）を示す：１ｋＤａ（三角）；２ｋＤａ（丸）；３ｋＤａ（四角）。 図４は、ビリオンパッケージされたレプリコン（四角）として、裸のＲＮＡ（菱形）として、もしくはリポソーム（＋＝０．１μｇ、ｘ＝１μｇ）中で、ＲＮＡの送達後、１日目、３日目および６日目のタンパク質発現を示す。 図５は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｌｏｇ_１０ Ｆ特異的ＩｇＧ力価を示す。その５群は、左から右に、１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、５ｋＤａもしくは１０ｋＤａのＰＥＧ長を有した。丸は、１回の注射の２週間後の力価を示す；三角は、２回目の注射の２週間後の力価を示す；バーは、２つの力価の平均を示す。

ＲＮＡレプリコン
種々のレプリコンは、以下で使用される。一般に、これらは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に由来する非構造タンパク質、ＶＥＥＶ由来のパッケージングシグナル、およびシンドビス・ウイルスもしくはＶＥＥＶ変異体に由来する３’ＵＴＲを有するハイブリッドアルファウイルスゲノムに基づく。上記レプリコンは、約１０ｋｂ長であり、ポリＡテールを有する。

アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドＤＮＡ（名称：ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＦＬ．ＲＳＶＦもしくはＡ３１７；ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＳＥＡＰもしくはＡ３０６；ｐＳＰ６−ＶＣＲ−ＧＦＰもしくはＡ５０）を、インビトロでのＲＮＡ合成のテンプレートとして役立てた。上記レプリコンは、ＲＮＡ複製に必要とされるアルファウイルス遺伝子エレメントを含むが、粒子アセンブリに必要な遺伝子産物をコードするエレメントを欠いている；構造タンパク質は、代わりに、目的のタンパク質（レポーター（例えば、ＳＥＡＰもしくはＧＦＰ）または免疫原（例えば、全長ＲＳＶ Ｆタンパク質）のいずれか）によって置き換えられるので、上記レプリコンは、感染性粒子の生成を誘導できない。上記アルファウイルスｃＤＮＡの上流にあるバクテリオファージ（Ｔ７もしくはＳＰ６）プロモーターは、インビトロで上記レプリコンＲＮＡの合成を促進し、上記ポリ（Ａ）テールの直ぐ下流にあるデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムは、その自己切断活性を介して正確な３’末端を生成する。

適切な制限エンドヌクレアーゼで上記ＨＤＶリボザイムの下流で上記プラスミドＤＮＡを直線状にした後に、ランオフ転写物（ｒｕｎ−ｏｆｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を、Ｔ７もしくはＳＰ６バクテリオファージ由来ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロで合成した。転写を、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ）によって提供される指示書に従って、ヌクレオシドトリホスフェート（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）の各々の７．５ｍＭ（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）もしくは５ｍＭ（ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）の存在下で、３７℃において２時間にわたって行った。転写の後、上記テンプレートＤＮＡを、ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で消化した。上記レプリコンＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。キャップのないＲＮＡを、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇキャッピングシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ユーザーマニュアルに概説されるとおり、ワクシニアキャッピング酵素（ＶＣＥ）で転写後にキャップした；このようにキャップしたレプリコンに、「ｖ」の接頭文字を付ける（例えば、ｖＡ３１７は、ＶＣＥによってキャップされたＡ３１７レプリコンである）。転写後キャップされたＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。上記ＲＮＡサンプルの濃度を、ＯＤ_{２６０ｎｍ}を測定することによって決定した。上記インビトロ転写物の完全性を、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。

リポソーム被包
ＲＮＡを、参考文献９および４２の方法によって本質的に作製したリポソーム中に被包した。簡潔には、脂質をエタノール中に溶解し、ＲＮＡレプリコンを、緩衝液中に溶解し、これらを緩衝液と混合し、続いて、平衡化させた。上記混合物を緩衝液で希釈し、次いで、濾過した。得られた生成物は、高い被包効率でリポソームを含んだ。上記リポソームを、１０％ ＤＳＰＣ（両性イオン性）、４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性）、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ結合体化ＤＭＧから作製した。これら割合は、全リポソーム中の％モルをいう。

ＤｌｉｎＤＭＡ（１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン）を、参考文献４の手順を使用して合成した。ＤＳＰＣ（１，２−ジアステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）を、Ｇｅｎｚｙｍｅから購入した。コレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ＰＥＧ結合体化ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール），アンモニウム塩）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン，塩化物塩）およびＤＣ−ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールヒドロクロリド）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓからであった。

いくつかのリポソームにおいて、代替のカチオン性脂質を、ＤｌｉｎＤＭＡの代わりに使用した（例えば、ＲＶ０５もしくはＲＶ１７）：

一般に、８つの異なる方法を、本発明に従うリポソームを調製するために使用した。これらは、方法（Ａ）〜（Ｈ）として本文中で言及され、主に濾過およびＴＦＦ工程に関連して異なっている。詳細は、以下のとおりである。

