JP2023533528A - Ｈｂｖに対するｒｎａレプリコンワクチン - Google Patents

Ｈｂｖに対するｒｎａレプリコンワクチン Download PDF

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Abstract

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原、ＨＢＶコア抗原、およびＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする核酸分子、ならびに関連する組合せを記載する。また、ＨＢＶ抗原を発現するベクター、例えば、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクター、およびＲＮＡレプリコン、ならびに発現ベクターを含有する医薬組成物も記載する。本発明の医薬組成物を使用して、特に慢性ＨＢＶ感染を有する個体において、ＨＢＶに対する免疫応答を誘導する方法またはＨＢＶ誘導性疾患を処置する方法も記載する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月８日に出願された米国仮特許出願第６３／０４９，４００号、および２０２１年２月１日に出願された米国仮特許出願第６３／１４４，０５１号の優先権を主張し、これらの開示内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子提出された配列表の参照
本出願は、作成日が２０２１年６月２４日で、サイズ３９０ＫＢを有するファイル名「ＴＩＰ１０８８ＷＯＰＣＴ１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ」を有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子提出された配列表を含有する。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本開示は、一般に、遺伝子発現を調節するために有用な核酸分子、ならびに、例えば、細胞培養中の好適な宿主細胞における、または対象における所望の産物の産生のため、および宿主細胞または対象に有益な特性を付与するための核酸分子の使用を含む、分子生物学および遺伝子工学の分野に関する。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、４つのオープンリーディングフレームおよび７つのタンパク質をコードする、３．２ｋｂの小型の肝臓指向性ＤＮＡウイルスである。ＨＢＶは約２０億人に感染しており、およそ２億４０００万人が慢性Ｂ型肝炎感染症（慢性ＨＢＶ）を有し、これは血液中に持続性のウイルスおよびサブウイルス粒子が６か月以上存在することによって特徴付けられる（Cohen et al. J. Viral Hepat. (2011)18(6), 377-83）。持続的なＨＢＶ感染は、ウイルスペプチドおよび循環性抗原によるＨＢＶ特異的Ｔ細胞受容体の慢性刺激を通して、循環性の肝内ＨＢＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴ細胞疲弊を招く。その結果、Ｔ細胞の多機能性が低下する（すなわち、ＩＬ－２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、ＩＦＮ－γのレベルの低下、および増殖の欠如）。
ＨＢＶ感染症に対する安全で有効な予防ワクチンは、１９８０年代から利用可能であり、Ｂ型肝炎予防の主力となっている（World Health Organization, Hepatitis B: Fact sheet No. 204; 2015 March）。世界保健機関は、すべての乳児へのワクチン接種を推奨しており、Ｂ型肝炎の流行性が低いかまたは中程度である国については、すべての小児および青年（１８歳未満）、ならびにリスクのある特定の集団カテゴリーへのワクチン接種を推奨している。ワクチン接種により、世界の感染率は劇的に低下した。しかし、予防ワクチンは、確立されたＨＢＶ感染症を治癒させることはない。
慢性ＨＢＶは、現在、ＩＦＮ－α、およびヌクレオシドアナログまたはヌクレオチドアナログによって処置されているが、ウイルスＲＮＡの鋳型として基本的役割を果たす共有結合閉環ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）と呼ばれる細胞内ウイルス複製中間体、したがって新たなビリオンが感染肝細胞内に持続するため、最終的な治癒には至らない。誘導されたウイルス特異的Ｔ細胞およびＢ細胞の応答は、ｃｃｃＤＮＡを保有する肝細胞を効率的に排除し得ると考えられている。ＨＢＶポリメラーゼを標的とする現在の治療法は、ウイルス血症を抑制するが、核内に存在するｃｃｃＤＮＡ、および関連する循環性抗原の産生に対する効果は限定的である。治癒の最も厳密な形態は、生物からのＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの排除であるが、これは天然に存在するアウトカムとしても、いかなる治療介入の結果としても観察されていない。しかし、疾患再燃は重度の免疫抑制の症例にのみ起こり得、その場合は予防的処置によって予防し得ることから、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の消失は、臨床的には確実に治癒に相当するものである。したがって、少なくとも臨床的な観点からは、ＨＢｓＡｇの消失は、ＨＢＶに対する最も厳格な免疫再構築の形態と関連している。
例えば、ペグ化インターフェロン（ｐｅｇＩＦＮ）－αによる免疫調節は、有限な処置コースによる非処置中の持続的な応答という点で、ヌクレオシド療法またはヌクレオチド療法と比較して優れることが証明されている。直接的な抗ウイルス効果に加えて、ＩＦＮ－αは、細胞培養物およびヒト化マウスにおいてｃｃｃＤＮＡのエピジェネティック抑制を生じさせ、ビリオン生産性および転写物の低減をもたらすことが報告されている（Belloni et al. J. Clin. Invest. (2012) 122(2), 529-537）。しかし、この治療法は、依然として副作用が多く、全体的な奏効性はむしろ低いが、これは一部には、ＩＦＮ－αがＨＢＶ特異的Ｔ細胞に及ぼす調節的な影響がわずかにとどまることが理由である。特に、治癒率が低く（１０％未満）、毒性が高い。同様に、直接作用型のＨＢＶ抗ウイルス剤、すなわち、ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤であるエンテカビルおよびテノホビルは、ウイルス抑制を誘導する点で単剤療法として有効であり、薬物耐性突然変異体の出現に対する高い遺伝子障壁、および肝疾患進行の連続的予防を伴う。しかし、ＨＢｓＡｇの消失または血清変換によって定義される慢性Ｂ型肝炎の治癒が、そのようなＨＢＶポリメラーゼ阻害剤によって達成されることは稀である。したがって、これらの抗ウイルス剤は、理論的には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する抗レトロウイルス療法と同様に、肝疾患の再発を予防するために無期限に投与される必要がある。
治療ワクチン接種は、慢性感染患者からＨＢＶを排除する可能性がある（Michel et al. J. Hepatol. (2011) 54(6), 1286-1296）。多くの戦略が検討されているが、現在までのところ、治療ワクチン接種が成功したことは証明されていない。
したがって、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、特に慢性ＨＢＶの処置には、より治癒率の高い、有限で、忍容性が良好な処置に対して、未だ対処されていない医療上の需要が存在する。本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物および方法を提供することによって、この需要を満たす。本発明の免疫原性組成物および方法を使用して、対象、例えば、慢性ＨＢＶ感染を有する対象に治療的免疫を提供することができる。
一般的な一態様では、本出願は、天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む核酸分子または核酸組合せに関する。一部の実施形態では、天然に存在しないポリヌクレオチド配列は、
５’末端から３’末端の順で、
（１）第１のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原をコードするポリヌクレオチド配列、
（２）第１の内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）エレメント、または第１の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および
第２のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
を含み、
ここで、第１のＨＢＶ抗原および第２のＨＢＶ抗原は、それぞれ独立して、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）抗原、およびＨＢＶ表面抗原からなる群から選択され、第１および第２のＨＢＶ抗原のうちの少なくとも１つは、ＨＢＶ表面抗原、好ましくはＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原またはＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原である。
一実施形態では、第１または第２のＨＢＶ抗原のうちの１つは、ＨＢＶコアまたはＨＢＶ ｐｏｌ抗原である。
一実施形態では、天然に存在しないポリヌクレオチド配列は、
５’末端から３’末端の順で、
（４）第２のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の３’末端に作動可能に連結された、第２のＩＲＥＳエレメント、または第２の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、ならびに
（５）ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原、およびＨＢＶ表面抗原からなる群から独立して選択される第３のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
をさらに含む。
別の実施形態では、天然に存在しないポリヌクレオチド配列は、
５’末端から３’末端の順で、
（６）第３のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の３’末端に作動可能に連結された、第３のＩＲＥＳエレメント、または第３の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、ならびに
（７）ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原、およびＨＢＶ表面抗原からなる群から独立して選択される第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
をさらに含む。
別の実施形態では、核酸分子または核酸組合せは、
５’末端から３’末端の順で、
（１）第１のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原をコードするポリヌクレオチド配列、
（２）第１の内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）エレメント、または第１の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および
（３）第２のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
を含む、第１の天然に存在しないポリヌクレオチド配列、ならびに
５’末端から３’末端の順で、
（１）第３のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原をコードするポリヌクレオチド配列、
（２）第２の内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）エレメント、または第２の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および
（３）第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
を含む、第２の天然に存在しないポリヌクレオチド配列
を含み、
ここで、第１および第２の天然に存在しないポリヌクレオチド配列は、第３の内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）エレメント、もしくは第３の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって連結されているか、または別個の核酸分子中に存在し、
第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原は、それぞれ独立して、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）抗原、およびＨＢＶ表面抗原からなる群から選択され、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のうちの少なくとも１つは、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原から選択されるＨＢＶ表面抗原であり、好ましくは、第１、第２、第３または第４のＨＢＶ抗原のうちの１つは、ＨＢＶコアまたはＨＢＶ ｐｏｌ抗原である。
別の実施形態では、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれは、互いに異なる。
別の実施形態では、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれは、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原；
（ｉｖ）配列番号７と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＢＶコア抗原；および
（ｖ）配列番号９と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原
からなる群から独立して選択され、
好ましくは、第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、ＨＢＶコア抗原ならびにＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれは、独立して、シグナルペプチドに作動可能に連結されており、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原は内部シグナルペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＨＢＶコア抗原は、配列番号８４、８５、または８６のうちの少なくとも１つと少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号８４、８５、または８６と少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。一部の実施形態では、ＨＢＶコア抗原の最後の５つのＣ末端アミノ酸は、ＶＶＲアミノ酸配列、より詳細には、ＶＶＲＲ（配列番号９１）アミノ酸配列、より詳細には、ＶＶＲＲＲ（配列番号９２）アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれは、
（ｉ）ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのコンセンサス配列；ならびに／または
（ｉｉ）ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１、もしくはＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１の１つもしくは複数のエピトープ
を含む。
一部の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原、およびＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれは、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１の１つまたは複数のエピトープを含む。
別の実施形態では、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれは、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなる第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列からなる第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原；
（ｉｖ）配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原；および
（ｖ）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ｐｏｌ抗原
からなる群から独立して選択され、
好ましくは、第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、ＨＢＶコア抗原ならびにＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれは、独立して、シグナルペプチド、例えば、配列番号７７のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドに作動可能に連結されている。
別の実施形態では、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれは、
（ｉ）配列番号２と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有する第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号４と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有する第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）配列番号６と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｖ）配列番号８と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；および
（ｖ）配列番号１０と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号１０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有するＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
からなる群から独立して選択され、
好ましくは、第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、ＨＢＶコア抗原ならびにＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列は、独立して、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原は内部シグナルペプチドを含む。
一部の実施形態では、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれは、
（ｉ）配列番号２の配列からなる第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号４の配列からなる第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）配列番号６の配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｖ）配列番号８７、配列番号８８または配列番号８９のうちのいずれか１つの配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；および
（ｖ）配列番号１０の配列からなるＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
からなる群から独立して選択され、
好ましくは、第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、ＨＢＶコア抗原ならびにＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列は、独立して、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号９０の配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。
一実施形態では、第１、第２および第３の自己プロテアーゼペプチドのそれぞれは、ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、トセアアシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、フラシェリーウイルス２ Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるペプチド配列を独立して含む。好ましくは、第１、第２および第３の自己プロテアーゼペプチドのそれぞれは、Ｐ２Ａのペプチド配列、例えば、配列番号１１のＰ２Ａ配列を含む。
別の実施形態では、第１、第２および第３のＩＲＥＳのそれぞれは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）またはエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）に由来する。好ましくは、第１、第２および第３のＩＲＥＳのそれぞれは、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、核酸分子または核酸組合せは、
５’末端から３’末端の順で、
（１）配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列もしくは配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列もしくは配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（３）配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（４）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（５）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（６）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（７）配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（８）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（９）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１０）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１１）配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１２）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１３）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１４）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１５）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１６）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１７）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１８）配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１９）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２０）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２１）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；または
（２２）配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
を含む、天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、ＨＢＶコア抗原ならびにＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列は、独立して、シグナルペプチド、例えば、配列番号７７のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
一実施形態では、核酸分子または核酸組合せは、配列番号１５から５４のうちのいずれか１つの天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む。
別の一般的な一態様では、本出願は、本出願の核酸分子または核酸組合せを含むベクターに関する。
一実施形態では、ベクターはＤＮＡプラスミドである。別の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡウイルスベクターまたはＲＮＡウイルスベクターである。一実施形態では、ベクターは、改変ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara）（ＭＶＡ）ベクターまたはアデノウイルスベクターである。一実施形態では、ベクターは、Ａｄ２６、Ａｄ３５、またはＭＶＡ－ＢＮベクターである。
別の一般的な一態様では、本出願は、
５’末端から３’末端の順で、
（１）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質媒介増幅のために必要な５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）；
（２）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質のうちの少なくとも１つ、好ましくはすべてをコードするポリヌクレオチド配列；
（３）ＲＮＡウイルスのサブゲノムプロモーター；
（４）本出願の核酸分子または核酸組合せ；および
（５）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質媒介増幅のために必要な３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）
を含む、ＲＮＡレプリコンに関する。
別の一般的な一態様では、本出願は、
５’末端から３’末端の順で、
（１）アルファウイルス５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、
（２）アルファウイルス非構造遺伝子ｎｓｐ１の５’複製配列、
（３）ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフ、
（４）第４の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
（５）アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチド配列、
（６）アルファウイルスサブゲノムプロモーター、
（７）本出願の核酸分子または核酸組合せ、
（８）アルファウイルス３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、ならびに
（９）任意選択で、ポリアデノシン配列
を含む、ＲＮＡレプリコンに関する。
一実施形態では、ＤＬＰモチーフは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＴＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（Ｕ ＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガッハウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウイルス（ＦＭＶ）、ヌドゥム（ＮＤＵＶ）、およびバギークリークウイルスからなる群から選択されるウイルス種に由来する。
別の実施形態では、第４の自己プロテアーゼペプチドは、ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、トセアアシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、フラシェリーウイルス２ Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、第４の自己プロテアーゼペプチドは、Ｐ２Ａのペプチド配列を含む。
別の一般的な一態様では、本出願は、
５’末端から３’末端の順で、
（１）配列番号５５のポリヌクレオチド配列を有する５’－ＵＴＲ、
（２）配列番号５６のポリヌクレオチド配列を有する５’複製配列、
（３）配列番号５７のポリヌクレオチド配列を含むＤＬＰモチーフ、
（４）配列番号１１のＰ２Ａ配列をコードするポリヌクレオチド配列、
（５）それぞれ配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１の核酸配列を有する、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチド配列、
（６）配列番号６２のポリヌクレオチド配列を有するサブゲノムプロモーター、
（７）本出願の核酸分子または核酸組合せ、ならびに
（８）配列番号６３のポリヌクレオチド配列を有する３’ＵＴＲ
を含むＲＮＡレプリコンに関する。
一実施形態では、Ｐ２Ａ配列をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２を含み、核酸分子または核酸組合せは、配列番号１５から５４のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡレプリコンは、レプリコンの３’末端にポリアデノシン配列をさらに含む。好ましくは、ポリアデノシン配列は、配列番号６４の配列を有する。
別の一般的な一態様では、本出願は、配列番号６５から７２のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡレプリコンに関する。
別の一般的な一態様では、本出願は、本出願のＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。好ましくは、核酸は、ＤＮＡ配列の５’末端に作動可能に連結されたＴ７プロモーターをさらに含む。より好ましくは、Ｔ７プロモーターは、配列番号７３のヌクレオチド配列を含む。
別の一般的な一態様では、本出願は、本出願の核酸分子もしくは核酸組合せ、ベクター、またはＲＮＡレプリコンと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
一実施形態では、薬学的に許容される担体は脂質ナノ粒子を含み、好ましくは、脂質ナノ粒子は、ＡＬＣ－０３１５、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＯＧＳ、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、γ－ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ、ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ｙ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ、またはＤＣＣｈｏｌのうちの１つまたは複数を含む。
別の実施形態では、医薬組成物は、（１）配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列もしくは配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；または（２）配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列もしくは配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。
別の一般的な一態様では、本出願は、対象にＨＢＶに対するワクチン接種を行うための方法であって、本出願の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法に関する。一実施形態では、本方法は、プライムブーストレジメンとして、同一な少なくとも１つのＨＢＶ抗原をコードする核酸分子または核酸組合せを含む第２の組成物を対象に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、プライムブーストレジメンは、本出願のＲＮＡレプリコンを含むプライミング組成物、およびＲＮＡレプリコンではないが、プライミング組成物と同一な少なくとも１つのＨＢＶエピトープ、好ましくは、同一な少なくとも１つのＨＢＶ抗原をコードするベクターを含むブースティング組成物を含む。一実施形態では、ブースティング組成物は、改変ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara）（ＭＶＡ）ベクター、アデノウイルスベクターまたはプラスミドベクターを含む。一部の実施形態では、ブースティング組成物は、Ａｄ２６、Ａｄ３５、またはＭＶＡ－ＢＮベクターを含む。一部の実施形態では、プライムブーストレジメンは、本出願のＲＮＡレプリコンを含むブースティング組成物、およびＲＮＡレプリコンではないが、ブースティング組成物と同一な少なくとも１つのＨＢＶエピトープ、例えば、同一な少なくとも１つのＨＬＡエピトープ、好ましくは、同一な少なくとも１つのＨＢＶ抗原をコードするベクターを含むプライミング組成物を含む。一実施形態では、プライミング組成物は、改変ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara）（ＭＶＡ）ベクター、アデノウイルスベクターまたはプラスミドベクターを含む。一部の実施形態では、プライミング組成物は、Ａｄ２６、Ａｄ３５、またはＭＶＡ－ＢＮベクターを含む。
別の一般的な一態様では、本出願は、対象においてＨＢＶの感染および／または複製を低減させるための方法であって、本出願の医薬組成物を対象に投与するステップ、または本出願の方法に従って対象にワクチン接種を行うステップを含む、方法に関する。
別の一般的な一態様では、本出願は、本出願の核酸分子もしくは核酸組合せ、ベクター、またはＲＮＡレプリコンを含む、単離された宿主細胞に関する。
別の一般的な一態様では、本出願は、本出願の核酸をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで転写するステップを含む、ＲＮＡレプリコンを産生する方法に関する。
別の一般的な一態様では、本出願は、それを必要とする対象においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答を誘導することに使用するための本出願の医薬組成物であって、好ましくは、対象が慢性ＨＢＶ感染を有し、任意選択で、別の免疫原性作用剤、好ましくは別の抗ＨＢＶ作用剤と組み合わされる、医薬組成物に関する。
別の一般的な一態様では、本出願は、それを必要とする対象においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）誘導性疾患を処置することに使用するための本出願の医薬組成物であって、好ましくは、対象が慢性ＨＢＶ感染を有し、ＨＢＶ誘導性疾患が、進行線維症、肝硬変および肝細胞癌（ＨＣＣ）からなる群から選択され、任意選択で、別の治療剤、好ましくは別の抗ＨＢＶ作用剤と組み合わされる、医薬組成物に関する。
本発明の他の態様、特色および利点は、本発明の詳細な説明、ならびにその好ましい実施形態および添付の特許請求の範囲を含む以下の開示から明らかであろう。
前述の概要、ならびに本発明の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読む場合、よりよく理解される。本発明は、図面に示される正確な実施形態に限定されるものではないことを理解されたい。
不活性化点突然変異を伴うＰｏｌ、Ｃ末端欠失を伴う切断型コア（配列番号７６）、ＰｒｅＳ２．Ｓ、およびシスタチンＳシグナルペプチド（配列番号７７）を示すＰｒｅＳ１を含む、抗原設計の概略図を示す。 二シストロン性および四シストロン性ワクチン設計の概略図を示す。 上位４つの二シストロン性および上位４つの四シストロン性ワクチン設計からのＨＢＶ抗原の相対的発現を示す一連のグラフである。Ｖｅｒｏ細胞におけるコア、ＰｒｅＳ２．ＳおよびＰｒｅＳ１発現をフローサイトメトリーにより測定し、単一遺伝子対照と比較してＭＦＩとして報告した。Ｐｏｌ発現はウエスタンブロットにより測定し、相対的発現はデンシトメトリーを用いて測定した。 （上記の通り。） 三シストロン性ワクチン設計からのＨＢＶ抗原の相対的発現を示す一連のグラフである。Ｖｅｒｏ細胞におけるコアおよびＰｒｅＳ２．Ｓ発現をフローサイトメトリーにより測定し、単一遺伝子対照と比較してＭＦＩとして報告した。Ｐｏｌ発現はウエスタンブロットにより測定し、相対的発現はデンシトメトリーを用いて測定した。 （上記の通り。） ＨＢＶ抗原をコードするＳＭＡＲＲＴレプリコンによるｉｎ ｖｉｖｏ免疫化の結果を示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、単一遺伝子性ＨＢＶ抗原または混合物をコードするＳＭＡＲＲＴレプリコンをｉ．ｍ．注射した。対照群として生理食塩水を注射した。プライミングから１４日後、脾臓を回収し、脾臓細胞を、コア（図４Ａ）、Ｐｏｌ（図４Ｂ）、ＰｒｅＳ２．Ｓ（図４Ｃ）およびＰｒｅＳ１（図４Ｄ）のための重複ペプチドプールで再刺激した。ＩＦＮγ産生細胞数をＥＬＩＳｐｏｔにより測定した。グラフは９５％ＣＩ（群あたりｎ＝５匹）の平均値を示し、統計的比較のためにＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を行った ＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１ （上記の通り。） ＨＢＶ抗原をコードするＳＭＡＲＲＴレプリコンによるｉｎ ｖｉｖｏ免疫化および第２週の再刺激の結果を示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、単一遺伝子性ＨＢＶ抗原または混合物をコードするＳＭＡＲＲＴレプリコンをｉ．ｍ．注射した。対照群として生理食塩水を注射した。プライミングから１４日後に、脾臓を回収し、脾臓細胞を、コア（図５Ａおよび図５Ｅ）、Ｐｏｌ（図５Ｂおよび図５Ｆ）、ＰｒｅＳ２．Ｓ（図５Ｃおよび図５Ｇ）およびＰｒｅＳ１（図５Ｄおよび図５Ｈ）についての重複ペプチドプールで、ブレフェルジンＡの存在下で６時間、再刺激した。ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞によるＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ－２産生を細胞内サイトカイン染色により測定した。多官能性は、細胞あたり１つ（ＩＦＮγ＋）、２つ（ＩＦＮγ＋ ＴＮＦα＋）または３つ（ＩＦＮγ＋ ＴＮＦα＋ ＩＬ－２＋）のサイトカインの産生によって決定されるようにプロットされる。グラフはＳＤを伴う平均値（群あたりｎ＝５匹）を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） ＨＢＶ抗原をコードするＳＭＡＲＲＴレプリコンによるｉｎ ｖｉｖｏ免疫化の結果を示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、単一遺伝子性または混合ＨＢＶ抗原、二遺伝子性抗原、または四シストロン性構築物をコードするＳＭＡＲＲＴレプリコンをｉ．ｍ．注射した。対照群として生理食塩水を注射した。プライミングから１４日後に、脾臓を回収し、脾臓細胞を、コア（図６Ａ）、Ｐｏｌ（図６Ｂ）、ＰｒｅＳ２．Ｓ（図６Ｃ）およびＰｒｅＳ１（図６Ｄ）の重複ペプチドプールで再刺激した。ＩＦＮγ産生細胞数をＥＬＩＳｐｏｔにより測定した。グラフは９５％ＣＩ（群あたりｎ＝５匹）の平均値を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） ＨＢＶ抗原をコードするＳＭＡＲＲＴレプリコンによるｉｎ ｖｉｖｏ免疫化および第２週の再刺激の結果を示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、単一遺伝子性または混合ＨＢＶ抗原、二遺伝子性抗原、または四シストロン性構築物をコードするＳＭＡＲＲＴレプリコンをｉ．ｍ．注射した。対照群として生理食塩水を注射した。プライミングから１４日後、脾臓を回収し、脾臓細胞を、コア（図７Ａ）、Ｐｏｌ（図７Ｂ）、ＰｒｅＳ２．Ｓ（図７Ｃ）およびＰｒｅＳ１（図７Ｄ）についての重複ペプチドプールで、ブレフェルジンＡの存在下で６時間、再刺激した。ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞によるＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ－２産生を細胞内サイトカイン染色により測定した。多官能性は、細胞あたり１つ（ＩＦＮγ＋）、２つ（ＩＦＮγ＋ ＴＮＦα＋）または３つ（ＩＦＮγ＋ ＴＮＦα＋ ＩＬ－２＋）のサイトカインの産生によって決定されるようにプロットされる。グラフはＳＤを伴う平均値（群あたりｎ＝５匹）を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。）
様々な刊行物、論文および特許が、背景および本出願の全体を通して引用または記載されているが、これらの参照のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、行為、材料、デバイス、品目などに関する考察は、本発明の内容を提供する目的のためである。そのような考察は、これらの事柄のいずれかまたはすべてが、開示または特許請求される任意の発明に対する先行技術の一部を形成すると認めるものではない。
別様に定義される場合を除き、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。そうでない場合は、本明細書で使用されるある特定の用語は、本明細書で定められる意味を有する。本明細書で引用されるすべての特許、公開された特許出願、および刊行物は、それらが本明細書に十分に記載されているように参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別のことを明白に示していない限り、複数のものへの言及を含むことに留意しなければならない。
別様に明記されている場合を除き、本明細書に記載されるあらゆる数値、例えば、パーセント配列同一性またはパーセント配列同一性の範囲は、すべての場合に、用語「約」によって修飾されていると理解される。したがって、数値は典型的には、挙げられた値の±１０％を含む。例えば、１０ｍｇの投与量は、９ｍｇから１１ｍｇまでを含む。本明細書で使用される場合、文脈が明白に別様であることを示していない限り、数値範囲の使用は、可能性のあるすべての部分範囲、ならびに値のそのような範囲および部分内の整数を含む、その範囲内のすべての個々の数値を明白に含む。
本明細書で使用される場合、挙げられた複数の要素の間の接続詞「および／または」は、個々のおよび組合せの選択肢の両方を範囲に含むと理解される。例えば、２つの要素が「および／または」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素を有しない第１の要素の適用性を指す。第２の選択肢は、第１の要素を有しない第２の要素の適用性を指す。第３の選択肢は、第１および第２の要素の両方の適用性を指す。これらの選択肢のうちの任意の１つがその意味に含まれ、したがって用語「および／または」が本明細書で使用される場合の必要条件を満たすと理解される。複数の選択肢の同時の適用性も、その意味に含まれ、したがって用語「および／または」の必要条件を満たすと理解される。
別様に示されていない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その一連のあらゆる要素を指すと理解される。当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、慣行の範囲を超えない実験を使用して認識するか、または確認することができる。そのような等価物は、本発明の範囲に含まれることが意図される。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈によって別様に要求されない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述された１つの整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の１つの整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の除外を意味しないと理解される。本明細書で使用される場合、用語「含むこと」は、用語「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」で代用することができ、または時には、本明細書で使用される場合、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」で代用することができる。
本明細書で使用される場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素に明記されていないいかなる要素、ステップ、または成分も除外する。本明細書で使用される場合、「本質的に～からなる」は、特許請求の範囲の基本的および新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップを除外しない。上記の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」はいずれも、本出願の一態様または一実施形態の文脈において本明細書で使用される場合は常に、本開示の範囲を変化させるために用語「からなる」または「本質的に～からなる」に置き換えることができる。
「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子によって認識される部位を形成するアミノ酸残基のセットである。
ＨＬＡタンパク質は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）として知られる第６染色体上に位置する領域を形成する遺伝子のクラスターによってコードされ、移植片拒絶においてＭＨＣ座位によってコードされるタンパク質の重要な役割が認識される。このため、ＨＬＡタンパク質はＭＨＣタンパク質とも称される。ＨＬＡまたはＭＨＣタンパク質は、細胞内の位置でペプチドに結合してそれを細胞表面に送達し、そこで結合リガンドをＴ細胞に認識させる細胞表面糖タンパク質である。クラスＩ ＭＨＣタンパク質は、身体の実質的にすべての有核細胞上に存在する。クラスＩ ＭＨＣタンパク質は細胞質に存在するペプチドに結合し、細胞表面に存在するペプチド－ＭＨＣタンパク質複合体を形成し、細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞によって認識される。クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質は通常、抗原提示細胞、例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、樹状細胞上にのみ存在する。各ＭＨＣクラスＩ受容体は、可変α鎖および比較的保存されたβ２ミクログロブリン鎖からなる。３つの異なる高い多型性のクラスＩα鎖遺伝子が同定されている。これらはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃと呼ばれる。α鎖の多様性により、集団内のさまざまなクラスＩ ＭＨＣ遺伝子のすべてが説明される。
アミノ酸配列を参照して使用される場合、語句「パーセント（％）配列同一性」または「％同一性」または「％同一の」は、アミノ酸配列の全長を構成するアミノ酸残基の数と比較して、２つ以上のアラインメントされたアミノ酸配列の同一のアミノ酸のマッチ（「ヒット」）の数を記載する。換言すれば、２つ以上の配列についてアラインメントを使用して、当該技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを使用して測定した場合に最大に一致するように、配列を比較およびアラインメントさせた場合、または手作業でアラインメントさせて目視で検査する場合に、同じアミノ酸残基のパーセンテージ（例えば、アミノ酸配列の全長にわたる９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を決定することができる。ヌクレオチド配列についても同じ決定を行うことができる。したがって、配列同一性を決定するために比較される配列は、アミノ酸の置換、付加、または欠失によって異なっていてもよい。タンパク質配列のアラインメントのための適切なプログラムは、当業者に公知である。タンパク質配列のパーセンテージ配列同一性は、プログラム、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴにより、例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul SF, et al (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389－3402）を使用して、決定することができる。
本明細書で使用される場合、２つ以上の治療法または構成要素の対象への投与の文脈における、用語および語句「組合せ」、「組み合わせて」、「同時送達」、および「共に投与される」は、２つ以上の治療法または構成要素、例えば、２つの核酸分子、例えば、ＲＮＡレプリコン、または免疫原性組成物およびアジュバントを同時に投与することを指す。「同時投与」は、少なくともその日における２つの構成要素の投与であり得る。２つの構成要素を「共に投与する」または「組み合わせて投与する」場合、それらは別個の組成物中で短時間の間に順次に、例えば、２４、２０、１６、１２、８または４時間にわたり、もしくは１時間以内に投与することもでき、またはそれらを単一の組成物中で同時に投与することもできる。用語「組み合わせて」の使用は、治療法または構成要素が対象に投与される順序を制限しない。例えば、第１の治療法または構成要素（例えば、第１の核酸分子）を、第２の治療法または構成要素（例えば、第２の核酸分子）の投与の前（例えば、５分から１時間前）に、付随するかもしくは同時に、またはその後（例えば、５分から１時間後）に投与することができる。一部の実施形態では、第１の治療法または構成要素（例えば、第１の核酸分子）および第２の治療法または構成要素（例えば、第２の核酸分子）は、同一の組成物中で投与される。他の実施形態では、第１の治療法または構成要素（例えば、第１の核酸分子）および第２の治療法または構成要素（例えば、第２の核酸分子）は、別個の組成物中で投与される。
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」核酸またはポリペプチドは、自然界に存在しない核酸またはポリペプチドを指す。「天然に存在しない」核酸またはポリペプチドは、研究室および／または製造環境において、合成、処理、製作、および／または他の操作が可能である。場合によっては、天然に存在しない核酸またはポリペプチドは、天然に存在する核酸またはポリペプチドに処理前に存在しなかった特性を示すように、処理、加工処理、または操作された、天然に存在する核酸またはポリペプチドを含み得る。本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」核酸またはポリペプチドは、それが発見された天然の供給源から単離または分離された核酸またはポリペプチドであり得、天然の供給源においてそれが結び付けられている配列への共有結合を欠く。「天然に存在しない」核酸またはポリペプチドは、組換えによって、または他の方法、例えば、化学合成を介して作製することができる。
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、そのように記載された構成要素が意図された方法で機能することを可能にする関係にある連結または並置を指す。例えば、目的の核酸配列に作動可能に連結された調節配列は、目的の核酸配列の転写を指示することができ、または目的のアミノ酸配列に作動可能に連結されたシグナル配列は、膜を越えて目的のアミノ酸配列を分泌または移動させることができる。
本明細書で使用される場合、用語「プライミング組成物」、「プライミング免疫化」または「プライム免疫化」は、本発明の第１の組成物を使用することによる一次抗原刺激を指す。具体的には、本明細書で使用される場合、免疫応答の「プライミング」または「増強」という用語は、所望の抗原に対する免疫応答を誘導する抗原を使用した第１の免疫化を指し、これはその後の同じ抗原による再免疫化時に、所望の抗原に対するより高いレベルの免疫応答を復帰させる。本明細書で使用される場合、用語「ブースティング組成物」、「ブースティング免疫化」または「ブースト免疫化」は、一次免疫化後の哺乳動物に投与される、または有効な追加免疫化を指す。具体的には、本明細書で使用される場合、免疫応答の「ブースティング」という用語は、プライミング免疫化においてコードされるのと同じ抗原を送達する組成物の投与を指す。
本明細書で使用される場合、「対象」は、本出願の実施形態に従う方法によって処置される、または処置された任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」は、任意の哺乳動物を範囲に含む。哺乳動物の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、例えば、サルまたは類人猿、ヒトが挙げられるが、これらに限定されず、より好ましくはヒトである。ヒト対象は患者を含み得る。
本出願の読者を助ける試みとして、記載は様々な段落もしくは節で区切られているか、または本出願の様々な実施形態を対象としている。これらの区切りは、段落もしくは節または実施形態の物質を、別の段落もしくは節または実施形態の物質と切り離すと考えるべきではない。その反対に、当業者は、記載が広い応用を有し、想定され得る様々な節、段落、および文章のすべての組合せを範囲に含むと理解するであろう。いかなる実施形態の考察も単に例示的であることを意味しており、特許請求の範囲を含む本開示の範囲は、これらの例に限定されると示唆することを意図していない。例えば、本明細書に記載の本出願のアルファウイルスレプリコンＲＮＡの実施形態は、特定の順序で配置されたある特定のプロモーター配列、エンハンサーまたは調節配列、シグナルペプチド、ＨＢＶ抗原のコード配列、ポリアデニル化シグナル配列などを含むがこれらに限定されない、特定の構成要素を含有し得るが、当業者は、本明細書で開示される概念が、本出願のアルファウイルスレプリコンＲＮＡにおいて使用され得る他の順序で配置された他の構成要素にも等しく該当し得ることを認識するであろう。本出願は、特定の組合せが明白に記載されているか否かにかかわらず、本出願のアルファウイルスレプリコンにおいて使用され得る任意の配列を有する任意の適用可能な構成要素の任意の組合せでの使用を想定している。
