CN108884473B - 用于多功能和有效的基因表达的rna复制子 - Google Patents

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Abstract

本发明包括可以通过甲病毒来源的复制酶复制的RNA复制子。所述RNA复制子包含复制酶进行复制所需的序列元件，但这些序列元件不编码任何蛋白质或其片段，例如甲病毒非结构蛋白或其片段。因此，在根据本发明的RNA复制子中，通过复制酶进行复制所需的序列元件和蛋白质编码区是解偶联的。根据本发明，通过与天然甲病毒基因组RNA相比移除至少一个起始密码子实现解偶联。特别地，RNA复制子包含5’复制识别序列，其中5’复制识别序列的特征在于其包含与天然甲病毒5’复制识别序列相比至少一个起始密码子的移除。甲病毒来源的复制酶可以由该RNA复制子上或单独的RNA分子上的开放阅读框编码。本发明能够使得在细胞或生物体中有效且安全地表达目的蛋白，但不伴随不希望的甲病毒非结构蛋白片段的产生。本文中提供了体外和体内蛋白质产生的方法以及医学用途。

Description

用于多功能和有效的基因表达的RNA复制子
技术领域
本发明包括可以通过甲病毒来源的复制酶复制的RNA复制子。RNA复制子包含通过复制酶进行复制所需的序列元件，但这些序列元件不编码任何蛋白质或其片段，例如甲病毒非结构蛋白或其片段。因此，在根据本发明的RNA复制子中，通过复制酶进行复制所需的序列元件和蛋白质编码区是解偶联的。根据本发明，通过与天然甲病毒基因组RNA相比移除至少一个起始密码子实现解偶联。RNA复制子可包含编码目的蛋白(例如药学活性蛋白)的基因。复制酶可以由RNA复制子或单独的核酸分子编码。
背景技术
多年来在生物医学研究中已经研究了用于预防和治疗目的的包含编码一种或更多种多肽之外来遗传信息的核酸分子。现有技术方法将核酸分子向靶细胞或生物体的递送相同，但核酸分子和/或递送系统的类型不同：受与使用脱氧核糖核酸(DNA)分子相关的安全性问题的影响，近年来，核糖核酸(RNA)分子受到越来越多的关注。已经提出了多种方法，包括以裸RNA形式，或者以复合或包装形式(例如，在非病毒或病毒递送载体中)施用单链或双链RNA。在病毒和病毒递送载体中，遗传信息通常由蛋白质和/或脂质(病毒颗粒)包封。例如，已提出来源于RNA病毒的经改造的RNA病毒颗粒作为用于处理植物(WO 2000/053780A2)或用于哺乳动物疫苗接种(Tubulekas等，1997，Gene，第190卷，第191-195页)的递送载体。通常，RNA病毒是具有RNA基因组的一组多样感染性颗粒。RNA病毒可以分组为单链RNA(ssRNA)和双链RNA(dsRNA)病毒，并且ssRNA病毒通常可以进一步分为正链[(+)链]和/或负链[(-)链]病毒。正链RNA病毒作为生物医学中的递送系统初步看来是有吸引力的，因为它们的RNA在宿主细胞中可以直接用作用于翻译的模板。
甲病毒是正链RNA病毒的典型代表。甲病毒的宿主包括多种生物，包括昆虫、鱼和哺乳动物，例如家养动物和人。甲病毒在感染细胞的细胞质中复制(关于甲病毒生命周期的综述，参见José等，Future Microbiol.，2009，第4卷，第837-856页)。许多甲病毒的总基因组长度通常为11,000至12,000个核苷酸，并且基因组RNA通常具有5’-帽和3’poly(A)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒RNA的转录、修饰和复制以及蛋白质修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。基因组中通常有两个开放阅读框(ORF)。四种非结构蛋白(nsP1-nsP4)通常由在基因组5’末端附近开始的第一个ORF一起编码，而甲病毒结构蛋白由在第一个ORF的下游发现的并延伸靠近基因组的3’末端的第二个ORF一起编码。通常，第一个ORF多于第二个ORF，比例大致为2∶1。
在由甲病毒感染的细胞中，仅编码非结构蛋白的核酸序列从基因组RNA翻译，而编码结构蛋白的遗传信息可从亚基因组转录物翻译，所述亚基因组转录物是类似于真核信使RNA的RNA分子(mRNA；Gould等，2010，Antiviral Res.，第87卷，第111-124页)。感染后，即在病毒生命周期的早期阶段，(+)链基因组RNA像信使RNA一样直接用于翻译编码非结构多聚蛋白(nsP1234)的开放阅读框。在一些甲病毒中，在nsP3和nsP4的编码序列之间存在乳白终止密码子(opal stop codon)：当翻译在乳白终止密码子处终止时产生含有nsP1、nsP2和nsP3的多聚蛋白P123以及通过通读该乳白密码子产生的另外含有nsP4的多聚蛋白P1234(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页；Rupp等，2015，J.Gen.Virology，第96卷，第2483-2500页)。nsP1234被自我蛋白水解切割成片段nsP123和nsP4。多肽nsP123和nsP4缔合形成(-)链复制酶复合物，其使用(+)链基因组RNA作为模板转录(-)链RNA。通常在后期阶段，nsP123片段被完全切割成单个蛋白质nsP1、nsP2和nsP3(Shirako&Strauss，1994，J.Virol.，第68卷，第1874-1885页)。所有四种蛋白质形成(+)链复制酶复合物，其使用基因组RNA的(-)链互补序列作为模板合成新的(+)链基因组(Kim等，2004，Virology，第323卷，第153-163页，Vasiljeva等，2003，J.Biol.Chem.第278卷，第41636-41645页)。
在感染的细胞中，亚基因组RNA以及新的基因组RNA由nsP1提供5’-帽(Pettersson等，1980，Eur.J.Biochem.105，435-443；Rozanov等，1992，J.Gen.Virology，第73卷，第2129-2134页)，并由nsP4提供多腺苷酸[poly(A)]尾(Rubach等，Virology，2009，第384卷，第201-208页)。因此，亚基因组RNA和基因组RNA二者都类似于信使RNA(mRNA)。
甲病毒结构蛋白(核心核衣壳蛋白C、包膜蛋白E2和包膜蛋白E1，病毒颗粒的所有成分)通常由亚基因组启动子控制下的单个开放阅读框编码(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页)。亚基因组启动子被顺式作用的甲病毒非结构蛋白所识别。特别地，甲病毒复制酶使用基因组RNA的(-)链互补序列作为模板合成(+)链亚基因组转录物。(+)链亚基因组转录物编码甲病毒结构蛋白(Kim等，2004，Virology，第323卷，第153-163页，Vasiljeva等，2003，J.Biol.Chem.第278卷，第41636-41645页)。亚基因组RNA转录物用作将编码结构蛋白的开放阅读框翻译为一种多聚蛋白的模板，并且多聚蛋白被切割以产生结构蛋白。在宿主细胞中甲病毒感染的晚期，位于nsP2编码序列内的包装信号确保将基因组RNA选择性包装到由结构蛋白包装的出芽病毒粒子(budding virion)中(White等，1998，J.Virol.，第72卷，第4320-4326页)。
在感染的细胞中，通常仅在感染后的前3至4小时观察到(-)链RNA合成，并且在晚期检测不到，那时仅观察到(+)链RNA(基因组和亚基因组二者)的合成。根据Frolov等，2001，RNA，第7卷，第1638-1651页，用于调节RNA合成的主要模型表明依赖非结构多聚蛋白的加工：非结构多聚蛋白nsP1234的初始切割产生nsP123和nsP4；nsP4充当RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，其对(-)链合成具有活性，但对于(+)链RNA的产生效率低。多聚蛋白nsP123的进一步加工(包括在nsP2/nsP3连接处的切割)改变复制酶的模板特异性以增加(+)链RNA的合成以及减少或终止(-)链RNA的合成。
甲病毒RNA的合成还受顺式作用的RNA元件(包括四个保守序列元件)的调节(CSE；Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页；以及Frolov，2001，RNA，第7卷，第1638-1651页)。
通常，甲病毒基因组的5’复制识别序列的特征在于不同甲病毒之间的低总体同源性，但具有保守的预测的二级结构。甲病毒基因组的5’复制识别序列不仅参与翻译起始，而且还包含5’复制识别序列，其包含参与病毒RNA合成的两个保守序列元件，CSE1和CSE2。对于CSE1和2的功能，认为二级结构比线性序列更重要(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页)。
相反，甲病毒基因组的3’末端序列，即紧邻poly(A)序列上游的序列，其特征在于保守的一级结构，特别是保守序列元件4(CSE4)，也称为“19-nt保守序列”，其对于(-)链合成的起始是重要的。
CSE3，也称为“连接序列”，是甲病毒基因组RNA的(+)链上的保守序列元件，(-)链上的CSE3的互补序列充当用于亚基因组RNA转录的启动子(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页；Frolov等，2001，RNA，第7卷，第1638-1651页)。CSE3通常与编码nsP4的C端片段的区域重叠。
除甲病毒蛋白外，宿主细胞因子(可能是蛋白质)也可与保守序列元件结合(Strauss&Strauss，同上)。
已提出甲病毒衍生的载体用于将外源遗传信息递送到靶细胞或靶生物体中。在简单的方法中，编码甲病毒结构蛋白的开放阅读框被编码目的蛋白的开放阅读框替代。基于甲病毒的反式复制系统依赖于两个单独核酸分子上的甲病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶(通常为多聚蛋白nsP1234)，另一个核酸分子能够被所述复制酶反式复制(因此称为反式复制系统)。反式复制需要在给定的宿主细胞中存在这两种核酸分子。能够被复制酶反式复制的核酸分子必须包含某些甲病毒序列元件以允许通过甲病毒复制酶进行识别和RNA合成。各自的复制子在图1中显示为“模板RNA WT-RRS”。这样的复制子与允许在亚基因组启动子控制下扩增目的基因的优点相关；然而，由于编码nsP1234的开放阅读框与甲病毒基因组的5’复制识别序列(nsP1的编码序列)重叠，并且通常还与包含CSE3的亚基因组启动子(nsP4的编码序列)重叠，因此难以开发更多功能的载体。
例如，Michel等(2007，Virology，第362卷，第475-487页)描述了将95个沉默突变(即不影响编码的蛋白质序列的突变)引入甲病毒委内瑞拉脑炎病毒(Venezuelanencephalitis virus，VEEV)的nsP1的编码区中完全废除了VEEV在细胞中复制的能力，这可能是因为沉默突变破坏了RNA的二级结构。WO 2008/156829 A2和Kamrud等(2010，J.Gen.Virol.，第91卷，第1723-1727页)描述了辅助RNA(即表达VEEV衣壳和包膜的反式复制RNA)，其被修饰以使得用作在自然界中发现的VEEV的nsP1之起始密码子的特定AUG碱基三联体可以被移除(通过转化成终止密码子)以产生经修饰的构建体。根据Kamrud等，将nsP1起始密码子转化成终止密码子保留了RNA的复制潜力，并且这些经修饰的辅助RNA产生仅略微降低效价的VEEV颗粒。然而，作者观察到，在CSE1/2区域内发现的所有AUG转化为终止密码子导致在存在甲病毒复制酶的情况下辅助RNA复制不良。作者将这种不良复制归因于对潜在RNA二级结构的假定破坏。由于作者没有提到他们控制了其经修饰的辅助RNA的正确RNA折叠，因此二级结构受损是一种非常可能的解释。
RNA复制所需的5’复制识别序列包含nsP1的AUG起始密码子并因此与甲病毒非结构蛋白的N-端片段的编码序列重叠的事实代表了用于改造基于甲病毒的载体的重要瓶颈，因为包含5’复制识别序列的复制子通常编码(至少)甲病毒非结构蛋白的一部分，通常是nsP1的N-端片段。这在几个方面是不利的：
在顺式复制子的情况下，这种重叠限制了例如复制酶ORF的密码子使用对不同的哺乳动物靶细胞(人、小鼠、农场动物)的适应。可以想象，在病毒中发现的5’复制识别序列的二级结构在每个靶细胞中不是最佳的。然而，二级结构不能被自由改变，因为必须考虑复制酶ORF中可能导致的氨基酸变化并测试其对复制酶功能的影响。也不可能将完整的复制酶ORF交换为来自异源的复制酶，因为这可能导致5’复制识别序列结构的破坏。
在反式复制子的情况下，这种重叠导致nsP1蛋白片段的合成，因为5’复制识别序列需要保留在反式复制子中。通常不需要和不希望nsP1的片段：不希望的翻译给宿主细胞造成不必要的负担，并且除药学活性蛋白之外，还编码nsP1的片段的旨在用于治疗应用的RNA复制子可能会面临调节问题。例如，有必要证明截短的nsP1不会产生不需要的副作用。此外，5’复制识别序列中nsP1的AUG起始密码子的存在已勉强阻止了编码异源目的基因的反式复制子的设计，其中用于目的基因翻译的起始密码子位于可用于核糖体翻译起始的最5’位置。反过来，来自现有技术反式复制子RNA的转基因的5’-帽依赖性翻译是具有挑战性的，除非被克隆为与nsP1的起始密码子框内的融合蛋白(这样的融合构建体例如由Michel等，2007，Virology，第362卷，第475-487页描述)。这样的融合构建体导致上述nsP1片段的同样不必要的翻译，引起与上述相同的问题。此外，融合蛋白引起另外的问题，因为它们可能改变目的融合转基因的功能或活性，或者当用作疫苗载体时，跨越融合区的肽可改变融合抗原的免疫原性。
需要克服这些缺点。例如，需要提供改进的复制子用于以安全且有效的方式表达编码目的蛋白(例如药物活性蛋白)的核酸。如本文中所述，本发明的方面和实施方案解决了这种需要。
发明内容
免疫治疗策略代表了用于预防和治疗例如感染性疾病和癌症疾病的有前途的选择。越来越多的病原体和肿瘤相关抗原的鉴定导致广泛收集用于免疫疗法的合适靶标。本发明包括适用于有效表达抗原的改进的试剂和方法，适用于预防和治疗疾病的免疫治疗。
在第一方面中，本发明提供了包含5’复制识别序列的RNA复制子，其中5’复制识别序列的特征在于其包含与天然甲病毒5’复制识别序列相比至少一个起始密码子的移除。
在一个实施方案中，本发明的RNA复制子包含(经修饰的)5’复制识别序列和编码目的蛋白的第一开放阅读框，例如，功能性甲病毒非结构蛋白或优选不衍生自甲病毒的转基因，特别是位于5’复制识别序列下游的甲病毒非结构蛋白，其中5’复制识别序列和编码目的蛋白的第一开放阅读框不重叠，且优选5’复制识别序列与RNA复制子的任何开放阅读框不重叠，例如5’复制识别序列不含有功能性起始密码子，并且优选不含任何起始密码子。最优选地，编码目的蛋白的第一个开放阅读框的起始密码子在第一个功能性起始密码子，优选第一个起始密码子的RNA复制子的5’→3’方向。在一个实施方案中，编码目的蛋白的第一开放阅读框编码功能性甲病毒非结构蛋白。在一个实施方案中，编码目的蛋白的第一开放阅读框且优选整个RNA复制子不表达非功能性甲病毒非结构蛋白，例如甲病毒非结构蛋白的片段，特别是nsP1和/或nsP4的片段。在一个实施方案中，功能性甲病毒非结构蛋白与5’复制识别序列是异源的。在一个实施方案中，编码目的蛋白的第一开放阅读框不在亚基因组启动子的控制下。在一个实施方案中，RNA复制子包含至少一个在亚基因组启动子的控制下的编码目的蛋白的另外的开放阅读框。在一个实施方案中，亚基因组启动子与编码目的蛋白的第一开放阅读框不重叠。
在一个实施方案中，特征在于至少一个起始密码子的移除之RNA复制子的5’复制识别序列包含与甲病毒5’末端处约250个核苷酸同源的序列。在一个优选的实施方案中，它包含与甲病毒的5’末端处约300至500个核苷酸同源的序列。在一个优选的实施方案中，它包含有效复制作为载体系统来源的特定甲病毒物种所需的5’-端序列。
在一个实施方案中，RNA复制子的5’复制识别序列包含与甲病毒的保守序列元件1(CSE 1)和保守序列元件2(CSE 2)同源的序列。
在一个优选的实施方案中，RNA复制子包含CSE 2，并且其特征还在于其包含来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框的片段。在一个更优选的实施方案中，所述非结构蛋白的开放阅读框的片段不包含任何起始密码子。
在一个实施方案中，5’复制识别序列包含与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列，其中与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的所述序列的特征在于它包含与天然甲病毒序列相比至少一个起始密码子的移除。
在一个优选的实施方案中，与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列的特征在于其包含非结构蛋白的开放阅读框的至少天然起始密码子的移除。
在一个优选的实施方案中，与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列的特征在于其包含非结构蛋白的开放阅读框天然起始密码子外的一个或更多个起始密码子的移除。在一个更优选的实施方案中，所述核酸序列的另外特征在于非结构蛋白的开放阅读框，优选nsP1的天然起始密码子的移除。
在一个优选的实施方案中，5’复制识别序列包含一个或更多个茎环，其提供关于RNA复制的5’复制识别序列的功能。在一个优选的实施方案中，5’复制识别序列的一个或更多个茎环不被缺失或破坏。更优选地，茎环1、3和5中的一个或更多个，优选地所有茎环1、3和4，或茎环3和4不被缺失或破坏。更优选地，5’复制识别序列的茎环中没有一个被缺失或破坏。
在一个优选的实施方案中，RNA复制子包含一个或更多个核苷酸变化，其补偿通过移除至少一个起始密码子而引入的一个或更多个茎环内的核苷酸配对破坏。
在一个实施方案中，RNA复制子不包含编码截短的甲病毒非结构蛋白的开放阅读框。
在一个实施方案中，RNA复制子包含3’复制识别序列。
在一个实施方案中，RNA复制子包含编码目的蛋白的第一开放阅读框。
在一个实施方案中，RNA复制子的特征在于由第一开放阅读框所编码的目的蛋白可以由RNA复制子作为模板来表达。
在一个实施方案中，RNA复制子的特征在于其包含亚基因组启动子。通常，亚基因组启动子控制包含编码目的蛋白之开放阅读框的亚基因组RNA的产生。
在一个优选的实施方案中，由第一开放阅读框编码的目的蛋白可以由RNA复制子作为模板来表达。在一个更优选的实施方案中，由第一开放阅读框编码的目的蛋白可另外由亚基因组RNA表达。
在一个优选的实施方案中，RNA复制子的特征还在于它包含控制亚基因组RNA产生的亚基因组启动子，所述亚基因组RNA包含编码目的蛋白的第二开放阅读框。目的蛋白可以是与由第一开放阅读框架编码的目的蛋白相同或不同的第二蛋白。
在一个更优选的实施方案中，编码目的蛋白的亚基因组启动子和第二开放阅读框位于编码目的蛋白的第一开放阅读框的下游。
在一个实施方案中，由第一和/或第二开放阅读框编码的目的蛋白是功能性甲病毒非结构蛋白。
在一个实施方案中，RNA复制子包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框。
在一个实施方案中，编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框与5’复制识别序列不重叠。
在一个实施方案中，编码功能性甲病毒非结构蛋白的RNA复制子可以被功能性甲病毒非结构蛋白复制。
在一个实施方案中，RNA复制子不包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框。在该实施方案中，用于复制复制子的功能性甲病毒非结构蛋白可以如本文中所述反式提供。
在第二方面中，本发明提供了系统，其包含：
用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体，
根据本发明第一方面的RNA复制子，其可以通过功能性甲病毒非结构蛋白反式复制。优选地，所述RNA复制子的特征还在于它不编码功能性甲病毒非结构蛋白。
在一个实施方案中，根据第一方面的RNA复制子或根据第二方面的系统的特征在于所述甲病毒是塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)。
在第三方面中，本发明提供了包含编码根据本发明第一方面的RNA复制子之核酸序列的DNA。
在第四方面中，本发明提供了用于在细胞中产生目的蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a)获得包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框、可以由功能性甲病毒非结构蛋白复制并且还包含编码目的蛋白的开放阅读框之根据本发明第一方面的RNA复制子，以及
(b)将所述RNA复制子接种到细胞中。
在该方法的多个实施方案中，RNA复制子如上文对本发明的复制子所定义。
在第五方面中，本发明提供了用于在细胞中产生目的蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a)获得用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体，
(b)获得根据本发明第一方面的RNA复制子，其可以通过根据(a)的功能性甲病毒非结构蛋白反式复制并且其包含编码目的蛋白的开放阅读框，以及
(c)将RNA复制子和用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体共同接种到细胞中。
在该方法的多个实施方案中，用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体和/或RNA复制子如上文对本发明的系统所定义。根据第五方面，RNA复制子本身通常不编码功能性甲病毒非结构蛋白。
在第六方面中，本发明提供了含有第一方面的复制子或第二方面的系统的细胞。在一个实施方案中，根据本发明第四方面的方法或根据第五方面的方法接种细胞。在一个实施方案中，细胞可通过本发明第四方面的方法或通过第五方面的方法获得。在一个实施方案中，细胞是生物体的一部分。
在第七方面中，本发明提供了用于在对象中产生目的蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a)获得包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框、可以由功能性甲病毒非结构蛋白复制并且还包含编码目的蛋白的开放阅读框之根据本发明第一方面的RNA复制子，以及
(b)向对象施用所述RNA复制子。
在该方法的多个实施方案中，RNA复制子如上文对本发明的复制子所定义。
在第八方面中，本发明提供了用于在对象中产生目的蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a)获得用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体，
(b)获得根据本发明第一方面的RNA复制子，其可以通过根据(a)的功能性甲病毒非结构蛋白反式复制并且包含编码目的蛋白的开放阅读框，以及
(c)向对象施用RNA复制子和用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体。
在该方法的多个实施方案中，用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体和/或RNA复制子如上文对本发明系统所定义。根据第八方面中，RNA复制子本身通常不编码功能性甲病毒非结构蛋白。
附图简述
图1：包含未修饰或修饰的5’复制识别序列之RNA复制子的示意图
缩写：AAAA＝Poly(A)尾；ATG＝起始密码子/起始密码子(DNA水平为ATG；RNA水平为AUG)；5x ATG＝包含编码nsP1*的核酸序列中所有起始密码子的核酸序列(在编码来自塞姆利基森林病毒的nsP1*的核酸序列的情况下，5x ATG对应于5个特定起始密码子，参见实施例1)；Δ5ATG＝对应于编码nsP1*的核酸序列的核酸序列；然而，不包含在自然界中发现的甲病毒中编码nsP1*的核酸序列的任何起始密码子(在来自塞姆利基森林病毒的nsP1*的情况下，“Δ5ATG”对应于与在自然界中发现的塞姆利基森林病毒相比5个特定起始密码子的移除，参见实施例1)；EcoRV＝EcoRV限制性位点；nsP＝编码甲病毒非结构蛋白的核酸序列(例如nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)；nsP1*＝编码nsP1的片段的核酸序列，其中该片段不包含nsP1的C端片段；*nsP4＝编码nsP4的片段的核酸序列，其中该片段不包含nsP4的N端片段；RRS＝5’复制识别序列；SalI＝SalI限制性位点；SGP＝亚基因组启动子；SL＝茎环(例如SL1、SL2、SL3、SL4)；用图示出了SL1-4的位置；UTR＝非翻译区(例如5’-UTR、3’-UTR)；WT＝野生型。
顺式复制子WT-RRS：RNA复制子基本上对应于甲病毒的基因组，不同之处在于编码甲病毒结构蛋白的核酸序列已被编码目的基因(“转基因”)的开放阅读框所取代。当将“复制子WT-RRS”引入细胞时，编码复制酶的开放阅读框的翻译产物(nsP1234或其片段)可以驱动RNA复制子的顺式复制并驱动亚基因组启动子(SGP)下游核酸序列(亚基因组转录物)的合成。
反式复制子或模板RNA WT-RRS：RNA复制子基本上对应于“复制子WT-RRS”，不同之处在于编码甲病毒非结构蛋白nsP1-4的大多数核酸序列已被移除。更具体地，编码nsP2和nsP3的核酸序列已被完全移除；编码nsP1的核酸序列已被截短，以使得“模板RNA WT-RRS”编码nsP1的片段，该片段不包含nsP1的C端片段(但它包含nsP1的N端片段；nsP1*)；编码nsP4的核酸序列已被截短，以使得“模板RNA WT-RRS”编码nsP4的片段，该片段不包含nsP4的N端片段(但它包含nsP4的C端片段；*nsP4)。该截短的nsP4序列与完全活化的亚基因组启动子部分重叠。编码nsP1*的核酸序列包含编码在自然界中发现的甲病毒中nsP1*的核酸序列的所有起始密码子(在来自塞姆利基森林病毒的nsP1*的情况下，五个特异性起始密码子)。
Δ5ATG-RRS：RNA复制子基本上对应于“模板RNA WT-RRS”，不同之处在于它不包含编码在自然界中发现的甲病毒中nsP1*的核酸序列的任何起始密码子(在塞姆利基森林病毒的情况下，“Δ5ATG-RRS“对应于与自然界中发现的塞姆利基森林病毒相比移除五个特异性起始密码子)。引入以移除起始密码子的所有核苷酸变化均通过另外的核苷酸变化来补偿以保留预测的RNA的二级结构。
Δ5ATG-RRSΔSGP：RNA复制子基本上对应于“Δ5ATG-RRS”，不同之处在于它不包含亚基因组启动子(SGP)并且不包含编码*nsP4的核酸序列。“转基因1”＝目的基因。
Δ5ATG-RRS-双顺反子：RNA复制子基本上对应于“Δ5ATG-RRS”，不同之处在于它包含编码亚基因组启动子上游的第一目的基因(“转基因1”)的第一开放阅读框和编码亚基因组启动子下游的第二目的基因(“转基因2”)的第二开放阅读框。第二开放阅读框的定位对应于RNA复制子“Δ5ATG-RRS”中目的基因(“转基因”)的定位。
顺式复制子Δ5ATG-RRS：RNA复制子基本上对应于“Δ5ATG-RRS-双顺反子”，不同之处在于编码第一目的基因的开放阅读框编码功能性甲病毒非结构蛋白(通常是编码多蛋白nsP1-nsP2-nsP3-nsP4，即nsP1234的一个开放阅读框)。“顺式复制子Δ5ATG-RRS”中的“转基因”对应于“Δ5ATG-RRS-双顺反子”中的“转基因2”。功能性甲病毒非结构蛋白能够识别亚基因组启动子以及合成包含编码目的基因(“转基因”)的核酸序列的亚基因组转录物。“顺式复制子Δ5ATG-RRS”与“顺式复制子WT-RRS”一样顺式编码功能性甲病毒非结构蛋白；然而，不需要由“顺式复制子Δ5ATG-RRS”编码的nsP1的编码序列包含含有所有茎环的“顺式复制子WT-RRS”的精确核酸序列。
图2：5’复制识别序列内起始密码子的移除不影响反式复制子RNA的复制。A：实施例2中使用的核酸分子的说明。B：测量的电穿孔BHK21细胞的荧光素酶表达。详情请参见实施例2。示出了2个独立实验的平均值±SD，具有2个独立产生的RNA复制子批次(“模板”)；(N＝4)。
图3：5’复制识别序列内的起始密码子的移除使得能够进行帽依赖性翻译。左：实施例3中使用的核酸分子(RNA复制子)的图示。右：测量的电穿孔人包皮成纤维细胞的荧光素酶表达。详情请参见实施例3。示出了一式三份进行的一个实验的平均值±SD。
图4：紧接转染后，其特征在于5’复制识别序列内起始密码子的移除的反式复制子的帽依赖性翻译比从亚基因组转录物的翻译更强。左：核酸分子的图示。实施例4中使用的RNA复制子示为“Δ5ATG-RRS”和“Δ5ATG-RRSΔSGP”。右：测量的电穿孔BHK21细胞的荧光素酶表达。详情请参见实施例4。示出了一式三份进行的一个实验的平均值。
图5：加帽的反式复制子，其特征在于5’复制识别序列内起始密码子的移除使得能够在早期阶段表达转基因。左：实施例5中使用的“Δ5ATG-RRSΔSGP”核酸分子的图示。右：测量的电穿孔BHK21细胞的荧光素酶表达。详情请参见实施例5。示出了一式三份进行的一个实验的平均值±SD。
图6.帽二核苷酸的结构。上：天然帽二核苷酸，m7GpppG。底：硫代磷酸酯帽类似物β-S-ARCA二核苷酸：根据在反相HPLC中其洗脱特征，由于立体P中心而存在两种β-S-ARCA的非对映体，称为D1和D2。
图7.具有ATG缺失的RRS的重构顺式复制子是功能性的。将SFV复制酶的ORF插入到编码亚基因组启动子(SGP)下游的萤火虫荧光素酶的“Δ5ATG-RRS”中。在插入的复制酶内，对应于CSE2和核心SGP的区域通过核苷酸交换(虚线框)被破坏以避免这些调节区域的重复。这得到了重构的顺式复制子。将BHK21细胞与2.5μg“顺式复制子WT-RRS”或“顺式复制子Δ5ATG-RRS”共电穿孔。电穿孔后24小时测量荧光素酶表达。一式三份一个实验的平均值±SD。
图8.双顺反子复制子表达两种转基因。可分泌的纳米荧光素酶(SNL)克隆到反式复制子WT-RSS的亚基因组启动子(SGP)的下游。SGP上游的位置不编码转基因(-)SGP(SNL)。在以下构建体中，SNL被克隆到ΔATG-RSS的下游，并且萤火虫荧光素酶(Luc)被插入SGP(SNL)SGP(Luc)的下游。BHK21细胞与0.9μg反式复制的RNA和5μg编码mRNA的SFV-复制酶共电穿孔，电穿孔后48小时测量SNL和Luc表达。一个实验的数据。
图9.在复制识别序列中缺少起始密码子的辛德毕斯病毒反式复制子有效地复制。通过基因合成从辛德毕斯病毒基因组改造反式复制子，并将GFP插入亚基因组启动子(SGP)的下游。除了具有未修饰的复制识别序列(WT-RSS)的该反式复制子之外，还产生了其两个变体。在ΔATG-RRS中，从WT-RRS中缺失了原始起始密码子加上另外4个ATG。还根据需要引入补偿性核苷酸变化以保持RNA二级结构。为了产生ΔATG-RRSΔSGP，从ΔATG-RRS中缺失对应于亚基因组启动子的区域，从而得到具有直接位于ATG缺失的5’RRS下游的具有GFP的载体。将BHK21细胞与0.1μg反式复制RNA和2.4μg SFV-复制酶编码mRNA共电穿孔。电穿孔后24小时评估GFP表达(转染率[％]和平均荧光强度(MFI))。一个实验的数据。
发明详述
尽管下面详细描述了本发明，但应理解本发明不限于本文中所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限制。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
优选地，本文中使用的术语如在“A multilingual glossary ofbiotechnological terms：(IUPAC Recommendations)”，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel，和H.