（Ａ）エタノール中の新鮮な脂質ストック溶液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ−ＤＭＧ ２０００を秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中に溶解した。上記新たに調製した脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、上記ストックのうちの７５５μＬを、１．２４５ｍＬ エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。この量の脂質を使用して、２５０μｇ ＲＮＡと共にリポソームを形成した。ＲＮＡの２ｍＬ 作業溶液をまた、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中のストック溶液約１μｇ／μＬから調製した。３つの２０ｍＬ ガラスバイアル（撹拌子有り）を、ＲＮａｓｅ Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、上記バイアルのＲＮａｓｅの汚染を除去した。上記バイアルのうちの１つを、上記ＲＮＡ作業溶液に使用し、他のものを脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した（後に記載されるとおり）。作業脂質溶液およびＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ ルアーロックシリンジに入れた。２ｍＬ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃ シリンジに入れた。ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、ＦＥＰチューブ（フッ素化エチレン−プロピレン；すべてのＦＥＰチューブは、２ｍｍ内径×３ｍｍ外径を有した；Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅによって供給）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫ^ＴＭ ５００μｍ ＩＤ接合部，Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に接続した。上記Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第３のシリンジを、別個の１つのＦＥＰチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量７ｍＬ／分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、２０ｍＬ ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。上記混合物のうちの４ｍｌを、５ｃｃ シリンジに入れ、これを、ＦＥＰチューブの１つに接続し、別の５ｃｃ シリンジを、等しい長さのＦＥＰチューブに接続し、等量の１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、上記シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流量において作動させ、最終の混合物を、２０ｍＬ ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、第２の混合工程（リポソーム）から集めた上記混合物を、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体）を通過させた。上記リポソームを通過させる前に、４ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ、４ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＬの１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）が、上記Ｍｕｓｔａｎｇ膜を連続して通過した。リポソームを、１０分間にわたって３７℃において加温し、その後、上記膜を通過させた。次に、ＴＦＦを使用して、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記ＴＦＦシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓから購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび８ｃｍ^２ 表面積を有するポリスルホン中空ファイバー濾過膜を使用した。インビトロおよびインビボ実験に関しては、処方物を、１×ＰＢＳで、必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。

（Ｂ）振盪後、上記ストックのうちの２２６．７μＬを、１．７７３ｍＬ エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製したこと（従って、上記脂質：ＲＮＡ比を改変）を除いて、方法（Ａ）のとおり。

（Ｃ）上記Ｍｕｓｔａｎｇ濾過を省略したので、リポソームが、上記２０ｍＬ ガラスバイアルから上記ＴＦＦ透析へと向かったことを除いて、方法（Ｂ）のとおり。

（Ｄ）上記ＴＦＦが、１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび２０ｃｍ^２ 表面積を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空ファイバー膜（部品番号 Ｐ−Ｃ１−１００Ｅ−１００−０１Ｎ）を使用したことを除いて、方法（Ｃ）のとおり。

（Ｅ）方法（Ａ）のようにＭｕｓｔａｎｇ膜を使用したことを除いて、方法（Ｄ）のとおり。

（Ｆ）上記Ｍｕｓｔａｎｇ濾過を省略したので、リポソームが、上記２０ｍＬ ガラスバイアルから上記ＴＦＦ透析へと向かったことを除いて、方法（Ａ）のとおり。

（Ｇ）ＲＮＡの４ｍＬ 作業溶液を、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の約１μｇ／μＬのストック溶液から調製したことを除いて、方法（Ｄ）のとおり。次いで、４つの２０ｍＬ ガラスバイアルを、同じ方法で調製した。それらのうちの２本を、上記ＲＮＡ作業溶液（各バイアル中２ｍＬ）に使用し、他のものを、（Ｃ）のように、上記脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した。Ｔミキサーを使用するのではなく、ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、Ｍｉｔｏｓ Ｄｒｏｐｌｅｔ接合チップ（Ｓｙｒｒｉｓから得られるガラス製マイクロ流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）デバイス（部品番号 ３０００１５８））に、ＰＴＦＥチューブ（０．０３インチ内径×１／１６インチ外径）を使用して、４ウェイエッジコネクタ（Ｓｙｒｒｉｓ）を使用して接続した。２つのＲＮＡストリームおよび１つの脂質ストリームを、シリンジポンプによって作動させ、上記エタノールおよび水相の混合を、上記チップのＸ接合部（１００μｍ×１０５μｍ）において行った。３つすべてのストリームの流量を、１．５ｍＬ／分において維持し、従って、全水性の流量 対 エタノールの流量の比は、２：１であった。上記チューブ出口を、２０ｍＬ ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を５ｃｃ シリンジに入れ、これを、上記ＰＴＦＥチューブの別の１つにはめた；等しい長さのＰＴＦＥチューブ付きの別の５ｃｃ シリンジに、等容積の１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、３ｍＬ／分の流量において、シリンジポンプを使用して作動させ、最終混合物を、２０ｍＬ ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、（Ｄ）におけるように、ＴＦＦを使用して、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析した。