Ｂ型肝炎ウイルス
本明細書で使用される場合、「Ｂ型肝炎ウイルス」または「ＨＢＶ」は、ヘパドナウイルス科のウイルスを指す。ＨＢＶは、４つのオープンリーディングフレームおよび７つのタンパク質をコードする、小型（例えば、３．２ｋｂ）の肝臓指向性ＤＮＡウイルスである。ＨＢＶによってコードされる７つのタンパク質は、スモール（Ｓ）、ミディアム（Ｍ）、およびラージ（Ｌ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）またはエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質、プレコアタンパク質、コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、ならびにＨＢｘタンパク質を含む。ＨＢＶは、３つの表面抗原またはエンベロープタンパク質Ｌ、Ｍ、およびＳを発現し、このうちＳが最小であり、Ｌが最大である。ＭおよびＬタンパク質における余分なドメインはそれぞれ、Ｐｒｅ－Ｓ２およびＰｒｅ－Ｓ１と名付けられている。コアタンパク質は、ウイルスヌクレオカプシドのサブユニットである。Ｐｏｌは、ウイルスＤＮＡの合成に必要であり（逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ、およびプライマー）、これは感染された肝細胞の細胞質に局在するヌクレオカプシドで起こる。プレコアは、Ｎ末端シグナルペプチドを有するコアタンパク質であり、そのＮ末端およびＣ末端でタンパク質分解によりプロセシングされた後、感染された細胞からいわゆるＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）として分泌される。ＨＢｘタンパク質は、共有結合閉環ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の効率的な転写にとって必要である。ＨＢｘは、ウイルスの構造タンパク質ではない。ＨＢＶのすべてのウイルスタンパク質は、ｍＲＮＡを共有するコアおよびポリメラーゼを除き、自らのｍＲＮＡを有する。タンパク質プレコアを除き、ＨＢＶウイルスタンパク質はいずれも翻訳後タンパク質分解によるプロセシングを受けない。
ＨＢＶビリオンは、ウイルスエンベロープ、ヌクレオカプシド、および単一コピーの部分的二本鎖ＤＮＡゲノムを含有する。ヌクレオカプシドは、コアタンパク質の１２０個の二量体を含み、Ｓ、Ｍ、およびＬウイルスエンベロープ、または表面抗原タンパク質が埋め込まれたカプシド膜で覆われている。細胞内に侵入した後、ウイルスはコーティングが除去され、ウイルスポリメラーゼが共有結合したカプシド含有不完全二重鎖ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）が核に移行する。そのプロセスの間、コアタンパク質のリン酸化によって構造の変化が誘導され、核移行シグナルが露出して、カプシドといわゆるインポーチンとの相互作用が可能になる。これらのインポーチンは、コアタンパク質と核膜孔複合体との結合を媒介し、それによってカプシドが分解し、ポリメラーゼ／ｒｃＤＮＡ複合体が核に放出される。核内でｒｃＤＮＡが、脱タンパク質化され（ポリメラーゼの除去）、宿主ＤＮＡ修復機構によって共有結合閉環ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）ゲノムに変換され、そこからの重複性転写物が、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇ、コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼおよびＨＢｘタンパク質をコードする。コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼ、およびプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）は細胞質中で会合し、自己集合して未熟ｐｇＲＮＡ含有カプシド粒子となり、これはさらに成熟ｒｃＤＮＡカプシドに変換されて、エンベロープに包まれて感染性ウイルス粒子として分泌されるか、または核に逆輸送されて安定なｃｃｃＤＮＡプールを補充および維持するかのいずれかの共通の中間体として機能する。
現在までに、ＨＢＶは、エンベロープタンパク質に存在する抗原性エピトープに基づいて４つの血清型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗ）に、およびウイルスゲノムの配列に基づいて８つの遺伝子型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）に分類されている。ＨＢＶ遺伝子型は、異なる地域にわたって分布している。例えば、アジアで最も多い遺伝子型は、遺伝子型ＢおよびＣである。遺伝子型Ｄは、アフリカ、中東、およびインドで優勢であり、一方、遺伝子型Ａは、北部ヨーロッパ、サハラ以南アフリカ、および西アフリカで広く認められる。
ＨＢＶ抗原
本明細書で使用される場合、用語「ＨＢＶ抗原」、「ＨＢＶの抗原性ポリペプチド」、「ＨＢＶ抗原性ポリペプチド」、「ＨＢＶ抗原性タンパク質」、「ＨＢＶ免疫原性ポリペプチド」、および「ＨＢＶ免疫原」はすべて、対象においてＨＢＶに対する免疫応答を誘導することが可能なポリペプチドを指す。誘導される応答は、液性および／または細胞媒介性応答であり得る。ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶのポリペプチド、その断片もしくはエピトープ、または複数のＨＢＶポリペプチド、その一部もしくは誘導体の組合せであり得る。ＨＢＶ抗原は、宿主において保護的免疫応答を生じさせる、例えば、ウイルス疾患もしくは感染症に対する免疫応答を誘導することが可能であり、および／または対象において、ウイルス疾患もしくは感染症に対して対象を防御する、ウイルス疾患もしくは感染症に対する免疫を生じさせること（すなわち、ワクチン接種）が可能である。例えば、ＨＢＶ抗原は、任意のＨＢＶタンパク質、例えば、ＨＢｅＡｇ、プレコアタンパク質、ＨＢｓＡｇ（Ｓ、Ｍ、またはＬタンパク質）、コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼ、または任意のＨＢＶ遺伝子型、例えば、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、および／もしくはＨに由来するＨＢｘタンパク質からのポリペプチドまたはその免疫原性断片、またはその組合せを含み得る。
（１）ＨＢＶコア抗原
本明細書で使用される場合、用語「ＨＢＶコア抗原」、「ＨＢｃＡｇ」および「コア抗原」のそれぞれは、対象においてＨＢＶコアタンパク質に対する免疫応答を誘導することが可能なＨＢＶ抗原を指す。誘導される免疫応答は、液性および／または細胞媒介性応答であり得る。用語「コア」、「コアポリペプチド」、および「コアタンパク質」のそれぞれは、ＨＢＶウイルスコアタンパク質を指す。完全長のコア抗原は、典型的には、１８３アミノ酸長であり、アセンブリドメイン（アミノ酸１から１４９）および核酸結合ドメイン（アミノ酸１５０から１８３）を含む。３４残基の核酸結合ドメインは、プレゲノムＲＮＡカプシド形成にとって必要である。このドメインはまた、核輸入シグナルとしても機能する。これは、１７個のアルギニン残基を含み、その機能に一致して、高度に塩基性である。ＨＢＶコアタンパク質は溶液中で二量体であり、二量体は、正二十面体のカプシドへと自己集合する。コアタンパク質のそれぞれの二量体は、いずれかの側にα－ヘリックスドメインが隣接する４つのα－ヘリックスバンドルを有する。核酸結合ドメインを欠く切断型ＨＢＶコアタンパク質も、カプシドを形成することが可能である。
本出願の一実施形態では、ＨＢＶ抗原は、切断型ＨＢＶコア抗原である。本明細書で使用される場合、「切断型ＨＢＶコア抗原」は、ＨＢＶコアタンパク質の完全長を含有しないが、対象においてＨＢＶコアタンパク質に対する免疫応答を誘導することが可能なＨＢＶ抗原を指す。例えば、ＨＢＶコア抗原は、典型的に１７個のアルギニン（Ｒ）残基を含有するコア抗原の高度に正に荷電した（アルギニンリッチの）Ｃ末端核酸結合ドメインの１つまたは複数のアミノ酸を欠失させるように改変することができる。本出願の切断型ＨＢＶコア抗原は、好ましくは、ＨＢＶコア核輸入シグナルを含まないＣ末端切断型ＨＢＶコアタンパク質、および／またはＣ末端ＨＢＶコア核輸入シグナルが欠失している切断型ＨＢＶコアタンパク質である。一実施形態では、切断型ＨＢＶコア抗原は、Ｃ末端核酸結合ドメインの１から３４のアミノ酸残基の欠失、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４のアミノ酸残基の欠失、好ましくは、Ｃ末端核酸結合ドメインの３１～３４のＣ末端アミノ酸残基の欠失を含む。好ましい実施形態では、切断型ＨＢＶコア抗原は、Ｃ末端核酸結合ドメインの欠失を含み、好ましくは、Ｃ末端核酸結合ドメインの３１のＣ末端アミノ酸残基の欠失を含む。
一部の実施形態では、ＨＢＶコア抗原アミノ酸配列は、分泌のためのシグナルペプチドに作動可能に連結されている。任意の好適なシグナルペプチドを使用することができる。一実施形態では、ＨＢＶコア抗原は、分泌を増強するために、そのＮ末端でシスタチンＳ前駆体シグナルペプチドに作動可能に連結されている。特定の一実施形態では、シスタチンＳ前駆体シグナルペプチドは、配列番号７７のアミノ酸配列を有する。別の特定の実施形態では、ＨＢＶコア抗原のコード配列は、配列番号９０のポリヌクレオチド配列を有するシスタチンＳ前駆体シグナルペプチドのコード配列に作動可能に連結されている。
本出願のＨＢＶコア抗原は、複数のＨＢＶ遺伝子型（例えば、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）に由来するコンセンサス配列であり得る。本明細書で使用される場合、「コンセンサス配列」は、例えば、相同タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントによって決定される、相同タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントに基づく人工的なアミノ酸配列を意味する。アラインメントは、当該技術分野で公知の方法またはアルゴリズムを使用して、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して、実施することができる。これは、少なくとも１００個の天然のＨＢＶ単離体からのＨＢＶ抗原（例えば、コア、ｐｏｌなど）の配列に基づいて、配列アラインメントにおいて各位置で見出される最も頻度の高いアミノ酸残基の計算された順序であり得る。コンセンサス配列は、天然に存在しなくともよく、ネイティブウイルス配列と異なり得る。コンセンサス配列は、複数配列アラインメントツールを使用して、異なる起源からの複数のＨＢＶ抗原配列をアラインメントするステップ、および多様なアラインメント位置で最も頻度の高いアミノ酸を選択するステップによって設計することができる。好ましくは、ＨＢＶ抗原のコンセンサス配列は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来する。用語「コンセンサス抗原」は、コンセンサス配列を有する抗原を指すために使用される。
本出願による例示的な切断型ＨＢＶコア抗原は、核酸結合機能を欠いており、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することができる。好ましくは、切断型ＨＢＶコア抗原は、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導することができる。より好ましくは、切断型ＨＢＶコア抗原は、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することができる。
一部の実施形態では、本出願のＨＢＶコア抗原は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡアレルの１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、ＨＢＶコア抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１エピトープ、およびＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のエピトープを含む。好ましくは、ＨＢＶコア抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１エピトープ、およびＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１エピトープからなる群から選択されるＴ細胞エピトープのうちの２つ以上、例えば、２つ、３つ、または４つを含む。より好ましくは、ＨＢＶコア抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１、およびＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１ Ｔ細胞エピトープを含む。より好ましくは、ＨＢＶコア抗原は、１つまたは複数のＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープを含む。
一部の実施形態では、本出願のＨＢＶコア抗原は、コンセンサス抗原であり、好ましくは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤのうちの少なくとも２つ、好ましくはすべてに由来するコンセンサス抗原、より好ましくは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来する切断型コンセンサス抗原である。本出願による例示的な切断型ＨＢＶコアコンセンサス抗原は、配列番号８６と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号８６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＨＢＶコア抗原は、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。配列番号８６は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するコアコンセンサス抗原である。配列番号７は、ネイティブ性コア抗原の高度に正に荷電した（アルギニンリッチの）核酸結合ドメインの３４アミノ酸のＣ末端欠失を含有する。一部の好ましい実施形態では、本出願のＨＢＶコア抗原は、Ｃ末端アルギニン残基の１つまたは複数を保持しており、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６のアミノ酸配列を有し、それにより、ＨＢＶコア抗原においてＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープが復旧される。一部の実施形態では、ＨＢＶコア抗原の最後の５つのＣ末端アミノ酸は、ＶＶＲアミノ酸配列、より詳細には、ＶＶＲＲ（配列番号９１）アミノ酸配列、より詳細には、ＶＶＲＲＲ（配列番号９２）アミノ酸配列を含む。
本出願の特定の一実施形態では、ＨＢＶコア抗原は、配列番号７、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ＨＢＶコア抗原は、それぞれ配列番号８、配列番号８７、配列番号８８、または配列番号８９のポリヌクレオチド配列によってコードされる。好ましくは、ＨＢＶコア抗原は、配列番号８６のアミノ酸配列からなり、配列番号８９のポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＨＢＶコア抗原は、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１９／０１８５８２８号明細書に記載されているアミノ酸配列からなり、または記載されているポリヌクレオチド配列によってコードされる。
（２）ＨＢＶポリメラーゼ抗原
本明細書で使用される場合、用語「ＨＢＶポリメラーゼ抗原」、「ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原」または「ＨＢＶ ｐｏｌ抗原」は、対象においてＨＢＶポリメラーゼに対する免疫応答を誘導することが可能なＨＢＶ抗原を指す。免疫応答は、液性および／または細胞媒介性応答であり得る。用語「ポリメラーゼ」、「ポリメラーゼポリペプチド」、「Ｐｏｌ」および「ｐｏｌ」のそれぞれは、ＨＢＶウイルスＤＮＡポリメラーゼを指す。ＨＢＶウイルスＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ末端からＣ末端の順で、マイナス鎖ＤＮＡ合成のプライマーとして作用する末端タンパク質（ＴＰ）ドメイン、ポリメラーゼ機能にとって必須ではないスペーサー、転写のための逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、およびＲＮアーゼＨドメインを含む、４つのドメインを有する。
本出願の一実施形態では、ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原、またはそれらの任意の免疫原性断片もしくは組合せを含む。ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、例えば、ある特定の酵素活性を減少させるかまたは実質的に排除するために、ポリメラーゼおよび／またはＲＮアーゼドメインの活性部位に突然変異を導入することによって、抗原の免疫原性を改善するためのさらなる改変をさらに含有し得る。
好ましくは、本発明のＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有さず、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することができる。好ましくは、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、哺乳動物において、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤのうちの少なくとも２つ、好ましくはすべてに対するＴ細胞応答を誘導することができる。より好ましくは、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、ヒト対象において、少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することができる。
したがって、一部の実施形態では、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、不活性化Ｐｏｌ抗原である。一実施形態では、不活性化ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、ポリメラーゼドメインの活性部位に１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。別の実施形態では、不活性化ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、ＲＮアーゼＨドメインの活性部位に１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。好ましい一実施形態では、不活性化ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、ポリメラーゼドメインおよびＲＮアーゼＨドメインの両方の活性部位に１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。例えば、ヌクレオチド／金属イオン結合のために必要なことがある、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原のポリメラーゼドメインにおける「ＹＸＤＤ」モチーフ（配列番号７４）を、例えば、アスパラギン酸残基（Ｄ）の１つまたは複数をアスパラギン残基（Ｎ）に置き換えることによって突然変異させて、金属配位機能を排除するかまたは低減させ、それによって逆転写酵素機能を減少させるかまたは実質的に排除することができる。「ＹＸＤＤ」モチーフ（配列番号７４）の突然変異に対して代替的または追加的に、Ｍｇ２＋配位のために必要なＨＢＶ ｐｏｌ抗原のＲＮアーゼＨドメインにおける「ＤＥＤＤ」モチーフ（配列番号７５）を、例えば、１つもしくは複数のアスパラギン酸残基（Ｄ）をアスパラギン残基（Ｎ）に置き換える、および／またはグルタミン酸残基（Ｅ）をグルタミン（Ｑ）に置き換えることによって突然変異させ、それによってＲＮアーゼＨ機能を減少させるかまたは実質的に排除することもできる。特定の一実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、（１）ポリメラーゼドメインの「ＹＸＤＤ」モチーフ（配列番号７４）におけるアスパラギン酸残基（Ｄ）をアスパラギン残基（Ｎ）に突然変異させること、ならびに（２）ＲＮアーゼＨドメインの「ＤＥＤＤ」モチーフ（配列番号７５）における第１のアスパラギン酸残基（Ｄ）をアスパラギン残基（Ｎ）に、および第１のグルタミン酸残基（Ｅ）をグルタミン残基（Ｎ）に突然変異させることによって改変され、それによってｐｏｌ抗原の逆転写酵素機能およびＲＮアーゼＨ機能の両方が減少するかまたは実質的に排除される。
一部の実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原アミノ酸配列は、分泌のためのシグナルペプチドに作動可能に連結されている。任意の好適なシグナルペプチドを使用することができる。一実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、分泌を増強するために、そのＮ末端でシスタチンＳ前駆体シグナルペプチドに作動可能に連結されている。特定の一実施形態では、シスタチンＳ前駆体シグナルペプチドは、配列番号７７のアミノ酸配列を有する。別の特定の実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原のコード配列は、配列番号９０のポリヌクレオチド配列を有するシスタチンＳ前駆体シグナルペプチドのコード配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、本出願のＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡアレルの１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１エピトープ、およびＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のエピトープを含む。好ましくは、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１エピトープ、およびＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１からなる群から選択されるＴ細胞エピトープの２つ以上、例えば、２つ、３つ、または４つを含む。より好ましくは、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、およびＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１ Ｔ細胞エピトープを含む。より好ましくは、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、１つまたは複数のＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープを含む。
本出願の好ましい一実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、コンセンサス抗原であり、好ましくは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤのうちの少なくとも２つ、好ましくはすべてに由来するコンセンサス抗原、より好ましくは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来する不活性化コンセンサス抗原である。本出願による例示的なＨＢＶ ｐｏｌコンセンサス抗原は、配列番号９と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の、好ましくは、配列番号９と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号９と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。配列番号９は、ポリメラーゼおよびＲＮアーゼＨドメインの活性部位に位置する４つの突然変異を含む、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するｐｏｌコンセンサス抗原である。特に、この４つの突然変異は、ポリメラーゼドメインの「ＹＸＤＤ」モチーフ（配列番号７４）におけるアスパラギン酸残基（Ｄ）のアスパラギン残基（Ｎ）への突然変異；ならびに、ＲＮアーゼＨドメインの「ＤＥＤＤ」（配列番号７５）モチーフにおける第１のアスパラギン酸残基（Ｄ）のアスパラギン残基（Ｎ）への突然変異およびグルタミン酸残基（Ｅ）のグルタミン残基（Ｑ）への突然変異を含む。
本出願の特定の一実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、配列番号９のアミノ酸配列からなる。別の特定の実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１９／０１８５８２８号明細書に記載されているアミノ酸配列を含有するか、もしくはそれからなり、または記載されているポリヌクレオチド配列によってコードされる。
（３）ＨＢＶ表面抗原
本明細書で使用される場合、用語「ＨＢＶ表面抗原」、「表面抗原」、「ＨＢＶエンベロープ抗原」、「エンベロープ抗原」および「ｅｎｖ抗原」のそれぞれは、対象において１つまたは複数のＨＢＶ表面抗原またはエンベロープタンパク質に対する免疫応答を誘導するかまたは誘発することができるＨＢＶ抗原を指す。免疫応答は、液性および／または細胞媒介性応答であり得る。用語「ＨＢＶ表面タンパク質」、「表面タンパク質」、「ＨＢＶエンベロープタンパク質」および「エンベロープタンパク質」のそれぞれは、ＨＢＶウイルス表面タンパク質またはエンベロープタンパク質を指す。ＨＢＶは３つの表面抗原、またはエンベロープタンパク質を発現する。遺伝子Ｓは、表面抗原をコードするＨＢＶゲノムの遺伝子である。表面抗原遺伝子は、１つの長いオープンリーディングフレームであるが、遺伝子を３つの区画ｐｒｅ－Ｓ１、ｐｒｅ－Ｓ２、およびＳに分ける３つのインフレーム「開始」（ＡＴＧ）コドンを含有する。複数の開始コドンがあることから、ラージ（Ｌ）またはＬ表面抗原、ミドル（Ｍ）またはＭ表面抗原、およびスモール（Ｓ）またはＳ－表面抗原と呼ばれる３つの異なるサイズのポリペプチドが産生され、これらはＨＢＶ Ｌ、ＭおよびＳエンベロープタンパク質とも名付けられる。２種類のプロモーター（ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２）が、Ｌ、Ｍ、およびＳ－表面抗原コード配列の転写を作動させ、その結果、３つの異なる翻訳されたタンパク質であるＬ、ＭおよびＳエンベロープタンパク質が生じる。ＰｒｅＳ２プロモーターは時にＰｒｅＳ２／Ｓプロモーターとも称されるが、これはそれがＭ表面抗原およびＳ表面抗原の転写を別個に作動させるためである。Ｌ表面抗原のアミノ酸配列は、ＭおよびＳ表面抗原の配列とインフレームにある。したがって、Ｌ表面抗原は、ＭおよびＳ表面抗原ドメインを含有し、Ｍ表面抗原はＳ表面抗原ドメインを含む。Ｌ、ＭおよびＳ表面抗原は、共通のＣ末端を有し、Ｓドメイン全体を共有する。Ｓに比して、Ｍは追加のドメインであるｐｒｅ－Ｓ２をそのＮ末端に有し、Ｍに比して、Ｌはｐｒｅ－Ｓ１ドメインを有する。
一部の実施形態では、ＨＢＶ抗原はＨＢＶ ＰｒｅＳ１抗原であり、これはｐｒｅ－Ｓ１遺伝子区画によってコードされ、Ｌ抗原のＰｒｅ－Ｓ１ドメインのみを含有する。ＰｒｅＳ１抗原は、さまざまな長さを有し得、例えば、９９から１０９アミノ酸を有し得る。本出願のＨＢＶ ＰｒｅＳ１抗原は、天然に存在する任意のＰｒｅＳ１ドメイン、およびそのバリアントまたは誘導体の配列を含有し得る。
他の実施形態では、ＨＢＶ抗原はＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原であり、これはｐｒｅ－Ｓ２およびＳ遺伝子区画によってコードされ、ＰｒｅＳ２ドメインおよびＳドメインを含有する。ＰｒｅＳ２ドメインは約５５アミノ酸長であり得、Ｓ－ドメインは約２２６アミノ酸を含有し得る。本出願のＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原は、天然に存在する任意のＰｒｅＳ２およびＳドメイン、ならびにそれらのバリアントまたは誘導体の配列を含有し得る。一部の実施形態では、ＰｒｅＳ２．Ｓの内部シグナルペプチドは、ＨＢＶ ＭおよびＨＢＶ Ｓ抗原のＰｒｅＳ２．Ｓタンパク質産物の分泌を助長するために無傷のまま残される。一実施形態では、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原は、ＨＢＶ Ｍ表面抗原である。別の実施形態では、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原は、ＨＢＶ Ｓ表面抗原である。さらに別の実施形態では、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原は、ＨＢＶ Ｍ表面抗原およびＨＢＶ Ｓ表面抗原を範囲に含む。
一部の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原アミノ酸配列は、分泌のためのシグナルペプチドに作動可能に連結されているか、またはそれを含有する。任意の好適なシグナルペプチドを使用することができる。一実施形態では、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原アミノ酸配列は、分泌を増強するために、そのＮ末端でシスタチンＳ前駆体シグナルペプチドに作動可能に連結されている。特定の一実施形態では、シスタチンＳ前駆体シグナルペプチドは、配列番号７７のアミノ酸配列を有する。別の特定の実施形態では、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原のコード配列は、配列番号９０のポリヌクレオチド配列を有するシスタチンＳ前駆体シグナルペプチドのコード配列に作動可能に連結されている。
本出願の一実施形態では、ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ表面抗原、またはその任意の免疫原性断片または組合せを含む。ＨＢＶ表面抗原は、対象において、Ｌ表面抗原タンパク質、Ｍ表面抗原タンパク質、およびＳ表面抗原タンパク質のうちの少なくとも１つに対して免疫応答を誘導することができる。好ましくは、ＨＢＶ表面抗原、例えば、Ｐｒｅ－Ｓ１またはＰｒｅＳ２．Ｓ抗原は、コンセンサス抗原であり、好ましくは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤのうちの少なくとも２つに由来するコンセンサス抗原、より好ましくは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するコンセンサス抗原である。
一部の実施形態では、本出願のＨＢＶ表面抗原は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡアレルの１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープ、およびＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含む。好ましくは、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープおよびＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含む。より好ましくは、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１およびＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ Ｔ細胞エピトープを含む。より好ましくは、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原は、１つまたは複数のＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープを含む。好ましくは、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープ、およびＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含む。より好ましくは、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、およびＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２ Ｔ細胞エピトープを含む。より好ましくは、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原は、１つまたは複数のＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープを含む。
本出願の一部の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、Ｐｒｅ－Ｓ１抗原である。本出願による例示的なＰｒｅ－Ｓ１抗原は、配列番号１または配列番号３と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号１または配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。本出願の一部の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、Ｐｒｅ－Ｓ２．Ｓ抗原である。本出願による例示的なＰｒｅ－Ｓ２．Ｓ抗原は、配列番号５と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
本出願の特定の一実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列からなるＰｒｅ－Ｓ１抗原である。別の特定の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、配列番号２または配列番号４のポリヌクレオチド配列によってコードされる。別の特定の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、配列番号５のアミノ酸配列からなるＰｒｅ－Ｓ２．Ｓ抗原である。別の特定の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、配列番号６のポリヌクレオチド配列によってコードされる。
本出願の一部の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、Ｓ表面抗原である。本出願による例示的なＳ表面抗原は、配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列からなる。配列番号８１は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するＨＢＶコンセンサスＳ表面抗原である。本出願の特定の一実施形態では、Ｓ表面抗原は、配列番号７９のアミノ酸配列からなる。別の特定の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、配列番号７８のポリヌクレオチド配列によってコードされる。
一部の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、Ｍ表面抗原、またはその任意の免疫原性断片もしくは組合せである。好ましくは、Ｍ表面抗原は、コンセンサス抗原であり、好ましくは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤのうちの少なくとも２つ、好ましくはすべてに由来するコンセンサス抗原、より好ましくは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するコンセンサス抗原である。好ましくは、Ｍ表面抗原は、対象においてＭ表面抗原に対する免疫応答を誘導するかまたは誘発することができる。
本出願による例示的なＭ表面抗原は、配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。配列番号８２は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するＨＢＶコンセンサスＭ表面抗原である。本出願の特定の一実施形態では、Ｍ表面抗原は、配列番号８２のアミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、Ｌ表面抗原、またはその任意の免疫原性断片もしくは組合せである。好ましくは、Ｌ表面抗原は、コンセンサス抗原であり、好ましくは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤのうちの少なくとも２つ、好ましくはすべてに由来するコンセンサス抗原、より好ましくは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するコンセンサス抗原である。好ましくは、Ｌ表面抗原は、対象においてＬ表面抗原に対する免疫応答を誘導するかまたは誘発することができる。
本出願による例示的なＬ表面抗原は、配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。配列番号８３は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するＨＢＶコンセンサスＬ表面抗原である。本出願の特定の一実施形態では、Ｍ表面抗原は、配列番号８３のアミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面抗原のうちのいずれか１つの一部分、またはそれらの任意の組合せを含む。例えば、ＨＢＶ表面抗原は、Ｎ末端Ｌ表面抗原ドメインを含むか、またはそれからなることができる。ＨＢＶ表面抗原はまた、Ｍ表面抗原ドメインを含むか、またはそれからなることもできる。ＨＢＶ表面抗原はまた、Ｎ末端Ｌ表面抗原ドメインおよびＭ表面抗原ドメインを含むか、またはそれからなることもできる。ＨＢＶ表面抗原はまた、Ｎ末端Ｌ表面抗原ドメイン、Ｍ表面抗原ドメイン、およびＳ表面抗原ドメインの一部分を含むか、またはそれからなることもできる。
本出願によるそのような表面抗原の例示的な一例は、配列番号８１のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号８１と少なくとも９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の、好ましくは、配列番号８１と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号８１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列からなる。配列番号８１は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するコンセンサス抗原であり、Ｎ末端Ｌ表面抗原ドメイン、Ｍ表面抗原ドメイン全体、およびＳ表面抗原ドメインからの１５アミノ酸Ｃ末端尾部を含有する。本出願の特定の一実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、配列番号８１のアミノ酸配列からなる。別の特定の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、ＨＢＶ表面抗原をコードする配列番号８０のポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＨＢＶ表面抗原は、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第１９１８０９２６号明細書に記載されているアミノ酸配列からなる、または記載されているポリヌクレオチド配列によってコードされる。
ポリヌクレオチドおよびベクター
別の一般的な一態様では、本出願は、本出願によるＨＢＶ抗原をコードする非天然のポリヌクレオチド配列を含む核酸分子または核酸組合せ、および天然に存在しない核酸を含むベクターを提供する。核酸分子は、本出願のＨＢＶ抗原をコードする天然に存在しない任意のポリヌクレオチド配列を含むことができ、これは本開示に鑑みて当該技術分野で公知の方法を使用して作製することができる。好ましくは、天然に存在しないポリヌクレオチドは、本出願の切断型ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶポリメラーゼ抗原、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、およびＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ２．Ｓ抗原のうちの少なくとも１つをコードする。ポリヌクレオチドは、組換え手法（例えば、クローニング）によって得られるか、または合成（例えば、化学合成）によって生成される、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含有し得る。例えば、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはその組合せを含み得る。ポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドでもあり得る。本出願のポリヌクレオチドおよびベクターは、組換えタンパク質産生、宿主細胞におけるタンパク質の発現、またはウイルス粒子の産生のために使用することができる。好ましくは、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
本出願の一実施形態では、核酸分子または核酸組合せは、配列番号７、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号７、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の、好ましくは配列番号７、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６と９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む。本出願の特定の一実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号７、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする。好ましくは、切断型ＨＢＶコア抗原は、配列番号８６からなる。
配列番号７、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする本出願のポリヌクレオチド配列の例としては、それぞれ配列番号８、配列番号８７、配列番号８８、または配列番号８９と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号８、配列番号８７、配列番号８８、または配列番号８９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の、好ましくは、配列番号８、配列番号８７、配列番号８８、または配列番号８９と９８％、９９％または１００％同一のポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これに限定されない。切断型ＨＢＶコア抗原をコードする例示的な天然に存在しない核酸分子は、配列番号８、配列番号８７、配列番号８８、または配列番号８９のポリヌクレオチド配列を有する。好ましくは、切断型ＨＢＶコア抗原をコードする分子は、配列番号８９のポリヌクレオチド配列を有する。
本出願の一実施形態では、核酸分子または核酸組合せは、配列番号９と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む。本出願の特定の一実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする。
配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原をコードする本出願のポリヌクレオチド配列の例としては、配列番号１０と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号１０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の、好ましくは、配列番号１０と９８％、９９％または１００％同一のポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これに限定されない。ＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードする例示的な天然に存在しない核酸分子は、配列番号１０のポリヌクレオチド配列を有する。
本出願の一実施形態では、核酸分子または核酸組合せは、配列番号１または配列番号３と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号１または配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の、好ましくは配列番号１または配列番号３と９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードする天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む。本出願の特定の一実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードする。
配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードする本出願のポリヌクレオチド配列の例としては、それぞれ配列番号２または配列番号４と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号２または配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の、好ましくは、配列番号２または配列番号４と９８％、９９％または１００％同一のポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これに限定されない。ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードする例示的な天然に存在しない核酸分子は、配列番号２または４のポリヌクレオチド配列を有する。
本出願の一実施形態では、核酸分子または核酸組合せは、配列番号５と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の、好ましくは、配列番号５と９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ２．Ｓ抗原をコードする天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む。本出願の特定の一実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ２．Ｓ抗原をコードする。
配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ２．Ｓ抗原をコードする本出願のポリヌクレオチド配列の例としては、それぞれ配列番号６と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の、好ましくは、配列番号６と９８％、９９％または１００％同一のポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これに限定されない。ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ２．Ｓ抗原をコードする例示的な天然に存在しない核酸分子は、配列番号６のポリヌクレオチド配列を有する。
本出願の一実施形態では、核酸分子または核酸組合せは、５’末端から３’末端の順で、第１のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、第１の内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）エレメント、または第１の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および第２のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列をコードする、天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含み、ここで、第１および第２のＨＢＶ抗原のうちの少なくとも１つはＨＢＶ表面抗原である。一部の実施形態では、天然に存在しないポリヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端の順で、第２のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の３’末端に作動可能に連結された、第２のＩＲＥＳエレメント、または第２の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および第３のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、天然に存在しないポリヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端の順で、第３のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の３’末端に作動可能に連結された、第３のＩＲＥＳエレメント、または第３の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。
一部の実施形態では、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、第１のＨＢＶ表面抗原；（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、第２のＨＢＶ表面抗原；（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、第３のＨＢＶ表面抗原；（ｉｖ）配列番号７と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＢＶコア抗原；および（ｖ）配列番号９と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原からなる群から独立して選択される。一部の実施形態では、ＨＢＶコア抗原は、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。
一部の実施形態では、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれは、（ｉ）配列番号２と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有する第１のＨＢＶ ＰｒｅＳ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号４と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有する第２のＨＢＶ ＰｒｅＳ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号６と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号８と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；および（ｖ）配列番号１０と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号１０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列からなる群から独立して選択される。一部の実施形態では、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号８７、配列番号８８、または配列番号８９と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号８７、配列番号８８、または配列番号８９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。
一部の実施形態では、第１、第２および第３の自己プロテアーゼペプチドのそれぞれは、ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、トセアアシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、フラシェリーウイルス２ Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるペプチド配列を独立して含む。好ましくは、第１、第２および第３の自己プロテアーゼペプチドのそれぞれは、Ｐ２Ａのペプチド配列、例えば、配列番号１１のＰ２Ａ配列を含む。好ましくは、Ｐ２Ａペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２である。
一部の実施形態では、第１、第２および第３のＩＲＥＳのそれぞれは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）またはエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）に由来し、好ましくは、第１、第２および第３のＩＲＥＳのそれぞれは、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を含む。
本出願のある実施形態では、核酸分子または組合せは、５’末端から３’末端に、（１）配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５もしくは８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（２）配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５もしくは８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（３）配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（４）配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（５）配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（６）配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（７）配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、
