KR20180127356A - 다양하고 효율적인 유전자 발현을 위한 rna 레플리콘 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알파바이러스 기원의 복제효소에 의해 복제될 수 있는 RNA 레플리콘을 포함한다. RNA 레플리콘은 복제효소에 의한 복제에 필요한 서열 요소를 포함하지만, 이러한 서열 요소는 알파바이러스 비구조성 단백질 또는 이의 단편과 같은 임의의 단백질 또는 이의 단편을 코딩하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 RNA 레플리콘에서, 복제효소에 의한 복제에 필요한 서열 요소 및 단백질 코딩 영역(들)은 커플링되지 않는다. 본 발명에 따르면, 탈커플링은 자연성 알파바이러스 게놈 RNA와 비교하여 적어도 하나의 개시코돈의 제거에 의해 달성된다. 특히, RNA 레플리콘은 5' 복제인식서열을 포함하며, 여기서 5' 복제인식서열은 자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열과 비교하여 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 한다. 알파바이러스 기원의 복제효소는 RNA 레플리콘 또는 별도의 RNA 분자 상의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명은 세포 또는 유기체에서 목적 단백질의 효율적이고 안전한 발현을 가능하게 하지만, 알파바이러스 비구조성 단백질 단편의 바람직하지 않은 생성과 관련되지 않는다. 시험관내 및 생체내에서의 단백질 생산 방법뿐만 아니라 의학적 용도를 본 명세서에 제공하고 있다.

Description

다양하고 효율적인 유전자 발현을 위한 RNA 레플리콘
본 발명은 알파바이러스 기원의 복제효소에 의해 복제될 수 있는 RNA 레플리콘을 포함한다. RNA 레플리콘은 복제효소에 의한 복제에 필요한 서열 요소를 포함하지만, 이들 서열 요소는 알파바이러스 비구조성 단백질 또는 이의 단편과 같은 임의의 단백질 또는 이의 단편을 코딩하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 RNA 레플리콘에서, 복제효소에 의한 복제에 필요한 서열 요소 및 단백질 코딩 영역은 커플링되지 않는다. 본 발명에 따르면, 탈커플링은 자연성 알파바이러스 게놈 RNA와 비교하여 적어도 하나의 개시코돈의 제거에 의해 달성된다. RNA 레플리콘은 약학적 활성 단백질과 같은 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 복제효소는 RNA 레플리콘 또는 별도의 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다.
예방적 및 치료적 목적으로 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 외래 유전자 정보를 포함하는 핵산 분자는 수년 동안 생물 의학 연구에서 연구되어왔다. 종래 기술에서는 표적 세포 또는 생물체로 핵산 분자의 전달에 대한 처리법을 개시하고 있지만, 핵산 분자 및/또는 전달 시스템의 유형이 다르다: 데옥시리보핵산(DNA) 분자의 사용과 관련된 안전 문제에 의해 영향을 받으면서, 최근 몇 년간 리보핵산(RNA) 분자가 주목을 받고 있다. 네이키드된 RNA의 형태로, 또는 복합체 또는 포장된 형태로, 예를 들면, 비바이러스성 또는 바이러스성 운반체에 단일가닥 RNA 또는 이중가닥 RNA의 투여를 포함하는 다양한 접근법이 제안되어왔다. 바이러스 및 바이러스성 전달 운반체에서, 유전 정보는 전형적으로 단백질 및/또는 지질 (바이러스 입자)에 의해 캡슐화된다. 예를 들어, RNA 바이러스 유래의 조작된 RNA 바이러스 입자는 식물을 치료하기 위한 전달 운반체로서 제안되거나 (WO 2000/053780 A2) 또는 포유류의 백신접종을 위해 제안되어왔다 (Tubulekas et al., 1997, Gene, vol. 190, pp. 191-195). 일반적으로 RNA 바이러스는 RNA 게놈을 가진 다양한 종류의 감염성 입자이다. RNA 바이러스는 단일가닥 RNA (ssRNA) 및 이중가닥 RNA (dsRNA) 바이러스로 세분화될 수 있으며, ssRNA 바이러스는 일반적으로 양성 가닥 [(+) 가닥] 및/또는 음성 가닥 [(-) 가닥] 바이러스로 추가로 분류될 수 있다. 양성 가닥 RNA 바이러스는 이들의 RNA가 숙주세포에서 번역을 위한 주형으로 직접 작용할 수 있기 때문에 생의약품 전달 시스템으로서 매력적인 것이다.
알파바이러스는 양성-가닥 RNA 바이러스에서 전형적으로 대표하는 것이다. 알파바이러스의 숙주는 곤충, 어류 및 포유류, 예를 들어, 가축 동물 및 인간 을 포함하는 광범위한 유기체를 포함한다. 알파바이러스는 감염된 세포의 세포질에서 복제한다 (알파바이러스 생활주기의 검토는 Jose et al., uture Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856 참조). 많은 알파바이러스의 전체 게놈 길이는 전형적으로 11,000 내지 12,000개의 뉴클레오타이드 범위이고, 게놈 RNA는 전형적으로 5'-캡 및 3' 폴리(A) 꼬리를 갖는다. 알파바이러스의 게놈은 비구조성 단백질 (바이러스 RNA의 전사, 변형 및 복제, 및 단백질 변형에 관여한다) 및 구조 단백질 (바이러스 입자를 형성한다)을 코딩한다. 게놈에는 일반적으로 두개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 있다. 4개의 비구조성 단백질 (nsP1-nsP4)은 전형적으로 게놈의 5' 말단 근처에서 시작하는 첫 번째 ORF에 의해 함께 코딩되는 반면, 알파바이러스 구조 단백질이 첫 번째 ORF의 하류에서 발견되고 게놈의 3'-말단 근처에서 연장되는 두 번째 ORF에 의해 함께 코딩된다. 전형적으로 첫 번째 ORF는 두 번째 ORF보다 크며, 그 비율은 대략 2:1이다.
알파바이러스에 감염된 세포에서, 구조 단백질을 코딩하는 유전 정보는 진핵세포의 메신저 RNA와 유사한 RNA 분자인 서브게놈 전사체에서 번역될 수 있는 반면, 비구조성 단백질을 코딩하는 핵산 서열만이 게놈 RNA로부터 번역된다 (mRNA; Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124). 감염 후, 즉 바이러스 생활주기의 초기 단계에서, (+) 가닥의 게놈 RNA는 비구조성 폴리-단백질 (nsP1234)을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 번역을 위한 메신저 RNA처럼 직접적으로 작용한다. 일부 알파바이러스에서는, nsP3과 nsP4의 코딩 서열 사이에 opal 종결 코돈이 있다: nsP1, nsP2 및 nsP3을 함유하는 폴리단백질 P123은 번역이 opal 종결 코돈에서 종결될 때 생성되며, nsP4를 추가로 포함하는 폴리단백질 P1234는 opal 종결 코돈의 번역초과시 생성된다 (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562; Rupp et al., 2015, J. Gen. Virology, vol. 96, pp. 2483-2500). nsP1234는 단편 nsP123과 nsP4로 자가단백질분해적으로 절단된다. 폴리펩티드 nsP123 및 nsP4는 (+) 가닥의 게놈 RNA를 주형으로 사용하여 (-) 가닥 RNA를 전사하는 (-) 가닥 복제효소 복합체를 형성하도록 결합한다. 전형적으로 후기 단계에서 nsP123 단편은 개별 단백질 nsP1, nsP2 및 nsP3으로 완전히 절단된다 (Shirako & Strauss, 1994, J. Virol., vol. 68, pp. 1874-1885). 네개의 모든 단백질은 주형으로서 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체를 사용하여 새로운 (+) 가닥 게놈을 합성하는 (+) 가닥 복제효소 복합체를 형성한다 (Kim et al., 2004, Virology, vol. 323, pp. 153-163, Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem. vol. 278, pp. 41636-41645).
감염된 세포에서, 새로운 게놈 RNA뿐만 아니라 서브게놈 RNA는 nsP1에 의해 5'-캡을 제공하고(Pettersson et al. 1980, Eur. J. Biochem. 105, 435-443; Rozanov et al., 1992, J. Gen. Virology, vol. 73, pp. 2129-2134), nsP4에 의해 폴리-아데닐레이트 [폴리(A)] 꼬리를 제공한다(Rubach et al., Virology, 2009, vol. 384, pp. 201-208). 따라서, 서브게놈 RNA와 게놈 RNA는 모두 메신저 RNA (mRNA)와 유사하다.
알파바이러스 구조 단백질 (코어 뉴클레오캡시드 단백질 C, 외피 단백질 E2 및 외피 단백질 E1, 바이러스 입자의 모든 성분)은 일반적으로 서브게놈 프로모터의 제어 하에 하나의 단일 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된다 (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562). 서브게놈 프로모터는 시스로 작용하는 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 인식된다. 특히, 알파바이러스 복제효소는 주형으로서 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체를 사용하여 (+) 가닥의 서브게놈 전사체를 합성한다. (+) 가닥 서브게놈 전사체는 알파바이러스 구조 단백질을 암호화한다 (Kim et al., 2004, Virology, vol. 323, pp. 153-163, Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem. vol. 278, pp. 41636-41645). 서브게놈 RNA 전사체는 하나의 폴리-단백질로서 구조 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 번역을 위한 주형으로서 작용하고, 폴리-단백질은 절단되어 구조 단백질을 생성한다. 숙주세포에서의 알파바이러스 감염 후기에, nsP2의 코딩 서열 내에 위치하는 패키징 신호는 구조 단백질에 의해 패키징되어 출아하는 비리온으로의 게놈 RNA의 선택적 패키징을 보장한다 (White et al., 1998, J. Virol., vol. 72, pp. 4320-4326).
감염된 세포에서, (-) 가닥 RNA 합성은 전형적으로 감염 후 처음 3-4시간에서만 관찰되며 후기 단계에서는 발견되지 않으며, 이때 (+) 가닥 RNA (게놈 및 서브게놈 모두)의 합성은 후기 단계에 관찰 가능하다. 문헌[Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651]에 따르면, RNA 합성 조절에 대한 지배적인 모델은 비구조적 폴리-단백질의 처리에 대한 의존성을 제시한다: 비구조적 폴리-단백질 nsP1234의 초기 절단으로 nsP123 및 nsP4를 생성하고; nsP4는 (-) 가닥 합성에는 활성이지만 (+) 가닥 RNA 생성에는 비효율적인 RNA 의존성 RNA 중합 효소 (RdRp)로서 작용한다. 작용한다. nsP2/nsP3 접합부에서의 절단을 포함하는 폴리단백질 nsP123의 추가 가공은 (+) 가닥 RNA의 합성을 증가시키고 (-) 가닥 RNA의 합성을 감소시키거나 종료시키기 위해 복제효소의 주형 특이성을 변화시킨다.
알파바이러스 RNA의 합성은 또한 4개의 보존서열구성을 포함하는 시스-작용 RNA 요소에 의해 조절된다 (CSE들; Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562; 및 Frolov, 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651).
일반적으로, 알파바이러스 게놈의 5' 복제인식서열은 상이한 알파바이러스들 사이의 전반적으로 낮은 상동성을 특징으로 하지만, 보존되고 예측된 2차 구조체를 갖는다. 알파바이러스 게놈의 5' 복제인식서열은 번역 개시에만 관여할뿐만 아니라, 바이러스 RNA, CSE 1 및 CSE 2의 합성에 관여하는 2개의 보존서열구성을 포함하는 5' 복제인식서열을 또한 포함한다. CSE 1 및 2의 기능에 대해서, 2차 구조체는 선형 서열보다 더 중요하다고 여겨진다 (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562).
대조적으로, 알파바이러스 게놈의 3'-말단 서열, 즉 폴리(A) 서열의 바로 상류의 서열은 보존된 일차 구조, 특히 보존서열구성 4 (CSE 4)를 특징으로 하고, (-) 가닥 합성의 억제에 중요한 "19-nt 보존서열"이라고도 한다.
"접합 서열"이라고도 불리는 CSE 3는 알파바이러스 게놈 RNA의 (+) 가닥에 보존서열구성이며, (-) 가닥 상의 CSE 3의 상보체는 서브게놈 RNA 전사를 위한 프로모터로서 작용한다 (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562; Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651). CSE 3은 전형적으로 nsP4의 C-말단 단편을 코딩하는 영역과 중첩된다.
또한, 알파바이러스 단백질 외에도, 숙주세포 인자, 아마도 단백질은 보존서열구성에 결합할 수 있다 (Strauss & Strauss, 상기).
알파바이러스-유래된 벡터는 외래 유전자 정보를 표적 세포 또는 표적 유기체로 전달하기 위해 제안되어왔다. 간단한 접근법에서, 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로 대체된다. 알파바이러스 기반의 트랜스-복제 시스템은 2개의 분리된 핵산 분자 상의 알파바이러스 뉴클레오타이드 서열 요소에 의존한다: 하나의 핵산 분자는 바이러스 복제효소 (전형적으로 폴리-단백질 nsP1234로서)를 코딩하고, 다른 핵산 분자는 상기 복제효소에 의해 트랜스로 복제되는 것이 가능하다 (따라서 트랜스-복제 시스템 지칭). 트랜스-복제는 주어진 숙주세포에서 이들 핵산 분자 모두의 존재를 필요로 한다. 복제효소에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 핵산 분자는 알파바이러스 복제효소에 의한 인식 및 RNA 합성을 허용하는 특정 알파바이러스 서열 요소를 포함해야 한다. 각각의 레플리콘은 도 1에 "주형 RNA WT-RRS"로 예시되어있다. 이러한 레플리콘은 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 목적 유전자의 증폭을 허용하는 장점과 관련이 있으나; nsP1234를 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 알파바이러스 게놈의 5' 복제인식서열(nsP1에 대한 코딩 서열)과 중첩 및 전형적으로 CSE3을 포함하는 서브게놈 프로모터(nsP4에 대한 코딩 서열)와도 중첩되기 때문에 보다 다양한 벡터를 개발하는 것이 어렵다.
예를 들어 문헌[Michel et al. (2007, Virology, vol. 362, pp. 475-487)]에 따르면, 알파바이러스 베네수엘라 뇌염 바이러스(VEEV)의 nsP1의 코딩 영역 내에 95개의 침묵 돌연변이 (즉, 코딩된 단백질 서열에 영향을 미치지 않는 돌연변이)의 도입으로 인해 VEEV가 세포에서 복제할 수 있는 능력을 완전히 없앴는데, 이는 아마도 침묵 돌연변이가 RNA의 2차 구조체를 파괴했기 때문이라고 기재되어 있다. WO 2008/156829 A2 및 문헌[Kamrud et al. (2010, J. Gen. Virol., vol. 91, pp. 1723-1727)]에서는 자연계에서 발견되는 VEEV의 nsP1에 대한 개시코돈으로 작용하는 특정 AUG 염기 삼중항이 제거되어(종결 코돈으로의 전환에 의해) 변형된 구성체를 생성하도록 변형된 헬퍼 RNA (즉, VEEV 캡시드 및 외피를 발현하는 트랜스-복제한 RNA)에 대해서 기재하고 있다. 문헌[Kamrud et al.]에 따르면, nsP1 시작코돈을 종결 코돈으로 전환하면 RNA의 복제 가능성이 보존되고 이러한 변형된 헬퍼 RNA는 VEEV 입자가 약간만 감소된 역가를 산출하게 된다. 그러나 저자들은 CSE 1/2 영역에서 발견된 모든 AUG이 종결 코돈으로 전환함으로써 알파바이러스 복제효소의 존재 하에서는 잘 복제되지 않은 헬퍼 RNA를 생성한다는 것을 발견하였다. 저자들은 빈약한 복제가 근본적인 RNA 2차 구조체의 추정된 파괴에 있다고 생각한다. 저자들은 면역 반응 따위가 제대로 발휘되지 못하는 2차 구조체가 변형된 헬퍼 RNA의 정확한 RNA 접힘을 조절한다고 언급하지 않았기 때문에 상당히 유력한 설명이다.
RNA 복제에 필요한 5' 복제인식서열이 nsP1에 대한 AUG 개시코돈을 포함하여 알파바이러스 비구조성 단백질의 N-말단 단편에 대한 코딩 서열과 중첩된다는 사실은, 5' 복제인식서열을 포함하는 레플리콘이 일반적으로 (적어도) 알파바이러스 비구조성 단백질의 일부, 전형적으로 nsP1의 N-말단 단편을 코딩할 것이기 때문에 알파바이러스-기반 벡터의 조작에 대한 심각한 장애물을 나타낸다. 이것은 몇 가지 측면에서 불리하다:
시스-레플리콘의 경우, 이 중첩은 예를 들어 다른 포유류 표적 세포 (인간, 마우스, 가축)에 대해 복제효소 ORF의 코돈 사용법의 변경을 제한한다. 바이러스에서 발견되는 바와 같은 5' 복제인식서열의 2차 구조체가 모든 표적 세포에서 최적이 아닌 것으로 여겨진다. 그러나, 가능한 한 복제효소 ORF에서 얻어진 아미노산 변화가 복제효소 기능에 영향을 주는 것에 대해 고려하고 시험해봐야 하므로, 2차 구조체를 자유롭게 변경할 수 없다. 또한, 5' 복제인식서열 구조를 파괴시킬 수 있기 때문에 이종 기원의 복제효소에 대해 완전한 복제효소 ORF를 교체하는 것이 불가능하다.
트랜스-레플리콘의 경우, 5' 복제인식서열이 트랜스 레플리콘에서 유지될 필요가 있기 때문에, 이 중첩은 nsP1 단백질 단편의 합성을 하게 된다. nsP1의 단편은 전형적으로 요구되지는 않으며 바람직하지 않다: 원하지 않는 번역은 숙주세포에 불필요한 부담을 부과하고 약학적 활성 단백질 이외에 nsP1의 단편을 코딩하는 치료용으로 의도된 RNA 레플리콘은 조절 문제에 직면할 수 있다. 예를 들어, 절단된 nsP1이 원하지 않는 부작용을 일으키지 않는다는 것을 입증할 필요가 있을 것이다. 또한, 5' 복제인식서열 내에서 nsP1에 대한 AUG 개시코돈의 존재는 목적 유전자의 번역을 위한 개시코돈이 리보솜 번역 개시를 위해 접근 가능하게 하는 가장 5' 위치하게 하는 방식으로 이종 목적 유전자를 코딩하는 트랜스-레플리콘의 설계를 방해하였다. 다시 말하면, 융합 단백질로서 nsP1의 개시코돈과 프레임 내에서 클로닝되지 않는 한, 선행 기술인 트랜스-레플리콘 RNA로부터 전이유전자(transgene)의 5'-캡-의존성 번역이 도전적인 것이다 (그러한 융합 구성체는 예를 들어 문헌[Michel et al., 2007, Virology, vol. 362, pp. 475-487]에 의해 기재됨). 그러한 융합 구성체는 상기 언급한 nsP1 단편과 동일한 불필요한 번역을 유도하여 상기와 동일한 우려를 야기한다. 또한, 융합 단백질은 융합된 목적 전이유전자의 기능 또는 활성을 변화시킬 수 있거나, 백신 벡터로 사용될 때 융합 영역을 포괄하는 펩티드가 융합된 항원의 면역원성을 변화시킬 수 있기 때문에 추가적인 염려를 일으킨다.
이러한 단점을 극복할 필요가 있다. 예를 들어, 약학적 활성 단백질과 같은 목적 단백질을 코딩하는 핵산을 안전하고 효율적인 방식으로 발현시키기 위한 개선된 레플리콘을 제공할 필요가 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 양상 및 실시형태는 이러한 요구를 다루고 있다.
면역요법 전략은 예를 들어 전염병 및 암 질환의 예방 및 치료를 위한 유망한 선택들 중에 대표적인 것이다. 병원균 및 종양 관련 항원의 수가 증가함에 따라 면역요법에 적합한 표적이 광범위하게 수집되었다. 본 발명은 질환의 예방 및 치료를 위한 면역요법 치료에 적합한 항원의 효율적인 발현에 적합한 개선된 제제 및 방법을 포함한다.
제 1 양상에서, 본 발명은 5' 복제인식서열을 포함하는 RNA 레플리콘을 제공하며, 여기서 5' 복제인식서열은 자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열과 비교하여 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 RNA 레플리콘은 (변형된) 5' 복제인식서열 및 목적 단백질을 코딩하는 제 1 오픈 리딩 프레임, 예를 들어 바람직하게는 알파바이러스 비구조성 단백질로부터 유래되지 않은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질 또는 전이유전자를 포함하고, 특히 알파바이러스 비구조성 단백질은 5' 복제인식서열로부터 하류에 위치하며, 5' 복제인식서열 및 목적 단백질을 코딩하는 제 1 오픈 리딩 프레임은 중첩되지 않으며, 바람직하게는 5' 복제인식서열은 RNA 레플리콘의 임의의 오픈 리딩 프레임과 중첩되지 않으며, 예를 들어 5' 복제인식서열은 기능적 개시코돈을 함유하지 않으며, 바람직하게는 임의의 개시코돈을 함유하지 않는다. 가장 바람직하게, 목적 단백질을 코딩하는 제 1 오픈 리딩 프레임의 개시코돈은 RNA 레플리콘의 5'→ 3' 방향에서 제 1 기능적 개시코돈, 바람직하게는 제 1 개시코돈이다. 일 실시형태에서, 목적 단백질을 코딩하는 제 1 오픈 리딩 프레임은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 암호화한다. 일 실시형태에서, 목적 단백질 및 바람직하게는 전체 RNA 레플리콘을 코딩하는 제 1 오픈 리딩 프레임은 비-기능성 알파바이러스 비구조성 단백질, 예컨대 알파바이러스 비구조성 단백질의 단편, 특히 nsP1 및/또는 nsP4의 단편을 발현하지 않는다. 일 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 5' 복제인식서열에 대해 이종이다. 일 실시형태에서, 목적 단백질을 코딩하는 제 1 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있지 않다. 일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있는 목적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 또 다른 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 일 실시형태에서, 서브게놈 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 제 1 오픈 리딩 프레임은 중첩되지 않는다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 특징으로 하는 RNA 레플리콘의 5' 복제인식서열은 알파바이러스의 5' 말단에서 약 250개 뉴클레오타이드에 상동인 서열을 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스의 5' 말단에 약 300 내지 500개의 뉴클레오타이드에 상동인 서열을 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, 이는 벡터 시스템에 모체인 특정 알파바이러스 종의 효율적인 복제에 필요한 5'-말단 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, RNA 레플리콘의 5' 복제인식서열은 알파바이러스의 보존서열구성 1 (CSE 1) 및 보존서열구성 2 (CSE 2)에 상동인 서열을 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 CSE 2를 포함하고, 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다. 보다 바람직한 일 실시형태에서, 상기 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임의 단편은 임의의 개시코돈을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 5' 복제인식서열은 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편을 포함하며, 여기서 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편은 자연성 알파바이러스 서열과 비교하여 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편은 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임의 적어도 자연성 시작코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편은 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임의 자연성 시작코돈 이외의 하나 이상의 개시코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 한다. 보다 바람직한 일 실시형태에서, 상기 핵산 서열은 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임, 바람직하게는 nsP1의 자연성 시작코돈의 제거를 추가적으로 특징으로 한다.
바람직한 일 실시형태에서, 5' 복제인식서열은 RNA 복제와 관련하여 5' 복제인식서열의 기능을 제공하는 하나 이상의 스템루프를 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, 5' 복제인식서열의 하나 이상의 스템루프는 결실되거나 파괴되지 않는다. 보다 바람직하게는, 하나 이상의 스템루프 1, 3 및 5, 바람직하게는 모든 스템루프 1, 3 및 4, 또는 스템루프 3 및 4는 삭제되거나 파괴되지 않는다. 보다 바람직하게는, 5' 복제인식서열의 스템루프가 결실되거나 파괴되지 않는다.
바람직한 일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 적어도 하나의 개시코돈의 제거에 의해 도입된 하나 이상의 스템루프 내에서의 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 보상하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화를 포함한다.
일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 절단된 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 3' 복제인식서열을 포함한다.
일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 목적 단백질을 코딩하는 제 1 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질이 주형으로서 RNA 레플리콘으로부터 발현될 수 있다는 것을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 서브게놈 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 한다. 전형적으로, 서브게놈 프로모터는 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 서브게놈 RNA의 생산을 제어한다.
바람직한 일 실시형태에서, 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은 주형으로서 RNA 레플리콘으로부터 발현될 수 있다. 보다 바람직한 일 실시형태에서, 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은 추가로 서브게놈 RNA로부터 발현될 수 있다.
바람직한 일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 목적 단백질을 코딩하는 제 2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 서브게놈 RNA의 생산을 제어하는 서브게놈 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 한다. 목적 단백질은 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질과 동일하거나 다른 제 2 단백질일 수 있다.
보다 바람직한 일 실시형태에서, 서브게놈 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 제 2 오픈 리딩 프레임은 목적 단백질을 코딩하는 제 1 오픈 리딩 프레임의 하류에 위치한다.