（Ｈ）上記２ｍＬ作業脂質ストック溶液を、１２０．９μＬの上記脂質ストックと１．８７９ｍＬ エタノールとを混合することによって作製したことを除いて、方法（Ａ）のとおり。また、上記Ｔミキサーにおいて混合した後に、上記２０ｍＬ バイアルからの上記リポソームを、Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，特に強力，０．５〜３ｍＬ 容量）に入れ、オートクレーブしたプラスチック容器中、４００〜５００ｍＬの１×ＰＢＳに対して一晩４℃において透析し、その後、最終生成物を収集した。

リポソーム形成後、被包されたＲＮＡのパーセンテージおよびＲＮＡの濃度を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、製造業者の指示書に従って、上記キット中に提供されたリボソームＲＮＡ標準を使用して標準曲線を作成して、決定し得る。例えば、リポソームを、１×ＴＥ緩衝液（キットから）中で、１０×もしくは１００×に希釈し、その後、色素を添加する。別個に、リポソームを、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘを含む１×ＴＥ緩衝液中で１０×もしくは１００×に希釈し、その後、色素を添加する（上記リポソームを破壊するため。従って、全ＲＮＡをアッセイするため）。その後、等量の色素を各溶液に添加する。次いで、色素添加後の約１８０μＬの各溶液を、二連で９６ウェル組織培養プレートに入れた。蛍光（励起４８５ｎｍ，発光５２８ｎｍ）を、マイクロプレートリーダーで読み取る。リポソーム処方物を、被包されたＲＮＡの量に基づいて、インビボで投与し得る。

リポソームにおける被包は、ＲＮａｓｅ消化からＲＮＡを保護することを示した。実験では、１μｇのＲＮＡあたり３．８ｍＡＵのＲＮａｓｅ Ａを使用し、３０分間にわたって室温においてインキュベートした。ＲＮａｓｅを、プロテイナーゼＫで、５５℃において１０分間にわたって不活性化した。次いで、サンプル 対 ２５：２４：１ ｖ／ｖ／ｖ，フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの１：１ ｖ／ｖ混合物を添加して、上記ＲＮＡを上記脂質から水相へと抽出した。サンプルを、数秒間にわたってボルテックスすることによって混合し、次いで、１２ｋ ＲＰＭにおける１５分間にわたって遠心分離機に置いた。上記水相（上記ＲＮＡを含む）を取り出し、上記ＲＮＡを分析するために使用した。ローディング前に（４００ｎｇ ＲＮＡ／ウェル）、上記サンプルすべてを、ホルムアルデヒドローディング色素と共にインキュベートし、１０分間にわたって６５℃において変性させ、室温へと冷却した。Ａｍｂｉｏｎ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍマーカーを使用して、上記ＲＮＡ構築物の分子量を概算した。上記ゲルを、９０Ｖにおいて泳動した。上記ゲルを、室温において１時間にわたって振盪することによって、製造業者のガイドラインに従って、水中の０．１％ ＳＹＢＲゴールドを使用して染色した。図１は、被包の非存在下でＲＮａｓｅがＲＮＡを完全に消化することを示す（レーン３）。ＲＮＡは、被包後に検出不能であり（レーン４）、これらリポソームがＲＮａｓｅで処理されても全く変化が認められない（レーン４）。ＲＮａｓｅ処理リポソームをフェノール抽出に供した後、消化されていないＲＮＡが認められる（レーン６）。４℃において１週間後ですら、上記ＲＮＡを、いかなるフラグメント化もなしに認めることができた（図２，矢印）。インビボでのタンパク質発現は、４℃において６週間および１回の凍結融解サイクル後にも変化しなかった。従って、リポソーム被包ＲＮＡは安定である。

レポーター遺伝子の発現
ＲＮＡのインビボ発現を評価するために、免疫原ではなく、レポーター酵素（ＳＥＡＰ；分泌型アルカリホスファターゼ）を、上記レプリコン中にコードさせた。発現レベルを、化学発光アルカリホスファターゼ基質を使用して、１×Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ希釈緩衝液中で１：４希釈した血清中で測定した。８〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）に、０日目に、０．１μｇもしくは１μｇ ＲＮＡ用量で脚１本あたり５０μｌを筋肉内に注射した。同じベクターを、１μｇにおいて上記リポソームなしで（ＲＮａｓｅ非含有１×ＰＢＳ中で）も投与した。ビリオンパッケージングされたレプリコンもまた、試験した。本明細書で使用したビリオンパッケージングされたレプリコン（「ＶＲＰ」と呼ぶ）を、参考文献４３の方法によって得た。ここでアルファウイルスレプリコンは、変異ＶＥＥＶに由来するか、またはシンドビスウイルスの３’ＵＴＲおよびシンドビスウイルスパッケージングシグナル（ＰＳ）を含むように操作されたＶＥＥＶのゲノムから得られるキメラであり、シンドビスウイルスキャプシドおよび糖タンパク質遺伝子をコードする欠損性ヘルパーＲＮＡと共にＢＨＫ細胞へと共エレクトロポレーション（ｃｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｎｇ）することによってパッケージングした。