Figure BDA0001807839270000131
编辑.，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland，(1995)中所述定义。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，这些方法在本领域的文献中有解释(参见，例如，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，J.Sambrook等.编辑.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor 1989。
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列出，然而，应理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方案。不应将多个描述的实施例和优选的实施方案解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应被理解为公开和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选的要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的元素的任何排列和组合都应被认为通过本说明书公开。
术语“约”意指大约或接近，并且在本文中所述的数值或范围的上下文中，优选意指所列举或要求保护的数值或范围的+/-10％。
除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一”和“一个/种”和“所述”以及类似的引用应被解释为涵盖单数和复数两者。本文中对数值范围的叙述仅旨在用作单独的提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另有说明，否则将每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独引用一样。除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制，除非另外声明。说明书中的任何语言都不应被解释为表示任何对于本发明的实践必不可少的未要求保护的要素。
除非另有明确说明，否则在本文件的上下文中使用术语“包含”来表示除了由“包含”引入的列表的成员之外可以任选地存在其他成员。然而，预期作为本发明的一个具体实施方案，术语“包含”包括不存在其他成员的可能性，即，为了本实施方案的目的，“包含”应理解为具有“由...组成”的含义。
由通用术语表征的组分的相对量的指示意指所述通用术语涵盖的所有特定变体或成员的总量。如果指定由通用术语定义的某个组件以某个相对量存在，并且如果该组件被进一步表征为通用术语所涵盖的特定变体或成员，则意味着没有另外存在由通用术语涵盖的其他变体或成员，使得通用术语所涵盖的组件的总相对量超过指定的相对量；更优选地，根本不存在由通用术语所涵盖的其他变体或成员。
在本说明书的全文中引用了若干文献。本文中引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)，无论是上文中还是下文中，均通过引用整体在此并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权先于此类公开内容。
本文中使用的术语如“减少/降低”或“抑制”意指引起在水平上总体减少/降低优选为5％或更高、10％或更高、20％或更高、更优选为50％或更高以及最优选75％或更高的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全的抑制，即减少至零或基本上减少至零。
术语例如“增加/提高”或“增强”优选涉及增加/提高或增强约至少10％、优选至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少80％、最优选至少100％。
术语“净电荷”是指整个物体(例如化合物或颗粒)上的电荷。
具有总净正电荷的离子是阳离子，而具有总净负电荷的离子是阴离子。因此，根据本发明，阴离子是比质子具有更多电子的离子，使其具有净负电荷；阳离子是比质子具有更少电子的离子，使其具有净正电荷。
关于给定化合物或颗粒，术语“带电荷的”，“净电荷”，“带负电荷的”或“带正电荷的”是指给定化合物或颗粒在pH 7.0下溶解或悬浮于水中时的净电荷。
根据本发明的术语“核酸”还包括核酸在核苷酸碱基上、糖上或磷酸酯上的核酸的化学衍生化，以及含有非天然的核苷酸和核苷酸类似物的核酸。在一些实施方案中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。通常，核酸分子或核酸序列是指优选为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的核酸。根据本发明，核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、病毒RNA、重组制备的和化学合成的分子。根据本发明，核酸可以是单链或双链和线性或共价闭合的环状分子的形式。
根据本发明，“核酸序列”是指核酸，例如核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)中的核苷酸序列。该术语可以指整个核酸分子(例如整个核酸分子的单链)或其部分(例如片段)。
根据本发明，术语“RNA”或“RNA分子”涉及包含核糖核苷酸残基并且优选完全或基本上由核糖核苷酸残基组成的分子。术语“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2′-位具有羟基的核苷酸。术语“RNA”包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分或完全纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA和重组产生的RNA，例如通过添加、缺失替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的RNA之经修饰的RNA。这样的改变可包括添加非核苷酸材料，例如添加在RNA的一个或更多个核苷酸处，例如添加至RNA的末端或内部。RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为类似物，特别是天然存在的RNA的类似物。
根据本发明，RNA可以是单链或双链的。在本发明的一些实施方案中，优选单链RNA。术语“单链RNA”通常是指不与任何互补核酸分子相关(通常没有互补RNA分子)的RNA分子。单链RNA可含有自身互补序列，其允许部分RNA折叠回并形成二级结构基序，包括但不限于碱基对、茎、茎环和凸起。单链RNA可以作为负链[(-)链]或作为正链[(+)链]存在。(+)链是包含或编码遗传信息的链。遗传信息可以是例如编码蛋白质的多核苷酸序列。当(+)链RNA编码蛋白质时，(+)链可直接用作进行翻译(蛋白质合成)的模板。(-)链是(+)链的互补链。在双链RNA的情况下，(+)链和(-)链是两个独立的RNA分子，并且这两种RNA分子彼此结合以形成双链RNA(“双链RNA”)。
术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及消除一半活性、量或分子数所需的时间。在本发明的上下文中，RNA的半衰期表示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可能影响RNA的“表达持续时间”。可以预期具有长半衰期的RNA将长期表达。
术语“翻译效率”涉及在特定时间段内由RNA分子提供的翻译产物的量。
提及核酸序列，“片段”涉及核酸序列的一部分，即代表在5’和/或3’端缩短的核酸序列的序列。优选地，核酸序列的片段包含来自所述核酸序列的至少80％、优选至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸残基。在本发明中，优选保留了RNA稳定性和/或翻译效率的RNA分子的那些片段。
提及氨基酸序列(肽或蛋白质)，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即代表在N-端和/或C-端截短的氨基酸序列的序列。在C-端处截短的片段(N-端片段)可通过例如翻译缺少开放阅读框的3’末端的截短的开放阅读框获得。在N-端处截短的片段(C-端片段)可通过例如翻译缺少开放阅读框的5’末端的截短的开放阅读框获得，只要截短的开放阅读框包含用于起始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含例如至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％来自氨基酸序列的氨基酸残基。
关于例如核酸和氨基酸序列，根据本发明术语“变体”包括任何变体，特别是突变体、病毒株变体、剪接变体、构象、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因正常序列的改变，其重要性通常不清楚。完整的基因测序通常鉴定给定基因的许多等位基因变体。关于核酸分子，术语“变体”包括简并核酸序列，其中根据本发明的简并核酸是由于遗传密码的简并性而与密码子序列中的参考核酸不同的核酸。物种同源物是具有与给定核酸或氨基酸序列具有不同的起源物种的核酸或氨基酸序列。病毒同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同的起源病毒的核酸或氨基酸序列。
根据本发明，与参考核酸相比，核酸变体包括单个或多个核苷酸缺失、添加、突变、替换和/或插入。缺失包括从参考核酸中移除一个或更多个核苷酸。添加变体包含一个或更多个核苷酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个核苷酸的5’-和/或3’-末端融合。在替换的情况下，移除序列中的至少一个核苷酸并在其位置处插入至少一个其他核苷酸(例如颠换和转换)。突变包括无碱基位点、交联位点和化学改变或修饰的碱基。插入包括在参考核酸中添加至少一个核苷酸。
根据本发明，“核苷酸变化”可以指与参考核酸相比，单个或多个核苷酸缺失、添加、突变、替换和/或插入。在一些实施方案中，“核苷酸变化”选自与参考核酸相比单个核苷酸的缺失、单个核苷酸的添加、单个核苷酸的突变、单个核苷酸的替换和/或单个核苷酸的插入。根据本发明，与参考核酸相比，核酸变体可包含一个或更多个核苷酸变化。
特定核酸序列的变体优选具有所述特定序列的至少一种功能特性，并且优选与所述特定序列在功能上等同，例如，与特定核酸序列的那些表现出相同或相似的性质的核酸序列。
如下所述，本发明的一些实施方案的特征尤其在于与甲病毒(例如天然存在的甲病毒)的核酸序列同源的核酸序列。这些同源序列是甲病毒(例如天然存在的甲病毒)的核酸序列的变体。
优选地，给定核酸序列和作为所述给定核酸序列的变体的核酸序列之间的同一性程度将为至少70％、优选至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、或最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。优选对至少约30、至少约50、至少约70、至少约90、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300，或至少约400个核苷酸的区域给出同一性程度。在优选的实施方案中，对参考核酸序列的整个长度给出同一性程度。
“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个多肽或核酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸或核苷酸的百分比。
术语“同一性％”意指特别是在待比较的两个序列之间的最佳比对中相同的核苷酸的百分比，所述百分比是纯粹统计学上的，并且两个序列之间的差异可以是在序列的整个长度上随机分布的，并且待比较的序列可以包含与参考序列相比的添加或缺失以便获得两个序列之间的最佳比对。两个序列的比较通常通过在最佳比对后相对于片段或“比较窗”比较所述序列来进行，以鉴定相应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可以手动地进行或借助于Smith和Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法、借助于Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的本地同源算法以及借助于Pearson和Lipman的相似性搜索算法，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85，2444或借助于使用所述算法的计算机程序(在Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLASTP、BLASTN和TFASTA)进行。
通过确定待比较的序列对应的相同位置的数目，将该数量除以比较的位置数并将该结果乘以100来获得同一性百分比。
例如，可以使用网站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi上可获得的BLAST程序“BLAST2 sequences”。
如果两个序列彼此互补，则核酸与另一个核酸“能够杂交”或“杂交”。如果两个序列能够彼此形成稳定的双链体，则核酸与另一个核酸“互补”。根据本发明，杂交优选在允许多核苷酸之间特异性杂交的条件下进行(严格的条件)。严格的条件描述于例如MolecularCloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等.，编辑，第2版，Cold Spring HarborLaboratory press，Cold Spring Harbor，New York，1989中，或者Molecular Biology，F.M.Ausubel等.，编辑，John Wiley&Sons，Inc.，New York的Current Protocols中，例如，指的是在65℃下在杂交缓冲液(3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH2PO4(pH 7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中杂交。SSC为0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠，pH 7。杂交后，将转移了DNA的膜洗涤，例如在室温下在2×SSC中洗涤，然后在高达68℃的温度下在0.1-0.5×SSC/0.1×SDS中洗涤。
百分比互补性表示核酸分子中可以与第二核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的连续残基的百分比(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完美互补”或“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基氢键结合。优选地，根据本发明的互补程度为至少70％、优选至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％或最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。最优选地，根据本发明的互补程度为100％。
术语“衍生物”包括在核苷酸碱基上、糖上或磷酸酯上核酸的任何化学衍生化。术语“衍生物”还包括含有非天然存在的核苷酸和核苷酸类似物的核酸。优选地，核酸的衍生化增加了其稳定性。
根据本发明，“衍生自核酸序列的核酸序列”指的是这样的核酸，其是衍生其的核酸的变体。优选地，当其替代RNA分子中的特定序列时，为关于特定序列的变体的序列保留了RNA稳定性和/或翻译效率。
“nt”是核苷酸的缩写；或者核苷酸的缩写，优选核酸分子中的连续核苷酸。
根据本发明，术语“密码子”是指编码核酸中的碱基三联体，编码核酸指定在核糖体的蛋白质合成期间接下来将添加哪种氨基酸。
术语“转录”涉及通过RNA聚合酶读取具有特定核酸序列的核酸分子(“核酸模板”)以使RNA聚合酶产生单链RNA分子的过程。在转录期间，核酸模板中的遗传信息被转录。核酸模板可以是DNA；然而，例如，在从甲病毒核酸模板转录的情况下，模板通常是RNA。随后，转录的RNA可以翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及其中RNA，特别是mRNA，在无细胞系统中体外合成的方法。优选地，应用克隆载体来产生转录物。这些克隆载体通常称为转录载体，并且根据本发明包含在术语“载体”中。克隆载体优选为质粒。根据本发明，RNA优选是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过体外转录合适的DNA模板获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入合适的载体进行体外转录来获得。可以通过RNA的逆转录获得cDNA。
转录期间产生的单链核酸分子通常具有为模板的互补序列的核酸序列。
根据本发明，术语“模板”或“核酸模板”或“模板核酸”通常是指可以复制或转录的核酸序列。
“从核酸序列转录的核酸序列”和类似术语是指适当时作为完整RNA分子的一部分的核酸序列，其是模板核酸序列的转录产物。通常，转录的核酸序列是单链RNA分子。
根据本发明，“核酸的3’末端”指的是具有游离羟基的末端。在双链核酸，特别是DNA的图解表示中，3’末端总是在右侧。根据本发明，“核酸的5’末端”指的是具有游离磷酸基团的末端。在双链核酸，特别是DNA的图解表示中，5’末端总是在左侧。
5’末端5’--P-NNNNNNN-OH-3’ 3’末端
3’-HO-NNNNNNN-P-5’
“上游”描述了核酸分子的第一元件相对于该核酸分子的第二元件的相对定位，其中两个元件均包含在相同的核酸分子中，并且其中与该核酸分子的第二个元件相比，第一元件位于更靠近核酸分子的5’末端。那么将第二种元件称为该核酸分子的第一元件的“下游”。位于第二元件“上游”的元件可以同义地称为位于该第二元件的“5”’。对于双链核酸分子，关于(+)链给出了例如“上游”和“下游”的指示。
根据本发明，“功能连接”或“功能性连接的”涉及功能关系内的连接。如果核酸在功能上与另一核酸序列相关，则它是“功能性连接的”。例如，如果启动子影响所述编码序列的转录，则它与编码序列功能性连接。功能性连接的核酸通常彼此相邻，在适当时通过另外的核酸序列分开，并且在特定的实施方案中，通过RNA聚合酶转录以产生单个RNA分子(共同转录物)。
在特定实施方案中，根据本发明，核酸与表达控制序列功能性连接，所述表达控制序列可以与所述核酸同源或异源。
根据本发明，术语“表达控制序列”包括启动子、核糖体结合序列和控制基因转录或衍生RNA的翻译的其他控制元件。在本发明的一些特定实施方案中，可以调节表达控制序列。表达控制序列的精确结构可以根据物种或细胞类型而变化，但通常包括分别参与启动转录和翻译的5’-非转录和5’-和3’-非翻译序列。更具体地，5’-非转录的表达控制序列包括启动子区，其包含用于转录控制功能性连接的基因的启动子序列。表达控制序列还可包括增强子序列或上游激活子序列。DNA分子的表达控制序列通常包括5’-非转录的和5’-和3’-非翻译的序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。甲病毒RNA的表达控制序列可包括亚基因组启动子和/或一个或更多个保守序列元件。如本文中所述，根据本发明的特定表达控制序列是甲病毒的亚基因组启动子。
本文中指明的核酸序列，特别是可转录和编码核酸序列，可以与任何表达控制序列(特别是启动子)组合，表达控制序列可以与所述核酸序列同源或异源，其中术语“同源”指的是核酸序列也与表达控制序列天然地功能性连接的事实，术语“异源”指的是核酸序列不与表达控制序列天然地功能性连接的事实。
如果它们以这样的方式彼此共价连接，使得可转录的并且特别是编码核酸序列的转录或表达受到表达控制序列的控制或影响，则可转录的核酸序列，特别是编码肽或蛋白质的核酸序列，以及表达控制序列彼此“功能性”连接。如果要将核酸序列翻译为功能性肽或蛋白质，则与编码序列功能性连接的表达控制序列的诱导导致所述编码序列的转录，而不会导致编码序列或编码序列的框移位而无法翻译成所需的肽或蛋白质。
术语“启动子”或“启动子区”是指通过提供RNA聚合酶的识别和结合位点控制转录物(例如包含编码序列的转录物)合成的核酸序列。启动子区可包括用于参与调节所述基因转录的其他因子的另外的识别或结合位点。启动子可以控制原核或真核基因的转录。启动子可以是“可诱导的”并且响应于诱导物而启动转录，或者如果转录不受诱导物控制，则可以是“组成型的”。如果不存在诱导物，则诱导型启动子仅在非常小的程度上表达或根本不表达。在存在诱导物的情况下，基因被“打开(switched on)”或转录水平增加。这通常通过特定转录因子的结合来介导。如本文中所述，根据本发明的特异性启动子是甲病毒的亚基因组启动子。另一些特异性启动子是甲病毒的基因组正链或负链启动子。
术语“核心启动子”指的是由启动子所包含的核酸序列。核心启动子通常是正确启动转录所需的启动子的最小部分。核心启动子通常包括转录起始位点和RNA聚合酶的结合位点。
“聚合酶”通常指的是能够催化由单体结构单元合成聚合物分子的分子实体。“RNA聚合酶”是能够催化从核糖核苷酸结构单元合成RNA分子的分子实体。“DNA聚合酶”是能够催化从脱氧核糖核苷酸结构单元合成DNA分子的分子实体。对于DNA聚合酶和RNA聚合酶的情况，分子实体通常是蛋白质或多个蛋白质的装配物或复合物。通常，DNA聚合酶基于模板核酸合成DNA分子，模板核酸通常是DNA分子。通常，RNA聚合酶基于模板核酸合成RNA分子，模板核酸是DNA分子(在这种情况下，RNA聚合酶是DNA依赖性RNA聚合酶，DdRP)或者是RNA分子(在这种情况下是RNA聚合酶是RNA依赖性RNA聚合酶，RdRP)。
“RNA依赖性RNA聚合酶”或“RdRP”是催化从RNA模板转录RNA的酶。在甲病毒RNA依赖性RNA聚合酶的情况下，依次合成基因组RNA的(-)链互补序列和(+)链基因组RNA导致RNA复制。因此，甲病毒RNA依赖性RNA聚合酶被同义地称为“RNA复制酶”。在自然界中，RNA依赖性RNA聚合酶通常由除逆转录病毒之外的所有RNA病毒编码。编码RNA依赖性RNA聚合酶的病毒的典型代表是甲病毒。
根据本发明，“RNA复制”通常是指基于给定RNA分子(模板RNA分子)的核苷酸序列合成的RNA分子。合成的RNA分子可以例如与模板RNA分子相同或互补。通常，RNA复制可以通过DNA中间体的合成发生，或者可以直接通过RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)介导的RNA依赖性RNA复制发生。在甲病毒的情况下，RNA复制不会通过DNA中间体发生，而是由RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)介导：模板RNA链(第一RNA链)-或其部分-用作用于合成与第一RNA链或其部分互补的第二RNA链的模板。第二RNA链-或其部分-可以进而任选地用作合成与第二RNA链或其部分互补的第三RNA链的模板。因此，第三RNA链与第一RNA链或其部分相同。因此，RNA依赖性RNA聚合酶能够直接合成模板的互补RNA链，并且能够间接合成相同的RNA链(通过互补的中间链)。
根据本发明，术语“模板RNA”指的是可以通过RNA依赖性RNA聚合酶转录或复制的RNA。
根据本发明，术语“基因”指的是特定的核酸序列，其负责产生一种或更多种细胞产物和/或用于实现一种或更多种细胞间或细胞内功能。更具体地，所述术语涉及包含编码特定蛋白质或功能或结构RNA分子的核酸的核酸区段(通常为DNA；但在RNA病毒的情况下为RNA)。
如本文中使用的“分离的分子”意指基本上不含其他分子例如其他细胞材料的分子。术语“分离的核酸”意指根据本发明，核酸已经(i)在体外扩增，例如通过聚合酶链反应(PCR)，(ii)通过克隆重组产生，(iii)纯化，例如通过切割和凝胶电泳分级分离，或(iv)合成，例如通过化学合成。分离的核酸是可通过重组技术操作的核酸。
术语“载体”在本文以其最通常的含义使用，并且包括用于核酸的任何中间载体，所述中间载体例如使得所述核酸能够被引入原核和/或真核宿主细胞中，并且在适当时，被整合到基因组中。优选在细胞中复制和/或表达这样的载体。载体包括质粒、噬菌粒、病毒基因组及其部分。
在本发明的上下文中，术语“重组”意指“通过基因工程制造”。优选地，在本发明的上下文中，“重组对象”例如重组细胞不是天然存在的。
本文中使用的术语“天然存在的”指的是对象可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从自然界来源中分离并且在实验室中没有被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中发现”意指“存在于自然中”并且包括已知对象以及尚未被从自然界发现和/或分离的但可能在未来从自然来源发现和/或分离的对象。
根据本发明，术语“表达”以其最通常的含义使用，并且包括RNA的产生、或RNA与蛋白质的产生。它还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及细胞的核糖体中的过程，通过该过程，编码RNA(例如信使RNA)的链指导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白。
根据本发明，术语“mRNA”意指“信使RNA”并且涉及通常通过使用DNA模板产生并编码肽或蛋白质的转录物。通常，mRNA包含5’-UTR、蛋白质编码区、3’-UTR和poly(A)序列。mRNA可以通过从DNA模板进行体外转录产生。体外转录方法是本领域技术人员已知的。例如，市售有多种体外转录试剂盒。根据本发明，可以通过稳定修饰和加帽来修饰mRNA。
根据本发明，术语“poly(A)序列”或“poly(A)尾”指的是不间断或中断的腺苷酸残基序列，其通常位于RNA分子的3’末端。不间断序列的特征在于连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断的poly(A)序列是典型的。虽然poly(A)序列通常不在真核DNA中编码，但是在转录后通过模板非依赖性RNA聚合酶在细胞核中的真核转录期间附着到RNA的游离3’末端，本发明包括由DNA编码的poly(A)序列。
根据本发明，提及核酸分子，术语“一级结构”指的是核苷酸单体的线性序列。
根据本发明，提及核酸分子，术语“二级结构”指的是反映碱基配对的核酸分子的二维图示；例如，在单链RNA分子的情况下，特别是分子内碱基配对。尽管每个RNA分子仅具有单个多核苷酸链，但该分子通常以(分子内)碱基对的区域为特征。根据本发明，术语“二级结构”包括结构基序，包括但不限于碱基对、茎、茎环、凸起、环例如内环和多分支环。核酸分子的二级结构可以通过二维图(平面图)表示，示出了碱基配对(关于RNA分子二级结构的进一步细节，请参见Auber等.，J.Graph Algorithms Appl.，2006，第10卷，第329-351页)。如本文中所述，某些RNA分子的二级结构与本发明的上下文相关。
根据本发明，核酸分子(特别是单链RNA分子)的二级结构通过使用用于RNA二级结构预测的网络服务器(http：//rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)进行预测来确定。优选地，根据本发明，提及核酸分子，“二级结构”具体指的是由所述预测确定的二级结构。还可以使用MFOLD结构预测(http：//unafold.ma.albany.edu/？q＝mfold)来执行或确认预测。
根据本发明，“碱基对”是二级结构的结构基序，其中两个核苷酸碱基通过碱基上的供体和受体位点之间的氢键彼此缔合。互补碱基A：U和G：C通过碱基上供体和受体位点之间的氢键形成稳定的碱基对；A：U和G：C碱基对称为Watson-Crick碱基对。较弱的碱基对(称为摆动碱基对)由碱基G和U(G：U)形成。碱基对A：U和G：C称为经典碱基对。其他碱基对像G：U(在RNA中经常发生)和其他稀有碱基对(例如A：C；U：U)称为非经典碱基对。
根据本发明，“核苷酸配对”指的是彼此缔合的两个核苷酸使得它们的碱基形成碱基对(经典或非经典碱基对，优选经典碱基对，最优选Watson-Crick碱基对)。
