JP2020500536A - 遺伝子発現増強のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年12月5日に出願された米国仮特許出願第62/430,250号、2017年4月17日に出願された米国仮特許出願第62/486,361号、2017年11月17日に出願された米国仮特許出願第62/587,954号に対する優先権を主張する。上記参照された出願の内容は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
添付の配列表の材料は、参照により本出願に組み込まれる。添付の配列表テキストファイル(ファイル名SGI012WO_SeqListing.txt)は、2017年12月4日に作成されたもの(169KB)である。
単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「細胞」は、それらの混合物など、1つ以上の細胞を含む。
いくつかのウイルスは、キャプシド遺伝子発現を調節する(例えば、増大する)、1つ以上のステムループ構造を形成することができる配列を有する。用語「ウイルスキャプシドエンハンサー」は、本明細書では、そのようなステムループ構造を形成することができる配列を含む調節エレメントを指すために使用される。いくつかの例では、ステムループ構造は、キャプシドタンパク質のコード配列内の配列によって形成され、下流ループ(DLP)配列と呼ばれる。本明細書に開示されているように、これらのステムループ構造またはその多様体は、目的遺伝子の発現レベルを調節するため、例えば増大するために使用することができる。例えば、これらのステムループ構造またはその多様体は、その下流に作動可能に連結されているコード配列の転写および/または翻訳を増強するために、組換えベクター(例えば、異種ウイルスゲノム)において使用することができる。一例として、アルファウイルス属のメンバーは、ウイルス26S転写物中に存在する顕著なRNA構造によって、抗ウイルスRNA活性化プロテインキナーゼ(PKR)の活性化に抵抗することができ、これにより、これらのmRNAのeIF2非依存性翻訳の開始が可能になる。下流ループ(DLP)と呼ばれるこの構造は、SINV26S mRNA中およびアルファウイルス属の他のメンバー中のAUGから下流に配置される。シンドビスウイルスの場合、DLPモチーフは、シンドビスサブゲノムRNAの最初の約150ntに見られる。ヘアピンは、シンドビスキャプシドAUG開始コドンの下流に配置される(AUGは、シンドビスサブゲノムRNAのnt50で照合される)。これまでの配列比較および構造的RNA分析の研究により、SINVにおけるDLPの進化的保存を明らかにし、アルファウイルス属の多くのメンバーにおける同等のDLP構造の存在を予測した(例えば、Ventoso、J.Virol.9484−9494、第86巻、2012年9月を参照されたい)。
DLP構造は、シンドビスウイルス(SINV)26S mRNAにおいて最初に特徴が明らかになり、またセムリキ森林ウイルス(SFV)においても検出された。同様のDLP構造が、新世界(例えば、MAYV、UNAV、EEEV(NA)、EEEV(SA)、AURAV)および旧世界(SV、SFV、BEBV、RRV、SAG、GETV、MIDV、CHIKV、およびONNV)メンバーなど、アルファウイルス属の他の少なくとも14種中に存在していることが報告されている。これらのアルファウイルス26S mRNAの予測される構造は、SHAPE(選択的2‘−ヒドロキシルアシル化およびプライマー伸長)データに基づいて構築された(Toribioら、Nucleic Acids Res.5月19日;44(9):4368−80、2016年、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。CHIKVおよびONNVを除くすべてのウイルスにおいて安定したステムループ構造が検出されたが、MAYVおよびEEEVは、より低い安定性のDLPを示した(図11A〜B、およびToribioら、2016年(上記)を参照されたい)。最も高いDLP活性は、最も安定したDLP構造を含むアルファウイルスにおいて報告された。場合によっては、DLP活性は、DLPモチーフと開始コドンAUG(AUGi)との間の距離に依存する。アルファウイルス26S mRNAにおけるAUG−DLP間隔は、DLPによって失速された40SサブユニットのP部位にAUGiを配置できるようにする様式で、リボソーム18S rRNAのES6S領域のトポロジーに調整され、これにより、eIF2が関与することなく、Met−tRNAを組み込むことができるようになる。2つの主なトポロジー(SFVクレードにおいてコンパクトで安定した構造、およびSINV群においてより伸長された構造)が検出された。両方の場合において、DLP構造では、強いSHAPE反応性の領域が先行していることが観察されており、これはAUG−DLP伸長の一本鎖構成であることが示唆されている。したがって、この領域は、全マウスmRNAトランスクリプトームまたはDLPを欠くアルファウイルスmRNAにおいて、同等の位置で比較した場合、高含有量のAおよび低含有量のGでは、二次構造を形成する傾向が低いことが示されている。これらの結果は、Toribioらによって報告されており(2016年、上記)、アルファウイルスにおけるDLPの発生が、おそらく、先行する領域の平坦化に関連しており、その結果、このmRNA領域の谷ピークトポロジーがもたらされていることが示唆されている。
アルテリウイルス(アルテリウイルス科アルテリウイルス属)は、家畜および野生動物に感染する、エンベロープのある、一本鎖のプラスセンスRNAウイルスの重要な群を包含する。アルテリウイルスは、コロナウイルス科(コロナウイルスおよびトロウイルス属)のメンバーと同様のゲノム構成および複製戦略を共有しているが、それらの遺伝的複雑性、ゲノムの長さ、生物物理学的性質、サイズ、構造、およびウイルス粒子(例えば、ビリオン)の構造タンパク質組成においてはかなり異なる。現在、アルテリウイルス属には、ウマ動脈炎ウイルス(EAV)、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)、マウスの乳酸脱水素酵素上昇ウイルス(LDV)、サル出血熱ウイルス(SHFV)、およびwobbly possum diseaseウイルス(WPDV)が含まれると考えられている。
アルファウイルスは、少なくとも30のメンバーを含む、IV群のトガウイルス科の遺伝的、構造的、および血清学的に関連するウイルスの属である。これらのメンバーは、各々が、ウイルススパイクタンパク質を含むエンベロープに取り囲まれたヌクレオキャプシドに囲まれた正の極性の一本鎖RNAゲノムを有する。現在、アルファウイルス属は、特にシンドビスウイルス(SIN)、セムリキ森林ウイルス(SFV)、ロスリバーウイルス(RRV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、および東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)を含む。これらは、すべて密接に関連しており、哺乳類、げっ歯類、魚類、鳥類などの様々な脊椎動物、およびヒトまたはウマなどの大型哺乳類、ならびに昆虫などの無脊椎動物に感染することができる。種と個体間の伝染は主に蚊を介して起こり、アルファウイルスをアルボウイルス、または節足動物媒介ウイルスの収集の一因としている。特に、シンドビスおよびセムリキ森林ウイルスは広く研究されており、したがって、これらのウイルスのライフサイクル、複製様式などは十分に特徴が明らかになっている。特に、アルファウイルスは、動物細胞中で非常に効率的に複製することが示されており、このため、こうした細胞中でタンパク質および核酸を産生するためのベクターとして、価値のあるものとなる。
先天性免疫活性化は、多くの異なる刺激により起こり得るので、抗原または治療用GOIを発現させるために自己増幅RNAレプリコンに頼るワクチンアプローチは、eIF2αのPKRリン酸化に関連して、包括的な宿主タンパク質がシャットダウンされることにより、悪影響を受ける可能性がある。宿主タンパク質の翻訳が抑制されている細胞環境で機能するようにRNAレプリコンを操作することにより、標準的RNAレプリコン系を上回る有意な利点がそれらの系に提供される。
本開示のいくつかの態様は、1つ以上のDLPモチーフ、1つ以上のDLPモチーフのコード配列、またはそれらの組み合わせを含む、合成または組換え核酸分子などの核酸分子に関する。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、DLPモチーフ(複数可)に作動可能に連結されている目的遺伝子(GOI)のコード配列および/またはDLPモチーフのコード配列を含み得る。
一態様では、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、動物細胞などの宿主細胞、本明細書に提供される核酸分子に導入すること、および形質転換細胞を選択またはスクリーニングすることを含む細胞の形質転換方法に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書では同義的に使用される。こうした用語は、特定の対象の細胞のみでなく、こうした細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。突然変異または環境の影響のいずれかにより、後続の世代においてある種の改変が起こり得るので、こうした子孫は、実際に、親細胞と同一ではない可能性もあるが、それでも本明細書で用いる用語の範囲内に含まれる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、エレクトロポレーション手順またはバイオリスティック手順によって宿主細胞に導入される。
本開示のいくつかの実施形態によれば、様々な核酸配列は、本開示の核酸分子によって担持され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、いかなる追加の異種核酸配列も含まない。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、1つ以上の追加の異種核酸配列または外来核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の追加の異種核酸配列または外来核酸配列は、目的遺伝子(GOI)のコード配列を含む。本明細書に開示のいくつかの実施形態では、GOIのコード配列は、ポリペプチドまたは機能的RNAをコードする。いくつかの実施形態では、GOIのコード配列は、リボソームRNA、tRNA、リボザイム、CRISPR系のトランス活性型(tr)RNA、CRISPR系のcrispr(cr)RNA、CRISPR系のキメラガイドRNA、マイクロRNA、干渉RNA(RNAi)分子、低分子ヘアピン(sh)RNA、またはアンチセンスRNA分子から選択される機能的RNAをコードする。いくつかの実施形態では、GOIのコード配列は、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、GOIのコード配列は、抗体、抗原、免疫調節剤、およびサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、GOIは、サイトカインをコードする。一般に、サイトカインは、免疫エフェクター細胞を増殖、活性化、および/または分化させるように作用する。サイトカインの例としては、これらに限定されないが、マクロファージ、Bリンパ球、Tリンパ球、内皮細胞、線維芽細胞、γインターフェロンなどのリンホカイン、腫瘍壊死因子、インターロイキン、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−1、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、GM−CSF、CSF−1およびG−CSFが挙げられる。
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、GOIは、毒素をコードする。いくつかの実施形態では、毒素は、細胞の成長を直接阻害するように作用する。毒素の例としては、これらに限定されるものではないが、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、ヤマゴボウ、抗ウイルスタンパク質、トリチン、赤痢菌毒素、シュードモナス外毒素A、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVTK)、および大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられる。