図４に示されるように、被包は、１μｇ用量においてＳＥＡＰレベルを約１／２ ｌｏｇだけ増大させ、６日目において、０．１μｇ 被包用量からの発現は、１μｇ 非被包用量で認められたレベルに匹敵した。３日目までに、発現レベルは、ＶＲＰで達成されたものを超えた（四角）。従って、ＳＥＡＰ発現は、裸のＲＮＡコントロールと比較して、１／１０用量においてすら、上記ＲＮＡが上記リポソーム中に処方された場合に増大された。発現はまた、上記ＶＲＰコントロールと比較して高かったが、発現の動態は、非常に異なっていた（図４を参照のこと）。エレクトロポレーションを用いた上記ＲＮＡの送達は、上記裸のコントロールと比較して増大した発現を生じたが、これらレベルは、リポソームでのものより低かった。

上記リポソーム群において認められる効果が、上記リポソーム成分にのみ起因するか、または上記被包に関連するのかを評価するために、上記レプリコンを、被包形態（２つの異なる精製プロトコルで、０．１μｇ ＲＮＡ）において、または形成後にリポソームと混合して（非被包化「リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）」，０．１μｇ ＲＮＡ）、または裸のＲＮＡ（１μｇ）として投与した。上記リポプレックスは、最低レベルの発現を与えた。このことは、被包が、強力な発現に必須であることを示す。

さらなるＳＥＡＰ実験から、インビボで明らかな用量応答が示された。発現は、１ｎｇほどのＲＮＡの送達後にも認められた。被包レプリコンからの発現と裸のレプリコンからの発現とを比較するさらなる実験から、０．０１μｇ 被包ＲＮＡは、１μｇの裸のＲＮＡに等しいことが示された。ＲＮＡの０．５μｇ用量において、上記被包物質は、６日目において１２倍高い発現を与えた；０．１μｇ用量レベルでは、６日目において２４倍高かった。

上記群において平均レベルで調べるだけでなく、個々の動物もまた研究した。いくらかの動物は、裸のレプリコンに対して応答しなかったのに対して、被包は、非応答をなくした。

免疫原のインビボ発現
インビボでの免疫原性を評価するために、レプリコンを構築して、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に由来する全長Ｆタンパク質を発現させた。これを、裸（１μｇ）、リポソーム中に被包（０．１もしくは１μｇ）、またはビリオン中にパッケージング（１０^６ＩＵ；「ＶＲＰ」）で、０日目および２１日目に送達した。上記リポソームは、明らかに免疫原性を増強し、上記ＲＮＡは、堅調なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発する。さらなる実験において、ＶＲＰ、０．１μｇ リポソーム被包ＲＮＡ、もしくは１μｇ リポソーム被包ＲＮＡを与えられたマウスにおけるＦ特異的ＩｇＧ力価を比較した。上記リポソーム被包ＲＮＡは、ビリオン送達で認められるのと本質的に同程度の免疫応答を誘導する。

さらなる研究から、上記０．１μｇのリポソーム被包ＲＮＡは、０．１μｇの送達されたＤＮＡより遙かに高い抗Ｆ ＩｇＧ応答を与え（２回目の用量の１５日後）、さらに、エレクトロポレーションによって送達された、上記Ｆ抗原をコードする２０μｇ プラスミドＤＮＡより免疫原性であることが確認された。

ＲＳＶ Ｆタンパク質免疫原性を研究するために、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする自己複製レプリコン「ｖＡ３１７」を調製した。これを、以下のように、０日目および２１日目にＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり４匹もしくは８匹の動物）に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）によって投与した：１μｇ レプリコン単独もしくは上記のようにＤＬｉｎＤＭＡで調製されたリポソームとして処方されたレプリコン。これら脂質における上記ＰＥＧ−ＤＭＧは、ＰＥＧ−２０００を含んだ。比較のために、同じＲＳＶ−Ｆ抗原を発現する裸のプラスミドＤＮＡ（２０μｇ）を、エレクトロポレーションを使用して、またはリポソームと共に（０．１μｇ ＤＮＡ）のいずれかで送達した。４匹のマウスを、ナイーブコントロール群として使用した。血清を、１４日目および３６日目に抗体分析のために集めた。脾臓を、４９日目に、Ｔ細胞分析のためにマウスから採取した。

Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであり、４種の異なるＲＮＡ含有リポソーム調製物のデータおよび比較のためのＤＮＡ含有リポソームのデータを示す：

従って、上記リポソーム処方物は、増大したＦ特異的ＩｇＧ力価（および同様にＴ細胞頻度；データは示さず）。によって決定されるように、上記裸のＲＮＡコントロールと比較して、免疫原性を有意に増強した。リポソームとともに処方したプラスミドＤＮＡ、もしくはエレクトロポレーションを使用して送達された裸のプラスミドＤＮＡは、リポソームで処方された自己複製ＲＮＡより免疫原性が有意に低かった。

より長いＰＥＧ長
インビボ免疫原性に対するＰＥＧ長の効果を比較するために、上記２つの異なるセットのリポソームを、１５０μｇ ＲＮＡありもしくはＲＮＡなし（空のリポソームを作製するために）で、方法（Ｈ）を使用して調製した。２種の異なる脂質混合物を使用した（共に、４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＳＰＣ、４８％ コレステロール、および２％ ＰＥＧ−ＤＭＧを有するが、上記２つの組成物は、ＰＥＧ ２０００もしくはＰＥＧ ５０００のいずれかを使用した）。上記ＲＮＡレプリコンは、ＲＳＶの表面融合タンパク質をコードするｖＡ３７５であった。