根据本发明，提及核酸分子，术语“茎环”或“发夹”或“发夹环”均可互换地指核酸分子(通常是单链核酸分子，例如单链RNA)的特定二级结构。由茎环表示的特定二级结构由连续的核酸序列组成，所述核酸序列包含茎和(末端)环，也称为发夹环，其中茎由两个相邻的完全或部分互补的序列元件形成；它们被形成茎-环结构的环的短序列(例如3至10个核苷酸)分开。两个相邻的完全或部分互补序列可以定义为例如，茎环元件茎1和茎2。当这两个相邻的全部或部分反向互补序列(例如，茎环元件茎1和茎2)彼此形成碱基对时，形成茎环，这导致由位于茎环元件茎1和茎2之间的短序列在其末端形成包含非配对环的双链核酸序列。因此，茎环包含两个茎(茎1和茎2)，其在核酸分子的二级结构水平上彼此形成碱基对，并且在核酸分子的一级结构水平上-由不是茎1或茎2的一部分的短序列分开。为了说明，茎环的二维图示类似于棒棒糖状结构。茎环结构的形成需要存在可以自身折叠以形成配对双链的序列；配对的双链由茎1和茎2形成。配对的茎环元件的稳定性通常由茎1的长度，能够与茎2的核苷酸形成碱基对(优选经典碱基对，更优选Watson碱基对)的核苷酸的数目，与不能与茎2的核苷酸形成这样的碱基对(错配或凸起)的茎1的核苷酸的数目来决定。根据本发明，最佳环长度为3至10个核苷酸，更优选为4至7个核苷酸，例如4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸或7个核苷酸。如果给定的核酸序列的特征在于茎环，则相应的互补核酸序列通常也以茎环为特征。茎环通常由单链RNA分子形成。例如，几个茎环存在于甲病毒基因组RNA的5’复制识别序列中(如图1中所示)。
根据本发明，提及核酸分子的特定二级结构(例如茎环)，“破坏(disruption)”或“破坏(disrupt)”意指特定的二级结构不存在或被改变。通常，二级结构可能由于作为二级结构的一部分的至少一个核苷酸的变化而被破坏。例如，可以通过改变形成茎的一个或更多个核苷酸来破坏茎环，以使得不可能进行核苷酸配对。
根据本发明，“补偿二级结构破坏”或“补偿二级结构破坏”指的是核酸序列中的一个或更多个核苷酸变化；更典型地，它指核酸序列中的一个或更多个第二核苷酸变化，该核酸序列还包含一个或更多个第一核苷酸变化，其特征如下：当一个或更多个第一核苷酸变化时，在不存在一个或更多个第二核苷酸变化的情况下，导致核酸序列的二级结构的破坏，一个或更多个第一核苷酸变化的和一个或更多个第二核苷酸变化共现(co-occurrence)不会导致核酸的二级结构被破坏。共现意指存在一个或更多个第一核苷酸变化和一个或更多个第二核苷酸变化二者。通常，一个或更多个第一核苷酸变化和一个或更多个第二核苷酸变化一起存在于同一核酸分子中。在一个具体实施方案中，补偿二级结构破坏的一个或更多个核苷酸变化是补偿一个或更多个核苷酸配对破坏的一个或更多个核苷酸变化。因此，在一个实施方案中，“补偿二级结构破坏”意指“补偿核苷酸配对破坏”，即一个或更多个核苷酸配对破坏，例如一个或更多个茎环内的一个或更多个核苷酸配对破坏。通过移除至少一个起始密码子可以引入一个或更多个核苷酸配对破坏。补偿二级结构破坏的一个或更多个核苷酸变化中的每一种是核苷酸变化，其各自可以独立地选自一个或更多个核苷酸的缺失、添加、替换和/或插入。在一个示例性实例中，当通过将A替换为C已破坏了核苷酸配对A：U(C和U通常不适合形成核苷酸对)；那么补偿核苷酸配对破坏的核苷酸变化可以用G替换U，从而能够形成C：G核苷酸配对。因此用G替换U补偿核苷酸配对破坏。在一个替代的实例中，当通过将A替换为C已破坏了核苷酸配对A：U；那么，补偿核苷酸配对破坏的核苷酸变化可以用A替换C，从而恢复原始A：U核苷酸配对的形成。通常，在本发明中，优选补偿二级结构破坏的那些核苷酸变化既不恢复原始核酸序列也不产生新的AUG三联体。在上述一组实例中，U到G的替换优于C到A的替换。
根据本发明，提及核酸分子，术语“三级结构”指的是核酸分子的三维结构，如通过原子坐标所定义。
根据本发明，核酸如RNA，例如RNA。mRNA可编码肽或蛋白质。因此，可转录的核酸序列或其转录物可含有编码肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)。
根据本发明，术语“编码肽或蛋白质的核酸”意指这样的核酸，如果存在于适当的环境中，优选细胞内，可指导氨基酸的组装以在翻译的过程中产生肽或蛋白质。优选地，根据本发明的编码RNA能够与细胞翻译机制相互作用，从而允许翻译编码RNA以产生肽或蛋白质。
根据本发明，术语“肽”包括寡肽和多肽，并且指的是包含两个或更多个，优选3个或更多个，优选4个或更多个，优选6个或更多个，优选8个或更多个，优选10个或更多个，优选13个或更多个，优选16个或更多个，优选20个或更多个，并且优选多达50个，优选100个或优选150个通过肽键彼此连接的连续的氨基酸的物质。术语“蛋白质”指的是大肽，优选具有至少151个氨基酸的肽，但术语“肽”和“蛋白质”在本文中通常用作同义词使用。
根据本发明，术语“肽”和“蛋白质”包括不仅含有氨基酸组分而且含有非氨基酸组分例如糖和磷酸酯结构的的物质，以及还包括含有酯、硫醚或二硫键等键的物质。
根据本发明，术语“起始密码子(initiation codon)”和“起始密码子(startcodon)”同义地指RNA分子的密码子(碱基三联体)，其可能是由核糖体翻译的第一密码子。这样的密码子通常编码真核生物中的氨基酸甲硫氨酸和原核生物中的经修饰的甲硫氨酸。真核生物和原核生物中最常见的起始密码子是AUG。除非本文中特别说明意指除AUG之外的起始密码子，否则提及RNA分子，术语“起始密码子”和“起始密码子”指的是密码子AUG。根据本发明，术语“起始密码子”和“起始密码子”还用于指脱氧核糖核酸的相应碱基三联体，即编码RNA起始密码子的碱基三联体。如果信使RNA的起始密码子是AUG，则编码AUG的基础三联体是ATG。根据本发明，术语“起始密码子”和“起始密码子”优选指的是功能性起始密码子或起始密码子，即指的是用作或将用作核糖体的密码子以起始翻译的起始密码子或起始密码子。在RNA分子中可能存在不被核糖体用作密码子以起始翻译的AUG密码子，例如，因为密码子到帽的距离很短。这些密码子不包含在术语功能性起始密码子或起始密码子中。
根据本发明，术语“开放阅读框的起始密码子”或“开放阅读框的起始密码子”指的是用作编码序列中(例如，在自然界中发现的核酸分子的编码序列中)用于蛋白质合成的起始密码子的基础三联体。在RNA分子中，开放阅读框的起始密码子通常在5’非翻译区(5’-UTR)之前，尽管这不是严格要求的。
根据本发明，术语“开放阅读框的天然起始密码子”或“开放阅读框的天然起始密码子”指的是用作天然编码序列中蛋白质合成的起始密码子的基础三联体。天然编码序列可以是例如在自然界中发现的核酸分子的编码序列。在一些实施方案中，本发明提供了在自然界中发现的核酸分子的变体，其特征在于已移除天然起始密码子(其存在于天然编码序列中)(因此其不存在于变体核酸中)。
根据本发明，“第一AUG”意指信使RNA分子的最上游AUG碱基三联体，优选被核糖体用作或将被用作密码子以起始翻译的信使RNA分子的最上游AUG碱基三联体。因此，“第一ATG”指的是编码第一AUG的编码DNA序列的ATG碱基三联体。在一些情况下，mRNA分子的第一AUG是开放阅读框的起始密码子，即在核糖体蛋白质合成期间用作起始密码子的密码子。
根据本发明，提及核酸变体的某些元件，术语“包括移除”或“以移除为特征”和类似术语意指与参考核酸分子相比，所述某些元件在核酸变体中不起作用或不存在。在没有限制的情况下，移除可以包括缺失特定元件的全部或部分，替换特定元件的全部或部分，或者改变特定元件的功能或结构特性。移除核酸序列的功能元件需要在包含移除的核酸变体的位置处不发挥该功能。例如，特征在于移除某些起始密码子的RNA变体需要核糖体蛋白质合成不在以移除为特征的RNA变体的位置处开始。移除核酸序列的结构元件需要结构元件不存在于包含移除的核酸变体的位置处。例如，特征在于移除某些AUG碱基三联体，即某一位置的AUG碱基三联体的RNA变体可能以以下为特征：例如，通过缺失某些AUG碱基三联体(例如ΔAUG)的部分或全部，或通过用任意一个或更多个不同核苷酸替换某个AUG碱基三联体的一个或更多个核苷酸(A、U、G)，使得得到的该变体的核苷酸序列不包含所述AUG碱基三联体。一个核苷酸的合适替换是将AUG碱基三联体转化为GUG、CUG或UUG碱基三联体，或转化为AAG、ACG或AGG碱基三联体，或转化为AUA、AUC或AUU碱基三联体的那些。因此可以选择更多核苷酸的合适替换。
根据本发明，术语“甲病毒”应广泛理解，并包括具有甲病毒特征的任何病毒颗粒。甲病毒的特征包括存在(+)链RNA，其编码适于在宿主细胞中复制的遗传信息，包括RNA聚合酶活性。许多甲病毒的更多特征描述于例如Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页中。术语“甲病毒”包括自然界发现的甲病毒，以及其任何变体或衍生物。在一些实施方案中，在自然界中未发现变体或衍生物。
在一个实施方案中，甲病毒是自然界发现的甲病毒。通常，自然界发现的甲病毒对任何一种或更多种真核生物(例如动物(包括脊椎动物如人，以及节肢动物如昆虫))是感染性的。
在自然界中发现的甲病毒优选选自：巴马森林病毒复合体(包括巴马森林病毒)；东部马脑炎复合体(包括七种抗原类型的东部马脑炎病毒)；米德尔堡病毒复合体(包括米德尔堡病毒)；恩杜穆(Ndumu)病毒复合体(包含恩杜穆病毒)；赛姆利基森林病毒复合体(包括Bebaru病毒、基孔肯雅病毒、Mayaro病毒及其亚型Una病毒、O′Nyong Nyong病毒及其亚型Igbo-Ora病毒、Ross River病毒及其亚型Bebaru病毒、Getah病毒、Sagiyama病毒、赛姆利基森林病毒及其亚型Me Tri病毒)；委内瑞拉马脑炎复合体(包括Cabassou病毒、Everglades病毒，Mosso das Pedras病毒、Mucambo病毒、Paramana病毒、Pixuna病毒、Rio Negro病毒、Trocara病毒及其亚型Bijou桥病毒、委内瑞拉马脑炎病毒)；西部马脑炎复合体(包括Aura病毒、Babanki病毒、Kyzylagach病毒、Sindbis病毒、Ockelbo病毒、Whataroa病毒、BuggyCreek病毒、Fort Morgan病毒、Highlands J病毒、西部马脑炎病毒)；和一些未分类的病毒，包括鲑鱼胰腺病毒；睡病病毒；南象海豹病毒；Tonate病毒。更优选地，甲病毒选自赛姆利基森林病毒复合体(包括如上所述的病毒类型，包括赛姆利基森林病毒)、西部马脑炎复合体(包括如上所述的病毒类型，包括辛德毕斯病毒)、东部马脑炎病毒(包括如上所述的病毒类型)、委内瑞拉马脑炎复合体(包括如上所述的病毒类型，包括委内瑞拉马脑炎病毒)。
在另一个优选实施方案中，甲病毒是赛姆利基森林病毒。在替代的另一个优选实施方案中，甲病毒是辛德毕斯病毒。在替代的另一个优选实施方案中，甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒。
在本发明的一些实施方案中，甲病毒不是自然界中发现的甲病毒。通常，在自然界中未发现的甲病毒是自然界中发现的甲病毒的变体或衍生物，其与自然界中发现的甲病毒的区别在于核苷酸序列(即基因组RNA)中的至少一个突变。与自然界中发现的甲病毒相比，核苷酸序列中的突变可以选自一个或更多个核苷酸的插入、替换或缺失。核苷酸序列中的突变可以与核苷酸序列编码的多肽或蛋白质中的突变相关或不相关。例如，在自然界中未发现的甲病毒可以是减毒的甲病毒。在自然界中未发现的减毒甲病毒是通常在其核苷酸序列中具有至少一个突变的甲病毒，通过该突变其与自然界中发现的甲病毒区分开，并且其根本不具有感染性，或者具有感染性但具有较低致病的能力或根本没有致病能力。作为示例性实例，TC83是区别于在自然界中发现的委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的减毒的甲病毒(McKinney等.，1963，Am.J.Trop.Med.Hyg.，1963，第12卷；第597-603页)。
甲病毒属的成员也可以基于其在人中的相对临床特征进行分类：主要与脑炎相关的甲病毒和主要与发热、皮疹和多关节炎相关的甲病毒。
术语“甲病毒的”意指在甲病毒中发现的，或例如通过基因工程起源于甲病毒的或衍生自甲病毒。
根据本发明，“SFV”代表赛姆利基森林病毒。根据本发明，“SIN”或“SINV”代表辛德毕斯病毒。根据本发明，“VEE”或“VEEV”代表委内瑞拉马脑炎病毒。
根据本发明，术语“甲病毒”指的是源自甲病毒的实体。为了说明，甲病毒的蛋白质可以指在甲病毒中发现的蛋白质和/或由甲病毒编码的蛋白质；甲病毒的核酸序列可以指在甲病毒中存在的核酸序列和/或由甲病毒编码的核酸序列。优选地，“甲病毒”的核酸序列指的是“甲病毒基因组”的核酸序列和/或“甲病毒的基因组RNA”的核酸序列。
根据本发明，术语“甲病毒RNA”指的是甲病毒基因组RNA(即(+)链)、甲病毒基因组RNA的互补序列(即(-)链)和亚基因组转录物(即(+)链)中的任何一个或更多个，或其任何片段。
根据本发明，“甲病毒基因组”是指甲病毒的基因组(+)链RNA。
根据本发明，术语“天然甲病毒序列”和类似术语通常指的是天然存在的甲病毒(自然界中发现的甲病毒)的(例如核酸)序列。在一些实施方案中，术语“天然甲病毒序列”还包括减毒甲病毒的序列。
根据本发明，术语“5’复制识别序列”优选指的是连续核酸序列，优选核糖核酸序列，其与甲病毒基因组的5’片段相同或同源。“5’复制识别序列”是可以被甲病毒复制酶识别的核酸序列。术语5’复制识别序列包括天然5’复制识别序列以及其功能等同物，例如自然界发现的甲病毒的5’复制识别序列的功能变体。根据本发明，功能等同物包括特征在于移除如本文中所述的至少一个起始密码子的5’复制识别序列的衍生物。5’复制识别序列是合成甲病毒基因组RNA的(-)链互补序列所必需的，并且是基于(-)链模板合成(+)链病毒基因组RNA所必需的。天然5’复制识别序列通常至少编码nsP1的N末端片段；但不包括编码nsP1234的整个开放阅读框。鉴于天然5’复制识别序列通常至少编码nsP1的N末端片段的事实，天然5’复制识别序列通常包含至少一个起始密码子，通常为AUG。在一个实施方案中，5’复制识别序列包含甲病毒基因组的保守序列元件1(CSE 1)或其变体和甲病毒基因组的保守序列元件2(CSE 2)或其变体。5’复制识别序列通常能够形成四个茎环(SL)，即SL1、SL2、SL3、SL4。这些茎环的编号开始于5’复制识别序列的5’末端。
根据本发明，术语“在甲病毒的5’末端”是指甲病毒的基因组的5’末端。甲病毒5’末端的核酸序列包括位于甲病毒基因组RNA的5’末端的核苷酸，加上任选的其他核苷酸的连续序列。在一个实施方案中，甲病毒的5’末端的核酸序列与甲病毒基因组的5’复制识别序列相同。
术语“保守序列元件”或“CSE”指的是在甲病毒RNA中发现的核苷酸序列。这些序列元件称为“保守的”，因为直系同源物存在于不同甲病毒的基因组中，并且不同甲病毒的直系同源CSE优选地共享高百分比的序列同一性和/或相似的二级或三级结构。术语CSE包括CSE 1、CSE 2、CSE 3和CSE 4。
根据本发明，术语“CSE 1”或“44-nt CSE”同义地指从(-)链模板合成(+)链所需的核苷酸序列。术语“CSE 1”指的是(+)链上的序列；CSE 1的互补序列(在(-)链上)起到用于(+)链合成的启动子的作用。优选地，术语CSE 1包括甲病毒基因组的最5’核苷酸。CSE 1通常形成保守的茎环结构。不希望受特定理论束缚，认为对于CSE 1，二级结构比一级结构即线性序列更重要。在模型甲病毒辛德毕斯病毒的基因组RNA中，CSE 1由44个核苷酸的连续序列组成，其由基因组RNA的最5’处44个核苷酸形成(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页)。
根据本发明，术语“CSE 2”或“51-nt CSE”同义地指从(+)链模板合成(-)链所需的核苷酸序列。(+)链模板通常是甲病毒基因组RNA或RNA复制子(注意，不包含CSE 2的亚基因组RNA转录物不起(-)链合成的模板的作用)。在甲病毒基因组RNA中，CSE 2通常位于nsP1的编码序列内。在模型甲病毒辛德毕斯病毒的基因组RNA中，51-nt CSE位于基因组RNA的核苷酸第155-205位(Frolov等，2001，RNA，第7卷，第1638-1651页)。CSE 2通常形成两个保守的茎环结构。这些茎环结构被称为茎环3(SL3)和茎环4(SL4)，因为它们分别是从甲病毒基因组RNA的5’末端开始计数的甲病毒基因组RNA的第三和第四保守茎环。不希望受特定理论束缚，认为对于CSE 2，二级结构比一级结构即线性序列更重要。
根据本发明，术语“CSE 3”或“连接序列”同义地指源自甲病毒基因组RNA并且包含亚基因组RNA的起始位点的核苷酸序列。(-)链中该序列的互补序列用于促进亚基因组RNA转录。在甲病毒基因组RNA中，CSE 3通常与编码nsP4的C末端片段的区域重叠，并延伸至位于编码结构蛋白的开放阅读框上游的短非编码区。根据Strauss&Strauss(Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页)，CSE 3的特征在于共有序列ACCUCUACGGCGGUCCUAAAUAGG(SEQ ID NO：1；共有连接序列(共有序列CSE 3)；加下划线的核苷酸代表亚基因组转录物的前五个核苷酸)。
在本发明的一个实施方案中，CSE 3由SEQ ID NO：1或其变体组成或包含SEQ IDNO：1或其变体，其中变体优选特征在于与SEQ ID NO：1的序列同一性程度为80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高。
根据本发明，术语“CSE 4”或“19-nt保守序列”或“19-nt CSE”同义地指来自甲病毒基因组RNA的核苷酸序列，紧邻甲病毒基因组的3’非翻译区中poly(A)序列的上游。CSE 4通常由19个连续核苷酸组成。不希望受特定理论束缚，CSE 4被理解作为起始(-)链合成的核心启动子起作用(José等，Future Microbiol.，2009，第4卷，第837-856页)；和/或CSE 4和甲病毒基因组RNA的poly(A)尾被理解为对进行有效的(-)链合成共同起作用(Hardy&Rice，J.Virol.，2005，第79卷，第4630-4639页)。
根据Strauss&Strauss，CSE 4的特征在于保守序列AUUUUGUUUUUAAUAUUUC(SEQ IDNO：2；19nt保守序列)。
在本发明的一个实施方案中，CSE 4由SEQ ID NO：2或其变体组成或包含SEQ IDNO：2或其变体，其中所述变体优选特征在于与SEQ ID NO：2的序列同一性程度为80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高。
根据本发明，术语“亚基因组启动子”或“SGP”指的是核酸序列(例如编码序列)的上游(5’)的核酸序列，其通过提供RNA聚合酶(通常是RNA依赖性RNA聚合酶，特别是功能性甲病毒非结构蛋白)的识别和结合位点来控制所述核酸序列的转录。SGP可以包括另外的因子的其他识别或结合位点。亚基因组启动子通常是正链RNA病毒(例如甲病毒)的遗传元件。甲病毒的亚基因组启动子是包含在病毒基因组RNA中的核酸序列。亚基因组启动子的特征通常在于它允许在存在RNA依赖性RNA聚合酶(例如功能性甲病毒非结构蛋白)的情况下启动转录(RNA合成)。RNA(-)链，即甲病毒基因组RNA的互补序列，用作合成(+)链亚基因组转录物的模板，并且(+)链亚基因组转录物的合成通常在亚基因组启动子处或附近启始。如本文中使用的术语“亚基因组启动子”不限于包含这样的亚基因组启动子的核酸中的任何特定定位。在一些实施方案中，SGP与CSE 3相同或与CSE 3重叠或包含CSE 3。
术语“亚基因组转录物”或“亚基因组RNA”同义地指使用RNA分子作为模板(“模板RNA”)转录获得的RNA分子，其中模板RNA包含控制亚基因组转录物转录的亚基因组启动子。亚基因组转录物可在存在RNA依赖性RNA聚合酶，特别是功能性甲病毒非结构蛋白的情况下获得。例如，术语“亚基因组转录物”可以指使用甲病毒基因组RNA的(-)链互补序列作为模板在由甲病毒感染的细胞中制备的RNA转录物。然而，本文中使用的术语“亚基因组转录物”不限于此，并且还包括通过使用异源RNA作为模板可获得的转录物。例如，也可通过使用根据本发明的含SGP的复制子的(-)链互补序列作为模板获得亚基因组转录物。因此，术语“亚基因组转录物”可以指通过转录甲病毒基因组RNA片段而获得的RNA分子，以及通过转录根据本发明的复制子片段可获得的RNA分子。
术语“自体的”用于描述源自相同对象的任何事物。例如，“自体细胞”是指衍生自相同对象的细胞。将自体细胞引入对象是有利的，因为这些细胞克服了原本会导致排斥的免疫屏障。
术语“同种异体的”用于描述源自相同物种的不同个体的任何物质。当位于一个或更多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个体彼此被称为是同种异体的。
术语“同源的”用于描述衍生自具有相同基因型的个体或组织的任何物质，即同一近交品系的相同双胞胎或动物，或其组织或细胞。
术语“异源的”用于描述由多种不同元素组成的事物。例如，将个体的细胞引入不同的个体中构成了异源移植物。异源基因是来源于对象以外来源的基因。
以下提供本发明的个体特征的具体和/或优选变体。本发明还构想了作为特别优选的实施方案的那些实施方案，其通过组合两个或更多个针对本发明的两个或更多个特征描述的特定和/或优选变体而产生。
RNA复制子
在第一方面中，本发明提供了包含5’复制识别序列的复制子，其中5’复制识别序列的特征在于其与天然甲病毒5’复制识别序列相比包含至少一个起始密码子的移除。复制子优选是RNA复制子。
根据本发明，特征在于与天然甲病毒5’复制识别序列相比其包含至少一个起始密码子的移除的5’复制识别序列在本文中可称为“经修饰的5’复制识别序列”或“根据本发明的5’复制识别序列”。如下文中所述，根据本发明的5’复制识别序列可任选地以存在一个或更多个另外的核苷酸变化为特征。
能够被复制酶(优选甲病毒复制酶)复制的核酸构建体被称为复制子。根据本发明，术语“复制子”定义了可以通过RNA依赖性RNA聚合酶复制的RNA分子，其在没有DNA中间体的情况下产生RNA复制子的一个或更多个相同或基本相同的拷贝。“没有DNA中间体”意指在形成RNA复制子拷贝的过程中没有形成复制子的脱氧核糖核酸(DNA)拷贝或互补序列，和/或在形成RNA复制子拷贝或其互补序列的过程中没有使用脱氧核糖核酸(DNA)分子作为模板。复制酶功能通常由功能性甲病毒非结构蛋白提供。
根据本发明，术语“可以被复制的”和“能够被复制的”通常描述可以制备的一个或更多个相同或基本相同的核酸拷贝。当与术语“复制酶”一起使用时，例如“能够被复制酶复制”时，术语“可以被复制”和“能够被复制”描述关于复制酶的核酸分子(例如RNA复制子)的功能特征。这些功能特征包括至少以下一种：(i)复制酶能够识别复制子和(ii)复制酶能够用作RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)。优选地，复制酶能够(i)识别复制子和(ii)用作RNA依赖性RNA聚合酶二者。
表述“能够识别”描述了复制酶能够与复制子物理缔合，并且优选地，复制酶能够与复制子结合，通常是非共价的。术语“结合”可以意指复制酶具有与保守序列元件1(CSE1)或其互补序列(如果由复制子包含)、保守序列元件2(CSE 2)或其互补序列(如果由复制子包含)、保守序列元件3(CSE 3)或其互补序列(如果由复制子包含)、保守序列元件4(CSE4)或其互补序列(如果由复制子包含))中的任何一个或更多个结合的能力。优选地，复制酶能够与CSE 2[即与(+)链]和/或与CSE 4[即与(+)链]结合，或与CSE 1的互补序列[即与(-)链]和/或与CSE 3的互补序列[即与(-)链]结合。
表述“能够用作RdRP”意指复制酶能够催化甲病毒基因组(+)链RNA的(-)链互补序列的合成，其中(+)链RNA具有模板功能，和/或复制酶能够催化(+)链甲病毒基因组RNA的合成，其中(-)链RNA具有模板功能。通常，表述“能够用作RdRP”还可以包括复制酶能够催化(+)链亚基因组转录物的合成，其中(-)链RNA具有模板功能，并且其中(+)链亚基因组转录物的合成通常在甲病毒亚基因组启动子处起始。
表述“能够结合”和“能够用作RdRP”指的是在正常生理条件下的能力。特别地，它们指的是细胞内的条件，其表达功能性甲病毒非结构蛋白或已经用编码功能性甲病毒非结构蛋白的核酸所转染。细胞优选是真核细胞。结合能力和/或用作RdRP的能力可以例如，在无细胞的体外系统或真核细胞中通过实验测试。任选地，所述真核细胞是来自其中代表复制酶起源的特定甲病毒是感染性的物种的细胞。例如，当使用对人具有感染性的来自特定甲病毒的甲病毒复制酶时，正常的生理条件是人细胞中的条件。更优选地，真核细胞(在一个实例中是人细胞)来自与代表复制酶起点的特定甲病毒对其是感染性的相同组织或器官。
根据本发明，“与天然甲病毒序列相比”和类似术语指的是为天然甲病毒序列的变体的序列。该变体通常本身不是天然甲病毒序列。
在一个实施方案中，RNA复制子包含3’复制识别序列。3’复制识别序列是可被功能性甲病毒非结构蛋白识别的核酸序列。换言之，功能性甲病毒非结构蛋白能够识别3’复制识别序列。优选地，3’复制识别序列位于复制子的3’末端(如果复制子不包含poly(A)尾)，或紧邻poly(A)尾的上游(如果复制子包含poly(A)尾)。在一个实施方案中，3’复制识别序列由CSE 4组成或包含CSE 4。
在一个实施方案中，5’复制识别序列和3’复制识别序列能够在存在功能性甲病毒非结构蛋白的情况下指导根据本发明的RNA复制子的复制。因此，当单独存在或优选一起存在时，这些识别序列指导RNA复制子在存在功能性甲病毒非结构蛋白的情况下的复制。
优选功能性甲病毒非结构蛋白以顺式(通过复制子上的开放阅读框编码为目的蛋白)或反式(通过在第二方面中描述的单独的复制酶构建体上的开放阅读框编码为目的蛋白)提供，其能够识别复制子的经修饰的5’复制识别序列和3’复制识别序列。在一个实施方案中，当3’复制识别序列对于衍生功能性甲病毒非结构蛋白的甲病毒是天然的，并且当经修饰的5’复制识别序列是5’复制识别序列的变体时，实现这一点。5’复制识别序列的变体对甲病毒而言是天然的，其中衍生出功能性甲病毒非结构蛋白。天然意味着这些序列的天然来源是相同的甲病毒。在一个替代的实施方案中，经修饰的5’复制识别序列和/或3’复制识别序列对于衍生功能性甲病毒非结构蛋白的甲病毒不是天然的，条件是功能性甲病毒非结构蛋白能够识别复制子的修饰的5’复制识别序列和3’复制识别序列二者。换言之，功能性甲病毒非结构蛋白与修饰的5’复制识别序列和3’复制识别序列相容。当非天然功能性甲病毒非结构蛋白能够识别各自序列或序列元件时，认为功能性甲病毒非结构蛋白是相容的(交叉病毒相容性)。分别具有功能性甲病毒非结构蛋白的(3’/5’)复制识别序列和CSE的任何组合都是可能的，只要存在交叉病毒相容性即可。通过将待测试的功能性甲病毒非结构蛋白与RNA一起孵育，其中RNA具有待测试的3’-和(任选经修饰的)5’复制识别序列，执行本发明的本领域技术人员在适合RNA复制的条件下(例如在合适的宿主细胞中)可以容易地测试交叉病毒相容性。如果发生复制，则确定(3’/5’)复制识别序列和功能性甲病毒非结构蛋白是相容的。
至少一个起始密码子的移除提供了优于现有技术反式复制子(例如，由图1的“模板RNA WT-RRS”表示)的若干优点。在编码nsP1*的核酸序列中不存在起始密码子通常会导致nsP1*(nsP1的N末端片段)不被翻译。此外，由于nsP1*未被翻译，编码目的蛋白(“转基因”)的开放阅读框是核糖体可接近的最上游开放阅读框；因此，当复制子存在于细胞中时，在编码目的基因的开放阅读框(RNA)的第一个AUG处开始翻译。这代表了优于现有技术反式复制子的优点，例如由Spuul等描述的那些(J.Virol.，2011，第85卷，第4739-4751页)：根据Spuul等的复制子指导nsP1(一种74个氨基酸的肽)的N-端部分的表达。从现有技术中还已知，从全长病毒基因组构建RNA复制子不是一件小事，因为某些突变可使得RNA不能被复制(WO 2000/053780 A2)，并且了甲病毒复制很重要的部分5’结构的移除影响复制效率(Kamrud等.，2010，J.Gen.Virol.，第91卷，第1723-1727页)。
相对于现有技术顺式复制子的优点是至少一个起始密码子的移除使甲病毒非结构蛋白的编码区与5’复制识别序列解偶联。这使得能够进一步改造顺式复制子，例如通过将天然5’复制识别序列交换为人工序列、突变序列或取自另一种RNA病毒的异源序列。现有技术顺式复制子中的这样的序列操作受nsP1的氨基酸序列的限制。任何点突变或点突变簇都需要实验评估复制是否受到影响，并且由于它们对蛋白质的不利影响，导致移码突变的小的插入或缺失是不可能的。
根据本发明的至少一个起始密码子的移除可以通过本领域已知的任何合适的方法实现。例如，编码本发明复制子的合适的DNA分子，即以移除起始密码子为特征，可以在计算机上设计，随后在体外合成(基因合成)；或者，可以通过编码复制子的DNA序列的定点诱变获得合适的DNA分子。在任何情况下，各自的DNA分子可以作为体外转录的模板，从而提供根据本发明的复制子。
与天然甲病毒5’复制识别序列相比，至少一个起始密码子的移除没有特别限制并且可以选自任何核苷酸修饰，包括一个或更多个核苷酸的替换(包括在DNA水平上，起始密码子的A和/或T和/或G的替换)；一个或更多个核苷酸的缺失(包括在DNA水平上，起始密码子的A和/或T和/或G的缺失)，以及一个或更多个核苷酸的插入(包括在DNA水平上在起始密码子的A和T之间和/或T和G之间一个或更多个核苷酸的插入)。无论核苷酸修饰是替换、插入还是缺失，核苷酸修饰都不能导致新的起始密码子的形成(作为实例的例子：在DNA水平，插入必须不是ATG的插入)。