일 실시형태에서, 제 1 및/또는 제 2 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이다.
일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
일 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 5' 복제인식서열과 중첩되지 않는다.
일 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있다.
일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는다. 이 실시형태에서, 레플리콘의 복제를 위한 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 본원에 기재된 바와 같이 트랜스로 제공될 수 있다.
제 2 양상에서, 본 발명은:
기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체,
기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 본 발명의 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘을 포함하는 시스템을 제공한다. 바람직하게는, RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하지 않는다는 점을 추가로 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘 또는 제 2 양상에 따른 시스템은 알파바이러스가 Semliki Forest 바이러스인 것을 특징으로 한다.
제 3 양상에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA를 제공한다.
제 4 양상에서, 본 발명은 이하 단계를 포함하는 세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있으며, 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 추가로 포함하는, 본 발명의 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘을 수득하는 단계, 및
(b) RNA 레플리콘을 세포 내에 접종하는 단계.
상기 방법의 다양한 실시형태에서, RNA 레플리콘은 상기 정의된 바와 같이 본 발명의 레플리콘에 대한 것이다.
제 5 양상에서, 본 발명은 이하 단계를 포함하는, 세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체를 수득하는 단계,
(b) (a)에 따른 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 트랜스로 복제될 수 있고 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 본 발명의 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘을 수득하는 단계, 및
(c) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체 및 the RNA 레플리콘을 세포 내로 함께 접종하는 단계.
상기 방법의 다양한 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체 및/또는 RNA 레플리콘은 본 발명의 시스템에 대해 상기 정의된 바와 같다. 제 5 양상에 따르면, RNA 레플리콘은 전형적으로 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 그 자체로 코딩하지 않는다.
제 6 양상에서, 본 발명은 제 1 양상의 레플리콘 또는 제 2 양상의 시스템을 함유하는 세포를 제공한다. 일 실시형태에서, 세포는 본 발명의 제 4 양상의 방법 또는 제 5 양상의 방법에 따라 접종된다. 일 실시형태에서, 세포는 본 발명의 제 4 양상의 방법 또는 제 5 양상의 방법에 의해 수득 가능하다. 일 실시형태에서, 세포는 유기체의 일부이다.
제 7 양상에서, 본 발명은 이하 단계를 포함하는, 대상체에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있으며 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 추가로 포함하는, 본 발명의 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘을 수득하는 단계, 및
(b) 대상체에 RNA 레플리콘을 투여하는 단계.
상기 방법의 다양한 실시형태에서, RNA 레플리콘은 본 발명의 레플리콘에 대해 상기 정의된 바와 같다.
제 8 양상에서, 본 발명은 이하 단계를 포함하는, 대상체에서 단백질을 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체를 수득하는 단계,
(b) (a)에 따른 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 트랜스로 복제될 수 있고 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는, 본 발명의 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘을 수득하는 단계, 및
(c) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체 및 RNA 레플리콘을 대상체에게 투여하는 단계.
상기 방법의 다양한 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체 및/또는 RNA 레플리콘은 본 발명의 시스템에 대해 상기 정의된 바와 같다. 제 8 양상에 따르면, RNA 레플리콘은 전형적으로 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하지 않는다.
도 1은 비변형 또는 변형된 5' 복제인식서열을 포함하는 RNA 레플리콘의 도식 표현을 나타낸 것이다.
약어: AAAA = 폴리(A) 꼬리; ATG = 시작코돈/개시코돈 (DNA 수준의 ATG; RNA 수준의 AUG); 5x ATG = nsP1*을 코딩하는 핵산 서열에서 모든 시작코돈을 포함하는 핵산 서열 (Semliki Forest 바이러스로부터의 nsP1*를 코딩하는 핵산 서열의 경우, 5x ATG는 5개의 특정 개시코돈에 상응하며, 실시예 1을 참조); △5ATG = nsP1*을 코딩하는 핵산 서열에 상응하는 핵산 서열; 그러나 자연계에서 발견되는 알파바이러스에서 nsP1*을 코딩하는 핵산 서열의 시작코돈을 포함하지 않고 (Semliki Forest 바이러스로부터 유래된 nsP1*의 경우, "△5ATG"는 자연계에서 발견되는 Semliki Forest 바이러스와 비교하여 5개의 특정 개시코돈의 제거에 해당하고, 실시예 1을 참조); EcoRV = EcoRV 제한효소부위; nsP = 알파바이러스 비구조성 단백질 (예컨대 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4)을 코딩하는 핵산 서열; nsP1 * = nsP1의 단편을 코딩하는 핵산 서열, 여기서 단편은 nsP1의 C-말단 단편을 포함하지 않으며; * nsP4 = nsP4의 단편을 코딩하는 핵산 서열, 여기서 단편은 nsP4의 N-말단 단편을 포함하지 않으며; RRS = 5' 복제인식서열; Sal I = SalI 제한효소부위; SGP = 서브게놈 프로모터; SL = 스템루프 (예컨대 SL1, SL2, SL3, SL4); SL1-4의 위치가 도표로 표시되고; UTR = 비번역 영역 (예컨대 5'-UTR, 3'-UTR); WT = 야생형.
시스레플리콘 WT-RRS: 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 목적 유전자 ("전이유전자")를 코딩하는 개방된 오픈 리딩 프레임로 대체된 것을 제외하고는, 알파바이러스의 게놈에 본질적으로 상응하는 RNA 레플리콘. "레플리콘 WT-RRS"가 세포 내로 도입될 때, 복제효소 (nsP1234 또는 이의 단편(들))를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 번역 산물은 RNA 레플리콘의 복제를 시스로 유도하고 서브게놈 프로모터 (SGP)의 하류에서 핵산 서열(서브게놈 전사체)의 합성을 유도할 수 있다.
트랜스-레플리콘 또는 주형 RNA WT-RRS: 알파바이러스 비구조성 단백질들 nsP1-4를 코딩하는 대부분의 핵산 서열이 제거된 것을 제외하고는, 본질적으로 "레플리콘 WT-RRS"에 상응하는 RNA 레플리콘. 보다 구체적으로, nsP2 및 nsP3을 코딩하는 핵산 서열은 완전히 제거하였고; nsP1을 코딩하는 핵산 서열이 절단되어 "주형 RNA WT-RRS"가 nsP1의 단편을 코딩하고, 상기 단편은 nsP1의 C-말단 단편을 포함하지 않으며 (nsP1의 N-말단 단편을 포함하고; nsP1*); nsP4를 코딩하는 핵산 서열이 절단되어 "주형 RNA WT-RRS"는 nsP4의 단편을 코딩하고, 상기 단편은 nsP4의 N-말단 단편을 포함하지 않으며 (nsP4의 C-말단 단편을 포함하고; *nsP4). 이 절단된 nsP4 서열은 부분적으로 완전 활성 서브게놈 프로모터와 중첩된다. nsP1*를 코딩하는 핵산 서열은 자연계에서 발견되는 알파바이러스에서 nsP1*을 코딩하는 핵산 서열의 모든 개시코돈을 포함한다 (Semliki Forest 바이러스로부터의 nsP1*의 경우, 5개의 특이 개시코돈).
△5ATG-RRS: 자연계에서 발견되는 알파바이러스에서 nsP1*을 코딩하는 핵산 서열의 임의의 개시코돈을 포함하지 않는다는 점을 제외하고는, 본질적으로 "주형 RNA WT-RRS"에 상응하는 RNA 레플리콘 (Semliki Forest 바이러스의 경우, "△5ATG-RRS"는 자연계에서 발견된 Semliki Forest 바이러스와 비교하여 5개의 특정 개시코돈의 제거에 해당함). 시작코돈을 제거하기 위해 도입된 모든 뉴클레오타이드 변화는 RNA의 예측된 2차 구조체를 보존하기 위해 추가적인 뉴클레오타이드 변화에 의해 보완하였다.
△5ATG-RRS△SGP: 서브게놈 프로모터 (SGP)를 포함하지 않으며 *nsP4를 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다는 점을 제외하고는, 본질적으로 "△5ATG-RRS"에 상응하는 RNA 레플리콘. "전이유전자 1" = 목적 유전자.
△5ATG-RRS-바이시스트론: 서브게놈 프로모터의 상류에 제 1 목적 유전자 ("전이유전자 1")를 코딩하는 제 1 오픈 리딩 프레임, 및 서브게놈 프로모터의 하류에 제 2 목적 유전자 ("전이유전자 2")를 코딩하는 제 2 오픈 리딩 프레임을 포함한다는 점을 제외하고는, 본질적으로 "△5ATG-RRS"에 상응하는 RNA 레플리콘. 제 2 오픈 리딩 프레임의 위치는 RNA 레플리콘 "△5ATG-RRS"에서 목적 유전자 ("전이유전자")의 위치에 상응한다.
시스레플리콘 △5ATG-RRS: 제 1 목적 유전자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩한다는(전형적으로 폴리-단백질 nsP1-nsP2-nsP3-nsP4, 즉 nsP1234를 코딩하는 하나의 오픈 리딩 프레임) 점을 제외하고는, 본질적으로 "△5ATG-RRS-바이시스트론"에 상응하는 RNA 레플리콘. "시스레플리콘 △5ATG-RRS"의 "전이유전자"는 "△5ATG-RRS-바이시스트론"의 "전이유전자 2"에 상응한다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 서브게놈 프로모터를 인식할 수 있고 목적 유전자 ("전이유전자")를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 서브게놈 전사체를 합성할 수 있다. "시스레플리콘 △5ATG-RRS"는 "시스레플리콘 WT-RRS"처럼 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 시스로 코딩하지만; "시스레플리콘 △5ATG-RRS"에 의해 코딩된 nsP1의 코딩 서열이 모든 스템루프를 포함하는 "시스레플리콘 WT-RRS"의 정확한 핵산 서열을 포함할 필요는 없다.
도 2는 5' 복제인식서열 내 개시코돈의 제거는 트랜스-레플리콘 RNA의 복제에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내는 도면이다. A: 실시예 2에서 사용된 핵산 분자의 설명. B: 전기천공된 BHK21 세포의 루시퍼라아제 발현 측정. 자세한 내용은 예제 2를 참조. 2개의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 RNA 레플리콘("주형")의 2개의 독립적으로 생성된 베치로 보여준다(N=4).
도 3은 5' 복제인식서열 내 시작코돈의 제거는 캡 의존성 번역을 가능하게 한다는 것을 나타내는 도면이다. 좌측: 실시예 3에서 사용된 핵산 분자 (RNA의 레플리콘)의 도면. 우측: 전기천공된 인간 포피 섬유아세포의 루시퍼라아제 발현 측정. 상세한 내용은 실시예 3을 참조한다. 3회 수행된 하나의 실험에서의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 4는 형질주입 직후, 5' 복제인식서열 내에서 시작코돈의 제거를 특징으로 하는 트랜스-레플리콘으로부터의 캡 의존성 번역은 서브게놈 전사체로부터의 번역보다 강하다는 것을 나타내는 도면이다. 좌측: 핵산 분자의 도면. 실시예 4에서 사용된 RNA 레플리콘은 "△5ATG-RRS" 및 "△5ATG-RRS△SGP"로 예시된다. 우측: 전기천공된 BHK21 세포의 루시퍼라아제 발현 측정. 상세한 내용은 실시예 4를 참조한다. 3회 수행된 하나의 실험에서의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 5는 5' 복제인식서열 내 시작코돈의 제거를 특징으로 하는 캡핑된 트랜스-레플리콘은 초기 단계에서 전이유전자의 발현을 가능하게 한다는 것을 나타내는 도면이다. 좌측: 실시예 5에서 사용된 "△5ATG-RRS△SGP" 핵산 분자의 도면. 우측: 전기천공된 BHK21 세포의 루시퍼라아제 발현 측정. 상세한 내용은 실시예 5를 참조한다. 3회 수행된 하나의 실험에서의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 6은 캡 디뉴클레오타이드의 구조를 나타내는 도면이다. 상단: 자연성 캡 디뉴클레오타이드, m7GpppG. 하단: 포스포로티오에이트 캡 유사체 베타-S-ARCA 디뉴클레오타이드: 입체발생 P 중심으로 인해 역상 HPLC에서 용출 특성에 따라 D1 및 D2로 표시되는 베타-S-ARCA의 2개의 부분입체이성질체가 있다.
도 7은 ATG-삭제된 RRS를 갖는 재구성된 시스-레플리콘은 기능적임을 나타내는 도면이다. SFV 복제효소의 ORF는 서브게놈 프로모터 (SGP)의 반딧불이 루시퍼라아제 하류를 코딩하는 "△5ATG-RRS"에 삽입하였다. 삽입된 복제효소 내에서, CSE 2 및 핵심 SGP에 상응하는 영역은 이들 조절 영역의 중복을 피하기 위해 뉴클레오타이드 변환 (빗금친 박스)에 의해 파괴되었다. 이로 인해 시스-레플리콘이 재구성되었다. BHK21 세포는 2,5μg "시스-레플리콘 WT-RRS" 또는 "시스-레플리콘 △5ATG-RRS"로 공동 전기천공주입하였다. 전기천공 24시간 후 루시퍼라아제 발현을 측정하였다. 3회 수행된 하나의 실험에서의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 8은 바이시스트론 트랜스-레플리콘은 두 가지 전이유전자를 발현한다는 것을 나타내는 도면이다. 트랜스-레플리콘 WT-RSS의 서브게놈 프로모터 (SGP)의 하류에 Secretable Nano-루시퍼라아제 (SNL)를 클로닝하였다. SGP의 상류 위치는 전이유전자를 코딩하지 않는다(-)SGP(SNL). 하부 구성체에서, SNL은 △ATG-RSS의 하류에 클로닝되었고, 반딧불이 루시퍼라아제 (Luc)는 SGP (SNL)SGP(Luc)의 하류에 삽입하였다. BHK21 세포는 0.9μg 트랜스-복제한 RNA와 5μg SFV-복제효소 코딩하는 mRNA로 공동-전기천공주입하였다. 전기천공 후 48시간에 SNL 및 Luc 발현이 측정하였다. 하나의 실험에 대한 데이터이다.
도 9는 복제인식서열에서 시작코돈이 결여된 Sindbis 바이러스 트랜스-레플리콘은 효율적으로 복제한다는 것을 나타내는 도면이다. 트랜스-레플리콘은 유전자 합성에 의해 Sindbis 바이러스 게놈으로부터 조작되었고 GFP는 서브게놈 프로모터 (SGP)의 하류에 삽입하였다. 변형되지 않은 복제인식서열을 갖는 이 트랜스-레플리콘(WT-RSS) 외에 이의 2개 변이체를 생성하였다. △ATG-RRS에서 원래의 시작코돈과 4개의 추가 ATG를 WT-RRS에서 삭제하였다. 또한, 필요에 따라 RNA 2차 구조체를 유지하기 위한 보완적 뉴클레오타이드 변화도 도입하였다. △ATG-RRS△SGP를 생성하기 위해, ATG-결실된 5'RRS의 바로 하류에 GFP를 갖는 벡터를 생성하는 △ATG-RRS로부터 서브게놈 프로모터에 상응하는 영역을 결실시켰다. BHK21 세포는 0.1μg의 트랜스-복제한 RNA 및 2.4μg의 SFV-복제효소 코딩한 mRNA로 공동-전기천공주입하였다. 전기천공 24시간 후 GFP 발현 (형질주입률 [%] 및 평균 형광 강도 (MFI))을 평가 하였다. 하나의 실험에 대한 데이터이다.
비록 본 발명을 하기에서 자세하게 설명할 것이나, 본 발명이 본 명세서에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 한정되는 것으로 이해되어서는 안되며, 변화 가능할 수 있다. 또한 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 구체적인 예를 설명하기 위함일 뿐이고, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 사용된 기술 및 과학 용어는 당업계의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용된 용어는 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)"(H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995))에 설명된 바에 의하여 정의된다.
본 발명의 실시는 달리 명시하지 않는 한, 당 분야의 문헌에서 설명되는 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술의 종래 방법을 사용할 것이다 (예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989 참고).
이하, 본 발명의 구성요소에 대하여 설명한다. 이들 요소는 특정 구체적인 예와 함께 열거되지만, 추가 구체적인 예를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있다고 이해되어야 한다. 다양하게 기술된 구체적인 예들 및 바람직한 구체적인 예들은 명시적으로 설명된 구체적인 예들로만 제한하여 본 발명을 해석하지 않는다. 본 명세서는 본 명세서에 개시된 및/또는 바람직한 요소들과 명시적으로 설명된 예를 결합한 구체적인 예를 개시하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 나아가, 본 명세서에 기술된 모든 요소의 순열 및 조합은 문맥상 달리 나타내지 않는 한 본 출원의 명세서에 의해 개시되는 것으로 고려되어야 한다.
용어 "약"은 대략적으로 또는 거의를 의미하며, 본원에 기재된 수치 또는 범위와 관련하여 바람직하게는 열거되거나 청구된 수치 또는 범위의 +/- 10%를 의미한다.
본 발명을 설명하는 문맥에서(특히, 본 청구범위의 문맥상) 사용되는 용어 "하나"와 "한(부정관사)" 및 "정관사" 및 유사한 참조용어는 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 분명하게 부정되지 않는 한, 단수와 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 값들을 범위로 인용하는 것은 단지 해당 범위에 속하는 각각의 별개의 값들을 개별적으로 손쉽게 칭하기 위한 것이다. 본원에서 달리 명시되지 않으면, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 지칭되는 것처럼 본 명세서 내로 편입된 것으로 간주한다. 본원에서 설명되는 모든 방법은 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 명백하게 부정되지 않으면, 적절한 임의의 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된, 임의 및 모든 실례, 또는 예시적 어법(가령, "예를 들면")의 이용은 단지 본 발명을 더욱 잘 조명하기 위해 의도된 것이고, 청구되는 본 발명의 범위에 한정을 달리 부가하는 것은 아니다. 본 명세서에서 어떠한 어법도 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 구성 요소를 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다.
달리 명시하지 않는 한, "포함하는"이라는 용어는 본 명세서의 문맥에서 "포함하는" 것에 의해 도입된 목록의 구성원 이외에 추가적으로 구성원이 선택적으로 존재할 수 있음을 나타내기 위해 사용한다. 그러나, 본 발명의 특정 실시형태로서, "포함하는"이라는 용어는 더 이상의 추가적인 구성원이 존재하지 않을 가능성을 포함하는 것, 즉 이 실시형태의 목적 상 "포함한다"는 의미는 "구성한다"의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 함을 고려할 수 있다.
포괄적인 용어를 특징으로 하는 성분의 상대량의 표시는 상기 포괄적인 용어로 포괄되는 모든 특정 변형 또는 구성원의 총량을 일컫음을 의미한다. 포괄적인 용어로 정의된 특정 성분이 특정 상대량으로 존재하도록 지정되고, 이 성분이 포괄적인 용어로 포괄되는 특정 변형 또는 구성원을 추가적으로 특징으로 하는 경우 포괄적인 용어로 포괄되는 성분의 총 상대량이 특정 상대량을 초과하도록 포괄적인 용어로 포괄되는 다른 변형 또는 구성원이 추가적으로 존재하지 않음을 의미하고; 보다 바람직하게는 포괄적인 용어에 의해 포괄되는 다른 변형 또는 구성원이 전혀 존재하지 않는다.
본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 몇가지 문헌들이 인용된다. 본원에서 인용된 각각의 상기 또는 하기 문헌들(모든 특허, 특허출원, 과학간행물, 제조업체의 설명서, 지침서 등)은 그 내용 전체가 그 이상 또는 그 이하를 불문하고 본원에 참조 병합된다. 이들 문헌들이 선행발명임을 이유로, 본 발명이 이러한 개시내용에 선행한다고 하지 못함을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에서 사용된 바와 같이 "감소" 또는 "억제"와 같은 용어는 전반적인 감소를 일으키는 능력을 의미하며, 그 수준에서 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상의 감소, 보다 바람직하게는 50% 이상의 감소, 가장 바람직하게는 75% 이상 감소시키는 능력을 의미한다. 용어 "억제" 또는 유사한 문구는 완전하거나 본질적으로 완전한 억제, 즉 제로로의 감소 또는 본질적으로 제로로의 감소를 포함한다.
"증가" 또는 "증진"과 같은 용어는 바람직하게는 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더더욱 바람직하게는 적어도 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 100%로의 증가 또는 증진에 관한 것이다.
용어 "순 전하"는 전체 대상, 예컨대 화합물 또는 입자에 대한 전하를 일컫는다.
전체 순 양전하를 갖는 이온이 양이온이지만, 전체 순 음전하를 갖는 이온은 음이온이다. 따라서, 본 발명에 따르면, 음이온은 양성자보다 더 많은 전자를 갖는 이온이고, 순 음전하이며; 양이온은 양성자보다 더 적은 전자를 갖는 이온이고, 순 양전하이다.
주어진 화합물 또는 입자와 관련하여 "하전된", "순 전하", "음성 하전된" 또는 "양성 하전된"이라는 용어는 pH 7.0의 물에 용해되거나 부유하는 경우에 주어진 화합물 또는 입자의 전기적 순 전하를 일컫는다.
본 발명에 따른 용어 "핵산"은 또한 뉴클레오타이드 염기, 당 또는 포스페이트 상의 핵산, 및 비-자연성 뉴클레오타이드와 뉴클레오타이드 유사체를 함유하는 핵산의 화학적 유도체화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)이다. 일반적으로, 핵산 분자 또는 핵산 서열은 바람직하게는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)인 핵산을 지칭한다. 본 발명에 따르면, 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 바이러스 RNA, 재조합적으로 제조된 분자 및 화학적으로 합성된 분자를 포함한다. 본 발명에 따르면, 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥 및 선형 또는 공유적으로 폐쇄된 원형 분자의 형태일 수 있다.
본 발명에 따르면, "핵산 서열"은 핵산, 예를 들어 리보핵산(RNA) 또는 a 데옥시리보핵산(DNA)에서의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 상기 용어는 전체 핵산 분자(예를 들어, 전체 핵산 분자의 단일가닥) 또는 그의 일부(예를 들어, 단편)를 지칭할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "RNA" 또는 "RNA 분자"는 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자에 관한 것이고, 바람직하게는 완전히 또는 대체로 리보뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 분자에 관한 것이다. 용어 "리보뉴클레오타이드"는 β-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 수산기를 갖는 뉴클레오타이드에 관한 것이다. 용어 "RNA"는 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 분리된 RNA, 예컨대 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 재조합적으로 발생된 RNA, 예컨대 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연-발생 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 예를 들어, RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에서, RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 비-뉴클레오타이드 물질을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또한, RNA 분자의 뉴클레오타이드는 비-표준 뉴클레오타이드, 예컨대 비-자연 발생 뉴클레오타이드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체, 특히 자연 발생 RNA의 유사체로 지칭할 수 있다.
본 발명에 따르면, RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서는, 단일가닥 RNA가 바람직하다. 용어 "단일가닥 RNA"는 일반적으로 상보적인 핵산 분자(전형적으로 상보적인 RNA 분자 없음)가 결합되지 않은 RNA 분자를 지칭한다. 단일가닥 RNA는 RNA의 일부를 되접어서 형성된 자체-상보 서열 및 제한 없이 염기쌍, 스템, 스템루프 및 벌지(bulges)를 포함한 2차 구조 모티프를 형성하도록 허용된 자체-상보 서열을 포함할 수 있다. 단일가닥 RNA는 마이너스 가닥 [(-) 가닥] 또는 플러스 가닥 [(+) 가닥]으로 존재할 수 있다. (+) 가닥은 유전 정보를 포함하거나 코딩하는 가닥이다. 유전 정보는 예를 들어 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다. (+) 가닥 RNA가 단백질을 코딩할 때, (+) 가닥은 번역(단백질 합성)을 위한 주형으로 직접 작용할 수 있다. (-) 가닥은 (+) 가닥의 상보체이다. 이중가닥 RNA의 경우, (+) 가닥 및 (-) 가닥은 2개의 분리된 RNA 분자이며, 이들 두 RNA 분자는 서로 결합하여 이중가닥 RNA("듀플렉스 RNA")를 형성한다.
RNA의 "안정성"이라는 용어는 RNA의 "반감기"에 관한 것이다. "반감기"는 분자의 활성, 양, 또는 수의 절반을 제거하는 데 필요한 시간을 말한다. 본 발명의 문맥 상에서, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성을 나타낸다. RNA의 반감기는 RNA의 "발현 지속"에 영향을 줄 수 있다. 반감기가 긴 RNA는 장시간에 걸쳐 발현될 것으로 예상될 수 있다.
용어 "번역 효율"은 특정 기간 내에 RNA 분자에 의해 제공된 번역 산물의 양을 의미한다.
핵산 서열과 관련하여, "단편"은 핵산 서열의 일부, 즉 5'-말단 및/또는 3'-말단에서 단축된 핵산 서열을 나타내는 서열에 관한 것이다. 바람직하게는, 핵산 서열의 단편은 상기 핵산 서열의 뉴클레오타이드 잔기의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다. 본 발명에서, RNA 안정성 및/또는 번역 효율을 유지하는 RNA 분자의 단편이 바람직하다.