以下の表は、上記リポソームのサイズ（Ｚ平均および多分散性指数）および各々におけるＲＮＡ被包の％を示す：

上記リポソームを、０日目および２１日目にＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹／群）に、両側の筋肉内注射（５０μｌ／脚）によって投与した。用量は、０．０１μｇ、０．０３μｇ、０．１μｇ、０．３μｇもしくは１μｇであった。Ｆ特異的血清ＩｇＧおよびＰＲＮＴ６０力価（ＧＭＴ）は、１回目もしくは２回目の注射の２週間後に以下のとおりであった：

ＰＥＧ ５０００を含めると、０．１μｇ（１．６×）、０．３μｇ（１．５×）もしくは１μｇ（２．４×） ＲＮＡの２用量後に上記ＰＥＧ ２０００より高いＦ特異的力価を誘発する。統計分析（Ｔ検定）から、Ｆ特異的力価（２ｗｐ２）は、０．０１μｇ、０．１μｇ、０．３μｇおよび１μｇ ＲＮＡ用量において、上記ＰＥＧ ５０００群とＰＥＧ ２０００群との間で統計的に異なる（Ｐ＜０．０５）ことが示された。ＰＥＧ ５０００は、１μｇ ＲＮＡにおいてより高い中和力価（２．４×）を与えた（Ｐ＜０．０５）。

類似の比較実験を、上記ｖＡ３１７レプリコンで行った。リポソームを、４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＳＰＣ、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ ＤＭＧ（ＰＥＧ ２０００もしくはＰＥＧ ５０００のいずれか）を用いて、方法（Ｈ）によって作製した。それらの特徴は、以下のとおりであった：

ＢＡＬＢ／ｃマウス（８匹／群）に、０日目および２１日目に裸のＲＮＡ（１μｇ）もしくはリポソーム被包ＲＮＡ（０．１μｇ）を両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）で与えた。血清を、１４日目および３５日目に集め、脾臓を４９日目に採取した。

Ｆ特異的血清ＩｇＧ（ＧＭＴ）は、１回目の注射もしくは２回目の注射の２週間後に以下のとおりであった：

平均正味Ｆ特異的サイトカイン陽性Ｔ細胞頻度（ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋）は、以下のとおりであった。統計的に有意にゼロを上回った数字のみを示す（ＣＤ４＋に関してはＲＳＶペプチドＦ５１−６６、Ｆ１６４−１７８、Ｆ３０９−３２３に、またはＣＤ８＋に関してはＲＳＶペプチドＦ８５−９３およびＦ２４９−２５８に対して特異的）：

従って、Ｆ特異的ＩｇＧ力価は、上記ＰＥＧヘッド基の分子量を２０００から５０００へと増大させることによって、２．５倍（２ｗｐ１）および３倍（２ｗｐ２）増大した。Ｔ細胞応答に対して正の影響もあった。

最大１０ｋＤａまでのＰＥＧ長の効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して、１〜１０ｋＤａの範囲の異なるＰＥＧ長の影響を研究した。５群に、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする０．１μｇ ＲＮＡ（ｖＡ３７５レプリコン）を、ＤＬｉｎＤＭＡ カチオン性脂質および異なる長さのＰＥＧ−ＤＭＧ（１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ）から形成されるリポソームにおいて２用量与えた（０日目および２１日目）。Ｆ特異的ＩｇＧ力価を、第１の用量および第２の用量の１４日後に測定した。結果を図５に示す。データは、２ｋＤａ、３ｋＤａ、５ｋＤａおよび１０ｋＤａのＰＥＧ長が、両方の時点で本質的に同じ力価を提供し、これらは、１ｋＤａ ＰＥＧで認められたものより全て良好であることを示す。

コントロール動物に、２ｋＤａ ＰＥＧ−ＤＭＧを有するＤＬｉｎＤＭＡ リポソームを与えたが、ＲＮＡは与えなかった。これら動物は、同様に第２の用量の後に（しかし被包ＲＮＡを与えられた動物におけるより遙かに低いレベルにおいて）増大した抗Ｆ ＩｇＧ力価を示した。この群の血清サンプルは、ｇｐ１４０もしくはＰＢＳコーティングＥＬＩＳＡプレートに対して非特異的応答を示さなかった。

血清サイトカインを、上記リポソームの注射の５時間後に測定した。一般に、ＩＬ−１β応答もＴＮＦ−α応答も、いずれのマウスにおいても認められず、ＩＬ−１２／ｐ７０、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＩＰ−１０に関する応答は、全てのＰＥＧ長について等しかった。ＫＣ／ＧＲＯ応答は、ＰＥＧ化なしのリポソームにおけるものより、５ｋＤａもしくは１０ｋＤａ ＰＥＧ−ＤＭＧを有するリポソームを受けたマウスにおいて有意に低かった。