通过至少一个起始密码子的移除(表征的RNA复制子的5’复制识别序列即根据本发明的经修饰的5’复制识别序列)优选是在自然界中存在的甲病毒的基因组的5’复制识别序列的变体。在一个实施方案中，根据本发明的经修饰的5’复制识别序列的特征优选在于与自然界中存在的至少一种甲病毒的基因组的5’复制识别序列的序列同一性程度为80％或更高、优选85％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高。
在一个实施方案中，特征在于至少一个起始密码子的移除的RNA复制子的5’复制识别序列包含与甲病毒的5’末端约250个核苷酸同源的序列，即在甲病毒基因组的5’末端处。在一个优选的实施方案中，它包含与甲病毒的5’末端处的约250至500，优选约300至500个核苷酸同源的序列，即在甲病毒基因组的5’末端处。“在甲病毒基因组的5’末端”意指从甲病毒基因组的最上游核苷酸开始并包括其的核酸序列。换言之，甲病毒基因组的最上游核苷酸被命名为核苷酸no.1，例如“甲病毒基因组5’末端的250个核苷酸”是指甲病毒基因组的1至250个核苷酸。在一个实施方案中，特征在于至少一个起始密码子的移除的RNA复制子的5’复制识别序列特征在于与在自然界中发现的至少一种甲病毒的基因组的5’末端至少250个核苷酸序列同一性程度为80％或更高、优选85％或更高、更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高。至少250个核苷酸包括例如250个核苷酸、300个核苷酸、400个核苷酸、500个核苷酸。
在自然界中发现的甲病毒的5’复制识别序列通常以至少一个起始密码子和/或保守的二级结构基序为特征。例如，塞姆利基森林病毒(SFV)的天然5’复制识别序列包含五个特异性AUG碱基三联体，对应于SEQ ID NO：4的DNA中的ATG碱基三联体(参见实施例1)。据Frolov等(2001，RNA，第7卷，第1638-1651页)通过MFOLD分析显示预测塞姆利基森林病毒的天然5’复制识别序列形成四个茎环(SL)，称为茎环1至4(SL1、SL2、SL3、SL4)。根据Frolov等，通过MFOLD分析显示预测不同的甲病毒、辛德毕斯病毒的天然5’复制识别序列也会形成四个茎环：SL1、SL2、SL3、SL4。在本发明的实施例1中，由两个用于RNA二级结构预测的网络服务器(http：//rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)(http：//unafold.rna.albany.edu/？q＝mfold)确认塞姆利基森林病毒的天然5’复制识别序列中预测的四个茎环的存在。
已知甲病毒基因组的5’末端包含能够通过功能性甲病毒非结构蛋白复制甲病毒基因组的序列元件。在本发明的一个实施方案中，RNA复制子的5’复制识别序列包含与甲病毒的保守序列元件1(CSE 1)同源的序列和/或与保守序列元件2(CSE 2)同源的序列。
甲病毒基因组RNA的保守序列元件2(CSE 2)通常由SL3和SL4表示，其前面是包含编码甲病毒非结构蛋白nsP1的第一个氨基酸残基的天然起始密码子的SL2。然而，在本说明书中，在一些实施方案中，甲病毒基因组RNA的保守序列元件2(CSE 2)指的是从SL2跨越到SL4并且包含编码甲病毒非结构蛋白nsP1的第一氨基酸残基的天然起始密码子的区域。在一个优选的实施方案中，RNA复制子包含CSE 2或与CSE 2同源的序列。在一个实施方案中，RNA复制子包含与CSE 2同源的序列，其优选特征在于与自然界中发现的的至少一种甲病毒的CSE 2序列的序列同一性程度为80％或更高、85％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高。
在一个优选的实施方案中，5’复制识别序列包含与甲病毒的CSE 2同源的序列。甲病毒的CSE 2可以包含来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框的片段。
因此，在一个优选的实施方案中，RNA复制子的特征在于其包含与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列。与非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列通常是天然存在的来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段的变体。在一个实施方案中，与非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列优选地特征在于与天然存在的至少一种甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段的序列同一性程度为80％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高。
在一个更优选的实施方案中，与本发明的复制子中包含的非结构蛋白的开放阅读框同源的序列不包含非结构蛋白的天然起始密码子，更优选不包含非结构蛋白的任何天然起始密码子。在一个优选的实施方案中，与CSE 2同源的序列的特征在于与天然甲病毒CSE2序列相比所有起始密码子的移除。因此，与CSE 2同源的序列优选不包含任何起始密码子。
当与开放阅读框同源的序列不包含任何起始密码子时，与开放阅读框同源的序列本身不是开放阅读框，因为其不用作翻译的模板。
在一个实施方案中，5′复制识别序列包含与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列，其中与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列的特征在于与天然甲病毒序列相比其包括至少一个起始密码子的移除。
在一个优选的实施方案中，与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列的特征在于其包括至少非结构蛋白的开放阅读框的天然起始密码子的移除。优选地，其特征在于其包括至少编码nsP1的开放阅读框的天然起始密码子的移除。
天然起始密码子是AUG碱基三联体，当宿主细胞中存在RNA时，宿主细胞中核糖体的翻译开始于此。换句话说，天然起始密码子是在核糖体蛋白质合成过程中翻译的第一个碱基三联体，如在已经用包含天然起始密码子的RNA接种的宿主细胞中。在一个实施方案中，宿主细胞是来自真核物种的细胞，所述真核物种是包含天然甲病毒5′复制识别序列的特定甲病毒的天然宿主。在一个优选的实施方案中，宿主细胞是来自细胞系“BHK21[C13](
Figure BDA0001807839270000391
CCL10TM)”的BHK21细胞，可从American Type Culture Collection，Manassas，Virginia，USA获得。
许多甲病毒的基因组已经完全测序并且可公开获得，并且由这些基因组编码的非结构蛋白的序列也可公开获得。此类序列信息允许在计算机中确定天然起始密码子。
为了说明，在实施例1中，描述了对应于SFV nsP1的天然起始密码子的DNA碱基三联体。
在一个实施方案中，天然起始密码子由Kozak序列或功能等同序列包含。Kozak序列是Kozak(1987，Nucleic Acids Res.，第15卷，第8125-8148页)最初描述的序列。mRNA分子上的Kozak序列被核糖体识别为翻译起始位点。根据该参考文献，Kozak序列包含AUG起始密码子，紧接着是高度保守的G核苷酸：AUGG(也参见根据SEQ ID NO：4的DNA序列中的起始密码子(实施例1))。特别地，该参考文献描述了Kozak序列可以通过(gcc)gccRccAUGG(SEOID NO：6)鉴定，如下：(i)小写字母表示位置处最常见的碱基，然而碱基可以变化；(ii)大写字母表示高度保守的碱基(例如′AUGG′)；(iii)′R′表示嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)；(iv)括号内的序列((gcc))具有不确定的重要性；(v)带下划线的AUG碱基三联体代表起始密码子。在本发明的一个实施方案中，与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列的特征在于其包括为Kozak序列的一部分的起始密码子的移除。
在本发明的一个实施方案中，复制子的5′复制识别序列的特征在于至少在RNA水平上为AUGG序列的一部分的那些起始密码子的移除。
在一个优选的实施方案中，与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列的特征在于其包括除了非结构蛋白的开放阅读框的天然起始密码子之外的一个或更多个起始密码子的移除。在一个更优选的实施方案中，所述核酸序列的另外特征在于天然起始密码子的移除。例如，除了天然起始密码子的移除之外，可以移除任意一个或两个或三个或四个或多于四个(例如五个)起始密码子。
如果复制子的特征在于非结构蛋白的开放阅读框的天然起始密码子的移除，以及任选地除了天然起始密码子之外的一个或更多个起始密码子的移除，则与开放阅读框同源的序列本身不是开放阅读框，因为其不用作翻译的模板。
优选地除了天然起始密码子的移除之外，除了天然起始密码子之外被移除一个或更多个起始密码子优选地选自具有启动翻译的潜力的AUG碱基三联体。具有启动翻译的潜力的AUG碱基三联体可称为“潜在起始密码子”。给定的AUG碱基三联体是否具有启动翻译的潜力可以在计算机中或在基于细胞的体外测定中确定。
在一个实施方案中，在计算机中确定给定的AUG碱基三联体是否具有启动翻译的潜力：在该实施方案中，检查核苷酸序列，并且如果它是AUGG序列的一部分，优选地是Kozak序列(SEO ID NO：6)的一部分，则确定AUG碱基三联体具有启动翻译的潜力。
在一个实施方案中，在基于细胞的体外测定中确定给定的AUG碱基三联体是否具有启动翻译的潜力：将RNA复制子引入到宿主细胞中，所述RNA复制子的特征在于天然起始密码子的移除且包含在天然起始密码子移除位置下游的给定AUG碱基三联体。在一个实施方案中，宿主细胞是来自真核物种的细胞，所述真核物种是包含天然甲病毒5′复制识别序列的特定甲病毒的天然宿主。在一个优选的实施方案中，宿主细胞是来自细胞系“BHK21[C13](
Figure BDA0001807839270000411
CCL10TM)”的BHK21细胞，可从American Type Culture Collection，Manassas，Virginia，USA获得。优选地在天然起始密码子移除位置和给定的AUG碱基三联体之间不存在另外的AUG碱基三联体。如果在将特征在于天然起始密码子的移除且包含给定AUG碱基三联体的RNA复制子转移到宿主细胞中之后，在给定的AUG碱基三联体处开始翻译，则确定给定的AUG碱基三联体具有启动翻译的潜力。是否启动翻译可以通过本领域已知的任何合适的方法确定。例如，复制子可以在给定的AUG碱基三联体的下游且与给定的AUG碱基三联体同框地编码有助于检测翻译产物(如果有的话)的标签，例如，myc-标签或HA-标签；可以例如通过Western印记确定具有编码的标签的表达产物是否存在。在该实施方案中，优选在给定的AUG碱基三联体和编码标签的核酸序列之间不存在另外的AUG碱基三联体。对于超过一个给定的AUG碱基三联体，可以分别进行基于细胞的体外测定：在每种情况下，优选在天然起始密码子移除位置和给定的AUG碱基三联体之间不存在另外的AUG碱基三联体。这可以通过移除在天然起始密码子移除位置和给定的AUG碱基三联体之间的所有AUG碱基三联体(如果有的话)来实现。因此，给定的AUG碱基三联体是天然起始密码子移除位置下游的第一个AUG碱基三联体。
优选地，根据本发明的复制子的特征在于在天然起始密码子移除位置下游并且位于甲病毒非结构蛋白或其片段的开放阅读框内的所有潜在起始密码子的移除。因此，根据本发明，5′复制识别序列优选不包含可翻译成蛋白质的开放阅读框。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的RNA复制子的5′复制识别序列的特征在于二级结构等同于甲病毒基因组RNA的5′复制识别序列的二级结构。在一个优选的实施方案中，根据本发明的RNA复制子的5′复制识别序列的特征在于预测的二级结构等同于甲病毒基因组RNA的5′复制识别序列的预测的二级结构。根据本发明，RNA分子的二级结构优选由用于RNA二级结构预测的网络服务器http：//rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html预测。
通过比较以与天然甲病毒5′复制识别序列相比至少一个起始密码子的移除为特征的RNA复制子的5′复制识别序列的二级结构或预测的二级结构，可以确定核苷酸配对破坏的存在或不存在。例如，与天然甲病毒5′复制识别序列相比，在给定位置可能不存在至少一个碱基对，例如茎环内，特别是茎环的茎内的碱基对。
在一个优选的实施方案中，5′复制识别序列的一个或更多个茎环未缺失或破坏。更优选地，茎环3和4未缺失或破坏。更优选地，5′复制识别序列没有茎环缺失或破坏。
在一个实施方案中，至少一个起始密码子的移除不破坏5′复制识别序列的二级结构。在一个可替选实施方案中，至少一个起始密码子的移除确实破坏了5′复制识别序列的二级结构。在该实施方案中，至少一个起始密码子的移除可能是与天然甲病毒5′复制识别序列相比给定位置的至少一个碱基对(例如茎环内的碱基对)不存在的原因。如果与天然甲病毒5′复制识别序列相比给定位置碱基对不存在，则确定至少一个起始密码子的移除在茎环内引入了核苷酸配对破坏。茎环内的碱基对通常是茎环的茎中的碱基对。
在一个优选的实施方案中，RNA复制子包含一个或更多个核苷酸变化，补偿通过至少一个起始密码子的移除引入的一个或更多个茎环内的核苷酸配对破坏。
如果与天然甲病毒5′复制识别序列相比至少一个起始密码子的移除在茎环内引入了核苷酸配对破坏，则可以引入预期补偿核苷酸配对破坏的一个或更多个核苷酸变化兵器由此获得的二级结构或预测的二级结构可以与天然甲病毒5′复制识别序列进行比较。
基于普通一般常识和本文的公开内容，技术人员可以预期某些核苷酸变化以补偿核苷酸配对破坏。例如，如果以与天然甲病毒5′复制识别序列相比至少一个起始密码子的移除为特征的RNA复制子的给定5′复制识别序列的二级结构或预测的二级结构的给定位置处的碱基对被破坏，则预期恢复该位置处的碱基对且优选地不重新引入起始密码子的核苷酸变化以补偿核苷酸配对破坏。在一个实例中，包含补偿通过至少一个起始密码子的移除在一个或更多个茎环内引入的核苷酸配对破坏的一个或更多个核苷酸变化的复制子的5′复制识别序列由SEQ ID NO：5(实施例1)表示的DNA序列编码。
在一个优选的实施方案中，复制子的5′复制识别序列不与可翻译核酸序列(即可翻译成肽或蛋白质，特别是nsP，特别是nsP1，或其任一者的片段)重叠或不包含所述可翻译核酸序列。对于“可翻译的”核苷酸序列，需要存在起始密码子；起始密码子编码肽或蛋白质的大多数N-端氨基酸残基。在一个实施方案中，复制子的5′复制识别序列不与编码nsP1的N末端片段的可翻译核酸序列重叠或不包含所述可翻译核酸序列。
在下文详细描述的一些情况中，RNA复制子包含至少一个亚基因组启动子。在一个优选的实施方案中，复制子的亚基因组启动子不与可翻译核酸序列(即可翻译成肽或蛋白质，特别是nsP，特别是nsP1，或其任一者的片段)重叠或不包含所述可翻译核酸序列。在一个实施方案中，复制子的亚基因组启动子不与编码nsP4的C末端片段的可翻译核酸序列重叠或不包含所述可翻译核酸序列。具有不与可翻译核酸序列(例如，翻译成nsP4的C末端片段)重叠或不包含所述可翻译核酸序列的亚基因组启动子的RNA复制子可通过使nsP4的编码序列的一部分(通常是编码nsP4的N端部分的部分)缺失和/或通过移除nsP4的编码序列中未缺失部分的AUG碱基三联体来产生。如果移除了nsP4的编码序列或其一部分中的AUG碱基三联体，则移除的AUG碱基三联体优选是潜在起始密码子。或者，如果亚基因组启动子不与编码nsP4的核酸序列重叠，则可以使编码nsP4的整个核酸序列缺失。
在一个实施方案中，RNA复制子不包含编码截短的甲病毒非结构蛋白的开放阅读框。在该实施方案的情况下，特别优选地RNA复制子不包含编码nsP1的N末端片段的开放阅读框，并且任选地不包含编码nsP4的C末端片段的开放阅读框。nsP1的N-端片段是截短的甲病毒蛋白；nsP4的C末端片段也是截短的甲病毒蛋白。
在一些实施方案中，根据本发明的复制子不包含甲病毒基因组的5′末端的茎环2(SL2)。根据Frolov等人(同上)，茎环2是发现于甲病毒基因组的5′末端的在CSE 2上游但对于复制非必要的保守二级结构。
在一个实施方案中，复制子的5′复制识别序列不与编码甲病毒非结构蛋白或其片段的核酸序列重叠。因此，本发明包括这样的复制子，所述复制子的特征在于与基因组甲病毒RNA相比，如本文所述至少一个起始密码子的移除，任选地还在于一个或更多个甲病毒非结构蛋白的编码区域或其一部分的缺失。例如，nsP2和nsP3的编码区域可以缺失，或者nsP2和nsP3的编码区域可以缺失且nsP1的C-端片段的编码区域和/或nsP4的N-端片段的编码区域缺失，并且一个或更多个剩余(即在所述移除后剩余)的起始密码子可以如本文所述移除。
一个或更多个甲病毒非结构蛋白的编码区的缺失可以通过标准方法实现，例如在DNA水平，通过限制酶的帮助切除，优选识别开放阅读框中的独特限制性位点的限制酶(例如：见实施例1)。任选地，可以通过诱变(例如定点诱变)将独特限制性位点引入到开放阅读框中。相应的DNA可以用作体外转录的模板。
限制性位点是核酸序列，例如DNA序列，其对于指导特定的限制酶限制(切割)包含限制性位点的核酸分子(例如DNA分子)是必要和充分的。如果核酸分子中存在一个拷贝的限制性位点，则限制性位点对于给定的核酸分子是独特的。
限制酶是在限制性位点处或附近切割核酸分子(例如DNA分子)的核酸内切酶。
或者，可以通过合成方法获得以部分或全部开放阅读框的缺失为特征的核酸序列。
根据本发明的RNA复制子优选是单链RNA分子。根据本发明的RNA复制子通常是(+)链RNA分子。在一个实施方案中，本发明的RNA复制子是分离的核酸分子。
复制子包含至少一个开放阅读框
在一个实施方案中，根据本发明的RNA复制子包含编码目的肽或目的蛋白的至少一个开放阅读框。优选地，目的蛋白由异源核酸序列编码。编码目的肽或蛋白质的基因同义地称为“目的基因”或“转基因”。在多个实施方案中，目的肽或蛋白质由异源核酸序列编码。根据本发明，术语“异源”是指核酸序列不是天然地在功能上或结构上与甲病毒核酸序列连接的事实。
根据本发明的复制子可以编码单个多肽或多个多肽。多个多肽可以编码为单个多肽(融合多肽)或分开的多肽。在一些实施方案中，根据本发明的复制子可包含超过一个的开放阅读框，每个开放阅读框可独立地选择为是否在亚基因组启动子的控制下。或者，多聚蛋白或融合多肽包含通过任选的自催化蛋白酶切割位点(例如口蹄疫病毒2A蛋白)或内含肽分开的个体多肽。
目的的蛋白质可例如选自报告蛋白、药学活性肽或蛋白质、细胞内干扰素(IFN)信号传导抑制剂和功能性甲病毒非结构蛋白。
报告蛋白
在一个实施方案中，开放阅读框编码报告蛋白。在该实施方案中，开放阅读框包含报告基因。可以选择某些基因作为报告基因，因为它们赋予表达它们的细胞或生物的特征可以容易地鉴定和测量，或者因为它们是可选择的标记。报告基因通常用作指示某种基因是否被细胞或生物群体吸收或表达。优选地，报告基因的表达产物是视觉上可检测的。常见的视觉可检测的报告蛋白通常具有荧光或发光蛋白。特定报告基因的实例包括编码以下的基因：水母绿色荧光蛋白(GFP)，其导致表达它的细胞在蓝光下发出绿光；酶荧光素酶，其催化与荧光素反应产生光；以及红色荧光蛋白(RFP)。任何这些特定报道基因的变体都是可能的，只要该变体具有视觉上可检测的特性即可。例如，eGFP是GFP的点突变体变体。报告蛋白实施方案特别适用于测试表达，参见例如实施例2至5。
药学活性肽或蛋白质
根据本发明，在一个实施方案中，复制子的RNA包含药学活性RNA或由药学活性RNA组成。“药物活性RNA”可以是编码药学活性肽或蛋白质的RNA。优选地，根据本发明的RNA复制子编码药学活性肽或蛋白质。优选地，开放阅读框编码药学活性肽或蛋白质。优选地，RNA复制子包含编码药学活性肽或蛋白质的开放阅读框，任选地在亚基因组启动子的控制下。
当以治疗有效量施用于对象时，“药学活性肽或蛋白质”对对象的病症或疾病状态具有积极或有利的作用。优选地，药学活性肽或蛋白质具有治疗或缓解性质，并且可以施用以改善、减轻、缓解、逆转疾病或病症的一种或更多种症状，延迟其发作或减轻其严重性。药学活性肽或蛋白质可具有预防性质，并且可以用于延迟疾病的发作或减轻这种疾病或病理状况的严重性。术语“药学活性肽或蛋白质”包括完整蛋白质或多肽，并且还可以指其药学活性片段。其还可以包括肽或蛋白质的药学活性类似物。术语“药学活性肽或蛋白质”包括作为抗原的肽和蛋白质，即肽或蛋白质在对象中引发免疫应答，其可以是治疗性的或部分或完全保护性的。
在一个实施方案中，药学活性肽或蛋白质是或包含免疫活性化合物或抗原或表位。
根据本发明，术语“免疫活性化合物”涉及改变免疫应答的任何化合物，优选通过诱导和/或抑制免疫细胞的成熟，诱导和/或抑制细胞因子生物合成，和/或通过刺激B细胞的抗体产生而改变体液免疫来改变。在一个实施方案中，免疫应答涉及刺激抗体应答(通常包括免疫球蛋白G(IgG))。免疫活性化合物具有强力的免疫刺激活性，包括但不限于抗病毒和抗肿瘤活性，并且还可以下调免疫应答的其他方面，例如使免疫应答离开TH2免疫应答，这对于治疗大量TH2介导的疾病是有用的。
根据本发明，术语“抗原”或“免疫原”涵盖引发免疫应答的任何物质。特别地，“抗原”涉及与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应的任何物质。根据本发明，术语“抗原”包括包含至少一个表位的任何分子。优选地，在本发明的上下文中的抗原是任选地在加工后诱导免疫反应的分子，所述免疫反应优选是抗原特异的。根据本发明，可以使用任何合适的抗原，其是免疫反应的候选物，其中免疫反应可以是体液免疫反应也可以是细胞免疫反应。在本发明实施方案的上下文中，在MHC分子的情况下，抗原优选由细胞，优选由抗原呈递细胞呈递，其导致针对抗原的免疫反应。抗原优选是对应于或衍生自天然存在的抗原的产物。这些天然存在的抗原可以包括或可以衍生自变应原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他感染因子和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本发明，抗原可以对应于天然存在的产物，例如病毒蛋白或其部分。在一个优选的实施方案中，抗原是表面多肽，即是在细胞、病原体、细菌、病毒、真菌、寄生虫、变应原或肿瘤的表面上天然展示的抗原。抗原可以引发针对细胞、病原体、细菌、病毒、真菌、寄生虫、变应原或肿瘤的免疫应答。
术语“病原体”是指能够在生物体，优选在脊椎动物生物体中引起疾病的致病生物材料。病原体包括微生物，如细菌、单细胞真核生物(原生动物)、真菌，以及病毒。
术语“表位”、“抗原肽”、“抗原表位”、“免疫原性肽”和“MHC结合肽”在本文中可互换使用，并且指分子(如抗原)中的抗原决定簇，即，免疫活性化合物的被免疫系统识别，例如被T细胞识别的部分或片段，特别是当在MHC分子的情况下呈递时。蛋白质的表位优选包含所述蛋白质的连续的或不连续的部分，并且优选长度为5至100，优选5至50，更优选8至30，最优选10至25个氨基酸，例如，表位的长度可以优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。根据本发明，表位可以与MHC分子，例如细胞表面上的MHC分子结合，因此可以是“MHC结合肽”或“抗原肽”。术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白质或分子对于免疫反应中淋巴细胞和抗原呈递细胞或患病细胞之间的信号传导是重要的，其中MHC蛋白质或分子结合肽并呈递它们以供T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如入侵微生物的片段)展示给T细胞。优选的此类免疫原性部分与MHC I类或II类分子结合。如本文所用，如果使用本领域已知的任何测定法检测到这种结合，则称免疫原性部分与MHC I类或II类分子“结合”。术语“MHC结合肽”涉及与MHC I类和/或MHC II类分子结合的肽。在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽的长度通常为8-10个氨基酸，尽管更长或更短的肽也可能是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽的长度通常为10-25个氨基酸，特别地长度为13-18个氨基酸，而更长和更短的肽也可能是有效的。
在一个实施方案中，根据本发明的目的蛋白包含适于靶生物的疫苗接种的表位。本领域技术人员知道，免疫生物学和疫苗接种的原理之一是基于以下事实：通过用与待治疗疾病在免疫学上相关抗原来免疫生物体，产生了免疫保护反应。根据本发明，抗原选自自身抗原和非自身抗原。非自身抗原优选为细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、变应原或寄生虫抗原。优选地，抗原包含能够在靶生物体中引发免疫应答的表位。例如，表位可以引发针对细菌、病毒、真菌、寄生虫、变应原或肿瘤的免疫应答。
在一些实施方案中，非自身抗原是细菌抗原。在一些实施方案中，抗原引发针对感染动物的细菌的免疫应答，所述动物包括鸟类、鱼类和哺乳动物，包括家养动物。优选地，引发针对其的免疫应答的细菌是致病细菌。
在一些实施方案中，非自身抗原是病毒抗原。病毒抗原可以是例如来自病毒表面蛋白的肽，例如衣壳多肽或刺突多肽。在一些实施方案中，抗原引发针对感染动物的病毒的免疫应答，所述动物包括鸟类、鱼类和哺乳动物，包括家养动物。优选地，引发针对其的免疫应答的病毒是致病病毒。
在一些实施方案中，非自身抗原是来自真菌的多肽或蛋白质。在一些实施方案中，抗原引发针对感染动物的真菌的免疫应答，所述动物包括鸟类、鱼类和哺乳动物，包括家养动物。优选地，引发针对其的免疫应答的真菌是致病真菌。
在一些实施方案中，非自身抗原是来自单细胞真核寄生虫的多肽或蛋白质。在一些实施方案中，抗原引发针对单细胞真核寄生虫，优选针对致病性单细胞真核寄生虫的免疫应答。致病性单细胞真核寄生虫可例如来自疟原虫(Plasmodium)属，例如恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)或卵形疟原虫(P.ovale)，来自利什曼原虫(Leishmania)属，或来自锥虫(Trypanosoma)属，例如克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)或布氏锥虫(T.brucei)。
在一些实施方案中，非自身抗原是变应原多肽或变应原蛋白。变应原蛋白或变应原多肽适用于变应原免疫治疗(也称为脱敏)。
在一些实施方案中，抗原是自身抗原，特别是肿瘤抗原。肿瘤抗原及其测定是本领域技术人员已知的。
在本发明的上下文中，术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”涉及在正常条件下在有限数量的组织和/或器官中或在特定发育阶段中特异性表达的蛋白质，例如，肿瘤抗原可以在正常条件下在胃组织(优选在胃粘膜)中，在生殖器官(例如在睾丸)中，在滋养细胞组织(例如在胎盘)中，或在种系细胞中特异性表达，并且在一种或更多种肿瘤或癌症组织中表达或异常表达。在本文中，“有限数量”优选表示不超过3个，更优选不超过2个。本发明上下文中的肿瘤抗原包括，例如：分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗原，即，在正常条件下在特定分化阶段特定细胞类型中特异性表达的蛋白质；癌症/睾丸抗原，即在正常条件下在睾丸和有时在胎盘中特异性表达的蛋白质；和种系特异性抗原。在本发明的上下文中，肿瘤抗原优选与癌细胞的细胞表面缔合，并且优选正常组织中不表达或仅很少表达。优选地，肿瘤抗原或肿瘤抗原的异常表达鉴定癌细胞。在本发明的上下文中，由对象(例如患有癌症疾病的患者)中的癌细胞表达的肿瘤抗原优选是所述对象中的自身蛋白。在一些优选的实施方案中，本发明上下文中的肿瘤抗原在正常条件下在非必需的组织或器官中(即在被免疫系统损伤时不会导致对象死亡的组织或器官)或在免疫系统无法或几乎无法进入的身体器官或结构中特异性表达。优选地，在正常组织中表达的肿瘤抗原和在癌组织中表达的肿瘤抗原之间，肿瘤抗原的氨基酸序列相同。
可用于本发明的肿瘤抗原的实例是p53、ART-4、BAGE、β-连环蛋白/m、Bcr-abLCAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA，封闭蛋白家族的细胞表面蛋白，如CLAUDIN-6、CLAUDIN-18.2和CLAUDIN-12，c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT(或hTRT)、LAGE、LDLR/FUT，MAGE-A，优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、-2、-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、p190 minor BCR-abL、Pm1/RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE和WT。特别优选的肿瘤抗原包括CLAUDIN-18.2(CLDN18.2)和CLAUDIN-6(CLDN6)。