아미노산 서열(펩티드 또는 단백질)과 관련하여, "단편"은 아미노산 서열의 일부, 즉 N-말단 및/또는 C-말단에서 단축된 아미노산 서열을 나타내는 서열에 관한 것이다. C-말단에서 단축된 단편(N-말단 단편)은 예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 3'-말단이 결여된 절단된 오픈 리딩 프레임의 번역에 의해 수득 가능한 것이다. N-말단에서 단축된 단편(C-말단 단편)은 예를 들어, 절단된 오픈 리딩 프레임이 번역을 개시하는 역할을 하는 시작코돈을 포함하는 한, 오픈 리딩 프레임의 5'-말단이 결여된 절단된 오픈 리딩 프레임의 번역에 의해 수득 가능한 것이다. 아미노산 서열의 단편은 예를 들어, 아미노산 서열로부터 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%의 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명에 따르면, 예를 들어 핵산 및 아미노산 서열에 관한 용어 "변이체"는 임의의 변이체, 특히 돌연변이체, 바이러스 균주 변이체, 스플라이스 변이체, 입체배좌체, 이소형체, 대립형질 변이체, 종 변이체 및 종 상동체, 특히 자연적으로 존재하는 것들을 포함한다. 대립형질 변이체는 유전자의 정상 서열에서의 변경에 관한 것이고, 그 중요성은 종종 불분명하다. 완전한 유전자 시퀀싱은 종종 주어진 유전자에 대한 수많은 대립형질 변이체를 동정한다. 핵산 분자와 관련하여, 용어 "변이체"는 축퇴성 핵산 서열을 포함하며, 여기서 본 발명에 따른 축퇴성 핵산은 유전 암호의 축퇴성 때문에 코돈 서열에서 기준 핵산과 상이한 핵산이다. 종 상동체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과는 다른 종의 기원을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열이다. 바이러스 상동체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과는 다른 바이러스의 기원을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열이다.
본 발명에 따르면, 핵산 변이체는 기준 핵산과 비교하여 단일 또는 다중 뉴클레오타이드 결실, 첨가, 돌연변이, 치환 및/또는 삽입을 포함한다. 결실은 기준 핵산으로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드를 제거하는 것을 포함한다. 첨가 변이체는 하나 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 이상의 뉴클레오타이드의 5'- 및/또는 3'-말단 융합체를 포함한다. 치환의 경우, 서열 중 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 제거되고 적어도 하나의 다른 뉴클레오타이드가 그 자리에 삽입된다(예컨대 전환 및 전이). 돌연변이는 일염기 부위, 가교 부위, 및 화학적으로 변경되거나 변형된 염기를 포함한다. 삽입은 기준 핵산 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 첨가하는 것을 포함한다.
본 발명에 따르면, "뉴클레오타이드 변화"는 기준 핵산과 비교하여 단일 또는 다중 뉴클레오타이드 결실, 첨가, 돌연변이, 치환 및/또는 삽입을 의미할 수 있다. 일부 실시형태에서, "뉴클레오타이드 변화"는 기준 핵산과 비교하여 단일 뉴클레오타이드의 결실, 단일 뉴클레오타이드의 첨가, 단일 뉴클레오타이드의 돌연변이, 단일 뉴클레오타이드의 치환 및/또는 단일 뉴클레오타이드의 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따르면, 핵산 변이체는 기준 핵산과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화를 포함할 수 있다.
특정 핵산 서열의 변이체는 바람직하게는 상기 특정 서열의 하나 이상의 기능적 특성을 가지며, 바람직하게는 상기 특정 서열, 예를 들어 특정 핵산 서열과 동일한 또는 유사한 특성을 나타내는 핵산 서열과 기능적으로 동등하다.
후술하는 바와 같이, 본 발명의 일부 실시형태는 그 중에서도 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 같은 알파바이러스의 핵산 서열에 상동인 핵산 서열을 특징으로 한다. 이러한 상동서열은 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 같은 알파바이러스의 핵산 서열의 변이체이다.
바람직하게는 주어진 핵산 서열과 상기 주어진 핵산 서열의 변이체인 핵산 서열 사이의 동일성 정도가 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더더욱 바람직하게는 적어도 90% 또는 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. 동일성 정도는 적어도 약 30, 적어도 약 50, 적어도 약 70, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 150, 적어도 약 200, 적어도 약 250, 적어도 약 300, 또는 적어도 약 400개의 뉴클레오타이드의 영역에 대하여 주어지는 것이 바람직하다. 바람직한 실시형태에서, 동일성 정도는 기준 핵산 서열의 전장에 대하여 부여된다.
"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다. 두 폴리펩티드 또는 핵산 서열들 간의 "서열 동일성"은 서열들 간에 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 백분율을 나타낸다.
용어 "동일성 백분율(% 동일성)"은 특히 비교하고자 하는 2개 서열들 간 최적 정렬 시 동일한 뉴클레오타이드들의 백분율을 일컫는 것이며, 상기 백분율은 순수하게 통계적인 것이고, 2개 서열들 간의 차이는 서열 전장에 걸쳐 무작위적으로 분포된 것일 수 있고 비교하고자 하는 서열은 2개 서열들 간에 최적 정렬을 달성하기 위해, 기준 서열과 비교시 부가 또는 결실을 포함하는 것일 수 있다. 2개 서열들의 비교는 대개 대응하는 서열들의 국소 영역들을 동정하기 위해, 세그먼트 또는 "비교 윈도우"와 관련하여 최적 정렬시킨 후, 상기 서열들을 비교함으로써 수행된다. 비교를 위한 최적 정렬은 수동으로 또는 문헌 [Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]에 따른 국소 상동성 알고리즘에 의하거나, 또는 문헌 [Needleman and Wunsch, 1970, J.　Mol. Biol. 48, 443]에 따른 국소 상동성 알고리즘에 의하거나, 또는 문헌 [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444]에 따른 유사성 검색 알고리즘에 의하거나 또는 상기 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575　Science Drive, Madison, Wis.)을 이용한 컴퓨터 프로그램의 도움을 받아 수행될 수 있다.
동일성 백분율은 비교될 2개의 서열 간의 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교된 위치의 수로 나누고, 얻어진 결과에 100을 곱하여 이들 두 서열 간의 동일성 백분율을 수득함으로써 계산된다.
예를 들면, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi 웹 사이트에서 이용 가능한 BLAST 프로그램인 "BBLAST 2 sequences"가 이용될 수 있다.
만일 두 서열들이 서로 상보적이라면 하나의 핵산은 또 다른 핵산에 "혼성화할 수 있거나" 또는 "혼성화"한다. 하나의 핵산은 또 다른 핵산에 만일 이들 두 서열들이 서로 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있다면 그 다른 핵산에 대해 "상보적"이다. 본 발명에 따르면, 혼성화는 폴리뉴클레오타이드들 간에 특이적인 혼성화를 허락하는 조건(엄격한 조건) 하에서 수행되는 것이 좋다. 엄격한 조건은 예를 들면, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York]에 기재되어 있으며, 예를 들면 혼성화 완충액(3.5 x SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소 혈청 알부민, 2.5 mM NaH2PO4 (pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA) 중 65℃에서의 혼성화를 가리킨다. SSC는 0.15 M 염화나트륨/0.15 M 구연산나트륨, pH 7이다. 혼성화 후, DNA가 이송되는 막을 예컨대 실온에서 2 Х SSC로 세척한 다음 68℃ 이하의 온도에서 0.1-0.5 Х SSC/0.1 Х SDS로 세척한다.
상보성 백분율은 핵산 분자에서 제 2 핵산 서열과 수소결합(예컨대, 왓슨-크릭 염기 결합형성)을 형성할 수 있는 인접 잔기들의 백분율을 나타낸다 (예컨대, 10개 중 5, 6, 7, 8, 9, 10개이면 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상동성임). "완전히 상보적" 또는 "전적으로 상보적"이라 함은 핵산 서열 내 모든 인접 잔기들이 제2의 핵산 서열에서의 동일한 갯수의 인접 잔기들과 수소결합을 형성함을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상보성 정도는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더더욱 바람직하게는 적어도 90% 또는 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 상보성 정도는 100%이다.
"유도체(derivative)"라는 용어는 뉴클레오타이드 염기, 당 또는 포스페이트 상에서 핵산의 여하한 화학적 유도화를 포함한다. "유도체"라는 용어는 또한 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오타이드들 및 뉴클레오타이드 유사체들을 함유하는 핵산도 포괄한다. 핵산의 유도체화는 바람직하게는 그의 안정성을 증가시킨다.
본 발명에 따르면, "핵산 서열로부터 유래된 핵산 서열"은 그것이 유래된 핵산의 변이체인 핵산을 지칭한다. 바람직하게는 RNA 분자 내 특정 서열을 대체하는 경우, 특정 서열에 대한 변이체인 서열은 RNA 안정성 및/또는 번역 효율을 유지한다.
"nt"는 뉴클레오타이드의 약자이거나; 또는 바람직하게는 핵산 분자 내의 연속적인 뉴클레오타이드를 의미한다.
본 발명에 따르면, 용어 "코돈"은 리보솜에서 단백질 합성 동안 어느 아미노산이 다음에 첨가될지를 특정하는 코딩 핵산의 염기 3개(삼중항)를 지칭한다.
"전사" 및 "전사하는"이라는 용어는 특정 핵산 서열을 갖는 핵산 분자("핵산 주형")가 RNA 중합효소에 의해 판독되어 RNA 중합효소가 단일가닥 RNA 분자를 생성하는 과정을 일컫는다. 전사 과정에서 핵산 주형의 유전 정보가 전사된다. 핵산 주형은 DNA일 수 있으나; 예를 들면, 알파바이러스 핵산 주형으로부터 전사되는 경우에는 주형이 전형적으로 RNA일 수 있다. 이어서, 전사된 RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "전사"는 "시험관내 전사"를 포함하며, 여기서 용어 "시험관내 전사"는 RNA, 특히 mRNA가 무세포 시스템에서 시험관내 합성되는 과정에 관한 것이다. 바람직하게는, 클로닝 벡터(cloning vector)는 전사체의 생성을 위해 적용된다. 이러한 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로 명시되며, 본 발명에 따르면 용어 "벡터"에 포함된다. 클로닝 벡터는 바람직하게는 플라스미드이다. 본 발명에 따르면, RNA는 바람직하게는 시험관내 전사된 RNA(IVT-RNA)이고 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있다. 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA의 클로닝에 의해 수득되고, 시험관내 전사를 위한 적절한 벡터 내로 도입함으로써 수득할 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 수득될 수 있다.
전사 동안 생산된 단일가닥 핵산 분자는 전형적으로 주형의 상보적인 서열 인 핵산 서열을 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "주형" 또는 "핵산 주형" 또는 "주형 핵산"은 일반적으로 복제되거나 전사될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다.
"핵산 서열로부터 전사된 핵산 서열" 및 이와 유사한 용어는 주형 핵산 서열의 전사 생성물인 완전한 RNA 분자의 일부로서 도용한 핵산 서열을 지칭한다. 전형적으로, 전사된 핵산 서열은 단일가닥 RNA 분자이다.
"핵산의 3'-말단"은 본 발명에 따라 자유 수산기를 갖는 말단을 지칭한다. 이중가닥 핵산, 특히 DNA의 도식적 표현에서, 3'-말단은 항상 우측면상에 있다. "핵산의 5'-말단"은 본 발명에 따라 유리 포스페이트기를 갖는 말단을 지칭한다. 이중가닥 핵산, 특히 DNA의 도식적 표현에서, 5'-말단은 항상 좌측면상에 있다.
5' 말단 5'--P-NNNNNNN-OH-3' 3' 말단
3'-HO-NNNNNNN-P--5'
"상류"는 핵산 분자의 제 2 요소에 대한 핵산 분자의 제 1 요소의 상대적인 위치를 나타내며, 여기서 두 핵산 분자는 동일한 핵산 분자에 포함되며, 제 1 요소는 핵산 분자의 제 2 요소보다 5' 말단에 위치한다. 그 후 제 2 요소는 해당 핵산 분자의 제 1 요소의 "하류"인 것으로 지칭한다. 제 2 요소의 "상류"에 위치한 요소는 해당 제 2 요소의 "5'"에 있는 것과 동의어라고 할 수 있다. 이중가닥 핵산 분자의 경우, "상류" 및 "하류"와 같은 표시는 (+) 가닥에 대해 부여된다.
본 발명에 따르면, "기능적 결합" 또는 "기능적으로 결합된"은 기능적 관계로 연결된 것에 관한 것이다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적으로 관련이 있다면 "기능적으로 결합"되어 있는 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사에 영향을 준다면 프로모터는 코딩 서열에 기능적으로 결합된다. 기능적으로 결합된 핵산은 전형적으로 다른 핵산 서열에 의해 적절하게 분리되어 서로에 인접하며, 특정 실시형태에서는 RNA 중합효소에 의해 전사되어 단일 RNA 분자(공통 전사체)를 생성한다.
특정 실시형태에서, 핵산은 본 발명에 따라 핵산에 대해 동종이거나 이종일 수 있는 발현 제어 서열에 기능적으로 결합된다.
용어 "발현 제어 서열"은 본 발명에 따라 프로모터, 리보솜-결합 서열 및 유전자의 전사 또는 유도된 RNA의 번역을 조절하는 다른 조절 요소를 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 발현 제어 서열을 조절할 수 있다. 발현 제어 서열의 정확한 구조는 종 또는 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로 전사 및 번역 개시에 관련된 5'-비전사 및 5'- 및 3'-비번역 서열을 각각 포함한다. 보다 구체적으로, 5'-비전사 발현 제어 서열은 기능적으로 연결된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포괄하는 프로모터 영역을 포함한다. 발현 제어 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상류 활성자 서열을 포함할 수 있다. DNA 분자의 발현 제어 서열은 일반적으로 TATA 박스, 캡핑 서열, 및 CAAT 서열 등과 같은 5'-비전사 서열 및 5'- 및 3'-비번역 서열을 포함한다. 알파바이러스 RNA의 발현 제어 서열은 서브게놈 프로모터 및/또는 하나 이상의 보존서열구성(들)을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 특정 발현 제어 서열은 본원에 기재된 바와 같이 알파바이러스의 서브게놈 프로모터이다.
본원에서 명시된 핵산 서열, 특히 전사 가능한 서열 및 코딩 핵산 서열은 임의의 발현 제어 서열, 특히 상기 핵산 서열과 동종이거나 이종일 수 있는 프로모터와 조합될 수 있으며, 용어 "동종"은 핵산 서열이 또한 기능적으로 발현 제어 서열에 자연적으로 연결되어 있다는 사실을 일컫고, 용어 "이종"은 핵산 서열이 발현 제어 서열에 자연적으로 기능적으로 연결되어 있지 않다는 사실을 일컫는다.
전사 가능한 핵산 서열, 특히 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 발현 제어 서열은 이들이 서로 공유 결합되어 전사 가능한 및 특히 코딩 핵산 서열의 전사 또는 발현이 발현 제어 서열의 영향 하에 있거나 제어 하에 있는 경우에, 서로 "기능적으로" 결합되어 있는 것이다. 만일 핵산 서열이 기능성 펩티드 또는 단백질로 번역되는 경우, 코딩 서열에 기능적으로 연결된 발현 제어 서열의 유도에 의해 코딩 서열 내 프레임 쉬프트를 일으키지 않고 또는 코딩 서열이 소망되는 펩티드나 단백질로 번역되지 못하는 일 없이, 상기 코딩 서열의 전사가 일어난다.
용어 "프로모터" 또는 "프로모터 영역"은 RNA 중합효소에 대한 인식 및 결합 부위를 제공함으로써, 전사체, 예를 들어 코딩 서열을 포함하는 전사체의 합성을 제어하는 핵산 서열을 말한다. 프로모터 영역은 상기 유전자의 전사 조절에 관여하는 추가 인자에 대한 추가적인 인식 부위 또는 결합 부위를 포함할 수 있다. 프로모터는 원핵 또는 진핵 유전자의 전사를 제어할 수 있다. 프로모터는 "유도성"일 수 있고 유도인자에 반응하여 전사를 개시할 수 있으며, 전사가 유도인자에 의해 조절되지 않으면 "항시성(constitutive)"일 수 있다. 유도성 프로모터는 매우 적은 정도로만 발현되거나 유도인자가 없는 경우에는 전혀 발현되지 않는다. 유도인자가 있으면 유전자가 "스위치 온"되거나 전사 수준이 증가한다. 이것은 대체로 특정 전사 인자의 결합에 의해 매개된다. 본 발명에 따른 특정 프로모터는 본원에 기재된 바와 같이 알파바이러스의 서브게놈 프로모터이다. 다른 특정 프로모터는 알파바이러스의 게놈 양성-가닥 또는 음성-가닥 프로모터이다.
용어 "코어 프로모터"는 프로모터에 포함되는 핵산 서열을 의미한다. 코어 프로모터는 전형적으로 전사를 적절히 개시하는데 필요한 프로모터의 최소 부분이다. 코어 프로모터는 전형적으로 전사 개시 부위 및 RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함한다.
"중합효소"는 일반적으로 단량체 빌딩 블록으로부터 중합체 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 실체를 지칭한다. "RNA 중합효소"는 리보뉴클레오타이드 빌딩 블록으로부터 RNA 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 실체이다. "DNA 중합효소"는 데옥시리보뉴클레오타이드 빌딩 블록으로부터 DNA 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 실체이다. DNA 중합효소 및 RNA 중합효소의 경우, 분자 실체는 전형적으로 단백질 또는 복수의 단백질의 집합체 또는 복합체이다. 전형적으로, DNA 중합효소는 전형적으로 DNA 분자인 주형 핵산을 기반으로 DNA 분자를 합성한다. 전형적으로, RNA 중합효소는 주형 핵산을 기반으로 RNA 분자를 합성하고, 주형 핵산은 DNA 분자(RNA 중합효소가 DNA 의존성 RNA 중합효소, DdRP인 경우)이거나 RNA 분자이다(RNA 중합효소가 RNA 의존성 RNA 중합효소인 RdRP인 경우).
"RNA-의존성 RNA 중합효소" 또는 "RdRP"는 RNA 주형으로부터 RNA의 전사를 촉매하는 효소이다. 알파바이러스 RNA 의존성 RNA 중합효소의 경우, 게놈 RNA 및 (+) 가닥 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 순차적 합성은 RNA 복제로 이어진다. 알파바이러스 RNA 의존성 RNA 중합효소는 "RNA 복제효소"와 동의어로 사용된다. 일반적으로 RNA 의존성 RNA 중합효소는 레트로바이러스를 제외한 모든 RNA 바이러스에 의해 코딩된다. RNA 의존성 RNA 중합효소를 코딩하는 바이러스의 전형적인 대표는 알파바이러스이다.
본 발명에 따르면, "RNA 복제"는 일반적으로 주어진 RNA 분자(주형 RNA 분자)의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성된 RNA 분자를 지칭한다. 합성되는 RNA 분자는 예를 들어, 주형 RNA 분자에 동일하거나 상보적일 수 있다. 일반적으로, RNA 복제는 DNA 중간체의 합성을 통해 일어날 수 있거나, RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRP)에 의해 매개되는 RNA 의존적 RNA 복제에 의해 직접적으로 발생할 수 있다. 알파바이러스의 경우 RNA 복제는 DNA 중간체를 통해 일어나지 않지만 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRP)에 의해 매개된다: 주형 RNA 가닥(제 1 RNA 가닥) 또는 그 일부가 제 1 RNA 가닥 또는 그의 일부에 상보적인 제 2 RNA 가닥의 합성을 위해 주형으로써 작용한다. 제 2 RNA 가닥 또는 그의 일부는 순서대로 선택적으로 제 2 RNA 가닥 또는 그의 일부에 상보적인 제 3 RNA 가닥의 주형으로 작용할 수 있다. 그로 인해, 제 3 RNA 가닥은 제 1 RNA 가닥 또는 그의 일부와 동일하다. 따라서, RNA 의존성 RNA 중합효소는 주형의 상보적인 RNA 가닥을 직접 합성 가능하고, (상보적인 중간체 가닥을 통해) 동일한 RNA 가닥을 간접적으로 합성할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "주형 RNA"는 RNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 전사되거나 복제될 수 있는 RNA를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "유전자"는 하나 이상의 세포 생성물을 생산하고/하거나 하나 이상의 세포 간 또는 세포 내 기능을 달성하기 위한 특정 핵산 서열을 지칭한다. 보다 구체적으로, 상기 용어는 특정 단백질 또는 기능적 또는 구조적 RNA 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 섹션(전형적으로 DNA이지만, RNA 바이러스의 경우에는 RNA이다)에 관한 것이다.
본원에 사용된 "분리된 분자"는 다른 분자, 예컨대 다른 세포 물질이 실질적으로 존재하지 않는 분자를 의미한다. "분리된 핵산"이라는 용어는 핵산이 (i) 시험관내, 예를 들면 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되거나, (iii) 예를 들면 절단 및 겔-전기천공 분획화에 의해 정제되거나, 또는 또는 (iv) 예를 들어 화학 합성법에 의해 합성된 핵산을 의미한다. 분리된 핵산은 재조합 기술에 의해 조작 가능한 핵산이다.
용어 "벡터"는 가장 일반적인 의미로 본원에서 사용되며, 예를 들어 상기 핵산을 원핵 및/또는 진핵 숙주세포 내로 도입시킬 수 있고, 적절한 경우, 게놈 내로 일체화할 수 있는, 여하한 중간체 운반체이 이에 포괄된다. 이러한 벡터는 바람직하게는 세포 내에서 복제 및/또는 발현된다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스 게놈 및 이들의 분획을 포함한다.
본 발명의 문맥상 용어 "재조합"은 "유전자 조작을 통해 제조됨"을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상 재조합 세포와 같은 "재조합 물체"는 자연적으로 발생하지 않다.
본 명세서에 사용된 용어 "자연-발생"은 대상이 자연계에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 유기체(바이러스를 포함함)에 존재하고 자연계 원천으로부터 분리할 수 있고 인간에 의해 실험실에서 인위적으로 변형된 바 없는 펩티드 또는 핵산은 자연 발생적이다. "자연계에서 발견된"이란 용어는 "자연에 존재하는"을 의미하며, 공지된 물질뿐만 아니라 자연계에서 아직 발견된 바 및/또는 분리된 바 없지만, 미래에 자연 원천으로부터 발견될 수 있고/있거나 분리될 수 있는 물질을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "발현"은 그의 가장 일반적인 의미로 사용되며, RNA의 생산 또는 RNA 및 단백질의 생산을 포함한다. 이것은 또한 핵산의 부분적 발현을 포함한다. 뿐만 아니라, 발현은 일시적이거나 안정한 것일 수 있다. RNA와 관련하여, "발현" 또는 "번역"이라는 용어는 세포의 리포좀 내에서 코딩 RNA(예를 들어 메신저 RNA)의 한 가닥이 아미노산 서열의 어셈블리를 지시하여 펩티드 또는 단백질을 만드는 프로세스에 관한 것이다.
용어 "mRNA"는 "메신저-RNA"를 의미하며 전형적으로 DNA 주형을 이용하여 생성되고 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 전사체에 관한 것이다. 전형적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역, 3'-UTR, 및 폴리(A) 서열을 포함한다. mRNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 전사 방법론은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 것이다. 예를 들어, 시험관내 전사 키트가 시중에 다양하게 판매되고 있다. 본 발명에 따르면, mRNA는 변형 및 캡핑을 안정화시킴으로서 변형시킬 수도 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "폴리(A) 서열" 또는 "폴리(A) 꼬리"는 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치하는 연속되거나 중단된 아데닐레이트 잔기 서열을 지칭한다. 연속적인 서열은 연속적인 아데닐레이트 잔기를 특징으로 한다. 사실상, 연속적인 폴리(A) 서열이 전형적인 것이다. 폴리(A) 서열은 전사 후 주형-독립적 RNA 중합효소에 의해 RNA의 자유 3'-말단에 세포 핵에서 진핵세포 전사 중에 부착되지만, 통상적으로 진핵세포 DNA에서 암호화되지 않은 반면, 본 발명은 DNA에 의해 코딩된 폴리(A) 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 핵산 분자에 관련하여 용어 "1차 구조체"는 뉴클레오타이드 단량체의 선형 서열을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 핵산 분자에 관련하여 용어 "2차 구조체"는 염기쌍을 반영하는 핵산 분자의 2차원적 표현을 의미하며; 예컨대 단일가닥 RNA 분자의 경우, 특히 분자내 염기쌍이다. 각 RNA 분자는 단 하나의 폴리뉴클레오타이드 사슬만을 가지고 있지만, 분자는 전형적으로 (분자내) 염기쌍의 영역을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 용어 "2차 구조체"는 제한 없이 염기쌍, 스템, 스템루프, 벌지, 내부루프 및 다중 분기 루프와 같은 루프를 포함하는 구조적 모티프를 포함한다. 핵산 분자의 2차 구조체는 염기쌍을 나타내는 2차원 도면(평면 그래프)으로 나타낼 수 있다(RNA 분자의 2차 구조체에 대한 더 자세한 설명은 Auber et al., J. Graph Algorithms Appl., 2006, vol. 10, pp. 329-351 참조). 본원에 기재된 바와 같이, 특정 RNA 분자의 2차 구조체가 본 발명의 문맥상 적절하다.