ＲＳＶでのＰＥＧ５０００研究
４種の異なるレプリコンを、この研究のために使用した（全て、融合ペプチドが欠失した、ＲＳＶの全長野生型Ｆ糖タンパク質をコードする）。上記ｖＡ３７２レプリコンを、ランオフ転写によって形成する。上記ｖＡ１４２レプリコンの３’末端を、リボザイム媒介性切断により形成する。上記タンパク質のｖＡ３６８発現において、ＥＶ７１内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって駆動される。ｖＡ３６９レプリコン発現において、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳによって駆動される。

リポソームを、４０％ ＲＶ１７ カチオン性脂質、１０％ ＤＳＰＣ、４９．５％ コレステロール、０．５％ ＰＥＧ ＤＭＧ ５０００で形成し、１７５μｇ ＲＮＡバッチサイズで方法（Ｈ）を使用して作製した。

ＢＡＬＢ／ｃマウス（７匹の動物／群）に、０日目および２１日目に以下を両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）で与えた：
群１ リポソーム中に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ３７２， １．０μｇ）
群２ リポソーム中に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２， １．０μｇ）
群３ ｖＡ１４２ ＲＮＡを含むＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）
群４ リポソーム中に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ３６８， １．０μｇ）
群５ ｖＡ３６８ ＲＮＡを含むＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）
群６ リポソーム中に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ３６９， １．０μｇ）
群７ ｖＡ３６９ ＲＮＡを含むＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）
群８ ナイーブコントロール（４匹の動物）。

血清を、０日目、２０日目、３５日目に、抗体分析のために集めた。脾臓を、３５日目にＴ細胞分析のために採取した。

Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価および中和力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：

従って、全ての４種のレプリコンは免疫原性であり、各々、最初のワクチン接種後に血清Ｆ特異的ＩｇＧ抗体を誘発し、第２のワクチン接種は、上記応答を効率的にブーストした。ＲＳＶ中和抗体を、第２のワクチン接種後に検出した。類似の第２のワクチン接種後抗体力価を、３’末端がリボザイム媒介性切断によって形成されたレプリコン（ｖＡ１４２）および３’末端がランオフ転写によって形成されたレプリコン（ｖＡ３７２）によって誘導した。上記Ｆ抗原のＥＶ７１もしくはＥＭＣＶ駆動発現は、上記レプリコンに対する抗体応答を増強しなかった（ｖＡ３６８もしくはｖＡ３６９ 対 ｖＡ１４２）。同様に、Ｔ細胞応答（示さず）は、３’末端がリボザイム媒介性切断によって形成されたレプリコン（ｖＡ１４２）もランオフ転写によって形成されたレプリコン（ｖＡ３７２）も区別を生じさせず、上記Ｆ抗原のＥＶ７１もしくはＥＭＣＶ駆動発現に対する利益を示さなかった（ｖＡ２３８もしくはｖＡ３６９ 対 ｖＡ１４２）。

上記ｖＡ１４２レプリコンをまた、以下から形成されたリポソームを使用して、コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｉｓ）において試験した：
（ａ）１７５μｇ ＲＮＡバッチサイズで方法（Ｄ）を使用して作製した、４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＰＳＣ、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ ＤＭＧ ２０００
（ｂ）２００μｇ ＲＮＡバッチサイズで方法（Ｈ）を使用して作製した、４０％ ＲＶ１７、１０％ ＤＳＰＣ、４９．５％ コレステロールおよび０．５％ ＰＥＧ ＤＭＧ ５０００
（ｃ）２００μｇ ＲＮＡバッチサイズで方法（Ｈ）を使用して作製した、４０％ ＲＶ０５、３０％ ＤＬｏＰＥ（１８：２ ＰＥ）、２８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ ＤＭＧ ２０００
コットンラット（４〜８匹の動物／群）に、０日目および２１日目に、以下を筋肉内ワクチン接種（１本の脚に１００μＬ）で与えた：
群１ リポソーム（ａ）中に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２， １μｇ， ＲＳＶ−Ｆ）
群２ リポソーム（ａ）中に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２， ０．１μｇ， ＲＳＶ−Ｆ）
群３ リポソーム（ｂ）中に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２， １μｇ， ＲＳＶ−Ｆ）
群４ リポソーム（ｂ）中に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２， ０．１μｇ， ＲＳＶ−Ｆ）
群５ リポソーム（ｃ）中に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２， １μｇ， ＲＳＶ−Ｆ）
群６ リポソーム（ｃ）中に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２， ０．１μｇ， ＲＳＶ−Ｆ）
群７ ＲＳＶの全長野生型表面Ｆ糖タンパク質を発現するＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）
群８ 水酸化アルミニウムをアジュバント添加した（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（５μｇ）
群９ ナイーブコントロール（３匹の動物） 。