在一些实施方案中，不要求药学活性肽或蛋白质是引发免疫应答的抗原。合适的药学活性蛋白质或肽可选自以下：细胞因子和免疫系统蛋白质，例如免疫活性化合物(例如白细胞介素、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素、整合素、地址素、选择素、归巢受体、T细胞受体、免疫球蛋白)、激素(胰岛素、甲状腺激素、儿茶酚胺、促性腺激素、营养激素、催乳素、催产素、多巴胺、牛生长激素、瘦素等)、生长激素(例如人生长激素)、生长因子(例如表皮生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子等)、生长因子受体、酶(组织纤溶酶原激活物、链激酶、胆固醇生物合成或降解、类固醇激素合成酶、激酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、去甲基化酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、芳香酶、细胞色素、腺苷酸或鸟苷酸环化酶、神经酰胺酶等)、受体(类固醇激素受体、肽受体)、结合蛋白(生长激素或生长因子结合蛋白等)、转录和翻译因子、抑制肿瘤生长的蛋白质(如抑制血管生成的蛋白质)、结构蛋白质(如胶原蛋白、丝心蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白)、血液蛋白(凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、胰岛素、因子IX、因子X、组织纤溶酶原激活物、蛋白质C、von Wilebrand因子、抗凝血酶III、葡糖脑苷脂酶、促红细胞生成素粒细胞集落刺激因子(GCSF)或修饰的因子VIII、抗凝血剂等。在一个实施方案中、根据本发明的药物活性蛋白质是参与调节淋巴样体内稳态的细胞因子，优选参与并优选诱导或增强T细胞的发育、引发、扩增、分化和/或存活的细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子是白细胞介素，例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21。
干扰素(IFN)信号传导的抑制剂
由开放阅读框编码的另一种合适的目的蛋白是干扰素(IFN)信号传导的抑制剂。虽然已经报道了可以降低已经引入RNA用于表达的细胞的活力，特别是如果用RNA转染细胞多次，发现IFN抑制剂增强RNA在其中表达的细胞活力(WO 2014/071963 A1)。优选地，抑制剂是IFN I型信号传导的抑制剂。通过阻止IFN受体被细胞外IFN结合并抑制细胞内的细胞内IFN信号传导，使得可以在细胞中稳定表达RNA。或者或另外，阻止IFN受体被细胞外IFN结合并抑制细胞内IFN信号传导增强了细胞的存活，特别是如果细胞用RNA重复转染。不希望受理论束缚，设想细胞内IFN信号传导可导致翻译和/或RNA降解的抑制。这可以通过抑制一种或更多种IFN诱导型抗病毒活性效应蛋白来解决。IFN诱导型抗病毒活性效应蛋白可选自RNA依赖性蛋白激酶(PKR)、2′，5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)和RNaseL。抑制细胞内IFN信号传导可包括抑制PKR依赖性途径和/或OAS依赖性途径。合适的目的蛋白是能够抑制PKR依赖性途径和/或OAS依赖性途径的蛋白质。抑制PKR依赖性途径可包括抑制eIF2-α磷酸化。抑制PKR可包括用至少一种PKR抑制剂处理细胞。PKR抑制剂可以是PKR的病毒抑制剂。PKR的优选的病毒抑制剂是痘苗病毒E3。如果用肽或蛋白质(例如E3、K3)抑制细胞内IFN信号传导，则优选肽或蛋白质的细胞内表达。痘苗病毒E3是25kDa dsRNA结合蛋白(由基因E3L编码)，其结合并隔离dsRNA以阻止PKR和OAS的活化。E3可以直接结合PKR并抑制其活性，导致eIF2-α的磷酸化降低。其他合适的IFN信号传导抑制剂是单纯疱疹病毒ICP34.5、托斯卡纳病毒NSs、家蚕核多角体病毒PK2和HCV NS34A。
IFN信号传导的抑制剂可以以编码IFN信号传导的抑制剂的核酸序列(例如RNA)的形式提供给细胞。
在一个实施方案中，细胞内或细胞外IFN信号传导的抑制剂由mRNA分子编码。该mRNA分子可包含如本文所述的非多肽序列修饰之修饰，例如帽、5′-UTR、3′-UTR、poly(A)序列、密码子使用的调整。代表性实施方案在例如实施例3中示出。
在另一个实施方案中，细胞内或细胞外IFN信号传导的抑制剂由复制子编码，优选如本文所述的反式复制子(trans-replicon或trans-replicon)。复制子包含允许通过甲病毒复制酶复制的核酸序列元件，通常是CSE1、CSE2和CSE4；优选地，还包含允许产生亚基因组转录物的核酸序列元件，即亚基因组启动子，通常包含CSE 3。复制子还可包含一个或更多个如本文所述的非多肽序列修饰之修饰，例如帽、poly(A)序列、密码子使用的调整。如果复制子上存在多个开放阅读框，则细胞内IFN信号传导的抑制剂可以由它们中的任何一个编码，任选地在亚基因组启动子的控制下或未在其控制下。在一个优选的实施方案中，细胞内IFN信号传导的抑制剂由RNA复制子的最上游开放阅读框编码。当细胞内IFN信号传导的抑制剂由RNA复制子的最上游开放阅读框编码时，编码细胞内IFN信号传导抑制剂的遗传信息将在将RNA复制子导入宿主细胞后早期翻译，并且所得到的蛋白质随后可抑制细胞内IFN信号传导。
功能性甲病毒非结构蛋白
由开放阅读框编码的另一种合适的目的蛋白是功能性甲病毒非结构蛋白。术语“甲病毒非结构蛋白”包括每一种和每种共翻译或翻译后修饰形式，包括碳水化合物修饰的(例如糖基化的)和脂质修饰形式的甲病毒非结构蛋白。
在一些实施方案中，术语“甲病毒非结构蛋白”是指甲病毒来源的单个非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)中的任何一种或更多种，或包含多于一种甲病毒来源的非结构蛋白的多肽序列的多聚蛋白。在一些实施方案中，“甲病毒非结构蛋白”是指nsP123和/或nsP4。在另一些实施方案中，“甲病毒非结构蛋白”是指nsP1234。在一个实施方案中，由开放阅读框编码的目的蛋白由nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的全部组成，作为一个单一的任选可切割的多聚蛋白：nsP1234。在一个实施方案中，由开放阅读框编码的目的蛋白由nsP1、nsP2和nsP3组成，作为一个单一的任选可切割的多聚蛋白：nsP123。在该实施方案中，nsP4可以是另外的目的蛋白，并且可以由另外的开放阅读框编码。
在一些实施方案中，甲病毒非结构蛋白能够形成复合物或缔合物，例如，在宿主细胞中。在一些实施方案中，“甲病毒非结构蛋白”是指nsP123(同义词P123)和nsP4的复合物或缔合物。在一些实施方案中，“甲病毒非结构蛋白”是指nsP1、nsP2和nsP3的复合物或缔合物。在一些实施方案中，“甲病毒非结构蛋白”是指nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的复合物或缔合物。在一些实施方案中，“甲病毒非结构蛋白”是指选自nsP1、nsP2、nsP3和nsP4中的任何一种或更多种的复合物或缔合物。在一些实施方案中，甲病毒非结构蛋白至少包含nsP4。
术语“复合物”或“缔合物”是指在空间上接近的两种或更多种相同或不同的蛋白质分子。复合物的蛋白质优选彼此直接或间接物理或物理化学接触。复合物或缔合物可以由多种不同的蛋白质(异多聚体)和/或一种特定蛋白质的多拷贝(同多聚体)组成。在甲病毒非结构蛋白的情况下，术语“复合物或缔合物”描述了多种至少两种蛋白质分子，其中至少一种是甲病毒非结构蛋白。复合物或缔合物可以由一种特定蛋白质的多拷贝(同多聚体)和/或多种不同蛋白质(异多聚体)组成。在多聚体的情况下，“多”意指多于一个，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个。
术语“功能性甲病毒非结构蛋白”包括具有复制酶功能的甲病毒非结构蛋白。因此，“功能性甲病毒非结构蛋白”包括甲病毒复制酶。“复制酶功能”包括RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的功能，即能够基于(+)链RNA模板催化合成(-)链RNA和/或能够基于(-)链RNA模板催化合成(+)链RNA的酶。因此，术语“功能性甲病毒非结构蛋白”可以指使用(+)链(例如基因组)RNA作为模板合成(-)链RNA的蛋白质或复合物，使用基因组RNA的(-)链互补链作为模板合成新的(+)链RNA的蛋白质或复合物，和/或使用基因组RNA的(-)链互补链的片段作为模板合成亚基因组转录物的蛋白质或复合物。功能性甲病毒非结构蛋白可额外具有一种或更多种另外的功能，例如，蛋白酶(用于自切割)、解旋酶、末端腺苷酰转移酶(用于poly(A)尾添加)、甲基转移酶和鸟苷酸转移酶(用于提供具有5′帽的核酸)、核定位位点、三磷酸酶(Gould等，2010，Antiviral Res.，第87卷，第111-124页；Rupp等，2015，J.Gen.Virol.，第96卷，第2483-500页)。
根据本发明，术语“甲病毒复制酶”是指甲病毒RNA依赖性RNA聚合酶，包括来自天然存在的甲病毒(自然界中发现的甲病毒)的RNA依赖性RNA聚合酶和来自甲病毒的变体或衍生物(例如减毒的甲病毒)的RNA依赖性RNA聚合酶。在本发明的上下文中，术语“复制酶”和“甲病毒复制酶”可互换使用，除非上下文规定任何特定的复制酶不是甲病毒复制酶。
术语“复制酶”包括由甲病毒感染的细胞表达或由已经用编码甲病毒复制酶的核酸转染的细胞表达的甲病毒复制酶的所有变体，特别是翻译后修饰的变体、构象、同种型和同源物。此外，术语“复制酶”包括通过重组方法产生或可以产生的所有形式的复制酶。例如，可以通过重组方法产生包含有助于在实验室中检测和/或纯化复制酶的标签(例如myc标签、HA标签或寡组氨酸标签(His标签))的复制酶。
任选地，甲病毒复制酶另外在功能上通过与以下中的任意一种或更多种结合的能力限定：甲病毒保守序列元件1(CSE 1)或其互补序列，保守序列元件2(CSE 2)或其互补序列，保守序列元件3(CSE 3)或其互补序列，保守序列元件4(CSE 4)或其互补序列。优选地，复制酶能够与CSE 2[即(+)链]和/或CSE 4[即(+)链]结合，或与CSE 1的互补链[即到(-)链]和/或到CSE 3的互补链[即到(-)链]结合。
复制酶的来源不限于任何特定的甲病毒。在一个优选的实施方案中，甲病毒复制酶包含来自塞姆利基森林病毒的非结构蛋白，包括天然存在的塞姆利基森林病毒和塞姆利基森林病毒的变体或衍生物，例如减毒的塞姆利基森林病毒。在另一个优选的实施方案中，甲病毒复制酶包含来自辛德毕斯病毒(Sindbis virus)的非结构蛋白，包括天然存在的辛德毕斯病毒和辛德毕斯病毒的变体或衍生物，例如减毒的辛德毕斯病毒。在另一个优选的实施方案中，甲病毒复制酶包含来自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的非结构蛋白，包括天然存在的VEEV和VEEV的变体或衍生物，例如减毒的VEEV。在另一个优选的实施方案中，甲病毒复制酶包含来自基孔肯雅病毒(CHIKV)的非结构蛋白，包括天然存在的CHIKV和CHIKV的变体或衍生物，例如减毒的CHIKV。
复制酶还可以包含来自多于一种甲病毒的非结构蛋白。因此，包含甲病毒非结构蛋白且具有复制酶功能的异复合物或缔合物同样包含在本发明中。仅用于说明性目的，复制酶可包含来自第一甲病毒的一种或更多种非结构蛋白(例如nsP1、nsP2)和来自第二甲病毒的一种或更多种非结构蛋白(nsP3、nsP4)。来自多于一种不同甲病毒的非结构蛋白可以通过独立的开放阅读框编码，或者可以通过单个开放阅读框编码为多聚蛋白，例如nsP1234。
在一些实施方案中，功能性甲病毒非结构蛋白能够在其中表达功能性甲病毒非结构蛋白的细胞中形成膜复制复合物和/或液泡。
如果功能性甲病毒非结构蛋白，即具有复制酶功能的甲病毒非结构蛋白由根据本发明的核酸分子编码，则优选地复制子的亚基因组启动子(如果存在的话)与所述复制酶相容。在该上下文中相容意味着甲病毒复制酶能够识别亚基因组启动子(如果存在的话)。在一个实施方案中，当亚基因组启动子对于作为得到复制酶的甲病毒是天然的，即这些序列的天然来源是相同的甲病毒时，实现了这一点。在一个替代实施方案中，亚基因组启动子对于得到甲病毒复制酶的甲病毒不是天然的，条件是甲病毒复制酶能够识别亚基因组启动子。换句话说，复制酶与亚基因组启动子相容(交叉病毒相容性)。涉及来源于不同甲病毒的亚基因组启动子和复制酶的交叉病毒相容性的实例是本领域已知的。只要存在交叉病毒相容性，亚基因启动子和复制酶的任何组合都是可能的。本发明的技术人员可以通过在适合于从亚基因组启动子合成RNA的条件下将待测试的复制酶与RNA一起孵育来容易地测试交叉病毒的相容性，其中RNA具有待测试的亚基因组启动子。如果制备了亚基因组转录物，则确定亚基因组启动子和复制酶是相容的。已知交叉病毒相容性的多个实例(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页综述)。
在一个实施方案中，甲病毒非结构蛋白不编码为具有异源蛋白的融合蛋白，例如，泛素。
在本发明中，编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框可以在RNA复制子上提供，或者可以作为独立的核酸分子(例如mRNA分子)提供。独立的mRNA分子可任选包含例如帽、5′-UTR、3′-UTR、poly(A)序列和/或密码子使用的调整。如本文对于本发明的系统所述，独立的mRNA分子可以反式提供。
当在RNA复制子上提供编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框时，复制子可优选地被功能性甲病毒非结构蛋白复制。特别地，编码功能性甲病毒非结构蛋白的RNA复制子可以由复制子编码的功能性甲病毒非结构蛋白复制。当没有反式提供编码功能性甲病毒非结构蛋白的核酸分子时，该实施方案是非常优选的。在该实施方案中，旨在实现复制子的顺式复制。在一个优选的实施方案中，RNA复制子包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框以及编码目的蛋白的另外的开放阅读框，并且可以由功能性甲病毒非结构蛋白复制。该实施方案特别适用于生产根据本发明的目的蛋白的一些方法。各个复制子的实例如图1所示(“顺式复制子Δ5ATG-RRS”)。
如果复制子包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框，则优选地编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框不与5′复制识别序列重叠。在一个实施方案中，编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框不与亚基因组启动子(如果存在的话)重叠。各个复制子的实例如图1所示(“顺式复制子Δ5ATG-RRS”)。
如果复制子上存在多个开放阅读框，则功能性甲病毒非结构蛋白可以由它们中的任何一个编码，任选地在亚基因组启动子的控制下或不在亚基因组启动子的控制下，优选不在亚基因组启动子的控制下。在一个优选的实施方案中，功能性甲病毒非结构蛋白由RNA复制子的最上游开放阅读框编码。当功能性甲病毒非结构蛋白由RNA复制子的最上游开放阅读框编码时，编码功能性甲病毒非结构蛋白的遗传信息将在将RNA复制子引入宿主细胞后早期翻译，并且在宿主细胞中所得蛋白质可以随后驱动复制，并任选地产生亚基因组转录物。各个复制子的实例如图1所示(“顺式复制子Δ5ATG-RRS”)。
由复制子包含或由反式提供的单独核酸分子包含的编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框的存在允许复制子被复制，并且因此，以高水平表达由复制子编码的目的基因，任选地在亚基因组启动子控制下。与其他转基因表达系统相比，这与成本优势相关。例如，在动物疫苗接种的情况下，疫苗的成本是其在兽医和农业社区取得成功的关键。由于本发明的复制子可以在功能性甲病毒非结构蛋白的存在下复制，例如，在接种疫苗的动物的细胞中，所以即使施用相对低量的复制子RNA，也可以实现目的基因的高水平表达。少量复制子RNA对每个对象的疫苗成本产生积极影响。
RNA复制子中至少一个开放阅读框的位置
RNA复制子适于表达编码目的肽或目的蛋白的一种或更多种基因，任选地在亚基因组启动子的控制下。多种实施方案是可能的。RNA复制子上可以存在一个或更多个开放阅读框，每个开放阅读框编码目的肽或目的蛋白。RNA复制子的最上游开放阅读框被称为“第一开放阅读框”。在一些实施方案中，“第一开放阅读框”是RNA复制子的唯一开放阅读框。任选地，一个或更多个另外的开放阅读框可以存在于第一开放阅读框的下游。在第一开放阅读框下游的一个或更多个另外的开放阅读框按照它们在第一开放阅读框下游存在的顺序(5′至3′)可以称为“第二开放阅读框”、“第三开放阅读框”等。优选地，每个开放阅读框包含起始密码子(碱基三联体)，通常是AUG(在RNA分子中)，对应于ATG(在相应的DNA分子中)。
如果复制子包含3′复制识别序列，则优选所有开放阅读框位于3′复制识别序列的上游。
当将包含一个或更多个开放阅读框的RNA复制子引入宿主细胞时，由于从5′复制识别中移除了至少一个起始密码子，翻译优选不在第一开放阅读框上游的任何位置开始。因此，复制子可以直接用作第一开放阅读框的翻译模板。优选地，复制子包含5′-帽。这有助于直接从复制子表达由第一开放阅读框编码的基因。
在一些实施方案中，复制子的至少一个开放阅读框处于亚基因组启动子，优选甲病毒亚基因组启动子的控制下。甲病毒亚基因组启动子非常有效，因此适合于高水平的异源基因表达。优选地，亚基因组启动子是甲病毒中亚基因组转录物的启动子。这意味着亚基因组启动子是甲病毒天然的启动子，并且优选控制编码所述甲病毒中的一种或更多种结构蛋白的开放阅读框的转录。或者，亚基因组启动子是甲病毒的亚基因组启动子的变体；任何在宿主细胞中起亚基因组RNA转录启动子作用的变体都是合适的。如果复制子包含亚基因组启动子，则优选复制子包含保守序列元件3(CSE 3)或其变体。
优选地，在亚基因组启动子控制下的至少一个开放阅读框位于亚基因组启动子的下游。优选地，亚基因组启动子控制包含开放阅读框的转录物的亚基因组RNA的产生
在一些实施方案中，第一开放阅读框在亚基因组启动子的控制下。当第一开放阅读框在亚基因组启动子的控制下时，其定位类似于甲病毒基因组中编码结构蛋白的开放阅读框的定位。当第一开放阅读框在亚基因组启动子的控制下时，由第一开放阅读框编码的基因既可以从复制子也可以从其亚基因组转录物中表达(后者存在功能性甲病毒非结构蛋白)。各实施方案由图1中的复制子“Δ5ATG-RRS”示出。优选地，“Δ5ATG-RRS”不包含编码nsP4的C末端片段(*nsP4)的核酸序列中的任何起始密码子。在亚基因组启动子控制下的第一开放阅读框的下游可以存在一个或更多个另外的开放阅读框，每一个在亚基因组启动子控制下(图1中未示出)。由一个或更多个另外的开放阅读框(例如，通过第二开放阅读框)编码的基因可以从一个或更多个亚基因组转录物翻译，每个在亚基因组启动子的控制下。例如，RNA复制子可包含控制编码第二目的蛋白的转录物产生的亚基因组启动子。
在另一些实施方案中，第一开放阅读框不在亚基因组启动子的控制下。当第一开放阅读框不在亚基因组启动子的控制下时，由第一开放阅读框编码的基因可以从复制子表达。各实施方案由图1中的复制子“Δ5ATG-RRSΔSGP”示出。在第一开放阅读框的下游可以存在一个或更多个另外的开放阅读框，每个在亚基因组启动子的控制下(为了说明两个示例性实施方案，参见图1中的“Δ5ATG-RRS-双顺反子”和“顺式复制子Δ5ATG-RRS”。由一个或更多个另外的开放阅读框编码的基因可以从亚基因组转录物表达。
在包含根据本发明的复制子的细胞中，复制子可以通过功能性甲病毒非结构蛋白扩增。另外，如果复制子包含在亚基因组启动子控制下的一个或更多个开放阅读框，则预期一个或更多个亚基因组转录物由功能性甲病毒非结构蛋白制备。功能性甲病毒非结构蛋白可以反式提供，或者可以由复制子的开放阅读框编码。
如果复制子包含多于一个编码目的蛋白的开放阅读框，则优选每个开放阅读框编码不同的蛋白质。例如，由第二开放阅读框编码的蛋白质与由第一开放阅读框编码的蛋白质不同。
在一些实施方案中，由第一和/或另外的开放阅读框，优选由第一开放阅读框编码的目的蛋白是功能性甲病毒非结构蛋白或IFN信号传导的抑制剂，例如，E3。在一些实施方案中，由第一和/或另外的开放阅读框编码，例如，由第二开放阅读框编码的目的蛋白是药学活性肽或蛋白质，或报告蛋白。
在一个实施方案中，由第一开放阅读框编码的目的蛋白是功能性甲病毒非结构蛋白。在该实施方案中，复制子优选包含5′-帽。特别是当由第一开放阅读框编码的目的蛋白是功能性甲病毒非结构蛋白时，并且优选当复制子包含5′-帽时，编码功能性甲病毒非结构蛋白的核酸序列可以有效地从复制子翻译，并且所得蛋白质随后可以驱动复制子的复制并驱动亚基因组转录物的合成。当不使用编码功能性甲病毒非结构蛋白的另外的核酸分子或不与复制子一起存在时，该实施方案可能是优选的。在该实施方案中，旨在实现复制子的顺式复制。
其中第一开放阅读框编码功能性甲病毒非结构蛋白的一个实施方案由图1中的“顺式复制子Δ5ATG-RRS”示出。在翻译编码nsP1234的核酸序列后，翻译产物(nsP1234或其片段)可以作为复制酶并驱动RNA合成，即复制子的复制和包含第二开放阅读框的亚基因组转录物的合成(图1中的“转基因”)。
反式复制系统
在第二方面，本发明提供了一种系统，其包含：
用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体，
根据本发明第一方面的RNA复制子，其能够通过功能性甲病毒非结构蛋白反式复制。
在第二方面，优选地RNA复制子不包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框。
因此，本发明提供了包含两个核酸分子的系统：用于表达功能性甲病毒非结构蛋白(即编码功能性甲病毒非结构蛋白)的第一RNA构建体；和第二RNA分子，RNA复制子。用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体在本文中同义地称为“用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体”或“复制酶构建体”。
功能性甲病毒非结构蛋白如上所定义，并且通常由复制酶构建体包含的开放阅读框编码。由复制酶构建体编码的功能性甲病毒非结构蛋白可以是能够复制复制子的任何功能性甲病毒非结构蛋白。
当将本发明的系统引入细胞，优选真核细胞时，可以翻译编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框。翻译后，功能性甲病毒非结构蛋白能够以反式复制单独的RNA分子(RNA复制子)。因此，本发明提供了用于以反式复制RNA的系统。因此，本发明的系统是反式复制系统。根据第二方面，复制子是反式复制子。
本文中，反式(例如在反式作用，反式调节的情况下)通常意指“来自不同分子的作用”(即，分子间)。它与顺式相反(例如在顺式作用，顺式调节的情况下)，后者通常意指“来自同一分子的作用”(即，分子内)。在RNA合成(包括转录和RNA复制)的背景下，反式作用元件包括含有编码能够进行RNA合成的酶(RNA聚合酶)的基因的核酸序列。RNA聚合酶使用第二核酸分子(即除了编码它的核酸分子之外的核酸分子)作为RNA合成的模板。RNA聚合酶和含有编码RNA聚合酶的基因的核酸序列都被称为“反式”作用于第二核酸分子。在本发明的上下文中，由反式作用RNA编码的RNA聚合酶是功能性甲病毒非结构蛋白。功能性甲病毒非结构蛋白能够使用第二核酸分子(其为RNA复制子)作为合成模板或RNA，包括RNA复制子的复制。可以通过根据本发明的反式复制酶复制的RNA复制子在本文中同义地称为“反式复制子”。
在本发明的系统中，功能性甲病毒非结构蛋白的作用是扩增复制子，并且如果复制子上存在亚基因组启动子，则制备亚基因组转录物。如果复制子用于表达的编码目的基因，则可以通过改变功能性甲病毒非结构蛋白的水平来反式调节目的基因的表达水平和/或表达的持续时间。
最初在20世纪80年代发现了甲病毒复制酶通常能够以反式识别和复制模板RNA的事实，但是反式复制用于生物医学应用的潜力尚未得到认可，尤其是因为反式复制的RNA被认为抑制有效复制：在感染细胞中有缺陷的干扰(DI)RNA与甲病毒基因组共复制的情况下发现(Barrett等，1984，J.Gen.Virol.，第65卷(Pt 8)，第1273-1283页；Lehtovaara等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，第78卷，第5353-5357页；Pettersson，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，v第78卷，第115-119页)。DI RNA是反式复制子，其可以在具有高病毒载量的细胞系感染期间准自然地发生。DI元件如此有效地共复制以降低亲本病毒的毒力，从而起抑制性寄生RNA的作用(Barrett等，1984，J.Gen.Virol.，第65卷(Pt 11)，第1909-1920页)。虽然没有认识到生物医学应用的潜力，但是在一些旨在阐明复制机制的基础研究中使用了反式复制现象，而不需要顺式地从相同分子表达复制酶；此外，复制酶和复制子的分离也允许涉及病毒蛋白突变体的功能研究，即使相应的突变体是功能丧失的突变体(Lemm等，1994，EMBO J.，第13卷，第2925-2934页)。这些功能丧失研究和DI RNA并未表明基于甲病毒元件的反式激活系统最终可用于治疗目的。
本发明的系统包含至少两种核酸分子。因此，其可包含两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、或十种或更多种核酸分子，它们优选为RNA分子。在一个优选的实施方案中，该系统由恰好两种RNA分子复制子和复制酶构建体组成。在一个可替选优选实施方案中，该系统包含多于一种复制子，每种复制子优选编码至少一种目的蛋白，并且还包含复制酶构建体。在这些实施方案中，由复制酶构建体编码的功能性甲病毒非结构蛋白可以作用于每种复制子以分别驱动亚基因组转录物的复制和产生。例如，每种复制子可以编码药学活性肽或蛋白质。这是有利的，例如如果需要针对多种不同抗原接种对象。
优选地，复制酶构建体缺少基于(+)链模板的(-)链合成和/或基于(-)链模板的(+)链合成所需的至少一个保守序列元件(CSE)。更优选地，复制酶构建体不包含任何甲病毒保守序列元件(CSE)。特别地，在甲病毒的四种CSE中(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页；José等，Future Microbiol.，2009，第4卷，第837-856页)，任何一种或更多种下列CSE优选不存在于复制酶构建体上：CSE 1；CSE 2；CSE3；CSE 4。特别地在不存在任何一种或更多种甲病毒CSE的情况下，与类似于甲病毒基因组RNA相比，本发明的复制酶构建体更类似于典型的真核mRNA。
本发明的复制酶构建体优选区别于甲病毒基因组RNA，在其其至少在于不能自我复制和/或其不包含在亚基因组启动子控制下的开放阅读框。当不能自我复制时，复制酶构建体也可称为“自杀构建体”。
反式制系统具有以下优点：
首先，反式复制系统的多功能性允许复制子和复制酶构建体可以在不同时间和/或不同位点设计和/或制备。在一个实施方案中，在第一时间点制备复制酶构建体，并在稍后的时间点制备复制子。例如，在其制备之后，复制酶构建体可以储存以供稍后使用。与顺式复制子相比，本发明提供了增加的灵活性：当出现新的病原体时，通过将编码引发针对新病原体的免疫应答的多肽的核酸克隆到复制子中，本发明的系统可以设计用于疫苗接种。可以从储存中回收先前制备的复制酶构建体。因此，在设计和制备复制酶构建体时，不需要已知特定病原体的性质或特定病原体的抗原。因此，在设计和制备复制酶构建体时，不需要编码引发针对特定新病原体的免疫应答的多肽的复制子可用。换句话说，可以独立于任何特定的复制子设计和制备复制酶构建体。这允许对新病原体或以至少一种新抗原的表达为特征的病原体的出现迅速作出反应，因为缺乏复制酶的复制子的制备比顺式复制子的制备需要更少的努力和资源。历史告诉我们需要一种允许对病原体快速反应的系统：这通过例如近年来由于引起严重急性呼吸综合征(SARS)的病原体、埃博拉病毒和各种流感病毒亚型的出现说明。
其次，根据本发明的反式复制子通常是比典型的顺式复制子更短的核酸分子。这使得能够更快地克隆编码目的蛋白(例如，免疫原性多肽)的复制子，并提供高产量的目的蛋白。
本发明系统的其他优点包括独立于核转录和在两个单独的RNA分子上存在关键遗传信息，这提供了前所未有的设计自由度。鉴于其可彼此组合的多功能元件，本发明允许优化复制酶表达以获得所需水平的RNA扩增，用于所需靶生物体，用于所需目的蛋白的生产水平等。根据本发明的系统允许共转染不同量或比例的复制子和复制酶构建体用于任何给定的细胞类型——静息的或循环的，体外的或体内的。本发明的反式复制系统适合于接种宿主细胞，以及用于在宿主细胞中表达目的基因(参见例如实施例2、3和5)。