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、GOIは、「プロドラッグ」をコードする。本開示の文脈内で利用される「プロドラッグ」とは、毒性生成物にほとんどまたは全く細胞毒性を有さない化合物を活性化させる遺伝子産物を指す。このような遺伝子産物の代表例としては、ある種のプリンアラビノシドおよび置換ピリミジン化合物を選択的にモノリン酸化し、それらを細胞傷害性または細胞増殖抑制性代謝産物に変換する、HSVTKおよびVZVTK(ならびにその類似体および誘導体)が挙げられる。より具体的には、薬物ガンシクロビル、アシクロビル、またはそれらの類似体(例えば、FIAU、およびDHPG)のいずれかがHSVTKに曝露することで、薬物が、リン酸化して、対応する活性ヌクレオチド三リン酸形態になる。
本明細書に開示されているいくつかの実施形態では、GOIのコード配列は、アンチセンス配列である。アンチセンス配列は、RNA転写物に結合し、それによって特定のタンパク質の細胞合成を妨げるか、または細胞によるそのRNA配列の使用を妨げるように設計されている。そのような配列の非限定的な例としては、アンチセンスチミジンキナーゼ、アンチセンスジヒドロ葉酸還元酵素、アンチセンスHER2、アンチセンスABL、アンチセンスMyc、アンチセンスras、ならびにヌクレオチド生合成経路中のあらゆる酵素を遮断するアンチセンス配列が挙げられる。さらに、本明細書に開示のいくつかの実施形態によれば、免疫応答を減少させるために、インターフェロンおよび2ミクログロブリンに対するアンチセンス配列が利用され得る。
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、宿主細胞の感染時にリボザイムを産生する、1つ以上のRNAステムループ構造を含む核酸分子が提供される。リボザイムは、特定のRNAを切断するために使用され、これにより、1つの特定のRNA配列に影響を与え得るように設計される。一般的に、リボザイムの基質結合配列は、10〜20ヌクレオチド長である。この配列の長さは、標的RNAとのハイブリダイゼーションおよび切断されたRNAからのリボザイムの解離を可能にするのに十分である。リボザイムを作製するための代表的な例としては、米国特許第5,116,742号、同第5,225,337号、および同第5,246,921号に記載されているものが挙げられる。
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、様々なタンパク質または他の細胞構成成分が、本開示の核酸分子によって担持され得る。こうしたタンパク質の非限定的な例としては、天然のまたは改変された細胞構成成分、ならびに例えばウイルス、細菌、寄生虫、真菌または哺乳動物などの動物に見られる外来タンパク質または細胞構成成分が挙げられる。
原核生物または真核生物宿主細胞など、本開示の宿主細胞を使用して、本明細書に開示の目的遺伝子(GOI)のオープンリーディングフレームにコードされている、例えば、ポリペプチドなどの目的の分子を産生(例えば、発現)させることができる。したがって、本出願は、本開示の宿主細胞および/または核酸分子を使用して、例えば、ポリペプチドなどの目的の分子を産生するための方法をさらに提供する。宿主細胞は、例えば、単離された細胞、細胞培養中の細胞、生体内の細胞、またはそれらの組み合わせであり得る。
本明細書に開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の1つ以上の実施形態による方法によって産生された組換えポリペプチドに関する。本出願の組換えポリペプチドは、一般に、任意の組換えポリペプチドであり得、例えば、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドのうちの1つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体、抗原、免疫調節剤、およびサイトカインのうちの1つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは、治療的または予防的活性を有し得る。
本明細書に開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載されている組換えポリペプチドのいずれかを含む組成物に関する。組成物は、例えば、栄養補給組成物、予防組成物、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物、またはこれらの混合物であり得る。いくつかの実施形態では、本願の組成物は、ワクチンとして使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の核酸分子、ポリペプチド分子、および/または組成物のうちの1つ以上は、粒子またはナノ粒子に組み込まれ得る。本明細書に開示の分子および組成物のうちの1つ以上を含む粒子は、ポリマー粒子、脂質粒子、固体脂質粒子、自己会合粒子、コンジュゲートリン脂質の複合ナノ粒子、界面活性剤、タンパク質、ポリアミノ酸、無機粒子、またはそれらの組み合わせ(例えば、脂質安定化ポリマー粒子)であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の分子および/または組成物は、粒子内に実質的にカプセル化されているかまたは部分的にカプセル化されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の分子および/または組成物は、粒子の表面に堆積および/または吸着される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の分子および/または組成物は、粒子に組み込まれている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の分子および/または組成物は、粒子の一部分または構成成分である。いくつかの実施形態では、本開示の分子および/または組成物は、共有結合または非共有相互作用により粒子の表面に付着することができる。いくつかの実施形態では、本開示の分子および/または組成物は、自己会合して粒子になる。
本開示の分子および/または組成物は、1つ以上のリポソーム、リポプレックス、および/または脂質ナノ粒子を使用して配合され得る。一実施形態では、本開示の分子および/または組成物の医薬用配合物としては、リポソームが挙げられる。リポソームは、人工的に調製された小胞であり、主に脂質二重層から構成され得、栄養素および医薬用配合物を投与するための送達ビヒクルとして使用され得る。リポソームは、これらに限定されないが、直径が数百ナノメートルになり得、狭い水性区画によって分離された一連の同心二重層を含み得る多層小胞(MLV)、直径50nm以下であり得る小さい単細胞小胞(SUV)、および直径50〜500nmであり得る大きい単層小胞(LUV)など、異なるサイズのものであり得る。リポソーム設計は、これらに限定されないが、リポソームの健康でない組織への付着を改善するため、またはこれに限定されないがエンドサイトーシスなどの事象を活性化するために、オプソニンまたはリガンドを含み得る。リポソームは、医薬用配合物の送達を改善するために低または高pHを含み得る。
以下の実施例において、さらなる代替物がさらに詳細に開示される。これらは、決して、特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
一般的な実験手順
DNA鋳型の調製
プラスミドDNA鋳型を、50ng/mlカルバミシリン(Teknovaカタログ番号NC9730116)を補充したLBブロス培地(Teknovaカタログ番号L8000 06)で増殖させた300mLの飽和大腸菌TransforMax Epi300(Epicentreカタログ番号300105)培養物から精製した(Qiagenカタログ番号12163)。プラスミドDNAを、37℃で1時間、NotI消化(New England Biolabs NEBカタログ番号R3189S)により直線状した。直鎖鋳型DNAを再精製し(Zymoカタログ番号D4003)、市販の2−log DNAラダー(New England Biolabs、NEBカタログ番号N3200S)に対して、0.8%アガロースゲル(Life Technologiesカタログ番号G5018−08)により分析した。単一のバンドの存在が各サンプルにおいて確認され、これは、ex vitro転写を進める前に、直鎖DNA鋳型の予想される断片サイズに対応するものであった。
Ex vitro転写(IVT)反応は、20μlの反応物中で上記のように調製した1μgのDNA鋳型を用いて、37°Cで、1時間にわたってインキュベーションして行った(NEBカタログ番号E2065S)。そして、供給元によって提供された1単位のDNase IをIVT反応物に直接添加し、37℃でさらに15分間インキュベートした。次に反応物を氷上に置き、製造者が示唆した方法を用いて精製した(Qiagenカタログ番号74104)。次いで、精製したRNAをNanoDrop 2000c UV−Vis分光光度計を用いて定量した。エレクトロポレーションを進める前に、RNAを、0.8%アガロースゲル(Life Technologiesカタログ番号G5018−08)を用いて、電気泳動により可視化し、Millennium RNA Marker(Ambionカタログ番号AM7150)と比較した。
典型的な細胞トランスフェクション実験において、4D−Nucleofector(商標)System(Lonza)用のSF Cell Line Nucleofector(商標)キットを用いて、エレクトロポレーションによりレプリコンRNAをBHK−21細胞に導入した。0.25%トリプシンを用いてBHK−21細胞を採取し、冷PBSで1回洗浄した。細胞を、20μLのエレクトロポレーション反応物あたり細胞密度1×106細胞でSF緩衝液に再懸濁した。3マイクログラムのRNAを、16ウェルキュベットストリップ中で、三連で細胞にエレクトロポレートし、室温で10分間インキュベートした。エレクトロポレートされた細胞を、10%ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地を含有するプレートに回収し、続いて標準的な細胞培養条件で16〜18時間インキュベートした。
DLP含有EAVレプリコンデザインの構築
この実施例は、ポリタンパク質遺伝子/非構造タンパク質遺伝子および/またはレポーター遺伝子の上流に、作動可能に位置付けられたDLPモチーフを有する複数のアルテリウイルスRNAレプリコンベースの発現ベクターの生成について記載する。これらのアルテリウイルスRNAレプリコンベースの発現ベクターは、その後、実施例4に記載のフローサイトメトリー分析およびバルクルシフェラーゼ分析においてその特徴を明らかにし、かつ分析した。
4つのEAVベースのDLPレプリコン構築物のそれぞれの設計上の特徴を、以下に記載する。
この構築物では、rFFのすぐ上流およびTRS7の下流に配置されたDLPモチーフがrFFの転写を駆動する。
この構築物では、複製およびサブゲノムmRNAの転写に必須であることが公知であるレプリコンの5’UTRにおいて、ステムループ構造を維持するために、以下に記載するいくつかの慎重な設計変更を加えて、DLPモチーフをpp1ab遺伝子のすぐ上流に配置した。
(i)非構造ウイルス遺伝子1aの最初の79ヌクレオチドは、ATGからTAGに変異したその開始コドンと重複しており、「ATGシフト領域」として示されている(以下の配列番号2の配列において太字である)。
(ii)1a遺伝子の上流に位置し、その開始コドンATGと塩基対を形成し、ステムを形成する対応するヌクレオチドもまた、CATからCTAに変更された(以下の配列番号2の配列において下線が引いてある)。
(iii)DLP(以下の配列でイタリック体で示す)を「ATGシフト領域」のすぐ下流、かつポリタンパク質1ab遺伝子の上流(以下の配列番号2の配列に示す開始コドンATG)に配置した。
配列番号3
GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT
この構築物は、別のDLPが、レポーターrFF遺伝子のすぐ上流に配置されたことを除いて(DLPモチーフが構築物1に配置されたのと同じ様式で)、上記の第3の構築物と本質的に同一であった。レプリコン構築物3(上記)および構築物4による性能の比較分析は、レポーター遺伝子の上流に配置された追加のDLPが、レポーター遺伝子の発現に付加価値を有するかに関する情報を提供する。