配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは、配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（８）配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは、配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（９）配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは、配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（１０）配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（１１）配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（１２）配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、（１３）配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、（１４）配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、
配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（１５）配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（１６）配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（１７）配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８６のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（１８）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（１９）配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは、配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（２０）配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（２１）配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（２２）配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；（２３）配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；ならびに（２４）配列番号７のアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列からなる、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号５のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む、天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＨＢＶ抗原の各々は、分泌のためのシグナルペプチド配列に独立して作動可能に連結されているか、またはそれを含有する。任意の適切なシグナルペプチド配列を使用することができる。好ましくは、ＨＢＶ ＰｒｅＳ１抗原、ＨＢＶコア抗原、およびＨＢＶ ｐｏｌ抗原の各々について、シグナルペプチドは、抗原配列のＮ末端に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号７７のアミノ酸配列を含有し、好ましくは、シグナルペプチドは、配列番号９０のヌクレオチド配列によってコードされる。
一部の実施形態では、核酸分子または核酸の組合せは、配列番号１５～５４のいずれか１つの天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子または核酸の組合せは、配列番号１５～５４の少なくとも２つの天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む。
本出願はまた、ＨＢＶ抗原をコードする天然に存在しないポリヌクレオチドを含むベクターに関する。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、遺伝物質を別の細胞に運ぶために使用される核酸分子であり、複製および／または発現され得る。本開示に照らして当業者に公知である任意のベクターを使用することができる。ベクターの例としては、限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、コスミド、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられる。好ましくは、ベクターはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであり得る。当業者は、本開示に照らして、標準的な組換え技術を介して本出願のベクターを構築することができる。
本出願のベクターは、発現ベクターであり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」とは、転写され得るＲＮＡをコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物を指す。発現ベクターには、限定されないが、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターなどの組換えタンパク質発現用ベクター、およびＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターのなどの対象の組織における発現のための対象への核酸送達用ベクターが含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者には理解される。
本出願のベクターは、種々の調節配列を含有することができる。本明細書で使用される場合、用語「調節配列」とは、宿主細胞または生物への核酸またはその誘導体（すなわち、ｍＲＮＡ）の複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、安定性および／または輸送を含む、核酸分子の機能的調節を可能にし、寄与し、またはモジュレートする任意の配列を指す。本開示の文脈において、この用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡ安定性に影響するエレメント）を包含する。
本出願の一部の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。非ウイルスベクターの例としては、限定されないが、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージなどが挙げられる。好ましくは、非ウイルスベクターはＤＮＡプラスミドである。「ＤＮＡプラスミド」は、「ＤＮＡプラスミドベクター」、「プラスミドＤＮＡ」または「プラスミドＤＮＡベクター」と交換可能に使用され、適切な宿主細胞において自律的複製が可能である二本鎖および一般的に環状のＤＮＡ配列を指す。コードされたポリヌクレオチドの発現に使用されるＤＮＡプラスミドは、典型的には、複製起点、多重クローニング部位、および、例えば、抗生物質耐性遺伝子であり得る選択マーカーを含む。使用することができる適切なＤＮＡプラスミドの例としては、限定されないが、周知の発現系（原核系と真核系の両方を含む）において使用するための市販の適切な発現ベクター、例えば、大腸菌におけるタンパク質の産生および／または発現に使用することができるｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；酵母のサッカロマイセスセレヴィシエ株における産生および／または発現に使用することができるｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；昆虫細胞における産生および／または発現に使用することができるＭＡＸＢＡＣ（登録商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；哺乳動物細胞における高レベルの構成タンパク質発現に使用することができるｐｃＤＮＡ（商標）またはｐｃＤＮＡ３（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ほとんどの哺乳動物細胞において目的のタンパク質を高レベルで一過性に発現させるために使用することができるｐＶＡＸまたはｐＶＡＸ－１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。任意の市販のＤＮＡプラスミドの骨格を修飾して、宿主細胞におけるタンパク質発現を最適化することができ、例えば、日常的な技術および容易に入手可能な出発材料を使用することによって、ある特定のエレメント（例えば、複製起点および／または抗生物質耐性カセット）の配向を逆にし、プラスミドに内在性のプロモーター（例えば、抗生物質耐性カセット中のプロモーター）を置換し、および／または転写されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子のコード配列）を置換することができる。（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)を参照されたい）。
好ましくは、ＤＮＡプラスミドは、哺乳動物宿主細胞におけるタンパク質発現に適した発現ベクターである。哺乳動物宿主細胞におけるタンパク質発現に適した発現ベクターには、限定されないが、例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）、ｐｃＤＮＡ３（商標）、ｐＶＡＸ、ｐＶＡＸ－１、ＡＤＶＡＸ、ＮＴＣ８４５４などが含まれる。好ましくは、発現ベクターはｐＶＡＸ－１に基づいており、これをさらに修飾して哺乳動物細胞におけるタンパク質発現を最適化することができる。ｐＶＡＸ－１は、ＤＮＡワクチンにおいて一般的に使用されるプラスミドであり、強力なヒト中間型初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ－ＩＥ）プロモーター、続いてウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）由来ポリアデニル化配列（ｐＡ）を含有する。ｐＶＡＸ－１はさらに、細菌プラスミドの増殖を可能にする小さな原核生物プロモーターによって駆動されるｐＵＣ複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子を含有する。
本出願のベクターはまた、ウイルスベクターであり得る。一般的に、ウイルスベクターは、修飾されたウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを有する遺伝子操作されたウイルスであって、非感染性にされたものであるが、ウイルスプロモーターおよび導入遺伝子をなおも含有し、したがって、ウイルスプロモーターを介して導入遺伝子の翻訳を可能にする。ウイルスベクターはしばしば感染性配列を欠いているため、大規模トランスフェクションのためにヘルパーウイルスまたはパッケージング系を必要とする。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるベクターは、例えば、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス（例えば、修飾されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ））、組換えアルファウイルス、例えば、セムリキ森林ウイルス、組換えパラミクソウイルス、例えば、組換え麻疹ウイルス、または別の組換えウイルスである。使用することができるウイルスベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、腸内ウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるベクターは、ＭＶＡベクターである。ベクターはまた、非ウイルスベクターであり得る。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、例えば、組換えアデノウイルスベクターである。組換えアデノウイルスベクターは、例えば、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ、またはＡｄＨｕ）、またはサルアデノウイルス、例えば、チンパンジーもしくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、またはＳＡｄＶ）またはアカゲザルアデノウイルス（ｒｈＡｄ）に由来し得る。好ましくは、アデノウイルスベクターは、組換えヒトアデノウイルスベクター、例えば、組換えヒトアデノウイルス血清型２６、または組換えヒトアデノウイルス血清型５、４、３５、７、４８などのいずれか１つである。他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ｒｈＡｄベクター、例えば、ｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２またはｒｈＡｄ５３である。本出願に有用な組換えウイルスベクターは、本開示に照らして当該技術分野において公知である方法を用いて調製することができる。例えば、遺伝暗号の縮重に照らして、同一のポリペプチドをコードするいくつかの核酸配列を設計することができる。本出願のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドは、必要に応じて、宿主細胞（例えば、細菌または哺乳動物細胞）における適切な発現を確実にするために、コドンを最適化することができる。コドン最適化は当業者に広く適用される技術であり、コドン最適化されたポリヌクレオチドを得るための方法は、本開示に照らして当業者に周知である。
本出願のベクター、例えば、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクター（特にアデノウイルスベクター）は、限定されないが、ベクターのポリヌクレオチド配列によってコードされるＨＢＶ抗原（複数可）の複製および発現を含む、ベクターの従来の機能（複数可）を確立するための任意の調節エレメントを含むことができる。調節エレメントには、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、翻訳終止コドン、リボソーム結合エレメント、転写ターミネーター、選択マーカー、複製起点などが含まれる。ベクターは、１つまたは複数の発現カセットを含むことができる。「発現カセット」は、細胞機構にＲＮＡおよびタンパク質の作製を指示するベクターの一部である。発現カセットは、典型的には、プロモーター配列、オープンリーディングフレーム、および必要に応じてポリアデニル化シグナルを含む３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）の３つの成分を含む。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドンから終止コドンまでの目的のタンパク質（例えば、ＨＢＶ抗原）のコード配列を含むリーディングフレームである。発現カセットの調節エレメントは、目的のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結することができる。本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結される」とは、その最も広い合理的な文脈において解釈されるべきであり、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。ポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと機能的関係に置かれる場合、ポリヌクレオチドは「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。本明細書に記載される発現カセットでの使用に適した任意の成分は、任意の組合せで、および任意の順番で、本出願のベクターを調製するために使用することができる。
ベクターは、目的のＨＢＶ抗原の発現を制御するために、好ましくは発現カセット内にプロモーター配列を含むことができる。用語「プロモーター」とは、その通常の意味で使用され、作動可能に連結されるヌクレオチド配列の転写を開始するヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、転写されるヌクレオチド配列の近くの同じ鎖上に位置する。プロモーターは構成的であり、誘導的であり、または抑制的であり得る。プロモーターは、天然に存在するかまたは合成のものであり得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫および動物を含む供給源から誘導することができる。プロモーターは、相同プロモーター（すなわち、ベクターと同じ遺伝的源に由来する）または異種プロモーター（すなわち、異なるベクターまたは遺伝的源に由来する）であり得る。例えば、採用されるベクターがＤＮＡプラスミドである場合、プロモーターは、プラスミドに対して内在性（相同性）であり得るか、または他の供給源（異種性）から誘導され得る。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドの上流に位置する。
使用することができるプロモーターの例としては、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター（ＣＭＶ－ＩＥ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターが挙げられる。本出願における使用に適した追加のプロモーターには、限定されないが、ＲＳＶプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター、ならびに種々のポックスウイルスプロモーター、例えば、限定されないが、以下のワクシニアウイルスまたはＭＶＡ由来およびＦＰＶ由来プロモーター：３０Ｋプロモーター、Ｉ３プロモーター、ＰｒＳプロモーター、ＰｒＨｙｂ、ＰｒＳ５Ｅプロモーター、Ｐｒ７．５Ｋ、Ｐｒ１３．５ロングプロモーター、４０Ｋプロモーター、ＭＶＡ－４０Ｋプロモーター、ＦＰＶ ４０Ｋプロモーター、３０ｋプロモーター、ＰｒＳｙｎＩＩｍプロモーター、ＰｒＬＥ１プロモーター、およびＰＲ１２３８プロモーターが含まれる。プロモーターはまた、ヒト遺伝子、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはヒトメタロチオネイン由来のプロモーターであり得る。プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、筋肉または皮膚特異的プロモーター、天然または合成プロモーターであり得る。好ましくは、プロモーターは２６ＳサブゲノムプロモーターまたはＴ７プロモーターである。例示的な２６Ｓサブゲノムプロモーターのヌクレオチド配列を配列番号６２に示す。例示的なＴ７プロモーターのヌクレオチド配列を配列番号７３に示す。
ベクターは、発現された転写物を安定化し、ＲＮＡ転写物の核外輸送を増強し、および／または転写－翻訳カップリングを改善する追加のポリヌクレオチド配列を含むことができる。このような配列の例には、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサー配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、典型的には、ベクターの発現カセット内の目的のタンパク質（例えば、ＨＢＶ抗原）のコード配列の下流に位置する。エンハンサー配列は、転写因子が結合した場合、関連遺伝子の転写を増強する調節ＤＮＡ配列である。エンハンサー配列は、好ましくは、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の上流であるが、ベクターの発現カセット内のプロモーター配列の下流に位置する。
本開示に照らして当業者に公知である任意のポリアデニル化シグナルを使用することができる。例えば、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（例えば、配列番号６４）、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。好ましくは、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。例示的なＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのヌクレオチド配列を配列番号６４に示す。
本開示に照らして当業者に公知である任意のエンハンサー配列を使用することができる。例えば、エンハンサー配列は、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはウイルスエンハンサー、例えば、ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、またはＥＢＶ由来のものであり得る。特定のエンハンサーの例としては、限定されないが、Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ＨＢＶ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ヒトアポリポタンパク質Ａ１前駆体（ＡｐｏＡＩ）に由来するイントロン／エキソン配列、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）の長い末端反復（ＬＴＲ）の非翻訳Ｒ－Ｕ５ドメイン、スプライシングエンハンサー、合成ウサギβ－グロビンイントロン、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
ベクターは、シグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。好ましくは、シグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の上流に位置する。シグナルペプチドは、典型的には、タンパク質の局在を指示し、それが産生される細胞からのタンパク質の分泌を促進し、および／または抗原発現および抗原提示細胞への交差提示を改善する。シグナルペプチドは、ベクターから発現される場合、ＨＢＶ抗原のＮ末端に存在することができるが、例えば、細胞からの分泌時にはシグナルペプチダーゼによって切断される。シグナルペプチドが切断された発現タンパク質は、しばしば「成熟タンパク質」と呼ばれる。本開示に照らして当該技術分野において公知である任意のシグナルペプチドを使用することができる。例えば、シグナルペプチドは、シスタチンＳシグナルペプチド；免疫グロブリン（Ｉｇ）分泌シグナル、例えば、シスタチンＳシグナルペプチド、Ｉｇ重鎖ガンマシグナルペプチドＳＰＩｇＧ、またはＩｇ重鎖イプシロンシグナルペプチドＳＰＩｇＥであり得る。
ベクター、例えば、ＤＮＡプラスミドはまた、細菌の複製起点、ならびに細菌細胞、例えば、大腸菌におけるプラスミドの選択および維持のための抗生物質耐性発現カセットを含むことができる。複製および抗生物質耐性カセットの細菌起源は、ＨＢＶ抗原をコードする発現カセットと同じ方向、または反対方向（逆方向）でベクターに位置させることができる。複製起点（ＯＲＩ）は、複製が開始され、プラスミドが細胞内で再生し、生存することを可能にする配列である。本出願における使用に適したＯＲＩの例としては、限定されないが、ＣｏｌＥ１、ｐＭＢ１、ｐＵＣ、ｐＳＣ１０１、Ｒ６Ｋ、および１５Ａ、好ましくはｐＵＣが挙げられる。
細菌細胞における選択および維持のための発現カセットは、典型的には、抗生物質耐性遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。好ましくは、抗生物質耐性遺伝子に作動可能に連結されるプロモーター配列は、目的のタンパク質、例えば、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されるプロモーター配列とは異なる。抗生物質耐性遺伝子は最適化したコドンであり得、抗生物質耐性遺伝子の配列組成は、通常、細菌の、例えば、大腸菌の、コドン使用頻度に合わせて調整される。本開示を照らして当業者に公知である任意の抗生物質耐性遺伝子を使用することができ、限定されないが、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、および四サイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔｒ）、ならびにクロラムフェニコール、ブレオマイシン、スペクチノマイシン、カルベニシリンなどに耐性を付与する遺伝子が含まれる。
本出願のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドおよび発現ベクターは、本開示に照らして当該技術分野において公知である任意の方法によって作製することができる。例えば、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドは、当業者に周知である標準的な分子生物学的技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを用いて、発現ベクターに導入または「クローニング」することができる。
アデノウイルス
一態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスを提供する。一態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶコア抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＭＶＡベクターを提供する。別の実施形態では、本出願は、抗原性ＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＭＶＡベクターを提供する。別の態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶ表面抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＭＶＡベクターを提供する。一部の態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶ抗原をコードする１つ、２つ、３つ、または４つのヌクレオチド配列を含み、各々が、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）抗原、およびＨＢＶ表面抗原からなる群から独立して選択される、組換えＭＶＡベクターを提供する。
本出願によるアデノウイルスはアデノウイルス科に属し、好ましくはマスタデノウイルス属に属するものである。これは、ヒトアデノウイルスであり得るが、他の種に感染するアデノウイルスでもあり得、限定されないが、ウシアデノウイルス（例えば、ウシアデノウイルス３、ＢＡｄＶ３）、イヌアデノウイルス（例えば、ＣＡｄＶ２）、ブタアデノウイルス（例えば、ＰＡｄＶ３または５）、またはシミアンアデノウイルス（サルアデノウイルス、および類人猿アデノウイルス、例えば、チンパンジーアデノウイルスまたはゴリラアデノウイルスを含む）が含まれる。好ましくは、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶまたはＡｄＨｕ；適用上、種の表示なしでＡｄと呼ばれる場合、ヒトアデノウイルスを意味し、例えば、簡単な表記「Ａｄ５」は、ヒトアデノウイルス血清型５であるＨＡｄＶ５と同じものを意味する）、またはシミアンアデノウイルス、例えば、チンパンジーもしくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、またはＳＡｄＶ）である。
ほとんどの高度研究は、ヒトアデノウイルスを用いて行われており、ヒトアデノウイルスは、本出願のある特定の態様に従って好ましい。ある特定の好ましい実施形態では、本出願による組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスに基づく。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８、４９または５０に基づく。本出願の特に好ましい実施形態によれば、アデノウイルスは、血清型２６または３５のうちの１つのヒトアデノウイルスである。
これらの血清型の利点は、ヒト集団における血清有病率が低いことおよび／または既存の中和抗体価が低いことである。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号、およびAbbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63に記載されており、両者はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ａｄ２６の例示的ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ１５３４７４、および国際公開第２００７／１０４７９２号（例えば、配列番号１を参照されたい）に見出される。ｒＡｄ３５ベクターの調製は、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号、国際公開第００／７００７１号、およびVogels et al., (2003) J Virol 77(15): 8263-71に記載されており、これらのすべては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ａｄ３５の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ００００１９、および国際公開第００／７００７１号（例えば、図６を参照されたい）に見出される。
一般的に、シミアンアデノウイルスはまた、ヒト集団において血清有病率が低く、および／または既存の中和抗体力価が低く、チンパンジーアデノウイルスベクターを用いたかなりの量の研究が報告されている（例えば、米国特許第６０８３７１６号；国際公開第２００５／０７１０９３号；国際公開第２０１０／０８６１８９号；国際公開第２０１０／０８５９８４号；Farina et al, 2001, J Virol 75: 11603-13；Cohen et al, 2002, J Gen Virol 83: 151-55；Kobinger et al, 2006, Virology 346: 394-401；Tatsis et al., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17；また、Bangari and Mittal, 2006, Vaccine 24: 849-62による概説；Lasaro and Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39による概説も参照されたい）。したがって、他の好ましい実施形態では、本出願による組換えアデノウイルスは、シミアンアデノウイルス、例えば、チンパンジーアデノウイルスに基づく。本出願のある実施形態では、組換えアデノウイルスは、シミアンアデノウイルス１型、３型、７型、８型、２１型、２２型、２３型、２４型、２５型、２６型、２７．１型、２８．１型、２９型、３０型、３１．１型、３２型、３３型、３４型、３５．１型、３６型、３７．２型、３９型、４０．１型、４１．１型、４２．１型、４３型、４４型、４５型、４６型、４８型、４９型、５０型またはＳＡ７Ｐ型に基づく。
アデノウイルスベクターｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５
本出願の好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、２つの希少な血清型：Ａｄ２６およびＡｄ３５由来のカプシドタンパク質を含む。典型的な実施形態では、ベクターはｒＡｄ２６またはｒＡｄ３５ウイルスである。
したがって、本出願で使用することができるベクターは、Ａｄ２６またはＡｄ３５カプシドタンパク質（例えば、繊維、ペントンまたはヘキソンタンパク質）を含む。当業者は、本出願のベクターにおいてＡｄ２６またはＡｄ３５カプシドタンパク質全体を使用する必要はないことを認識する。したがって、Ａｄ２６またはＡｄ３５カプシドタンパク質の少なくとも一部を含むキメラカプシドタンパク質を本出願のベクターに使用することができる。本出願のベクターはまた、少なくとも１つのカプシドタンパク質がＡｄ２６またはＡｄ３５に由来する限り、繊維、ペントン、およびヘキソンタンパク質が各々異なる血清型に由来するカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態では、繊維、ペントンおよびヘキソンタンパク質は各々Ａｄ２６または各々Ａｄ３５から誘導される。
当業者は、複数の血清型に由来するエレメントを単一の組換えアデノウイルスベクターに組み合わせることができることを認識する。したがって、異なる血清型からの所望の特性を組み合わせたキメラアデノウイルスを生成することができる。したがって、一部の実施形態では、本出願のキメラアデノウイルスは、温度安定性、アセンブリ、アンカー形成、生成量、リダイレクトまたは改善された感染、標的細胞におけるＤＮＡの安定性などの特徴を有するＡｄ２６およびＡｄ３５血清型の既存の免疫の欠如を組み合わせることができる。
本出願のある実施形態では、本出願において有用な組換えアデノウイルスベクターは、主にまたは完全にＡｄ３５からまたはＡｄ２６から誘導される（すなわち、ベクターはｒＡｄ３５またはｒＡｄ２６である）。一部の実施形態では、アデノウイルスは、例えば、それがゲノムのＥ１領域に欠失を含有するため、複製欠損である。本出願のアデノウイルスは、Ａｄ２６またはＡｄ３５に由来し、アデノウイルスのＥ４－ｏｒｆ６コード配列を、Ａｄ５などのヒトサブグループＣのアデノウイルスのＥ４－ｏｒｆ６と交換するのが典型的である。これは、Ａｄ５のＥ１遺伝子、例えば、２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞などを発現する周知の相補的細胞系において、このようなアデノウイルスの増殖を可能にする（例えば、Havenga et al, 2006, J Gen Virol 87: 2135-43；国際公開第０３／１０４４６７号を参照されたい）。本出願のある実施形態では、アデノウイルスは血清型３５のヒトアデノウイルスであり、抗原をコードする核酸がクローン化されたＥ１領域における欠失、およびＡｄ５のＥ４ ｏｒｆ６領域を有する。本出願のある実施形態では、アデノウイルスは血清型２６のヒトアデノウイルスであり、抗原をコードする核酸がクローン化されたＥ１領域における欠失、およびＡｄ５のＥ４ ｏｒｆ６領域を有する。Ａｄ３５アデノウイルスについて、アデノウイルス中にＥ１Ｂ ５５Ｋオープンリーディングフレームの３’末端を保持することが典型的であり、例えば、ｐＩＸオープンリーディングフレームの直接上流の１６６ｂｐ、またはこれを含む断片、例えば、５’末端でＢｓｕ３６Ｉ制限部位によってマークされたｐＩＸ開始コドンの直接上流の２４３ｂｐ断片を含む。これは、ｐＩＸ遺伝子のプロモーターが部分的にこの領域に存在するため、アデノウイルスの安定性を増大させるからである（例えば、Havenga et al, 2006, supra; WO 2004/001032を参照されたい）。
組換えアデノウイルスベクターの調製は当該技術分野において周知である。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号およびAbbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63に記載される。Ａｄ２６の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ１５３４７４、および国際公開第２００７／１０４７９２号の配列番号１に見出される。ｒＡｄ３５ベクターの調製は、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号およびVogels et al., (2003) J Virol 77(15): 8263-71に記載される。Ａｄ３５の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ＿００００１９に見出される。
本出願のある実施形態では、本出願において有用なベクターは、国際公開第２０１２／０８２９１８号に記載されるものを含み、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
典型的には、本出願において有用なベクターは、組換えアデノウイルスゲノム全体を含む核酸（例えば、プラスミド、コスミド、またはバキュロウイルスベクター）を用いて生成される。したがって、本出願はまた、本出願のアデノウイルスベクターをコードする単離された核酸分子を提供する。本出願の核酸分子は、ＲＮＡの形態であり得るか、またはクローニングによって得られたかもしくは合成して生成されたＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは二本鎖であっても一本鎖であり得る。
本出願において有用なアデノウイルスベクターは、典型的には複製欠損である。これらの実施形態では、ウイルスは、Ｅ１領域などのウイルスの複製に不可欠な領域の欠失または不活性化によって複製欠損とされる。これらの領域は、例えば、目的の遺伝子（通常はプロモーターに連結されている）を挿入することによって、実質的に欠失または不活性化され得る。一部の実施形態では、本出願のベクターは、Ｅ２、Ｅ３またはＥ４領域などの他の領域における欠失、またはプロモーターに連結された異種遺伝子の挿入を含み得る。Ｅ２－および／またはＥ４－突然変異アデノウイルスについて、一的般に、Ｅ２－および／またはＥ４－相補性細胞系を用いて、組換えアデノウイルスを生成する。Ｅ３は複製に必要ではないため、アデノウイルスのＥ３領域の突然変異は細胞系によって補完される必要はない。
パッケージング細胞系は、典型的には、十分な量の本出願のアデノウイルスベクターを生成するために使用される。パッケージング細胞は、複製欠損ベクター中で欠失または不活性化された遺伝子を含み、ウイルスが細胞内で複製することを可能にする細胞である。適切な細胞系には、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６、９１１、２９３、およびＥ１ Ａ５４９が含まれる。
上述のように、ベクター中には、多種多様なＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原（例えば、ＨＢＶコア、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原）を発現させることができる。必要に応じて、ＨＢＶ抗原をコードする異種遺伝子をコドン最適化して、処置された宿主（例えば、ヒト）における適切な発現を確実にすることができる。コドンの最適化は、当該技術分野において広く適用されている技術である。典型例には、異種遺伝子は、アデノウイルスゲノムのＥ１および／またはＥ３領域にクローニングされる。
異種性Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子は、アデノウイルス由来プロモーター（例えば、Ｍａｊｏｒ Ｌａｔｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下にあり得る（すなわち、作動可能に連結され得る）か、または異種プロモーターの制御下にあり得る。適切な異種プロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーターおよびＲＳＶプロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内の目的の異種遺伝子の上流に位置する。
ＭＶＡベクター
本出願に有用なＭＶＡベクターは、修飾されたワクシニアアンカラウイルス由来の弱毒化ウイルスを利用する。ＭＶＡベクターは、多種多様なＨＢＶ抗原（例えば、ＨＢＶコア、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ ＰｒｅＳ１、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原）を発現する。一態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶコア抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＭＶＡベクターを提供する。別の態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＭＶＡベクターを提供する。別の態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶ表面抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＭＶＡベクターを提供する。一態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶ抗原をコードする１つ、２つ、３つ、または４つのヌクレオチド配列を含み、各々は、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）抗原、およびＨＢＶ表面抗原からなる群から独立して選択される、組換えＭＶＡベクターを提供する。
ワクシニアウイルス（ＣＶＡ）のＡｎｋａｒａ株のニワトリ胚線維芽細胞上の５１６連続継代により、人工弱毒化ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（「ＭＶＡ」）を生成した（総説については、Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14 (1975)を参照されたい）。これらの長期継代の結果として、得られたＭＶＡウイルスのゲノムは、そのゲノム配列の約３１キロ塩基が欠失しており、したがって、複製のためにトリ細胞に制限された高度な宿主細胞として記載された（Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 (1991)）。種々の動物モデルにおいて、得られたＭＶＡは、完全複製能力のある出発材料（Mayr, A. & Danner, K., Dev. Biol. Stand. 41: 225-34 (1978))）と比較して有意に非病原性であることが示された。
本出願の実施において有用なＭＶＡウイルスには、限定されないが、ＭＶＡ－５７２（１９９４年１月２７日にＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１２７０７として寄託された）、ＭＶＡ－５７５（２０００年１２月７日にＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７として寄託された）、ＭＶＡ－ＩＶ７２１（Ｓｕｔｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２００９に参照される）、およびＡＣＡＭ３０００（２００３年３月２７日にＡＴＣＣ（登録商標）ＰＴＡ－５０９５として寄託された）が含まれ得る。
より好ましくは、本出願に従って使用されるＭＶＡは、ＭＶＡ－ＢＮおよびＭＶＡ－ＢＮの誘導体を含む。ＭＶＡ－ＢＮは、国際ＰＣＴ出願公開第０２／４２４８０号に記載されている。ＭＶＡ－ＢＮの「誘導体」とは、本明細書に記載されるように、ＭＶＡ－ＢＮと本質的に同じ複製特性を示すが、それらのゲノムの１つまたは複数の部分に差異を示すウイルスを指す。
ＭＶＡ－ＢＮ、ならびにその誘導体は、複製不能であり、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで再生的に複製することができないことを意味する。より具体的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＭＶＡ－ＢＮまたはその誘導体は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において再生的複製可能であるが、ヒトケラチノサイト細胞系ＨａＣａｔ（Boukamp et al (1988), J. Cell Biol. 106:761-771）、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ寄託番号９１１１２５０２）、ヒト胚腎細胞系２９３（ＥＣＡＣＣ寄託番号８５１２０６０２）、ヒト子宮頚部腺癌細胞系ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ－２）において再生的複製をすることができないものとして記載されている。さらに、ＭＶＡ－ＢＮまたはその誘導体は、Ｈｅｌａ細胞およびＨａＣａＴ細胞系において、ＭＶＡ－５７５よりも少なくとも２倍低く、より好ましくは３倍低く、ウイルス増幅比を有する。ＭＶＡ－ＢＮおよびその誘導体のこれらの特性に関する試験およびアッセイは、国際公開第０２／４２４８０号（米国特許出願第２００３／０２０６９２６号）および国際公開第０３／０４８１８４号（米国特許出願第２００６／０１５９６９９号）に記載されている。
前の段落に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト細胞系における「再生的複製ができない」または「再生的複製の能力がない」という用語は、例えば、国際公開第０２／４２４８０号に記載され、上述のように所望の特性を有するＭＶＡを得る方法を教示する。この用語は、国際公開第０２／４２４８０号または米国特許第６，７６１，８９３号に記載されているアッセイを用いて、１未満の感染後の４日でｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルス増幅比を有するウイルスに適用される。
「再生的製複製不能」という用語は、１未満の感染後の４日で前の段落に記載したように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト細胞系においてウイルス増幅比を有するウイルスを指す。国際公開第０２／４２４８０号または米国特許第６，７６１，８９３号に記載されるアッセイは、ウイルス増幅比の決定に適用可能である。
前の段落で記載したように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト細胞系におけるウイルスの増幅または複製は、通常、「増幅比」と呼ばれる、最初に細胞に感染するために使用された量（入力）に対する感染細胞から産生されたウイルスの比（出力）として表される。「１」の増幅比は、感染細胞から産生されたウイルスの量が、細胞に感染するために最初に使用された量と同じである増幅状態を定義し、感染細胞がウイルス感染および再生に対して許容性であることを意味する。対照的に、１未満の増幅比、すなわち、入力レベルと比較した出力の減少は、再生的複製の欠如を示し、したがって、ウイルスの弱毒化を示す。
ＭＶＡベースのワクチンの利点には、それらの安全性プロファイルおよび大規模ワクチン生成のための利用可能性が含まれる。前臨床試験は、ＭＶＡ－ＢＮが他のＭＶＡ株（国際公開第０２／４２４８０号）と比較して優れた弱毒化および有効性を示すことを明らかにした。ＭＶＡ－ＢＮ株の追加の特性は、ＤＮＡプライム／ワクシニアウイルスブーストレジームと比較した場合、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジームにおいて実質的に同じレベルの免疫を誘導する能力である。
本明細書において最も好ましい実施形態である組換えＭＶＡ－ＢＮウイルスは、哺乳動物細胞におけるそれらの異なる複製欠損およびそれらの十分に確立された非病原性のために安全であると考えられる。さらに、その有効性に加えて、工業規模の製造の実現可能性は有益であり得る。加えて、ＭＶＡベースのワクチンは、複数の異種抗原を送達することができ、体液性および細胞性免疫の同時誘導を可能にする。
本出願に有用なＭＶＡベクターは、国際公開第２００２／０４２４８０号および国際公開第２００２／２４２２４号に記載されるものなどの当該技術分野において公知である方法を用いて調製することができ、その関連開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願の好ましい実施形態では、ＭＶＡベクター（複数可）は、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原、およびＨＢＶ表面抗原からなる群から選択される１つまたは複数の抗原タンパク質をコードする核酸を含む。
ＨＢＶ抗原タンパク質は、ＭＶＡの１つまたは複数の遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入され得る。本出願のある実施形態では、ＩＧＲは、ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、ＩＧＲ１３６／１３７、およびＩＧＲ１４８／１４９から選択される。本出願のある実施形態では、組換えＭＶＡの５、４、３または２つ未満のＩＧＲは、ＨＢＶコア抗原および／またはＨＢＶ ｐｏｌ抗原の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。異種ヌクレオチド配列は、追加的にまたは代替的に、１つまたは複数の天然に存在する欠失部位、特にＭＶＡゲノムの主要欠失部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩに挿入され得る。本出願のある実施形態では、組換えＭＶＡの天然に存在する欠失部位の５、４、３または２つ未満は、ＨＢＶコア抗原および／またはＨＢＶ ｐｏｌ抗原の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
ＨＢＶタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含むＭＶＡの挿入部位の数は、１、２、３、４、５、６、７つまたはそれ以上であり得る。本出願のある実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、４、３、２つまたはそれより少ない挿入部位に挿入される。好ましくは、２つの挿入部位が使用される。本出願のある実施形態では、３つの挿入部位が使用される。好ましくは、組換えＭＶＡは、２または３つの挿入部位に挿入された少なくとも２、３、４、５、６、または７つの遺伝子を含む。
本明細書に提供される組換えＭＶＡウイルスは、当該技術分野において公知である通常の方法によって生成することができる。組換えポックスウイルスを得る方法、またはポックスウイルスゲノム中に外因性コード配列を挿入する方法は、当業者において周知である。例えば、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、ウエスタンブロット分析、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲ増幅技術などの標準的な分子生物学技術の方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）に記載され、ウイルスの取扱いおよび操作の技術は、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（B.W.J. Mahy et al. (eds.), Academic Press (1996)）に記載されている。同様に、ＭＶＡの取扱い、操作、および遺伝子操作に関する技術およびノウハウは、 Molecular Virology: A Practical Approach (A.J. Davison & R.M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK (1993)(例えば、Chapter 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectorsを参照されたい)）およびCurrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Son, Inc. (1998)(例えば、Chapter 16, Section IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vectorを参照されたい)に記載されている。
本明細書に開示される種々の組換えＭＶＡの生成のために、異なる方法が適用可能であり得る。ウイルスに挿入されるＤＮＡ配列は、ＭＶＡのＤＮＡ切片に相同なＤＮＡが挿入されている大腸菌プラスミド構築物に配置させることができる。別個に、挿入されるＤＮＡ配列をプロモーターに連結することができる。プロモーター－遺伝子連結は、プロモーター－遺伝子連結が、非必須遺伝子座を含有するＭＶＡ ＤＮＡの領域に隣接するＤＮＡ配列と相同なＤＮＡによって両末端に隣接するように、プラスミド構築物中に配置され得る。得られたプラスミド構築物は、大腸菌内での増殖によって増幅され、単離され得る。挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離されたプラスミドは、培養物をＭＶＡに感染させると同時に、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞培養物にトランスフェクトすることができる。プラスミド中の相同なＭＶＡ ＤＮＡとウイルスゲノムの間の組換えは、それぞれ、外来ＤＮＡ配列の存在によって修飾されたＭＶＡを生成することができる。
好ましい実施形態によれば、例えば、ＣＥＦ細胞のような適切な細胞培養の細胞をポックスウイルスに感染させることができる。感染細胞は、その後、好ましくはポックスウイルス発現制御エレメントの転写制御下で、外来性もしくは異種性の遺伝子または複数の遺伝子を含む第１のプラスミドベクターでトランスフェクトすることができる。上記のように、プラスミドベクターはまた、ポックスウイルスゲノムの選択された部分への外因性配列の挿入を指令することができる配列を含む。必要に応じて、プラスミドベクターはまた、ポックスウイルスプロモーターに作動可能に連結されたマーカーおよび／または選択遺伝子を含むカセットを含む。
適切なマーカーまたは選択遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、ネオマイシン－ホスホリボシルトランスフェラーゼまたは他のマーカーをコードする遺伝子である。選択またはマーカーカセットの使用は、生成された組換えポックスウイルスの同定および単離を簡単にする。しかしながら、組換えポックスウイルスはまた、ＰＣＲ技術によって同定することができる。その後、さらなる細胞を、上述のように得られた組換えポックスウイルスに感染させ、第２の外来性または異種性の遺伝子または複数の遺伝子を含む第２のベクターでトランスフェクトすることができる。この遺伝子をポックスウイルスゲノムの別の挿入部位に導入する場合において、第２のベクターはまた、ポックスウイルスのゲノムへの第２の外来遺伝子または複数の遺伝子の組込みを指示するポックスウイルス相同配列において異なる。相同組換えが起こった後、２つ以上の外来遺伝子または異種遺伝子を含む組換えウイルスを単離することができる。追加の外来遺伝子を組換えウイルスに導入するためには、感染の前ステップで単離された組換えウイルスを使用することによって、およびトランスフェクションのためのさらなる外来遺伝子または複数の遺伝子を含むさらなるベクターを使用することによって、感染およびトランスフェクションのステップを繰り返すことができる。
あるいは、上記のような感染およびトランスフェクションのステップは交換可能であり、すなわち、適切な細胞は、最初に、外来遺伝子を含むプラスミドベクターによってトランスフェクトされ、次に、ポックスウイルスに感染され得る。さらなる選択肢として、各々の外来遺伝子を異なるウイルスに導入し、得られたすべての組換えウイルスと細胞を共感染させ、すべての外来遺伝子を含む組換え体をスクリーニングすることも可能である。第３の選択肢は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮＡゲノムおよび外来配列の連結、ならびにヘルパーウイルスを用いた組換えワクシニアウイルスＤＮＡゲノムの再構成である。第４の選択肢は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローニングされたＭＶＡなどのワクシニアウイルスゲノム間の大腸菌または別の細菌種における相同組換え、およびワクシニアウイルスゲノムにおける所望の組込み部位に隣接する配列と相同なＤＮＡ配列に隣接する線状の外来配列である。