根据本发明的复制酶构建体优选是单链RNA分子。根据本发明的复制酶构建体通常是(+)链RNA分子。在一个实施方案中，本发明的复制酶构建体是分离的核酸分子。
根据本发明的RNA分子的优选特征
根据本发明的RNA分子可任选地通过其他特征表征，例如，5′-帽、5′-UTR、3′-UTR、poly(A)序列和/或密码子使用的调整。细节描述如下。帽
在一些实施方案中，根据本发明的复制子包含5′-帽。
在一些实施方案中，根据本发明的复制酶构建体包含5′-帽。
术语“5′-帽”、“帽”、“5′-帽结构”、“帽结构”同义使用是指在一些真核原发性转录物如前体信使RNA的5′末端发现的二核苷酸。5′-帽是这样的结构，其中(任选修饰的)鸟苷通过5′至5′三磷酸键连接(或在某些帽类似物的情况下为修饰的三磷酸键连接)与mRNA分子的第一个核苷酸键合。这些术语可以指传统的帽或帽类似物。为了说明，一些特定的帽二核苷酸(包括帽类似物二核苷酸)显示在图6中。
“包含5′-帽的RNA”或“具有5′-帽的RNA”或“用5′-帽修饰的RNA”或“加帽的RNA”是指包含5′-帽的RNA。例如，提供具有5′-帽的RNA可以通过在所述5′-帽存在下体外转录DNA模板来实现，其中所述5′-帽被共转录地并入所产生的RNA链中，或者RNA可以例如通过体外转录产生，并且可以使用加帽酶(痘苗病毒的加帽酶)在转录后将5′-帽与RNA连接。在加帽的RNA中，(加帽的)RNA分子的第一个碱基的3′位置通过磷酸二酯键与RNA分子的后续碱基(“第二碱基”)的5′位置连接。
如果需要在将各RNA引入宿主细胞或宿主生物体后的早期阶段翻译编码蛋白质的核酸序列，则非常优选在RNA分子上存在帽。例如，如实施例4中所示，帽的存在允许在将各RNA引入宿主细胞后的早期阶段有效翻译RNA复制子编码的目的基因。“早期阶段”通常表示在引入RNA后的前1小时内，或在前2小时内，或在前3小时内。
如果希望在不存在功能性复制酶的情况下发生翻译，或者当宿主细胞中仅存在少量复制酶时，也优选在RNA分子上存在帽。例如，即使将编码复制酶的核酸分子引入宿主细胞中，在引入后的早期阶段，复制酶的水平通常也很小。
在根据本发明的系统中，优选用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体包含5′-帽。
特别是当根据本发明的RNA复制子不与编码功能性甲病毒非结构蛋白的第二核酸分子(例如mRNA)一起使用或提供时，优选RNA复制子包含5′-帽。独立地，即使RNA复制子与编码功能性甲病毒非结构蛋白的第二核酸分子一起使用或提供，它也可以包含5′-帽。
术语“常规5′-帽”是指天然存在的5′-帽，优选7-甲基鸟苷帽。在7-甲基鸟苷帽中，帽的鸟苷是修饰的鸟苷，其中修饰由7位甲基化组成(图6的顶部)。
在本发明的上下文中，术语“5′-帽类似物”是指类似于常规5′-帽的分子结构，但是经修饰以具有在与其连接时稳定RNA的能力，优选在体内和/或帽子类似物不是常规5′帽。
对于真核mRNA的情况，5′-帽通常被描述为参与mRNA的有效翻译：通常，在真核生物中，翻译仅在信使RNA(mRNA)分子的5′末端开始，除非存在内部核糖体进入位点(IRES)。真核细胞能够在细胞核中转录期间提供具有5′-帽的RNA：新合成的mRNA通常用5′-帽结构修饰，例如5′-帽。当转录物达到20至30个核苷酸的长度时。首先，5′末端核苷酸pppN(ppp代表三磷酸；N代表任何核苷)通过具有RNA 5′-三磷酸酶和鸟嘌呤基转移酶活性的加帽酶在细胞中转化为5′GpppN。随后GpppN可以通过具有(鸟嘌呤-7)-甲基转移酶活性的第二种酶在细胞中甲基化以形成单甲基化的m7GpppN帽。在一个实施方案中，本发明中使用的5′-帽是天然5′-帽。
在本发明中，天然5′-帽二核苷酸通常选自非甲基化的帽二核苷酸(G(5′)ppp(5′)N；也称为GpppN)和甲基化的帽二核苷酸((m7G(5′)ppp(5′)N；也称为m7GpppN)。m7GpppN(其中N是G)由下式表示：
Figure BDA0001807839270000621
本发明的加帽RNA可以在体外制备，因此不依赖于宿主细胞中的加帽机制。在体外制备加帽RNA的最常用方法是在所有四种核糖核苷三磷酸和帽二核苷酸如m7G(5′)ppp(5′)G(也称为m7GpppG)的存在下用细菌或噬菌体RNA聚合酶转录DNA模板。RNA聚合酶通过m7GpppG的鸟苷部分的3′-OH对下一个模板核苷三磷酸(pppN)的α-磷酸的亲核攻击启动转录，产生中间体m7GpppGpN(其中N是RNA分子的第二个碱基)。通过在体外转录期间将帽与GTP的摩尔比设定在5至10来抑制竞争性GTP引发的产物pppGpN的形成。
在本发明的一些优选实施方案中，5′-帽(如果存在)是5′-帽类似物。如果RNA通过体外转录获得，例如是体外转录的RNA(IVT-RNA)，则这些实施方案是特别合适的。最初已经描述了帽类似物通过体外转录促进RNA转录物的大规模合成。
对于信使RNA，迄今为止一般描述了一些帽类似物(合成帽)，它们都可以用于本发明的上下文中。理想地，选择与更高的翻译效率和/或增加的体内降解抗性和/或增加的体外降解抗性相关的帽类似物。
优选地，使用仅可以在一个方向上引入到RNA链中的帽类似物。Pasquinelli等(1995，RNA J.，第1卷，第957-967页)证明，在体外转录过程中，噬菌体RNA聚合酶使用7-甲基鸟苷单元启动转录，其中约40-50％的具有帽的转录物具有反向的帽二核苷酸(即，初始反应产物是Gpppm7GpN)。与具有正确帽的RNA相比，具有反向帽的RNA在核酸序列翻译成蛋白质方面不起作用。因此，希望将帽以正确的方向引入，即产生具有基本上对应于m7GpppGpN等的结构的RNA。已经显示，通过取代甲基化鸟苷单元的2′-或3′-OH基团中的任一种来抑制帽二核苷酸的反向整合(Stepinski等，2001；RNA J.，第7卷，第1486-1495页；Peng等，2002；Org.Lett.，第24卷，第161-164页)。在存在这种“抗反向帽类似物”的情况下合成的RNA比在常规5′-帽m7GpppG存在下体外转录的RNA更有效地翻译。因此，例如Holtkamp等，2006，Blood，第108卷，第4009-4017页描述了一种帽类似物，其中甲基化鸟苷单元的3′OH基团被OCH3代替(7-甲基(3′-O-甲基)GpppG；抗反向帽类似物(ARCA))。ARCA是根据本发明的合适的帽二核苷酸。
Figure BDA0001807839270000641
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的RNA基本上不易于脱帽。这是重要的，因为通常，由引入培养的哺乳动物细胞中的合成mRNA产生的蛋白质的量受到mRNA的天然降解的限制。mRNA降解的一个体内途径始于mRNA帽的去除。这种去除由异二聚体焦磷酸酶催化，其含有调节亚基(Dcp1)和催化亚基(Dcp2)。催化亚基在三磷酸桥的α和β磷酸基团之间切割。在本发明中，可以选择或存在对这种类型的切割不敏感或不易受影响的帽类似物。用于此目的的合适的帽类似物可以选自根据式(I)的帽二核苷酸：
Figure BDA0001807839270000642
其中R1选自任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基，
R2和R3独立地选自H、卤素、OH和任选取代的烷氧基，或R2和R3一起形成O-X-O，其中X选自任选取代的CH2、CH2CH2、CH2CH2CH2、CH2CH(CH3)、和C(CH3)2或R2与R2所连接的环的4′位氢原子结合形成-O-CH2-或-CH2-O-，
R5选自S、Se和BH3，
R4和R6独立地选自O、S、Se和BH3。
n是1、2或3。
R1、R2、R3、R4、R5、R6的优选实施方案公开在WO2011/015347A1中，并且可以相应地在本发明中选择。
例如，在本发明的一个优选实施方案中，本发明的RNA包含硫代磷酸酯-帽-类似物。硫代磷酸酯-帽-类似物是特定的帽类似物，其中三磷酸链中的三个非桥连O原子之一被S原子取代，即式(I)中的R4、R5或R6之一是S。硫代磷酸酯-帽-类似物由J.Kowalska等，2008，RNA，第14卷，第1119-1131页描述为不希望的去帽过程的解决方案，从而提高体内RNA的稳定性。特别地，用氧原子取代5′-帽的β-磷酸基团上的硫原子导致对Dcp2的稳定化。在本发明优选的该实施方案中，式(I)中的R5是S；并且R4和R6是O。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的RNA包含硫代磷酸酯-帽-类似物，其中RNA 5′-帽的硫代磷酸酯修饰与“抗反向帽类似物”(ARCA)修饰组合。各种ARCA-硫代磷酸酯-帽-类似物描述于WO 2008/157688 A2中，并且它们均可用于本发明的RNA中。在该实施方案中，式(I)中的R2或R3中的至少一个不是OH，优选R2和R3中的一个是甲氧基(OCH3)，并且R2和R3中的另一个优选是OH。在一个优选的实施方案中，氧原子取代β-磷酸基团上的硫原子(使得式(I)中的R5是S；并且R4和R6是O)。据信，ARCA的硫代磷酸酯修饰确保在翻译和去帽机器中α、β和γ硫代磷酸酯基团精确地定位在帽结合蛋白的活性位点内。这些类似物中的至少一些基本上对焦磷酸酶Dcp1/Dcp2具有抗性。据描述，硫代磷酸酯修饰的ARCA对eIF4E具有比缺乏硫代磷酸酯基团的相应ARCA高得多的亲和力。
在本发明中特别优选的相应的帽类似物(即m2’ 7，2’-OGppspG)被称为β-S-ARCA(WO2008/157688 A2；Kuhn等，Gene Ther.，2010，第17卷，第961-971页)。因此，在本发明的一个实施方案中，用β-S-ARCA修饰本发明的RNA。β-S-ARCA由以下结构表示：
Figure BDA0001807839270000661
通常，在桥接磷酸酯处用硫原子代替氧原子得到硫代磷酸酯非对映异构体，基于它们在HPLC中的洗脱模式，其命名为D1和D2。简而言之，β-S-ARCA的D1非对映异构体或“β-S-ARCA(D1)”是β-S-ARCA的非对映异构体，与β-S-ARCA的D2非对映异构体(β-S-ARCA(D2))相比，其首先在HPLC柱上洗脱。因此表现出更短的保留时间。通过HPLC测定立体化学构型描述于WO2011/015347A1中。
在本发明的第一个特别优选的实施方案中，用β-S-ARCA(D2)非对映异构体修饰本发明的RNA。β-S-ARCA的两种非对映异构体对核酸酶的敏感性不同。已经显示携带β-S-ARCA的D2非对映异构体的RNA几乎完全抵抗Dcp2切割(与在未修饰的ARCA 5′-帽存在下合成的RNA相比仅有6％的切割)，而具有β-S-ARCA(D1)5′-帽的RNA表现出对Dcp2切割的中度敏感性(71％切割)。进一步显示，对Dcp2切割的提高的稳定性与哺乳动物细胞中增加的蛋白质表达相关。特别地，已经显示携带β-S-ARCA(D2)帽的RNA在哺乳动物细胞中比携带β-S-ARCA(D1)帽的RNA更有效地翻译。因此，在本发明的一个实施方案中，用式(I)的帽类似物修饰本发明的RNA，其特征在于式(I)中包含取代基R5的P原子处的立体化学构型，其对应于在β-S-ARCA的D2非对映异构体的Pβ原子处。在该实施方案中，式(I)中的R5是S；并且R4和R6是O。另外，式(I)中的R2或R3中的至少一个优选不是OH，优选地R2和R3中的一个是甲氧基(OCH3)，并且R2和R3中的另一个优选是OH。
在第二个特别优选的实施方案中，用β-S-ARCA(D1)非对映异构体修饰本发明的RNA。该实施方案特别适用于将加帽的RNA转移到未成熟的抗原呈递细胞中，例如用于疫苗接种目的。已经证明β-S-ARCA(D1)非对映异构体在将分别加帽的RNA转移到未成熟抗原呈递细胞中时特别适合于提高RNA的稳定性，提高RNA的翻译效率，延长RNA的翻译，提高RNA的总蛋白质表达，和/或提高针对由所述RNA编码的抗原或抗原肽的免疫应答(Kuhn等，2010，Gene Ther.，第17卷，第961-971页)。因此，在本发明的一个可替选实施方案中，用式(I)的帽类似物修饰本发明的RNA，其特征在于式(I)中包含取代基R5的P原子处的立体化学构型，其对应于在β-S-ARCA的D1非对映异构体的Pβ原子处。各种帽类似物及其实施方案描述于WO2011/015347 A1和Kuhn等，2010，Gene Ther.，第17卷，第961-971页。在本发明中可以使用WO2011/015347A1中描述的任何帽类似物，其中在包含取代基R5的P原子处的立体化学构型对应于β-S-ARCA的D1非对映异构体的Pβ原子处的立体化学构型。优选地，式(I)中的R5是S；另外，式(I)中的R2或R3中的至少一个优选不是OH，优选R2和R3中的一个是甲氧基(OCH3)，R2和R3中的另一个优选是OH。
在一个实施方案中，用根据式(I)的5′-帽结构修饰本发明的RNA，其中任何一个磷酸基团被硼代磷酸酯基团或硒代磷酸酯基团代替。这种帽在体外和体内都具有提高的稳定性。任选地，相应的化合物具有′-O-或3′-O-烷基(其中烷基优选为甲基)；相应的帽类似物称为β-BH3-ARCAs或β-Se-ARCAs。特别适合于mRNA加帽的化合物包括β-BH3-ARCAs和β-Se-ARCAs，如WO2009/149253A2中所述。对于这些化合物，优选包含式(I)中的取代基R5的P原子的立体化学构型，其对应于β-S-ARCA的D1非对映异构体的Pβ原子。
UTR
术语“非翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中转录但不翻译成氨基酸序列的区域，或RNA分子(例如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可以存在于开放阅读框(5′-UTR)的5′(上游)和/或开放阅读框(3′-UTR)的3′(下游)。
如果存在，3′-UTR位于基因的3′端，蛋白质编码区终止密码子下游，但术语“3′-UTR”优选不包含poly(A)尾。因此，3′-UTR位于poly(A)尾(如果存在)的上游，例如，与poly(A)尾部直接相邻。
如果存在，5′-UTR位于基因的5′端，蛋白质编码区的起始密码子的上游。5′-UTR位于5′-帽(如果存在的话)的下游，例如与5′-帽直接相邻。
根据本发明，5′和/或3′非翻译区可以与开放阅读框功能性连接，以便这些区域与开放阅读框相关联，使得稳定性和/或包含所述开放阅读框的RNA的翻译效率提高。
在一些实施方案中，根据本发明的复制酶构建体包含5′-UTR和/或3′-UTR。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的复制酶构建体包含
(1)5′-UTR，
(2)开放阅读框，和
(3)3′-UTR。
UTR涉及RNA的稳定性和翻译效率。除了关于本文所述的5′-帽和/或3′poly(A)尾的结构修饰之外，通过选择特定的5′和/或3′非翻译区(UTR)，两者都可以得到改善。UTR内的序列元件通常被理解为影响翻译效率(主要是5′-UTR)和RNA稳定性(主要是3′-UTR)。优选存在5′-UTR，其有活性以提高复制酶构建体的翻译效率和/或稳定性。独立地或另外地，优选存在3′-UTR，其有活性以提高复制酶构建体的翻译效率和/或稳定性。
参考第一核酸序列(例如UTR)的术语“有活性以提高翻译效率”和/或“活性以增加稳定性”意指在与第二核酸序列的共同转录物中，第一核酸序列能够修饰所述第二核酸序列的翻译效率和/或稳定性，使得所述翻译效率和/或稳定性与不存在所述第一核酸序列时所述第二核酸序列的翻译效率和/或稳定性相比提高。
在一个实施方案中，根据本发明的复制酶构建体包含5′-UTR和/或3′-UTR，其对于得到功能性甲病毒非结构蛋白的甲病毒是异源的或非天然的。这允许根据所需的翻译效率和RNA稳定性设计非翻译区。因此，异源或非天然UTR允许高度的灵活性，并且与天然甲病毒UTR相比，这种灵活性是有利的。特别是，虽然已知甲病毒(天然)RNA还包含5′-UTR和/或3′-UTR，但甲病毒UTR具有双重功能，即(i)驱动RNA复制以及(ii)驱动翻译。虽然据报道甲病毒UTR的对于翻译是低效率的(Berben-Bloemheuvel等，1992，Eur.J.Biochem.，第208卷，第581-587页)，但它们通常不易被更有效的UTR替代，因为他们的双重功能。然而，在本发明中，可以选择包含在用于反式复制的复制酶构建体中的5′-UTR和/或3′-UTR，而与它们对RNA复制的潜在影响无关。
优选地，根据本发明的复制酶构建体包含非病毒来源的5′-UTR和/或3′-UTR；特别地不是甲病毒来源。在一个实施方案中，复制酶构建体包含衍生自真核生物5′-UTR的5′-UTR和/或衍生自真核生物3′-UTR的3′-UTR。
根据本发明的5′-UTR可包含多于一个核酸序列的任何组合，任选地通过接头分开。根据本发明的3′-UTR可包含多于一个核酸序列的任何组合，任选地通过接头分开。
根据本发明的术语“接头”涉及在两个核酸序列之间添加以连接所述两个核酸序列的核酸序列。关于接头序列没有特别限制。
3′-UTR通常具有200至2000个核苷酸的长度，例如，500至1500个核苷酸。免疫球蛋白mRNA的3′-非翻译区相对较短(少于约300个核苷酸)，而其他基因的3′-非翻译区相对较长。例如，tPA的3′非翻译区长度为约800个核苷酸，因子VIII的3′非翻译区长度为约1800个核苷酸，促红细胞生成素的3′非翻译区长度为约560个核苷酸。哺乳动物mRNA的3′-非翻译区通常具有称为AAUAAA六核苷酸序列的同源区。该序列可能是poly(A)附着信号，并且通常位于poly(A)连接位点上游10至30个碱基处。3′-非翻译区可含有一个或更多个反向重复，其可折叠以产生茎环结构，所述茎环结构充当外切核糖核酸酶的屏障或与已知提高RNA稳定性的蛋白质(例如RNA结合蛋白)相互作用。
人β-珠蛋白3′-UTR，特别是两个连续相同拷贝的人β-珠蛋白3′-UTR有助于高转录稳定性和翻译效率(Holtkamp等，2006，Blood，第108卷，第4009-4017页)。因此，在一个实施方案中，根据本发明的复制酶构建体包含两个连续相同拷贝的人β-肌球蛋白3′-UTR。因此，其在5′→3′方向包含：(a)任选地5′-UTR；(b)开放阅读框；(c)3′-UTR；所述3′-UTR包含两个连续相同拷贝的人β-珠蛋白3′-UTR，其片段，或人β-珠蛋白3′-UTR或其片段的变体。
在一个实施方案中，根据本发明的复制酶构建体包含3′-UTR，其具有活性以提高翻译效率和/或稳定性，但不是人β-珠蛋白3′-UTR，其片段，或人β-珠蛋白3′-UTR或其片段的变体。
在一个实施方案中，根据本发明的复制酶构建体包含5′-UTR，其具有活性以提高翻译效率和/或稳定性。
根据本发明的含有UTR的复制酶构建体可以例如通过体外转录制备。这可以通过以允许具有5′-UTR和/或3′-UTR的RNA转录的方式对模板核酸分子(例如DNA)进行修饰来实现。
如图1所示，复制子也可以用5′-UTR和/或3′-UTR表征。复制子的UTR通常是甲病毒UTR或其变体。
poly(A)序列
在一些实施方案中，根据本发明的复制子包含3′-poly(A)序列。如果复制子包含保守序列元件4(CSE 4)，则复制子的3′-poly(A)序列优选存在于CSE 4的下游，最优选与CSE 4直接相邻。
在一些实施方案中，根据本发明的复制酶构建体包含3′-poly(A)序列。
根据本发明，在一个实施方案中，poly(A)序列包含以下或基本上由以下或由以下组成：至少20个、优选至少26个、优选至少40个、优选至少80个、优选至少100个，且优选至多500个、优选至多400个、优选至多300、优选至多200、特别是至多150个A核苷酸，特别是约120个A核苷酸。在本文中，“基本上由......组成”是指poly(A)序列中的大多数核苷酸，通常是“poly(A)序列”中至少50％、优选至少75％的核苷酸数目是A核苷酸(腺苷酸)，但允许其余核苷酸是除A核苷酸以外的核苷酸，例如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)、C核苷酸(胞苷酸)。在本文中，“由...组成”是指poly(A)序列中的所有核苷酸，即poly(A)序列中100％数目的核苷酸是A核苷酸。术语“A核苷酸”或“A”是指腺苷酸。
实际上，已经证明，约120个A核苷酸的3′poly(A)序列对转染的真核细胞中的RNA水平以及从存在于3′poly(A)序列的上游(5′)的开放阅读框翻译的蛋白质水平具有有益影响(Holtkamp等，2006，Blood，第108卷，第4009-4017页)。
在甲病毒中，认为至少11个连续腺苷酸残基或至少25个连续腺苷酸残基的3′poly(A)序列对于负链的有效合成是重要的。特别地，在甲病毒中，至少25个连续腺苷酸残基的3′poly(A)序列被理解为与保守序列元件4(CSE 4)一起起作用以促进(-)链的合成(Hardy&Rice，J.Virol.，2005，第79卷，第4630-4639页)。
本发明提供了3′poly(A)序列，其在RNA转录期间，即在体外转录的RNA的制备过程中，基于与编码链互补的链中包含的重复的dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板连接。编码poly(A)序列的DNA序列(编码链)称为poly(A)盒。
在本发明的一个优选实施方案中，存在于DNA编码链中的3′poly(A)盒基本上由dA核苷酸组成，但被具有相等分布的四种核苷酸(dA、dC、dG、dT)的随机序列中断。这种随机序列的长度可以是5至50，优选10至30，更优选10至20个核苷酸。这样的盒在WO 2016/005004A1中公开。WO 2016/005004 A1中公开的任何poly(A)盒可用于本发明。基本上由dA核苷酸组成但被具有相等分布的四种核苷酸(dA、dC、dG、dT)的随机序列中断并且长度为例如5至50个核苷酸的poly(A)盒在DNA水平上显示质粒DNA在大肠杆菌中的恒定增殖，并且在RNA水平上仍然与关于支持RNA稳定性和翻译效率的有益特性相关。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，本文所述的RNA分子中包含的3′poly(A)序列基本上由A核苷酸组成，但被具有具有相等分布的四种核苷酸(dA、dC、dG、dT)的随机序列中断。这种随机序列的长度可以是5至50，优选10至30，更优选10至20个核苷酸。
密码子使用
一般而言，遗传密码的简并性将允许用其他密码子(碱基三联体)替换存在于RNA序列中的某些密码子(编码氨基酸的碱基三联体)，同时保持相同的编码能力(使得替换密码子与被替换密码子编码相同的氨基酸)。在本发明的一些实施方案中，由RNA分子包含的开放阅读框的至少一个密码子与开放阅读框起源的物种中的相应开放阅读框中的相应密码子不同。在该实施方案中，开放阅读框的编码序列被称为“调整”或“修改”。可以调整由复制子包含的开放阅读框的编码序列。或者或另外，可以修改由复制酶构建体包含的功能性甲病毒非结构蛋白的编码序列。
例如，当调整开放阅读框的编码序列时，可以选择常用的密码子：WO2009/024567A1描述了核酸分子的编码序列的调整，涉及用更频繁使用密码子替换稀有密码子。由于密码子使用的频率取决于宿主细胞或宿主生物，因此该类型的调整适合于使核酸序列适合于在特定宿主细胞或宿主生物中的表达。一般而言，更常用的密码子通常在宿主细胞或宿主生物中更有效地翻译，尽管并不总是需要对开放阅读框的所有密码子进行调整。
例如，当调整开放阅读框的编码序列时，可以通过选择每种氨基酸的具有最高GC含量的密码子来改变G(鸟苷酸)残基和C(胞苷酸酯)残基的含量。据报道，具有富含GC的开放阅读框的RNA分子具有降低免疫激活和改善RNA的翻译和半衰期的潜力(Thess等，2015，Mol.Ther.23，1457-1465)。
当根据本发明的复制子编码甲病毒非结构蛋白时，可以根据需要调整甲病毒非结构蛋白的编码序列。这种自由是可能的，因为编码甲病毒非结构蛋白的开放阅读框不与复制子的5′复制识别序列重叠。
本发明实施例的安全特征
以下特征在本发明中是优选的，单独或以任何合适的组合：
优选地，本发明的复制子或系统不是颗粒形成的。这意味着，在用本发明的复制子或系统接种宿主细胞后，宿主细胞不产生病毒颗粒，例如下一代病毒颗粒。在一个实施方案中，根据本发明的所有RNA分子完全不含编码任何甲病毒结构蛋白(例如核心核衣壳蛋白C，包膜蛋白P62和/或包膜蛋白E1)的遗传信息。本发明的这一方面在安全性方面提供了超过现有技术系统的额外价值，其中结构蛋白在反式复制辅助RNA上编码(例如Bredenbeek等，J.Virol，1993，第67卷，第6439-6446页)。
优选地，本发明的系统不包含任何甲病毒结构蛋白，例如核心核衣壳蛋白C、包膜蛋白P62和/或包膜蛋白E1。
优选地，本发明系统的复制子和复制酶构建体彼此不同。在一个实施方案中，复制子不编码功能性甲病毒非结构蛋白。在一个实施方案中，复制酶构建体缺少基于(+)链模板的(-)链合成和/或基于基于(-)链模板的(+)链合成所需的至少一个序列元件(优选至少一个CSE)。在一个实施方案中，复制酶构建体不包含CSE1和/或CSE4。
优选地，根据本发明的复制子和根据本发明的复制酶构建体均不包含甲病毒包装信号。例如，可以去除包含在SFV的nsP2编码区中的甲病毒包装信号(White等.1998，J.Virol.，第72卷，第4320-4326页)，例如，通过缺失或突变。去除甲病毒包装信号的合适方式包括调整nsP2编码区的密码子使用。遗传密码的简并性可以允许缺失包装信号的功能而不影响编码的nsP2的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的系统是分离的系统。在该实施方案中，该系统不存在于细胞内，例如哺乳动物细胞内，或不存在于病毒衣壳内，例如在包含甲病毒结构蛋白的外壳内。在一个实施方案中，本发明的系统存在于体外。
DNA
在第三方面，本发明提供了包含编码根据本发明第一方面的RNA复制子的核酸序列的DNA。
优选地，DNA是双链的。
在一个优选的实施方案中，根据本发明第三方面的DNA是质粒。如本文所用，术语“质粒”通常涉及染色体外遗传物质的构建体，通常是环状DNA双链体，其可独立于染色体DNA复制。
本发明的DNA可包含可被DNA依赖性RNA聚合酶识别的启动子。这允许编码的RNA(例如本发明的RNA)在体内或体外转录。IVT载体可以以标准化方式用作体外转录的模板。根据本发明优选的启动子的实例是SP6、T3或T7聚合酶的启动子。
在一个实施方案中，本发明的DNA是分离的核酸分子。
制备RNA的方法
根据本发明的任何RNA分子，无论是否是本发明系统的一部分，都可以通过体外转录获得。体外转录的RNA(IVT-RNA)在本发明中是特别感兴趣的。IVT-RNA可通过从核酸分子(特别是DNA分子)转录获得。本发明第三方面的DNA分子适用于此目的，特别是如果包含可被DNA依赖性RNA聚合酶识别的启动子的情况下。
根据本发明的RNA可以在体外合成。这允许将帽-类似物添加到体外转录反应中。通常，poly(A)尾部由DNA模板上的聚(dT)序列编码。或者，可以在转录后酶促实现加帽和poly(A)尾部添加。
体外转录方法学是本领域技术人员已知的。例如，如WO2011/015347A1中所述，各种体外转录试剂盒是可商购的。
试剂盒
本发明还提供了包含根据本发明第一方面的RNA复制子或根据本发明第二方面的系统的试剂盒。
在一个实施方案中，试剂盒的组分作为单独的实体存在。例如，试剂盒的一种核酸分子可以存在于一个实体中，并且试剂盒的另一种核酸可以存在于单独的实体中。例如，开放或封闭的容器是合适的实体。密闭容器是优选的。使用的容器应优选不含RNA酶或基本上不含RNA酶。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于接种细胞和/或用于施用于人或动物对象的RNA。
根据本发明的试剂盒任选地包含标签或其他形式的信息元件，例如，电子数据载体。标签或信息元件优选地包括指令，例如，印刷的书面说明书或可任选打印的电子形式的说明书。说明书可以涉及试剂盒的至少一种合适的可能用途。
药物组合物
本文所述的复制酶构建体和/或复制子可以以药物组合物的形式存在。根据本发明的药物组合物可包含至少一种根据本发明的核酸分子。根据本发明的药物组合物包含可药用稀释剂和/或可药用赋形剂和/或可药用载体和/或可药用载剂。可药用载体、载剂、赋形剂或稀释剂的选择不受特别限制。可以使用本领域已知的任何合适的可药用载体、载剂、赋形剂或稀释剂。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物可以另外包含溶剂，例如含水溶剂或任何能够保持RNA完整性的溶剂。在一个优选的实施方案中，药物组合物是包含RNA的水溶液。水溶液可任选地包含溶质，例如盐。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物是冻干组合物的形式。通过冷冻干燥各自的含水组合物可获得冻干组合物。