全てのコットンラット（群９を除く）を、４９日目（２回目のワクチン接種の４週間後）に、５μｇ Ｆサブユニット＋水酸化アルミニウムをワクチン接種した。

血清を、０日目、２１日目、３５日目、４９日目、６４日目に、抗体分析のために集めた。

Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：

ＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった：

上記タンパク質ワクチン接種は、タンパク質を以前にワクチン接種したコットンラットにおいて抗体力価をブーストしなかったが、ＲＮＡを以前にワクチン接種したコットンラットにおける力価に大きなブーストを提供した。大部分の場合において、２回のＲＮＡワクチン接種、続く、タンパク質の後の上記ＲＳＶ血清中和力価は、２回もしくは３回の一連のアジュバント添加したタンパク質ワクチン接種によって誘導された力価に等しかった。

（ＣＭＶ免疫原性）
リポソームを使用して、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）糖タンパク質をコードするＲＮＡレプリコンを送達した。「ｖＡ１６０」レプリコンは、全長糖タンパク質ＨおよびＬ（ｇＨ／ｇＬ）をコードするのに対して、「ｖＡ３２２」レプリコンは、可溶性形態（ｇＨｓｏｌ／ｇＬ）をコードする。上記２種のタンパク質は、単一のレプリコンにおいて別個のサブゲノムプロモーターの制御下にある；２つの別個のベクター（一方は、ｇＨをコードし、一方はｇＬをコードする）の共投与は、良好な結果を与えなかった。

ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹／群）に、０日目、２１日目および４２日目に、ｇＨ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）、ｇＨｓｏｌ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）およびコントロールとしてＰＢＳを、両側の筋肉内ワクチン接種で与えた（５０μＬ／脚）。２つの試験群に、リポソーム（４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＳＰＣ、４８％ Ｃｈｏｌ、２％ ＰＥＧ−ＤＭＧ ２０００；方法（Ｄ）を使用して作製（ただし１５０μｇ ＲＮＡバッチサイズで））中に処方した１μｇの上記ｖＡ１６０レプリコンもしくはｖＡ３２２レプリコンを与えた。

上記ｖＡ１６０リポソームは、Ｚａｖ（Ｚ平均）直径 １６８ｎｍ、ｐｄＩ（多分散性指数）０．１４４、および８７．４％ 被包を有した。上記ｖＡ３２２リポソームは、Ｚａｖ直径 １６２ｎｍ、ｐｄＩ ０．１３１、および９０％ 被包を有した。

上記レプリコンは、単一ベクターから２種のタンパク質を発現できた。

血清を、６３日目（３ｗｐ３）に免疫学的分析のために集めた。ＣＭＶ中和力価（コントロールと比較して、陽性ウイルスフォーカス／ウェルの数において５０％低下を生じる血清希釈の逆数）は、以下のとおりであった：

全長もしくは可溶性形態のＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ複合体のいずれかを発現するＲＮＡは、従って、上皮細胞でアッセイされる場合、高い力価の中和抗体を誘発した。上記リポソーム被包ＲＮＡによって誘発された平均力価は、その対応するＶＲＰについてのものと少なくとも同程度に高かった。

反復実験から、上記レプリコンが、単一のベクターから２種のタンパク質を発現できることが確認された。上記ＲＮＡレプリコンは、ＶＲＰでの３ｗｐ３力価 ５５１６と比較して、３ｗｐ３力価 １１４５７を与えた。

さらなる実験は、ｖＡ１６０に加えて異なるレプリコンを使用し、上記リポソームにおいてより長いＰＥＧを使用した。上記ｖＡ５２６レプリコンは、ＣＭＶペンタマー複合体（ｇＨ−ｇＬ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ−１３１）を３つのサブゲノムプロモーターの制御下で発現する：第１のものは、ｇＨの発現を駆動し；第２のものは、ｇＬの発現を駆動し；第３のものは、ＵＬ１２８−２Ａ−ＵＬ１３０−２Ａ−ＵＬ１３１ポリプロテイン（これは、３個のＵＬ遺伝子の間に２個の２Ａ切断部位を含む）の発現を駆動する。上記ｖＡ５２７レプリコンは、３個のサブゲノムプロモーターおよび２個のＩＲＥＳを介してＣＭＶペンタマー複合体を発現する：第１のサブゲノムプロモーターは、ｇＨの発現を駆動し；第２のサブゲノムプロモーターは、ｇＬの発現を駆動し；第３のサブゲノムプロモーターは、ＵＬ１２８の発現を駆動する；ＵＬ１３０は、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳの制御下にあり；ＵＬ１３１は、ＥＶ７１ ＩＲＥＳの制御下にある。これら３種のレプリコンを、リポソーム（１５０μｇバッチサイズで方法（Ｈ）によって調製； ４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＳＰＣ、４８％ コレステロール、２％ ＰＥＧ ＤＭＧ ５０００）によってもしくはＶＲＰによって送達した。

ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹の動物の１０群）に、０日目、２１日目および４２日目に、以下を両側の筋肉内注射（５０μＬ／脚）で与えた：
群１ ｇＨ ＦＬ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）
群２ ペンタマー， ２Ａ ＶＲＰ（１×１０^５ ＩＵ）
群３ ペンタマー， ２Ａ ＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）
群４ ペンタマー， ＩＲＥＳ ＶＲＰ（１×１０^５ ＩＵ）
群５ リポソーム中に処方された自己複製ＲＮＡ ｖＡ１６０（１μｇ）
群６ リポソーム中に処方された自己複製ＲＮＡ ｖＡ５２６（１μｇ）
群７ リポソーム中に処方された自己複製ＲＮＡ ｖＡ５２７（１μｇ）
群８ カチオン性ナノエマルジョン中に処方された自己複製ＲＮＡ ｖＡ１６０ （１μｇ）
群９ カチオン性ナノエマルジョン中に処方された自己複製ＲＮＡ ｖＡ５２６（１μｇ）
群１０ カチオン性ナノエマルジョン中に処方された自己複製ＲＮＡ ｖＡ５２７（１μｇ）。