異種ＨＢＶ遺伝子（例えば、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原、および／またはＨＢＶ表面抗原）は、１つまたは複数のポックスウイルスプロモーターの制御下であり得る（すなわち、作動可能に連結され得る）。本出願のある実施形態では、ポックスウイルスプロモーターは、Ｐｒ７．５プロモーター、ハイブリッド初期／後期プロモーター、またはＰｒＳプロモーター、ＰｒＳ５Ｅプロモーター、合成もしくは天然の初期または後期プロモーター、あるいは牛痘ウイルスＡＴＩプロモーターである。
ＲＮＡレプリコン
好ましくは、ベクターは自己複製ＲＮＡレプリコンである。本明細書で使用される場合、「自己複製ＲＮＡ分子」は、「自己増幅ＲＮＡ分子」または「ＲＮＡレプリコン」または「レプリコンＲＮＡ」または「ｓａＲＮＡ」と交換可能に使用され、ヒト、哺乳動物、または動物細胞であり得る許容細胞内で自己増幅または自己複製を指令するのに必要なすべての遺伝情報を含有するＲＮＡを指す。自己複製ＲＮＡ分子はｍＲＮＡに類似する。それは一本鎖で、５’キャップ化され、３’－ポリアデニル化されており、正の配向である。自身の複製を指令するために、ＲＮＡ分子は、１）ＲＮＡ増幅プロセスを触媒するためにウイルスまたは宿主細胞由来のタンパク質、核酸またはリボヌクレオタンパク質と相互作用することができるポリメラーゼ、レプリカーゼ、または他のタンパク質をコードし、２）サブゲノムレプリコンによりコードされるＲＮＡの複製および転写に必要なシス作用性ＲＮＡ配列を含有する。このようにして、送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらす。これらの娘ＲＮＡ、ならびに共線サブゲノム転写物は、目的の遺伝子のインサイチュでの発現を提供するために翻訳され得るか、または目的の遺伝子のインサイチュでの発現を提供するために翻訳される送達されたＲＮＡと同じ意味を有するさらなる転写物を提供するために転写され得る。この転写配列の全体的な結果は、導入されたレプリコンＲＮＡの数の膨大な増幅であり、したがって、コードされた目的の遺伝子は、細胞の主要なポリペプチド産物となる。
ＲＮＡレプリコンは、１）ＲＮＡ増幅プロセスを触媒するためにウイルスまたは宿主細胞由来タンパク質、核酸またはリボヌクレオタンパク質と相互作用し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４をコードし；２）３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ；非構造タンパク質媒介増幅のためのアルファウイルスヌクレオチド配列）、および／またはサブゲノムプロモーターなどのゲノムおよびサブゲノムＲＮＡの複製および転写に必要なシス作用性ＲＮＡ配列を含有する。これらの配列は、複製の過程中に、自己コード化タンパク質、または非自己コード化細胞由来タンパク質、核酸もしくはリボヌクレオタンパク質、またはこれらの成分のいずれかの間の複合体に結合され得る。一部の実施形態では、修飾されたＲＮＡレプリコン分子は、典型的には、以下の順番のエレメント：複製のためにシスに必要とされる５’ウイルスＲＮＡ配列（複数可）（例えば、５’ＵＴＲおよび５’ＣＳＥ）、生物学的に活性な非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１２３４）をコードする配列、サブゲノムＲＮＡを転写するためのプロモーター、複製のためにシスに必要とされる３’ウイルス配列（例えば、３’ＵＴＲ）、およびポリアデニル酸トラクト、および必要に応じてサブゲノムプロモーターの後または制御下で、異種タンパク質またはペプチドをコードする配列（または２つ以上の配列）を含む。さらに、用語「ＲＮＡレプリコン」は、プラス鎖（またはメッセージ鎖）分子を指すことができ、ＲＮＡレプリコンは、任意の公知の、天然に存在するＲＮＡウイルスのものとは異なる長さのものであり得る。本開示の実施形態のいずれかでは、ＲＮＡレプリコンは、構造ウイルスタンパク質（例えば、ヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、およびエンベロープタンパク質Ｐ６２、６Ｋ、およびＥ１）の少なくとも１つ（またはすべて）の配列（複数可）を欠く（または含有しない）ことができる。これらの実施形態では、１つまたは複数の構造遺伝子をコードする配列は、例えば、少なくとも１つの異種タンパク質またはペプチド（または目的とする他の遺伝子（ＧＯＩ））のコード配列などの１つまたは複数の異種配列で置換され得る。
ある特定の実施形態では、本出願のＲＮＡレプリコンは、５’末端から３’末端の順で、（１）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質媒介増幅に必要な５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）；（２）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質の少なくとも１つ、好ましくはすべてをコードするポリヌクレオチド配列；（３）ＲＮＡウイルスのサブゲノムプロモーター；（４）ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；および（５）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質媒介増幅に必要な３’－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む。
ある特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ機能、ヘリカーゼ、キャッピング、およびポリアデニル化活性を含む自己増幅のための酵素複合体（レプリカーゼポリタンパク質）をコードする。サブゲノムプロモーターの制御下にあるレプリカーゼの下流のウイルス構造遺伝子は、ＨＢＶ抗原に置換することができる。トランスフェクションの際に、レプリカーゼは直ちに翻訳され、ゲノムＲＮＡの５’末端および３’末端と相互作用し、相補的なゲノムＲＮＡコピーを合成する。これらは、新規のプラス鎖化、キャップ化、およびポリアデニル化ゲノムコピー、ならびサブゲノム転写物の合成のための鋳型として作用する。増幅は、最終的には細胞あたり最大２×１０５の非常に高いＲＮＡコピー数をもたらす。したがって、効果的な遺伝子導入および予防ワクチン接種を達成するためには、従来のｍＲＮＡと比較して、はるかに少ない量のｓａＲＮＡで十分である（Beissert et al., Hum Gene Ther. 2017, 28(12): 1138-1146）。
サブゲノムＲＮＡは、それが由来するゲノムＲＮＡよりも小さい長さまたはサイズのＲＮＡ分子である。ウイルスサブゲノムＲＮＡは、配列がゲノムＲＮＡまたはその相補体内に存在する内部プロモーターから転写され得る。サブゲノムＲＮＡの転写は、宿主細胞にコードされたタンパク質、リボヌクレオタンパク質（複数可）、またはそれらの組合せに関連するウイルスにコードされたポリメラーゼによって媒介され得る。多くのＲＮＡウイルスは、それらの３’近位遺伝子の発現のためにサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を産生する。
本開示の一部の実施形態では、ＨＢＶ抗原は、サブゲノムプロモーターの制御下で発現される。ある特定の実施形態では、天然のサブゲノムプロモーターの代わりに、サブゲノムＲＮＡを、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ポリオウイルス、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤ）、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、またはＣ型肝炎ウイルスに由来する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の制御下に配置することができる。サブゲノムプロモーターは、２４ヌクレオチド（シンドビスウイルス）から１００ヌクレオチド以上（ビート壊死性黄色静脈ウイルス）の範囲で、通常は転写開始の上流に見られる。
一部の実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの非構造ウイルスタンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）のコード配列を含む。アルファウイルスゲノムは、非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードし、時としてＰ１２３４（またはｎｓＰ１－４もしくはｎｓＰ１２３４）と呼ばれる単一のポリタンパク質前駆体として産生され、タンパク質分解プロセシングを介して成熟タンパク質に切断される。ｎｓＰ１はサイズが約６０ｋＤａであり得、メチルトランスフェラーゼ活性を有し、ウイルスキャッピング反応に関与し得る。ｎｓＰ２は約９０ｋＤａのサイズを有し、ヘリカーゼおよびプロテアーゼ活性を有する一方、ｎｓＰ３は約６０ｋＤａであり、３つのドメイン：マクロドメイン、セントラル（またはアルファウイルス固有）ドメイン、および超可変ドメイン（ＨＶＤ）を含有する。ｎｓＰ４はサイズが約７０ｋＤａであり、コアＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）触媒ドメインを含有する。感染後、アルファウイルスゲノムＲＮＡは翻訳されて、Ｐ１２３４ポリタンパク質を生成し、個々のタンパク質に切断される。本明細書における核酸またはポリペプチド配列を開示する際に、例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４の配列も開示され、元の配列に基づくかまたは元の配列に由来すると考えられる。
一部の実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質の一部のコード配列を含む。例えば、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質のコード配列の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、またはこれら数値の任意の２つの間の範囲を含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質の実質的な部分のコード配列を含み得る。本明細書で使用される場合、非構造ウイルスタンパク質をコードする核酸配列の「実質的な部分」は、非構造ウイルスタンパク質をコードする核酸配列の十分な量を含み、当業者による配列の手動評価によって、またはＢＬＡＳＴ（例えば、“Basic Local Alignment Search Tool”; Altschul S F et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1993）などのアルゴリズムを用いたコンピュータ自動配列比較および同定によって、そのタンパク質の推定上の同定を与える。一部の実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの非構造タンパク質の全コード配列を含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、天然ウイルス非構造タンパク質の実質的にすべてのコード配列を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の非構造ウイルスタンパク質は、同じウイルスに由来する。他の実施形態では、１つまたは複数の非構造タンパク質は、異なるウイルスに由来する。
ＲＮＡレプリコンは、アルファウイルスまたはフラビウイルスなどの任意の適切なプラス鎖ＲＮＡウイルスに由来することができる。好ましくは、ＲＮＡレプリコンはアルファウイルスに由来する。用語「アルファウイルス」は、トガウイルス科のエンベロープ化された一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスを表す。アルファウイルス属は約３０のメンバーを含み、ヒトおよび他の動物に感染する可能性がある。アルファウイルス粒子は、典型的には、直径７０ｎｍを有し、球形またはわずかに多形である傾向があり、４０ｎｍの等尺性ヌクレオカプシドを有する。アルファウイルスの全ゲノム長は１１，０００～１２，０００ヌクレオチドの範囲で、５’キャップと３’ポリＡテールを有する。ゲノムには２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）があり、非構造的（ｎｓ）および構造的である。ｎｓ ＯＲＦは、ウイルスＲＮＡの転写と複製に必要なタンパク質（ｎｓＰ１－ｎｓＰ４）をコードする。構造的ＯＲＦは３つの構造タンパク質、すなわちコアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、およびヘテロ二量体として会合するエンベロープタンパク質Ｐ６２およびＥｌをコードする。ウイルス膜に結合した表面糖タンパク質は、受容体の認識と膜融合による標的細胞への侵入に関与する。４つのｎｓタンパク質遺伝子は、ゲノムの５’側２／３にある遺伝子によってコードされているが、３つの構造タンパク質はゲノムの３’側１／３にあるサブゲノムのｍＲＮＡコリニアから翻訳される。
一部の実施形態では、本発明に有用な自己複製ＲＮＡは、アルファウイルス種に由来するＲＮＡレプリコンである。一部の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ群、またはＳＦ群、またはＳＩＮ群に属するアルファウイルスのものである。ＳＦ群アルファウイルスの非限定的な例には、セムリキ森林ウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ミデルバーグウイルス、チクングニアウイルス、バルマ森林ウイルス、ゲタウイルス、マヤロウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、およびウナウイルスが含まれる。ＳＩＮ群アルファウイルスの非限定的な例としては、シンドビスウイルス、ガードウッドＳ．Ａ．ウイルス、南アフリカアルボウイルスＮｏ．８６、オッケルボウイルス、アウラウイルス、ババンキウイルス、ワタロアウイルス、およびキザイラガーチウイルスが挙げられる。ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ群アルファウイルスの非限定的な例としては、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、およびウナウイルス（ＵＮＡＶ）が挙げられる。
アルファウイルス種の非限定的な例としては、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、オーラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キズラガッチウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウイルス（ＦＭＶ）、ヌドゥム（ＮＤＵＶ）、およびバギークリークウイルスが挙げられる。病原性および非病原性のアルファウイルス株はいずれも適している。一部の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、または東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）のものである。一部の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のものである。
一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の非構造タンパク質ｎｓＰ１－４をコードするポリヌクレオチド、２６Ｓサブゲノムプロモーターなどのサブゲノムプロモーター、および本明細書に記載されるＨＢＶ抗原またはその断片をコードする目的の遺伝子を含む。
自己複製ＲＮＡ分子は５’キャップ（例えば、７－メチルグアノシン）を有することができる。このキャップはＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの翻訳を増強することができる。
本発明で有用な自己複製ＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドは、５’三リン酸基を有することができる。キャップ化されたＲＮＡでは、これは５’から５’への架橋を介して７－メチルグアノシンに連結することができる。５’三リン酸はＲＩＧ－Ｉ結合を増強することができる。
自己複製するＲＮＡ分子は３’ポリＡテールを有することができる。また、３’末端近傍にあるポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含むことができる。
本開示のいずれの実施形態のいずれかにおいて、ＲＮＡレプリコンは、構造ウイルスタンパク質（例えば、ヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、ならびにエンベロープタンパク質Ｐ６２、６Ｋ、およびＥ１）のうちの少なくとも１つ（またはすべて）のコード配列を欠く（または含まない）ことができる。これらの実施形態では、１つまたは複数の構造遺伝子をコードする配列は、例えば、本明細書に記載されるＨＢＶ抗原のコード配列またはその断片などの１つまたは複数の異種配列で置換され得る。
一部の実施形態では、本出願の自己複製ＲＮＡベクターは、先天性免疫系による翻訳阻害に対する抵抗性を付与するため、またはそうでなければＧＯＩ（例えば、ＨＢＶ抗原）の発現を増加させるための１つまたは複数の特徴を含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、翻訳効率を改善するためにコドンを最適化することができる。ＲＮＡ分子は、安定性および／または翻訳を増強するために、本開示に照らして当該技術分野において公知である任意の方法によって修飾することができ、例えば、少なくとも３０個のアデノシン残基のポリＡテールを加えること；および／またはＲＮＡ合成中に取り込むことができ、またはＲＮＡ転写後に酵素的に操作することができる修飾リボヌクレオチド、例えば、７－メチルグアノシンキャップで５－末端をキャップすることによって改変することができる。
ある特定の実施形態では、本出願のＲＮＡレプリコンは、５’末端から３’末端の順で、（１）アルファウイルス５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、（２）アルファウイルス非構造遺伝子ｎｓｐ１の５’複製配列、（３）ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフ、（４）第４オートプロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、（５）アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチド配列、（６）アルファウイルスサブゲノムプロモーター、（７）本出願の１つまたは複数のＨＢＶ抗原をコードする天然に存在しないポリヌクレオチド配列、（８）アルファウイルス３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および（９）必要に応じてポリアデノシン配列を含む。
一部の実施形態では、本出願の自己複製ＲＮＡベクターは、ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフを含む。本明細書で使用される場合、「下流ループ」または「ＤＬＰモチーフ」とは、少なくとも１つのＲＮＡステム－ループを含むポリヌクレオチド配列を指し、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始コドンの下流に配置された場合、ＤＬＰモチーフを伴わない他の点で同一の構築物と比較して、ＯＲＦの翻訳を増加させる。一例として、アルファウイルス属のメンバーは、ウイルス２６Ｓ転写物中に存在する顕著なＲＮＡ構造により、抗ウイルスＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）の活性化に抵抗することができ、これらのｍＲＮＡのｅＩＦ２非依存性翻訳開始を可能にする。この構造は、下流ループ（ＤＬＰ）と呼ばれ、ＳＩＮＶ ２６Ｓ ｍＲＮＡのＡＵＧから下流に位置する。ＤＬＰはまた、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）において検出される。同様のＤＬＰ構造は、新世界（例えば、ＭＡＹＶ、ＵＮＡＶ、ＥＥＥＶ（ＮＡ）、ＥＥＥＶ（ＳＡ）、ＡＵＲＡＶ）、および旧世界（ＳＶ、ＳＦＶ、ＢＥＢＶ、ＲＲＶ、ＳＡＧ、ＧＥＴＶ、ＭＩＤＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＯＮＮＶ）メンバーを含むアルファウイルス属の少なくとも１４個の他のメンバーに存在することが報告されている。これらのアルファウイルス２６Ｓ ｍＲＮＡの予測される構造は、ＳＨＡＰＥ（選択的２’－ヒドロキシルアシル化およびプライマー伸長）データ（Toribio et al., Nucleic Acids Res. May 19; 44(9):4368-80, 2016、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に基づいて構築された。安定なステムループ構造は、ＣＨＩＫＶおよびＯＮＮＶを除くすべての症例で検出されたが、ＭＡＹＶおよびＥＥＥＶはより低い安定性のＤＬＰを示した（Toribio et al., 2016、前掲）。Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスの場合、ＤＬＰモチーフはＳｉｎｄｂｉｓサブゲノムＲＮＡの最初の１５０ｎｔに見出される。ヘアピンはＳｉｎｄｂｉｓカプシドＡＵＧ開始コドンの下流に位置する（ＡＵＧはＳｉｎｄｂｉｓサブゲノムＲＮＡのｎｔ５０で照合される）。配列比較および構造ＲＮＡ分析の以前の研究は、ＳＩＮＶにおけるＤＬＰの進化的保存を明らかにし、アルファウイルス属の多くのメンバーにおける同等なＤＬＰ構造の存在を予測した（例えば、Ventoso, J. Virol. 9484-9494, Vol. 86, September 2012を参照されたい）。ＤＬＰモチーフを含む自己複製ＲＮＡベクターの例は、米国特許出願公開第２０１８／０１７１３４０号および国際特許出願公開第２０１８／１０６６１５号に記載されており、その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本出願のレプリコンＲＮＡは、配列番号５７に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を示すＤＬＰモチーフを含む。
一実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子はまた、ＤＬＰモチーフの下流および非構造タンパク質（例えば、ｎｓｐ１－４のうちの１つまたは複数）または目的の遺伝子（例えば、本明細書に記載されるＨＢＶ抗原）のコード配列の上流に作動可能に連結された自己プロテアーゼペプチドのコード配列を含有する。自己プロテアーゼペプチドの例としては、限定されないが、ブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、ゾセアアシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるペプチド配列が挙げられる。一部の実施形態では、本出願のレプリコンＲＮＡは、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＰ２Ａのコード配列を含む。好ましくは、コード配列は、配列番号１２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を示す。
本発明のレプリコンのいずれも、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。ＵＴＲは、野生型の新世界もしくは旧世界アルファウイルスのＵＴＲ配列、またはそれらのいずれかに由来する配列とすることができる。種々の実施形態では、５’ＵＴＲは、約６０ｎｔまたは５０～７０ｎｔまたは４０～８０ｎｔなどの任意の適切な長さであり得る。一部の実施形態では、５’ＵＴＲはまた、保存された一次または二次構造（例えば、１つまたは複数のステム－ループ）を有することができ、アルファウイルスのまたはレプリコンＲＮＡの複製に関与することができる。一部の実施態様では、３’ＵＴＲは、最大数百ヌクレオチドであり得、例えば、５０～９００、または１００～９００、または５０～８００、または１００～７００、または２００ｎｔ～７００ｎｔであり得る。３’ＵＴＲはまた、二次構造、例えば、ステップループを有することができ、ポリアデニル酸トラクトまたはポリＡテールが続くことができる。本発明の実施形態のいずれかでは、５’および３’非翻訳領域は、レプリコンによりコードされる他の配列のいずれかに作動可能に連結され得る。ＵＴＲは、他のコードされた配列の認識および転写に必要な配列および間隔を提供することによって、異種タンパク質またはペプチドをコードするプロモーターおよび／または配列に作動可能に連結することができる。本開示に照らして当業者に公知である任意のポリアデニル化シグナルを使用することができる。例えば、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。
別の実施形態では、本出願の自己複製ＲＮＡレプリコンは、修飾された５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含み、好ましくは、ＲＮＡレプリコンは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている。例えば、修飾された５’－ＵＴＲは、１位、２位、４位、またはそれらの組合せにおける１つまたは複数のヌクレオチド置換を含むことができる。好ましくは、修飾された５’－ＵＴＲは、２位でのヌクレオチド置換を含み、より好ましくは修飾された５’－ＵＴＲは、２位でＵ－＞ＧまたはＵ－＞Ａ置換を有する。このような自己複製ＲＮＡ分子の例は、米国特許出願公開ＵＳ２０１８／０１０４３５９号および国際特許出願公開第２０１８／０７５２３５号に記載されており、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本出願のレプリコンＲＮＡは、配列番号５５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を示す５’－ＵＴＲを含む。
一部の実施形態では、本出願のＲＮＡレプリコンは、５’末端から３’末端の順で、（１）配列番号５５のポリヌクレオチド配列を有する５’ＵＴＲ、（２）配列番号５６のポリヌクレオチド配列を有する５’複製配列、（３）配列番号５７のポリヌクレオチド配列を含むＤＬＰモチーフ、（４）配列番号１１のＰ２Ａ配列をコードするポリヌクレオチド配列、（５）それぞれ配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１の核酸配列を有するアルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチド配列、（６）配列番号６２のポリヌクレオチド配列を有するサブゲノムプロモーター、（７）本明細書に記載される天然に存在しないポリヌクレオチド配列、および（８）配列番号６３のポリヌクレオチド配列を有する３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、Ｐ２Ａ配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列番号１２を含み、天然に存在しないポリヌクレオチド配列は配列番号１５～５４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡレプリコンはポリアデノシン配列をさらに含む。好ましくは、ポリアデノシン配列は、レプリコンの３’末端に配列番号６４の配列を有する。
一部の好ましい実施形態では、本出願のＲＮＡレプリコンは、配列番号６５～７２のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本出願のＲＮＡレプリコンは、シグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。好ましくは、シグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ＨＢＶ ＰｒｅＳ１抗原、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶ ｐｏｌ抗原などのＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の上流または５’末端に位置する。シグナルペプチドは、典型的には、タンパク質の局在を指示し、それが産生される細胞からのタンパク質の分泌を促進し、ならびに／または抗原発現および抗原提示細胞への交差提示を改善する。シグナルペプチドは、レプリコンから発現される場合、ＨＢＶ抗原のＮ末端に存在することができるが、例えば、細胞からの分泌時に、シグナルペプチダーゼによって切断される。シグナルペプチドが切断されている発現タンパク質は、しばしば「成熟タンパク質」と呼ばれる。本開示に照らして当該技術分野において公知である任意のシグナルペプチドを使用することができる。例えば、シグナルペプチドは、シスタチンＳシグナルペプチド；免疫グロブリン（Ｉｇ）分泌シグナル、例えば、シスタチンＳシグナルペプチド、Ｉｇ重鎖ガンマシグナルペプチドＳＰＩｇＧ、Ｉｇ重鎖エプシロンシグナルペプチドＳＰＩｇＥ、または短いリーダーペプチド配列であり得る。シグナルペプチドの例示的なアミノ酸配列は、配列番号７７に示される。
種々の実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡレプリコンは、操作、合成、または組換えＲＮＡレプリコンであり得る。本明細書で使用される場合、用語「組換え体」とは、ポリヌクレオチドのヒトによる操作に起因するか、または間接的ではあるが結果として生じる任意の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を意味する。非限定的な例として、ｃＤＮＡは組換えＤＮＡ分子であり、同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応（複数可）によって生成されたか、またはリンカーが結合されたか、またはクローニングベクターもしくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子である。非限定的な例として、組換えＲＮＡレプリコンは、以下：１）例えば、化学的または酵素的技術を使用して（例えば、化学的核酸合成の使用によって、または核酸分子の複製、重合、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化を含む）、もしくは組換え（相同組換えおよび部位特異的組換えを含む）のための酵素の使用によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成または修飾されたもの；２）自然界では結合しない結合したヌクレオチド配列；３）分子クローニング技術を使用して、天然に存在するヌクレオチド配列に関して１つまたは複数のヌクレオチドを欠くように操作されたもの；４）分子クローニング技術を用いて、天然に存在するヌクレオチド配列に対して１つまたは複数の配列変化または再編成を有するように操作されたもの、のうちの１つまたは複数であり得る。
ＲＮＡレプリコンの任意の成分または配列は、任意の他の成分または配列に作動可能に連結することができる。ＲＮＡレプリコンの成分または配列は、宿主細胞もしくは処置された生物における少なくとも１つの異種タンパク質またはペプチド（またはバイオ医薬）の発現のため、および／またはレプリコンの自己複製能力のために作動可能に連結され得る。「作動可能に連結される」という用語は、それらの通常の機能を果たすように構成された２つ以上の配列間の機能的連結を意味する。したがって、コード配列に作動可能に連結されたプロモーターまたはＵＴＲは、適切な酵素が存在する場合にコード配列の転写および発現を行うことができる。プロモーターは、その発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接する必要はない。したがって、異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列と調節配列（例えば、プロモーターまたはＵＴＲ）との間の作動可能な連結は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的連結である。また、作動可能に連結されるとは、バイオ医薬分子の転写および翻訳、ならびに／またはレプリコンの複製を可能にするように連結される、ｎｓＰ１－４をコードする配列、ＵＴＲ、プロモーター、およびＲＮＡレプリコンにおいてコードされる他の配列などの配列を指す。ＵＴＲは、他のコードされた配列のリボソームによる認識および翻訳に必要な配列および間隔を提供することによって、作動可能に連結することができる。
本発明のＲＮＡレプリコンは、アルファウイルスゲノムから誘導することができ、これは、それらがアルファウイルスゲノムの構造的特徴の一部を有するか、またはそれらに類似していることを意味する。本発明のＲＮＡレプリコンは、修飾アルファウイルスゲノムであり得る。本明細書に開示されるレプリコンの一部の実施形態では、レプリコンの１つまたは複数の配列を「トランス」で提供することができ、すなわち、レプリコンの配列は、１を超えるＲＮＡ分子上に提供される。他の実施形態では、レプリコンのすべての配列は、単一のＲＮＡ分子上に存在し、本明細書に記載されるように処理される哺乳動物に投与することもできる。
本明細書で使用される場合、核酸配列またはポリペプチド配列に関して「同一性パーセント」または「相同性」または「共有配列同一性」または「配列同一性パーセント（％）」という用語は、最大同一性パーセントのために配列を整列させ、必要であれば最大相同性パーセントを達成するためにギャップを導入した後の、公知のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。Ｎ末端またはＣ末端の挿入または欠失は、相同性に影響を及ぼすものと解釈してはならず、約３０個未満、約２０個未満または約１０個未満または５個未満のアミノ酸残基の、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の内部欠失および／または挿入は、相同性に影響を及ぼすものと解釈してはならない。ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列レベルでの相同性または同一性は、配列の類似性検索に適合される、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘ（Altschul (1997), Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402、およびKarlin (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268）によって採用されるアルゴリズムを使用して、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）分析によって決定することができる。ＢＬＡＳＴプログラムによって使用されるアプローチは、最初に、クエリー配列とデータベース配列との間のギャップの有無に関わらず、類似のセグメントを考慮し、次に、同定されたすべての一致の統計的有意性を評価し、最後に、予め選択された有意性の閾値を満たすそれらの一致のみを要約することである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の議論については、Altschul (1994), Nature Genetics 6, 119-129を参照されたい。ヒストグラム、説明、アラインメント、期待（すなわち、データベース配列との一致を報告するための統計的有意性の閾値）、カットオフ、マトリックス、およびフィルター（複雑性が低い）の検索パラメータは、デフォルト設定であり得る。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘにより使用されるデフォルトのスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919)、長さが８５を超えるクエリー配列（ヌクレオチド塩基またはアミノ酸）について推奨される）である。
ヌクレオチド配列を比較するように設計されたｂｌａｓｔｎについては、スコアリングマトリックスは、Ｍ（すなわち、一対の一致している残基に対する報酬スコア）対Ｎ（すなわち、一致していない残基に対するペナルティースコア）の比によって設定され、ＭおよびＮに対するデフォルト値は、それぞれ＋５および－４であり得る。４つのｂｌａｓｔｎパラメータは、以下：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティ）、Ｒ＝１０（ギャップ拡張ペナルティ）、ｗｉｎｋ＝１（クエリーに沿ったウィンク番目の位置ごとにワードヒットを生成する）、およびｇａｐｗ＝１６（ギャップアラインメントが生成されるウィンドウ幅を設定する）のように調整することができる。アミノ酸配列の比較のための等価なＢｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２であり得る。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で入手可能な配列間のＢＥＳＴＦＩＴ（登録商標）比較は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップ拡張ペナルティ）を使用することができ、タンパク質比較における同等の設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２であり得る。
本明細書における核酸配列またはポリペプチド配列、例えば、ウイルスカプシドエンハンサー、自己プロテアーゼペプチド、サブゲノムプロモーター、非構造タンパク質、ＨＢＶ抗原の配列を開示する際には、元の配列に基づくか、またはそれに由来すると考えられる配列も開示されている。したがって、開示される配列には、配列番号１～９０、およびそれらの断片などの、それぞれ本明細書に開示される任意のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の全長ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列と、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％、または８５～９９％もしくは８５～９５％もしくは９０～９９％もしくは９５～９９％もしくは９７～９９％もしくは９８～９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が含まれる。また、本明細書に開示される配列のいずれかの断片または一部もまた開示される。配列の断片または部分は、本明細書に開示される配列番号１～９０のいずれかまたは任意の断片の、少なくとも５、もしくは少なくとも７、もしくは少なくとも１０、もしくは少なくとも２０、もしくは少なくとも３０、もしくは少なくとも５０、もしくは少なくとも７５、もしくは少なくとも１００、もしくは少なくとも１２５、１５０もしくはそれ以上、もしくは５～１０、もしくは１０～１２，もしくは１０～１５、もしくは１５～２０、もしくは２０～４０、もしくは２０～５０、もしくは３０～５０、もしくは３０～７５、もしくは３０～１００全配列のアミノ酸もしくは核酸残基、または少なくとも１００、もしくは少なくとも２００、もしくは少なくとも３００、もしくは少なくとも４００、もしくは少なくとも５００、もしくは少なくとも６００、もしくは少なくとも７００、もしくは少なくとも８００、もしくは少なくとも９００、もしくは少なくとも１０００、もしくは１００～２００、もしくは１００～５００、少なくとも１００～１０００、もしくは５００～１０００のアミノ酸もしくは核酸残基、またはこれらの量のいずれかであるが、５００未満、もしくは７００未満、もしくは１０００未満、もしくは２０００未満の連続アミノ酸もしくは核酸を有する配列を含むことができる。このような配列のバリアント、例えば、少なくとも１つもしくは２つもしくは３つもしくは４つもしくは５つのアミノ酸残基が、挿入および置換を含有する開示された配列（複数可）におよび／またはその中にＮ末端および／もしくはＣ末端で挿入される場合の配列、およびこのようなバリアントをコードする核酸配列もまた開示される。考えられるバリアントは、追加的または代替的に、例えば、相同組換えまたは部位特異的またはＰＣＲ突然変異誘発による所定の突然変異を含有するもの、および他の種の対応するポリペプチドまたは核酸を含むことができ、限定されないが、明細書に記載されるもの、対立遺伝子、または挿入および置換を含有するポリペプチドまたは核酸のファミリーの天然に存在する他のバリアント、および／またはポリペプチドが、挿入および置換を含有する天然に存在するアミノ酸以外の部分（例えば、酵素などの検出可能な部分）での置換、化学的、酵素的、または他の適切な手段によって共有結合的に修飾される誘導体が含まれる。本明細書に記載される核酸配列は、ＲＮＡ配列であり得る。
異種タンパク質とペプチド
本発明のＲＮＡレプリコンは、アルファウイルスに対して異種であり、体内でＲＮＡ配列を発現するヒト、哺乳動物、または動物に対して異種であり得る（しかし、必ずしもそうではない）少なくとも１つのタンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列を含むことができる。任意の実施形態では、レプリコンは、２つもしくは３つもしくは４つもしくはそれ以上の異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列（複数可）を有することができる。一部の実施形態では、異種タンパク質またはペプチドは、本明細書に記載されるＨＢＶ抗原である。実施形態のいずれかでは、異種タンパク質またはペプチドをコードする配列は、レプリコンの１つまたは複数の他の配列（例えば、プロモーターまたは５’もしくは３’ＵＴＲ配列）に作動可能に連結することができ、異種タンパク質またはペプチドがヒト、哺乳動物、または動物において発現されるように、サブゲノムプロモーターの制御下にあることができる。
一実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、異種タンパク質またはペプチド（例えば、モノクローナル抗体またはバイオ医薬タンパク質もしくはペプチド）をコードするＲＮＡ配列、野生型アルファウイルスｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４タンパク質配列に由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列、ならびに５’および３’ＵＴＲ配列（非構造タンパク質媒介増幅用）を有することができる。ＲＮＡレプリコンはまた、５’キャップおよびポリアデニル酸（またはポリＡ）テールを有することができる。
異種タンパク質またはペプチドの免疫原性は、当業者に公知である多数のアッセイ、例えば、エピトープ特異的Ｔ細胞集団による細胞内サイトカインもしくは分泌サイトカインの免疫染色によって、またはエピトープ特異的Ｔ細胞の頻度および総数を定量化し、それらの分化および活性化状態を特徴付けること、例えば、短寿命エフェクターおよび記憶前駆体エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞によって決定することができる。免疫原性はまた、抗体媒介性免疫応答、例えば、血清ＩｇＡまたはＩｇＧ力価を測定することによる抗体の産生を測定することによっても決定することができる。
本出願のＨＢＶ抗原に加えて、本出願のＲＮＡレプリコンは、必要に応じて、限定されないが、サイトカイン、増殖因子、免疫グロブリン、モノクローナル抗体（Ｆａｂ抗原結合断片、Ｆｃ融合タンパク質を含む）、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、調節ペプチドおよびタンパク質を含む、任意のタンパク質またはペプチドであり得る１つまたは複数の異種タンパク質またはペプチドをさらにコードし得る。
一部の実施形態では、異種タンパク質またはペプチドは、最大５ｋｂ、または最大６ｋｂ、または最大７ｋｂ、または最大８ｋｂ、または最大９ｋｂ、または最大１０ｋｂ、または最大１１ｋｂ、または最大１２ｋｂのＲＮＡ配列によりコードされ得る。異種タンパク質はまた、一本鎖抗体分子であり得る。
本発明のアルファウイルスレプリコンはまた、異種タンパク質またはペプチドの発現のためのサブゲノムプロモーターを有することができる。用語「サブゲノムプロモーター」は、本明細書で使用される場合、ウイルス核酸のサブゲノムｍＲＮＡのプロモーターを指す。本明細書で使用される場合、「アルファウイルスサブゲノムプロモーター」は、アルファウイルス複製プロセスの一部としてサブゲノムメッセンジャーＲＮＡの転写を指令するアルファウイルスゲノムにおいて元々定義されたプロモーターである。
用語「異種」とは、ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、タンパク質、または酵素に関して使用される場合、宿主種由来ではないポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、タンパク質、または酵素を指す。例えば、本明細書で使用される「異種遺伝子」または「異種核酸配列」とは、それが導入される宿主生物の種とは異なる種由来の遺伝子または核酸配列を指す。異種配列はまた、合成であり得、生物に由来しないか、または自然界に見出されないものであり得る。遺伝子調節配列、または遺伝子配列の発現を操作するために使用される補助核酸配列に言及する場合（例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリＡ付加配列、イントロン配列、スプライス部位、リボソーム結合部位、内部リボソーム侵入配列、ゲノム相同領域、組換え部位など）、またはタンパク質ドメインもしくはタンパク質局在化配列をコードする核酸配列に言及する場合、「異種」とは、調節配列もしくは補助配列、またはタンパク質ドメインもしくは局在化配列をコードする配列が、調節もしくは補助核酸配列、またはタンパク質ドメインもしくは局在化配列をコードする核酸配列がゲノム、染色体またはエピソームに並置される遺伝子とは異なる供給源に由来することを意味する。したがって、天然の状態では（例えば、遺伝子操作されていない生物のゲノムにおいて）作動可能に連結されていない遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、本明細書では「異種プロモーター」と呼ばれるが、なおも、プロモーターは、それが連結されている遺伝子と同種（または、場合によっては同じ生物）に由来する可能性がある。同様に、操作されたタンパク質のタンパク質局在化配列またはタンパク質ドメインに言及する場合、「異種」とは、局在化配列またはタンパク質ドメインが、遺伝子操作により組み込まれるタンパク質とは異なるタンパク質に由来することを意味する。
用語「天然に存在しない」、「組換え」または「操作された」核酸分子またはポリヌクレオチド配列は、本明細書で使用される場合、ヒトの介入によって改変された核酸分子または天然に存在しないポリヌクレオチド配列を指す。非限定的な例として、組換え核酸分子は：１）例えば、化学的または酵素的技術（例えば、化学的核酸合成の使用によって、または複製のための酵素の使用、核酸分子の重合、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化を含む）、または組換え（相同組換えおよび部位特異的組換えを含むによる）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成もしくは修飾されていて；２）自然界では結合しない、結合したヌクレオチドを含み；３）天然に存在する核酸分子配列に関して、１つまたは複数のヌクレオチドを欠くように分子クローニング技術を使用して操作されていて、および／または４）天然に存在する核酸配列に関して、１つまたは複数の配列変化または再編成を有するように分子クローニング技術を使用して操作されている。非限定的な例として、ｃＤＮＡは組換えＤＮＡ分子であり、同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応によって生成された、またはリンカーが結合された、またはクローニングベクターもしくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた、またはＲＮＡレプリコンに組み込まれている任意の核酸分子である。
一部の実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、５’－末端から３’－末端の順で、ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質媒介増幅に必要な５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）；ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質の少なくとも１つ、好ましくはすべてをコードするポリヌクレオチド配列；ＲＮＡウイルスのサブゲノムプロモーター；本明細書に記載される天然に存在しないポリヌクレオチド配列；およびＲＮＡウイルスの非構造タンパク質媒介増幅に必要な３’－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む。
一部の実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、５’末端から３’末端の順で、アルファウイルス５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）；アルファウイルス非構造遺伝子ｎｓｐ１の５’複製配列；ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフ；第４の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチド配列；アルファウイルスサブゲノムプロモーター；本明細書に記載される天然に存在しないポリヌクレオチド配列；アルファウイルス３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）；および必要に応じてポリアデノシン配列を含む。
一部の実施形態では、ＤＬＰモチーフは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＴＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガッハウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウイルス（ＦＭＶ）、ヌドゥム（ＮＤＵＶ）、およびバギークリークウイルスからなる群から選択されるウイルス種に由来する。
一部の実施形態では、第４の自己プロテアーゼペプチドが、ブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、トセアアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、フラシェリーウイルス２ Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、第４の自己プロテアーゼペプチドは、Ｐ２Ａのペプチド配列を含む。一部の実施形態では、第４の自己プロテアーゼペプチドは、配列番号１１を含む。一部の実施形態では、第４の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２を含む。一部の実施形態では、第４の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２からなる。
一部の実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、５’末端から３’末端の順で、配列番号５５のポリヌクレオチド配列を有する５’－ＵＴＲ、配列番号５６のポリヌクレオチド配列を有する５’－複製配列、配列番号５７のポリヌクレオチド配列を有するＤＬＰモチーフ、配列番号１１のＰ２Ａ配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１の核酸配列によってコードされるものとして、それぞれアルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号６２のポリヌクレオチド配列を有するサブゲノムプロモーター、本明細書に開示される天然に存在しないポリヌクレオチド配列、配列番号６３のポリヌクレオチド配列を有する３’－ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、Ｐ２Ａ配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列番号１２を含み、天然に存在しないポリヌクレオチド配列は配列番号１５～５４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡレプリコンはポリアデノシン配列をさらに含む。好ましくは、ポリアデノシン配列は、レプリコンの３’末端に配列番号６４の配列を有する。
一部の実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、配列番号６５～７２のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子は、ＤＮＡ配列の５’末端に作動可能に連結されたＴ７プロモーターをさらに含む。より好ましくは、Ｔ７プロモーターは、配列番号７３のヌクレオチド配列を含む。
また、本明細書に開示されたＲＮＡレプリコンをコードするＤＮＡ配列を含む核酸分子を転写するステップを含む、本出願のＲＮＡレプリコンを生成する方法が提供される。一部の実施形態では、核酸分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで転写される。一部の実施形態では、核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写される。
細胞およびポリペプチド
本出願はまた、本明細書に記載されるポリヌクレオチドおよびベクターのいずれかを含む細胞、好ましくは単離された細胞を提供する。細胞は、例えば、組換えタンパク質産生のため、またはウイルス粒子の産生のために用いることができる。一部の実施形態では、細胞は、ＲＮＡレプリコンの生成のために使用され得る。