본 발명에 따르면, 핵산 분자, 특히 단일가닥 RNA 분자의 2차 구조체는 RNA 2차 구조체 예측을 위해 웹서버 (http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)를 이용하여 예측함으로써 결정된다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 핵산 분자에 관련하여 "2차 구조체"는 구체적으로 상기 예측에 의해 결정된 2차 구조체를 말한다. MFOLD 구조 예측(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)을 이용하여 예측하거나 확인할 수도 있다.
본 발명에 따르면, "염기쌍"은 2개의 뉴클레오타이드 염기가 염기 상의 공여체와 수여체 간의 수소결합을 통해 서로 결합하는 2차 구조체의 구조 모티프이다. 상보적인 염기인 A:U 및 G:C는 염기 상의 공여체와 수여체 간의 수소결합을 통해 안정한 염기쌍을 형성하고; A:U 및 G:C 염기쌍을 왓슨-크릭 염기쌍이라고 한다. 약한 염기쌍(워블 염기쌍이라고 함)은 염기 G 및 U(G:U)에 의해 형성된다. 염기쌍 A:U 및 G:C는 표준 염기쌍이라고 한다. G:U(RNA에서 상당히 자주 발생함)와 같은 다른 염기쌍 및 다른 희귀한 염기쌍(예컨대 A:C, U:U)은 비표준 염기쌍이라고 한다.
본 발명에 따르면, "뉴클레오타이드 결합형성"은 그들의 염기가 염기쌍(표준 또는 비표준 염기쌍, 바람직하게는 표준 염기쌍, 가장 바람직하게는 왓슨-크릭 염기쌍)을 형성하도록 서로 결합하는 2개의 뉴클레오타이드를 일컫는다.
본 발명에 따르면, 핵산 분자에 관련하여 용어 "스템루프" 또는 "헤어핀" 또는 "헤어핀 루프"는 모든 같은 의미로 핵산 분자, 전형적으로 단일가닥 핵산 분자, 예컨대 단일가닥 RNA의 특정 이차 구조라고 일컫는다. 스템루프에 의해 나타내지는 특정 2차 구조체는 스템 및 헤어핀 루프라고도 하는 (말단) 루프를 포함하는 연속적인 핵산 서열로 이루어지며, 여기서 스템은 2개의 이웃하는 완전히 또는 부분적으로 상보적인 서열 요소에 의해 형성되고; 이는 스템-루프 구조의 루프를 형성하는 짧은 서열(예를 들어, 3-10개의 뉴클레오타이드)에 의해 분리된다. 2개의 이웃하는 완전히 또는 부분적으로 상보적인 서열은 예를 들어, 스템루프 요소 스템 1 및 스템 2로 정의될 수 있다. 스템루프는 이들 2개의 이웃하는 완전히 또는 부분적으로 상보적인 서열, 예를 들어 스템루프 요소 스템 1 및 스템 2가 서로 염기쌍을 형성하는 경우 형성되어, 스템루프 요소 스템 1과 스템 2 사이에 위치한 짧은 서열에 의해 형성된 이의 말단에서 쌍을 이루지 않는 루프를 포함하는 이중가닥 핵산 서열을 유도한다. 따라서, 스템루프는 핵산 분자의 2차 구조체 수준에서 서로 염기 쌍을 형성하고, 핵산 분자의 1차 구조체 수준에서 스템 1 또는 스템 2의 일부가 아닌 짧은 서열에 의해 분리된 2개의 스템(스템 1 및 스템 2)를 포함한다. 실례로, 스템루프의 2차원 표현은 롤리팝 형상의 구조와 유사하다. 스템-루프 구조의 형성은 자체적으로 되접어서 쌍을 이루는 이중가닥을 형성할 수 있는 서열의 존재를 필요로 하고; 쌍을 이루는 이중가닥은 스템 1 및 스템 2에 의해 형성된다. 스템루프 요소의 안정성은 전형적으로 길이, 스템 2의 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성할 수 있는 스템 1의 뉴클레오타이드의 수(바람직하게는 표준 염기쌍, 보다 바람직하게는 왓슨-크릭 염기쌍) 대 스템 2의 뉴클레오타이드와 이러한 염기쌍을 형성할 수 없는(미스매칭 또는 벌지) 스템 1의 뉴클레오타이드의 수에 의해 결정된다. 본 발명에 따르면, 최적의 루프 길이는 3-10개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 4 내지 7개의, 뉴클레오타이드, 예컨대 4개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드, 6개의 뉴클레오타이드 또는 7개의 뉴클레오타이드이다. 주어진 핵산 서열이 스템루프을 특징으로 하는 경우, 각각의 상보적인 핵산 서열은 전형적으로 스템루프을 특징으로 한다. 스템루프는 전형적으로 단일가닥 RNA 분자에 의해 형성된다. 예를 들어, 몇몇 스템루프는 알파바이러스 게놈 RNA의 5' 복제인식서열에 존재한다(도 1 참조).
본 발명에 따르면, 핵산 분자의 특정 2차 구조체(예를 들어, 스템루프)와 관련하여 "파괴" 또는 "파괴하다"는 특정 2차 구조체가 부재하거나 변경된 것을 의미한다. 전형적으로, 2차 구조체는 2차 구조체의 일부인 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 변화의 결과로 파괴될 수 있다. 예를 들어, 스템루프는 스템을 형성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 변화에 의해 파괴되어 뉴클레오타이드 결합형성이 불가능하게 한다.
본 발명에 따르면, "2차 구조체 파괴에 대한 보완" 또는 "2차 구조체 파괴를 보완한다"는 것은 핵산 서열에서 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화를 지칭하고; 보다 일반적으로, 이는 핵산 서열에서 하나 이상의 제 2 뉴클레오타이드 변화를 지칭하며, 핵산 서열은 또한 하나 이상의 제 1 뉴클레오타이드 변화를 포함하며, 하기와 같은 특징을 갖는다: 하나 이상의 제 2 뉴클레오타이드 변화가 없는 경우, 하나 이상의 제 1 뉴클레오타이드는 핵산 서열의 2차 구조체의 파괴를 야기하고, 하나 이상의 제 1 뉴클레오타이드 변화 및 하나 이상의 제 2 뉴클레오타이드 변화의 동시 발생은 핵산의 2차 구조체를 파괴시키지 않는다. 동시 발생은 하나 이상의 제 1 뉴클레오타이드 변화 및 하나 이상의 제 2 뉴클레오타이드 변화 모두의 존재를 의미한다. 일반적으로, 하나 이상의 제 1 뉴클레오타이드 변화 및 하나 이상의 제 2 뉴클레오타이드 변화가 동일한 핵산 분자 내에 함께 존재한다. 특정 일 실시형태에서, 2차 구조체 파괴를 보완하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화는 하나 이상의 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 보완하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화이다. 따라서, 일 실시형태에서, "2차 구조체 파괴의 보완"은 "뉴클레오타이드 결합형성 파괴에 대한 보완", 즉 하나 이상의 뉴클레오타이드 결합형성 파괴, 예를 들면 하나 이상의 스템루프 내의 하나 이상의 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 의미한다. 하나 이상의 뉴클레오타이드 결합형성 파괴는 적어도 하나의 개시코돈의 제거에 의해 도입될 수 있다. 2차 구조체 파괴를 보완하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화 각각은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 추가, 치환 및/또는 삽입으로부터 각각 독립적으로 선택할 수 있는 뉴클레오타이드 변화이다. 일례에서, 뉴클레오타이드 결합형성 A:U는 A가 C로 치환에 의해 파괴된 경우(C 및 U는 전형적으로 뉴클레오타이드 쌍을 형성하기에 적합하지 않다); 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 보완하는 뉴클레오타이드 변화는 U를 G로 치환함으로써 C:G 뉴클레오타이드 쌍의 형성을 가능하게 할 수 있다. 따라서, U를 G로의 치환은 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 보완한다. 다른 예에서, 뉴클레오타이드 결합형성 A:U는 A가 C로 치환에 의해 파괴되는 경우; 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 보완하는 뉴클레오타이드 변화는 C를 A로 치환하는 것일 수 있어서, 원래의 A:U 뉴클레오타이드 결합형성의 형성을 회복시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명에서, 원래의 핵산 서열을 회복시키거나 신규한 AUG 삼중항을 생성하지 않는 2차 구조체 파괴에 대해 보완하는 뉴클레오타이드 변화가 바람직하다. 상기 예들에서, U를 G로의 치환은 C를 A로의 치환보다 바람직하다.
본 발명에 따르면, 핵산 분자에 관련하여 용어 "3차 구조체"는 원자 좌표에 의해 정의된 바와 같은 핵산 분자의 3차원 구조를 나타낸다.
본 발명에 따르면, RNA, 예를 들어 mRNA와 같은 핵산은 펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있다. 따라서, 전사 가능한 핵산 서열 또는 그의 전사체는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, "펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산"이란 용어는 적절한 환경, 바람직하게는 세포 내에 존재한다면 핵산이 아미노산의 어셈블리를 지시하여 번역 과정 동안에 펩티드 또는 단백질을 생산할 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 코딩 RNA는 세포 번역 시스템과 상호작용하여 코딩 RNA의 번역을 허용하여 펩티드 또는 단백질을 생성할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "펩티드"는 올리고- 및 폴리펩티드를 포함하고, 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상, 바람직하게는 6개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 바람직하게는 13개 이상, 바람직하게는 16개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 바람직하게는 50개 이하, 바람직하게는 100개 이하 또는 바람직하게는 150개 이하의 펩티드결합을 통해 다른 하나와 연결된 연속적인 아미노산을 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질"은 큰 펩티드, 바람직하게는 적어도 151개의 아미노산을 갖는 펩티드를 지칭하지만, 용어 "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 일반적으로 동의어로 사용된다.
용어 "펩티드" 및 "단백질"은 본 발명에 따라 아미노산 성분뿐만 아니라 당 및 포스페이트 구조와 같은 비-아미노산 성분을 함유하는 물질을 포함하고, 또한 에스터, 티오에테르 또는 이황화결합과 같은 결합을 함유하는 물질을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "개시코돈" 및 "시작코돈"은 잠재적으로 리보솜에 의해 번역되는 제 1 코돈인 RNA 분자의 코돈(염기 삼중항)을 동의어로 지칭한다. 이러한 코돈은 전형적으로 진핵세포에서 아미노산 메티오닌 및 원핵세포에서 변형된 메티오닌을 코딩한다. 진핵세포과 원핵세포에서 가장 공통적인 개시코돈은 AUG이다. 본원에서 AUG 이외에 개시코돈을 의미하는 것을 구체적으로 언급하지 않는 한, RNA 분자와 관련하여 용어 "개시코돈" 및 "시작코돈"은 코돈 AUG를 지칭한다. 본 발명에 따르면, 용어 "개시코돈" 및 "시작코돈"은 또한 데옥시리보핵산의 상응하는 염기 삼중항, 즉 RNA의 개시코돈을 코딩하는 염기 삼중항을 지칭하는데 사용된다. 메신저 RNA의 개시코돈이 AUG인 경우, AUG를 코딩하는 염기 삼중항은 ATG이다. 본 발명에 따르면, 용어 "개시코돈" 및 "시작코돈"은 바람직하게는 기능적 개시코돈 또는 개시코돈, 즉 번역을 시작하기 위해 리보솜에 의해 코돈으로서 사용되거나 사용될 수 있는 개시코돈 또는 시작코돈을 지칭한다. 예를 들어 캡과 코돈의 거리가 짧기 때문에, 번역을 시작하기 위해 리보솜에 의해 코돈으로 사용되지 않는 RNA 분자 내의 AUG 코돈이 있을 수 있다. 이들 코돈은 기능적 개시코돈 또는 시작코돈이라는 용어에 의해 포함되지 않는다.
본 발명에 따르면, "오픈 리딩 프레임의 시작코돈" 또는 "오픈 리딩 프레임의 개시코돈"이란 용어는 코딩 서열, 예를 들어 자연계에서 발견되는 핵산 분자의 암호화 서열에서 단백질 합성을 위한 개시코돈으로 작용하는 염기 삼중항을 지칭한다. RNA 분자에서, 오픈 리딩 프레임의 시작코돈은 엄격하게 요구되는 것은 아니지만 종종 5' 비번역 영역(5'-UTR)이 선행된다.
본 발명에 따르면, "천연 오픈 리딩 프레임의 시작코돈" 또는 "천연 오픈 리딩 프레임의 개시코돈"이란 용어는 천연 코딩 서열에서 단백질 합성을 위한 개시코돈으로서 작용하는 염기 삼중항을 지칭한다. 천연 코딩 서열은 예를 들어, 자연계에서 발견되는 핵산 분자의 코딩 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 (변이체 핵산 분자 내에 존재하지 않아) (천연 코딩 서열에 존재하는) 천연 시작코돈이 제거되어 자연계에서 발견되는 핵산 분자의 변이체를 제공한다.
본 발명에 따르면, "첫 번째 AUG"는 메신저 RNA 분자의 가장 상류인 AUG 염기 삼중항, 바람직하게는 번역을 시작하기 위해 리보솜에 의해 코돈으로 사용되거나 사용될 수 있는 메신저 RNA 분자의 가장 상류인 AUG 염기 삼중항을 의미한다. 따라서, "첫 번째 ATG"는 첫 번째 AUG를 코딩하는 코딩 DNA 서열의 ATG 염기 삼중항을 지칭한다. 일부 예에서, mRNA 분자의 첫 번째 AUG는 오픈 리딩 프레임의 시작코돈, 즉 리보솜 단백질 합성 동안 시작코돈으로 사용되는 코돈이다.
본 발명에 따르면, 핵산 변이체의 특정 요소와 관련하여 용어 "제거를 포함한다" 또는 "제거를 특징으로 하는" 및 유사한 용어는 표준 핵산 분자와 비교하여 상기 특정 요소가 기능이 없거나 핵산 변이체에 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 제한 없이, 제거는 특정 요소의 전부 또는 일부의 결실, 특정 요소의 전부 또는 일부의 치환, 또는 특정 요소의 기능적 또는 구조적 특성의 변경으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열의 기능성 요소의 제거는 제거를 포함하는 핵산 변이체의 위치에서 기능이 나타나지 않아야 한다. 예를 들어, 특정 개시코돈의 제거를 특징으로 하는 RNA 변이체는 리보솜 단백질 합성이 제거를 특징으로 하는 RNA 변이체의 위치에서 개시되지 않아야 한다. 핵산 서열의 구조적 요소를 제거는 구조적 요소가 제거를 포함하는 핵산 변이체의 위치에 존재하지 않아야 한다. 예를 들어, 특정 AUG 염기 삼중항, 즉 특정 위치에서의 AUG 염기 삼중항의 제거를 특징으로 하는 RNA 변이체는 예를 들어, 특정 AUG 염기 삼중항의 일부 또는 전부의 결실(예컨대 △AUG), 또는 임의의 하나 이상의 다른 뉴클레오타이드에 의한 특정 AUG 염기 삼중항의 하나 이상의 뉴클레오타이드(A, U, G)의 치환을 특징으로 할 수 있어, 얻어진 변이체의 뉴클레오타이드 서열은 상기 AUG 염기 삼중항을 포함하지 않는다. 하나의 뉴클레오타이드의 적절한 치환은 AUG 염기 삼중항을 GUG, CUG 또는 UUG 염기 삼중항으로, 또는 AAG, ACG 또는 AGG 염기 삼중항으로, 또는 AUA, AUC 또는 AUU 염기 삼중항으로 전환시키는 것들이다. 그에 따라 더 많은 뉴클레오타이드의 적절한 치환기를 선택할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "알파바이러스"는 광범위하게 이해되어야 하며, 알파바이러스의 특징을 갖는 임의의 바이러스 입자를 포함한다. 알파바이러스의 특성은 RNA 중합효소 활성을 포함하여 숙주세포에서의 복제에 적합한 유전 정보를 코딩하는 (+) 가닥 RNA의 존재를 포함한다. 많은 알파바이러스의 추가적인 특성은 예를 들어 문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]에 기재되어 있다. 용어 "알파바이러스"는 자연계에서 발견되는 알파바이러스뿐만 아니라 임의의 변이체 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 또는 유도체는 자연계에서 발견되지 않는다.
일 실시형태에서, 알파바이러스는 자연계에서 발견되는 알파바이러스이다. 전형적으로, 자연계에서 발견되는 알파바이러스는 동물(인간과 같은 척추동물 및 곤충과 같은 절지동물을 포함한다)과 같은 임의의 하나 이상의 진핵 생물체에 대해 감염성이 있다.
자연계에서 발견되는 알파바이러스는 바람직하게는 이하와 같이 이루어진 군으로부터 선택된다: Barmah Forest 바이러스 복합체 (Barmah Forest 바이러스를 포함한다); 동부형 마뇌염(Eastern equine encephalitis) 복합체 (동부형 마뇌염 바이러스의 7가지 항원 유형을 포함한다); Middelburg 바이러스 복합체 (Middelburg 바이러스를 포함한다); Ndumu 바이러스 복합체 (Ndumu 바이러스를 포함한다); Semliki Forest 바이러스 복합체 (Bebaru 바이러스, Chikungunya 바이러스, Mayaro 바이러스 및 그 아류형 Una 바이러스, O'Nyong Nyong 바이러스, 및 그 아류형 Igbo-Ora 바이러스, Ross River 바이러스 및 그 아류형 Bebaru 바이러스, Getah 바이러스, Sagiyama 바이러스, Semliki Forest 바이러스 및 그 아류형 Me Tri 바이러스를 포함한다); 베네수엘라 마뇌염(Venezuelan equine encephalitis) 복합체 (Cabassou 바이러스, Everglades 바이러스, Mosso das Pedras 바이러스, Mucambo 바이러스, Paramana 바이러스, Pixuna 바이러스, Rio Negro 바이러스, Trocara 바이러스 및 그 아류형 Bijou Bridge 바이러스, 베네수엘라 마뇌염 바이러스를 포함한다); 서부형 마뇌염(WWestern equine encephalitis) 복합체 (Aura 바이러스, Babanki 바이러스, Kyzylagach 바이러스, Sindbis 바이러스, Ockelbo 바이러스, Whataroa 바이러스, Buggy Creek 바이러스, Fort Morgan 바이러스, Highlands J 바이러스, 서부형 마뇌염 바이러스를 포함한다); 및 연어류 췌장병 바이러스(Salmon pancreas disease virus); 수면 질환 바이러스(Sleeping Disease virus); 남방코끼리바다표범 바이러스(Southern elephant seal virus); Tonate 바이러스를 포함하는 일부 미분류된 바이러스를 들 수 있다. 보다 바람직하게는, 알파바이러스는 Semliki Forest 바이러스 복합체 (Semliki Forest 바이러스를 포함하고, 상기한 바와 같은 바이러스 유형을 포함한다), 서부형 마뇌염 복합체 (Sindbis 바이러스를 포함하고, 상기한 바와 같은 바이러스 유형을 포함한다), 동부형 마뇌염 바이러스 (상기한 바와 같은 바이러스 유형을 포함한다), 베네수엘라 마뇌염 복합체 (베네수엘라 마뇌염 바이러스를 포함하고, 상기한 바와 같은 바이러스 유형을 포함한다)로 이루어진 구능로부터 선택된다.
보다 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스는 Semliki Forest 바이러스이다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스는 Sindbis 바이러스이다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스는 베네수엘라 마뇌염 바이러스이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 알파바이러스는 자연계에서 발견되는 알파바이러스가 아니다. 전형적으로 자연계에 존재하지 않는 알파바이러스는 자연계에서 발견되는 알파바이러스의 변이체 또는 유도체이며, 뉴클레오타이드 서열, 즉 게놈 RNA에서 적어도 하나의 돌연변이에 의해 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 구별된다. 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이는 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 치환 또는 결실로부터 선택될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열에서의 돌연변이는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 단백질에서의 돌연변이와 관련되거나 관련 없을 수 있다. 예를 들어, 자연계에 존재하지 않는 알파바이러스는 약독 알파바이러스일 수 있다. 자연계에 존재하지 않는 약독 알파바이러스는 전형적으로 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 구별되어 그 뉴클레오타이드 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 알파바이러스이며, 이는 감염성이 전혀 없거나 감염성이 있지만 질병 발생력이 약화되어 있거나 질병 발생력이 전혀 없는 알파바이러스이다. 일례로서, TC83은 자연계에서 발견되는 베네수엘라 마뇌염 바이러스 (VEEV)와 구별되는 약독 알파바이러스이다(McKinney et al., 1963, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1963, vol. 12; pp. 597-603).
또한, 알파바이러스 속의 구성은 인간에서의 상대적인 임상 특징에 의거하여 분류될 수도 있다: 주로 뇌염과 관련된 알파바이러스, 주로 발열, 발진 및 다발성관절염과 관련된 알파바이러스를 들 수 있다.
용어 "알파바이러스"는 알파바이러스에서 발견되거나 예를 들어 유전공학적 조작에 의해 알파바이러스로부터 유래되거나 알파바이러스로부터 유도된 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, "SFV"는 Semliki Forest 바이러스를 나타낸다. 본 발명에 따르면, "SIN" 또는 "SINV"는 Sindbis 바이러스를 나타낸다. 본 발명에 따르면, "VEE" 또는 "VEEV"는 베네수엘라 마뇌염 바이러스를 나타낸다.
본 발명에 따르면, "알파바이러스"라는 용어는 알파바이러스로부터 기원된 개체를 나타낸다. 예를 들어, 알파바이러스의 단백질은 알파바이러스에서 발견되는 단백질 및/또는 알파바이러스에 의해 코딩된 단백질을 지칭할 수 있고; 알파바이러스의 핵산 서열은 알파바이러스에서 발견되는 핵산 서열 및/또는 알파바이러스에 의해 코딩된 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 바람직하게는, "알파바이러스의" 핵산 서열은 "알파바이러스의 게놈의" 핵산 서열 및/또는 "알파바이러스의 게놈 RNA의" 핵산 서열을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "알파바이러스 RNA"는 알파바이러스 게놈 RNA (즉, (+) 가닥), 알파바이러스 게놈 RNA (즉, (-) 가닥)의 상보체 및 서브게놈 전사체 (즉 (+) 가닥) 또는 이의 임의의 단편을 지칭한다.
본 발명에 따르면, "알파바이러스 게놈"은 알파바이러스의 게놈 (+) 가닥 RNA를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "자연성 알파바이러스 서열" 및 유사한 용어는 전형적으로 자연-발생 알파바이러스(자연계에서 발견되는 알파바이러스)의 (예를 들어 핵산) 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "자연성 알파바이러스 서열"은 또한 약독 알파바이러스의 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "5' 복제인식서열"은 바람직하게는 알파바이러스 게놈의 5' 단편과 동일하거나 상동인 연속적인 핵산 서열, 바람직하게는 리보핵산 서열을 지칭한다. "5' 복제인식서열"은 알파바이러스 복제효소에 의해 인식될 수 있는 핵산 서열이다. 용어 5' 복제인식서열은 자연성 5' 복제인식서열뿐만 아니라 그의 기능적 등가물, 예를 들어 자연계에서 발견되는 알파바이러스의 5' 복제인식서열의 기능적 변이체를 포함한다. 본 발명에 따르면, 기능적 등가물은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 특징으로 하는 5' 복제인식서열의 유도체를 포함한다. 5' 복제인식서열은 알파바이러스 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 합성에 필요하며, (-) 가닥 주형에 기반으로 (+) 가닥 바이러스 게놈 RNA의 합성에 필요하다. 자연성 5' 복제인식서열은 전형적으로 적어도 nsP1의 N-말단 단편을 코딩하지만; nsP1234를 코딩하는 전체 오픈 리딩 프레임을 포함하지는 않는다. 자연성 5' 복제인식서열은 전형적으로 적어도 nsP1의 N-말단 단편을 코딩한다는 사실을 고려하여, 자연성 5' 복제인식서열은 전형적으로 적어도 하나의 개시코돈, 전형적으로 AUG를 포함한다. 일 실시형태에서, 5' 복제인식서열은 알파바이러스 게놈의 보존서열구성 1 (CSE 1) 또는 이의 변이체 및 알파바이러스 게놈의 보존서열구성 2 (CSE 2) 또는 이의 변이체를 포함한다. 5' 복제인식서열은 전형적으로 4개의 스템루프(SL), 즉 SL1, SL2, SL3, SL4를 형성할 수 있다. 이들 스템루프의 번호 매김은 5' 복제인식서열의 5' 말단에서 시작한다.