在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种阳离子实体。通常，阳离子脂质、阳离子聚合物和具有正电荷的其他物质可以与带负电荷的核酸形成复合物。通过与阳离子化合物，优选与聚阳离子化合物(例如阳离子或聚阳离子肽或蛋白质)复合，可以稳定根据本发明的RNA。在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物包含选自鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、聚-L-赖氨酸、聚-L-精氨酸、组蛋白或阳离子脂质的至少一种阳离子分子。
根据本发明，阳离子脂质是阳离子两亲性分子，例如包含至少一个亲水和亲脂部分的分子。阳离子脂质可以是单阳离子的或聚阳离子的。阳离子脂质通常具有亲脂部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，并且具有总净正电荷。脂质的头部基团通常带有正电荷。阳离子脂质优选具有1至10价的正电荷，更优选具有1至3价的正电荷，更优选具有1价的正电荷。阳离子脂质的实例包括但不限于1，2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)；二甲基二十八烷基铵(DDAB)；1，2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；1，2-二油酰-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)；1，2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1，2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷；二十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、1，2-二肉豆蔻酰氧基丙基-1，3-二甲基羟乙基铵(DMRIE)和2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙胺三氟乙酸盐(DOSPA)。阳离子脂质还包括具有叔胺基团的脂质，包括1，2-二乙烯基氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)。阳离子脂质适合于在如本文所述的脂质制剂中配制RNA，例如脂质体、乳剂和脂质复合物。通常，正电荷由至少一种阳离子脂质贡献，负电荷由RNA贡献。在一个实施方案中，除阳离子脂质外，药物组合物还包含至少一种辅助脂质。辅助脂质可以是中性或阴离子脂质。辅助脂质可以是天然脂质，例如磷脂，或天然脂质的类似物，或与天然脂质没有相似性的完全合成的脂质或脂质样分子。在药物组合物包含阳离子脂质和辅助脂质的情况下，考虑到制剂的稳定性等，可以适当地确定阳离子脂质与中性脂质的摩尔比。
在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物包含鱼精蛋白。根据本发明，鱼精蛋白可用作阳离子载体剂。术语“鱼精蛋白”是指具有相对低分子量的多种强碱性蛋白质中的任何一种，其富含精氨酸并且特别是与DNA相关联以代替动物如鱼类的精子细胞中的体细胞组蛋白。特别地，术语“鱼精蛋白”是指在鱼精子中发现的蛋白质，其是强碱性的，可溶于水，加热不凝结，并且包含多个精氨酸单体。根据本发明，如本文所用的术语“鱼精蛋白”意指包含从天然或生物来源获得或衍生的任何鱼精蛋白氨基酸序列，包括其片段和所述氨基酸序列或其片段的多聚体形式。此外，该术语包括(合成的)多肽，其是人工的并且是为特定目的而特别设计的，并且不能从天然或生物来源中分离。
在一些实施方案中，本发明的组合物可包含一种或更多种佐剂。可以在疫苗中加入佐剂以刺激免疫系统的反应；佐剂通常本身不提供免疫力。示例性佐剂包括但不限于以下：无机化合物(例如明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸氢钙)；矿物油(例如石蜡油)、细胞因子(例如IL-1、IL-2、IL-12)；免疫刺激多核苷酸(如RNA或DNA；例如含CpG的寡核苷酸)；皂苷(例如来自皂树、大豆、美远志(Polygala senega)的植物皂苷)；油乳剂或脂质体；聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂；聚磷腈(PCPP)；胞壁酰肽；咪唑喹诺酮类化合物；缩氨基硫脲化合物；Flt3配体(WO2010/066418A1)；或本领域技术人员已知的任何其他佐剂。根据本发明的用于施用RNA的优选佐剂是Flt3配体(WO2010/066418A1)。当Flt3配体与编码抗原的RNA一起施用时，可观察到抗原特异性CD8+T细胞的强烈增加。
可以缓冲根据本发明的药物组合物(例如，用乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液)。
含有RNA的颗粒
在一些实施方案中，由于未受保护的RNA的不稳定性，所以有利的是以复合或包封形式提供本发明的RNA分子。在本发明中提供各种药物组合物。特别地，在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含含有核酸的颗粒，优选含有RNA的颗粒。各药物组合物称为颗粒制剂。在根据本发明的颗粒制剂中，颗粒包含根据本发明的核酸和适于递送核酸的可药用载体或可药用载体。含核酸的颗粒可以是例如蛋白质颗粒的形式或含脂质的颗粒的形式。合适的蛋白质或脂质被称为颗粒形成剂。先前已经描述了适合于以颗粒形式递送甲病毒RNA的蛋白质颗粒和含脂质的颗粒(例如Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页)。特别地，甲病毒结构蛋白(例如由辅助病毒提供)是用于递送蛋白质颗粒形式的RNA的合适载体。
当根据本发明的系统配制成颗粒制剂时，每种RNA种类(例如复制子、复制酶构建体和任选的其他RNA种类，例如编码适于抑制IFN的蛋白质的RNA)可以单独配制成单独颗粒制剂。在那种情况下，每个单独颗粒制剂包含一种RNA种类。单独颗粒制剂可以作为单独的实体存在，例如，在单独的容器中。通过分别提供每种RNA种类(通常各自以含RNA溶液的形式)和颗粒形成剂来提供这样的制剂，从而允许形成颗粒。各个颗粒将仅包含在形成颗粒时提供的特定RNA种类(单独颗粒制剂)。
在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物包含多于一种单独颗粒制剂。各药物组合物称为混合颗粒制剂。根据本发明的混合颗粒制剂可通过单独形成如上所述的单独颗粒制剂，然后混合单独颗粒制剂的步骤而获得。通过混合步骤，可获得包含含RNA的颗粒的混合群的一种制剂(为了说明：例如，第一颗粒群可包含根据本发明的复制子，并且第二种颗粒制剂可包含根据本发明的复制酶构建体)。单独颗粒群可以一起在包含混合的单独颗粒制剂群的一个容器中。
或者，可以将药物组合物的所有RNA种类(例如复制子、复制酶构建体和任选的其他种类，例如编码适于抑制IFN的蛋白质的RNA)一起配制成组合颗粒制剂。通过提供所有RNA种类和颗粒形成剂的组合制剂(通常为组合溶液)，从而允许形成颗粒，可以获得这样的制剂。与混合颗粒制剂相反，组合颗粒制剂通常包含含有多于一种RNA种类的颗粒。在组合颗粒组合物中，不同的RNA种类通常一起存在于单个颗粒中。
在一个实施方案中，本发明的颗粒制剂是纳米颗粒制剂。在该实施方案中，根据本发明的组合物包含纳米颗粒形式的根据本发明的核酸。纳米颗粒制剂可通过各种方案和各种复合化合物获得。脂质、聚合物、低聚物或两亲性物是纳米颗粒制剂的典型组分。
如本文所用，术语“纳米颗粒”是指具有这样的直径的任何颗粒，所述直径使得颗粒适合于特别是核酸的全身性，特别是肠胃外施用，通常直径为1000纳米(nm)或更小。在一个实施方案中，纳米颗粒的平均直径为约50nm至约1000nm，优选约50nm至约400nm，优选约100nm至约300nm，例如约150nm至约200nm。。在一个实施方案中，纳米颗粒的直径为约200至约700nm，约200至约600nm，优选约250至约550nm，特别是约300至约500nm或约200至约400nm。
在一个实施方案中，通过动态光散射测量的本文所述纳米颗粒的多分散指数(PI)为0.5或更小，优选0.4或更小，或甚至更优选0.3或更小。“多分散指数”(PI)是颗粒混合物中单独颗粒(例如脂质体)的均匀或不均匀尺寸分布的量度，并且表示混合物中颗粒分布的宽度。例如，可以如WO2013/143555A1中所述确定PI。
如本文所用，术语“纳米颗粒制剂”或类似术语是指含有至少一种纳米颗粒的任何颗粒制剂。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是纳米颗粒的均匀集合。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是含脂质的药物制剂，例如脂质体制剂或乳液。
含有脂质的药物组合物
在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种脂质。优选地，至少一种脂质是阳离子脂质。所述含有脂质的药物组合物包含根据本发明的核酸。在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物包含包封在囊泡(例如脂质体)中的RNA。在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物包含乳液形式的RNA。在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物包含与阳离子化合物形成复合物的RNA，从而形成例如所谓的脂质复合物(lipoplexes)或聚合复合物(polyplexes)。RNA在囊泡(例如脂质体)内的包封不同于例如脂质/RNA复合物。脂质/RNA复合物可以例如当RNA例如与预先形成的脂质体混合时获得。
在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物包含包封在囊泡中的RNA。这种制剂是根据本发明的特定颗粒制剂。囊泡是卷成球形壳的脂质双层，其包围小空间并将该空间与囊泡外的空间隔开。通常，囊泡内的空间是含水空间，即包含水。通常，囊泡外部的空间是含水空间，即包含水。脂质双层由一种或更多种脂质(形成囊泡的脂质)形成。包围囊泡的膜是层状相，类似于质膜。根据本发明的囊泡可以是多层囊泡、单层囊泡或其混合物。当包封在囊泡中时，RNA通常与任何外部培养基分离。因此，其以受保护的形式存在，在功能上等同于天然甲病毒中的受保护形式。合适的囊泡是如本文所述的颗粒，特别是纳米颗粒。
例如，RNA可以包封在脂质体中。在该实施方案中，药物组合物是或包含脂质体制剂。脂质体内的包封通常将保护RNA免于RNA酶消化。脂质体可能包含一些外部RNA(例如在其表面上)，但至少一半RNA(并且理想地全部RNA)被包封在脂质体的核心内。
脂质体是微观脂质囊泡，通常具有一个或更多个形成囊泡的脂质的双层，例如磷脂，并且能够包封药物，例如RNA。在本发明的上下文中可以使用不同类型的脂质体，包括但不限于多层囊泡(multilamellar vesicle，MLV)、小单层囊泡(small unilamellarvesicle，SUV)、大单层囊泡(large unilamellar vesicle，LUV)、空间稳定化脂质体(sterically stabilized liposome，SSL)、多泡囊泡(multivesicular vesicle，MV)和大多泡囊泡(large mutivesicular vesicle，LMV)以及本领域已知的其他双层形式。脂质体的大小和层质(lamellarity)将取决于制备方式。存在多种其他形式的超分子组织，其中脂质可以存在于含水介质中，包括层状相、六方相(hexagonal phase)和反六方相、立方相、胶束、由单层组成的反胶束。这些相也可以与DNA或RNA组合获得，并且与RNA和DNA的相互作用可以显著影响相状态。这些相可以存在于本发明的纳米颗粒RNA制剂中。
可以使用技术人员已知的标准方法形成脂质体。各种方法包括反向蒸发方法、乙醇注入方法、脱水-再水合方法、超声处理或其他合适的方法。在脂质体形成之后，可以调整脂质体的大小以获得具有基本上均匀的大小范围的脂质体群。
在本发明的一个优选实施方案中，RNA存在于脂质体中，所述脂质体包含至少一种阳离子脂质。相应的脂质体可以由单一脂质或脂质混合物形成，条件是使用至少一种阳离子脂质。优选的阳离子脂质具有能够被质子化的氮原子；优选地，这种阳离子脂质是具有叔胺基团的脂质。具有叔胺基团的特别合适的脂质是1，2-二乙烯基氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)。在一个实施方案中，根据本发明的RNA存在于脂质体制剂中，如WO2012/006378A1中所述：脂质体，其具有包封含有RNA的含水核心的脂质双层，其中脂质双层包含pKa为5.0至7.6的脂质，其优选具有叔胺基团。具有叔胺基团的优选阳离子脂质包括DLinDMA(pKa 5.8)并且通常描述于WO2012/031046A2中。根据WO2012/031046A2，包含相应化合物的脂质体特别适合于包封RNA，并因此适合于RNA的脂质体递送。在一个实施方案中，根据本发明的RNA存在于脂质体制剂中，其中脂质体包含至少一种阳离子脂质，其头部基团包含至少一个能够被质子化的氮原子(N)，其中脂质体和RNA的N∶P比为1∶1至20∶1。根据本发明，“N∶P比”是指阳离子脂质中的氮原子(N)与包含在含脂质之颗粒(例如脂质体)中的RNA中的磷酸根原子(P)的摩尔比，如WO2013/006825A1所述。N∶P比为1∶1至20∶1与脂质体的净电荷和RNA向脊椎动物细胞的递送效率有关。
在一个实施方案中，根据本发明的RNA存在于脂质体制剂中，所述脂质体制剂包含至少一种包含聚乙二醇(PEG)部分的脂质，其中RNA包封在PEG化的脂质体内，使得PEG部分存在于脂质体的外部，如WO2012/031043A1和WO2013/033563A1中所述。
在一个实施方案中，根据本发明的RNA存在于脂质体制剂中，其中脂质体的直径为60-180nm，如WO2012/030901A1中所述。
在一个实施方案中，根据本发明的RNA存在于脂质体制剂中，其中含RNA之脂质体具有接近零或负的净电荷，如WO2013/143555A1中所公开的。
在另一些实施方案中，根据本发明的RNA以乳液的形式存在。先前已经描述了乳液用于将核酸分子(例如RNA分子)递送至细胞。本文优选的是水包油乳液。各乳液颗粒包含油核心和阳离子脂质。更优选的是阳离子水包油乳液，其中根据本发明的RNA与乳液颗粒复合。乳液颗粒包含油心和阳离子脂质。阳离子脂质可以与带负电荷的RNA相互作用，从而将RNA锚定在乳液颗粒上。在水包油乳液中，乳液颗粒分散在水性连续相中。例如，乳液颗粒的平均直径通常可为约80nm至180nm。在一个实施方案中，本发明的药物组合物是阳离子水包油乳液，其中乳液颗粒包含油核心和阳离子脂质，如WO2012/006380A2中所述。如WO2013/006834A1中所述，根据本发明的RNA可以以包含阳离子脂质的乳液形式存在，其中乳液的N∶P比率为至少4∶1。如WO2013/006837A1中所述，根据本发明的RNA可以以阳离子脂质乳液的形式存在。特别地，该组合物可包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的RNA，其中油/脂质的比为至少约8∶1(摩尔∶摩尔)。
在另一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含脂质复合物形式的RNA。术语“脂质复合物”或“RNA脂质复合物”是指脂质与核酸(如RNA)的复合物。脂质复合物可由阳离子(带正电荷)脂质体和阴离子(带负电荷)核酸形成。阳离子脂质体还可包括中性“辅助”脂质。在最简单的情况下，通过用某些混合方案将核酸与脂质体混合自发形成脂质体复合物，然而可以应用各种其他方案。应当理解，带正电荷的脂质体和带负电荷的核酸之间的静电相互作用是脂质复合物形成的驱动力(WO2013/143555A1)。在本发明的一个实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的净电荷接近于零或为负。已知RNA和脂质体的电中性或带负电荷的脂质复合物在全身给药后导致脾脏树突细胞(DC)中的大量RNA表达，并且与已报道的带正电荷的脂质体和脂质体复合物的毒性升高无关(参见WO2013/143555 A1)。因此，在本发明的一个实施方案中，根据本发明的药物组合物包含纳米颗粒形式的RNA，优选脂质复合物纳米颗粒，其中(i)纳米颗粒中的正电荷数不超过纳米颗粒中负电荷数，和/或(ii)纳米颗粒具有中性或净负电荷，和/或(iii)纳米颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为1.4∶1或更小，和/或(iv)纳米颗粒的ζ电位为0或更小。如WO2013/143555A1中所述，ζ电位是胶体系统中的电动势的科学术语。在本发明中，纳米颗粒中的(a)ζ电位和(b)阳离子脂质与RNA的电荷比可如WO2013/143555A1中所公开的那样计算。总之，本发明的上下文中优选的药物组合物是如WO2013/143555A1中所公开的具有确定粒径的纳米颗粒脂质复合物制剂的药物组合物，其中颗粒的净电荷接近于零或为负。
产生蛋白质的方法
在第四方面，本发明提供了在细胞中产生目的蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a)获得根据本发明第一方面的RNA复制子，其包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框，其可由功能性甲病毒非结构蛋白复制，并且还包含编码目的蛋白的开放阅读框，以及
(b)将RNA复制子接种到细胞中。
在该方法的多个实施方案中，RNA复制子如上文对于本发明的RNA复制子所定义，只要RNA复制子包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框和编码目的蛋白的开放阅读框并且可以通过功能性甲病毒非结构蛋白复制即可。
在第五方面，本发明提供了在细胞中产生目的蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a)获得用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体，
(b)获得根据本发明第一方面的RNA复制子，其能够通过根据(a)的功能性甲病毒非结构蛋白反式复制，并且包含编码目的蛋白的开放阅读框，以及
(c)将RNA复制子和表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体共接种到细胞中。
在该方法的多个实施方案中，用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体和/或RNA复制子如上文对本发明系统所定义，只要RNA复制子可被功能性甲病毒非结构蛋白反式复制并且包含编码目的蛋白的开放阅读框即可。用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体和RNA复制子可以在相同的时间点接种，或者可以替代地在不同的时间点接种。在第二种情况下，通常在第一时间点接种用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体，并且通常在随后的第二时间点接种RNA复制子。在这种情况下，设想复制子将立即复制，因为复制酶已经在细胞中合成。第二时间点通常是在第一时间点之后不久，例如，第一时间点后1分钟至24小时。
可以将一种或更多种核酸分子接种到其中的细胞称为“宿主细胞”。根据本发明，术语“宿主细胞”是指可以用外源核酸分子转化或转染的任何细胞。术语“细胞”优选是完整细胞，即具有完整膜的细胞，其未释放其正常的细胞内组分，例如酶、细胞器或遗传物质。完整细胞优选是活细胞，即能够发挥其正常代谢功能的活细胞。根据本发明，术语“宿主细胞”包括原核(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如人和动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选哺乳动物细胞，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪，驯养动物，包括马、牛、绵羊和山羊，以及灵长类动物的细胞。细胞可以衍生自多种组织类型，并且包括原代细胞和细胞系。具体实例包括角质形成细胞、外周血白细胞、骨髓干细胞和胚胎干细胞。在另一些实施方案中，宿主细胞是抗原呈递细胞，特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。核酸可以以单个或多个拷贝存在于宿主细胞中，并且在一个实施方案中，在宿主细胞中表达
细胞可以是原核细胞或真核细胞。原核细胞在本文中适用于例如传播根据本发明的DNA，并且真核细胞在本文中合适于例如表达复制子的开放阅读框。
在本发明的方法中，可以使用根据本发明的任何系统，或根据本发明的试剂盒，或根据本发明的药物组合物。RNA可以以药物组合物的形式使用，或者以裸RNA使用，例如用于电穿孔。
根据本发明的方法，可以实现宿主细胞中目的基因的有效表达(参见例如实施例2至5)。
在一个实施方案中，可以用细胞接种另外的RNA分子，优选mRNA分子。任选地，另外的RNA分子编码适于抑制IFN的蛋白质，例如如本文所述的E3。任选地，可以在接种根据本发明的复制子或复制酶构建体或系统之前接种另外的RNA分子。
在根据本发明的细胞中产生蛋白质的方法中，细胞可以是抗原呈递细胞，并且该方法可以用于表达编码抗原的RNA。为此，本发明可涉及将编码抗原的RNA引入抗原呈递细胞如树突细胞中。对于转染抗原呈递细胞如树突细胞，可以使用包含编码抗原的RNA的药物组合物。
在一个实施方案中，用于在细胞中产生蛋白质的方法是体外方法。在一个实施方案中，用于在细胞中产生蛋白质的方法不包括通过手术或治疗从人或动物对象中移出细胞。
在该实施方案中，可以将根据本发明第四方面接种的细胞施用于对象，以便在对象中产生蛋白质并向对象提供蛋白质。相对于对象，细胞可以是自体的、同系的、同种异体的或异源的。
在另一些实施方案中，细胞中产生蛋白质的方法中的细胞可以存在于对象例如患者中。在这些实施方案中，用于在细胞中产生蛋白质的方法是体内方法，其包括向对象施用RNA分子。
在该方面，本发明还提供了在对象中产生目的蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a)获得根据本发明第一方面的RNA复制子，其包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框，其可由功能性甲病毒非结构蛋白复制，并且还包含编码目的蛋白的开放阅读框，以及
(b)向对象施用RNA复制子。
在该方法的多个实施方案中，RNA复制子如上文对本发明的RNA复制子所定义，只要RNA复制子包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框和编码目的蛋白的开放阅读框，并且可以通过功能性甲病毒非结构蛋白复制即可。
本发明进一步提供了在对象中产生目的蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a)获得用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体，
(b)获得根据本发明第一方面的RNA复制子，其能够通过根据(a)的功能性甲病毒非结构蛋白反式复制，并且包含编码目的蛋白的开放阅读框，以及
(c)向对象施用RNA复制子和用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体。
在该方法的多个实施方案中，用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体和/或RNA复制子如上文对本发明系统所定义，只要RNA复制子可被功能性甲病毒非结构蛋白反式复制并且包含编码目的蛋白的开放阅读框即可。用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体和RNA复制子可以在相同的时间点施用，或者可以替代地在不同的时间点施用。在第二种情况下，通常在第一时间点施用用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体，并且通常在随后的第二时间点施用RNA复制子。在这种情况下，设想复制子将立即复制，因为复制酶已经在细胞中合成。第二时间点通常是在第一时间点之后不久，例如，第一时间点后1分钟至24小时。优选地，RNA复制子的施用在与用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体的施用在相同的部位通过相同的施用途径进行，以提高RNA复制子和用于用于表达功能性甲病毒的非结构蛋白的RNA构建体到达相同的靶组织或细胞的前景。“部位”是指对象身体的位置。合适的部位是例如左臂、右臂等。
在一个实施方案中，可以向对象施用另外的RNA分子，优选mRNA分子。如本文所述的，任选地，另外的RNA分子编码适于抑制IFN的蛋白质，例如E3。任选地，可以在施用根据本发明的复制子或复制酶构建体或系统之前施用另外的RNA分子。
根据本发明的RNA复制子、根据本发明的系统、或根据本发明的试剂盒、或根据本发明的药物组合物中的任一种可用于根据本发明的在对象中产生蛋白质的方法中。例如，在本发明的方法中，RNA可以以药物组合物的形式使用，例如，如本文所述，或作为裸RNA。
鉴于向对象施用的能力，本发明的RNA复制子、根据本发明的系统、或根据本发明的试剂盒、或根据本发明的药物组合物中的每一种可称为“药物”等。本发明预见到提供本发明的RNA复制子、系统、试剂盒、药物组合物用作药物。该药物可用于治疗对象。“治疗”是指将本文所述的化合物或组合物或其他实体施用至对象。该术语包括通过疗法治疗人体或动物体的方法。
上述药物通常不包含DNA，因此与现有技术中描述的DNA疫苗(例如WO 2008/119827 A1)相比与额外的安全特征相关。
根据本发明的替代医学用途包括根据本发明第四方面在细胞中产生蛋白质的方法，其中所述细胞可以是抗原呈递细胞，例如树突细胞，然后将所述细胞引入到对象中。例如，可以将编码药学活性蛋白质(例如抗原)的RNA导入(转染)到离体抗原呈递细胞中，例如，取自对象的抗原呈递细胞和，并且可以将任选离体克隆繁殖的抗原呈递细胞重新引入相同或不同的对象。可以使用本领域已知的任何方法将转染的细胞重新引入对象体内。
可以向有需要的对象施用根据本发明的药物。本发明的药物可用于治疗对象的预防性以及治疗性方法。
根据本发明的药物以有效量施用。“有效量”涉及足以单独或与其他剂量一起引起反应或所需效果的量。在治疗对象中的某种疾病或某种病症的情况下，期望的效果是抑制疾病进展。这包括疾病进展的减缓，特别是疾病进展的中断。治疗疾病或病症的期望效果还可以是疾病爆发的延迟或疾病爆发的抑制。
有效量将取决于所治疗的病症、疾病的严重程度、患者的个体参数，包括年龄、生理状况、尺寸和体重、治疗持续时间、伴随治疗的类型(如果有的话)、具体施用方式和其他因素。
疫苗接种
术语“免疫接种”或“疫苗接种”通常是指出于治疗或预防原因而治疗对象的过程。治疗，特别是预防性治疗，优选是或旨在包括旨在诱导或增强对象的针对一种或更多种抗原的免疫应答的治疗。根据本发明，如果期望通过使用如本文所述的RNA诱导或增强免疫应答，则可以通过RNA引发或增强免疫应答。在一个实施方案中，本发明提供预防性治疗，其优选地是或包括对对象进行疫苗接种。本发明的一个实施方案特别适用于疫苗接种，其中复制子编码作为目的蛋白的药学活性肽或蛋白质，它们是免疫活性化合物或抗原。
先前已经描述了RNA用于针对包括病原体的外来物质或癌症的疫苗接种(最近由Ulmer等，2012，Vaccine，第30卷，第4414-4418页综述)。与现有技术中的常规方法相反，根据本发明的复制子是用于有效疫苗接种的特别合适的元件，因为其能够被如本文所述的功能性甲病毒非结构蛋白复制。根据本发明的疫苗接种可用于例如诱导对弱免疫原性蛋白质的免疫应答。在根据本发明的RNA疫苗的情况下，蛋白质抗原从未暴露于血清抗体，但是在RNA翻译后由转染的细胞自身产生。因此，变态反应不应成为问题。因此，本发明允许患者重复免疫而没有变态反应的风险。
在涉及根据本发明的疫苗接种的方法中，将本发明的药物施用于对象，特别是如果需要治疗患有涉及抗原的疾病或具有涉及抗原的疾病的风险的对象。
在涉及根据本发明的疫苗接种的方法中，由根据本发明的复制子编码的目的蛋白编码待由免疫应答针对的细菌抗原，待由免疫应答针对的病毒抗原，或待由免疫应答针对的癌症抗原。疫苗接种的效力可通过已知的标准方法评估，例如通过测量来自生物体的抗原特异性IgG抗体。在涉及根据本发明的变应原特异性免疫治疗的方法中，由根据本发明的复制子编码的目的蛋白编码与变应原性相关的抗原。变应原特异性免疫治疗(也称为脱敏)定义为向具有一种或更多种变应原性的生物体施用优选增加剂量的变应原疫苗，以达到减轻与随后暴露于致病变应原的相关的症状减轻的状态。变应原特异性免疫治疗的功效可通过已知的标准方法评估，例如通过测量来自生物体的变应原特异性IgG和IgE抗体。
本发明的药物可以施用于对象，例如，用于治疗对象，包括对象的疫苗接种。