本出願のＲＮＡレプリコンまたはＲＮＡレプリコンをコードする核酸を含む宿主細胞はまた本発明の一部を形成する。ＨＢＶ抗原は、宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、腫瘍細胞系、ＢＨＫ細胞、ヒト細胞系、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、もしくは酵母、真菌、昆虫細胞など、またはトランスジェニック動物もしくは植物において、分子の発現を伴う組換えＤＮＡ技術を介して産生され得る。ある特定の実施形態では、細胞は、多細胞生物由来であり、ある特定の実施形態では、それらは、脊椎動物または無脊椎動物由来である。ある特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞、または昆虫細胞である。一般的に、宿主細胞における組換えタンパク質、例えば、本発明のＨＢＶ抗原の産生は、宿主細胞への発現可能なフォーマットでタンパク質をコードする異種核酸分子の導入、核酸分子の発現に導く条件下での細胞の培養、および上記細胞におけるタンパク質の発現を可能にすることを含む。発現可能な形式でタンパク質をコードする核酸分子は、発現カセットの形態であり得、通常、エンハンサー（複数可）、プロモーター、ポリアデニル化シグナルなどの核酸の発現をもたらすことができる配列を必要とする。当業者は、種々のプロモーターを使用して宿主細胞中の遺伝子の発現を得ることができることを知っている。プロモーターは構成的または調節的であり得、ウイルス、原核生物、または真核生物源を含む種々の供給源から得ることができ、または人工的に設計され得る。さらなる調節配列を加えることができる。多くのプロモーターは、導入遺伝子の発現に使用することができ、当業者に公知であり、例えば、これらはウイルス、哺乳動物、合成プロモーターなどを含むことができる。真核細胞における発現を得るための適切なプロモーターの非限定的な例は、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号）、例えば、ＣＭＶ前初期プロモーターであり、例えば、ＣＭＶ前初期遺伝子エンハンサー／プロモーターから－７３５～＋９５ｎｔを含む。ポリアデニル化シグナル、例えば、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号）は、導入遺伝子（複数可）の後に存在し得る。あるいは、広く使用されているいくつかの発現ベクターは、当該技術分野においておよび市販の供給源から利用可能であり、例えば、ＩｎｂｉｔｒｏｇｅｎからのｐｃＤＮＡおよびｐＥＦベクターシリーズ、ＢＤ ＳｃｉｅｎｃｅｓからのｐＭＳＣＶおよびｐＴＫ－Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＣＭＶ－Ｓｃｒｉｐｔが挙げられ、目的のタンパク質を組換え的に発現させるために、または適切なプロモーターおよび／もしくは転写ターミネーター配列、ポリＡ配列などを得るために使用することができる。
細胞培養物は、接着細胞培養物、例えば、培養容器の表面またはマイクロキャリアーに付着した細胞、ならびに懸濁培養物を含む、任意のタイプの細胞培養物であり得る。ほとんどの大規模懸濁培養物は、操作およびスケールアップが最も簡単であるため、バッチ処理または供給バッチ処理として操作される。今日では、潅流原理に基づく連続プロセスがより一般的になりつつあり、また適切である。適切な培地は、当業者に周知であり、一般的に、大量の商業的供給源から、または標準的なプロトコールに従ってカスタム製造されたものから入手することができる。培養は、例えば、バッチ、供給バッチ、連続システムなどを用いて、ディッシュ、ローラーボトルまたはバイオリアクター中で行うことができる。細胞を培養するための適切な条件は公知である（例えば、Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), and R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)を参照されたい）。細胞培養培地は、種々の供給業者から入手可能であり、好適な培地は、目的のタンパク質、ここではＨＢＶ抗原を発現するために、宿主細胞のために日常的に選択され得る。適切な培地は血清を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。
したがって、本出願の実施形態はまた、本出願のＨＢＶ抗原を作製する方法に関する。本方法は、プロモーターに作動可能に連結された本出願のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、ＨＢＶ抗原の発現に適した条件下でトランスフェクトされた細胞を増殖させ、および必要に応じて細胞内で発現されたＨＢＶ抗原を精製または単離するステップを含む。ＨＢＶ抗原は、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどを含む当該技術分野において公知である任意の方法によって、細胞から単離または回収することができる。組換えタンパク質発現のために使用される技術は、本開示に照らして、当業者に周知である。発現されたＨＢＶ抗原はまた、発現されたタンパク質を精製または単離することなく、例えば、ＨＢＶ抗原をコードする発現ベクターでトランスフェクトされ、ＨＢＶ抗原の発現に適した条件下で増殖された細胞の上清を分析することにより、研究することができる。
したがって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、８４、８５もしくは８６、または配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む天然に存在しないまたは組換えポリペプチドもまた提供される。上述および下記のように、これらの配列をコードする単離された核酸分子、プロモーターに作動可能に連結されたこれらの配列を含むベクター、およびポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターを含む組成物はまた、本出願によって意図される。
本出願のある実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、８４、８５もしくは８６、または配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、８４、８５もしくは８６、または配列番号９のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。好ましくは、天然に存在しないまたは組換えポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号８４、８５もしくは８６、または配列番号９からなる。
組成物
本出願はまた、本出願による１種以上のＨＢＶ抗原、ポリヌクレオチド、および／または１種または複数のＨＢＶ抗原をコードするベクターを含む、組成物、医薬組成物、免疫原性組成物、およびより具体的にはワクチンに関する。本明細書に記載される本出願のＨＢＶ抗原、ポリヌクレオチド（ＲＮＡおよびＤＮＡを含む）、および／またはベクターのいずれも、本出願の組成物、医薬組成物、免疫原性組成物、およびワクチンにおいて使用することができる。
本出願は、例えば、本明細書に記載される任意の核酸分子、ベクター、またはＲＮＡレプリコンを、薬学的に許容される担体とともに含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される担体は無毒性であり、活性成分の有効性を妨げてはならない。薬学的に許容される担体には、１種以上の賦形剤、例えば、結合剤、崩壊剤、膨潤剤、懸濁剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、香味剤、甘味剤、保存剤、染料、可溶化剤および被覆剤が含まれ得る。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、筋肉内、皮内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば、腸）、鼻腔内または腹腔内経路に依存し得る。液体注射用調製物、例えば、懸濁液および溶液について、適切な担体および添加剤は、水、グリコール、油、アルコール、防腐剤、着色剤などを含む。固形経口調製物、例えば、粉末、カプセル、カプレット、ジェルキャップおよび錠剤について、適切な担体および添加剤には、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などが含まれる。鼻スプレー／吸入混合物について、水溶液／懸濁液は、水、グリコール、油、皮膚軟化剤、安定剤、湿潤剤、防腐剤、芳香剤、香料などを適切な担体および添加剤として含むことができる。
本出願の医薬組成物は、限定されないが、経口（経腸）投与および非経口注射を含む、投与を容易にし、有効性を改善するために、対象への投与に適した任意の物質に製剤化することができる。非経口注射には、静脈内注射または点滴、皮下注射、皮内注射、および筋肉内注射が含まれる。本出願の医薬組成物はまた、経粘膜、眼、直腸、長時間作用性移植、舌下投与、舌の下、門脈循環をバイパスする口腔粘膜から、吸入、または鼻腔内を含む他の投与経路用に製剤化することができる。
本出願の好ましい実施形態では、本出願の医薬組成物は、非経口注射、好ましくは皮下注射、皮内注射、または筋肉内注射、より好ましくは筋肉内注射用に製剤化される。
本出願の実施形態によれば、投与のための医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体、例えば、水性担体中の緩衝液、例えば、緩衝生理食塩水など、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。組成物および免疫原性組合せはまた、ｐＨ調整剤および緩衝剤などの生理学的条件を近似するために必要とされるように、薬学的に許容される物質を含有することができる。例えば、プラスミドＤＮＡを含む本出願の医薬組成物は、薬学的に許容される担体としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含有することができる。プラスミドＤＮＡは、例えば、０．５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、例えば、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、または５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在することができる。
一部の実施形態では、ＲＮＡレプリコンを含む本出願の医薬組成物は、例えば、約２０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、例えば２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１１０μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬ、１３０μｇ／ｍＬ、１４０μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、１６０μｇ／ｍＬ、１７０μｇ／ｍＬ、１８０μｇ／ｍＬ、１９０μｇ／ｍＬ、または２００μｇ／ｍＬの濃度で投与することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡレプリコンを含む本出願の医薬組成物は、２０μｇ／ｍＬを下回る濃度で投与することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡレプリコンを含む本出願の医薬組成物は、２００μｇ／ｍＬを超える濃度で投与することができる。
本出願の医薬組成物は、当該技術分野において周知である方法に従ってワクチン（「免疫原性組成物」とも呼ばれる）として製剤化することができる。このような組成物は、免疫応答を増強するためのアジュバントを含むことができる。製剤中の各成分の最適比は、本開示に照らして当業者に周知である技術によって決定することができる。
本出願の特定の実施形態では、医薬組成物、組成物、または免疫原性組成物は、ＤＮＡワクチンである。ＤＮＡワクチンは、典型的には、強力な真核生物プロモーターの制御下で目的の抗原をコードするポリヌクレオチドを含む細菌プラスミドを含む。プラスミドが宿主の細胞質に送達されると、コードされた抗原が産生され、内因的にプロセシングされる。得られた抗原は、典型的には、体液性と細胞性免疫応答の両方を誘導する。ＤＮＡワクチンは、少なくとも改良された安全性を提供し、温度が安定であり、抗原性バリアントを発現するのに容易に適応することができ、産生が簡単であるため有利である。本出願のＤＮＡプラスミドのいずれも、このようなＤＮＡワクチンを調製するために使用することができる。
本出願の他の特定の実施形態では、医薬組成物、組成物、または免疫原性組成物は、ＲＮＡワクチンである。ＲＮＡワクチンは、典型的には、目的の抗原、例えば、ＨＢＶ抗原をコードする少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡ分子を含む。ＲＮＡが宿主の細胞質に送達されると、コードされた抗原が産生され、内因的にプロセシングされ、ＤＮＡワクチンと同様に、体液性と細胞性免疫応答の両方を誘導する。ＲＮＡ配列は、翻訳効率を改善するためにコドンを最適化することができる。ＲＮＡ分子は、安定性および／または翻訳を増強するために、本開示に照らして当該技術分野において公知である任意の方法によって修飾することができ、例えば、少なくとも３０個のアデノシン残基のポリＡテールを加えること；および／またはＲＮＡ合成中に取り込むことができ、またはＲＮＡ転写後に酵素的に操作することができる修飾されたリボヌクレオチド、例えば、７－メチルグアノシンキャップで５末端をキャップすることによって修飾することができる。ＲＮＡワクチンはまた、アルファウイルス発現ベクターから開発された自己複製ＲＮＡワクチンであり得る。自己複製ＲＮＡワクチンは、ＨＢＶ抗原ＲＮＡの複製を制御するサブゲノムプロモーターを有するアルファウイルスファミリーに属するウイルスに由来するレプリカーゼＲＮＡ分子、続いてレプリカーゼの下流に位置する人工ポリＡテールを含む。
一部の実施形態では、アジュバントは、本出願の医薬組成物中に含まれるか、または本出願の医薬組成物と同時に投与される。アジュバントの使用は任意であり、組成物がワクチン接種目的に使用される場合、免疫応答をさらに増強することができる。本出願による同時投与または組成物中の包含に適したアジュバントは、好ましくは、ヒトにおいて潜在的に安全であり、良好な忍容性および有効性を有するアジュバントである必要がある。アジュバントは、限定されないが、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＴＩＭ－３など）、トール様受容体アゴニスト（例えば、ＴＬＲ７アゴニストおよび／またはＴＬＲ８アゴニスト）、ＲＩＧ－１アゴニスト、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（Ａｌｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、突然変異ＩＲＦ３およびＩＲＦ７遺伝子アジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ａｄｕｒｏ）、ＦＬＴ３Ｌ遺伝子アジュバント、ＩＬ－１２遺伝子アジュバント、およびＩＬ－７－ｈｙＦｃを含む小分子または抗体であり得る。
本出願はまた、本出願の医薬組成物および免疫原性組合せを作製する方法を提供する。医薬組成物または免疫原性組合せを産生する方法は、本出願のＨＢＶ抗原、ベクター、および／またはポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを、１つまたは複数の薬学的に許容される担体と混合するステップを含む。当業者は、このような組成物を調製するために使用される従来の技術に精通している。
免疫応答を誘導する方法
本出願はまた、免疫原的に有効な量の本出願の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、対象においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。本明細書に記載される本出願の医薬組成物のいずれも、本出願の方法において使用することができる。
本明細書で使用される場合、用語「感染」とは、疾患の原因物質による宿主の侵入を指す。疾患の原因物質は、宿主に侵入することができ、宿主内で複製または増殖することができる場合、「感染性」であると考えられる。感染物質の例としては、ウイルス、例えば、ＨＢＶおよびある特定のアデノウイルス、プリオン、細菌、真菌、原虫などが挙げられる。「ＨＢＶ感染」とは、特に、宿主生物の細胞および組織などの宿主生物のＨＢＶによる侵入を指す。
「免疫応答を誘導する」という語句は、本明細書に記載される方法に関して使用される場合、感染、例えば、ＨＢＶ感染に対して、それを必要とする対象において所望の免疫応答または効果を引き起こすことを包含する。また、「免疫応答を誘導する」は、病原体、例えば、ＨＢＶに対して処置するための治療的免疫を提供することを包含する。本明細書で使用される「治療的免疫」または「治療的免疫応答」という用語は、ワクチン接種された対象が、ワクチン接種が行われた病原体、例えば、ＨＢＶワクチンによるワクチン接種によって付与されたＨＢＶ感染に対する免疫による感染を制御することができることを意味する。ある実施形態では、「免疫応答を誘導する」とは、それを必要とする対象において免疫を生成することを意味し、例えば、ＨＢＶ感染などの疾患に対する治療効果を提供する。ある特定の実施形態では、「免疫応答を誘導する」とは、ＨＢＶ感染に対する細胞性免疫、例えば、Ｔ細胞応答を引き起こすかまたは改善することを指す。ある特定の実施形態では、「免疫応答を誘導する」とは、ＨＢＶ感染に対する体液性免疫応答を引き起こすかまたは改善することを指す。ある特定の実施形態では、「免疫応答を誘導する」とは、ＨＢＶ感染に対する細胞性および体液性免疫応答を引き起こすかまたは改善することを指す。
本出願はまた、本出願の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象をＨＢＶに対するワクチン接種する方法を提供する。一部の実施形態では、対象のワクチン接種は、予防的ワクチン接種または治療的ワクチン接種であり、より具体的には、ワクチン接種は、治療的ワクチン接種である。また、本出願は、本出願の医薬組成物または本出願のワクチンを対象に投与するステップを含む、対象におけるＨＢＶの感染および／または複製を減少する方法を提供する。本明細書に記載される本出願の医薬組成物またはワクチンのいずれも、本出願の方法において使用することができる。
本明細中で使用される場合、用語「防御免疫」または「防御免疫応答」とは、ワクチン接種された対象が、ワクチン接種が行われた病原体による感染を制御することができることを意味する。通常、「防御免疫応答」を発現した対象は、軽度から中等度の臨床症状のみを発現するか、または全く症状を発現しない。通常、ある特定の薬物に対する「防御免疫応答」または「防御免疫」を有する対象は、該薬物による感染の結果として死亡しない。
典型的には、本出願の医薬組成物および免疫原性組合せの投与は、ＨＢＶ感染後またはＨＢＶ感染に特徴的な症状の発現後、例えば、治療的ワクチン接種について、ＨＢＶに対する免疫応答を生成するための治療目的を有する。
本明細書で使用される場合、「免疫原的に有効な量」または「免疫学的に有効な量」とは、それを必要とする対象において所望の免疫効果または免疫応答を誘導するのに十分な組成物、ポリヌクレオチド、ベクターまたは抗原の量を意味する。免疫原的に有効な量は、それを必要とする対象において免疫応答を誘導するのに十分な量であり得る。免疫原的に有効な量は、それを必要とする対象において免疫を生成し、例えば、ＨＢＶ感染などの疾患に対する治療効果を提供するのに十分な量であり得る。免疫原的に有効な量は、対象の身体的状態、年齢、体重、健康状態などの様々な要因；特定の用途、例えば、防御免疫または治療免疫を提供すること；免疫が望まれる特定の疾患、例えばウイルス感染によって異なることがある。免疫原的に有効な量は、本開示に照らして、当業者によって容易に決定することができる。
本出願の特定の実施形態では、免疫原的に有効な量とは、以下の効果：（ｉ）ＨＢＶ感染またはそれに関連する症状の重症度を減少または軽減すること；（ｉｉ）ＨＢＶ感染またはそれに関連する症状の期間を減少すること；（ｉｉｉ）ＨＢＶ感染またはそれに関連する症状の進行を妨げること；（ｉｖ）ＨＢＶ感染またはそれに関連する症状の退行を引き起こすこと；（ｖ）ＨＢＶ感染またはそれに関連する症状の発現または発症を防げること；（ｖｉ）ＨＢＶ感染またはそれに関連する症状の再発を防げること；（ｖｉｉ）ＨＢＶ感染を有する対象の入院を減少すること；（ｖｉｉｉ）ＨＢＶ感染を有する対象の入院期間を減少すること；（ｉｘ）ＨＢＶ感染を有する対象の生存を増加すること；（ｘ）対象におけるＨＢＶ感染を除去すること；（ｘｉ）対象におけるＨＢＶ複製を阻害または減少すること、および／または（ｘｉｉ）別の治療の予防効果または治療効果（複数可）を増強または改善することのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を達成するのに十分な組成物または免疫原性組合せの量を指す
免疫原的に有効な量はまた、臨床的セロコンバージョンへの進展と一致するＨＢｓ抗原レベルを減少させ；対象の免疫系による感染肝細胞の減少に関連するＨＢｓ抗原クリアランスの持続を達成し；ＨＢＶ抗原特異的活性化Ｔ細胞集団を誘導し；および／または１２カ月以内にＨＢｓ抗原の持続的な喪失を達成するのに十分な量であり得る。標的指数の例としては、５００コピーのＨＢｓ抗原国際単位（ＩＵ）および／またはより高いＣＤ８カウントの閾値を下回るＨＢｓ抗原が挙げられる。
一般的なガイダンスとして、核酸分子、ベクター、またはＲＮＡレプリコンに関して使用される場合の免疫原的に有効な量は、約１μｇの核酸分子、ベクター、またはＲＮＡレプリコンから約１ｍｇの核酸分子、ベクター、またはＲＮＡレプリコンの範囲であり得、例えば、１μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、または１ｍｇである。好ましくは、免疫原的に有効な量の核酸分子、ベクター、またはＲＮＡレプリコンは、約１０μｇ～約１００μｇである。医薬組成物中の核酸分子、ベクター、またはＲＮＡレプリコンに関して使用される場合の免疫原的に有効な量は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬの核酸分子、ベクター、またはＲＮＡレプリコン全体の濃度の範囲であり得、例えば、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．０３ｍｇ／ｍＬ、０．０４ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬ量、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、または２ｍｇ／ｍＬである。好ましくは、核酸分子、ベクター、またはＲＮＡレプリコンの免疫原的に有効な量は、１ｍｇ／ｍＬ未満、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ未満である。免疫原的に有効な量は、１つの核酸分子、ベクター、もしくはＲＮＡレプリコンから、または複数の核酸分子、ベクター、もしくはＲＮＡレプリコンからのものであり得る。免疫原的に有効な量は、単一の組成物、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の組成物などの複数の組成物（例えば、錠剤、カプセルもしくは注射剤、または皮内送達、例えば、皮内送達パッチを使用する皮内送達に適合した任意の組成物）で投与され得、複数のカプセルまたは注射の投与は、対象に免疫原的に有効な量を集合的に提供する。例えば、２種のＤＮＡプラスミドを使用する場合、免疫原的に有効な量は３～４ｍｇ／ｍＬであり、各プラスミドは１．５～２ｍｇ／ｍＬであり得る。また、いわゆるプライム－ブーストレジメンにおいて、対象に免疫原的に有効な量を投与し、その後、同対象に免疫原的に有効な量を別の用量で投与することが可能である。プライム－ブーストレジメンのこの一般的概念は、ワクチン分野の当業者に周知である。必要とする場合、さらなるブースター投与は、必要に応じて、レジメンに追加することができる。
２つのベクター、例えば、第１のＨＢＶ抗原をコードする第１のベクターと第２のＨＢＶ抗原をコードする第２のベクターを含む免疫原性組合せは、両方のベクターを混合し、混合物を単一の解剖学的部位に送達することによって、対象に投与することができる。あるいは、各々が単一の発現ベクターを送達する２つの別々の免疫化を行うことができる。このような実施形態では、両方のベクターが単一の免疫化で２回の別個の免疫化の混合物として投与されるかどうかにかかわらず、第１のベクターと第２のベクターは、重量比で１０：１～１：１０、例えば、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０の重量で投与することができる。好ましくは、第１および第２のベクターは、１：１の重量比で投与される。
好ましくは、本出願の方法に従って処置される対象は、ＨＢＶ感染対象、特に慢性ＨＢＶ感染を有する対象である。急性ＨＢＶ感染は、その後の広範な適応反応（例えば、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞、中和抗体）で補完された自然免疫系の効率的な活性化によって特徴付けられ、通常は感染した肝細胞の複製の抑制または除去の成功をもたらす。対照的に、このような応答は、高いウイルスおよび抗原負荷のために障害または減少し、例えば、ＨＢＶエンベロープタンパク質は豊富に産生され、感染性ウイルスに対して１，０００倍過剰にサブウイルス粒子中に放出され得る。
慢性ＨＢＶ感染は、ウイルス量、肝酵素レベル（壊死炎症活性）、ＨＢｅ抗原、またはＨＢｓ抗原量、またはこれらの抗原に対する抗体の存在によって特徴付けられる段階で記述される。ウイルス血症にはかなりのばらつきがあるが、ｃｃｃＤＮＡレベルは細胞あたり約１０～５０コピーで比較的一定である。ｃｃｃＤＮＡ種の存続は慢性化をもたらす。より具体的には、慢性ＨＢＶ感染の段階には、（ｉ）ウイルス量が高く、肝酵素が正常またはわずかに上昇することによって特徴付けられる免疫寛容期、（ｉｉ）肝酵素の有意な上昇を伴うウイルス複製レベルの低下または減少が観察される免疫活性化ＨＢｅ抗原陽性期、（ｉｉｉ）ＨＢｅ抗原セロコンバージョンに続く血清中の低いウイルス量および正常肝酵素レベルの低い複製状態である不活性ＨＢｓ抗原キャリア期、および（ｉｖ）肝酵素レベルの変動を伴うウイルス複製が周期的に（再活性化）起こるＨＢｅ抗原陰性期が含まれ、プレコアおよび／または基底コアプロモーターにおける突然変異が一般的であり、ＨＢｅ抗原が感染細胞によって産生されないようにする。
本明細書で使用される場合、「慢性ＨＢＶ感染」とは、６カ月を超えてＨＢＶの検出可能な存在を有する対象を指す。慢性ＨＢＶ感染を有する対象は、慢性ＨＢＶ感染のいずれの段階でもよい。慢性ＨＢＶ感染は、現場での通常の意味に従って理解されている。慢性ＨＢＶ感染は、例えば、急性ＨＢＶ感染後の６カ月以上、ＨＢｓ抗原が持続することによって特徴付けることができる。例えば、本明細書において言及される慢性ＨＢＶ感染は、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によって公開された定義に従い、それによれば、慢性ＨＢＶ感染は、例えば、（ｉ）Ｂ型肝炎コア抗原に対するＩｇＭ抗体（ＩｇＭ抗ＨＢｃ）陰性であり、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ抗原）、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅ抗原）、またはＢ型肝炎ウイルスＤＮＡに対する核酸試験陽性、または（ｉｉ）ＨＢＶ ＤＮＡに対するＨＢｓ抗原または核酸試験陽性、または少なくとも６カ月間隔を置いて２回のＨＢｅ抗原陽性の臨床検査基準によって特徴付けることができる。好ましくは、免疫原的に有効な量は、慢性ＨＢＶ感染を処置するのに十分な本出願の組成物または免疫原性組合せの量を指す。
一部の実施形態では、慢性ＨＢＶ感染を有する対象は、ヌクレオシド類似体（ＮＵＣ）処置を受けており、ＮＵＣ抑制される。本明細書で使用される場合、「ＮＵＣ抑制」とは、少なくとも６カ月間、検出不能なウイルスレベルのＨＢＶおよび安定なアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを有する対象を指す。ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体処置の例には、エンタカビルおよびテノホビルなどのＨＢＶポリメラーゼ阻害剤が挙げられる。好ましくは、慢性ＨＢＶ感染を有する対象は、進行した肝線維症または肝硬変を有さない。このような対象は、典型的には、線維症については３未満のＭＥＴＡＶＩＲスコア、および９ｋＰａ未満の線維スキャン結果を有する。ＭＥＴＡＶＩＲスコアは、Ｂ型肝炎患者の肝生検において、組織病理学的評価により炎症および線維化の程度を評価するために一般的に用いられるスコアシステムである。このスコアシステムは炎症の程度を反映するスコアと線維化の程度を反映するスコアの２つの標準化された数字を割り当てる。
慢性ＨＢＶの排除または減少は、ウイルス誘導性肝硬変および肝細胞癌を含む重篤な肝疾患の早期の疾患遮断を可能にすると考えられている。したがって、本出願の方法は、ＨＢＶ誘導性疾患を処置するための治療としても使用することができる。ＨＢＶ誘導性疾患の例としては、限定されないが、肝硬変、がん（例えば、肝細胞癌）、および線維症、特に、線維症のＭＥＴＡＶＩＲスコアが３以上であることによって特徴付けられる進行した線維症が挙げられる。このような実施形態では、免疫原的に有効な量は、１２カ月以内にＨＢｓ抗原の持続的な喪失、および臨床疾患（例えば、肝硬変、肝細胞癌など）の有意な減少を達成するのに十分な量である。
本出願の実施形態に従う方法は、さらに、それを必要とする対象に、本出願の医薬組成物と組み合わせて、別の免疫原性薬物（例えば、別のＨＢＶ抗原または他の抗原）または別の抗ＨＢＶ薬物（例えば、ヌクレオシド類似体または他の抗ＨＢＶ薬物）を投与するステップを含む。例えば、別の抗ＨＢＶ作用剤または免疫原性作用剤は、限定されないが、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＴＩＭ－３など）、トール様受容体アゴニスト（例えば、ＴＬＲ７アゴニストおよび／またはＴＬＲ８アゴニスト）、ＲＩＧ－１アゴニスト、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（Ａｌｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、突然変異ＩＲＦ３およびＩＲＦ７遺伝子アジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ａｄｕｒｏ）、ＦＬＴ３Ｌ遺伝子アジュバント、ＩＬ－１２遺伝子アジュバント、ＩＬ－７－ｈｙＦｃ；ＨＢＶ ｅｎｖに結合するＣＡＲ－Ｔ（Ｓ－ＣＡＲ細胞）；カプシドアセンブリモジュレーター；ｃｃｃＤＮＡ阻害剤、ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤（例えば、エンテカビルおよびテノホビル）を含む、小分子または抗体であり得る。１つまたは他の抗ＨＢＶ活性剤は、例えば、小分子、その抗体もしくは抗原結合断片、ポリペプチド、タンパク質、または核酸であり得る。
送達方法
本出願の医薬組成物および免疫原性組合せは、限定されないが、非経口投与（例えば、筋肉内、皮下、静脈内、または皮内注射）、経口投与、経皮投与、および経鼻投与を含む、本開示を考慮して、当該技術分野において公知である任意の方法によって対象に投与することができる。好ましくは、医薬組成物および免疫原性組合せは、非経口的に（例えば、筋肉内注射または皮内注射によって）または経皮的に投与される。
医薬組成物または免疫原性組合せが１つまたは複数のＤＮＡプラスミドを含む本出願の一部の実施形態では、投与は、皮膚を介した注射、例えば、筋肉内または皮内注射、好ましくは筋肉内注射によって行うことができる。筋肉内注射は、エレクトロポレーション、すなわち、細胞へのＤＮＡプラスミドの送達を容易にするための電場の印加と組み合わせることができる。本明細書で使用される場合、用語「エレクトロポレーション」とは、膜貫通電場パルスを使用して、生体膜内に微小経路（孔）を誘導することを指す。ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションの間、適切な大きさおよび持続時間の電場が細胞に印加され、細胞膜透過性の増大の一過性状態を誘導し、それによって細胞膜を単独で通過できない分子の細胞取り込みを可能にする。エレクトロポレーションによるこのような孔の作出は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物などの生体分子の細胞膜の一方から他方への通過を容易にする。ＤＮＡワクチンの送達のためのｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションは、宿主細胞によるプラスミド取り込みを有意に増加させる一方で、注射部位において軽度から中等度の炎症を引き起こすことが示されている。結果として、従来の注射と比較して、皮内または筋肉内エレクトロポレーションにより、トランスフェクション効率および免疫応答が有意に改善される（例えば、それぞれ最大１，０００倍および１００倍）。
典型的な実施形態では、エレクトロポレーションを筋肉内注射と組み合わせる。しかしながら、エレクトロポレーションを、他の形態の非経口投与、例えば、皮内注射、皮下注射などと組み合わせることも可能である。
本出願の医薬組成物、免疫原性組合せまたはエレクトロポレーションを介したワクチンの投与は、可逆的孔を細胞膜中に形成させるのに有効なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得るエレクトロポレーションデバイスを使用して達成することができる。エレクトロポレーションデバイスは、エレクトロポレーション構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含むことができる。エレクトロポレーション構成要素は、以下のエレクトロポレーションデバイスの構成要素：コントローラ、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力エレメント、ステータス報告エレメント、通信ポート、メモリ構成要素、電源、および電源スイッチのうちの１つまたは複数を含むことができる。エレクトロポレーションは、ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションデバイスを用いて達成することができる。本出願の組成物の送達および免疫原性組合せを容易にすることができるエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション法の例、特にＤＮＡプラスミドを含むものは、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ、ＰＡ）、Ｅｌｇｅｎエレクトロポレーター（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、Ｔｒｉ－Ｇｒｉｄ（商標）送達システム（Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１）、ならびにすべてが全体として参照により組み込まれる米国特許第７，６６４，５４５号、米国特許第８，２０９，００６号、米国特許第９，４５２，２８５号、米国特許第５，２７３，５２５号、米国特許第６，１１０，１６１号、米国特許第６，２６１，２８１号、米国特許第６，９５８，０６０号、および米国特許第６，９３９，８６２号、米国特許第７，３２８，０６４号、米国特許第６，０４１，２５２号、米国特許第５，８７３，８４９号、米国特許第６，２７８，８９５号、米国特許第６，３１９，９０１号、米国特許第６，９１２，４１７号、米国特許第８，１８７，２４９号、米国特許第９，３６４，６６４号、米国特許第９，８０２，０３５号、米国特許第６，１１７，６６０および国際特許出願公開第２０１７／１７２８３８号に記載されているものを含む。ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションデバイスの他の例は、本出願と同日に、弁護士ドケット番号６８８０９７－４０５ＷＯで出願された「Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチンの送達のための方法および装置」と題する国際特許出願に記載されており、その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、本出願の組成物の送達および免疫原性組合せのための出願により、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６９７，６６９号に記載されているようなパルス電場の使用が考えられる。
医薬組成物または免疫原性組合せが１つまたは複数のＤＮＡプラスミドを含む本出願の他の実施形態では、投与方法は経皮である。経皮投与は、ＤＮＡプラスミドの細胞への送達を容易にするために、表皮皮膚擦過と組み合わせることができる。例えば、皮膚パッチは、表皮皮膚擦過に使用することができる。皮膚パッチを除去すると、組成物または免疫原性組合せを擦過皮膚上に沈着させることができる。
送達の方法は、上述の実施形態に限定されず、細胞内送達のための任意の手段を使用することができる。本出願の方法によって意図される細胞内送達の他の方法は、限定されないが、リポソームカプセル化、リポプレックス、ナノ粒子などを含む。例えば、本出願のＲＮＡレプリコンは、１つまたは複数の脂質分子、好ましくは正に荷電した脂質分子を含む免疫原性組成物中に製剤化することができる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡレプリコンは、１種または複数のリポソーム、リポプレックス、および／または脂質ナノ粒子を用いて製剤化することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるリポソームまたは脂質ナノ粒子製剤は、ポリカチオン組成物を含むことができる。一部の実施形態では、ポリカチオン組成物を含む製剤は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ ｖｉｔｒｏで本明細書に記載されるＲＮＡレプリコンの送達のために使用することができる。
本発明によれば、用語「脂質」とは、リオトロピック脂質相、またはより好ましくは、ラメラリオトロピック相を形成することができる任意の脂肪酸誘導体または他の両親媒性化合物を指す。特に、用語「脂質」とは、脂質分子の疎水性部分が二重層に向かって配向し、一方親水性部分が水性相に向かって配向するような二重層を形成することができる任意の脂肪酸誘導体を指す。用語「脂質」は、中性、アニオン性またはカチオン性脂質を含む。脂質は、好ましくは、少なくとも１つ、好ましくは２つのアルキル鎖またはコレステロール部分および極性頭部基を有する疎水性ドメインを含む。脂質の疎水性ドメイン中の脂肪酸のアルキル鎖は、特定の長さまたは数の二重結合に限定されない。それにもかかわらず、脂肪酸は、好ましくは、１０～３０個、好ましくは１４～２５個の炭素原子の長さを有する。脂質はまた、２つの異なる脂肪酸を含み得る。
本開示の文脈において、脂質ベースの送達ビヒクルは、典型的には、所望のＲＮＡレプリコンを標的細胞または組織に輸送するのに役立つ。一部の実施形態では、脂質ベースの送達ビヒクルは、脂質分子のナノ粒子または二重層および本開示のＲＮＡレプリコンを含む。一部の実施形態では、脂質二重層は、好ましくは、中性脂質またはポリマーをさらに含む。用語「中性脂質」とは、選択されたｐＨで、荷電していないかまたは中性の双性イオン形態で存在する脂質種を意味する。生理的ｐＨでは、このような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、およびジアシルグリセロールが含まれる。一部の実施形態では、脂質製剤は、好ましくは、液体媒体を含む。一部の実施形態では、製剤は、好ましくは、核酸をさらにカプセル化する。一部の実施形態では、脂質製剤は、好ましくは、核酸および中性脂質またはポリマーをさらに含む。一部の実施形態では、脂質製剤は、好ましくは、核酸をカプセル化する。
本明細書は、脂質製剤中にカプセル化された１つまたは複数のＲＮＡレプリコンを含む脂質製剤を提供する。一部の実施形態では、脂質製剤はリポソームを含む。一部の実施形態では、脂質製剤はカチオン性リポソームを含む。一部の実施形態では、脂質製剤は脂質ナノ粒子を含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡレプリコン、または核酸分子の組合せは、脂質製剤中のＲＮＡレプリコン、または核酸分子の組合せが、水溶液中でヌクレアーゼ分解に対して耐性であるように、脂質製剤の脂質部分内に完全にカプセル化される。用語「完全にカプセル化された」とは、核酸－脂質粒子中の核酸（例えば、ＲＮＡレプリコン）が、血清、または遊離ＲＮＡを有意に分解するヌクレアーゼアッセイへの曝露後に有意に分解されないことを意味する。完全にカプセル化された場合、好ましくは粒子中の核酸の２５％未満が、通常は遊離核酸の１００％、より好ましくは粒子中の核酸の１０％未満、最も好ましくは５％未満が分解される処理において分解される。本明細書で使用される「完全にカプセル化された」とはまた、核酸－脂質粒子がｉｎ ｖｉｖｏ投与時にそれらの成分部分に急速に分解しないことを意味する。他の実施形態では、本明細書に記載される脂質製剤は、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に無毒性である。一部の実施形態では、核酸の組合せは、同じ脂質ナノ粒子内にカプセル化される。一部の実施形態では、核酸分子の組合せにおける各核酸分子は、個々の脂質ナノ粒子において独立してカプセル化される。
本開示の脂質製剤はまた、典型的には、約１：１～約１００：１、約１：１～約５０：１、約２：１～約４５：１、約３：１～約４０：１、約５：１～約３８：１、または約６：１～約４０：１、または約７：１～約３５：１、または約８：１～約３０：１、または約１０：１～約２５：１、または約８：１～約１２：１、または約１３：１～約１７：１、または約１８：１～約２４：１、または約２０：１～約３０：１の総脂質：ＲＮＡ比（質量／質量比）を有する。一部の好ましい実施形態では、総脂質：ＲＮＡ比（質量／質量比）は、約１０：１～約２５：１である。比は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値またはサブ値であり得る。
本開示の脂質製剤は、典型的には、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、または約１５０ｎｍの平均径を有し、実質的に非毒性である。直径は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値またはサブ値であり得る。加えて、核酸は、本開示の脂質ナノ粒子に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性である。
好ましい実施形態では、脂質製剤は、ＲＮＡレプリコン、または核酸分子の組合せ、カチオン性脂質（例えば、本明細書に記載される１つまたは複数のカチオン性脂質またはその塩）、リン脂質、および粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質（例えば、１つまたは複数のＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含む。脂質製剤はまた、コレステロールを含むことができる。用語「脂質コンジュゲート」とは、脂質粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を意味する。このような脂質コンジュゲートには、限定されないが、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、ジアルキルオキシプロピルにカップリングされたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールにカップリングされたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールにカップリングされたＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンにカップリングされたＰＥＧ、およびセラミドにコンジュゲートされたＰＥＧ、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミドオリゴマー、およびそれらの混合物が含まれる。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質に直接コンジュゲートされ得るか、またはリンカー部分を介して脂質に結合され得る。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含めて、ＰＥＧまたはＰＯＺを脂質にカップリングするのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、アミドまたはカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。ある特定の好ましい実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（すなわち、ＡＬＣ－０１５９）である。
本明細書で使用される用語「カチオン性脂質」とは、正の親水性頭部基；１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の疎水性（すなわち、無極性基を有する）脂肪酸または脂肪アルキル鎖；およびこれら２つのドメイン間のコネクターを有する両親媒性脂質およびその塩を指す。イオン化可能またはプロトン化可能なカチオン性脂質は、典型的には、そのｐＫａ未満のｐＨでプロトン化され（すなわち、正に荷電され）、ｐＫａを超えるｐＨで実質的に中性である。好ましいイオン化可能なカチオン性脂質は、典型的には約７．４である生理学的ｐＨよりも小さいｐＫａを有するものである。本開示のカチオン性脂質はまた、滴定可能なカチオン性脂質と呼ばれ得る。カチオン性脂質は、プロトン化可能な第三級アミン（例えば、ｐＨ－滴定可能）頭部基を有する「アミノ脂質」であり得る。いくつかのアミノ例示的アミノ脂質は、Ｃ１８アルキル鎖を含むことができ、各アルキル鎖は、独立して、０～３個（例えば、０、１、２、または３個）の二重結合；および頭部基とアルキル鎖の間のエーテル、エステル、またはケタール結合を有する。このようなカチオン性脂質には、限定されないが、（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカン酸塩（ＡＬＣ－０３１５としても公知である）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ－Ｄ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピルＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリドとしても知られる）リポフェクチン（商標）、ＤＯＴＡＰ（１，２－ビス（オレイルオキシ）－３（トリメチルアンモニオ）プロパン）、ＤＤＡＢ（臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、γ－ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＸＴＣ２、およびＣ２Ｋとしても公知である）、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ、ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ｙ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＭＣ２としても公知である）、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（ＭＣ３としても公知である）、（ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ）（１－Ｂ１１としても公知である）、およびコレステロール誘導体、例えば、ＤＣＣｈｏｌ（３ベータ－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノメタン）－カルバモイル）コレステロール）が含まれる。ある特定の好ましい実施形態では、カチオン性脂質は、（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカン酸塩）、すなわちＡＬＣ－０３１５である。
本明細書で使用される用語「アニオン性脂質」とは、生理学的ｐＨで負に荷電した脂質を指す。これらの脂質には、限定されないが、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオールホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、および中性脂質に接続した他のアニオン性修飾基が含まれる。
核酸－脂質製剤において、ＲＮＡレプリコン、または核酸分子の組合せは、製剤の脂質部分内に完全にカプセル化され得、それによって核酸をヌクレアーゼ分解から保護し得る。好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコン、または核酸分子の組合せを含む脂質製剤は、脂質製剤の脂質部分内に完全にカプセル化され、それによって核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。ある特定の例では、ＲＮＡレプリコン、または脂質製剤中の核酸分子の組合せは、３７℃で少なくとも２０、３０、４５、または６０分間、ヌクレアーゼに粒子を曝露した後、実質的に分解されない。ある特定の他の例では、脂質製剤中のＲＮＡレプリコン、または核酸分子の組合せは、製剤を血清中、３７℃で少なくとも３０、４５、もしくは６０分間、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間、インキュベートした後、実質的に分解されない。他の実施形態では、ＲＮＡレプリコン、または核酸分子の組合せは、製剤の脂質部分と複合体化される。
核酸の文脈では、完全なカプセル化は、核酸と会合した場合に、増強された蛍光を有する色素を用いる膜不透過性蛍光色素排除アッセイを実施することによって決定することができる。カプセル化は、色素を脂質製剤に添加し、得られた蛍光を測定し、少量の非イオン性界面活性剤を添加した際に観察される蛍光と比較することによって決定される。脂質層を界面活性剤を介して破壊すると、カプセル化された核酸が放出され、それが膜不透過性色素と相互作用することを可能にする。核酸カプセル化は、Ｅ＝（Ｉ０－Ｉ）／Ｉ０として計算することができ、ＩおよびＩ０は、界面活性剤の添加前後の蛍光強度を指す。
他の実施形態では、本開示は、複数の核酸－リポソーム、核酸－カチオン性リポソーム、または核酸－脂質ナノ粒子を含む核酸－脂質組成物を提供する。一部の実施形態では、核酸－脂質組成物は、複数のＲＮＡレプリコン－リポソームを含む。一部の実施形態では、核酸－脂質組成物は、複数のＲＮＡレプリコン－カチオン性リポソームを含む。一部の実施形態では、核酸－脂質組成物は、複数のＲＮＡレプリコン－脂質ナノ粒子を含む。
一部の実施形態では、脂質製剤は、製剤の脂質部分内に完全にカプセル化されたＲＮＡレプリコン、または核酸分子の組合せを含み、その結果、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約３０％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、約７０％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、または少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％（またはその任意の割合またはその範囲）の粒子が、その中にカプセル化されたＲＮＡレプリコンまたは核酸分子の組合せを有する。量は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値またはサブ値であり得る。
脂質製剤の意図された用途に応じて、成分の割合を変化させることができ、特定の製剤の送達効率を当該技術分野において公知であるアッセイを用いて測定することができる。
一部の実施形態によれば、本明細書に記載される発現可能なポリヌクレオチドおよびＲＮＡレプリコンは、脂質製剤化される。脂質製剤は、好ましくは、限定されないが、リポソーム、カチオン性リポソーム、および脂質ナノ粒子から選択される。好ましい一実施形態では、脂質製剤は、以下：
（ａ）本開示のＲＮＡレプリコンまたは核酸分子の組合せ、
（ｂ）カチオン性脂質、
（ｃ）凝集還元剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質またはＰＥＧ修飾脂質など）、
（ｄ）必要に応じて非カチオン性脂質（例えば中性脂質）、および
（ｅ）必要に応じて、ステロール
を含むカチオン性リポソームまたは脂質ナノ粒子である。
好ましくは、ＲＮＡレプリコンまたは核酸分子の組合せをカプセル化する脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質と、アニオン性脂質、双性イオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーをコンジュゲートした脂質、リン脂質、糖脂質、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの他の脂質とを含む。
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質である。一実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）少なくとも１つのカチオン性脂質；（ｉｉ）ヘルパー脂質；（ｉｉｉ）ステロール（例えば、コレステロール）；および（ｉｖ）約３０％～約６０％のイオン化可能なカチオン性脂質：約５％～約２０％のヘルパー脂質：約３５％～約５０％のステロール：約０．５～５％のＰＥＧ－脂質のモル比でのＰＥＧ－脂質からなる。例示的なカチオン性脂質（イオン化可能なカチオン性脂質を含む）、ヘルパー脂質（例えば、中性脂質）、ステロール、およびリガンド含有脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質）は、本明細書において以下に記載される。
特定の脂質およびそれらの相対的％の組成物の選択は、所望の治療効果、意図されたｉｎ ｖｉｖｏ送達標的、ならびに計画された投薬レジメンおよび頻度を含むいくつかの因子に依存する。一般的に、高い効力（すなわち、ノックダウン活性または翻訳効率などの治療効果）と迅速な組織クリアランスをもたらす生分解性の両方に対応する脂質が最も好ましい。しかしながら、対象内で１回または２回の投与のみを意図した製剤では、生分解性はそれほど重要ではない場合がある。加えて、脂質組成物は、脂質製剤が、ｉｎ ｖｉｖｏ投与中および意図された標的へのその旅行中にその形態を保存するが、次に、標的細胞への取り込み時に活性剤を放出することができるように、注意深い操作必要とすることがある。従って、脂質の最良のモル比、ならびに総脂質対活性成分の比において脂質の最良の可能な組合せを見出すために、典型的には、いくつかの製剤を評価する必要がある。
適切な脂質成分および脂質ナノ粒子の製造方法は当該技術分野で周知であり、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２３４４２、米国特許第８，０５８，０６９号、米国特許第８，８２２，６６８号、米国特許第９，７３８，５９３号、米国特許第９，１３９，５５４号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６６２４２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３０２１８、ＰＣＴ／２０１７／０１５８８６、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６７７５６に記載され、これらの内容は参照により組み込まれる。
カチオン性脂質
脂質製剤は、好ましくは、カチオン性リポソームまたは脂質ナノ粒子を形成するのに適したカチオン性脂質を含む。陽イオン性脂質は負電荷を帯びた膜に結合し、取り込みを誘導することができるため、核酸送達のために広く研究されている。一般的に、カチオン性脂質は、正の親水性頭部基、２つ（またはそれ以上）の親油性尾部、またはステロイド部分、およびこれら２つのドメイン間のコネクターを含む両親媒性である。好ましくは、カチオン性脂質は、生理学的ｐＨ付近で正味の正電荷を有する。カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴ、およびｓｉＲＮＡ／小ヘアピンＲＮＡ－ｓｈＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドのために、伝統的に最も一般的に使用されている非ウイルスデリバリーシステムである。ＤＯＴＡＰ、（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン）およびＤＯＴＭＡ（Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムメチル硫酸塩）などのカチオン性脂質は、静電相互作用により、負に荷電した核酸と錯体またはリポプレックスを形成することができ、高いｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率を提供する。