본 발명에 따르면, "알파바이러스의 5' 말단"이란 용어는 알파바이러스의 게놈의 5' 말단을 지칭한다. 알파바이러스의 5' 말단의 핵산 서열은 알파바이러스 게놈 RNA의 5' 말단에 위치하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 선택적으로 추가적인 뉴클레오타이드의 연속적인 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 알파바이러스의 5' 말단의 핵산 서열은 알파바이러스 게놈의 5' 복제인식서열과 동일하다.
"보존서열구성" 또는 "CSE"라는 용어는 알파바이러스 RNA에서 발견되는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 이종상동성이 상이한 알파바이러스의 게놈에 존재하고 상이한 알파바이러스의 이종상동한 CSE가 높은 서열 동일성 백분율 및/또는 유사한 2차 또는 3차 구조의 높은 비율을 공유하는 것이 바람직하기 때문에 이들 서열 요소는 "보전된 것"으로 지칭한다. 용어 CSE는 CSE 1, CSE 2, CSE 3 및 CSE 4을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "CSE 1" 또는 "44-nt CSE"는 (-) 가닥 주형으로부터 (+) 가닥 합성에 필요한 뉴클레오타이드 서열을 동의적으로 지칭한다. 용어 "CSE 1"은 (+) 가닥 상에 있는 서열을 지칭하고; ((-) 가닥 상에) CSE 1의 상보적인 서열은 (+) 가닥 합성을 위한 프로모터로서 기능한다. 바람직하게는, 용어 CSE 1은 알파바이러스 게놈의 5' 뉴클레오타이드를 포함한다. CSE 1은 전형적으로 보존된 스템-루프 구조를 형성한다. 특정 이론에 결부되기를 바라는 것 없이, CSE 1의 경우, 2차 구조체는 1차 구조체, 즉 선형 서열보다 더 중요한 것으로 여겨진다. 모델 알파바이러스 Sindbis 바이러스의 게놈 RNA에서, CSE 1은 44개 뉴클레오타이드의 연속적인 서열로 구성되어 있고, 게놈 RNA의 가장 5'의 44개의 뉴클레오타이드에 의해 형성된다(Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562).
본 발명에 따르면, 용어 "CSE 2" 또는 "51-nt CSE"는 (+) 가닥 주형으로부터 (-) 가닥 합성에 필요한 뉴클레오타이드 서열을 동의적으로 지칭한다. (+) 가닥 주형은 전형적으로 알파바이러스 게놈 RNA 또는 RNA 레플리콘이다(CSE 2를 포함하지 않는 서브게놈 RNA 전사체가 (-) 가닥 합성을 위한 주형으로 작용하지 않는다). 알파바이러스 게놈 RNA에서, CSE 2는 전형적으로 nsP1에 대한 코딩 서열 내에 위치한다. 모델 알파바이러스 Sindbis 바이러스의 게놈 RNA에서, 51-nt CSE는 게놈 RNA의 155-205 위치에 있다(Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651). CSE 2는 전형적으로 두개의 보존된 스템루프 구조를 형성한다. 이들 스템루프 구조는 이들이 알파바이러스 게놈 RNA의 5' 말단에서부터 계산된 알파바이러스 게놈 RNA의 세 번째 및 네 번째 보존 스템루프이기 때문에 스템루프 3 (SL3) 및 스템루프 4 (SL4)로 표기한다. 특정 이론에 결부되기를 바라는 것 없이, CSE 2의 경우, 2차 구조체는 1차 구조체, 즉 선형 서열보다 더 중요한 것으로 여겨진다.
본 발명에 따르면, 용어 "CSE 3" 또는 "접합 서열"은 알파바이러스 게놈 RNA로부터 유도되고 서브게놈 RNA의 개시 부위를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 동의적으로 지칭한다. (-) 가닥에서 이 서열의 상보체는 서브게놈 RNA 전사를 촉진시키는 역할을 한다. 알파바이러스 게놈 RNA에서, CSE 3은 전형적으로 nsP4의 C-말단 단편을 코딩하는 영역과 중첩되며, 구조 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 상류에 위치한 짧은 비-코팅 영역까지 연장된다. Strauss & Strauss(Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562)에 따르면, CSE 3는 컨센서스 서열을 특징으로 한다.
ACCUCUACGGCGGUCCUAAAUAGG (서열번호 1; 컨센서스 접합 서열 (컨센서스 CSE 3); 밑줄 친 뉴클레오타이드는 서브게놈 전사체의 처음 5개 뉴클레오타이드를 나타낸다)
본 발명의 일 실시형태에서, CSE 3은 서열번호 1 또는 이의 변이체로 이루어지거나 포함하고, 여기서 변이체는 바람직하게는 서열번호 1에 대한 서열 동일성 정도가 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 용어 "CSE 4" 또는 "19-nt 보존서열" 또는 "19-nt CSE"는 알파바이러스 게놈의 3' 비번역 영역에서 폴리(A) 서열의 바로 상류인 알파바이러스 게놈 RNA로부터의 뉴클레오타이드 서열을 동의적으로 지칭한다. CSE 4는 전형적으로 19개의 연속적인 뉴클레오타이드로 구성된다. 특정 이론에 결부되기를 바라는 것 없이, CSE 4는 (-) 가닥 합성의 개시를 위한 코어 프로모터로서 기능하는 것으로 이해되거나(Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856); 및/또는 알파바이러스 게놈 RNA의 CSE 4 및 폴리(A) 꼬리는 효율적인 (-) 가닥 합성을 위해 함께 작용하는 것으로 이해된다(Hardy & Rice, J. Virol., 2005, vol. 79, pp. 4630-4639).
Strauss & Strauss에 따르면, CSE 4는 보존서열을 특징으로 한다.
AUUUUGUUUUUAAUAUUUC (서열번호 2; 19 nt 보존서열)
본 발명의 일 실시형태에서, CSE 4는 서열번호 2 또는 이의 변이체로 이루어지거나 포함하며, 바람직하게는 서열번호 2에 대한 서열 동일성 정도가 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, "서브게놈 프로모터" 또는 "SGP"라는 용어는 핵산 서열 (예컨대 코딩 서열)의 핵산 서열 상류(5')를 지칭하며, RNA 중합효소, 전형적으로 RNA 의존성 RNA 중합효소, 특히 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 대한 결합 부위 및 인식 부위를 제공함으로써 상기 핵산 서열의 전사를 제어한다. SGP는 추가적인 인자에 대한 추가적인 인식 또는 결합 부위를 포함할 수 있다. 서브게놈 프로모터는 전형적으로 알파바이러스와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스의 유전적 요소이다. 알파바이러스의 서브게놈 프로모터는 바이러스 게놈 RNA에 포함된 핵산 서열이다. 서브게놈 프로모터는 일반적으로 RNA 의존성 RNA 중합효소, 예를 들어 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 존재 하에서 전사(RNA 합성)의 개시를 허용하는 것을 특징으로 한다. RNA (-) 가닥, 즉 알파바이러스 게놈 RNA의 상보체는 (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성을 위한 주형으로서 작용하고, (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성은 전형적으로 서브게놈 프로모터에서 또는 그 근처에서 개시된다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "서브게놈 프로모터"라는 용어는 그러한 서브게놈 프로모터를 포함하는 핵산에서 임의의 특정 위치에 국한되지 않는다. 일부 실시형태에서, SGP는 CSE 3과 동일하거나 CSE 3과 중첩되거나 CSE 3을 포함한다.
용어 "서브게놈 전사체" 또는 "서브게놈 RNA"는 RNA 분자를 주형("주형 RNA")으로 사용한 전사의 결과로서 얻을 수 있는 RNA 분자를 동의적으로 지칭하며, 여기서 주형 RNA는 서브게놈 전사체의 전사를 제어하는 서브게놈 프로모터를 포함한다. 서브게놈 전사체는 RNA 의존성 RNA 중합효소, 특히 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 존재 하에 수득 가능하다. 예를 들어, "서브게놈 전사체"라는 용어는 알파바이러스 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체를 주형으로 사용하여, 알파바이러스에 감염된 세포에서 제조된 RNA 전사체를 지칭할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "서브게놈 전사체"라는 용어는 이에 한정되지 않고, 이형 RNA를 주형으로 사용함으로써 수득 가능한 전사체를 포함한다. 예를 들어, 서브게놈 전사체는 또한 본 발명에 따른 SGP-함유 레플리콘의 (-) 가닥 상보체를 주형으로 사용하여 수득할 수 있다. 따라서, 용어 "서브게놈 전사체"는 알파바이러스 게놈 RNA의 단편을 전사시킴으로써 수득할 수 있는 RNA 분자뿐만 아니라 본 발명에 따른 레플리콘의 단편을 전사시킴으로써 수득할 수 있는 RNA 분자를 지칭할 수 있다.
용어 "자가(autologous)"는 동일한 대상체로부터 유래된 것을 설명하는 데 사용한다. 예를 들어, "자가 세포(autologous cell)"는 동일한 대상체로부터 유래된 세포를 지칭한다. 대상체 내에 자가 세포를 도입하는 것은, 이들 세포가 별도로 거부 반응을 일으키는 면역 장벽을 극복하기 때문에 유리하다.
용어 "동종이계(allogeneic)"는 동일한 종의 다른 개체로부터 유래된 것을 설명하는 데 사용된다. 하나 이상의 유전자좌에서의 유전자가 동일하지 않은 경우 둘 이상의 개체가 서로 동종이계에 있다고 한다.
용어 "동계(syngeneic)"는 동일한 유전자형을 갖는 개체 또는 조직, 일란성 쌍생아 또는 동일한 동계교배의 동물 또는 이들의 조직 또는 세포로부터 유래한 것을 설명하는 데 사용된다.
용어 "이종(heterologous)"은 다양한 다른 요소로 구성된 것을 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어 한 개체의 세포를 다른 개체에 도입하는 것은 이종 이식한 것이 된다. 이종 유전자는 대상체 이외의 공급원으로부터 유래된 유전자이다.
다음은 본 발명의 개별적인 특징의 특정 및/또는 바람직한 변형예를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 2개 이상의 특징에 대해 기재된 2개 이상의 특정 및/또는 바람직한 변형예를 조합함으로써 생성되는 이들 실시형태를 특히 바람직한 실시형태로서 고려한다.
RNA 레플리콘
제 1 양상에서, 본 발명은 5' 복제인식서열을 포함하는 레플리콘을 제공하며, 여기서 5' 복제인식서열은 자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열과 비교하여 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 한다. 레플리콘은 바람직하게는 RNA 레플리콘이다.
본 발명에 따른 자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열과 비교하여 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 하는 5' 복제인식서열은, "변형된 5' 복제인식서열" 또는 "본 발명에 따른 5' 복제인식서열"로 본원에서 지칭될 수 있다. 이하 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 5' 복제인식서열은 선택적으로 하나 이상의 추가적인 뉴클레오타이드 변화의 존재를 특징으로 할 수 있다.
복제효소, 바람직하게는 알파바이러스 복제효소에 의해 복제될 수 있는 핵산 구조물은 레플리콘으로 불린다. 본 발명에 따르면, 용어 "레플리콘"은 RNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 복제될 수 있는 RNA 분자를 정의하며, DNA 중간체 없이 하나 또는 다수의 동일하거나 본질적으로 동일한 RNA 레플리콘의 복사본을 생성한다. "DNA 중간체 없다"는 것은 RNA 레플리콘의 레플리콘을 형성하는 과정에서 레플리콘의 데옥시리보핵산(DNA) 복사본 또는 레플리콘의 상보체가 RNA 레플리콘의 복사본을 형성하는 과정에서 형성되지 않고, 및/또는 데옥시리보핵산(DNA) 분자가 RNA 레플리콘, 또는 이의 상보체의 복사본을 형성하는 과정에서 주형으로 사용되지 않는 것을 의미한다. 복제효소 기능은 전형적으로 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 제공된다.
본 발명에 따르면, 용어 "복제될 수 있다" 및 "복제되는 것이 가능하다"는 일반적으로 핵산의 하나 이상의 동일하거나 본질적으로 동일한 복사본이 제조될 수 있음을 설명한다. "복제효소에 의해 복제되는 것이 가능하다"에서 용어 "복제효소"와 함께 사용하는 경우, 용어 "복제될 수 있다" 및 "복제되는 것이 가능하다"는 복제효소에 대해 핵산 분자, 예를 들어 RNA 레플리콘의 기능적 특성을 설명하는 것이다. 이러한 기능적 특성은 (i) 복제효소가 레플리콘을 인식할 수 있고 (ii) 복제효소가 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRP)로서 작용할 수 있는 것 중 적어도 하나를 포함한다. 바람직하게는, 복제효소는 (i) 레플리콘을 인식할 수 있고 (ii) RNA 의존성 RNA 중합효소로서 작용할 수 있다.
"인식할 수 있는"이라는 표현은 복제효소가 레플리콘과 물리적으로 결합할 수 있으며, 바람직하게는 복제효소가 전형적으로 비공유 결합으로 레플리콘에 결합할 수 있는 것을 설명한다. "결합"이라는 용어는 복제효소가 임의의 하나 이상의 보존서열구성 1 (CSE 1) 또는 이의 상보 서열(레플리콘에 포함되는 경우), 보존서열구성 2 (CSE 2) 또는 이의 상보 서열(레플리콘에 포함되는 경우), 보존서열구성 3 (CSE 3) 또는 이의 상보 서열(레플리콘에 포함되는 경우), 보존서열구성 4 (CSE 4) 또는 상보 서열(레플리콘에 포함되는 경우)에 대해 결합 능력이 있음을 의미할 수 있다. 바람직하게는, 복제효소는 CSE 2 [즉, (+) 가닥에] 및/또는 CSE 4 [즉, (+) 가닥에]에 결합할 수 있거나, CSE 1의 상보체 [즉, (-) 가닥에] 및/또는 CSE 3의 상보체 [즉, (-) 가닥에]에 결합할 수 있다.
"RdRP로서 작용할 수 있다"는 표현은 복제효소가 알파바이러스 게놈 (+) 가닥 RNA의 (-) 가닥 상보체의 합성을 촉매할 수 있음을 의미하고, 여기서 (+) 가닥 RNA는 주형 기능을 가지며, 및/또는 복제효소가 (+) 가닥 알파바이러스 게놈 RNA의 합성을 촉매할 수 잇음을 의미하고, 여기서 (-) 가닥 RNA는 주형 기능을 갖는다. 일반적으로, "RdRP로서 작용할 수 있는"이라는 표현은 또한 복제효소가 (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성을 촉매할 수 잇음을 의미하고, 여기서 (-) 가닥 RNA는 주형 기능을 가지며, (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성은 전형적으로 알파바이러스 서브게놈 프로모터에서 개시된다.
"결합할 수 있는" 및 "RdRP로 작용할 수 있는"이라는 표현은 정상적인 생리 조건에서의 능력을 지칭한다. 특히, 이들은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하거나 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 핵산으로 형질주입된 세포 내 조건을 지칭한다. 세포는 바람직하게는 진핵세포이다. 결합 능력 및/또는 RdRP로서 작용하는 능력은 실험적으로 예를 들어 무세포 시험관내 시스템 또는 진핵세포 내에서 시험할 수 있다. 선택적으로, 상기 진핵세포는 복제효소의 기원을 나타내는 특정 알파바이러스가 감염되는 종으로부터 유래된 세포이다. 예를 들어, 사람에게 감염되는 특정 알파바이러스의 알파바이러스 복제효소를 사용하는 경우, 정상적인 생리 조건은 인간 세포에서의 상태이다. 보다 바람직하게는, 진핵세포(일례로 인간 세포)는 복제효소의 기원을 나타내는 특정 알파바이러스가 감염된 동일한 조직 또는 기관에서 유래한 것이다.
본 발명에 따르면, "자연성 알파바이러스 서열과 비교" 및 유사한 용어는 자연성 알파바이러스 서열의 변이체인 서열을 지칭한다. 이 변이체는 전형적으로 자연성 알파바이러스 서열 자체는 아니다.
일 실시형태에 있어서, RNA 레플리콘은 3' 복제인식서열을 포함한다. 3' 복제인식서열은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 인식될 수 있는 핵산 서열이다. 즉, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 3' 복제인식서열을 인식할 수 있다. 바람직하게는, 3' 복제인식서열은 레플리콘의 3' 말단(레플리콘이 폴리(A) 꼬리를 포함하지 않는 경우) 또는 폴리(A) 꼬리의 바로 상류에 위치한다(레플리콘이 폴리(A) 꼬리를 포함하는 경우). 일 실시형태에서, 3' 복제인식서열은 CSE 4로 이루어지거나 포함한다.
일 실시형태에서, 5' 복제인식서열 및 3' 복제인식서열은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 존재 하에 본 발명에 따른 RNA 레플리콘의 복제를 지시할 수 있다. 따라서, 단독으로 또는 바람직하게 함께 존재할 때, 이들 인식 서열은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 존재 하에 RNA 레플리콘의 복제를 지시한다.
기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 시스(레플리콘 상의 오픈 리딩 프레임에 의해 목적 단백질로서 코딩됨) 또는 트랜스(제 2 양상에서 기술된 바와 같이, 별도의 복제효소 구성체 상의 오픈 리딩 프레임에 의해 목적 단백질로서 코딩됨)로 제공되고, 레플리콘의 변형된 5' 복제인식서열 및 3' 복제인식서열 모두를 인식할 수 있는 것이 바람직하다. 일 실시형태에서, 이는 3' 복제인식서열이 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 유래된 알파바이러스에 고유한 것인 경우, 및 변형된 5' 복제인식서열이 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 유래된 알파바이러스에 고유한 5' 복제인식서열의 변이체인 경우에 달성된다. 고유한이란 이들 서열의 자연적 기원이 동일한 알파바이러스임을 의미한다. 또 다른 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 레플리콘의 변형된 5' 복제인식서열 및 3' 복제인식서열 모두를 인식할 수 있는 경우, 변형된 5' 복제인식서열 및/또는 3' 복제인식서열은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 유래된 알파바이러스에 고유하지 않은 것이다. 즉, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 변형된 5' 복제인식서열 및 3' 복제인식서열에 호환할 수 있다. 비-자연성 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 각각의 서열 또는 서열 요소를 인식할 수 있는 경우, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 호환한다고 한다(바이러스 간 호환성). 바이러스 간 호환성이 존재하는 한, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질과 각각 (3'/5') 복제인식서열 및 CSE의 임의의 조합이 가능하다. RNA와 함께 시험할 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 인큐베이팅함으로써 본 발명을 수행하는 당업자는 바이러스 간 호환성을 용이하게 시험할 수 있고, 여기서 RNA는 RNA 복제에 적합한 조건, 예를 들어 적합한 숙주세포에서 시험할 3'- 및 (임의로 변형된) 5' 복제인식서열을 갖는다. 복제가 발생하면, (3'/5') 복제인식서열 및 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 호환할 수 있는 것으로 결정된다.
적어도 하나의 개시코돈의 제거는 종래의 트랜스-레플리콘에 비해 몇 가지 이점을 제공한다(예를 들어, 도 1의 "주형 RNA WT-RRS"로 나타냄). nsP1*을 코딩하는 핵산 서열에서 개시코돈이 없으면 일반적으로 nsP1*(nsP1의 N-말단 단편)이 번역되지 않게 된다. 또한, nsP1*이 번역되지 않기 때문에, 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임("전이유전자")은 리보솜에 접근 가능한 가장 상류 오픈 리딩 프레임이고; 따라서 레플리콘이 세포 내에 존재할 때, 목적 유전자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(RNA)의 첫 번째 AUG에서 번역이 개시된다. 이것은 문헌[Spuul et al. (J. Virol., 2011, vol. 85, pp. 4739-4751)]에 의해 기술된 것과 같은 종래의 트랜스-레플리콘에 비해 이점을 나타낸다: Spuul et al.에 따른 레플리콘은 74개 아미노산의 펩티드인 nsP1의 N 말단 부위의 발현을 지시한다. 또한, 전장 바이러스 게놈으로부터의 RNA 레플리콘의 구축은 특정 돌연변이가 RNA를 복제할 수 없게 만들 수 있기 때문에 사소한 문제가 아니라는 것이 종래기술로부터 공지되어 있고(WO 2000/053780 A2), 알파바이러스의 복제에 중요한 5' 구조의 일부분을 제거하는 것은 복제 효율에 영향을 미친다(Kamrud et al., 2010, J. Gen. Virol., vol. 91, pp. 1723-1727).
종래의 시스-레플리콘을 능가하는 이점은 적어도 하나의 개시코돈의 제거가 5' 복제인식서열로부터 알파바이러스 비구조성 단백질에 대한 코딩 영역을 분리하는 것이다. 이것은 시스-레플리콘의 추가적인 공학, 예를 들어 자연성 5' 복제인식서열을 인공 서열, 돌연변이된 서열 또는 다른 RNA 바이러스로부터 취해진 이종 서열로 교환함으로써 가능하게 한다. 종래의 시스-레플리콘에서의 이러한 서열 조작은 nsP1의 아미노산 서열에 의해 제한된다. 임의의 점돌연변이 또는 점돌연변이의 클러스터는 복제가 영향을 받는지 여부에 대해 실험적 평가가 필요하며, 프레임 쉬프트 돌연변이를 유도하는 작은 삽입 또는 결실은 단백질에 대한 이런 해로운 영향으로 인해 불가능한다.
본 발명에 따른 적어도 하나의 개시코돈의 제거는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 레플리콘을 코딩하는, 즉 개시코돈의 제거를 특징으로 하는 적합한 DNA 분자는 인실리코(in silico)로 설계될 수 있고, 이어서 시험관내에서 합성될 수 있으며(유전자 합성); 대체적으로는, 적절한 DNA 분자는 레플리콘을 코딩하는 DNA 서열의 부위 특이적 변이에 의해 수득될 수 있다. 어쨌든, 각각의 DNA 분자는 시험관내 전사를 위한 주형으로서 작용하여, 본 발명에 따른 레플리콘을 제공할 수 있다.
자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열과 비교하여 적어도 하나의 개시코돈의 제거는 특별히 제한되지 않으며, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환(DNA 수준에서 개시코돈의 A 및/또는 T 및/또는 G를 포함함); 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실(DNA 수준에서, 개시코돈의 A 및/또는 T 및/또는 G를 포함함), 및 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입(DNA 수준에서 개시코돈의 A와 T 사이 및/또는 T와 G 사이에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함함)을 포함하는, 임의의 뉴클레오타이드 변형으로부터 선택될 수 있다. 뉴클레오타이드 변형이 치환, 삽입 또는 결실인지 여부에 상관없이, 뉴클레오타이드 변형이 새로운 개시코돈의 형성을 초래해서는 안된다(예로서: DNA 수준에서의 삽입이 ATG의 삽입이어서는 안된다).
하나 이상의 개시코돈의 제거를 특징으로 하는 RNA 레플리콘의 5' 복제인식서열(즉, 본 발명에 따른 변형된 5' 복제인식서열)은 바람직하게는 자연계에서 발견되는 알파바이러스 게놈의 5' 복제인식서열의 변이체이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 변형된 5' 복제인식서열은 바람직하게는 자연계에서 발견되는 적어도 하나의 알파바이러스 게놈의 5' 복제인식서열에 대해 서열 동일성 정도가 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95%인 것을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 특징으로 하는 RNA 레플리콘의 5' 복제인식서열은 알파바이러스의 5' 말단, 즉 알파바이러스 게놈의 5' 말단에서 약 250개의 뉴클레오타이드에 상동인 서열을 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, 이는 알파바이러스의 5' 말단, 즉 알파바이러스 게놈의 5' 말단에서 약 250 내지 500개, 바람직하게는 약 300 내지 500개의 뉴클레오타이드에 상동인 서열을 포함한다. "알파바이러스 게놈의 5' 말단"은 알파바이러스 게놈의 가장 상류 뉴클레오타이드에서 시작하고 이를 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 달리 말하면, 알파바이러스 게놈의 가장 상류 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 제 1번으로 지정되고, "알파바이러스 게놈의 5' 말단에 250개의 뉴클레오타이드"는 알파바이러스 게놈의 1 내지 250개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 특징으로 하는 RNA 레플리콘의 5' 복제인식서열은 자연계에서 발견되는 적어도 하나의 알파바이러스 게놈의 5' 말단에서 적어도 250개의 뉴클레오타이드에 대해 서열 동일성 정도가 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상인 것을 특징으로 한다. 적어도 250개의 뉴클레오타이드는 예를 들어, 250개의 뉴클레오타이드, 300개의 뉴클레오타이드, 400개의 뉴클레오타이드, 500개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
자연계에서 발견되는 알파바이러스의 5' 복제인식서열은 전형적으로 적어도 하나의 개시코돈 및/또는 보존된 2차 구조 모티프를 특징으로 한다. 예를 들면, Semliki Forest 바이러스 (SFV)의 자연성 5' 복제인식서열은 서열번호 4의 DNA에서 ATG 염기 삼중항에 상응하는 5개의 특정 AUG 염기 삼중항을 포함한다 (실시예 1 참조). 문헌[Frolov et al. (2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651)]에 따르면, MFOLD에 의한 분석은 Semliki Forest 바이러스의 자연성 5' 복제인식서열이 스템루프 1 내지 4 (SL1, SL2, SL3, SL4)로 불리는 4개의 스템루프 (SL)를 형성할 것으로 예측되는 것으로 나타났다. 문헌[Frolov et al.]에 따르면, MFOLD에 의한 분석은 또한 다른 알파바이러스인 Sindbis 바이러스의 자연성 5' 복제인식서열도 SL1, SL2, SL3, SL4의 4개의 스템루프를 형성할 것으로 예측되는 것으로 나타났다. 본 발명의 실시예 1에서, Semliki Forest 바이러스의 자연성 5' 복제인식서열에서 4개의 스템루프의 예측된 존재는 RNA 2차 구조체 예측에 대한 2개의 웹서버에 의해 확인하였다.