血清を、２１日目（３ｗｐ１）、４２日目（３ｗｐ２）および６３日目（３ｗｐ３）に、免疫学的分析のために集めた。

２１日目、４２日目および６３日目のＣＭＶ血清中和力価は、以下であった：

従って、自己複製ＲＮＡは、単一のベクターから複数の抗原を発現するために、および強力かつ特異的な免疫応答を惹起するために使用され得る。上記レプリコンは、５種の抗原（ＣＭＶペンタマー複合体（ｇＨ−ｇＬ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ−１３１）を発現し得、強力な免疫応答を惹起し得る。ＰＥＧ５０００を有するリポソーム中で送達された自己複製ＲＮＡは、アッセイした全ての時点（３ｗｐ１、３ｗｐ２、および３ｗｐ３）において、上皮細胞に対してアッセイされる場合、高力価の中和抗体を誘発できた。これら応答は、対応するＶＲＰおよびカチオン性ナノエマルジョンより優れていた。

本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、本発明の範囲および趣旨内に留まりながら、改変が行われ得ることは、理解される。

表１：有用なリン脂質
ＤＤＰＣ １，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＡ １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＥＰＣ １，２−エルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＥ １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＥＰＧ １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＯＰＣ １，２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＡ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＬＰＣ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＥ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＬＰＧ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＰＳ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＭＧ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＭＰＡ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＭＰＣ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＤＭＰＥ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＭＰＧ １，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＭＰＳ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリンＤＯＰＡ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＯＰＣ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＯＰＥ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＰＧ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＯＰＳ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＰＰＡ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＰＰＣ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＤＰＰＥ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＰＰＧ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＰＰＳ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリンＤＰｙＰＥ １，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＳＰＡ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＳＰＣ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＤＳＰＥ １，２−ジステアロイル（Ｄｉｏｓｔｅａｒｐｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＳＰＧ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＳＰＳ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリンＥＰＣ 卵−ＰＣ
ＨＥＰＣ 水素化卵ＰＣ
ＨＳＰＣ 高純度水素化ダイズＰＣ
ＨＳＰＣ 水素化ダイズＰＣ
ＬＹＳＯＰＣ ＭＹＲＩＳＴＩＣ １−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ ＰＡＬＭＩＴＩＣ １−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ ＳＴＥＡＲＩＣ １−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ミルクスフィンゴミエリンＭＰＰＣ １−ミリストイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ ３−ホスファチジルコリン
ＭＳＰＣ １−ミリストイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＭＰＣ １−パルミトイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＣ １−パルミトイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＥ １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＰＯＰＧ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール）．．．］
ＰＳＰＣ １−パルミトイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＭＰＣ １−ステアロイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＯＰＣ １−ステアロイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＰＰＣ １−ステアロイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン

Claims (12)

1. 目的の免疫原をコードするＲＮＡが被包されているリポソームであって、ここで該リポソームは、ポリエチレングリコールが該リポソームの外側に存在するようにポリエチレングリコール部分を含む少なくとも１種の脂質を含み、該ポリエチレングリコールの平均分子量は、３ｋＤａより高いが１１ｋＤａ未満である、リポソーム。
2. ＰＥＧ−ＤＭＧおよび／もしくは式（Ｘ）の脂質を含む、請求項１に記載のリポソーム。
3. 前記リポソームは、８０〜１６０ｎｍの範囲の直径を有する、上述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。
4. 前記リポソームは、カチオン性ヘッド基を有する脂質を含む、上述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。
5. 前記リポソームは、両性イオン性ヘッド基を有する脂質を含む、上述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。
6. 前記ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡである、上述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。
7. 前記自己複製ＲＮＡ分子は、（ｉ）該自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）免疫原をコードする、請求項６に記載のリポソーム。
8. 前記ＲＮＡ分子は、２つのオープンリーディングフレームを有し、該オープンリーディングフレームのうちの第１のものは、アルファウイルスレプリカーゼをコードし、該オープンリーディングフレームのうちの第２のものは、前記免疫原をコードする、請求項７に記載のリポソーム。
9. 前記ＲＮＡ分子は、９０００〜１２０００ヌクレオチド長である、上述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。
10. 前記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘発し得る、上述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。
11. 上述の請求項のいずれかに記載のリポソームを含む、薬学的組成物。
12. 脊椎動物において防御免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、該脊椎動物に、有効量の、請求項１〜１０に記載のリポソームまたは請求項１１に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。