現在開示されている脂質製剤において、カチオン性脂質は、例えば、（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカン酸塩）（ＡＬＣ－０３１５としても公知である）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）（Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリドおよび１，２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩としても公知である）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－ｙ－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（γ－ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイロキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタン酸塩（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｃ１２－２００）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル ４－（ジメチルアミノ）ブタン酸塩（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ）、３－（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＭＣ３エーテル）、４－（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルブタン－１－アミン（ＭＣ４エーテル）、またはそれらの任意の組合せであり得る。他のカチオン性脂質には、限定されないが、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３Ｐ－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｉ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、および２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＸＴＣ）が含まれる。加えて、カチオン性脂質の市販の調製物、例えば、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む）、およびリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む）を使用することができる。
他の適切なカチオン性脂質は、国際公開第０９／０８６５５８号、国際公開第０９／１２７０６０号、国際公開第１０／０４８５３６号、国際公開第１０／０５４４０６号、国際公開第１０／０８８５３７号、国際公開第１０／１２９７０９号、および国際公開第２０１１／１５３４９３号；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号、第２０１２／０１２８７６０号、および第２０１２／００２７８０３号；米国特許第８，１５８，６０１号；ならびにLove et al., PNAS, 107(5), 1864-69, 2010に開示され、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
他の適切なカチオン性脂質は、代替脂肪酸基を有するもの、およびアルキル置換基が異なるもの（例えば、Ｎ－エチルＮ－メチルアミノ－およびＮ－プロピル－Ｎ－エチルアミノ－）を含む他のジアルキルアミノ基を含む。これらの脂質は、アミノ脂質と呼ばれるカチオン性脂質のサブカテゴリーの一部である。本明細書に記載される脂質製剤の一部の実施形態では、カチオン性脂質はアミノ脂質である。一般的に、少ない飽和アシル鎖を有するアミノ脂質は、特にフィルター滅菌の目的のために複合体が約０．３ミクロン未満でなければならない場合には、より容易にサイズ決定される。Ｃ１４～Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を有する不飽和脂肪酸を含有するアミノ酸脂質を使用することができる。アミノ基、およびアミノ脂質の脂肪酸または脂肪アルキル部分を分離するために、他の足場を使用することもできる。
一部の実施形態では、脂質製剤は、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４０６６に従って、式Ｉを有するカチオン性脂質を含む。この文脈において、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４０６６の開示もまた参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本開示のアミノまたはカチオン性脂質は、イオン化可能であり、少なくとも１つのプロトン化可能または脱プロトン可能な基を有し、その結果、脂質は、あるｐＨで、または生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）未満で正に荷電され、第２のｐＨで中性であり、好ましくは生理学的ｐＨまたはそれ以上である。当然に、ｐＨの関数としてのプロトンの付加または除去は平衡過程であり、荷電または中性脂質への言及は、優勢な種の性質を指し、すべての脂質が荷電または中性形態で存在することを必要としないことが理解される。１を超えるプロトン化可能な基もしくは脱プロトン化可能な基を有するか、または双性イオン性である脂質は、開示において使用から除外されない。ある特定の実施形態では、プロトン化可能な脂質は、約４～約１１のプロトン化可能な基のｐＫａを有する。一部の実施形態では、イオン化可能なカチオン性脂質は、約５～約７のｐＫａを有する。一部の実施形態では、イオン化可能なカチオン性脂質のｐＫａは、約６～約７である。
一部の実施形態では、脂質製剤は、式Ｉ：
〔式中、
Ｒ５およびＲ６は各々独立して、直鎖もしくは分枝Ｃ１－Ｃ３１アルキル、Ｃ２－Ｃ３１アルケニルまたはＣ２－Ｃ３１アルキニルおよびコレステリルからなる群から選択され；Ｌ５およびＬ６は各々独立して、直鎖Ｃ１－Ｃ２０アルキルおよびＣ２－Ｃ２０アルケニルからなる群から選択され；Ｘ５は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であって、それによって－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ６が形成されるか、またはＸ５は－ＯＣ（Ｏ）－であって、それによって－ＯＣ（Ｏ）－Ｒ６が形成され；Ｘ６は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、それによって－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ５が形成されるか、またはＸ６は－ＯＣ（Ｏ）－であり、それによって－ＯＣ（Ｏ）－Ｒ５が形成され；Ｘ７はＳまたはＯであり；Ｌ７は存在しないかまたは低級アルキルであり；Ｒ４は直鎖または分枝Ｃ１－Ｃ６アルキルであり；Ｒ７およびＲ８は各々独立して、水素および直鎖または分枝Ｃ１－Ｃ６アルキルからなる群から独立して選択される〕
のイオン化可能なカチオン性脂質、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む。
一部の実施形態では、Ｘ７はＳである。
一部の実施形態では、Ｘ５は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、それによって－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ６が形成され、Ｘ６は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、それによって－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ５が形成される。
一部の実施形態では、Ｒ７およびＲ８は、各々独立して、メチル、エチルおよびイソプロピルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、Ｌ５およびＬ６は、各々独立してＣ１－Ｃ１０アルキルである。一部の実施形態では、Ｌ５はＣ１－Ｃ３アルキルであり、Ｌ６はＣ１－Ｃ５アルキルである。一部の実施形態では、Ｌ６はＣ１－Ｃ２アルキルである。一部の実施形態では、Ｌ５およびＬ６は、各々、直鎖Ｃ７アルキルである。一部の実施形態では、Ｌ５およびＬ６は、各々、直鎖Ｃ９アルキルである。
一部の実施形態では、Ｒ５およびＲ６は、各々独立して、アルケニルである。一部の実施形態では、Ｒ６は、アルケニルである。一部の実施形態では、Ｒ６は、Ｃ２－Ｃ９アルケニルである。一部の実施形態では、アルケニルは、単一の二重結合を含む。一部の実施形態では、Ｒ５およびＲ６は、各々、アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ５は、分枝アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ５およびＲ６は、各々独立して、Ｃ９アルキル、Ｃ９アルケニル、およびＣ９アルキニルからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｒ５およびＲ６は、各々独立して、Ｃ１１アルキル、Ｃ１１アルケニル、およびＣ１１アルキニルからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｒ５およびＲ６は、各々独立して、Ｃ７アルキル、Ｃ７アルケニル、およびＣ７アルキニルからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｒ５は、－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）２または－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）（（ＣＨ２）ｐ－１ＣＨ３）であり、ｐは４～８である。一部の実施形態では、ｐは５であり、Ｌ５はＣ１－Ｃ３アルキルである。一部の実施形態では、ｐは６であり、Ｌ５はＣ３アルキルである。一部の実施形態では、ｐは７である。一部の実施形態では、ｐは８であり、Ｌ５はＣ１－Ｃ３アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ５は、－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）（（ＣＨ２）ｐ－１ＣＨ３）からなり、ｐは７または８である。
一部の実施形態では、Ｒ４はエチレンまたはプロピレンである。一部の実施形態では、Ｒ４はｎ－プロピレンまたはイソブチレンである。
一部の実施形態では、Ｌ７は存在せず、Ｒ４はエチレンであり、Ｘ７はＳであり、Ｒ７およびＲ８は各々、メチルである。一部の実施形態では、Ｌ７は存在せず、Ｒ４はｎ－プロピレンであり、Ｘ７はＳであり、Ｒ７およびＲ８は各々、メチルである。一部の実施形態では、Ｌ７は存在せず、Ｒ４はエチレンであり、Ｘ７はＳであり、Ｒ７およびＲ８は各々、エチルである。
一部の実施形態では、Ｘ７はＳであり、Ｘ５は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、それによって－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ６が形成され、Ｘ６は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、それによって－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ５が形成され、Ｌ５およびＬ６は各々独立して、直鎖Ｃ３－Ｃ７アルキルであり、Ｌ７は存在せず、Ｒ５は－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）２であり、Ｒ６はＣ７－Ｃ１２アルケニルである。一部のさらなる実施形態では、ｐは６であり、Ｒ６はＣ９アルケニルである。
一部の実施形態では、脂質製剤は、以下からなる群から選択されるイオン化可能なカチオン性脂質を含む。
一部の実施形態では、本明細書に列挙された任意の１種または複数の脂質は、明示的に除外され得る。
ヘルパー脂質およびステロール
本開示のＲＮＡレプリコン－脂質製剤は、中性脂質、中性ヘルパー脂質、非カチオン性脂質、非カチオン性ヘルパー脂質、アニオン性脂質、アニオン性ヘルパー脂質、または双性イオン性脂質と呼ばれ得るヘルパー脂質を含むことができる。脂質製剤、特にカチオン性リポソームおよび脂質ナノ粒子は、ヘルパー脂質が製剤にが存在する場合、細胞取り込みを増加させることが見出されている（Curr. Drug Metab. 2014; 15(9):882-92）。例えば、一部の研究では、中性および双性イオン性脂質、例えば、１、２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジ－オレオイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）および１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）は、カチオン性脂質よりも融合性（すなわち融合を促進する）であり、脂質－核酸複合体の多形特性に影響を及ぼし、ラメラから六方相への移行を促進し、したがって、融合および細胞膜の破壊を誘導し得ることが示されている（Nanomedicine (Lond). 2014 Jan; 9(1):105-20）。加えて、ヘルパー脂質の使用は、毒性および免疫原性などの多くの一般的なカチオン性脂質を使用することから潜在的な有害作用を低減するのに役立つ。
本開示の脂質製剤に適した非カチオン性脂質の非限定的な例としては、リン脂質、例えば、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルリン酸、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルロレイオール－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン ４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸塩（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチルホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、およびそれらの混合物が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質もまた使用することができる。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０－Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルから誘導されるアシル基である。
非カチオン性脂質の追加の例としては、ステロール、例えば、コレステロールおよびその誘導体が挙げられる。ある研究では、ヘルパー脂質として、コレステロールは、核酸と接触する脂質層の電荷の間隔を増加させ、電荷分布を核酸よりも密接に一致させると結論付けられた（J. R. Soc. Interface. 2012 Mar 7; 9(68): 548-561）。コレステロール誘導体の非限定的な例には、極性類似体、例えば、５α－コレスタノール、５α－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、および６－ケトコレスタノール；非極性類似体、例えば、５α－コレスタン、コレステノン、５α－コレスタノン、５α－コレスタノン、およびコレステリルデカン酸塩；ならびにそれらの混合物が挙げられる。好ましい実施形態では、コレステロール誘導体は、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルなどの極性類似体である。
一部の実施形態では、脂質製剤に存在するヘルパー脂質は、１種または複数のリン脂質およびコレステロールまたはその誘導体の混合物を含むかまたはそれらからなる。他の実施形態では、脂質製剤に存在するヘルパー脂質は、１つまたは複数のリン脂質、例えば、コレステロール不含脂質製剤を含むかまたはそれからなる。さらに他の実施形態では、脂質製剤に存在するヘルパー脂質は、コレステロールまたはその誘導体、例えば、リン脂質不含脂質製剤を含むかまたはそれからなる。
ヘルパー脂質の他の例としては、非リン含有脂質、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミチン酸塩、グリセロールリシノール酸塩、ヘキサデシルステアリン酸塩、イソプロピルミリスチン酸塩、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン－ラウリル硫酸塩、アルキル－アリール硫酸ポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム、セラミド、およびスフィンゴミエリンが挙げられる。
一部の実施形態では、ヘルパー脂質は、脂質製剤に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％～約５８ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％～約５６ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約５４ｍｏｌ％、約３６ｍｏｌ％～約５２ｍｏｌ％、約３７ｍｏｌ％～約５１ｍｏｌ％、約３８ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、または約３９ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％、約４１ｍｏｌ％、約４２ｍｏｌ％、約４３ｍｏｌ％、約４４ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％、約４６ｍｏｌ％、約４７ｍｏｌ％、約４８ｍｏｌ％、もしくは約４９ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその範囲）を構成する。
一部の実施形態では、製剤中のヘルパー脂質の全体は、２種以上のヘルパー脂質を含み、ヘルパー脂質の総量は、脂質製剤に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％～約５８ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％～約５６ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約５４ｍｏｌ％、約３６ｍｏｌ％～約５２ｍｏｌ％、約３７ｍｏｌ％～約５１ｍｏｌ％、約３８ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、または約３９ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％、約４１ｍｏｌ％、約４２ｍｏｌ％、約４３ｍｏｌ％、約４４ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％、約４６ｍｏｌ％、約４７ｍｏｌ％、約４８ｍｏｌ％、もしくは約４９ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその範囲）を構成する。一部の実施形態では、ヘルパー脂質は、ＤＳＰＣおよびＤＯＴＡＰの組合せである。一部の実施形態では、ヘルパー脂質は、ＤＳＰＣおよびＤＯＴＭＡの組合せである。
脂質製剤中のコレステロールまたはコレステロール誘導体は、脂質製剤に存在する総脂質の最大約５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％、または約５０ｍｏｌ％を構成することができる。一部の実施形態では、コレステロールまたはコレステロール誘導体は、脂質製剤に存在する総脂質の約１５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％、約３６ｍｏｌ％、約３７ｍｏｌ％、約３８ｍｏｌ％、約３９ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％、約４１ｍｏｌ％、約４２ｍｏｌ％、約４３ｍｏｌ％、約４４ｍｏｌ％、もしくは約４５ｍｏｌ％を構成する。
脂質製剤に存在するヘルパー脂質のパーセンテージは標的量であり、製剤に存在するヘルパー脂質の実際の量は、例えば、±５ｍｏｌ％で変動し得る。
カチオン性脂質化合物またはイオン化可能なカチオン性脂質化合物を含有する脂質製剤は、モルベースで、約３０～６０％のカチオン性脂質化合物、約３５～５０％のコレステロール、約５～２０％のヘルパー脂質、および約０．５～５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質であり得、パーセントは製剤に存在する総脂質のうちのものである。一部の実施形態では、組成物は、約４０～５０％のカチオン性脂質化合物、約３５～４５％のコレステロール、約５～１５％のヘルパー脂質、および約０．５～３％のＰＥＧ－脂質であり、パーセントは製剤に存在する総脂質のうちのものである。
脂質コンジュゲート
本明細書に記載される脂質製剤は、脂質コンジュゲートをさらに含むことができる。コンジュゲート化された脂質は、粒子の凝集を防止するのに有用である。適切なコンジュゲート脂質には、限定されないが、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、カチオン－ポリマー－脂質コンジュゲート、およびそれらの混合物が含まれる。さらに、脂質送達ビヒクルは、リガンド（例えば、抗体、ペプチド、および炭水化物）をその表面に、または付着したＰＥＧ鎖の末端に付着させることによって、特異的標的化に使用することができる（Front. Pharmacol. 2015 Dec 1; 6:286）。
好ましい実施形態では、脂質コンジュゲートはＰＥＧ－脂質である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を被覆または表面リガンドとして脂質製剤に包含することは、ＰＥＧ化と呼ばれる技術であり、ナノ粒子を免疫系から保護し、ＲＥＳ取り込みから逃れるのを助ける（Nanomedicine (Lond). 2011 Jun; 6(4):715-28）。ＰＥＧ化は、物理的、化学的、および生物学的メカニズムを介して脂質製剤およびそれらのペイロードを安定化するために広く使用されている。界面活性剤様ＰＥＧ脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）は、脂質製剤に入り、水和層および立体障壁を表面上に形成することができる。ＰＥＧ化の程度に基づいて、表面層は、一般的に、２つのタイプであるブラシ様層とキノコ様層に分けることができる。ＰＥＧ－ＤＳＰＥ安定化製剤について、ＰＥＧは、低程度のＰＥＧ化（通常、５ｍｏｌ％未満）でキノコ構造をとり、ＰＥＧ－ＤＳＰＥの含有量があるレベルを超えて増加するにつれてブラシ構造にシフトする（J. Nanomaterials. 2011;2011:12）。ＰＥＧ化の増加は脂質製剤の循環半減期の有意な増加をもたらすことが示されている（Annu. Rev. Biomed. Eng. 2011 Aug 15; 13:507-30; J. Control Release. 2010 Aug 3; 145(3):178-81）。
ＰＥＧ－脂質の適切な例としては、限定されないが、ジアルキルオキシプロピルにカップリングされたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＡ）、ジアシルグリセロールにカップリングされたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質にカップリングされたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＰＥ）、セラミドにコンジュゲートされたＰＥＧ、コレステロールまたはその誘導体にコンジュゲートされたＰＥＧ、およびそれらの混合物が挙げられる。
ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンＰＥＧ反復単位の直線の水溶性ポリマーである。ＰＥＧはそれらの分子量によって分類され、以下：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ－ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール－コハク酸塩（ＭｅＰＥＧ－Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール－スクシンイミジルコハク酸塩（ＭｅＰＥＧ－Ｓ－ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール－アミン（ＭｅＰＥＧ－ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール－トレシル酸塩（ＭｅＰＥＧ－ＴＲＥＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール－イミダゾリルカルボニル（ＭｅＰＥＧ－ＩＭ）、および末端メトキシ基の代わりに末端ヒドロキシ基を含有する化合物（例えば、ＨＯ－ＰＥＧ－Ｓ、ＨＯ－ＰＥＧ－Ｓ－ＮＨＳ、ＨＯ－ＰＥＧ－ＮＨＯ２）が含まれる。
本明細書に記載されるＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分は、約５５０ダルトン～約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を含み得る。ある特定の例では、ＰＥＧ部分は、約７５０ダルトン～約５，０００ダルトンまで（例えば、約１，０００ダルトン～約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約２，０００ダルトン）の平均分子量を有する。好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分は、約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。平均分子量は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値またはサブ値であり得る。
ある特定の例では、ＰＥＧモノマーは、必要に応じて、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、またはアリール基によって置換され得る。ＰＥＧは、脂質に直接コンジュゲートされ得るか、またはリンカー部分を介して脂質に連結され得る。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分などの、ＰＥＧを脂質にカップリングするのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。好ましい実施形態では、リンカー部分は、非エステル含有リンカー部分である。適切な非エステル含有リンカー部分には、限定されないが、アミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、アミノ（－ＮＲ－）、カルボニル（－Ｃ（Ｏ）－）、カルバメート（－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－）、尿素（－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－）、ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）、エーテル（－Ｏ－）、スクシニル（－（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－）、スクシンアミジル（－ＮＨＣ（Ｏ））ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、エーテル、およびそれらの組合せ（例えば、カルバメートリンカー部分とアミドリンカー部分の両方を含有するリンカー）が含まれる。好ましい実施形態では、カルバメートリンカーを使用して、ＰＥＧを脂質にカップリングさせる。
他の実施形態では、エステル含有リンカー部分を使用して、ＰＥＧを脂質にカップリングさせる。適切なエステル含有リンカー部分は、例えば、炭酸塩（－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－）、スクシノイル、リン酸塩（－Ｏ－（Ｏ）ＰＯＨ－Ｏ－）、スルホン酸塩、およびそれらの組合せを含む。
種々の鎖長および飽和度の種々のアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンをＰＥＧにコンジュゲートさせて、脂質コンジュゲートを形成することができる。このようなホスファチジルエタノールアミンは市販されているか、または当業者に公知である従来の技術を用いて単離もしくは合成することができる。Ｃ１０～Ｃ２０の範囲の炭素鎖長を有する飽和または不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンが好ましい。モノまたはジ不飽和脂肪酸、および飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の混合物を有するホスファチジルエタノールアミンもまた使用することができる。適切なホスファチジルエタノールアミンには、限定されないが、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が含まれる。
一部の実施形態では、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）コンジュゲート、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）コンジュゲートである。これらの実施形態では、ＰＥＧは、好ましくは、約７５０～約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。特定の実施形態では、ＰＥＧの末端ヒドロキシル基は、メチル基で置換される。
上記に加えて、ＰＥＧの代わりに他の親水性ポリマーを使用することができる。ＰＥＧの代わりに使用することができる適切なポリマーの例としては、限定されないが、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピル、メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、およびポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが挙げられる。
一部の実施形態では、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ脂質）は、脂質製剤に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、または約１．４ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその範囲）を構成する。他の実施形態では、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ脂質）は、脂質製剤中に存在する総脂質の約０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、または５％（またはその任意の割合またはその範囲）を構成する。量は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値またはサブ値であり得る。
一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質はＰＥＧ５５０－ＰＥである。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質はＰＥＧ７５０－ＰＥである。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質はＰＥＧ２０００－ＤＭＧである。一部の好ましい実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９としても公知である）である。
本開示の脂質製剤に存在する脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－脂質）のパーセンテージは標的量であり、製剤に存在する脂質コンジュゲートの実際の量は、例えば、±０．５ｍｏｌ％で変動し得る。当業者は、脂質コンジュゲートの濃度が、採用される脂質コンジュゲート、および脂質製剤が融合性になる速度に依存して変化させることができることを理解する。
脂質製剤の細胞取り込みについての作用機序
核酸、特にリポソーム、カチオン性リポソーム、および脂質ナノ粒子の細胞内送達のための脂質製剤は、脂質送達ビヒクルの内容物が標的細胞のサイトゾルに送達される、標的細胞のエンドサイトーシス機構の利用を通して標的細胞に浸透することによって細胞取り込みのために設計される（Nucleic Acid Therapeutics, 28(3):146-157, 2018）。具体的には、本明細書に記載される肝細胞を標的とするＲＮＡレプリコン－脂質製剤の場合、ｍＲＮＡ－脂質製剤は、受容体媒介エンドサイトーシスを介して肝細胞に入る。エンドサイトーシスの前に、脂質送達ビヒクルの表面におけるＰＥＧ－脂質などの官能化リガンドが表面から放出され、標的細胞への取り込みを誘発する。エンドサイトーシス中に、細胞膜の一部がベクターを取り囲み、それを小胞に飲み込んで、次に細胞膜から切り離し、細胞質に入り、最終的にエンドソーム経路を経る。イオン化可能なカチオン性脂質含有送達ビヒクルについて、エンドソームの加齢に伴って酸性度が増加し、表面に強い正電荷を有するビヒクルをもたらす。次に、送達ビヒクルとエンドソーム膜の間の相互作用は、ペイロードの細胞質への送達をもたらす膜融合事象を生じされる。ＲＮＡペイロードについて、細胞自身の内部翻訳プロセスは、次に、ＲＮＡレプリコンまたは核酸分子の組合せを、コードされたタンパク質（例えば、ＨＢＶ抗原）に翻訳する。コードされたタンパク質はさらに、標的細胞小器官への輸送または細胞内の位置を含む翻訳後プロセシングを受けることができる。
脂質コンジュゲートの組成および濃度を制御することにより、脂質コンジュゲートが脂質製剤から交換される速度、次に、脂質製剤が融合性になる速度を制御することができる。加えて、例えば、ｐＨ、温度、またはイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質製剤が融合性になる速度を変化させ、および／または制御することができる。脂質製剤が融合性になる速度を制御するために使用することができる他の方法は、この開示を読むことで当業者に明らかになる。また、脂質コンジュゲートの組成および濃度を制御することによって、リポソームまたは脂質粒子サイズを制御することができる。
脂質製剤の製造
核酸、例えば、ＲＮＡレプリコンまたは核酸分子の組合せ、を含む脂質製剤の調製には多くの異なる方法がある（Curr. Drug Metabol. 2014, 15, 882-892; Chem. Phys. Lipids 2014, 177, 8-18; Int. J. Pharm. Stud. Res. 2012, 3, 14-20）。薄膜水和、二重エマルジョン、逆相蒸発、マイクロ流体調製、二重非対称遠心分離、エタノール注入、界面活性剤透析、エタノール希釈による自然発生小胞形成、および予め形成されたリポソームにおけるカプセル化の技術が、本明細書に簡単に記載される。
薄膜水和
薄膜水和（ＴＦＨ）またはバンガム法では、脂質を有機溶媒に溶解し、次に回転エバポレーターを用いて蒸発させ、薄い脂質層の形成をもたらす。装填されるべき化合物を含有する水性緩衝液による層水和後、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）が形成され、膜を通しての押出または出発ＭＬＶの超音波処理によって、小型または大型単層小胞（ＬＵＶおよびＳＵＶ）を生成するために、サイズを縮小させることができる。
二重エマルジョン
脂質製剤はまた、水／有機溶媒混合物中での脂質溶解を伴う二重エマルジョン技術によって調製することができる。水滴を含有する有機溶液を過剰の水性媒体と混合し、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）二重エマルジョン形成をもたらす。機械的に激しく振とうさせた後、水滴の一部が崩壊し、大きな単層小胞（ＬＵＶ）を生じる。
逆相蒸発
逆相蒸発（ＲＥＶ）法はまた、核酸を装填したＬＵＶを達成することを可能にする。この技術では、有機溶媒および水性緩衝液中でのリン脂質溶解により二相系を形成する。次に、得られた懸濁液を、混合物が透明な一相分散になるまで簡単に超音波処理する。脂質製剤は、減圧下で有機溶媒を蒸発させた後に達成される。この技術は、核酸を含む異なる大型および小型の親水性分子をカプセル化するために使用されている。
マイクロ流体調製
マイクロ流体法は、他のバルク法とは異なり、脂質水和プロセスを制御する可能性を与える。この方法は、流動が操作される方法に従って、連続流動マイクロ流体および液滴ベースマイクロ流体に分類することができる。連続流動モードで動作するマイクロ流体力学的フォーカシング（ＭＨＦ）法では、脂質は、２つの水性緩衝流の間のマイクロチャネル交差接合内で流体力学的にフォーカスされるイソプロピルアルコールに溶解される。小胞サイズは、流速をモジュレートすることによって制御することができ、それによって脂質溶液／緩衝液希釈プロセスを制御することができる。この方法は、３つの入口ポートおよび１つの出口ポートからなるマイクロ流体デバイスを使用することによって、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）脂質製剤を生産するために使用することができる。
二重非対称遠心分離
二重非対称遠心分離（ＤＡＣ）は、より一般的な遠心分離とは異なり、それ自身の垂直軸の周りにさらなる回転を使用する。通常の遠心分離機のように、試料を外側に押し出し、次に、追加の回転によりバイアルの中心に向かって押し出すという、２つの重なり合った動きに起因して、効率的な均質化が達成される。脂質とＮａＣｌ－溶液を混合することにより、粘稠な小胞性リン脂質ゲル（ＶＰＣ）を達成し、次にそれを希釈して脂質製剤分散体を得る。脂質製剤サイズは、ＤＡＣ速度、脂質濃度および均質化時間を最適化することによって調節することができる。
エタノール注入
エタノール注入（ＥＩ）法は、核酸カプセル化に用いることができる。この方法は、脂質が溶解されるエタノール溶液を、針を使用してカプセル化されるべき核酸を含有する水性媒体中に迅速に注入する。リン脂質が培地中に分散した場合、小胞が自然に形成される。
界面活性剤透析
界面活性剤透析法は、核酸をカプセル化するために使用することができる。簡単に説明すると、脂質およびプラスミドは、適切なイオン強度の界面活性剤溶液中で可溶化され、透析により界面活性剤を除去した後、安定化された脂質製剤が形成される。次に、カプセル化されていない核酸は、イオン交換クロマトグラフィーによって除去され、空の小胞は、スクロース密度勾配遠心分離によって除去される。この方法は、カチオン性脂質含量および透析緩衝液の塩濃度に非常に感受性であり、また、該方法はスケール化が困難である。
エタノール希釈による自然発生小胞形成
安定な脂質製剤はまた、エタノール希釈法による自然発生小胞形成によって生産することができ、段階的または滴下エタノール希釈は、エタノールに溶解した脂質を、核酸を含有する水性緩衝液を急速に混合するように制御しながら添加することにより、核酸が装填された小胞を瞬時に形成する。
予め形成されたリポソームへのカプセル化
核酸の封入はまた、予め形成されたリポソームから開始して、２つの異なる方法：（１）「リポプレックス」と呼ばれる静電複合体を与える核酸とカチオン性リポソームとの単純な混合であって、それらは、細胞培養物をトランスフェクトするために成功裏に使用され得るが、ｉｎ ｖｉｖｏでの低いカプセル化効率および不十分な性能により特徴付けられる混合；および（２）リポソーム不安定化であって、無水エタノールを、最大４０％ｖ／ｖの濃度でカチオン性小胞の懸濁液にゆっくり添加し、続いて、核酸を滴下して、装填された小胞を達成するリポソーム不安定化を通じて得ることができ；しかしながら、カプセル化を特徴とする２つの主要ステップは、感度が高すぎ、粒子を小型化しなければならない。
ある特定の実施形態では、脂質および脂質ナノ粒子、脂質を含む医薬組成物、脂質を作製する方法、または脂質および核酸分子を含む医薬組成物を製剤化する方法、ならびに疾患を処置または予防するために医薬組成物を使用する方法の例は、米国出願公開または国際出願公開、例えば、米国出願公開第２０１７／０１９０６６１号、米国出願公開第２００６／０００８９１０号、米国出願公開第２０１５／００６４２４２号、米国出願公開第２００５／００６４５９５号、国際公開第２０１９／０３６０３０号、米国出願公開第２０１９／００２２２４７号、国際公開第２０１９／０３６０２８号、国際公開第２０１９／０３６００８号、国際公開第２０１９／０３６０００号、米国出願公開第２０１６／０３７６２２４号、米国出願公開第２０１７／０１１９９０４号、国際公開第２０１８／２００９４３号、国際公開第２０１８／１９１６５７号、国際公開第２０１８／１１８１０２号、米国出願公開第２０１８／０１６９２６８号、国際公開第２０１８／１１８１０２号、国際公開第２０１８／１１９１６３号、米国出願公開第２０１４／０２５５４７２号、および米国出願公開第２０１３／０１９５９６８号に記載され、これらの各々の関連内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
プライム／ブースト免疫法
本出願の実施形態はまた、免疫原的に有効な量の医薬組成物または免疫原性組合せを対象に投与し、その後、いわゆるプライム－ブーストレジメンにおいて、同対象に免疫原的に有効な量の医薬組成物または免疫原性組合せを別の用量で投与することを意図する。したがって、ある実施形態では、本出願の医薬組成物または免疫原性組合せは、免疫応答をプライミングするために使用されるプライマーワクチンである。別の実施形態では、本出願の医薬組成物または免疫原性組成物は、免疫応答をブーストするために使用されるブースターワクチンである。本出願のプライミングワクチンおよびブースティングワクチンは、本明細書に記載される本出願の方法で使用することができる。プライム－ブーストレジメンのこの一般的概念は、ワクチン分野の当業者に周知である。本明細書に記載される本出願の医薬組成物および免疫原性組合せのいずれも、ＨＢＶに対する免疫応答をプライミングおよび／またはブースティングするためのプライミングワクチンおよび／またはブースティングワクチンとして用いることができる。好ましくは、対象をワクチン接種する方法は、本出願の核酸分子、核酸組合せ、ベクター、またはＲＮＡレプリコンを含む医薬組成物を対象に投与し、プライム－ブーストレジメンとして少なくとも１つの同一なＨＢＶ抗原をコードする核酸分子を含む第２の組成物を対象に投与するステップを含む。
本出願の一部の実施形態では、本出願の医薬組成物または免疫原性組合せを、プライミング免疫化のために投与することができる。医薬組成物または免疫原性組合せは、ブースティング免疫化のために再投与することができる。必要とする場合、医薬組成物またはワクチンの組合せのさらなるブースター投与を、必要に応じて、レジメンに追加することができる。アジュバントは、ブースティング免疫化のために使用される本出願の医薬組成物に存在することができ、別々の組成物に存在することができ、ブースティング免疫化のために本出願の医薬組成物または免疫原性組合せと一緒に投与されるか、またはブースティング免疫化として単独で投与される。アジュバントがレジメンに含まれるそれらの実施形態では、アジュバントは、好ましくは、ブースティング免疫化のために使用される。
プライム－ブーストレジメンの例示的であり、非限定的な例としては、免疫応答をプライミングするために、対象に、本出願の免疫原的に有効な量の医薬組成物または免疫原性組合せを単回用量で投与すること；その後、免疫応答をブーストするために、本出願の免疫原的に有効な量の医薬組成物または免疫原性組合せを別の用量で投与することを含み、ブースティング免疫化は、最初にプライミング免疫化が投与された後、約２～６週間、好ましくは４週間後に最初に投与される。必要に応じて、プライミング免疫化を最初に投与した後、約１０～１４週間、好ましくは１２週間、医薬組成物または免疫原性組合せのさらなるブースティング免疫化、または他のアジュバントを投与する。
プライミングおよびブースティング組成物中の抗原は、同一である必要はなく、抗原を共有するか、または互いに実質的に類似していなければならない。ある特定の実施形態では、ブースティング組成物のベクターは、プライミング組成物、例えば、アデノウイルスベクター、修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、ＤＮＡ、またはタンパク質とは異なる。本発明のプライミングおよびブースティング組成物は、各々、１回、２回、３回または複数回投与を含むことができる。
実施形態
実施形態１は、
５’末端から３’末端の順で、
（１）第１のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原をコードするポリヌクレオチド配列、
（２）第１の内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）エレメント、または第１の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および
第２のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
を含む、天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む核酸分子または核酸組合せであって、
第１および第２のＨＢＶ抗原のうちの少なくとも１つがＨＢＶ表面抗原である、核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１ａは、第１および第２のＨＢＶ抗原が、独立して、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）抗原、およびＨＢＶ表面抗原からなる群から選択される、実施形態１に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１ｂは、第１および第２のＨＢＶ抗原のうちの少なくとも１つが、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原またはＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原である、実施形態１または１ａに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態２は、第１または第２のＨＢＶ抗原のうちの１つが、ＨＢＶコア抗原またはＨＢＶ ｐｏｌ抗原である、実施形態１～１ｂのいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態３は、天然に存在しないポリヌクレオチド配列が、
５’末端から３’末端の順で、
（３）第２のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の３’末端に作動可能に連結された、第２のＩＲＥＳエレメント、または第２の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、ならびに
（４）第３のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
をさらに含む、実施形態１～２のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態３ａは、第３のＨＢＶ抗原が、独立して、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）抗原、およびＨＢＶ表面抗原からなる群から選択される、実施形態３に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態４は、天然に存在しないポリヌクレオチド配列が、
５’末端から３’末端の順で、
（５）第３のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の３’末端に作動可能に連結された、第３のＩＲＥＳエレメント、または第３の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および
（６）第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
をさらに含む、実施形態３または３ａに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態４ａは、第３のＨＢＶ抗原が、独立して、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）抗原、およびＨＢＶ表面抗原からなる群から選択される、実施形態４に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態４ｂは、
５’末端から３’末端の順で、
（１）第１のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原をコードするポリヌクレオチド配列、
（２）第１の内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）エレメント、または第１の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および
（３）第２のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
を含む、第１の天然に存在しないポリヌクレオチド配列、ならびに
５’末端から３’末端の順で、
（１）第３のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原をコードするポリヌクレオチド配列、
（２）第２の内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）エレメント、または第２の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および
（３）第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
を含む、第２の天然に存在しないポリヌクレオチド配列
を含む、実施形態１～２に記載の核酸分子または核酸組合せであって、
第１および第２の天然に存在しないポリヌクレオチド配列が、第３の内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）エレメント、もしくは第３の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって連結されているか、または別個の核酸分子中に存在し、
第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原が、それぞれ独立して、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）抗原、およびＨＢＶ表面抗原からなる群から選択され、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のうちの少なくとも１つが、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原から選択されるＨＢＶ表面抗原であり、好ましくは、第１、第２、第３または第４のＨＢＶ抗原のうちの１つが、ＨＢＶコアまたはＨＢＶ ｐｏｌ抗原である、
核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態５は、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれが互いに異なる、実施形態１から４ｂに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６は、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、第１のＨＢＶ ＰｒｅＳ１抗原；
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、第２のＨＢＶ ＰｒｅＳ１抗原；
（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２抗原；
（ｉｖ）配列番号７と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＢＶコア抗原；および
（ｖ）配列番号９と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＢＶポリメラーゼ抗原
からなる群から独立して選択される、実施形態１～５のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ａは、ＨＢＶコア抗原が、配列番号８６と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号８６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、実施形態６に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｂは、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれが、
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（２）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（３）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原；
（４）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＢＶコア抗原；および
（５）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原
からなる群から独立して選択される、実施形態６に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｂ１は、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれが、
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなる第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（２）配列番号３のアミノ酸配列からなる第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（３）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原；
（４）配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原；および