(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)
(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)
알파바이러스 게놈의 5' 말단은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의한 알파바이러스 게놈의 복제를 가능하게 하는 서열 요소를 포함하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, RNA 레플리콘의 5' 복제인식서열은 알파바이러스의 보존서열구성 1 (CSE 1)에 상동인 서열 및/또는 보존서열구성 2 (CSE 2)에 상동인 서열을 포함한다.
알파바이러스 게놈 RNA의 보존서열구성 2 (CSE 2)는 전형적으로 알파바이러스 비구조성 단백질 nsP1의 첫 번째 아미노산 잔기를 코딩하는 자연성 개시코돈을 적어도 포함하는 SL2가 앞에 있는 SL3 및 SL4로 나타낸다. 그러나, 본 명세서에서, 일부 실시형태에서는, 알파바이러스 게놈 RNA의 보존서열구성 2 (CSE 2)는 SL2에서 SL4까지 걸쳐있고, 알파바이러스 비구조성 단백질 nsP1의 첫 번째 아미노산 잔기를 코딩하는 자연성 개시코돈을 포함하는 영역을 지칭한다. 바람직한 일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 CSE 2 또는 CSE 2에 상동인 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 바람직하게는 자연계에서 발견되는 적어도 하나의 알파바이러스의 CSE 2 서열에 대해 서열 동일성 정도가 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상인 것을 특징으로 하는 CSE 2에 상동인 서열을 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, 5' 복제인식서열은 알파바이러스의 CSE 2에 상동인 서열을 포함한다. 알파바이러스의 CSE 2는 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임의 단편을 포함할 수 있다.
따라서, 바람직한 일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다. 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편은 전형적으로 자연계에서 발견되는 알파바이러스의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임의 변이체 또는 그 단편이다. 일 실시형태에서, 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편은 바람직하게는 자연계에서 발견되는 적어도 하나의 알파바이러스의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 단편에 대해 서열 동일성 정도가 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상인 것을 특징으로 한다.
보다 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 레플리콘에 포함되는 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열은 비구조성 단백질의 자연성 개시코돈을 포함하지 않고, 보다 바람직하게는 비구조성 단백질의 임의의 개시코돈을 포함하지 않는다. 바람직한 일 실시형태에서, CSE 2에 상동인 서열은 자연성 알파바이러스 CSE 2 서열과 비교하여 모든 개시코돈의 제거를 특징으로 한다. 따라서, CSE 2에 상동인 서열은 임의의 개시코돈을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
오픈 리딩 프레임에 상동인 서열이 임의의 개시코돈을 포함하지 않는 경우, 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열은 번역을 위한 주형으로 작용하지 않기 때문에 그 자체가 오픈 리딩 프레임이 아니다.
일 실시형태에서, 5' 복제인식서열은 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편을 포함하며, 여기서 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편은 자연성 알파바이러스 서열과 비교하여 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편은 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에서 적어도 자연성 시작코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, nsP1을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에서 적어도 자연성 시작코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 한다.
자연성 시작코돈은 RNA가 숙주세포에 존재할 때 숙주세포에서 리보솜의 번역이 시작되는 AUG 염기 삼중항이다. 달리 말하면, 자연성 시작코돈은 예를 들어 자연성 개시코돈을 포함하는 RNA로 접종된 숙주세포에서, 리보솜 단백질 합성 동안 번역되는 첫 번째 염기 삼중항이다. 일 실시형태에서, 숙주세포는 자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열을 포함하는 특정 알파바이러스의 천연 숙주인 진핵세포 종으로부터의 세포이다. 바람직한 일 실시형태에서, 숙주세포는 미국 버지니아주 매너서스 소재의 American Type Culture Collection으로부터 입수 가능한 세포주 "BHK21 [C13] (ATCC® CCL10TM)"의 BHK21 세포이다.
많은 알파바이러스의 게놈은 완전히 시퀀싱되어 공개적으로 접근 가능하며, 이들 게놈에 의해 코딩된 비구조성 단백질의 서열도 공개적으로 접근 가능한다. 이러한 서열 정보는 인실리코로 자연성 시작코돈을 결정할 수 있게 한다.
예를 들어, 실시예 1에서는 SFV nsP1의 자연성 시작코돈에 상응하는 DNA 염기 삼중항이 기술하고 있다.
일 실시형태에서, 자연성 시작코돈은 Kozak 서열 또는 기능적으로 동등한 서열에 포함된다. Kozak 서열은 Kozak (1987, Nucleic Acids Res., vol. 15, pp. 8125-8148)에 의해 처음 기술된 서열이다. mRNA 분자 상의 Kozak 서열은 리보솜에 의해 번역 시작 지점으로 인식된다. 이 문헌에 따르면, Kozak 서열은 AUG 개시코돈을 포함하며, 바로 다음에 고도로 보존된 G 뉴클레오타이드: AUGG (또한 서열번호 4(실시예 1)에 따른 DNA 서열에서 개시코돈을 참조)을 포함한다. 특히, Kozak 서열은 다음과 같이 (gcc)gccRccAUGG (서열번호 6)에 의해 확인될 수 있음을 이 문헌에 기재되어 있다: (i) 소문자는 염기가 다를 수 있는 위치에서 가장 공통적인 염기를 표시하고; (ii) 대문자는 고도로 보존된 염기(예컨대 'AUGG')를 나타내며; (iii) 'R'은 퓨린(아데닌 또는 구아닌)을 나타내고; (iv) 괄호 안의 서열((gcc))은 불확실한 의의가 있고; (v) 밑줄 친 AUG 염기 삼중항은 시작코돈을 나타낸다. 본 발명의 일 실시형태에서, 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편은 Kozak 서열의 일부인 개시코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 레플리콘의 5' 복제인식서열은 RNA 레벨에서 AUGG 서열의 일부인 적어도 모든 개시코돈의 제거를 특징으로 한다.
바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편은 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임의 자연성 시작코돈 이외의 하나 이상의 개시코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 한다. 보다 바람직한 일 실시형태에서, 상기 핵산 서열은 자연성 시작코돈의 제거를 추가로 특징으로 한다. 예를 들어, 자연성 시작코돈의 제거에 추가하여, 임의의 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 4개 초과(예를 들어 5개)의 개시코돈이 제거될 수 있다.
레플리콘이 자연성 시작코돈의 제거 및 임의로 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임의 자연성 시작코돈 이외의 하나 이상의 개시코돈의 제거를 특징으로 하는 경우, 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열은 번역을 위한 주형으로 사용되지 않으므로 그 자체가 오픈 리딩 프레임이 아닌 것이다.
바람직하게는 자연성 시작코돈의 제거에 추가하여 제거된 자연성 시작코돈 이외의 하나 이상의 개시코돈은 바람직하게는 번역을 개시할 가능성이 있는 AUG 염기 삼중항로부터 선택된다. 번역을 개시할 가능성이 있는 AUG 염기 삼중항은 "잠재적 개시코돈"이라 할 수 있다. 주어진 AUG 염기 삼중항이 번역을 개시할 가능성이 있는지 여부는 인실리코 또는 세포-기반 시험관내 분석에서 결정될 수 있다.
일 실시형태에서, 주어진 AUG 염기 삼중항이 번역을 개시할 가능성이 있는지 여부를 인실리코로 결정한다: 이 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열을 검사하고, AUG 염기 삼중항이 AUGG 서열의 부분, 바람직하게는 Kozak 서열(서열번호 6)의 일부일 경우, 번역을 개시할 가능성이 있는 것으로 결정된다.
일 실시형태에서, 주어진 AUG 염기 삼중항이 번역을 개시할 가능성이 있는지 여부를 세포-기반 시험관내 분석에서 결정한다: 자연성 개시코돈의 제거를 특징으로 하고 자연성 시작코돈의 제거 위치의 하류의 주어진 AUG 염기 삼중항을 포함하는 RNA 레플리콘을 숙주세포 내에 도입한다. 바람직한 일 실시형태에서, 숙주세포는 자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열을 포함하는 특정 알파바이러스의 천연 숙주인 진핵세포 종으로부터의 세포인 것이다. 바람직한 일 실시형태에서, 숙주세포는 미국 버지니아주 매너서스 소재의 American Type Culture Collection으로부터 입수 가능한 세포주 "BHK21 [C13] (ATCC® CCL10TM)"의 BHK21 세포이다. 자연성 시작코돈의 제거 위치와 주어진 AUG 염기 삼중항 사이에는 더 이상의 AUG 염기 삼중항이 존재하지 않는 것이 바람직하다. RNA 레플리콘-자연성 시작코돈의 제거를 특징으로 하고 주어진 AUG 염기 삼중항을 포함하는-이 숙주세포 내에 전달된 후, 주어진 AUG 염기 삼중항에서 번역이 개시되면, 주어진 AUG 염기 삼중항은 번역을 시작할 가능성이 있는 것으로 결정된다. 번역이 개시되는지 여부는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 레플리콘은 주어진 AUG 염기 삼중항의 하류에서, 주어진 AUG 염기 삼중항과 함께 틀 내에서, 번역 생성물(존재하는 경우)의 검출을 용이하게 하는 태그, 예를 들어 myc-태그 또는 HA-태그를 코딩할 수 있고; 코딩된 태그를 갖는 발현 산물이 존재하는지의 여부는 예를 들어, Western Blot에 의해 결정될 수 있다. 이 실시형태에서, 주어진 AUG 염기 삼중항과 태그를 코딩하는 핵산 서열 사이에 추가의 AUG 염기 삼중항이 존재하지 않는 것이 바람직하다. 세포-기반 시험관내 분석은 하나를 초과하는 주어진 AUG 염기 삼중항에 대해 개별적으로 수행될 수 있다: 각각의 경우에, 자연성 개시코돈의 제거 위치와 주어진 AUG 염기 삼중항 사이에 더 이상의 AUG 염기 삼중항이 존재하지 않는 것이 바람직하다. 이것은 자연성 시작코돈 제거 위치와 주어진 AUG 염기 삼중항 사이의 모든 AUG 염기 삼중항(있는 경우)을 제거함으로써 달성될 수 있다. 이에 의해, 주어진 AUG 염기 삼중항은 자연성 시작코돈의 제거 위치의 하류 측의 첫 번째 AUG 염기 삼중항이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 레플리콘은 자연성 시작코돈의 제거 위치의 하류에 있으며 알파바이러스 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 단편 내에 위치하는 모든 잠재적 개시코돈의 제거를 특징으로 한다. 따라서, 본 발명에 따르면, 5' 복제인식서열은 바람직하게는 단백질로 번역될 수 있는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 RNA 레플리콘의 5' 복제인식서열은 알파바이러스 게놈 RNA의 5' 복제인식서열의 2차 구조체와 동등한 2차 구조체를 특징으로 한다. 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 RNA 레플리콘의 5' 복제인식서열은 알파바이러스 게놈 RNA의 5' 복제인식서열의 예측된 2차 구조체와 동등한 예측된 2차 구조체를 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, RNA 분자의 2차 구조체는 바람직하게는 RNA 2차 구조 예측을 위한 웹서버에 의해 예측된다(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html).
자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열과 비교하여 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 특징으로 하는 RNA 레플리콘의 5' 복제인식서열의 2차 구조체 또는 예측된 2차 구조체를 비교함으로써, 뉴클레오타이드 결합형성 파괴의 존재 또는 부재 확인할 수 있다. 예를 들면, 적어도 하나의 염기쌍, 스템루프, 특히 스템루프의 스템 내의 염기쌍은 자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열과 비교하여, 주어진 위치에 존재하지 않을 수 있다.
바람직한 일 실시형태에서, 5' 복제인식서열의 하나 이상의 스템루프는 결실되거나 파괴되지 않는다. 보다 바람직하게는, 스템루프 3 및 4는 결실되거나 파괴되지 않는다. 보다 바람직하게는, 5' 복제인식서열의 스템루프는 결실되거나 파괴되지 않는다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 개시코돈의 제거는 5' 복제인식서열의 2차 구조체를 파괴하지 않는다. 또 다른 일 실시형태에서, 적어도 하나의 개시코돈의 제거는 5' 복제인식서열의 2차 구조체를 파괴시킨다. 이 실시형태에서, 적어도 하나의 개시코돈의 제거는 자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열과 비교하여, 주어진 위치에서 적어도 하나의 염기쌍, 예를 들어 스템루프 내의 염기쌍의 부재에 대해 원인이 될 수 있다. 자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열과 비교하여, 스템루프 내에 염기쌍이 존재하지 않으면, 적어도 하나의 개시코돈의 제거가 스템루프 내에서 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 일으키는 것으로 결정된다. 스템루프 내의 염기쌍은 일반적으로 스템루프의 스템에서의 염기쌍이다.
바람직한 실시형태에서, RNA 레플리콘은 적어도 하나의 개시코돈의 제거에 의해 도입된 하나 이상의 스템루프 내에서 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 보완하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화를 포함한다.
적어도 하나의 개시코돈의 제거가 자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열과 비교하여 스템루프 내에서 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 유도하면, 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 보완할 것으로 예상되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화가 도입될 수 있고, 이에 의해 수득된 2차 구조체 또는 예측된 2차 구조체는 자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열과 비교될 수 있다.
공통적인 일반 지식 및 본원의 개시에 기초하여, 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 보완하기 위한 특정 뉴클레오타이드 변화가 당업자에 의해 기대될 수 있다. 예를 들어, 자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열과 비교하여 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 특징으로 하는 RNA 레플리콘의 주어진 5' 복제인식서열의 2차 구조체 또는 예측된 2차 구조체의 주어진 위치에서 염기쌍이 파괴되면, 바람직하게는 개시코돈의 재도입 없이, 그 위치의 염기쌍을 복구하는 뉴클레오타이드 변화는 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 보완할 것으로 예상된다. 일례로, 적어도 하나의 개시코돈의 제거에 의해 도입된 하나 이상의 스템루프 내에서의 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 보완하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화를 포함하는 레플리콘의 5' 복제인식서열은 서열번호 5로 나타내는 DNA 서열에 의해 코딩된다 (실시예 1).
바람직한 일 실시형태에서, 레플리콘의 5' 복제인식서열은 번역 가능한 핵산 서열, 즉 펩티드 또는 단백질, 특히 nsP, 특히 nsP1 또는 이의 임의의 단편으로 번역 가능한 서열과 중첩되지 않거나 포함하지 않는다. 뉴클레오타이드 서열이 "번역 가능"하기 위해서는, 개시코돈의 존재를 필요로 하고; 개시코돈은 펩티드 또는 단백질의 가장 N-말단 아미노산 잔기를 코딩한다. 일 실시형태에서, 레플리콘의 5' 복제인식서열은 nsP1의 N-말단 단편을 코딩하는 번역 가능한 핵산 서열과 중첩되지 않거나 포함하지 않는다.
하기에서 상세하게 설명되는 일부 실시형태에서, RNA 레플리콘은 적어도 하나의 서브게놈 프로모터를 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, 레플리콘의 서브게놈 프로모터는 번역 가능한 핵산 서열, 즉 펩티드 또는 단백질, 특히 nsP, 특히 nsP4 또는 이의 임의의 단편으로 번역 가능한 서열과 중첩되지 않거나, 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 레플리콘의 서브게놈 프로모터는 nsP4의 C-말단 단편을 코딩하는 번역 가능한 핵산 서열과 중첩되지 않거나 포함하지 않는다. 번역 가능한 핵산 서열, 예를 들어 nsP4의 C-말단 단편으로 번역 가능한 서열과 중첩되지 않거나 또는 포함하지 않는 서브게놈 프로모터를 갖는 RNA 레플리콘은 nsP4 (전형적으로 nsP4의 N 말단 부분을 코딩하는 부분)에 대한 코딩 서열의 일부를 결실시킴으로써, 및/또는 결실되어 있지 않은 nsP4에 대한 코딩 서열의 일부에서 AUG 염기 삼중항을 제거함으로써 생성될 수 있다. nsP4에 대한 코딩 서열 또는 그의 일부 중 AUG 염기 삼중항이 제거되면, 제거되는 AUG 염기 삼중항은 바람직하게는 잠재적 개시코돈이다. 또는, 서브게놈 프로모터가 nsP4를 코딩하는 핵산 서열과 중첩되지 않는다면, nsP4를 코딩하는 전체 핵산 서열이 결실될 수 있다.
일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 절단된 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는다. 이 실시형태와 관련하여, RNA 레플리콘은 nsP1의 N-말단 단편을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않으며, 선택적으로 nsP4의 C-말단 단편을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는 것이 특히 바람직하다. nsP1의 N-말단 단편은 절단된 알파바이러스 단백질이고; nsP4의 C-말단 단편 또한 절단된 알파바이러스 단백질이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 레플리콘은 알파바이러스의 게놈의 5' 말단의 스템루프 2 (SL2)를 포함하지 않는다. Frolov 등의 상기 문헌에 따르면, 스템루프 2는 CSE 2의 상류에 알파바이러스의 게놈의 5' 말단에서 발견되는 보존된 2차 구조체이지만 복제에는 필요하지 않다.
일 실시형태에서, 레플리콘의 5' 복제인식서열은 알파바이러스 비구조성 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열과 중첩되지 않는다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 알파바이러스 비구조성 단백질에 대한 코딩 영역 또는 이의 일부의 결실과 임의로 조합되어, 게놈 알파바이러스 RNA와 비교하여 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 특징으로 하는 레플리콘을 포함한다. 예를 들어, nsP2 및 nsP3의 코딩 영역이 결실될 수 있거나, nsP2 및 nsP3의 코딩 영역이 nsP1의 C-말단 단편에 대한 코딩 영역의 결실 및/또는 nsP4의 N-말단 단편에 대한 코딩 영역의 결실과 함께 결실될 수 있고, 하나 이상의 나머지 개시코돈, 즉 상기 제거 후에 잔류하는 개시코돈은 본원에 기재된 바와 같이 제거될 수 있다.
하나 이상의 알파바이러스 비구조성 단백질에 대한 코딩 영역의 결실은 표준 방법, 예를 들어 DNA 수준에서 제한효소의 도움에 의한 절단, 바람직하게는 오픈 리딩 프레임에서 고유의 제한효소부위를 인식하는 제한효소(예를 들어, 실시예 1 참조)에 의해 달성될 수 있다. 임의로, 고유의 제한효소부위가 돌연변이 유발, 예를 들어 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 오픈 리딩 프레임에 도입될 수 있다. 각각의 DNA는 시험관내 전사를 위한 주형으로 사용될 수 있다.
제한효소부위는 핵산 서열, 예를 들어 특정 제한효소에 의해 핵산 분자, 예를 들어 제한효소부위가 포함된 DNA 분자의 제한(절단)을 유도하는데 필요하고 충분한 DNA 서열이다. 제한효소부위는 핵산 분자에 제한효소부위의 사본이 하나 존재하면 주어진 핵산 분자에 대해 고유한 것이다.
제한효소는 제한효소부위이거나 그 근처의 핵산 분자, 예를 들어 DNA 분자를 절단하는 엔도뉴클레아제이다.
또는, 오픈 리딩 프레임의 일부 또는 전부의 결실을 특징으로 하는 핵산 서열은 합성 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 레플리콘은 바람직하게는 단일가닥 RNA 분자이다. 본 발명에 따른 RNA 레플리콘은 전형적으로 (+) 가닥 RNA 분자이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 RNA 레플리콘은 분리된 핵산 분자이다.
레플리콘에 포함된 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 RNA 레플리콘은 목적 펩티드 또는 목적 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 바람직하게, 목적 단백질은 이종 핵산 서열에 의해 코딩된다. 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자는 동의어로 "목적 유전자" 또는 "전이유전자"로 불린다. 다양한 실시형태에서, 목적 펩티드 또는 목적 단백질은 이종 핵산 서열에 의해 코딩된다. 본 발명에 따르면, 용어 "이종"은 핵산 서열이 알파바이러스 핵산 서열에 자연적으로 기능적으로 또는 구조적으로 결합되지 않는다는 사실을 의미한다.
본 발명에 따른 레플리콘은 단일 폴리펩티드 또는 다중 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 다중 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드 (융합 폴리펩티드) 또는 별도의 폴리펩티드로서 코딩될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 레플리콘은 하나를 초과하는 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있는지 아닌지를 독립적으로 선택될 수 있다. 또는, 폴리-단백질 또는 융합 폴리펩티드는 선택적으로 자가촉매성 프로테아제 절단 부위 (예를 들어 구제역 바이러스 2A 단백질)에 의해 분리된 개개의 폴리펩티드, 또는 인테인을 포함한다.
목적 단백질은 예를 들어, 리포터 단백질, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질, 세포내 인터페론(IFN) 신호전달의 억제제 및 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
리포터 단백질
일 실시형태에서, 오픈 리딩 프레임은 리포터 단백질을 코딩한다. 이 실시형태에서, 오픈 리딩 프레임은 리포터 유전자를 포함한다. 특정 유전자는 이들이 세포 또는 유기체에 부여하는 특성을 용이하게 확인하고 측정할 수 있거나 선택표지이기 때문에 리포터로 선택될 수 있다. 리포터 유전자는 종종 특정 유전자가 세포 또는 유기체 집단에 의해 흡수되거나 발현되었는지 여부를 나타내는 지표로 사용된다. 바람직하게는, 리포터 유전자의 발현 산물을 시각적으로 검출할 수 있다. 일반적으로 시각적으로 검출 가능한 리포터 단백질은 전형적으로 형광 또는 발광 단백질을 가지고 있다. 특정 리포터 유전자의 예로는 이를 발현하는 세포가 청색광 하에서 녹색을 발산하게 하는 해파리 녹색 형광 단백질 (GFP), 루시페린과 반응하여 빛을 생성하는 효소 루시퍼라아제, 및 적색 형광 단백질 (RFP)을 코딩하는 유전자를 포함한다. 변이체가 시각적으로 검출 가능한 특성을 갖는 한, 이러한 특정 리포터 유전자의 임의의 변이체가 가능하다. 예를 들어, eGFP는 GFP의 점돌연변이 변이체이다. 리포터 단백질 실시형태는 특히 발현을 시험하는데 적합하고, 예를 들어 실시예 2 내지 5를 참고한다.
약학적 활성 펩티드 또는 단백질
본 발명에 따르면, 일 실시형태에서, 레플리콘의 RNA는 약학적 활성 RNA를 포함하거나 이로부터 구성된다. "약학적 활성 RNA"는 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 RNA일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 RNA 레플리콘은 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 바람직하게는, 오픈 리딩 프레임은 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 바람직하게는, RNA 레플리콘은 임의로 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
"약학적 활성 펩티드 또는 단백질"은 대상체에게 치료적 유효량으로 투여될 때 대상체의 상태 또는 질병 상태에 긍정적이거나 유리한 효과를 갖는다. 바람직하게는, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질은 치유적 또는 완화된 성질을 가지며, 하나 이상의 질병 또는 장애 증상의 발병을 개선, 완화, 경감, 역전, 지연하거나 중증도를 줄이기 위해 투여될 수 있다. 약학적 활성 펩티드 또는 단백질은 예방적 특성을 가질 수 있으며, 질병의 발병을 지연시키거나 그러한 질병 또는 병리학적 상태의 중증도를 줄이기 위해 사용될 수 있다. 용어 "약학적 활성 펩티드 또는 단백질"은 전체 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하며, 그의 약학적 활성 단편을 지칭할 수도 있다. 또한 펩티드 또는 단백질의 약학적 활성 유사체를 포함할 수 있다. "약학적 활성 펩티드 또는 단백질"이라는 용어는 항원인 펩티드 및 단백질을 포함하고, 즉, 펩티드 또는 단백질은 치료적으로 또는 부분적으로 또는 완전히 보호할 수 있는 대상체에서 면역 반응을 유도한다.