rEx−DLP−rFFは、ベクターとしてのSphIおよびEcoRIおよびインサートとしてのDLP含有gブロックで消化させたrEx−rFF(c4;配列番号34)を用いて、Gibsonら(Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nat. Methods 6、343−345、2009年)に記載の3−piece Gibson Assembly(登録商標)手順により構築した。rEx−DLP−rFFの構築に使用されたgブロックの核酸配列は、配列表の配列番号4に記載されている。
rEx−DLP−pp1ab−rFFベクターの構築のために、3つの核酸断片を、以下のように、3−piece Gibson Assembly(登録商標)手順を使用することによって生成した。
rEx−DLP−2A−pp1ab−rFFベクターの構築のために、3つの核酸断片を、以下のように、3−piece Gibson Assembly(登録商標)手順を使用することによって生成した。
rEx−DLP−2A−pp1ab−DLP−rFFベクターの構築のために、3つの核酸断片を、以下のように、3−piece Gibson Assembly(登録商標)手順を使用することによって生成した。
DLP含有アルファウイルスレプリコンの構築デザイン
この実施例は、ポリタンパク質遺伝子/非構造タンパク質遺伝子および/またはレポーター遺伝子の上流に位置付けられたDLPモチーフを有する複数のアルファウイルスRNAレプリコンベースの発現ベクターの生成について記載する。これらのアルファウイルスRNAレプリコンベースの発現ベクターは、その後、実施例5に記載のフローサイトメトリー分析およびバルクルシフェラーゼ分析において特徴を明らかにし、かつ分析した。
A.デザイン
この構築物では、DLPをレポーター遺伝子rFFの開始コドンのすぐ上流に配置した。
この構築物において、DLPモチーフおよび2Aペプチド配列(これは、上記実施例2に記載のrEx−DLP−2A−pp1ab−rFFレプリコンにおいて使用されたのと同じ配列であった)をコードしている配列は、レプリコンの5’末端内に配置され、複製およびサブゲノムmRNA転写のための配列構造要件を潜在的に維持するために、以下に記載のいくつかの慎重な設計変更を行う。
(i)nsp1遺伝子の最初の195ヌクレオチドは、ATGからTAGに変異した開始コドンと重複している(以下の配列番号19の配列において太字で示す)。
(ii)この195のヌクレオチドの重複配列を野生型アルファウイルスの5’UTRの直後(下記の配列番号19の配列に下線付きで示す)、続いてDLP−2A配列(配列中のイタリック体で示す)に配置した。
(iii)DLP−2A配列後のnsp1遺伝子の開始コドンを除去した(以下の配列番号19の配列中において取り消し線で示す)。
この構築物は、別のDLPモチーフがレポーターrFF遺伝子のすぐ上流に配置された以外は、同じ3つの設計変更後、構築物2と本質的に同一である(DLPモチーフが構築物1に配置されたのと同じ様式)。レプリコン構築物2および3による性能の比較分析は、レポーター遺伝子の上流に配置された追加のDLPがレポーター遺伝子の発現に付加価値を有するかに関する情報を提供する(下記の実施例5を参照されたい)。
アルファ−R−DLP−rFFの構築
アルファ−R−DLP−rFFは、ベクターとしてEcoRI/SapI、インサートとして、PCRにより鋳型rEx−DLP−rFF(c2、配列番号15)から増幅させたDLP−rFFにより消化させたアルファ−R−eGFP(c6;配列番号35)を用いて、プライマーrP112(配列番号20)およびRP113(配列番号21)を用いて、Gibson Assembly(登録商標)手順によって構築し、eGFPをDLP−rFFに置換させた。クローン2および3は、MiSeqシーケンシングにより、完全に正しい配列であることが確認された。
アルファ−R−DLP−2A−nsp−rFF(構築物2)およびアルファ−R−DLP−2A−nsp−DLP−rFF(構築物3)は、それぞれのgブロックをインサート、プライマーRP124およびRP125(配列番号23)を用いて、それぞれの鋳型であるアルファ−R−rFF(c6;配列番号35)およびアルファ−R−DLP−rFF(c2;配列番号26)からPCR増幅されたベクターとして使用して、Gibson Assembly(登録商標)手順によって構築した。アルファ−R−DLP−2A−nsp−rFFのクローン1および3、ならびにアルファ−R−DLP−2A−nsp−DLP−rFFのクローン8および32は、MiSeqによって完全に正しいことが配列確認された。
いかなる特定の理論にも拘束されないが、間に2Aプロテアーゼを含まずに、DLPモチーフをレポーター遺伝子rFFのすぐ上流に配置することは、GOIのタンパク質発現に悪影響を及ぼし得ると考えられる。この悪影響は、rFFの5’末端に、ペプチドに翻訳されたDLP配列が存在することにより、rFFがここで「融合」タンパク質になったという事実に起因し得る。したがって、2つのアルファウイルス−レプリコン構築物についてのDLPモチーフとrFF遺伝子との間の2Aプロテアーゼ配列、アルファ−R−DLP−rFFおよびアルファ−R−DLP−2A−nsp−DLPなど、2つの新しい構築物を設計および構築し、アルファ−R−DLP−2A−rFFおよびアルファ−R−DLP−2A−nsp−DLP−2A−rFFを、それぞれ生成した。2Aプロテアーゼペプチド配列を含むことにより、rFFから、DLP配列によってコードされているペプチドの切断が可能になる(以下の実施例5を参照されたい)。
レプリコンを含むEAVベースのDLPの発現解析
上記の実施例2および3に示されるように、サブゲノムmRNA上で、レプリコン非構造タンパク質遺伝子またはGOI遺伝子のいずれかの上流に位置付けたDLPモチーフの操作の影響を決定するために、複数のEAVベースDLP含有レプリコンを構築した(表8)。
1)rEx−DLP−rFF:DLPモチーフをサブゲノムmRNA rFF転写産物の上流に位置付けたEAVベースレプリコン;
2)rEx−DLP−pp1ab−rFF:DLPを非構造的pp1ab遺伝子の上流に位置付けたEAVベースレプリコン;
3)rEx−DLP−2A−pp1ab−rFF:DLPモチーフを非構造タンパク質の上流に位置付け、2AプロテアーゼペプチドをDLPとpp1ab領域との間に位置付けたEAVベースレプリコン;および
4)rEx−DLP−2A−pp1ab−DLP−rFF:第1のDLPモチーフを非構造タンパク質の上流に位置付け、2AプロテアーゼペプチドをDLPとpp1ab領域との間に位置付け、第2のDLPモチーフをrFFサブゲノムmRNA転写産物の上流に位置付けたEAVベースレプリコン。
DLP含有VEEVレプリコンの発現解析
上記の実施例2および3に示されるように、サブゲノムmRNA上で、レプリコン非構造タンパク質遺伝子またはGOI遺伝子のいずれかの上流に位置付けたDLPモチーフの操作の影響を決定するために、複数のVEEVベースDLP含有レプリコンを構築した。
1)アルファ−R−rFF:DLPが存在していない対照VEEVベースレプリコン;
2)アルファ−R−DLP−rFF:DLPモチーフがサブゲノムmRNA rFF転写産物の上流に位置付けられているVEEVベースレプリコン;
3)アルファ−R−DLP−2A−nsp−rFF:DLPモチーフが非構造タンパク質の上流に位置付けられ、2AプロテアーゼがDLPとnsp領域との間にあるVEEVベースレプリコン;および
4)アルファ−R−DLP−2A−nsp−DLP−rFF:第1のDLPモチーフが非構造タンパク質の上流に位置付けられ、2AプロテアーゼがDLPとnsp領域との間にあり、第2のDLPモチーフがrFFサブゲノムmRNA転写産物の上流に位置付けられたVEEVベースレプリコンである。
DLPレプリコン発現系を用いた in vivo免疫原性反応
アルファウイルスレプリコンベクターは、上記のように、1つ以上のDLPモチーフを含むように操作された。DLP配列を含むRNAレプリコンであるアルファ−R−gDLP−HAを、Balb/cマウスにおいてin vivoでさらに分析した。この実験では、インフルエンザA/ベトナム/1203/2004(H5N1)由来のヘマグルチニンをコードする15μg、1.5μg、または0.15μgのRNAを6週間間隔でマウスに注射した。最後の追加免疫の14日後、脾臓および血清を採取してHAに対する免疫応答を分析した。これらの実験の結果のまとめを図12A〜図12Cに示す。図12Aでは、同程度の用量の未改変レプリコンと比較して、DLPモチーフ含有構築物においてメモリー前駆体エフェクター細胞(MPEC)の有意な増加が観察された。HA特異的MPECを、デキストラマー(H−2 Kd(IYSTVASSL;配列番号44))を用いて、他の集団特異的マーカー(CD8+CD44+CD62LLoKLRG−1LoIL−7RaHiCXCR3Hi)と共に検出した。注目すべきことに、この利点は、低用量でも観察可能であることであった。図12Bおよび図12Cにおいて、エフェクターT細胞応答は、CD4+T細胞またはCD8+T細胞ペプチドによる刺激後に、IFN−γを分泌していた抗原特異的HA細胞の数によって測定した。DLPモチーフを含むレプリコンで免疫した動物は、用量15μgおよび1.5μgでは、有意に高い頻度のサイトカイン発現CD4+およびCD8+T細胞を有する。これらのデータをまとめると、非改変型と比較して、DLPモチーフを含むレプリコンによって発現した抗原による免疫化に応答したエフェクターおよびメモリーT細胞応答の両方において、有意な増加が示されている。
DLP含有レプリコンを用いた免疫反応の抑制の防止
Balb/cマウスにおける免疫応答の抑制を妨げる能力について、上記のように構築されたDLP含有レプリコンをin vivoでさらに評価した。これらの実験では、DLPモチーフの有無にかかわらず、インフルエンザA/ベトナム/1203/2004(H5N1)由来のヘマグルチニンのコード配列を保持する1.5μgのmRNAを4週間間隔でマウスに注射する。注射の約24時間前に、6〜8週齢のBALB/cマウスを、ウイルス感染をシミュレートするために、水力学的尾静脈注射によって20μgのポリ(I:C)または生理食塩水で前処理する。最後の追加免疫から14日後、これらのマウスの血清を収集して、ヘマグルチニン(HA)に対する免疫応答を分析する。これらの実験のまとめを、図13に示す。図13では、ポリ(I:C)で前処理し、未改変レプリコンの用量を受けたマウスにおいて、HA特異的抗体の血清濃度の有意な減少が観察される。ポリ(I:C)群のレベルは、バックグラウンドを有意に上回ることはなかった。対照的に、ポリ(I:C)で前処理し、DLPモチーフを含有する構築物を投与した動物では、血清抗原特異的総IgG濃度の有意な減少を示すことはなかった。これらのデータをまとめると、未改変型と比較して、疑似ウイルス感染後のワクチン接種に応答して、DLPモチーフが、血清抗体レベルの抑制に対して保護することを示している。
DLP含有発現カセットの構築
この実施例は、本開示のいくつかの実施形態による、目的遺伝子、例えば、レポーター遺伝子の上流にシンドビスウイルスDLPエレメントを含むmRNAをex vitro転写するためのプラスミドベクターの作製について記載している。これらの実験で使用した5’および3’非翻訳領域(UTR)(それぞれ、配列番号36および配列番号41)は、ヒトベータグロビン遺伝子由来のものであった。5’UTR配列は、T7プロモーター(配列番号37)のすぐ下流およびシンドビスウイルスDLP配列(配列番号38)の上流に配置した。いくつかの実験では、目的遺伝子(GOI)のコード配列を、ブタテッショウウイルス−1由来の自己触媒性自己切断ペプチド(例えば、自己プロテアーゼペプチド)であるP2Aシグナルを介してDLPに連結した。いくつかの実験では、この場合GOIとして使用される、不安定化形態のEGFPレポーター遺伝子(dsGFP)のコード配列は、マウスオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子(MODC)由来のタンパク質分解性PEST分解シグナルに作動可能に連結されていた。いくつかの他の実験では、赤色発光ホタルルシフェラーゼにより報告された遺伝子のコード配列を目的遺伝子として使用した(以下の実施例9も参照)。しかしながら、任意の目的遺伝子のコード配列が、この構成で配置され得ることが企図される。また、図15に示すように、ヒトベータグロビン由来の3’UTR配列、120個のアデニン残基から構成されるポリAテール、およびT7ターミネーターを、dsGFPの終止コドンの下流に隣接して挿入した。上記の構成成分の各々の核酸配列は、以下のとおりである:
DLP含有発現カセットにおける遺伝子発現のex vivo評価
BHK−21細胞において、目的遺伝子の発現を増強する能力について、上記のように、1つ以上のDLPモチーフを含むように操作したDLP含有発現カセット由来のmRNAをex vivoで評価した。対照として、DLP配列を欠くがそれ以外は上記のDLP含有mRNAと同一であるmRNAサンプルを、同じ条件下で並行してアッセイした。これらの実験では、BHK−21細胞を汎発性 I型インターフェロンまたはビヒクル対照300、600または1000U/mLで2時間前処理した。前処理後、細胞に、DLPモチーフを含むかまたは含まないmRNA2.5μgと共に、三連でエレクトロポレートした。細胞は、前処理中に使用したものと同じ濃度のインターフェロンを含有する培地に戻した。GFP陽性細胞の頻度および平均蛍光強度(MFI)は、フローサイトメトリーによって、エレクトロポレーションの2時間後、4時間後および24時間後にアッセイした。DLP非含有mRNAと比較して、DLP含有mRNAでは、インターフェロンの存在下で、有意に高い頻度のGFP陽性細胞を生成することが観察された(図16A)。
DLP含有発現カセットにおける遺伝子発現のin vivo評価
Balb/cマウスにおける目的遺伝子の発現を増強する能力について、上記のように、1つ以上のDLPモチーフを含むように操作されたDLP含有発現カセット由来のmRNAをin vivoでさらに評価する。この実験では、赤色発光ホタルルシフェラーゼをコードする30μg、15μg、または1.5μgのDLP含有mRNAを6週間間隔でマウスに注射する。続いて、赤色発光ルシフェラーゼ発現を、注射後1、3、7、10、14、21および28日目にIVIS(in vivoイメージングシステム)分析によってモニターする。DLPモチーフを含まないmRNAを受けた対照動物と比較したとき、ルシフェラーゼ発現の有意な増加が、DLP含有mRNAを受けたマウスにおいて観察される。
DLP含有mRNAを用いた免疫応答の抑制の防止
Balb/cマウスにおいて、目的遺伝子の発現を増強する能力について、上記のようなDLP含有mRNAをin vivoでさらに評価する。この実験では、DLPモチーフの有無にかかわらず、インフルエンザA/ベトナム/1203/2004(H5N1)由来のヘマグルチ二ンのコード配列を保有する、30μg、15μg、または1.5μgのmRNAを4週間間隔でマウスに注射する。注射の約24時間前に、マウスを20μgのポリ(I:C)または生理食塩水で流体力学的尾静脈注射により前処理して、ウイルス感染をシミュレートする。最後の追加免疫から14日後、これらのマウスの血清を収集して、ヘマグルチニン(HA)に対する免疫応答を分析する。HA特異的抗体の血清濃度の有意な減少は、ポリ(I:C)で前処理され、DLP配列を有さない用量のmRNAを受けたマウスで観察されると予想される。対照的に、ポリ(I:C)で前処理し、DLPモチーフを含有するmRNAを投与した動物は、血清抗原特異的総IgG濃度の有意な減少を示さないと予想される。
Claims (174)
- ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの1つ以上のRNAステムループをコードしている第1の核酸配列と、
前記第1の核酸配列に作動可能に連結されている第2の核酸配列と、を含み、前記第2の核酸配列が、目的遺伝子(GOI)のコード配列を含む、核酸分子。 - 前記第1の核酸配列が、前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記第1の核酸配列の上流に作動可能に連結されているプロモーターをさらに含む、請求項1または2に記載の核酸分子。
- 前記第1の核酸配列の上流に作動可能に連結されている5’UTR配列をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記5’UTR配列が、前記プロモーターの下流および前記第1の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、請求項4に記載の核酸分子。
- 前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記自己プロテアーゼペプチドの前記コード配列が、前記第1の核酸配列の下流および前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、請求項6に記載の核酸分子。
- 前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−1 2A(P2A)、口蹄疫ウイルス(FMDV)2A(F2A)、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)2A(E2A)、Thosea asignaウイルス2A(T2A)、細胞質多角体病ウイルス2A(BmCPV2A)、軟化病ウイルス2A(BmIFV2A)、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項6〜7のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記第2の配列核酸配列の下流に作動可能に連結されている3’UTR配列をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、トガウイルス科に属するウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ウイルス種が、前記トガウイルス科のアルファウイルス属に属している、請求項10に記載の核酸分子。
- 前記アルファウイルス種は、東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、エバーグレーズウイルス(EVEV)、ムカンボウイルス(MUCV)、セムリキ森林ウイルス(SFV)、ピクスナウイルス(PIXV)、ミドレブルクウイルス(MIDV)、チクングニアウイルス(CHIKV)、オニョンニョンウイルス(ONNV)、ロスリバーウイルス(RRV)、バーマフォレストウイルス(BF)、ゲタウイルス(GET)、サギヤマウイルス(SAGV)、ベバルウイルス(BEBV)、マヤロウイルス(MAYV)、ウナウイルス(UNAV)、シンドビスウイルス(SINV)、アウラウイルス(AURAV)、ワタロアウイルス(WHAV)、ババンキウイルス(BABV)、キジラガウイルス(KYZV)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEEV)、ハイランドJウイルス(HJV)、フォートモーガンウィルス(FMV)、Ndumu(NDUV)、サケ科アルファウイルス(Salmonid alphavirus)(SAV)、およびBuggy Creekウイルスからなる群から選択される、請求項11に記載の核酸分子。
- 前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルス種の下流ループ(DLP)モチーフを含み、前記DLPモチーフが、前記1つ以上のRNAステムループのうちの少なくとも1つを含む、請求項10〜12のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、配列番号1および46〜52のうちの少なくとも1つに対して少なくとも80%の配列同一性を呈する核酸配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記核酸配列が、配列番号1および46〜52のうちの少なくとも1つに対して少なくとも95%の配列同一性を呈する、請求項14に記載の核酸分子。
- 前記GOIの前記コード配列が、ポリペプチドをコードする、請求項1〜15のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ポリヌクレオチドが、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ポリペプチドが、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 第2のウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体の1つ以上のRNAステムループをコードしている第3の核酸配列と、
前記第3の核酸配列に作動可能に連結されている第4の核酸配列と、をさらに含み、前記第4の核酸配列は、第2の目的遺伝子(GOI)のコード配列を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記第3の核酸配列の下流および前記第4の核酸配列の上流に作動可能に連結されている第2の自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項19に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、mRNA分子またはRNAレプリコンである、請求項1〜20のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 発現ベクターまたは転写ベクターである、請求項1〜20のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 1つ以上の追加の転写調節配列をさらに含む、請求項22に記載の核酸分子。
- 1つ以上の追加の翻訳調節配列をさらに含む、請求項22または23に記載の核酸分子。
- プラスミド、バクテリオファージベクター、コスミド、フォスミド、ウイルスレプリコン、シャトルベクター、またはそれらの組み合わせである、請求項22〜24のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 原核生物ベクターまたは真核生物ベクターである、請求項22〜25のいずれか一項に記載の核酸分子。
- de novo合成によって産生される、請求項1〜26のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 請求項16〜27のいずれか一項に記載の核酸分子を細胞内に導入することを含み、それによって前記細胞内において前記GOIによってコードされているポリペプチドを産生する、細胞内で目的のポリペプチドを産生するための方法。
- 細胞内において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、前記細胞内にRNA分子を導入することを含み、前記RNA分子は、ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体の1つ以上のRNAステムループ、および目的の前記ポリペプチドのコード配列を含み、それによって、前記細胞内に目的の前記ポリペプチドが産生される、方法。
- 前記RNA分子がメッセンジャーRNA(mRNA)分子またはレプリコンRNA分子である、請求項29に記載の方法。
- 前記RNA分子が、前記細胞に導入される前に、de novo合成および/またはin vitro転写によって産生される、請求項29または30に記載の方法。
- 前記RNA分子がウイルス種の下流ループ(DLP)モチーフを含み、前記DLPモチーフが前記ウイルスキャプシドエンハンサーの前記1つ以上のRNAステムループのうちの少なくとも1つを含む、請求項29〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNA分子が、前記1つ以上のRNAステムループのうちの少なくとも1つの下流、および目的の前記ポリペプチドの前記コード配列の上流に自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項29〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−1 2A(P2A)、口蹄疫ウイルス(FMDV)2A(F2A)、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)2A(E2A)、Thosea asignaウイルス2A(T2A)、細胞質多角体病ウイルス2A(BmCPV2A)、軟化病ウイルス2A(BmIFV2A)、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項29〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項29〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、組織、器官、または対象に存在する、請求項29〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、およびバッファローからなる群から選択される、請求項37に記載の方法。