（５）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原
からなる群から独立して選択される、実施形態６ｂに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｂ２は、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれが、
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなる第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（２）配列番号３のアミノ酸配列からなる第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（３）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原；
（４）配列番号８４のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原；および
（５）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原
からなる群から独立して選択される、実施形態６ｂに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｂ３は、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれが、
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなる第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（２）配列番号３のアミノ酸配列からなる第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（３）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原；
（４）配列番号８５のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原；および
（５）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原
からなる群から独立して選択される、実施形態６ｂに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｂ４は、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれが、
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなる第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（２）配列番号３のアミノ酸配列からなる第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
（３）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原；
（４）配列番号７のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原；および
（５）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原
からなる群から独立して選択される、実施形態６ｂに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｃは、核酸分子が、第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原およびＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原のうちの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド配列、ならびにＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原のうちの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１から６ｂ４のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｃ１は、第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、ＨＢＶコア抗原ならびにＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれが、独立して、シグナルペプチドに作動可能に連結されており、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原が内部シグナルペプチドを含む、実施形態１～６ｃのいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｃ２は、シグナルペプチドが、シスタチンＳシグナルペプチド、Ｉｇ重鎖γシグナルペプチドＳＰＩｇＧ、Ｉｇ重鎖イプシロンシグナルペプチドＳＰＩｇＥ、またはコロナウイルスの短いリーダーペプチド配列である、実施形態６ｃ１に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｃ３は、シグナルペプチドが、配列番号７７のアミノ酸配列を含み、ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶ ｐｏｌ抗原のＮ末端に作動可能に連結されている、実施形態６ｃ２に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｄは、核酸分子が少なくとも１つのＩＲＥＳエレメントを含む、実施形態１から６ｃ３のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｄ１は、ＩＲＥＳエレメントが、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態６ｄに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｄ２は、ＩＲＥＳエレメントが、配列番号１３のポリヌクレオチド配列からなる、実施形態６ｄ１に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｄ３は、ＩＲＥＳエレメントが、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態６ｄに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｄ４は、ＩＲＥＳエレメントが、配列番号１４のポリヌクレオチド配列からなる、実施形態６ｄ３に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｅは、核酸分子が、自己プロテアーゼペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１から６ｄ４のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｅ１は、自己プロテアーゼペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施形態６ｅに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｅ２は、自己プロテアーゼペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列からなる、実施形態６ｅ１に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｅ３は、自己プロテアーゼペプチドが、配列番号１２の配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態６ｅに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態６ｅ４は、自己プロテアーゼペプチドが、配列番号１２の配列からなるポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態６ｅに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態７は、ＨＢＶコア抗原が、配列番号８４、８５、または８６のうちの少なくとも１つと少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号８４、８５、または８６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、実施形態６ｃ～６ｅ４のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態７ａは、ＨＢＶコア抗原が、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、実施形態７に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態７ｂは、ＨＢＶコア抗原が、配列番号８６のアミノ酸配列からなる、実施形態７ａに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態８は、ＨＢＶコア抗原の最後の５つのＣ末端アミノ酸が、ＶＶＲアミノ酸配列、より詳細には、ＶＶＲＲ（配列番号９１）アミノ酸配列、より詳細には、ＶＶＲＲＲ（配列番号９２）アミノ酸配列を含む、実施形態１～７ｂのいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９は、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原のうちの少なくとも１つが、
（ｉ）ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのうちの２つ以上の、好ましくはすべてのコンセンサス配列；ならびに／または
（ｉｉ）ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１、もしくはＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１の１つもしくは複数のエピトープ
を含む、実施形態１～８のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ａは、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原のうちの少なくとも１つが、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１エピトープ、およびＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のエピトープを含む、実施形態９に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ａ１は、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原のうちの少なくとも１つが、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープ、およびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のエピトープを含む、実施形態９または９ａに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ａ２は、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原のうちの少なくとも１つが、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１の１つまたは複数のエピトープを含む、実施形態９～９ａ１のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ａ３は、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原のそれぞれが、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１の１つまたは複数のエピトープを含む、実施形態９～９ａ２のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ａ４は、ＨＢＶ ｐｒｅＳ１、ＨＢＶ ｐｒｅＳ２．Ｓ、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原のそれぞれが、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１の１つまたは複数のエピトープを含む、実施形態９～９ａ３のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｂは、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原のそれぞれが、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのコンセンサス配列を含む、実施形態９～９ａ４のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｃは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原、ＨＢＶ ｐｒｅ－Ｓ１抗原、およびＨＢＶ ｐｒｅＳ２．Ｓ抗原のうちの少なくとも１つが、１つまたは複数のＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープを含む、実施形態９に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｃ１は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原、ＨＢＶ ｐｒｅ－Ｓ１抗原、およびＨＢＶ ｐｒｅＳ２．Ｓ抗原のそれぞれが、１つまたは複数のＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープを含む、実施形態９または９ｃに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｃ２は、ＨＢＶ ｐｒｅＳ２．Ｓ抗原が、１つまたは複数のＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープを含む、実施形態９～９ｃ１のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｄは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原およびＨＢＶコア抗原のうちの少なくとも１つが、１つまたは複数のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１エピトープを含む、実施形態９に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｄ１は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原およびＨＢＶコア抗原のそれぞれが、１つまたは複数のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１エピトープを含む、実施形態９ｄに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｅは、ＨＢＶ ｐｒｅＳ２．Ｓ抗原が、１つまたは複数のＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２エピトープを含む、実施形態９に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｆは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原およびＨＢＶコア抗原のうちの少なくとも１つが、１つまたは複数のＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１エピトープを含む、実施形態９に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｆ１は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原およびＨＢＶコア抗原のそれぞれが、１つまたは複数のＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１エピトープを含む、実施形態９ｆに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｇは、ＨＢＶコア抗原が、１つまたは複数のＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１エピトープを含む、実施形態９に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｈは、ＨＢＶコア抗原が、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１エピトープ、およびＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のエピトープを含む、実施形態９に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｉは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１エピトープ、およびＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のエピトープを含む、実施形態９に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｊは、ＨＢＶ ｐｒｅ－Ｓ１抗原が、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープおよびＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のエピトープを含む、実施形態９に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｋは、ＨＢＶ ｐｒｅＳ２．Ｓ抗原が、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープおよびＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のエピトープを含む、実施形態９に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態９ｌは、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原のそれぞれが、
（ｉ）ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのコンセンサス配列；および
（ｉｉ）ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０２０１、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２およびＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１の１つまたは複数のエピトープ
を含む、実施形態９に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１０は、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれが、
（ｉ）配列番号２と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有する第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号４と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有する第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）配列番号６と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｖ）配列番号８と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；および
（ｖ）配列番号１０と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号１０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
からなる群から独立して選択され、
好ましくは、第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、ＨＢＶコア抗原ならびにＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列が、独立して、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原が内部シグナルペプチドを含む、実施形態１～９ｌのいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１０ａは、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれが、
（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列を有する第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド配列を有する第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）配列番号６のヌクレオチド配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｖ）配列番号８９のヌクレオチド配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；および
（ｖ）配列番号１０のヌクレオチド配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
からなる群から独立して選択される、実施形態１０に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１０ｂは、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれが、
（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列からなる第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド配列からなる第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）配列番号６のヌクレオチド配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｖ）配列番号８７のヌクレオチド配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；および
（ｖ）配列番号１０のヌクレオチド配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
からなる群から独立して選択される、実施形態１０に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１０ｃは、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれが、
（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列からなる第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド配列からなる第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）配列番号６のヌクレオチド配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｖ）配列番号８８のヌクレオチド配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；および
（ｖ）配列番号１０のヌクレオチド配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
からなる群から独立して選択される、実施形態１０に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１０ｄは、第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれが、
（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列からなる第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド配列からなる第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）配列番号６のヌクレオチド配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｉｖ）配列番号８９のヌクレオチド配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；および
（ｖ）配列番号１０のヌクレオチド配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
からなる群から独立して選択される、実施形態１０に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１１は、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号８７、配列番号８８または配列番号８９と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号８７、配列番号８８または配列番号８９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む、好ましくはそれからなる、実施形態１０に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１１ａは、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号８７、配列番号８８または配列番号８９のうちのいずれか１つを含み、好ましくはそれからなる、実施形態１１に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１１ｂは、ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号８９からなる、実施形態１１または１１ａに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１１ｃは、第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、ＨＢＶコア抗原ならびにＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列が、独立して、シグナルペプチド、例えば、シスタチンＳシグナルペプチド、Ｉｇ重鎖γシグナルペプチドＳＰＩｇＧ、Ｉｇ重鎖イプシロンシグナルペプチドＳＰＩｇＥ、またはコロナウイルスの短いリーダーペプチド配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、実施形態１０から１１ｂのいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１１ｄは、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号９０のヌクレオチド配列を含む、実施形態１１ｃに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１２は、第１、第２および第３の自己プロテアーゼペプチドのそれぞれが、ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、トセアアシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、フラシェリーウイルス２ Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるペプチド配列を独立して含む、実施形態１～１１ｄのいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１２ａは、第１、第２および第３の自己プロテアーゼペプチドのそれぞれが、Ｐ２Ａのペプチド配列、例えば、配列番号１１のＰ２Ａ配列を含む、実施形態１２に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１３は、第１、第２および第３のＩＲＥＳのそれぞれが、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）またはエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）に由来する、実施形態１～１２ａのいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１３ａは、第１、第２および第３のＩＲＥＳのそれぞれが、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１３に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１４は、
５’末端から３’末端の順で、
（１）配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（３）配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（４）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（５）配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（６）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（７）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（８）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（９）配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１０）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１１）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１２）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１３）配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１４）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１５）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１６）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１７）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１８）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１９）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２０）配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２１）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２２）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２３）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；ならびに
（２４）配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
を有する、天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１～３ａのいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１４ａ１は、
５’末端から３’末端の順で、
（１）配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコアをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（５）配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（６）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（７）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（８）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（９）配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１０）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１２）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１３）配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１４）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１５）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１６）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１７）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１８）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１９）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２０）配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２２）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２３）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；ならびに
（２４）配列番号７、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
を有する、天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１４に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１４ａ２は、
５’末端から３’末端の順で、
（１）配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（３）配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（４）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列または配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（５）配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（６）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（７）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（８）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（９）配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１０）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１２）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１３）配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１４）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１５）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１６）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１または３のアミノ酸配列からなるＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１７）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１８）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（１９）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２０）配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２２）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
（２３）配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；および
（２４）配列番号８６のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
を有する、天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１４に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１４ａ３は、第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、ＨＢＶコア抗原ならびにＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列が、独立して、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、実施形態１４、１４ａ１または１４ａ２に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１４ａ４は、シグナルペプチドが、シスタチンＳシグナルペプチド、Ｉｇ重鎖γシグナルペプチドＳＰＩｇＧ、Ｉｇ重鎖イプシロンシグナルペプチドＳＰＩｇＥ、またはコロナウイルスの短いリーダーペプチド配列である、実施形態１４ａ３に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１４ａ５は、シグナルペプチドが、配列番号７７のアミノ酸配列を含む、実施形態１４ａ４に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１４ａ６は、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号９０のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１４ａ５に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１４ｂは、実施形態１４（３）から１４（２４）、１４ａ１（５）から１４ａ１（２４）または１４ａ２（３）から１４ａ２（２４）のいずれか一項に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１４から１４ａ６のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１４ｃは、配列番号２１から５４のうちのいずれか１つの天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１４ｂに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１４ｄは、実施形態１４（１）、１４（２）、１４ａ１（１）、１４ａ１（２）、１４ａ２（１）、および１４ａ２（２）からなる群から選択される天然に存在しないポリヌクレオチド配列のいずれか１つと組み合わされる、実施形態１４ｂまたは１４ｃに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１４ｅは、配列番号１５から２０からなる群から選択される天然に存在しないポリヌクレオチド配列のいずれか１つと組み合わされる、実施形態１４ｂまたは１４ｃに記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１５は、配列番号１５から５４のうちのいずれか１つの天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１４に記載の核酸分子または核酸組合せを含む。
実施形態１６は、実施形態１～１５のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せを含むベクターを含む。
実施形態１７は、ＤＮＡプラスミドである、実施形態１６に記載のベクターを含む。
実施形態１８は、ＤＮＡウイルスベクターである、実施形態１６に記載のベクターを含む。
実施形態１８ａは、ＲＮＡウイルスベクターである、実施形態１６に記載のベクターを含む。
実施形態１８ｂは、ＲＮＡレプリコンである、実施形態１８ａに記載のベクターを含む。
実施形態１８ｃは、改変ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara）（ＭＶＡ）ベクターまたはアデノウイルスベクターである、実施形態１６に記載のベクターを含む。
実施形態１８ｃ１は、ＭＶＡ－ＢＮベクターである、実施形態１８ｃに記載のベクターを含む。
実施形態１８ｃ２は、Ａｄ２６またはＡｄ３５ベクターである、実施形態１８ｃに記載のベクターを含む。
実施形態１９は、
５’末端から３’末端の順で、
（１）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質媒介増幅のために必要な５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）；
（２）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質のうちの少なくとも１つ、好ましくはすべてをコードするポリヌクレオチド配列；
（３）ＲＮＡウイルスのサブゲノムプロモーター；
（４）実施形態１～１５のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せ；および
（５）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質媒介増幅のために必要な３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）
を含む、ＲＮＡレプリコンを含む。
実施形態２０は、
５’末端から３’末端の順で、
（１）アルファウイルス５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、
（２）アルファウイルス非構造遺伝子ｎｓｐ１の５’複製配列、
（３）ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフ、
（４）第４の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
（５）アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチド配列、
（６）アルファウイルスサブゲノムプロモーター、
（７）実施形態１～１５のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せ、
（８）アルファウイルス３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、ならびに
（９）任意選択で、ポリアデノシン配列
を含む、ＲＮＡレプリコンを含む。
実施形態２１は、ＤＬＰモチーフが、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＴＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガッハウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウイルス（ＦＭＶ）、ヌドゥム（ＮＤＵＶ）、およびバギークリークウイルスからなる群から選択されるウイルス種に由来する、実施形態２０に記載のＲＮＡレプリコンを含む。
実施形態２２は、第４の自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、トセアアシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、フラシェリーウイルス２ Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態２１に記載のＲＮＡレプリコンを含む。
実施形態２２ａは、第４の自己プロテアーゼペプチドが、Ｐ２Ａのペプチド配列を含む、実施形態２２に記載のＲＮＡレプリコンを含む。
実施形態２２ｂは、第４の自己プロテアーゼペプチドが、配列番号１１のペプチド配列を含む、実施形態２２または２２ａに記載のＲＮＡレプリコンを含む。
実施形態２３は、
５’末端から３’末端の順で、
（１）配列番号５５のポリヌクレオチド配列を有する５’－ＵＴＲ、
（２）配列番号５６のポリヌクレオチド配列を有する５’複製配列、
（３）配列番号５７のポリヌクレオチド配列を含むＤＬＰモチーフ、
（４）配列番号１１のＰ２Ａ配列をコードするポリヌクレオチド配列、
（５）それぞれ配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１の核酸配列によってコードされる、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチド配列、
（６）配列番号６２のポリヌクレオチド配列を有するサブゲノムプロモーター、
（７）実施形態１～１５のいずれか一項に記載の核酸分子または核酸組合せ、ならびに
（８）配列番号６３のポリヌクレオチド配列を有する３’ＵＴＲ
を含む、ＲＮＡレプリコンを含む。
実施形態２４は、
（ｉ）Ｐ２Ａ配列をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号１２を含み、
（ｉｉ）アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチド配列が、それぞれ配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１の核酸配列を有し、
（ｉｉｉ）核酸分子または核酸組合せが、配列番号１５から５４のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含み、
（ｉｖ）ＲＮＡレプリコンが、ポリアデノシン配列をさらに含み、好ましくは、ポリアデノシン配列が、レプリコンの３’末端に配列番号６４の配列を有する、
実施形態２３に記載のＲＮＡレプリコンを含む。
実施形態２５は、配列番号６５から７２のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡレプリコンを含む。
実施形態２６は、実施形態１９～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、好ましくは、核酸が、ＤＮＡ配列の５’末端に作動可能に連結されたＴ７プロモーターをさらに含み、より好ましくは、Ｔ７プロモーターが配列番号７３のヌクレオチド配列を含む、核酸分子を含む。
実施形態２７は、実施形態１～１５および２６のいずれか一項に記載の核酸分子もしくは核酸組合せ、実施形態１６～１８ｃ２のいずれか一項に記載のベクター、または実施形態１９～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を含む。
実施形態２８は、薬学的に許容される担体が、１つまたは複数の脂質を含む、実施形態２７に記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ａは、１つまたは複数の脂質が、カチオン性脂質を含む、実施形態２８に記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ａ１は、カチオン性脂質が、イオン化可能なカチオン性脂質である、実施形態２８ａに記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ａ２は、カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５（（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルドデカノエート））、ＤＯＴＭＡ（Ｎ－Ｄ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピルスＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２－ビス（オレイルオキシ）－３（トリメチルアンモニオ）プロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシル－アンモニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、γ－ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ、ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ｙ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ、およびＤＣＣｈｏｌ（３β－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノメタン）－カルバモイル）コレステロール）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態２８ａに記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ａ３は、カチオン性脂質がＡＬＣ－０３１５である、実施形態２８ａ～２８ａ２のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ｂは、（ａ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質またはＰＥＧ修飾脂質、（ｂ）ヘルパー脂質、および（ｃ）ステロールのうちの１つまたは複数をさらに含む、実施形態２８ａ～２８ａ３のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ｂ１は、ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質が、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９）、ＰＥＧ５５０－ＰＥ、ＰＥＧ７５０－ＰＥ、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、ＰＥＧ－ＤＡＡ、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ＰＥ、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ－ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール－サクシネート（ＭｅＰＥＧ－Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール－サクシニミジルサクシネート（ＭｅＰＥＧ－Ｓ－ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール－アミン（ＭｅＰＥＧ－ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール－トレシレート（ＭｅＰＥＧ－ＴＲＥＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール－イミダゾリル－カルボニル（ＭｅＰＥＧ－ＩＭ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態２８ｂに記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ｂ２は、ＰＥＧ脂質がＡＬＣ－０１５９である、実施形態２８ｂまたは２８ｂ１に記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ｃは、ヘルパー脂質が、中性脂質、中性ヘルパー脂質、非カチオン性脂質、非カチオン性ヘルパー脂質、アニオン性脂質、アニオン性ヘルパー脂質、または双性イオン性脂質、またはそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態２８ｂ～２８ｂ２のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ｃ１は、ヘルパー脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイル－ホスファジチルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファジチルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態２８ｃに記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ｃ２は、ヘルパー脂質がジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である、実施形態２８ｃまたは２８ｃ１に記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ｄは、ステロールが、コレステロール、５α－コレスタノール、５α－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、６－ケトコレスタノール、５α－コレスタン、コレステノン、５α－コレスタノン、５α－コレスタノン、デカン酸コレステリル、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態２８ｂ～２８ｃ２のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ｄ１は、ステロールがコレステロールである、実施形態２８ｄに記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ｅは、１つまたは複数の脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、およびコレステロールを含む、実施形態２８～２８ｄ１のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む。