일 실시형태에서, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질은 면역학적 활성 화합물 또는 항원 또는 에피토프이거나 이를 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "면역학적 활성 화합물"은 바람직하게는 면역 세포의 성숙을 유도 및/또는 억제하고, 사이토카인 생합성을 유도 및/또는 억제하고, 및/또는 B 세포에 의한 항체 생산을 자극함으로써 체액성 면역을 변화시킴으로써 면역 반응을 변화시키는 임의의 화합물에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 면역 반응은 항체 반응 (대체로 면역글로불린 G(IgG)를 포함한다)의 자극을 포함한다. 면역학적 활성 화합물은 항 바이러스 및 항암 활성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 강력한 면역 자극 활성을 보유하고, 또한 면역 반응을 TH2 면역 반응으로부터 멀리 이동시키는 것과 같은 면역 반응의 다른 측면을 하향 조절할 수 있으며, 이는 광범위한 TH2 매개성 질병 치료에 유용하다.
본 발명에 따르면, 용어 "항원" 또는 "면역원"은 면역 반응을 유도하는 임의의 물질을 포함한다. 특히, "항원"은 항체 또는 T-림프구 (T-세포)와 특이적으로 반응하는 임의의 물질에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 용어 "항원"은 하나 이상의 에피토프를 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥에서의 항원은 임의로 가공 후, 바람직하게 항원에 특이적인 면역 반응을 유도하는 분자이다. 본 발명에 따르면, 면역 반응의 후보인 임의의 적합한 항원이 사용될 수 있으며, 여기서 면역 반응은 체액성 반응뿐만 아니라 세포성 면역 반응일 수 있다. 본 발명의 실시형태와 관련하여, 항원은 바람직하게는 MHC 분자와 관련하여 세포, 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포에 의해 제시된다. 항원은 바람직하게는 자연 발생 항원에 상응한 것 또는 이로부터 유래된 생성물이다. 그러한 자연 발생 항원은 알러젠, 바이러스, 박테리아, 진균류, 기생충 및 기타 감염 인자 및 병원균을 포함하거나 이로부터 유도될 수 있거나 항원은 또한 종양 항원일 수 있다. 본 발명에 따르면, 항원은 자연 발생 산물, 예를 들면, 바이러스 단백질 또는 그의 일부에 상응할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항원은 표면 폴리펩티드, 즉 세포, 병원균, 박테리아, 바이러스, 진균류, 기생충, 알러젠 또는 종양의 표면 상에 자연적으로 전시된 폴리펩티드이다. 항원은 세포, 병원균, 박테리아, 바이러스, 균류, 기생충, 알레르기 항원 또는 종양에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
"병원균"라는 용어는 유기체, 바람직하게는 척추 동물에서 질병을 일으킬 수 있는 병원성 생물학적 물질을 의미한다. 병원균에는 박테리아, 단세포성 진핵세포 유기체(원생동물), 진균류와 같은 미생물뿐만 아니라 바이러스가 포함된다.
용어 "에피토프", "항원 펩티드", "항원 에피토프", "면역원성 펩티드" 및 "MHC 결합 펩티드"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 항원과 같은 분자 내의 항원 결정기, 즉 특히 MHC 분자와 관련하여 제시되는 경우 면역계에 의해 인식되는, 예를 들어 T 세포에 의해 인식되는 면역학적 활성 화합물의 일부 또는 단편을 의미한다. 단백질의 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 연속 또는 불연속 부분을 포함하고, 길이가 바람직하게는 5 내지 100개, 바람직하게는 5 내지 50개, 보다 바람직하게는 8 내지 30개, 가장 바람직하게는 10 내지 25개인 아미노산이고, 예를 들면 에피토프는 길이가 바람직하게는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개인 아미노산일 수 있다. 본 발명에 따른 에피토프는 세포 표면 상의 MHC 분자와 같은 MHC 분자에 결합할 수 있으며, 따라서 "MHC 결합 펩티드" 또는 "항원 펩티드"일 수 있다. 용어 "주요 조직 적합 유전자 복합체" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하고 모든 척추 동물에 존재하는 유전자의 복합체에 관한 것이다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질환 세포 사이의 신호전달에 중요하며, 여기서 MHC 단백질 또는 분자는 펩티드를 결합시키고 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 이들을 제시한다. MHC에 의해 코딩된 단백질은 세포 표면에서 발현되고, 자기 항원(세포 자체로부터의 펩티드 단편) 및 비-자기 항원(예를 들어, 침입하는 미생물의 단편) 모두를 T 세포에 제시한다. 그러한 바람직한 면역원성 부분은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합한다. 본원에 사용된 바와 같이, 이러한 결합이 해당 분야에 공지된 임의의 분석을 사용하여 검출 가능한 경우, 면역원 부분은 MHC클래스 I 또는 클래스 II 분자에 "결합"한다고 한다. 용어 "MHC 결합 펩티드"는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드에 관한 것이다. 클래스 I MHC/펩티드 복합체의 경우, 결합 펩티드는 보다 길거나 보다 짧은 펩티드가 효과적일 수 있지만 일반적으로 8-10개의 아미노산 길이이다. 클래스 II MHC/펩티드 복합체의 경우, 결합 펩티드는 전형적으로 10-25개의 아미노산 길이이고, 특히 13-18개의 아미노산 길이인 반면, 보다 길고 보다 짧은 펩티드가 효과적일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 목적 단백질은 표적 유기체의 백신접종에 적합한 에피토프를 포함한다. 당업자는 면역생물학 및 백신접종의 원리 중 하나가 생물체를 항원으로 면역화함으로써 치료될 질병에 대하여 면역학적으로 적절한 질병에 대한 면역보호반응이 생성된다는 사실에 기초한다는 것을 알 것이다. 본 발명에 따르면, 항원은 자기 항원 및 비자기 항원을 포함하는 군으로부터 선택된다. 비자기 항원은 세균 항원, 바이러스 항원, 진균 항원, 알러젠 또는 기생충 항원인 것이 바람직하다. 항원은 표적 유기체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 에피토프는 박테리아, 바이러스, 곰팡이, 기생충, 알러젠 또는 종양에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, 비자기 항원은 박테리아 항원이다. 일부 실시형태에서, 항원은 조류, 어류 및 가축을 비롯한 포유류를 포함한 동물을 감염시키는 박테리아에 대한 면역 반응을 유도한다. 바람직하게는, 면역 반응을 유발시키는 박테리아는 병원성 박테리아이다.
일부 실시형태에서, 비자기 항원은 바이러스 항원이다. 바이러스 항원은 예를 들어 바이러스 표면 단백질로부터의 펩티드, 예를 들어 캡시드 폴리펩티드 또는 스파이크 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 조류, 어류 및 가축을 비롯한 포유류를 포함한 동물을 감염시키는 바이러스에 대한 면역 반응을 유도한다. 바람직하게는, 면역 반응을 유발시키는 바이러스는 병원성 바이러스이다.
일부 실시형태에서, 비자기 항원은 진균류의 폴리펩티드 또는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 항원은 조류, 어류 및 가축을 비롯한 포유류를 포함한 동물을 감염시키는 진균류에 대한 면역 반응을 유도한다. 바람직하게는, 면역 반응을 유발시키는 진균류는 병원성 진균류이다.
일부 실시형태에서, 비자기 항원은 단세포성 진핵세포 기생충의 폴리펩티드 또는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 항원은 단세포성 진핵세포 기생충, 바람직하게는 병원성 단세포성 진핵세포 기생충에 대한 면역 반응을 유도한다. 병원성 단세포성 진핵세포 기생충은 예를 들어, Plasmodium 속, 예를 들어 P. falciparum, P. vivax, P. malariae 또는 P. ovale, Leishmania 속, 또는 Trypanosoma 속, 예를 들어 T. cruzi 또는 T. brucei에 속하는 것일 수 있다.
일부 실시형태에서, 비자기 항원은 알러젠성 폴리펩티드 또는 알러젠성 단백질이다. 알러젠성 단백질 또는 알러젠성 폴리펩티드는 알러젠 면역요법, 또한 탈감작요법에 적합한 것이다.
일부 실시형태에서 항원은 자기 항원, 특히 종양 항원이다. 종양 항원 및 그 결정기는 당업자에게 공지되어 있는 것이다.
본 발명의 문맥 상에서, 용어 "종양 항원" 또는 "종양-관련 항원"은 제한된 수의 조직 및/또는 기관에서 또는 특정 발달 단계에서 특이적으로 발현되는 정상 조건 하에 있는 단백질에 관한 것이고, 예를 들어, 상기 종양 항원은 위 조직, 바람직하게는 위 점막, 생식 기관, 예를 들어 고환, 영양막 조직, 예를 들어 태반 또는 생식선 세포에서 특이적으로 발현되는 정상 조건 하에 있는 단백질일 수 있고, 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현되는 단백질에 관한 것이다. 이러한 맥락에서 "제한된 수"는 바람직하게는 3 이하, 보다 바람직하게는 2 이하를 의미한다. 본 발명의 문맥에서 종양 항원은 예를 들어 분화 항원, 바람직하게는 세포 유형 특이성 분화 항원, 즉 특정 분화 단계에서 특정 세포 유형으로 특이적으로 발현되는 정상 상태 하의 단백질, 암/고환 항원, 즉 정소 및 때로경우에 따라 태반에서 특이적으로 발현되는 정상 상태 하의 단백질, 및 생식선 특정 항원을 포함한다. 본 발명과 관련하여, 종양 항원은 바람직하게는 암세포의 세포 표면과 결합하고, 바람직하게는 정상 조직에서는 거의 또는 거의 발현되지 않는다. 바람직하게는, 종양 항원 또는 종양 항원의 이상 발현은 암세포를 확인한다. 본 발명과 관련하여, 대상체, 예를 들어, 암 질환을 앓고 있는 환자에서 암세포에 의해 발현되는 종양 항원은 바람직하게는 상기 대상체에서의 자가-단백질이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 문맥에서의 종양 항원은 비필수적인 조직 또는 기관, 즉, 면역계에 의해 손상될 때 대상체의 죽음을 초래하지 않는 조직 또는 기관, 또는 면역계에 의해 거의 또는 전혀 접근 할 수 없는 신체의 장기 또는 구조에서 정상 조건 하에서 특이적으로 발현된다. 바람직하게는, 종양 항원의 아미노산 서열은 정상 조직에서 발현되는 종양 항원과 암 조직에서 발현되는 종양 항원 간에 동일하다.
본 발명에서 유용한 종양 항원의 예로서는 p53, ART-4, BAGE, 베타-카테닌/m, Bcr-abL CAMEL, 캡-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, 클라우딘 계열의 세포표면 단백질, 예컨대 CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 및 CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, 바람직하게는 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, 또는 MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 마이너 BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, 프로테이나제 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE 및 WT를 들 수 있다. 특히 바람직한 종양 항원은 CLAUDIN-18.2 (CLDN18.2) 및 CLAUDIN-6 (CLDN6)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질이 면역 반응을 유도하는 항원일 필요는 없다. 적절한 약학적 활성 단백질 또는 펩티드는 사이토카인 및 면역계 활성 화합물 (예컨대 인터루킨, 콜로니 자극 인자(CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 에리스로포이에틴, 종양괴사인자(TNF), 인터페론, 인테그린, 주소단백질(addressins), 셀레틴(seletin), 귀소수용체, T 세포 수용체, 면역글로불린), 호르몬 (인슐린, 갑상선 호르몬, 카테콜라민, 생식선 자극 호르몬, 영양 호르몬(trophic hormones), 프로락틴, 옥시토신, 도파민, 소 소마토트로핀(bovine somatotropin), 및 렙틴 등), 성장 호르몬 (예컨대 인간 성장 호르몬), 성장 인자 (예컨대 표피생장인자, 신경성장인자, 및 인슐린-유사 성장인자 등), 성장 인자 수용체, 효소 (조직플라스미노겐활성제, 스트렙토키나제, 콜레스테롤 생합성 또는 분해성, 스테로이드 생성 효소, 키나아제, 포스포디에스테라아제, 메틸화효소, 디메틸화효소, 탈수소효소, 셀룰라아제, 프로테아제, 리파아제, 포스포리파제, 아로마타제, 시토크롬, 아데닐레이트 또는 구아닐고리화효소 및 뉴라미데이즈 등), 수용체 (스테로이드 호르몬 수용체, 펩티드 수용체), 결합 단백질 (성장 호르몬 또는 성장 인자 결합 단백질 등), 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질 (예를 들어, 혈관생성을 억제하는 단백질), 구조 단백질 (예컨대 콜라겐, 피브로인, 피브리노겐, 엘라스틴, 튜불린, 액틴 및 미오신), 혈액 단백질 (트롬빈, 혈청 알부민, 인자 VII, 인자 VIII, 인슐린, 인자 IX, 인자 X, 조직플라스미노겐활성제, 단백질 C, 폰빌레브란트 인자(von Wilebrand factor), 항트롬빈 III, 글루코세레브로시다아제, 콜로니 자극 인자 (GCSF) 또는 변형된 인자 VIII, 항응고제 등)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학적 활성 단백질은 림프 항상성의 조절에 관여하는 사이토카인이고, 바람직하게는 T 세포의 발달, 초회항원자극(priming), 팽창, 분화 및/또는 생존에 관여하고 바람직하게는 이를 유도 및/또는 증가시키는 사이토카인이다. 일 실시형태에서, 사이토카인은 인터루킨, 예를 들어 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, 또는 IL-21이다.
인터페론 (IFN) 신호전달의 억제제
오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 적합한 추가 단백질은 인터페론 (IFN) 신호전달의 억제제이다. 발현을 위해 RNA가 도입된 세포의 생존력이 감소될 수 있다고 보고되고 있지만, 특히 세포가 RNA로 수회 형질주입된 경우, IFN 억제제는 RNA가 존재해야 하는 세포의 생존력을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(WO 2014/071963 A1). 바람직하게는, 억제제는 IFN 타입 I 신호전달의 억제제이다. 세포외 IFN에 의한 IFN 수용체의 결합을 방지하고 세포에서 세포내 IFN 신호전달을 억제함으로써 세포 내 RNA의 안정한 발현을 가능하게 한다. 또한, 세포외 IFN에 의한 IFN 수용체의 결합을 방지하고 세포내 IFN 신호전달을 억제함으로써, 특히 세포를 반복적으로 RNA로 형질주입시키는 경우, 세포의 생존은 향상된다. 이론에 결부되기를 바라는 것 없이, 세포내 IFN 신호전달이 번역 및/또는 RNA 분해의 억제를 초래할 수 있다고 생각된다. 이것은 하나 이상의 IFN-유도성 항바이러스 활성 이펙터 단백질을 억제함으로써 해결될 수 있다. IFN-유도성 항바이러스 활성 이펙터 단백질은 RNA 의존적 단백질 키나아제 (PKR), 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소(OAS) 및 RNaseL로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 세포내 IFN 신호전달을 저해하는 것은 PKR-의존성 경로 및/또는 OAS-의존성 경로를 억제하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 목적 단백질은 PKR-의존성 경로 및/또는 OAS-의존성 경로를 억제할 수 있는 단백질이다. PKR-의존성 경로를 억제하는 것은 eIF2-알파 인산화를 억제하는 것을 포함할 수 있다. PKR을 억제하는 것은 세포를 적어도 하나의 PKR 억제제로 처리하는 것을 포함할 수 있다. PKR 억제제는 PKR의 바이러스 억제제일 수 있다. PKR의 바람직한 바이러스 억제제는 종두증 바이러스 E3이다. 펩티드 또는 단백질 (예컨대 E3, K3)이 세포내 IFN 신호전달을 억제하는 것이라면, 펩티드 또는 단백질의 세포내 발현이 바람직하다. 종두증 바이러스 E3는 PKR과 OAS의 활성화를 막기 위해 dsRNA에 결합하고 격리하는 25 kDa dsRNA-결합 단백질 (유전자 E3L에 의해 코딩됨)이다. E3는 PKR에 직접 결합하여 그 활성을 억제하여 eIF2-알파의 인산화를 감소시킨다. IFN 신호전달의 다른 적합한 억제제는 단순포진 바이러스 ICP34.5, 토스카나 바이러스 NSs, Bombyx mori 핵다각체병바이러스 PK2 및 HCV NS34A이다.
IFN 신호전달 억제제는 IFN 신호전달 억제제를 코딩하는 핵산 서열 (예컨대 RNA)의 형태로 세포에 제공될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포내 또는 세포외 IFN 신호전달의 억제제는 mRNA 분자에 의해 코딩된다. 상기 mRNA 분자는 본원에 기재된 바와 같은 비-폴리펩티드-서열 개질 변형, 예를 들어 캡, 5'-UTR, 3'-UTR, 폴리(A) 서열, 코돈 사용의 변형(adaptation)을 포함할 수 있다. 각각의 실시형태가 예를 들어 실시예 3에서 설명된다.
또 다른 실시형태에서, 세포내 또는 세포외 IFN 신호전달의 억제제는 레플리콘, 바람직하게는 트랜스-레플리콘 또는 본원에 기재된 바와 같은 트랜스-레플리콘에 의해 코딩된다. 상기 레플리콘은 전형적으로 CSE 1, CSE 2 및 CSE 4의 알파바이러스 복제효소에 의한 복제를 허용하는 핵산 서열 요소; 바람직하게는 CSE 3을 전형적으로 포함하는 서브게놈 전사체, 즉 서브게놈 프로모터의 생산을 가능하게 하는 핵산 서열 요소를 포함한다. 레플리콘은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 비폴리펩티드-서열 개질 변형, 예를 들어 캡, 폴리(A) 서열, 코돈 사용의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 다수의 오픈 리딩 프레임이 레플리콘 상에 존재하는 경우, 세포내 IFN 신호전달의 억제제는 선택적으로 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있는지 없는지 여부에 관계없이 이들 중 어느 하나에 의해 코딩될 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 세포내 IFN 신호전달의 억제제는 RNA 레플리콘의 가장 상류의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 세포내 IFN 신호전달의 억제제가 RNA 레플리콘의 가장 상류 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩될 때, 세포내 IFN 신호전달 억제제를 코딩하는 유전 정보는 RNA 레플리콘이 숙주세포에 도입된 후 일찍 번역될 것이며, 이어서 얻어진 단백질은 세포내 IFN 신호전달을 억제할 수 있다.
기능성 알파바이러스 비구조성 단백질
오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 적합한 추가 단백질은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이다. "알파바이러스 비구조성 단백질"이란 용어는 알파바이러스 비구조성 단백질의 탄수화물-개질된 형태 (예컨대 글리코실화됨) 및 지질-개질된 형태를 포함하여 각각의 동시- 또는 번역-후 변형된 형태를 포함한다.
일부 실시형태에서, 용어 "알파바이러스 비구조성 단백질"은 알파바이러스 기원의 개별적인 비구조성 단백질 (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) 중 임의의 하나 이상을 지칭하거나, 알파바이러스 유래의 하나를 초과하는 비구조성 단백질의 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리-단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, "알파바이러스 비구조성 단백질"은 nsP123 및/또는 nsP4를 지칭한다. 다른 실시형태에서, "알파바이러스 비구조성 단백질"은 nsP1234를 지칭한다. 일 실시형태에서, 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은 단일의 선택적으로 절단 가능한 폴리-단백질 nsP1234로서 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4 모두로 이루어진다. 일 실시형태에서, 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은 단일의 선택적으로 절단 가능한 폴리-단백질 nsP123으로서 nsP1, nsP2 및 nsP3로 이루어진다. 상기 실시형태에서, nsP4는 추가적인 목적 단백질일 수 있고, 또 추가적인 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 알파바이러스 비구조성 단백질은 예를 들어, 숙주세포에서 복합체 또는 결합체를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, "알파바이러스 비구조성 단백질"은 nsP123 (동의어로 P123) 및 nsP4의 복합체 또는 결합체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, "알파바이러스 비구조성 단백질"은 nsP1, nsP2 및 nsP3의 복합체 또는 결합체를 의미한다. 일부 실시형태에서, "알파바이러스 비구조성 단백질"은 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4의 복합체 또는 결합체를 의미한다. 일부 실시형태에서, "알파바이러스 비구조성 단백질"은 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 복합체 또는 결합체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 알파바이러스 비구조성 단백질은 적어도 nsP4를 포함한다.
용어 "복합체" 또는 "결합체"는 공간적으로 근접한 2개 이상의 동일하거나 상이한 단백질 분자를 지칭한다. 복합체의 단백질은 바람직하게는 서로 직접적 또는 간접적인 물리적 또는 물리화학적 접촉을 한다. 복합체 또는 결합체는 다수의 상이한 단백질(헤테로다합체(heteromultimer)) 및/또는 하나의 특정 단백질(호모다합체)의 다수 사본으로 이루어질 수 있다. 알파바이러스 비구조성 단백질과 관련하여, 용어 "복합체 또는 결합체"는 다수의 적어도 2개의 단백질 분자를 의미하며, 그 중 적어도 하나는 알파바이러스 비구조성 단백질이다. 복합체 또는 결합체는 하나의 특정 단백질 (호모다합체)의 다수 사본 및/또는 여러 다른 단백질(헤테로다합체)의 다수 사본으로 구성될 수 있다. 다합체와 관련하여, "다수(multi)"는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10개 이상과 같은 하나 이상의 것을 의미한다.
"기능성 알파바이러스 비구조성 단백질"이란 용어는 복제효소 기능을 갖는 알파바이러스 비구조성 단백질을 포함한다. 따라서, "기능성 알파바이러스 비구조성 단백질"은 알파바이러스 복제효소를 포함한다. "복제효소 기능"은 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRP), 즉 (+) 가닥 RNA 주형을 기반으로 (-) 가닥 RNA의 합성을 촉매할 수 있고, 및/또는 (-) 가닥 RNA 주형을 기반으로 한 (+) 가닥 RNA의 합성을 촉매할 수 있는 효소를 포함한다. 따라서, "기능성 알파바이러스 비구조성 단백질"이라는 용어는 (+) 가닥 (예컨대 게놈) RNA를 주형으로 사용하여 (-) 가닥 RNA를 합성하는 단백질 또는 복합체, 주형으로서 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 단편을 사용하여, 새로운 (+) 가닥 RNA을 합성하는 단백질 또는 복합체, 및/또는 주형으로서 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 단편을 사용하여, 서브게놈 전사체를 합성하는 단백질 또는 복합체를 지칭할 수 있다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 하나 이상의 추가 기능, 예컨대 프로테아제 (자가-절단을 위해), 헬리카제, 말단 아데닐릴 전이효소 (폴리(A) 꼬리 추가를 위해), 메틸전달효소 및 구아닐릴 전이효소 (5'-캡을 핵산에 제공하기 위해), 핵이행부위(nuclear localization sites), 트리포스파타아제를 추가로 가질 수 있다(Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124; Rupp et al., 2015, J. Gen. Virol., vol. 96, pp. 2483-500).
본 발명에 따르면, 용어 "알파바이러스 복제효소"는 자연 발생 알파바이러스 (자연계에서 발견되는 알파바이러스)로부터의 RNA 의존성 RNA 중합효소 및 알파바이러스의 변이체 또는 유도체, 예컨대 약독 알파바이러스로부터의 RNA 의존성 RNA 중합효소를 포함하는 알파바이러스 RNA 의존성 RNA 중합효소를 지칭한다. 본 발명의 문맥 상에서, 용어 "복제효소" 및 "알파바이러스 복제효소"는 임의의 특정 복제효소가 알파바이러스 복제효소가 아니라고 문맥이 지시하지 않는 한 상호 교환적으로 사용된다.
"복제효소"라는 용어는 알파바이러스-감염된 세포에 의해 발현되거나 알파바이러스 복제효소에 대해 코딩하는 핵산으로 형질주입된 세포에 의해 발현되는 알파 리 바이러스 복제효소의 모든 변이체, 특히 번역 후 변형된 변이체, 입체배좌체, 이소형체, 및 상동체를 포함한다. 또한, 용어 "복제효소"는 재조합 방법에 의해 생성되고 생산될 수 있는 모든 형태의 복제효소를 포함한다. 예를 들어, 실험실에서 복제효소의 검출 및/또는 정제를 용이하게 하는 태그를 포함하는 복제효소, 예를 들어 myc-태그, HA-태그 또는 올리고히스티딘 태그(His-태그)는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.
선택적으로, 알파바이러스 복제효소는 알파바이러스 보존서열구성 1 (CSE 1) 또는 이의 상보 서열, 보존서열구성 2 (CSE 2) 또는 이의 상보 서열, 보존서열구성 3 (CSE 3) 또는 이의 상보 서열, 보존서열구성 4 (CSE 4) 또는 이의 상보 서열 중 임의의 하나 이상에 결합하는 능력에 의해 추가로 기능적으로 정의된다. 바람직하게는, 복제효소는 CSE 2 [즉, (+) 가닥에] 및/또는 CSE 4 [즉, (+) 가닥에]에 결합할 수 있거나, CSE 1의 상보체에 결합 [즉, (-) 가닥에] 및/또는 CSE 3의 상보체 [즉, (-) 가닥에]에 결합할 수 있다.