- 細胞内でメッセンジャーRNA(mRNA)を産生するための方法であって、ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの1つ以上のRNAステムループをコードしている第1の核酸配列と、前記第1の核酸配列に作動可能に連結されている第2の核酸配列であって、目的遺伝子(GOI)のコード配列を含む前記第2の核酸配列と、を含む核酸分子を前記細胞に投与することを含み、それによって前記GOIのmRNAを産生する、を含む方法。
- 前記第1の核酸配列が、前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項39記載の方法。
- 前記第1の核酸配列の上流に作動可能に連結されているプロモーターをさらに含む、請求項39または40に記載の方法。
- 前記第1の核酸配列の上流に作動可能に連結されている5’UTR配列をさらに含む、請求項39〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記5’UTR配列が、前記プロモーターの下流および前記第1の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、請求項42に記載の方法。
- 前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項39〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記自己プロテアーゼペプチドの前記コード配列が、前記第1の核酸配列の下流および前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、請求項44に記載の方法。
- 前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−1 2A(P2A)、口蹄疫ウイルス(FMDV)2A(F2A)、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)2A(E2A)、Thosea asignaウイルス2A(T2A)、細胞質多角体病ウイルス2A(BmCPV2A)、軟化病ウイルス2A(BmIFV2A)、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項44または45に記載の方法。
- 前記第2の配列核酸配列の下流に作動可能に連結されている3’UTR配列をさらに含む、請求項39〜46のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、トガウイルス科に属するウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する、請求項39〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルス種が、前記トガウイルス科のアルファウイルス属に属している、請求項39〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アルファウイルス種は、東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、エバーグレーズウイルス(EVEV)、ムカンボウイルス(MUCV)、セムリキ森林ウイルス(SFV)、ピクスナウイルス(PIXV)、ミドレブルクウイルス(MIDV)、チクングニアウイルス(CHIKV)、オニョンニョンウイルス(ONNV)、ロスリバーウイルス(RRV)、バーマフォレストウイルス(BF)、ゲタウイルス(GET)、サギヤマウイルス(SAGV)、ベバルウイルス(BEBV)、マヤロウイルス(MAYV)、ウナウイルス(UNAV)、シンドビスウイルス(SINV)、アウラウイルス(AURAV)、ワタロアウイルス(WHAV)、ババンキウイルス(BABV)、キジラガウイルス(KYZV)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEEV)、ハイランドJウイルス(HJV)、フォートモーガンウィルス(FMV)、Ndumu(NDUV)、サケ科アルファウイルス(Salmonid alphavirus)(SAV)、およびBuggy Creekウイルスからなる群から選択される、請求項49に記載の方法。
- 前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルス種の下流ループ(DLP)モチーフを含み、前記DLPモチーフが、前記1つ以上のRNAステムループのうちの少なくとも1つを含む、請求項48〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、配列番号1および46〜52のうちの少なくとも1つに対して少なくとも80%の配列同一性を呈する核酸配列を含む、請求項51に記載の方法。
- 前記核酸配列が、配列番号1および46〜52のうちの少なくとも1つに対して少なくとも95%の配列同一性を呈する、請求項52に記載の核酸分子。
- 前記GOIの前記コード配列が、ポリペプチドをコードする、請求項39〜53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項54に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項54に記載の方法。
- 第2のウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体の1つ以上のRNAステムループをコードしている第3の核酸配列と、
前記第3の核酸配列に作動可能に連結されている第4の核酸配列と、をさらに含み、前記第4の核酸配列は、第2の目的遺伝子(GOI)のコード配列を含む、請求項39〜56のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第3の核酸配列の下流および前記第4の核酸配列の上流に作動可能に連結されている第2の自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項57に記載の方法。
- 前記核酸分子が、RNAレプリコンである、請求項39〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、発現ベクターまたは転写ベクターである、請求項39〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、1つ以上の追加の転写調節配列をさらに含む、請求項59または60に記載の方法。
- 1つ以上の追加の翻訳調節配列をさらに含む、請求項60または61に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、プラスミド、バクテリオファージベクター、コスミド、フォスミド、ウイルスレプリコン、シャトルベクター、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される発現ベクターである、請求項60〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターである、請求項60〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、組織、器官、または対象に存在する、請求項39〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、およびバッファローからなる群から選択される、請求項65に記載の方法。
- 前記細胞内で前記GOIの前記mRNAによってコードされているポリペプチドを産生することをさらに含む、請求項39〜66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GOIの前記産生されたmRNAを得ることと、
前記得られたmRNAを第2の細胞に導入して、前記第2の細胞における前記GOIの前記mRNAによってコードされているポリペプチドを発現させることと、を含む、請求項39〜66のいずれか一項に記載の方法。 - 改変型ウイルスRNAレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子であって、前記改変型ウイルスRNAレプリコンは、
ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの1つ以上の構造エレメントをコードしている第1の核酸配列であって、前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルスRNAレプリコンに対して異種である、第1の核酸配列と、
少なくとも1つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第2の核酸配列と、を含み、
前記第1の核酸配列が、前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、核酸分子。 - 前記ウイルスキャプシドエンハンサーの前記1つ以上の構造エレメントのうちの少なくとも1つが、1つ以上のRNAステムループを含む、請求項69に記載の核酸分子。
- 前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、トガウイルス科に属するウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する、請求項69または70に記載の核酸分子。
- 前記ウイルス種が、前記トガウイルス科のアルファウイルス属に属している、請求項71に記載の核酸分子。
- 前記アルファウイルス種は、東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、エバーグレーズウイルス(EVEV)、ムカンボウイルス(MUCV)、セムリキ森林ウイルス(SFV)、ピクスナウイルス(PIXV)、ミドレブルクウイルス(MIDV)、チクングニアウイルス(CHIKV)、オニョンニョンウイルス(ONNV)、ロスリバーウイルス(RRV)、バーマフォレストウイルス(BF)、ゲタウイルス(GET)、サギヤマウイルス(SAGV)、ベバルウイルス(BEBV)、マヤロウイルス(MAYV)、ウナウイルス(UNAV)、シンドビスウイルス(SINV)、アウラウイルス(AURAV)、ワタロアウイルス(WHAV)、ババンキウイルス(BABV)、キジラガウイルス(KYZV)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEEV)、ハイランドJウイルス(HJV)、フォートモーガンウィルス(FMV)、Ndumu(NDUV)、およびBuggy Creekウイルスからなる群から選択される、請求項72に記載の核酸分子。
- 前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルス種の下流ループ(DLP)モチーフを含み、前記DLPモチーフが、前記1つ以上のRNAステムループのうちの少なくとも1つを含む、請求項71〜73のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、配列番号1および46〜52のうちの少なくとも1つに対して少なくとも80%の配列同一性を呈する核酸配列を含む、請求項69または70に記載の核酸分子。
- 前記核酸配列が、配列番号1および46〜52のうちの少なくとも1つに対して少なくとも95%の配列同一性を呈する、請求項75に記載の核酸分子。
- 前記改変型ウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第1の核酸配列の下流および前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項69〜76のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−1 2A(P2A)、口蹄疫ウイルス(FMDV)2A(F2A)、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)2A(E2A)、Thosea asignaウイルス2A(T2A)、細胞質多角体病ウイルス2A(BmCPV2A)、軟化病ウイルス2A(BmIFV2A)、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項77に記載の核酸分子。