术语“对象”涉及脊椎动物，特别是哺乳动物。例如，在本发明的上下文中的哺乳动物是人，非人灵长类动物，驯养的哺乳动物如狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等，实验动物如小鼠、大鼠、兔、豚鼠等，以及圈养的动物，如动物园的动物。术语“对象”还涉及非哺乳动物脊椎动物，例如鸟类(特别是家禽，例如鸡、鸭、鹅、火鸡)和鱼类(特别是养殖鱼类，例如鲑鱼或鲶鱼)。如本文所用的术语“动物”还包括人。
在一些实施方案中，向家养动物如狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、绵羊、牛、山羊、猪、马、鸡、鸭、鹅、火鸡或野生动物如狐狸施用是优选的。例如，根据本发明的预防性疫苗接种可适用于接种动物群体，例如，在农业中，或野生动物群体。圈养的其他动物种群如宠物或动物园的动物可以接种疫苗。
当施用于对象时，用作药物的复制子和/或复制酶构建体优选不包含来自对于治疗对象所属的物种或属具有感染性的甲病毒类型的序列。优选地，在那种情况下，复制子和/或复制酶构建体不包含来自可以感染相应物种或属的甲病毒的任何核苷酸序列。该实施方案具有以下优点：即使施用RNA的对象(例如，意外地)受到感染性甲病毒的影响，也不可能与感染性(例如全功能型或野生型)甲病毒重组。作为说明性实例，对于猪的治疗，使用的复制子和/或复制酶构建体不包含来自可感染猪的甲病毒的任何核苷酸序列。
施用方式
根据本发明的药物可以以任何合适的途径应用于对象。
例如，药物可以全身性施用，例如静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、皮内(i.d.)或通过吸入。
在一个实施方案中，将根据本发明的药物例如皮下施用于肌肉组织，例如骨骼肌或皮肤。通常理解的是，RNA转移到皮肤或肌肉中导致高度和持续的局部表达，同时强烈诱导体液和细胞免疫应答(Johansson等.2012，PLoS.One.，7，e29732；Geall等，2012，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，第109卷，第14604-14609页)。
施用于肌肉组织或皮肤的替代方案包括但不限于：皮内、鼻内、眼内、腹膜内、静脉内、间质、口腔、透皮或舌下施用。皮内和肌肉内施用是两种优选的途径。
可以以多种方式实现给药。在一个实施方案中，通过注射施用根据本发明的药物。在一个优选的实施方案中，通过针头注射。可以使用无针注射作为替代方案。
通过附图和实施例详细描述和说明本发明，这些附图和实施例仅用于说明目的而不是限制性的。根据描述和实施例，技术人员可以获得同样包括在本发明中的其他实施方案。
实施例
材料和方法：
以下材料和方法用于下面描述的实施例中。
质粒克隆，体外转录，RNA纯化：
使用标准技术克隆质粒。在实施例1中描述了关于本发明实施例中使用的各个质粒的克隆的细节。使用实施例1中描述的质粒和T7RNA聚合酶进行体外转录，并如前所述进行RNA的纯化(Holtkamp等，2006，Blood，第108卷，第4009-4017页；Kuhn等，2010，GeneTher.，第17卷，第961-971页)。
通过分光光度法评估纯化的RNA的质量，并在2100 BioAnalyzer(Agilent，SantaClara，USA)上进行分析。转染到实施例中的细胞中的所有RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)。
RNA转染：
对于电穿孔，使用方波电穿孔装置(BTX ECM 830，Harvard Apparatus，Holliston，MA，USA)在室温下将RNA电穿孔到哺乳动物细胞中，使用以下设置：对于BHK21细胞：750V/cm，16毫秒1脉冲；对于人包皮成纤维细胞：500V/cm，24毫秒1脉冲。将不同RNA种类的混合物在不含RNA酶的管中制备并保持在冰上直至转染。对于电穿孔，将RNA或RNA混合物以62.5μl/mm小池间隙大小(cuvette gap size)的最终体积重悬。
对于脂质转染，将细胞以约20,000个细胞/cm2生长区铺板，并按照制造商的说明书(Life Technologies，Darmstadt，Germany)用总量为260ng/cm2的RNA和1μl/cm2的MessengerMax试剂转染。
细胞培养：
所有生长培养基、胎牛血清(FCS)、抗生素和其他补充剂均由Life Technologies/Gibco提供，除非另有说明。从System Bioscience(HFF，neonatal)或ATCC(CCD-1079Sk)获得的人包皮成纤维细胞在含有15％FCS、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠的最低必需培养基(MEM)中于37℃下培养。细胞在37℃下在平衡至5％CO2的潮湿气氛中生长。来自美国典型培养物保藏中心(Manassas，Virginia，USA)的细胞系“BHK21[C13](
Figure BDA0001807839270000871
CCL10TM)”的BHK21细胞在补充有10％FCS的Eagle最低必需培养基中生长。
流式细胞术：
使用FACS Canto II流式细胞仪(BD Bioscience，Heidelberg，Germany)通过流式细胞术测量编码GFP的RNA的表达，并且通过相应的Diva软件或FlowJo软件(Tree StarInc.，Ashland，OR，USA)分析获得的数据。荧光素酶测定：
为了评估萤火虫荧光素酶的表达，将转染的细胞铺到96孔黑色微孔板中，并将来自Nanoluc转染细胞的上清液转移到96孔黑色微孔板(Nunc，Langenselbold，Germany)。使用Bright-Glo荧光素酶测定系统测量萤火虫荧光素酶表达，使用Nano-Glo荧光素酶测定系统(均为Promega，Madison，WI，USA)根据制造商的说明书测量Nanoluc表达。使用微孔板发光读数器Infinite M200(Tecan Group，
Figure BDA0001807839270000881
Switzerland)测量生物发光。数据以相对光单位[RLU]表示，荧光素酶阴性细胞用于减去背景信号。
实施例1：质粒的克隆
A.使用基于PCR的无缝克隆技术获得编码基于塞姆利基森林病毒(SFV)的复制子的质粒。无缝克隆意味着基于使用同源序列段将PCR产生的片段重组为线性化载体的克隆技术。因此，将编码除了缺少编码病毒结构基因的开放阅读框外对应于SFV基因组之复制子的DNA序列从pSFV-gen-GFP(Ehrengruber&Lundstrom，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，第96卷，第7041-7046页；Lundstrom，2001，Histochem.Cell Biol.，第115卷，第83-91页)转移到pST1质粒骨架中(Holtkamp等，2006，Blood，第108卷，第4009-4017页)，其紧接T7噬菌体RNA聚合酶启动子下游。紧接SFV 3’-UTR的最后一个核苷酸的下游添加120个腺苷酸残基的质粒编码的poly(A)盒(Holtkamp等，同上)或由通过10个核苷酸随机序列分开的30个和70个腺苷酸残基组成的经修饰的poly(A)盒(WO 2016/005004 A1)。紧接poly(A)盒或经修饰的poly(A)盒下游设置SapI限制性位点。此外，将编码myc-标签的编码序列插入到在SFVnsP3可变区的编码区中发现的XhoI位点中。插入到nsP3可变区中不影响复制酶多聚蛋白的活性(Spuu1等，2010，J.Virol，第85卷，第7543-7557页)。所得质粒包含在T7聚合酶启动子控制下的编码SFV的5′复制识别序列的DNA序列。编码SFV的5′复制识别序列的DNA序列由SEQ ID NO：4表示：
Figure BDA0001807839270000891
在SEQ ID NO：4的上述表示中，第一个带下划线的ATG充当合成nsP1的N-端片段的起始密码子；翻译成蛋白质的碱基以粗体表示。nsP1编码区域内的其他ATG也加了下划线。在通过T7聚合酶体外转录包含SFV的5′复制识别序列(由SEQ ID NO：4表示)的质粒期间，获得包含对应于SEQ ID NO：3的RNA序列的转录物：5′端G对应于由T7聚合酶转录的第一个核苷酸。该G在甲病毒序列之前，是T7聚合酶有效转录所必需的。
Figure BDA0001807839270000892
在SEQ ID NO：3的上述表示中，五个特定的ATG碱基三联体标有下划线。SFV复制酶编码区中的独特EcoRV限制性位点(GATATC)以粗体突出显示。
结果，获得了质粒A。质粒A包含功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框。
B.通过从质粒A中移除从EcoRV到SalI的非结构蛋白编码序列获得编码具有未修饰的5′复制识别序列的反式复制子的质粒(参见上文)。因此，移除了编码nsP1234的开放阅读框的主要部分，即从独特的EcoRV限制性位点延伸到独特的SalI限制性位点的序列。例如：GATATC(SEQ ID NO：3的最3′的六个核苷酸，在上述表示中的粗体)对应于SFV复制酶的编码序列的独特EcoRV限制性位点。移除编码nsP1234的开放阅读框的主要部分后，仍然存在5′复制识别序列和亚基因组启动子。由于移除了编码nsP1234的开放阅读框的主要部分，当存在于宿主细胞中时由相应质粒编码的RNA不能以顺式驱动复制，但复制需要功能性甲病毒非结构蛋白的存在。
将编码萤火虫荧光素酶的开放阅读框(转基因)插入到亚基因组启动子(SGP)的下游。由此，获得质粒B。由相应质粒编码的RNA复制子在图1中显示为“模板RNAWT-RRS”。
使用RNA二级结构预测网络服务器(http：//rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)确认了预测未修饰的5′复制识别序列(RNA)折叠成四个茎环，与亲本RNA无法区分并符合文献(Frolov，2001，RNA，第7卷，第1638-1651页)。
C-1。从质粒B开始，通过单核苷酸变化，即用不同碱基替换各ATG碱基三联体的一个碱基(即，替换A或T或G)，产生了编码具有5′复制识别序列修饰(包含编码nsP1的第一个氨基酸残基的ATG碱基三联体的移除，以及5′复制识别序列内4个另外的ATG碱基三联体的移除)的反式复制子的质粒。换句话说，分别通过单核苷酸变化(替换)移除了上面具有下划线的SEQ ID NO：3的那些ATG碱基三联体
使用RNA二级结构预测网络服务器(http：//rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)和Mfold(http：//unafold.ma.albany.edu/？q＝mfold)预测由质粒编码的反式复制子RNA的折叠。
将以ATG移除为特征的经修饰的5′复制识别序列的预测折叠与各未经修饰的5′复制识别序列的预测折叠进行比较。如果预测显示经修饰的5′复制识别序列的二级结构不同于未经修饰的5′复制识别序列的二级结构，则以尝试-错误方法进行一个或更多个另外的核苷酸改变(替换)，直至预测无ATG的5′复制识别序列(Δ5ATG-RRS)的RNA折叠与由质粒B编码的未经修饰的5′复制识别序列的RNA折叠相同。结果，获得了根据SEQ ID NO：5的DNA序列：
Figure BDA0001807839270000901
编码以预测的相同折叠为特征的经修饰的5′复制识别序列的质粒(即，包含SEQID NO：5的质粒)在本文中称为C-1。
由图1中所示的各质粒编码的RNA复制子命名为“Δ5ATG-RRS”。
应理解，如SEQ ID NO：5所示例的，五个特定ATG的移除将阻止nsP1或其片段的合成。由于移除了nsP1的天然起始密码子，应理解蛋白质合成从亚基因组启动子(SGP)下游的第一个起始密码子处开始，从而导致编码萤火虫荧光素酶的开放阅读框(转基因)的转录。
C-2。从C-1开始，通过用EcoRV和SmaI消化并重新连接来移除SGP。相应的RNA复制子示意性示出在图1中，称为“Δ5ATG-RRSΔSGP”。如果相应的RNA复制子包含5′帽，则编码荧光素酶的转基因可置于5′-帽的直接翻译控制下。
C-3。从C-1开始，使用EcoRV和SalI限制性位点插入编码SFV复制酶的开放阅读框。由此，获得了编码能够自我复制的RNA的质粒，其中复制酶ORF既不与5′复制识别序列重叠也不与亚基因组启动子重叠。各RNA复制子在图1中示意性地描绘，称为“顺式复制子Δ5ATG-RRS”。
D.为了能够使得从非复制mRNA翻译编码复制酶的核酸序列，将编码SFV复制酶的开放阅读框克隆到含有人α-珠蛋白5′-UTR、合成3′-UTR和由稳定的10核苷酸(10nt)接头分开的30加70个腺苷酸残基的质粒编码的poly(A)尾的质粒中(WO 2016/005324 A1)。编码SFV复制酶的开放阅读框克隆在人α-珠蛋白5′-UTR的下游。该质粒含有T7启动子，以用于转录编码SFV复制酶的开放阅读框。
E.为了能够使得从非复制mRNA翻译编码痘苗病毒蛋白激酶R抑制剂E3的核酸序列，将编码痘苗病毒蛋白激酶R抑制剂E3(“E3”)的开放阅读框克隆到含有人α-珠蛋白5′-UTR、合成3′-UTR和由稳定的10核苷酸(10nt)接头分开的30加70个腺苷酸残基的质粒编码的poly(A)尾的质粒中(WO 2016/005324 A1)。编码E3的开放阅读框克隆在人α-珠蛋白5′-UTR的下游。该质粒含有T7启动子，以用于转录编码E3的开放阅读框。
实施例2：5′复制识别序列内起始密码子的移除不影响反式复制子RNA的复制。
将BHK21细胞用以下共电穿孔：(i)5μg编码SFV复制酶的mRNA(由实施例1的质粒D编码)和(ii)不同量的反式复制子RNA(由实施例1的质粒B或C-1编码；图2中：“模板”)。反式复制子编码萤火虫荧光素酶；反式复制子含有野生型5′复制识别序列(图2：“WT-RRS”；由质粒B编码)；或以所有起始密码子的移除为特征的5′复制识别序列(图2：“Δ5ATG-RRS”；由质粒C-1编码)。反式复制子RNA未加帽(无帽)。将5000个电穿孔的BHK21细胞铺在96孔板的每个孔中以测量电穿孔后24小时的荧光素酶表达。结果显示在图2B中。
实施例3：5′复制识别序列内起始密码子的移除使得能够在帽的控制下翻译转基因
使用以所有起始密码子的移除为特征并且包含亚基因组启动子的反式复制子(图3：“Δ5ATG-RRS”；由实施例1的质粒C-1编码)，以所有起始密码子的移除为特征但不包含亚基因组启动子的反式复制子(图3：“Δ5ATG-RRSΔSGP”；由实施例1的质粒C-2编码)，以及具有所有起始密码子并包含亚基因组启动子的反式复制子(图3“模板RNAWT-RRS”)。将人包皮成纤维细胞用以下共电穿孔：(i)0.45μg如图3所示的各反式复制子RNA，以及或者(ii-a)2.5μg编码痘苗病毒E3蛋白的mRNA(由实施例1的质粒E编码，在图3中：“E3”)或者(ii-b)2.5μg编码复制酶的mRNA(由实施例1的质粒D编码，在图3中：“复制酶”)加2.5μg编码痘苗病毒E3蛋白的mRNA(由实施例1的质粒E编码)。添加编码痘苗病毒E3蛋白的mRNA以抑制蛋白激酶R活化，从而促进荧光素酶和复制酶的表达。反式复制子RNA未加帽(图3：“无帽”)或用β-S-ARCA(D2)帽类似物共转录加帽(图3：“D2-帽”)。24小时后评估荧光素酶表达。结果显示在图3中(右图)。
该实施例证明了从5′复制识别序列中移除起始密码子使得能够直接从加帽的反式复制子RNA有效地翻译转基因。
实施例4：在转染后的早期阶段，从以5′复制识别序列内起始密码子的移除为特征的反式复制子的帽依赖性翻译比从亚基因组RNA更强。
使用以所有起始密码子的移除为特征并且包含亚基因组启动子的反式复制子(图4：“Δ5ATG-RRS”；由实施例1的质粒C-1编码)，和以所有起始密码子的移除为特征但是不包含亚基因组启动子的反式复制子(图4中：“Δ5ATG-RRSΔSGP”；由实施例1的质粒C-2编码)。将BHK21细胞用以下共电穿孔：(i)0.45μg各反式复制子RNA和(ii)2.5μg编码复制酶的mRNA(由实施例1的质粒D编码)。反式复制子RNA未加帽(图4：“无帽”)或用β-S-ARCA(D2)帽类似物共转录加帽(图4：“D2-帽”)。随时间评估荧光素酶表达。结果显示在图4中(右图)。
实施例5：来自以5′复制识别序列内起始密码子的移除为特征的反式复制子的帽依赖性翻译使得能够在早期阶段进行转基因表达，而不依赖于复制酶的先前表达。
使用以所有起始密码子的移除为特征但是不包含亚基因组启动子的反式复制子(图5：“Δ5ATG-RRSΔSGP”；由实施例1的质粒C-2编码)。反式复制子RNA未加帽(图5：“无帽”)或用β-S-ARCA(D2)帽类似物共转录加帽(图5：“D2-帽”)。将BHK21细胞用(i)0.45μg各反式复制子RNA电穿孔，并且在指示的地方(图5中“复制酶”)，另外用(ii)2.5μg复制酶编码mRNA(由实施例1的质粒D编码)电穿孔。随时间评估荧光素酶表达。结果显示在图5中(右图)。
实施例6：具有ATG缺失的复制识别序列的重构顺式复制子是功能性的。将SFV复制酶的ORF插入“Δ5ATG-RRS”(图7A：“Δ5ATG-RRS”；由实施例1的质粒C-1编码)中，从而得到实施例1的质粒C-3“顺式复制子Δ5ATG-RRS”和在亚基因组启动子(SGP)下游编码萤火虫荧光素酶。在插入的复制酶中，对应于CSE2和核心SGP的区域被核苷酸交换(虚线框)破坏，以避免这些调节区域的重复。这导致重构的顺式复制子。将BHK21细胞用2.5μg“顺式复制子WT-RRS”或“顺式复制子Δ5ATG-RRS”共电穿孔。电穿孔后24小时测量荧光素酶表达并证明该重构的顺式复制子是功能性的(图7B)。
实施例7：双顺反子反式复制子表达两种转基因。将可分泌的纳米荧光素酶(SNL)克隆到反式复制子WT-RSS(实施例1的质粒B)的亚基因组启动子(SGP)的下游。SGP上游的位置由于不能被翻译而不编码转基因(图8A)。在第二种构建体中，将SNL克隆到ΔATG-RSS(实施例1的质粒C-1)的下游，并将萤火虫荧光素酶(Luc)插入SGP的下游。将BHK21细胞用0.9μg反式复制RNA和5μgSFV-复制酶编码mRNA共电穿孔。电穿孔后48小时测量SNL和Luc表达(图8B)。该实验提供了转基因在“Δ5ATG-RRS-双顺反子”反式复制子中的两个位置表达的证据。
实施例8：在复制识别序列中缺少起始密码子的辛德毕斯病毒反式复制子有效复制。类似于实施例1对于SFV描述的构建体，通过基因合成从辛德毕斯病毒基因组改造反式复制子。除了具有未经修饰的复制识别序列(WT-RSS)的反式复制子之外，还产生了两个变体。第一个(ΔATG-RRS)包含原始起始密码子加上另外4个ATG的缺失和相应的补偿性核苷酸变化以保持RNA二级结构。在下一步骤中，另外使对应于亚基因组启动子的区域缺失以获得ΔATG-RRSΔSGP。将GFP插入Δ5ATG-RRSΔSGP载体中ATG缺失的5′RRS的直接下游或Δ5ATG-RRS和WT-RRS载体中亚基因组启动子(SGP)下游的反式复制子RNA中(图9A)。将BHK21细胞用0.1μg反式复制RNA和2.4μg SVV-复制酶编码mRNA共电穿孔，24小时后评估GFP表达(转染率[％]和平均荧光强度(MFI)(图9B))。该实验表明，应用于SFV改造的复制子的相同序列修饰原理可应用于辛德毕斯病毒改造的复制子。
序列表
<110> BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH等
<120> 用于多功能和有效的基因表达的RNA复制子
<130> 674-173 PCT2
<150> PCT/EP2016/056165
<151> 2016-03-21
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 保守序列元件3
<400> 1
accucuacgg cgguccuaaa uagg 24
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 保守序列元件4
<400> 2
auuuuguuuu uaauauuuc 19
<210> 3
<211> 281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'复制识别序列
<400> 3
gatggcggat gtgtgacata cacgacgcca aaagattttg ttccagctcc tgccacctcc 60
gctacgcgag agattaacca cccacgatgg ccgccaaagt gcatgttgat attgaggctg 120
acagcccatt catcaagtct ttgcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgc 180
aggtcacacc aaatgaccat gcaaatgcca gagcattttc gcacctggct accaaattga 240
tcgagcagga gactgacaaa gacacactca tcttggatat c 281
<210> 4
<211> 239
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'复制识别序列
<400> 4
atggcggatg tgtgacatac acgacgccaa aagattttgt tccagctcct gccacctccg 60
ctacgcgaga gattaaccac ccacgatggc cgccaaagtg catgttgata ttgaggctga 120
cagcccattc atcaagtctt tgcagaaggc atttccgtcg ttcgaggtgg agtcattgca 180
ggtcacacca aatgaccatg caaatgccag agcattttcg cacctggcta ccaaattga 239
<210> 5
<211> 281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'复制识别序列
<400> 5
gatggcggat gtgtgacata cacgacgcca aaagattttg ttccagctcc tgccacctcc 60
gctacgcgag agattaacca cccacgacgg ccgccaaagt gcttgttgat attgaggctg 120
acagcccatt catcaagtct tagcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgg 180
aggtgacacc aaatcaccat ccaaatccca gagcattttc gcacctgggt accaaattga 240
tcgagcagga gactgacaaa gacacactca tcttggatat c 281
<210> 6
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Kozak序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (7)..(7)
<223> 嘌呤
<400> 6
gccgccncca ugg 13

Claims (26)

1.RNA复制子，其包含甲病毒的经修饰5’复制识别序列，其中所述经修饰5’复制识别序列的特征在于所有的起始密码子已经从所述5’复制识别序列的保守序列元件2(CSE 2)中移除，并且其中所述经修饰5’复制识别序列包含一个或更多个另外的核苷酸变化，所述核苷酸变化补偿通过移除所述起始密码子而引入的一个或更多个茎环(SL)内的核苷酸配对破坏，
其中所述CSE 2从SL2跨越到SL4并且包含编码甲病毒非结构蛋白nsP1的第一氨基酸残基的天然起始密码子，并且
其中所述经修饰5’复制识别序列的特征在于所预测的二级结构，其等同于甲病毒基因组RNA的5'复制识别序列的预测的二级结构。
2.根据权利要求1所述的RNA复制子，其中所述经修饰5’复制识别序列包含与甲病毒5’末端处250个核苷酸同源的序列。
3.根据权利要求1所述的RNA复制子，其中所述经修饰5’复制识别序列包含与甲病毒5’末端处300至500个核苷酸同源的序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的RNA复制子，其中所述经修饰5’复制识别序列包含与甲病毒的保守序列元件1和保守序列元件2同源的序列。
5.根据权利要求4所述的RNA复制子，其中保守序列元件2包含来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框的片段。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的RNA复制子，其不包含编码截短的甲病毒非结构蛋白的开放阅读框。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的RNA复制子，其包含3’复制识别序列。
8.根据权利要求1所述的RNA复制子，其包含编码目的蛋白的第一开放阅读框。
9.根据权利要求8所述的RNA复制子，其中由所述第一开放阅读框编码的所述目的蛋白能够由所述RNA复制子作为模板来表达。
10.根据权利要求8所述的RNA复制子，其包含控制亚基因组RNA产生的亚基因组启动子，所述亚基因组RNA包含编码目的蛋白的所述第
一开放阅读框。
11.根据权利要求10所述的RNA复制子，其中由所述第一开放阅读框编码的所述目的蛋白能够由所述RNA复制子和亚基因组RNA表达。
12.根据权利要求8所述的RNA复制子，其包含控制亚基因组RNA产生的亚基因组启动子，所述亚基因组RNA包含编码目的蛋白的第二开放阅读框。
13.根据权利要求12所述的RNA复制子，其中所述亚基因组启动子和编码目的蛋白的所述第二开放阅读框位于编码目的蛋白的所述第一开放阅读框的下游。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的RNA复制子，其中由所述第一和/或第二开放阅读框编码的所述目的蛋白是功能性甲病毒非结构蛋白。
15.根据权利要求1至3中任一项所述的RNA复制子，其包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框。
16.根据权利要求15所述的RNA复制子，其中编码功能性甲病毒非结构蛋白的所述开放阅读框与所述经修饰5’复制识别序列不重叠。
17.根据权利要求15所述的RNA复制子，其能够通过所述功能性甲病毒非结构蛋白复制。
18.根据权利要求1至3中任一项所述的RNA复制子，其不包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框。
19.系统，其包含：
用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体，
根据权利要求1至13和18中任一项所述的RNA复制子，其能够通过所述功能性甲病毒非结构蛋白反式复制。
20.根据权利要求1至3中任一项所述的RNA复制子或根据权利要求19所述的系统，其中所述甲病毒是塞姆利基森林病毒。
21.DNA，其包含编码权利要求1至18和20中任一项所述的RNA复制子的核酸序列。
22.用于在细胞中产生目的蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a)获得根据权利要求1至17和20中任一项所述的RNA复制子，其包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框、能够通过所述功能性甲病毒非结构蛋白复制并且包含编码所述目的蛋白的开放阅读框，以及
(b)将所述RNA复制子接种到细胞中。
23.用于在细胞中产生目的蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a)获得用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体，
(b)获得根据权利要求1至13、18和20中任一项所述的RNA复制子，其能够通过所述功能性甲病毒非结构蛋白反式复制并且包含编码所述目的蛋白的开放阅读框，以及
(c)将所述RNA复制子和所述用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体共同接种到细胞中。
24.根据权利要求22或23所述的方法接种的细胞。
25.根据权利要求1至17和20中任一项所述的RNA复制子在制造用于在对象中产生目的蛋白之药物中的用途，所述RNA复制子包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框、能够通过所述功能性甲病毒非结构蛋白复制并且包含编码所述目的蛋白的开放阅读框。
26.表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体和根据权利要求1至13、18和20中任一项所述的RNA复制子在制造用于在对象中产生目的蛋白之药物中的用途，所述RNA复制子能够通过所述功能性甲病毒非结构蛋白反式复制并且包含编码所述目的蛋白的开放阅读框。
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