実施形態２８ｆは、薬学的に許容される担体が、脂質ナノ粒子を含む、実施形態２８～２８ｅのいずれか一項に記載の医薬組成物を含む。
実施形態２９は、
（１）配列番号８４、８５もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列もしくは配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；または
（２）配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列もしくは配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列
をさらに含む、実施形態２７～２８ｆのいずれか一項に記載の医薬組成物を含む。
実施形態３０は、対象にＨＢＶに対するワクチン接種を行うための方法であって、実施形態２７～２８ｆのいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、好ましくは、対象が慢性ＨＢＶ感染を有する、方法を含む。
実施形態３０ａは、対象にＨＢＶに対するワクチン接種を行うことに使用するための、実施形態２７～２８ｆのいずれか一項に記載の医薬組成物であって、好ましくは、対象が慢性ＨＢＶ感染を有する、医薬組成物を含む。
実施形態３０ｂは、プライムブーストレジメンに使用するための、同一な少なくとも１つのＨＢＶエピトープ、例えば、同一な少なくとも１つのＨＬＡエピトープ、好ましくは同一な少なくとも１つの抗原をコードする核酸分子を含む第２の組成物をさらに含む、実施形態３０ａに記載の使用のための医薬組成物を含む。
実施形態３０ｃは、ＨＢＶ感染症の処置における使用のための、実施形態２７～２８ｆのいずれか一項に記載の医薬組成物を含む。
実施形態３１は、プライムブーストレジメンにおいて、同一な少なくとも１つのＨＢＶエピトープ、例えば、同一な少なくとも１つのＨＬＡエピトープ、好ましくは同一な少なくとも１つの抗原をコードする核酸分子を含む第２の組成物を対象に投与するステップをさらに含む、実施形態３０に記載の方法を含む。
実施形態３２は、プライムブーストレジメンが、実施形態１９～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンを含む第１の組成物、およびＲＮＡレプリコンではないが、プライミング組成物と同一な少なくとも１つのＨＢＶエピトープ、例えば、同一な少なくとも１つのＨＬＡエピトープ、好ましくは同一な少なくとも１つの抗原をコードするベクターを含む第２の組成物を含む、実施形態３１に記載の方法を含む。
実施形態３２ａは、プライムブーストレジメンにおいて、第１の組成物がプライミング免疫化のために使用され、第２の組成物がブースティング免疫化のために使用される、実施形態３２に記載の方法を含む。
実施形態３２ｂは、プライムブーストレジメンにおいて、第２の組成物がプライミング免疫化のために使用され、第１の組成物がブースティング免疫化のために使用される、実施形態３２に記載の方法を含む。
実施形態３３は、第２の組成物が、改変ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara）（ＭＶＡ）ベクター、アデノウイルスベクター、またはプラスミドを含む、実施形態３２～３２ｂのいずれか一項に記載の方法を含む。
実施形態３３ａは、第２の組成物がＭＶＡ－ＢＮベクターを含む、実施形態３３に記載の方法を含む。
実施形態３３ｂは、第２の組成物が、Ａｄ２６またはＡｄ３５ベクターを含む、実施形態３３に記載の方法を含む。
実施形態３４は、対象においてＨＢＶの感染および／または複製を低減させるための方法であって、実施形態２７～２８ｆのいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与するステップ、または実施形態３０もしくは３１～３３ｂのいずれか一項に記載の方法に従って対象にワクチン接種を行うステップを含む、方法を含む。
実施形態３４ａは、対象が、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１の対象、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２の対象、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の対象、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２の対象、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１の対象およびＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１の対象からなる群から選択される、実施形態３０または３１～３４のいずれか一項に記載の方法を含む。
実施形態３４ａ１は、対象が、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１の対象、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２の対象、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の対象およびＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２の対象からなる群から選択される、実施形態３４ａに記載の方法を含む。
実施形態３４ａ２は、対象が、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１の対象、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２の対象およびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の対象からなる群から選択される、実施形態３４ａまたは３４ａ１に記載の方法を含む。
実施形態３４ａ３は、対象がＨＬＡ－Ａ＊１１：０１の対象である、実施形態３４ａ～３４ａ２のいずれか一項に記載の方法を含む。
実施形態３４ａ４は、対象がヒト患者である、実施形態３４ａ～３４ａ３のいずれか一項に記載の方法を含む。
実施形態３４ｂは、対象が、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１エピトープおよびＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のエピトープを含有する少なくとも１つのＨＢＶ抗原を含む、実施形態３０または３１～３４のいずれか一項に記載の方法を含む。
実施形態３４ｂ１は、対象が、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１エピトープおよびＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のエピトープを含有する少なくとも１つのＨＢＶ抗原を含む、実施形態３４ｂに記載の方法を含む。
実施形態３４ｂ２は、対象が、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープ、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２エピトープおよびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のエピトープを含有する少なくとも１つのＨＢＶ抗原を含む、実施形態３４ｂまたは３４ｂ１に記載の方法を含む。
実施形態３４ｂ３は、対象が、１つまたは複数のＨＬＡ－Ａ＊１１：０１エピトープを含有する少なくとも１つのＨＢＶ抗原を含む、実施形態３４ｂ～３４ｂ２のいずれか一項に記載の方法を含む。
実施形態３４ｂ４は、対象がヒト患者である、実施形態３４ｂ～３４ｂ３のいずれか一項に記載の方法を含む。
実施形態３５は、実施形態１～１５および２６のいずれか一項に記載の核酸分子もしくは核酸組合せ、実施形態１６～１８ｃ２のいずれか一項に記載のベクター、または実施形態１９～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンを含む、単離された宿主細胞を含む。
実施形態３６は、実施形態２６に記載の核酸をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで転写するステップを含む、ＲＮＡレプリコンを産生する方法を含む。
実施形態３６ａは、核酸が非ヒト動物においてｉｎ ｖｉｖｏで転写される、実施形態３６に記載の方法を含む。
実施形態３６ｂは、核酸がヒトにおいてｉｎ ｖｉｖｏで転写される、実施形態３６に記載の方法を含む。
実施形態３７は、それを必要とする対象においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答を誘導することに使用するための、実施形態２７～２８ｆのいずれか一項に記載の医薬組成物であって、好ましくは、対象が慢性ＨＢＶ感染を有し、任意選択で、別の免疫原性作用剤または他の抗ＨＢＶ作用剤と組み合わされる、医薬組成物を含む。
実施形態３７ａは、他の抗ＨＢＶ作用剤が、小分子、抗体もしくはその抗原結合断片、ポリペプチド、タンパク質、または核酸である、実施形態３７に記載の使用のための医薬組成物を含む。
実施形態３７ｂは、それを必要とする対象においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、実施形態２７～２８ｆのいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、任意選択で、別の免疫原性作用剤および／または別の抗ＨＢＶ作用剤を対象に投与するステップをさらに含み、好ましくは、対象が慢性ＨＢＶ感染を有する、方法を含む。
実施形態３８は、それを必要とする対象においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）誘導性疾患を処置することに使用するための、実施形態２７～２８ｆのいずれか一項に記載の医薬組成物であって、好ましくは、対象が慢性ＨＢＶ感染を有し、ＨＢＶ誘導性疾患が、進行線維症、肝硬変および肝細胞がん（ＨＣＣ）からなる群から選択され、任意選択で、別の治療剤、好ましくは別の抗ＨＢＶ作用剤と組み合わされる、医薬組成物を含む。
実施形態３８ａは、それを必要とする対象においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）誘導性疾患を処置する方法であって、実施形態２７～２８ｆのいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、任意選択で、別の治療剤、好ましくは別の抗ＨＢＶ作用剤を対象に投与するステップをさらに含み、好ましくは、対象が慢性ＨＢＶ感染を有し、ＨＢＶ誘導性疾患が、進行線維症、肝硬変および肝細胞がん（ＨＣＣ）からなる群から選択される、方法を含む。
実施形態３９は、配列番号１、３、５、９、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたＨＢＶ抗原を含む。
実施形態３９ａは、ＨＢＶ抗原が、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのコンセンサス配列を含む、実施形態３９に記載の単離されたＨＢＶ抗原を含む。
実施形態３９ｂは、ＨＢＶ抗原が、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１およびＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１のエピトープの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてを含む、実施形態３９または３９ａに記載の単離されたＨＢＶ抗原を含む。
実施形態３９ｃは、配列番号１、３、５、９、８４、８５、または８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなる、実施形態３９～３９ｂのいずれか一項に記載の単離されたＨＢＶ抗原を含む。
実施形態４０は、実施形態３９～３９ｃのいずれか一項に記載のＨＢＶ抗原をコードする、単離されたポリヌクレオチド配列を含む。
実施形態４０ａは、配列番号２、４、６、１０、８７、８８、または８９のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態４０に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む。
実施形態４０ｂは、配列番号２、４、６、１０、８７、８８、または８９のいずれか１つのヌクレオチド配列からなる、実施形態４０ａに記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む。
実施形態４１は、実施形態４０～４０ｂのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターである。
実施形態４１ａは、プラスミドである、実施形態４１に記載のベクターである。
実施形態４１ｂは、ウイルスベクターである、実施形態４１に記載のベクターである。
実施形態４１ｂ１は、ＭＶＡベクター、好ましくはＭＶＡ－ＢＮである、実施形態４１ｂに記載のベクターである。
実施形態４１ｂ２は、アデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６またはＡｄ３５である、実施形態４１ｂに記載のベクターである。
実施形態４１ｃは、ＲＮＡレプリコンである、実施形態４１に記載のベクターである。
実施形態４２は、実施形態３９～３９ｃのいずれか一項に記載の単離されたＨＢＶ抗原、実施形態４０～４０ｂのいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド配列、または実施形態４１～４１ｃのいずれか一項に記載のベクターを含む、医薬組成物である。
実施形態４３は、それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、実施形態４２に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法である。
実施形態４３ａは、それを必要とする対象においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答を誘導することに使用するための、実施形態４２に記載の医薬組成物であって、好ましくは、対象が慢性ＨＢＶ感染を有し、任意選択で、別の免疫原性作用剤、好ましくは別の抗ＨＢＶ作用剤と組み合わされる、医薬組成物を含む。
実施形態４４は、実施形態４０～４０ｂのいずれか一項に記載の核酸分子、実施形態４１～４１ｃのいずれか一項に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞を含む。
[実施例１]
レプリコンワクチン候補の抗原選択、設計およびｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
Ｌ表面抗原由来の高度免疫原性ＨＢＶタンパク質コア、Ｐｏｌ、ＰｒｅＳ２．ＳおよびＰｒｅＳ１ドメインを各々、レプリコンＨＢＶ治療ワクチンに含めるために選択した。免疫原性を一元化するために、遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤからの各抗原に対する固有の配列のアラインメントに基づいてコンセンサス配列を生成した。世界の慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）感染の７８％超を占めるこれら４つの遺伝子型を含めることにより、治療可能な標的集団のサイズを最大化する。中国、米国およびヨーロッパにおける最も一般的な上位３つのＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子の公知のヒトＴ細胞エピトープ（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１、およびＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１を含む）を各コンセンサス配列にマッピングした。公知のエピトープが変化することが判明した場合、コンセンサス配列を調整してエピトープを回復させた。例えば、Ｃ末端のＡｒｇ１４９、１５０および１５１は、ＨＢＶ治療ワクチンにコードされるＨＢＶコアに含まれた。Ｐｏｌはさらに、その逆転写酵素およびＲＮアーゼＨ活性を不活性化するように最適化された。シスタチンＳ前駆体シグナルペプチドをコア、ＰｏｌおよびＰｒｅＳ１ドメインに加えて分泌を増強し、一方、ＰｒｅＳ２．Ｓの内部シグナルペプチドは、分泌ＰｒｅＳ２．Ｓタンパク質産物ＭおよびＳを促進するために無傷のままにした。最後に、各抗原のアミノ酸配列を逆翻訳し、コドンを最適化して、ヒトにおける発現を最大化した（図１Ａ）。
これらの抗原は、レプリコン単独または多シストロン配置のいずれかでコードされ、レプリコン内の各抗原の異なる位置を有し、各々は、ＥＭＣＶまたはＥＶ７１からのＰ２Ａリボソームスキッピングエレメントまたは内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって連結された（図１Ｂ）。プラスミド鋳型を用いて、各レプリコン設計のＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応で生成し、Ｖｅｒｏ細胞にエレクトロポレートした。エレクトロポレーションから２４～４８時間後、各抗原の発現および分泌をフローサイトメトリー、ウエスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡにより測定した。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および抗原陽性細胞の頻度はまた、レプリコン増幅効率の指標としてアッセイされた。各構築物について、各抗原には、１）発現、２）分泌、および３）単一抗原を発現するレプリコンに対する抗原／ｄｓＲＮＡ陽性細胞の頻度の相対的レベルに基づいてスコアが与えられた。抗原スコアを加重し、総レプリコン構築物スコアを与えた（下記の表１）。これらのスコアに基づいて各構築物をランク付けし、ｉｎ ｖｉｖｏ評価に先立って、上位４つの二シストロン性構築物および上位４つの四シストロン性構築物を選択した（図２）。結合構築物スコアの場合、遺伝子スコアは、これらの構築物をランク付けするために使用される次の順序：Ｃｏｒｅ＞Ｐｏｌ＞ＰｒｅＳ２．Ｓ＞ＰｒｅＳ１で優先順位付けされた。さらに、各抗原のより類似した相対的発現レベルを有する構築物を、単一抗原の高発現および他の抗原の低発現を有する構築物より優先した。
図２は、単一遺伝子対照に対する上位８レプリコンからの各抗原の発現を示す。すべての構築物は、各抗原の比較的高いレベルの発現を維持することができた。しかしながら、コアとｐｏｌを同じ二シストロン性レプリコンＲＮＡから発現させた場合、コア発現の減少が観察された。対照的に、同一レプリコンからコア、Ｐｏｌ、ＰｒｅＳ２．ＳおよびＰｒｅＳ１を発現する四シストロン性レプリコンは、単一遺伝子対照と比較してコア発現の２～３倍の増加を一貫して示した。三シストロン性レプリコンＲＮＡからのＣｏｒｅ、ＰｏｌおよびＰｒｅＳ２．Ｓの発現もまた、Ｃｏｒｅ発現レベルの増加をもたらした（図３）が、ＰｒｅＳ１が同じレプリコンＲＮＡから発現された場合ほど劇的な増加ではなかった。
[実施例２]
ＳＭＡＲＲＴレプリコンＲＮＡプラットフォームはＨＢＶ標的に対するマウスの細胞応答を誘導する
これらの研究の目的は、ＨＢＶ抗原をコードする合成修飾アルファＲＮＡレプリコン技術（ＳＭＡＲＲＴ）がＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて免疫応答をプライムすることができるかどうかを決定することであった。ＳＭＡＲＲＴ単一遺伝子性ＨＢＶ構築物を１５μｇで投薬し、混合群には各レプリコン１５μｇ（マウスあたり合計６０μｇのＲＮＡ）で４つのＳＭＡＲＲＴ単一遺伝子性レプリコンを投薬した。０目週に、マウスは、指示されたＳＭＡＲＲＴ構築物をＩＭ注射により免疫され、対照群は食塩水で注射された。２週目に、全動物を屠殺し、脾臓細胞をインサート中の抗原配列を覆う１５量体の重複ペプチドプールで刺激した（ＳＭＡＲＲＴについては、重複ライブラリーを２プールに分割した）。ＩＦＮ－γ産生細胞の誘導をＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔにより測定した。ＣＤ８およびＣＤ４多機能性Ｔ細胞応答は、フローサイトメトリーによりＩＦＮ－γ、ＴＮＦαおよびＩＬ－２の産生を測定することにより決定した。以下の表２は、種々の実験群を示す。
ＨＢＶ抗原をコードするＳＭＡＲＲＴレプリコンで免疫化されたすべての動物は、適切な抗原配列をカバーするペプチドで刺激すると、ＩＦＮ－γ産生細胞を発現した（図４）。
さらに、４つのＳＭＡＲＲＴレプリコンを混合すると、４つすべての抗原にＩＦＮγ産生細胞が誘導された。同一ではあるが、別の実験において、多機能性Ｔ細胞サイトカイン産生を細胞内フローサイトメトリーにより測定した（図５）。この実験は、ＳＭＡＲＲＴ．コアまたはＳＭＡＲＲＴ．ＰｒｅＳ１によるマウスの免疫化が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて多機能性ＣＤ４ Ｔ細胞を誘導することを示した。ＳＭＡＲＲＴ．ＰｏｌおよびＳＭＡＲＲＴ．ＰｒｅＳ２．Ｓ免疫化は、マウスにおいて多機能性ＣＤ４とＣＤ８ Ｔ細胞応答の両方をもたらした。
[実施例３]
マウスにおけるＳＭＡＲＲＴ ＨＢＶ治療ワクチン候補のダウンセレクション
ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングの後、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性分析のために８つの構築物を選択した。これには４つの四シストロン性構築物および４つの二遺伝子性構築物が含まれ、これらを４つの組合せで混合して４つのＨＢＶ抗原すべてを送達した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０週目に免疫し、次に、下記の表３における実験概要に従って免疫原性分析のために２週目に脾臓を採取した。ｅｘ ｖｉｖｏ研究には、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔおよび細胞内サイトカイン染色が含まれた。
すべての二遺伝子性および四シストロン性構築物は、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔにより測定した場合、ＨＢＶコア（図６Ａ）、Ｐｏｌ（図６Ｂ）、およびＰｒｅＳ２．Ｓ（図６Ｃ）に対して強いＴ細胞応答を誘導した。すべての二遺伝子性および四シストロン性構築物は、ＰｒｅＳ１に対するＴ細胞応答を誘導し（図６Ｄ）、構築物に依存して若干のばらつきがあった。最も強いＰｒｅＳ１応答は、二遺伝子性２および３（群９）、二遺伝子性２および４（群１０）、および四シストロン性構築物（群１１～１４）の混合物によって誘導された。
すべての二遺伝子性および四シストロン性構築物は、複数のサイトカインを産生する能力によって測定した場合、コア（図７Ａ）、Ｐｏｌ（図７Ｂ）、ＰｒｅＳ２．Ｓ（図７Ｃ）、およびＰｒｅＳ１（図７Ｄ）に対する多機能性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導した。ＰｒｅＳ１に対する応答は、構築物に依存して、より多様であり、二遺伝子性２および３（群９）、二遺伝子性２および４（群１０）、および四シストロン性構築物（群１１～１４）の混合物によって誘導された最も強い応答があった。
[実施例４]
非ヒト霊長類におけるＳＭＡＲＲＴ ＨＢＶ治療ワクチン候補のダウンセレクション
マウスにおいて選ばれる、選択された構築物が大型動物において免疫原性であることを確認するために、カニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において免疫原性研究を行う。ＮＨＰには、第０週に２種類のＳＭＡＲＲＴワクチン候補で免疫を与え、次に、４週間ごとにさらに３回、ブーストした。ＳＭＡＲＲＴの３つの異なる用量レベルを、以下の表４に示すように評価する。ｅｘ ｖｉｖｏアッセイには、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ、およびＰＢＭＣを用いた細胞内サイトカイン染色が含まれ、注射後の１０日での機能的Ｔ細胞応答を決定する。注射日に血清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により抗ＨＢｓ抗原抗体レベルを測定する。また、注射日、注射６時間後および注射２４時間後に血清を採取し、サイトカインおよびＣ反応性タンパク質レベルを測定する。
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明に様々な置換および修飾を行うことができることは、当業者に容易に明らかである。
本明細書に言及されたすべての特許および刊行物は、本発明が属する技術分野における当業者のレベルを示すものである。
本明細書に例示的に記載された本発明は、適切には、本明細書に具体的に開示されていない任意のエレメントもしくは複数のエレメント、制限または複数の制限が存在しない場合に行うことができる。したがって、例えば、本明細書の各例において、用語「含むこと」、「から本質的に含むこと」および「からなること」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。採用されている用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、このような用語および表現の使用において、示され、説明されている特徴またはその一部の同等物を除外する意図はないが、本発明の請求の範囲内で種々の修飾が可能であることを認識されたい。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合、当業者は、本発明がまた、それによって、マーカッシュ群のメンバーの任意の個々のメンバーまたはサブグループに関して記載されていることを認識する。例えば、Ｘが臭素、塩素およびヨウ素からなる群から選択されるように記載される場合、Ｘが臭素である請求項、ならびにＸが臭素および塩素である請求項は、完全に記載される。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (42)

  1. ５’末端から３’末端の順で、
    （１）第１のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原をコードするポリヌクレオチド配列、
    （２）第１の内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）エレメント、または第１の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および
    （３）第２のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
    を含む、第１の天然に存在しないポリヌクレオチド配列、ならびに
    ５’末端から３’末端の順で、
    （１）第３のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原をコードするポリヌクレオチド配列、
    （２）第２の内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）エレメント、または第２の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および
    （３）第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
    を含む、第２の天然に存在しないポリヌクレオチド配列
    を含む核酸組合せであって、
    前記第１および第２の天然に存在しないポリヌクレオチド配列が、第３の内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）エレメント、もしくは第３の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって連結されているか、または別個の核酸分子中に存在し、
    前記第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原が、それぞれ独立して、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）抗原、およびＨＢＶ表面抗原からなる群から選択され、前記第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のうちの少なくとも１つが、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原から選択されるＨＢＶ表面抗原であり、好ましくは、前記第１、第２、第３または第４のＨＢＶ抗原のうちの１つが、ＨＢＶコアまたはＨＢＶ ｐｏｌ抗原である、
    前記核酸組合せ。
  2. 前記第１、第２、第３または第４のＨＢＶ抗原のうちの１つがＨＢＶコア抗原であり、１つがＨＢＶ ｐｏｌ抗原である、請求項１に記載の核酸組合せ。
  3. 前記第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれが互いに異なる、請求項１または２に記載の核酸組合せ。
  4. 前記第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれが、
    （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
    （ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
    （ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原；
    （ｉｖ）配列番号７と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＢＶコア抗原；および
    （ｖ）配列番号９と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原
    からなる群から独立して選択され、
    好ましくは、前記第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、前記ＨＢＶコア抗原、ならびに前記ＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれが、独立して、シグナルペプチドに作動可能に連結されており、前記ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原が内部シグナルペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸組合せ。
  5. 前記ＨＢＶコア抗原が、配列番号８４、８５、または８６のうちの少なくとも１つと少なくとも９８％同一の、例えば、配列番号８４、８５、または８６と少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸組合せ。
  6. 前記ＨＢＶコア抗原の最後の５つのＣ末端アミノ酸が、ＶＶＲアミノ酸配列、より詳細には、ＶＶＲＲ（配列番号９１）アミノ酸配列、より詳細には、ＶＶＲＲＲ（配列番号９２）アミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸組合せ。
  7. 前記ＨＢＶ表面抗原、前記ＨＢＶコア抗原、および前記ＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれが、
    （ｉ）ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのコンセンサス配列；ならびに／または
    （ｉｉ）ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０１０１、もしくはＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１の１つもしくは複数のエピトープ
    を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸組合せ。
  8. 前記ＨＢＶ表面抗原、前記ＨＢＶコア抗原、および前記ＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれが、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１の１つまたは複数のエピトープを含む、請求項７に記載の核酸組合せ。
  9. 前記第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原のそれぞれが、
    （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなる前記第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
    （ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列からなる前記第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原；
    （ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなる前記ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原；
    （ｉｖ）配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６のアミノ酸配列からなる前記ＨＢＶコア抗原；および
    （ｖ）配列番号９のアミノ酸配列からなる前記ＨＢＶ ｐｏｌ抗原
    からなる群から独立して選択され、
    好ましくは、前記第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、前記ＨＢＶコア抗原、ならびに前記ＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれが、独立して、シグナルペプチド、例えば、配列番号７７のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドに作動可能に連結されている、請求項４に記載の核酸組合せ。
  10. 前記第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれが、
    （ｉ）配列番号２と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有する前記第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （ｉｉ）配列番号４と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有する前記第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （ｉｉｉ）配列番号６と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有する前記ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （ｉｖ）配列番号８と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有する前記ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；および
    （ｖ）配列番号１０と少なくとも９０％同一の、例えば、配列番号１０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％同一の配列を有する前記ＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
    からなる群から独立して選択され、
    好ましくは、前記第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、前記ＨＢＶコア抗原、ならびに前記ＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列が、独立して、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、前記ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原が内部シグナルペプチドを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸組合せ。
  11. 前記第１、第２、第３および第４のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれが、
    （ｉ）配列番号２の配列からなる前記第１のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （ｉｉ）配列番号４の配列からなる前記第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （ｉｉｉ）配列番号６の配列からなる前記ＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （ｉｖ）配列番号８７、配列番号８８、または配列番号８９のうちのいずれか１つの配列からなる前記ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；および
    （ｖ）配列番号１０の配列からなる前記ＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
    からなる群から独立して選択され、
    好ましくは、前記第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、前記ＨＢＶコア抗原、ならびに前記ＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列が、独立して、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号９０の配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、請求項１０に記載の核酸組合せ。
  12. 前記第１、第２および第３の自己プロテアーゼペプチドのそれぞれが、ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、トセアアシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、フラシェリーウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるペプチド配列を独立して含み、好ましくは、前記第１、第２および第３の自己プロテアーゼペプチドのそれぞれが、Ｐ２Ａのペプチド配列、例えば、配列番号１１のＰ２Ａ配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸組合せ。
  13. 前記第１、第２および第３のＩＲＥＳのそれぞれが、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）またはエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）に由来し、好ましくは、前記第１、第２および第３のＩＲＥＳのそれぞれが、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸組合せ。
  14. ５’末端から３’末端の順で、
    （１）配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列もしくは配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （２）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列もしくは配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （３）配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （４）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （５）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （６）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （７）配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （８）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （９）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （１０）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （１１）配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （１２）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （１３）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （１４）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （１５）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （１６）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （１７）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （１８）配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （１９）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （２０）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；
    （２１）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；または
    （２２）配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ＰｒｅＳ２．Ｓ抗原をコードするポリヌクレオチド配列
    を含み、
    好ましくは、前記第１および第２のＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ１抗原、前記ＨＢＶコア抗原、ならびに前記ＨＢＶ ｐｏｌ抗原のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列が、独立して、シグナルペプチド、例えば、配列番号７７のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の核酸組合せ。
  15. 配列番号１５から５４のうちのいずれか１つの天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の核酸組合せ。
  16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸組合せを含むベクター。
  17. ＤＮＡプラスミドである、請求項１６に記載のベクター。
  18. ＤＮＡウイルスベクターまたはＲＮＡウイルスベクターである、請求項１６に記載のベクター。
  19. 改変ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara）（ＭＶＡ）ベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項１８に記載のベクター。
  20. Ａｄ２６、Ａｄ３５、またはＭＶＡ－ＢＮベクターである、請求項１９に記載のベクター。
  21. ５’末端から３’末端の順で、
    （１）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質媒介増幅のために必要な５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）；
    （２）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質のうちの少なくとも１つ、好ましくはすべてをコードするポリヌクレオチド配列；
    （３）ＲＮＡウイルスのサブゲノムプロモーター；
    （４）請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸組合せ；および
    （５）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質媒介増幅のために必要な３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）
    を含む、ＲＮＡレプリコン。
  22. ５’末端から３’末端の順で、
    （１）アルファウイルス５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）；
    （２）アルファウイルス非構造遺伝子ｎｓｐ１の５’複製配列；
    （３）ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフ；
    （４）第４の自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；
    （５）アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチド配列；
    （６）アルファウイルスサブゲノムプロモーター；
    （７）請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸組合せ；
    （８）アルファウイルス３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）；ならびに
    （９）任意選択で、ポリアデノシン配列
    を含む、請求項２１に記載のＲＮＡレプリコン。
  23. 前記ＤＬＰモチーフが、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＴＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガッハウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウイルス（ＦＭＶ）、ヌドゥム（ＮＤＵＶ）、およびバギークリークウイルスからなる群から選択されるウイルス種に由来する、請求項２２に記載のＲＮＡレプリコン。
  24. 前記第４の自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、トセアアシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、フラシェリーウイルス２ Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、前記第４の自己プロテアーゼペプチドが、Ｐ２Ａのペプチド配列を含む、請求項２３に記載のＲＮＡレプリコン。
  25. ５’末端から３’末端の順で、
    （１）配列番号５５のポリヌクレオチド配列を有する５’－ＵＴＲ、
    （２）配列番号５６のポリヌクレオチド配列を有する５’複製配列、
    （３）配列番号５７のポリヌクレオチド配列を含むＤＬＰモチーフ、
    （４）配列番号１１のＰ２Ａ配列をコードするポリヌクレオチド配列、
    （５）それぞれ配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１の核酸配列を有する、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチド配列、
    （６）配列番号６２のポリヌクレオチド配列を有するサブゲノムプロモーター、
    （７）請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸組合せ、ならびに
    （８）配列番号６３のポリヌクレオチド配列を有する３’ＵＴＲ
    を含む、請求項２１に記載のＲＮＡレプリコン。
  26. （ｉ）前記Ｐ２Ａ配列をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号１２を含み、
    （ｉｉ）前記核酸組合せが、配列番号１５から５４のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含み、
    （ｉｉｉ）前記ＲＮＡレプリコンが、ポリアデノシン配列をさらに含み、好ましくは、前記ポリアデノシン配列が、レプリコンの３’末端に配列番号６４の配列を有する、
    請求項２５に記載のＲＮＡレプリコン。
  27. 配列番号６５から７２のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡレプリコン。
  28. 請求項２１～２７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、好ましくは、前記核酸が、ＤＮＡ配列の５’末端に作動可能に連結されたＴ７プロモーターをさらに含み、より好ましくは、前記Ｔ７プロモーターが配列番号７３のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  29. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸組合せ、請求項１６～２０のいずれか一項に記載のベクター、請求項２１～２７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン、または請求項２８に記載の核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  30. 前記薬学的に許容される担体が、脂質ナノ粒子を含み、好ましくは、前記脂質ナノ粒子が、ＡＬＣ－０３１５、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＯＧＳ、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、γ－ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ、ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ｙ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ、またはＤＣＣｈｏｌのうちの１つまたは複数を含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. （１）配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列もしくは配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列；または
    （２）配列番号９のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＰ２Ａアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列もしくは配列番号１３もしくは１４のポリヌクレオチド配列を有するＩＲＥＳ、および配列番号８４、８５、もしくは８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列
    をさらに含む、請求項２９または３０に記載の医薬組成物。
  32. ＨＢＶ感染症の処置における使用のための、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  33. ＨＢＶに対する治療ワクチンである、請求項３２に記載の使用のための医薬組成物。
  34. プライムブーストレジメンとしての使用のための、同一な少なくとも１つのＨＢＶ抗原をコードする核酸分子を含む第２の組成物をさらに含む、請求項３２または３３に記載の使用のための医薬組成物。
  35. 前記プライムブーストレジメンが、請求項２１～２７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンを含む第１の組成物、およびＲＮＡレプリコンではないが、第１の組成物と同一な少なくとも１つのＨＢＶエピトープ、好ましくは同一な少なくとも１つのＨＢＶ抗原をコードするベクターを含む第２の組成物を含み、前記第１および第２の組成物のうちの一方がプライミングワクチン接種のために使用され、他方がブースティングワクチン接種のために使用される、請求項３４に記載の使用のための医薬組成物。
  36. 前記第２の組成物が、改変ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara）（ＭＶＡ）ベクター、アデノウイルスベクター、またはプラスミドベクターを含む、請求項３５に記載の使用のための医薬組成物。
  37. 前記第２の組成物が、Ａｄ２６、Ａｄ３５、またはＭＶＡ－ＢＮベクターを含む、請求項３６に記載の使用のための医薬組成物。
  38. それを必要とする対象においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答を誘導することに使用するための、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、好ましくは、前記対象が慢性ＨＢＶ感染を有し、任意選択で、別の免疫原性作用剤または他の抗ＨＢＶ作用剤と組み合わされる、前記医薬組成物。
  39. 他の抗ＨＢＶ作用剤が、小分子、抗体もしくはその抗原結合断片、ポリペプチド、タンパク質、または核酸である、請求項３８に記載の使用のための医薬組成物。
  40. それを必要とする対象においてＨＢＶの感染および／または複製を低減させることに使用するための、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  41. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸組合せ、請求項１６～２０のいずれか一項に記載のベクター、請求項２１～２７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン、または請求項２８に記載の核酸分子を含む、単離された宿主細胞。
  42. 請求項２８に記載の核酸をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで転写するステップを含む、ＲＮＡレプリコンを産生する方法。
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