- 前記第1の核酸配列が、前記改変型ウイルスRNAレプリコンの前記5’末端の下流の約1〜1000ヌクレオチドの領域内に作動可能に位置付けられている、請求項69〜78のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記第2の核酸配列が、対応する未改変型ウイルスRNAレプリコンの天然ウイルス非構造タンパク質の前記コード配列を実質的にすべて含む、請求項69〜79のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記改変型ウイルスRNAレプリコンが、トガウイルス科のアルファウイルス属またはアルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属するウイルス種に由来の改変型RNAレプリコンである、請求項69〜80のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記アルテリウイルス種が、ウマ動脈炎ウイルス(EAV)、ブタ呼吸器生殖器症候群ウイルス(PRRSV)、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス(LDV)、およびサル出血熱ウイルス(SHFV)からなる群から選択される、請求項81に記載の核酸分子。
- 前記第1の核酸配列が、前記改変型アルテリウイルスRNAレプリコンのpp1ab非構造タンパク質の一部分または全体をコードしている第2の核酸配列の上流に作動可能に位置付けられている、請求項82に記載の核酸分子。
- 前記改変型アルテリウイルスRNAレプリコンをコードしている前記核酸配列が、1つ以上の発現カセットをさらに含み、前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つは、目的遺伝子(GOI)のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項82または83に記載の核酸分子。
- 前記改変型アルテリウイルスRNAレプリコンが、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの発現カセットを含む、請求項84に記載の核酸分子。
- 前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つが、前記改変型アルテリウイルスRNAレプリコンの一部分または全部のpp1ab非構造タンパク質をコードしている前記第2の核酸配列の下流に作動可能に連結されている、請求項84または85に記載の核酸分子。
- 前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つが、前記改変型アルテリウイルスRNAレプリコンの転写調節配列(TRS)の下流に作動可能に位置付けられ、前記TRSが、TRS1、TRS2、TRS3、TRS4、TRS5、TRS6、およびTRS7からなる群から選択される、請求項84〜86のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つが、ウイルスキャプシドエンハンサーの1つ以上の構造エレメントをコードしている第3の核酸配列をさらに含み、前記第3の核酸配列が、前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項84〜87のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記改変型アルテリウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第3の核酸配列の下流および前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項88に記載の核酸分子。
- 前記GOIの前記コード配列が、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される前記ポリペプチドをコードする、請求項84〜89のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記GOIの前記コード配列が、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項84〜89のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記改変型ウイルスRNAレプリコンは、東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、エバーグレーズウイルス(EVEV)、ムカンボウイルス(MUCV)、セムリキ森林ウイルス(SFV)、ピクスナウイルス(PIXV)、ミドレブルクウイルス(MIDV)、チクングニアウイルス(CHIKV)、オニョンニョンウイルス(ONNV)、ロスリバーウイルス(RRV)、バーマフォレストウイルス(BF)、ゲタウイルス(GET)、サギヤマウイルス(SAGV)、ベバルウイルス(BEBV)、マヤロウイルス(MAYV)、ウナウイルス(UNAV)、シンドビスウイルス(SINV)、アウラウイルス(AURAV)、ワタロアウイルス(WHAV)、ババンキウイルス(BABV)、キジラガウイルス(KYZV)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEEV)、ハイランドJウイルス(HJV)、フォートモーガンウィルス(FMV)、Ndumu(NDUV)、サケ科アルファウイルス(Salmonid alphavirus)(SAV)、およびBuggy Creekウイルスからなる群から選択されるアルファウイルス種由来の改変型RNAレプリコンを含む、請求項69〜91のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記第1の核酸配列が、前記改変型アルファウイルスRNAレプリコンの1つ以上の非構造タンパク質nsp1〜4またはその一部分をコードしている第2の核酸配列の上流に作動可能に位置付けられている、請求項92に記載の核酸分子。
- 前記改変型アルファウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列は、1つ以上の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットの各々は、目的遺伝子(GOI)のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項92または93に記載の核酸分子。
- 前記改変型アルファウイルスRNAレプリコンが、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの発現カセットを含む、請求項94に記載の核酸分子。
- 前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つは、前記改変型アルファウイルスRNAレプリコンの1つ以上の非構造タンパク質nsp1〜4またはその一部分をコードしている核酸配列の下流に作動可能に連結されている、請求項94または95に記載の核酸分子。
- 前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つが、ウイルスキャプシドエンハンサーの1つ以上の構造エレメントをコードしている第3の核酸配列をさらに含み、前記第3の核酸配列が、前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項94〜96のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記改変型アルファウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第3の核酸配列の下流および前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項97に記載の核酸分子。
- 前記GOIの前記コード配列が、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項94〜98のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記GOIの前記コード配列が、抗体、抗原、免疫調節剤、酵素、およびサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項94〜98のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 改変型非アルファウイルスRNAレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子であって、前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンが、ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの1つ以上の構造エレメントをコードしている第1の核酸配列を含む、核酸分子。
- 前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列が、少なくとも1つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第2の核酸配列をさらに含み、前記第1の核酸配列が、前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、請求項101に記載の核酸分子。
- 前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第1の核酸配列の下流および前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項101または102に記載の核酸分子。
- 前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−1 2A(P2A)、口蹄疫ウイルス(FMDV)2A(F2A)、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)2A(E2A)、Thosea asignaウイルス2A(T2A)、細胞質多角体病ウイルス2A(BmCPV2A)、軟化病ウイルス2A(BmIFV2A)、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項103に記載の核酸分子。
- 前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列が、プラス鎖RNAウイルスに由来する改変型RNAレプリコンを含む、請求項101〜104のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記プラス鎖RNAウイルスは、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、ラブドウイルス科、およびパラミクソウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス種である、請求項105に記載の核酸分子。
- 前記ウイルス種が、アルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属する、請求項106に記載の核酸分子。
- 前記改変型アルファウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列が、1つ以上の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットの各々は、目的遺伝子(GOI)のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項101〜107のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列が、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの発現カセットを含む、請求項101〜108のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記1つ以上の発現カセットの少なくとも1つが、前記少なくとも1つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている前記第2の核酸配列の下流に作動可能に連結されている、請求項101〜109のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つが、ウイルスキャプシドエンハンサーの1つ以上の構造エレメントをコードしている第3の核酸配列をさらに含み、前記第3の核酸配列が、前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項101〜110のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記改変型アルファウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第3の核酸配列の下流および前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項111に記載の核酸分子。
- de novo合成によって産生される、請求項1〜26、および69〜112のいずれか一項記載の核酸分子。
- 請求項1〜27および69〜113のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組換え細胞。
- 前記組換え細胞が、原核細胞または真核細胞である、請求項114に記載の組換え細胞。
- 前記組換え細胞が、動物細胞である、請求項114に記載の組換え細胞。
- 前記核酸分子が、改変型RNAレプリコンをコードしている核酸配列を含み、前記改変型レプリコンRNAの発現により、前記組換え細胞において先天性免疫応答に対する耐性が付与される、請求項114〜116のいずれか一項に記載の組換え細胞。
- 請求項114〜117のいずれか一項に記載の組換え細胞を含む細胞培養物。
- 対象に前記先天性免疫系に対する耐性を付与するための方法であって、前記方法は、改変型ウイルスRNAレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を前記対象に投与することを含み、前記改変型ウイルスRNAレプリコンは、
ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの1つ以上の構造エレメントをコードしている第1の核酸配列であって、前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルスRNAレプリコンに対して異種である、第1の核酸配列と、
少なくとも1つの非構造タンパク質またはその一部分をコードしている第2の核酸配列と、を含み、
前記第1の核酸配列が、前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結され、前記核酸分子によってコードされている前記改変型レプリコンRNAの発現により、前記対象において先天性免疫応答に対する耐性が付与される、方法。 - 対象において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法は、改変型ウイルスRNAレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を前記対象に投与することを含み、前記改変型ウイルスRNAレプリコンは、
ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの1つ以上の構造エレメントをコードしている第1の核酸配列であって、前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルスRNAレプリコンに対して異種である、第1の核酸配列と、
少なくとも1つの非構造タンパク質またはその一部分をコードしている第2の核酸配列と、を含み、
前記第1の核酸配列が、前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、方法。 - 目的のポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法は、改変型ウイルスRNAレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を含む宿主細胞を培養することを含み、前記改変型ウイルスRNAレプリコンは、
ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの1つ以上の構造エレメントをコードしている第1の核酸配列であって、前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルスRNAレプリコンに対して異種である、第1の核酸配列と、
少なくとも1つの非構造タンパク質またはその一部分をコードしている第2の核酸配列と、を含み、
前記第1の核酸配列が、前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、方法。 - 前記対象がヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、およびバッファローからなる群から選択される、請求項119または120に記載の方法。
- 前記ウイルスキャプシドエンハンサーの前記1つ以上の構造エレメントのうちの少なくとも1つが、1つ以上のRNAステムループを含む、請求項119〜122のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、トガウイルス科に属するウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する、請求項119〜123のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルス種が、トガウイルス科のアルファウイルス属に属している、請求項124に記載の方法。
- 前記アルファウイルス種は、東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、エバーグレーズウイルス(EVEV)、ムカンボウイルス(MUCV)、セムリキ森林ウイルス(SFV)、ピクスナウイルス(PIXV)、ミドレブルクウイルス(MIDV)、チクングニアウイルス(CHIKV)、オニョンニョンウイルス(ONNV)、ロスリバーウイルス(RRV)、バーマフォレストウイルス(BF)、ゲタウイルス(GET)、サギヤマウイルス(SAGV)、ベバルウイルス(BEBV)、マヤロウイルス(MAYV)、ウナウイルス(UNAV)、シンドビスウイルス(SINV)、アウラウイルス(AURAV)、ワタロアウイルス(WHAV)、ババンキウイルス(BABV)、キジラガウイルス(KYZV)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEEV)、ハイランドJウイルス(HJV)、フォートモーガンウィルス(FMV)、Ndumu(NDUV)、およびBuggy Creekウイルスからなる群から選択される、請求項125に記載の方法。
- 前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルス種の下流ループ(DLP)モチーフを含み、前記DLPモチーフが、前記1つ以上のRNAステムループのうちの少なくとも1つを含む、請求項124〜126のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、配列番号1および46〜52のうちの少なくとも1つに対して少なくとも80%の配列同一性を呈する核酸配列を含む、請求項119〜127のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸配列が、配列番号1および46〜52のうちの少なくとも1つに対して少なくとも95%の配列同一性を呈する、請求項128に記載の方法。
- 前記改変型ウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第1の核酸配列の下流および前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項119〜129のいずれか一項に記載の方法。
- 前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−1 2A(P2A)、口蹄疫ウイルス(FMDV)2A(F2A)、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)2A(E2A)、Thosea asignaウイルス2A(T2A)、細胞質多角体病ウイルス2A(BmCPV2A)、軟化病ウイルス2A(BmIFV2A)、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項130に記載の方法。
- 前記第1の核酸配列が、前記改変型ウイルスRNAレプリコンの前記5’末端の下流の約1〜1000ヌクレオチドの領域内に作動可能に位置付けられている、請求項119〜131のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の核酸配列が、対応する未改変型ウイルスRNAレプリコンの天然ウイルス非構造タンパク質の前記コード配列を実質的にすべて含む、請求項119〜132のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変型ウイルスRNAレプリコンが、トガウイルス科のアルファウイルス属またはアルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属するウイルス種に由来の改変型RNAレプリコンである、請求項119〜133のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アルテリウイルスウイルス種が、ウマ動脈炎ウイルス(EAV)、ブタ呼吸器生殖器症候群ウイルス(PRRSV)、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス(LDV)、およびサル出血熱ウイルス(SHFV)からなる群から選択される、請求項119〜134のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルス種は、アルテリウイルスであり、前記第1の核酸配列は、前記改変型アルテリウイルスRNAレプリコンの一部分または全部のpp1ab非構造タンパク質をコードしている核酸配列の上流に作動可能に位置付けられている、請求項134または135に記載の方法。
- 前記改変型アルテリウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列は、1つ以上の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットのうちの少なくとも1つは、目的遺伝子(GOI)のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項136に記載の方法。
- 前記改変型アルテリウイルスRNAレプリコンが、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの発現カセットをさらに含む、請求項137に記載の方法。
- 前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つが、前記改変型アルテリウイルスRNAレプリコンの一部分または全部のpp1ab非構造タンパク質をコードしている前記第2の核酸配列の下流に作動可能に連結されている、請求項137に記載の方法。
- 前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つが、改変型アルテリウイルスRNAレプリコンの転写調節配列(TRS)の下流に作動可能に位置付けられ、前記TRSが、TRS1、TRS2、TRS3、TRS4、TRS5、TRS6、およびTRS7からなる群から選択される、請求項137〜139のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つが、ウイルスキャプシドエンハンサーの1つ以上の構造エレメントをコードしている第3の核酸配列をさらに含み、前記第3の核酸配列が、前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項137〜140のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変型アルテリウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第3の核酸配列の下流および前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項141に記載の方法。
- 前記GOIの前記コード配列が、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項137〜142のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記GOIの前記コード配列が、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項137〜142のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変型ウイルスRNAレプリコンは、東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、エバーグレーズウイルス(EVEV)、ムカンボウイルス(MUCV)、セムリキ森林ウイルス(SFV)、ピクスナウイルス(PIXV)、ミドレブルクウイルス(MIDV)、チクングニアウイルス(CHIKV)、オニョンニョンウイルス(ONNV)、ロスリバーウイルス(RRV)、バーマフォレストウイルス(BF)、ゲタウイルス(GET)、サギヤマウイルス(SAGV)、ベバルウイルス(BEBV)、マヤロウイルス(MAYV)、ウナウイルス(UNAV)、シンドビスウイルス(SINV)、アウラウイルス(AURAV)、ワタロアウイルス(WHAV)、ババンキウイルス(BABV)、キジラガウイルス(KYZV)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEEV)、ハイランドJウイルス(HJV)、フォートモーガンウィルス(FMV)、Ndumu(NDUV)、およびBuggy Creekウイルスからなる群から選択されるアルファウイルス種由来の改変型RNAレプリコンを含む、請求項119〜134のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の核酸配列は、前記改変型アルファウイルスRNAレプリコンの1つ以上の非構造タンパク質nsp1〜4またはその一部分をコードしている核酸配列の上流に作動可能に位置付けられている、請求項145に記載の方法。
- 前記改変型アルファウイルスRNAレプリコンをコードする前記核酸配列は、1つ以上の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットの各々は、目的遺伝子(GOI)のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項145または146のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変型アルファウイルスRNAレプリコンが、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの発現カセットをさらに含む、請求項147に記載の方法。
- 前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つは、前記改変型アルファウイルスRNAレプリコンの1つ以上の非構造タンパク質nsp1〜4またはその一部分をコードしている核酸配列の下流に作動可能に連結されている、請求項147または148に記載の方法。
- 前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つが、ウイルスキャプシドエンハンサーの1つ以上の構造エレメントをコードしている第3の核酸配列をさらに含み、前記第3の核酸配列が、前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項147〜149のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変型アルファウイルスRNAレプリコンが、前記第3の核酸配列の下流および前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項150に記載の方法。
- 前記GOIの前記コード配列が、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項147〜151のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記GOIの前記コード配列が、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項147〜151のいずれか一項に記載の方法。
- 対象に先天性免疫系に対する耐性を付与するための方法であって、前記方法は、改変型非アルファウイルスRNAレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を前記対象に投与することを含み、前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンが、アルファウイルスキャプシドエンハンサーの1つ以上の構造エレメントをコードしている第1の核酸配列を含み、前記核酸分子によってコードされている前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンの発現により、前記対象において先天性免疫応答に対する耐性が付与される、方法。
- 対象において、目的のポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法が、改変型非アルファウイルスRNAレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を前記対象に投与することを含み、前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンは、アルファウイルスキャプシドエンハンサーの1つ以上の構造エレメントをコードしている第1の核酸配列を含む、方法。
- 改変型非アルファウイルスRNAレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を含む宿主細胞を培養することを含み、前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンは、アルファウイルスキャプシドエンハンサーの1つ以上の構造エレメントをコードしている第1の核酸配列を含む、目的のポリペプチドを産生するための方法。
- 前記対象がヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、およびバッファローからなる群から選択される、請求項154または155に記載の方法。
- 前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンが、少なくとも1つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第2の核酸配列をさらに含み、前記第1の核酸配列が、前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、請求項154〜157のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンが、前記第1の核酸配列の下流および前記第2の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項154〜158のいずれか一項記載の方法。
- 前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−1 2A(P2A)、口蹄疫ウイルス(FMDV)2A(F2A)、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)2A(E2A)、Thosea asignaウイルス2A(T2A)、細胞質多角体病ウイルス2A(BmCPV2A)、軟化病ウイルス2A(BmIFV2A)、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項159に記載の方法。
- 前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンは、プラス鎖RNAウイルスに由来する改変型RNAレプリコンを含む、請求項154〜160のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プラス鎖RNAウイルスは、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、ラブドウイルス科、およびパラミクソウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス種である、請求項161に記載の方法。
- 前記プラス鎖RNAウイルスが、アルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属するウイルス種である、請求項161に記載の方法。
- 前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンをコードする前記配列は、1つ以上の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットの各々は、目的遺伝子(GOI)のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項154〜163のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンが、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの発現カセットをさらに含む、請求項154〜164のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つが、前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンの前記少なくとも1つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている前記第2の核酸配列の下流に作動可能に連結されている、請求項154〜165のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の発現カセットのうちの少なくとも1つが、アルファウイルスキャプシドエンハンサーの1つ以上の構造エレメントをコードしている第3の核酸配列をさらに含み、前記第3の核酸配列が、前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項154〜166のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変型非アルファウイルスRNAレプリコンが、前記第3の核酸配列の下流および前記GOIの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項167に記載の方法。
- 請求項121〜153および155〜168のいずれか一項に記載の方法によって産生された組換えポリペプチド。
- 請求項169に記載の組換えポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 請求項1〜27および69〜113のいずれか一項に記載の核酸分子と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
- 請求項114〜117のいずれか一項に記載の組換え細胞と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
- 前記組成物が医薬用配合物に配合されている、請求項170〜172のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、共有結合化合物、非共有結合化合物、物理的組成物、または薬学的に許容される緩衝液を用いて医薬用配合物に配合される、請求項170〜173のいずれか一項に記載の組成物。
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