복제효소의 기원은 임의의 특정 알파바이러스에만 국한되지 않는다. 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스 복제효소는 자연-발생 Semliki Forest 바이러스 및 약독 Semliki Forest 바이러스와 같은 Semliki Forest 바이러스의 변이체 또는 유도체를 포함하는, Semliki Forest 바이러스 유래 비구조성 단백질을 포함한다. 또 다른 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스 복제효소는 자연 발생 Sindbis 바이러스 및 약독 Sindbis 바이러스와 같은 Sindbis 바이러스의 변이체 또는 유도체를 포함하는, Sindbis 바이러스 유래 비구조성 단백질을 포함한다. 또 다른 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스 복제효소는 자연 발생 VEEV 및 VEEV의 변이체 또는 유도체, 예컨대 약독 VEEV를 포함하는 베네수엘라 마뇌염 바이러스 (VEEV) 유래 비구조성 단백질을 포함한다. 또 다른 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스 복제효소는 자연 발생 CHIKV 및 약독 CHIKV와 같은 CHIKV의 변이체 또는 유도체를 포함하는, chikungunya 바이러스 (CHIKV) 유래 비구조성 단백질을 포함한다.
복제효소는 둘 이상의 알파바이러스의 비구조성 단백질을 포함할 수도 있다. 따라서, 알파바이러스 비구조성 단백질을 포함하고 복제효소 기능을 갖는 이종 복합체 또는 결합체는 본 발명에 의해 동등하게 포함된다. 예시만을 위해, 복제효소는 제 1 알파바이러스로부터의 하나 이상의 비구조성 단백질 (예컨대 nsP1, nsP2) 및 제 2 알파바이러스로부터의 하나 이상의 비구조성 단백질 (nsP3, nsP4)를 포함할 수 있다. 2개 이상의 상이한 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질은 별도의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩될 수 있거나, 폴리-단백질, 예를 들어 nsP1234로서 단일 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 발현되는 세포에서 막성(membranous) 복제 복합체 및/또는 액포를 형성할 수 있다.
기능성 알파바이러스 비구조성 단백질, 즉 복제효소 기능을 갖는 알파바이러스 비구조성 단백질이 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 코딩된 경우, 레플리콘의 서브게놈 프로모터가 존재한다면 상기 복제효소와 양립하는 것이 바람직하다. 이러한 맥락에서 양립할 수 있는 것은, 알파바이러스 복제효소가 존재한다면 서브게놈 프로모터를 인식할 수 있다는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 이것은 서브게놈 프로모터가 복제효소를 유도하는 알파바이러스에 대해 고유한 경우, 즉 이들 서열의 자연 기원이 동일한 알파바이러스인 경우에 달성된다. 대안적인 실시형태에서, 알파바이러스 복제효소가 서브게놈 프로모터를 인식할 수 있다면, 서브게놈 프로모터는 알파바이러스 복제효소를 유도한 알파바이러스에 대해 고유하지 않다. 즉, 복제효소는 서브게놈 프로모터와 호환된다(바이러스 간 호환성). 상이한 알파바이러스로부터 유래하는 서브게놈 프로모터 및 복제효소에 관한 바이러스 간 호환성의 예로서는 당업계에 공지되어 있다. 바이러스 간 호환성이 존재하는 한 서브게놈 프로모터와 복제효소의 임의의 조합이 가능한다. RNA와 함께 시험할 복제효소를 인큐베이팅함으로써 본 발명을 수행하는 당업자는 바이러스 간 호환성을 용이하게 시험할 수 있고, 여기서 RNA는 서브게놈 프로모터로부터 RNA 합성에 적합한 조건에서 실험할 서브게놈 프로모터를 갖는다. 서브게놈 전사체가 준비되면, 서브게놈 프로모터와 복제효소는 양립할 수 있는 것으로 결정된다. 바이러스 간 호환성의 다양한 예가 공지되어 있다 (문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]로 확인함).
일 실시형태에서, 알파바이러스 비구조성 단백질은 이종 단백질, 예를 들어 유비퀴틴과의 융합 단백질로 코딩되지 않는다.
본 발명에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 RNA 레플리콘 상에 제공될 수 있거나, 대안적으로, 별도의 핵산 분자, 예를 들어 mRNA 분자로 제공될 수 있다. 별도의 mRNA 분자는 선택적으로 예를 들어, 캡, 5'-UTR, 3'-UTR, 폴리(A) 서열 및/또는 코돈 사용의 변형을 포함한다. 별도의 mRNA 분자는 본 발명의 시스템에 대해 본원에 기재된 바와 같이 트랜스로 제공될 수 있다.
기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 RNA 레플리콘 상에 제공되는 경우, 레플리콘은 바람직하게는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있다. 특히, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 RNA 레플리콘은 레플리콘에 의해 코딩된 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있다. 이 실시형태는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 트랜스로 제공되지 않는 경우에 매우 바람직하다. 이 실시형태에서, 레플리콘의 시스-복제를 목표로 한다. 바람직한 일 실시형태에서, RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임뿐만 아니라 목적 단백질을 코딩하는 추가적인 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있다. 이 실시형태는 본 발명에 따른 목적 단백질을 생성하기 위한 몇몇 방법에 특히 적합하다. 각각의 레플리콘의 예는 도 1에 나타내고 있다("시스레플리콘 △5ATG-RRS").
레플리콘이 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 경우, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 5' 복제인식서열과 중첩되지 않는 것이 바람직하다. 일 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 존재한다면 서브게놈 프로모터와 중첩되지 않는다. 각각의 레플리콘의 예는 도 1에 나타내고 있다("시스레플리콘 △5ATG-RRS").
다수의 오픈 리딩 프레임이 레플리콘 상에 존재한다면, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 임의로 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있는지 여부에 관계없이, 임의의 하나에 의해 코딩될 수 있고, 바람직하게는 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있지 않은 것이다. 바람직한 일 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 RNA 레플리콘의 가장 상류의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 RNA 레플리콘의 가장 상류의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩될 때, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 유전 정보는 RNA 레플리콘을 숙주세포에 도입한 후 초기에 번역되고, 이어서 얻어진 단백질은 숙주세포에서 복제 및 임의로 서브게놈 전사체의 생산을 유도할 수 있다. 각각의 레플리콘의 예는도 1에 나타내고 있다("시스레플리콘 △5ATG-RRS").
레플리콘에 포함되거나 트랜스로 제공되는 별도의 핵산 분자에 포함되는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 존재는, 레플리콘이 복제될 수 있게 하여 결과적으로 임의로 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 레플리콘에 의해 코딩된 목적 유전자를 높은 수준으로 발현하게 한다. 이것은 다른 전이유전자 발현 시스템에 비해 비용면에서 유리하다. 예를 들어, 동물 백신접종의 경우, 백신 비용은 수의학 및 농업 공동체에서 성공에 중요한 요인이다. 본 발명의 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 존재 하에서, 예를 들어 백신접종된 동물의 세포에서 복제될 수 있기 때문에, 상대적으로 적은 양의 레플리콘 RNA가 투여 되더라도, 목적 유전자의 높은 수준의 발현이 달성될 수 있다. 저용량의 레플리콘 RNA는 대상체당 백신 비용에 긍정적인 영향을 미친다.
RNA 레플리콘에서 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임의 위치
RNA 레플리콘은 임의로 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 목적 펩티드 또는 목적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현에 적합하다. 다양한 실시형태가 가능하다. 목적 펩티드 또는 목적 단백질을 각각 코딩하는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임이 RNA 레플리콘 상에 존재할 수 있다. RNA 레플리콘의 가장 상류의 오픈 리딩 프레임은 "제 1 오픈 리딩 프레임"로 지칭한다. 일부 실시형태에서, "제 1 오픈 리딩 프레임"은 RNA 레플리콘의 유일한 오픈 리딩 프레임이다. 선택적으로, 하나 이상의 또 다른 오픈 리딩 프레임이 제 1 오픈 리딩 프레임의 하류에 존재할 수 있다. 제 1 오픈 리딩 프레임의 하류에 하나 이상의 또 다른 오픈 리딩 프레임은 (5'에서 3')의 순서로 제 1 오픈 리딩 프레임의 하류에 존재하는 "제 2 오픈 리딩 프레임", "제 3 오픈 리딩 프레임" 등으로 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 각각의 오픈 리딩 프레임은 ATG (각각의 DNA 분자 내)에 상응하는 개시코돈 (염기 삼중항), 전형적으로는 AUG (RNA 분자 내)를 포함한다.
레플리콘이 3' 복제인식서열을 포함하는 경우, 모든 오픈 리딩 프레임이 3' 복제인식서열의 상류에 위치하는 것이 바람직하다.
하나 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 RNA 레플리콘이 숙주세포에 도입될 때, 5' 복제인식서열로부터 적어도 하나의 개시코돈의 제거로 인해, 번역은 제 1 오픈 리딩 프레임의 임의의 상류 위치에서 개시되지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 레플리콘은 제 1 오픈 리딩 프레임의 번역을 위한 주형으로 직접 작용할 수 있다. 바람직하게는, 레플리콘은 5'-캡을 포함한다. 이것은 레플리콘으로부터 직접적으로 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 유전자의 발현에 도움이 된다.
일부 실시형태에서, 레플리콘의 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터의 제어 하에, 바람직하게는 알파바이러스 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있다. 알파바이러스 서브게놈 프로모터는 매우 효율적이어서 높은 수준의 이종 유전자 발현에 적합한다. 바람직하게는, 서브게놈 프로모터는 알파바이러스의 서브게놈 전사체에 대한 프로모터이다. 이는 서브게놈 프로모터가 알파바이러스에 고유한 것이고 바람직하게는 상기 알파바이러스에서 하나 이상의 구조 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 전사를 제어하는 것을 의미한다. 대안적으로, 서브게놈 프로모터는 알파바이러스의 서브게놈 프로모터의 변이체이고; 숙주세포에서 서브게놈 RNA 전사를 위한 프로모터로서 기능하는 임의의 변이체가 적합하다. 레플리콘이 서브게놈 프로모터를 포함하는 경우, 레플리콘은 보존서열구성 3 (CSE 3) 또는 이의 변이체를 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터의 하류에 위치하고 있다. 바람직하게는, 서브게놈 프로모터는 오픈 리딩 프레임의 전사체를 포함하는 서브게놈 RNA의 생산을 조절한다.
일부 실시형태에서, 제 1 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있다. 제 1 오픈 리딩 프레임이 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있을 때, 그 위치는 알파바이러스의 게놈에서 구조 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 위치와 유사하다. 제 1 오픈 리딩 프레임이 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있을 때, 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 유전자는 레플리콘뿐만 아니라 이의 서브게놈 전사체로부터 발현될 수 있다 (후자는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 존재할 때임). 각각의 실시형태는 도 1의 레플리콘 "△5ATG-RRS"에 의해 예시된다. 바람직하게 "△5ATG-RRS"는 nsP4의 C-말단 단편(*nsP4)을 코딩하는 핵산 서열에서 임의의 개시코돈을 포함하지 않는다. 각각 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 하나 이상의 또 다른 오픈 리딩 프레임이 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있는 제 1 오픈 리딩 프레임의 하류에 존재할 수 있다(도 1에 도시되지 않음). 하나 이상의 또 다른 오픈 리딩 프레임, 예를 들어 제 2 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 유전자는, 각각 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 하나 이상의 서브게놈 전사체로부터 번역될 수 있다. 예를 들어, RNA 레플리콘은 제 2 목적 단백질을 코딩하는 전사체의 생성을 제어하는 서브게놈 프로모터를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 제 1 오픈 리딩 프레임은 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있지 않다. 제 1 오픈 리딩 프레임이 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있지 않을 때, 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 유전자는 레플리콘으로부터 발현될 수 있다. 각각의 실시형태는 도 1의 레플리콘 "△5ATG-RRS△SGP"에 의해 예시된다. 각각 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 하나 이상의 또 다른 오픈 리딩 프레임이 제 1 오픈 리딩 프레임의 하류에 존재할 수 있다(2개의 실시형태에서 나타내듯이, 도 1에 "△5ATG-RRS-바이시스트론" 및 "시스레플리콘 △5ATG-RRS" 참조). 하나 이상의 또 다른 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 유전자는 서브게놈 전사체로부터 발현될 수 있다.
본 발명에 따른 레플리콘을 포함하는 세포에서, 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 증폭될 수 있다. 또한, 레플리콘이 서브게놈 프로모터의 제어 하에 하나 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 경우, 하나 이상의 서브게놈 전사체는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 제조될 것으로 기대된다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 트랜스로 제공되거나, 레플리콘의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩될 수 있다.
레플리콘이 목적 단백질을 코딩하는 두개 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 경우, 각각의 오픈 리딩 프레임이 상이한 단백질을 코딩하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 제 2 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질은 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 상이하다.
일부 실시형태에서, 제 1 및/또는 또 다른 오픈 리딩 프레임, 바람직하게는 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질 또는 IFN 신호전달의 억제제, 예를 들어 E3이다. 일부 실시형태에서, 제 1 및/또는 또 다른 오픈 리딩 프레임, 예를 들어 제 2 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은, 약학적 활성 펩티드 또는 단백질, 또는 리포터 단백질이다.
일 실시형태에서, 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이다. 이 실시형태에서, 레플리콘은 바람직하게는 5'-캡을 포함한다. 특히, 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질이 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이고, 바람직하게는 레플리콘이 5'-캡을 포함하는 경우, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 레플리콘으로부터 효율적으로 번역될 수 있고, 이어서 얻어진 단백질은 레플리콘의 복제를 유도하고 서브게놈 전사체(들)의 합성을 유도할 수 있다. 이 실시형태는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 추가적인 핵산 분자가 사용되지 않거나 레플리콘과 함께 존재하지 않을 때 바람직할 수 있다. 이 실시형태에서, 레플리콘의 시스-복제를 목표로 한다.
제 1 오픈 리딩 프레임이 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 일 실시형태는 도 1에서 "시스레플리콘 △5ATG-RRS"으로 나타내고 있다. nsP1234를 코딩하는 핵산 서열의 번역 후, 번역 산물(nsP1234 또는 이의 단편(들))은 복제효소로 작용하여 RNA 합성, 즉, 레플리콘의 복제와 제 2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 서브게놈 전사체의 합성을 일으킬 수 있다(도 1에서의 "전이유전자").
트랜스-복제 시스템
제 2 양상에서, 본 발명은:
기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체,
트랜스로 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있는 본 발명의 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘을 포함하는 시스템을 제공한다.
제 2 양상에서, RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 2개의 핵산 분자를 포함하는 시스템을 제공한다: 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질(즉, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는)을 발현시키는 제 1 RNA 구조체; 및 제 2 RNA 분자인 RNA 레플리콘을 포함한다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현시키기 위한 RNA 구조체는 본 명세서에서 "기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현시키기 위한 RNA 구조체" 또는 "복제효소 구성체"와 동의어로 지칭한다.
기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 상기 정의된 바와 같으며 전형적으로 복제효소 구성체에 포함된 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 복제효소 구성체에 의해 코딩된 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 레플리콘을 복제할 수 있는 임의의 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질일 수 있다.
본 발명의 시스템이 세포, 바람직하게는 진핵세포로 도입될 때, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 번역될 수 있다. 번역 후, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 별도의 RNA 분자(RNA 레플리콘)를 트랜스로 복제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 RNA를 트랜스로 복제하기 위한 시스템을 제공한다. 결과적으로, 본 발명의 시스템은 트랜스-복제 시스템이다. 제 2 양상에 따르면, 레플리콘은 트랜스-레플리콘이다.
여기서, 트랜스(예를 들어, 트랜스-작용, 트랜스-조절과 관련하여)는 일반적으로 "상이한 분자로부터의 작용"(즉, 분자간)을 의미한다. 그것은 일반적으로 "동일한 분자에서 작용"(즉, 분자내)을 의미하는 시스(예를 들어 시스-작용, 시스-조절과 관련하여)의 반대말이다. RNA 합성(전사 및 RNA 복제 포함)과 관련하여, 트랜스-작용 요소는 RNA 합성이 가능한 효소(RNA 중합효소)를 코딩하는 유전자를 함유하는 핵산 서열을 포함한다. RNA 중합효소는 RNA 합성을 위한 주형으로서 제 2 핵산 분자, 즉 그것이 코딩되는 것 이외의 핵산 분자를 사용한다. RNA 중합효소 및 RNA 중합효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 서열 모두는 제 2 핵산 분자 상에서 "트랜스로 작용한다"고 지칭한다. 본 발명의 문맥 상에서, 트랜스-작용 RNA에 의해 코딩된 RNA 중합효소는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 RNA 레플리콘의 복제를 포함하여 RNA 레플리콘인 제 2 핵산 분자를 합성용 또는 RNA의 주형으로 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 복제효소에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 RNA 레플리콘은 본원에서 동의어로 "트랜스-레플리콘"으로 지칭된다.
본 발명의 시스템에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 역할은 서브게놈 프로모터가 레플리콘 상에 존재하는 경우 레플리콘을 증폭시키고 서브게놈 전사체를 제조하는 것이다. 레플리콘이 발현을 위한 목적 유전자를 코딩하는 경우, 목적 유전자의 발현 수준 및/또는 발현 지속 시간은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 수준을 변형시킴으로써 트랜스로 조절될 수 있다.
알파바이러스 복제효소가 일반적으로 주형 RNA를 인식하고 트랜스로 복제할 수 있다는 사실은 1980년대에 처음 발견되었지만 특히 트랜스-복제 RNA가 효율적으로 억제되는 것으로 여겨졌기 때문에 생의학적 응용에 대한 트랜스-복제의 잠재력은 인식되지 않았다: 감염된 세포에서 알파바이러스 게놈과 함께 복제되는 결손 간섭(DI) RNA의 경우에서 발견하였다(Barrett et al., 1984, J. Gen. Virol., vol. 65 (Pt 8), pp. 1273-1283; Lehtovaara et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, vol. 78, pp. 5353-5357; Pettersson, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, vol. 78, pp. 115-119). DI RNA는 높은 바이러스 부하가 있는 세포주의 감염 동안 유사-자연 발생할 수 있는 트랜스-레플리콘이다. DI 요소는 부모 바이러스의 병독성을 감소시켜 저해 기생 RNA(inhibitory parasitic RNA)로서 작용하기 때문에 효율적으로 동시 복제한다(Barrett et al., 1984, J. Gen. Virol., vol. 65 (Pt 11), pp. 1909-1920). 생의학적 응용에 대한 잠재력은 인정되지 않았지만 트랜스-복제의 현상은 동일 분자의 복제효소를 시스로 발현할 필요없이, 복제 메커니즘을 밝히기 위한 몇 가지 기본 연구에서 사용되었고; 또한, 복제효소 및 레플리콘의 분리는 각각의 돌연변이가 기능상실 돌연변이체임에도 불구하고 바이러스성 단백질의 돌연변이체를 포함하는 기능적 연구를 가능하게 한다(Lemm et al., 1994, EMBO J., vol. 13, pp. 2925-2934). 이러한 기능상실 연구와 DI RNA는 알파바이러스 요소를 기반으로 한 트랜스-활성화 시스템이 결국 치료 목적에 적합하게 될 것이라고 제안하지 않았다.
본 발명의 시스템은 적어도 2개의 핵산 분자를 포함한다. 따라서, 이는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있고, 바람직하게는 RNA 분자이다. 바람직한 일 실시형태에서, 시스템은 정확히 2개의 RNA 분자, 레플리콘 및 복제효소 구성체로 구성된다. 대안적인 바람직한 일 실시형태에서, 시스템은 둘 이상의 레플리콘을 포함하고, 각각은 바람직하게는 적어도 하나의 목적 단백질을 코딩하고, 또한 복제효소 구성체를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 복제효소 구성체에 의해 코딩된 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질은 각각의 레플리콘으로 작용하여 복제 및 서브게놈 전사체의 생산을 각각 유도할 수 있다. 예를 들어, 각각의 레플리콘은 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있다. 이는 여러 다른 항원에 대한 대상체의 백신접종이 필요한 경우 유리하다.
바람직하게는, 복제효소 구성체는 (+) 가닥 주형에 기반한 (-) 가닥 합성 및/또는 (-) 가닥 주형에 기반한 (+) 가닥 합성에 필요한 적어도 하나의 보존서열구성 (CSE)이 부족하다. 보다 바람직하게는, 복제효소 구성체는 어떠한 알파바이러스 보존서열구성 (CSE)도 포함하지 않는다. 특히, 알파바이러스의 4개 CSE(Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562; Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856)에서, 하기 CSE 중 임의의 하나 이상이 바람직하게는 복제효소 구성체 상에 존재하지 않는다: CSE 1; CSE 2; CSE 3; CSE 4. 특히 하나 이상의 임의의 알파바이러스 CSE가 없는 경우, 본 발명의 복제효소 구성체는 알파바이러스 게놈 RNA와 유사한 것보다 전형적인 진핵세포 mRNA와 매우 유사하다.
본 발명의 복제효소 구성체는 바람직하게는 자가 복제가 불가능하다는 점 및/또는 서브게놈 프로모터의 제어 하에서 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는다는 점에서 알파바이러스 게놈 RNA와 구별된다. 또한, 자가 복제가 불가능한 경우, 복제효소 구성체는 "자살 구성체(suicide construct)"라고도 불릴 수 있다.
트랜스 복제 시스템은 다음과 같은 이점이 있다:
우선, 첫째로, 트랜스-복제 시스템의 다능성은 레플리콘 및 복제효소 구성체가 상이한 시간 및/또는 상이한 부위에서 설계 및/또는 제조될 수 있게 한다. 일 실시형태에서, 복제효소 구성체는 제 1 시점에서 제조되고, 레플리콘은 추후 시점에서 제조된다. 예를 들어, 그 제조 후, 복제효소 구성체는 추후 시점에 사용하기 위해 저장될 수 있다. 본 발명은 시스-레플리콘에 비해 증가된 유연성을 제공한다: 새로운 병원균이 나타나면, 새로운 병원균에 대한 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 레플리콘으로 클로닝함으로써, 백신접종을 설계할 수 있다. 미리 준비된 복제효소 구성체는 보관실에서 회수할 수 있다. 따라서, 복제효소 구성체가 설계되고 제조될 때 특정 병원균 또는 특정 병원균의 항원(들)의 성질이 알려져 있을 필요는 없다. 결과적으로, 복제효소 구성체가 설계되고 제조될 때 새로운 특정 병원균에 대한 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드를 코딩하는 레플리콘이 이용 가능할 필요는 없다. 다시 말해, 복제효소 구성체는 임의의 특정 레플리콘과 독립적으로 설계되고 제조될 수 있다. 이것은 복제효소가 없는 레플리콘의 준비가 시스-레플리콘의 준비보다 적은 노력과 자원을 필요로 하기 때문에 새로운 병원균이나 적어도 하나의 새로운 항원의 발현을 특징으로 하는 병원균의 출현에 신속하게 반응 할 수 있게 한다. 병원균에 대한 신속한 반응을 가능하게 하는 시스템이 필요하다는 것이 이력에 기록되어 있다: 이는 예를 들어 최근 중증급성호흡기증후군(SARS), 에볼라 및 다양한 인플루엔자 바이러스 아형을 유발하는 병원균의 출현을 예시로 들 수 있다.
둘째로, 본 발명에 따른 트랜스-레플리콘은 전형적으로 전형적인 시스-레플리콘보다 짧은 핵산 분자이다. 이것은 목적 단백질, 예를 들어 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 레플리콘의 보다 빠른 클로닝을 가능하게 하고, 목적 단백질의 높은 수율을 제공한다.
본 발명의 시스템의 또 다른 이점은 핵 전사로부터의 독립성 및 전례없는 자유로운 설계를 제공하는 2개의 별개의 RNA 분자 상의 중요한 유전 정보의 존재를 포함한다. 서로 조합할 수 있는 다목적 요소를 고려하여, 본 발명은 원하는 수준의 RNA 증폭, 원하는 표적 유기체, 원하는 수준의 목적 단백질 생산 등에 대한 복제효소 발현을 최적화할 수 있게 한다. 본 발명에 따른 시스템은 시험관내 또는 생체내에서 휴지기 또는 세포 사이클기인 임의의 주어진 세포 유형에 대한 다양한 양 또는 비율의 레플리콘 및 복제효소 구성체를 공동-형질주입시킬 수 있다. 본 발명의 트랜스-복제 시스템은 숙주세포의 접종 및 숙주세포에서 목적 유전자의 발현에 적합하다(실시예 2, 3 및 5 참조).
본 발명에 따른 복제효소 구성체는 바람직하게는 단일가닥 RNA 분자이다. 본 발명에 따른 복제효소 구성체는 전형적으로 (+) 가닥 RNA 분자이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 복제효소 구성체는 분리된 핵산 분자이다.
본 발명에 따른 RNA 분자의 바람직한 특징
본 발명에 따른 RNA 분자는 임의로 추가적인 특징, 예를 들면, 5'-UTR, 3'-UTR, 폴리(A) 서열 및/또는 코돈 사용의 변형을 특징으로 할 수 있다. 자세한 내용은 하기에 설명한다.
캡
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 레플리콘은 5'-캡을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 복제효소 구성체는 5'-캡을 포함한다.
"5'-캡", "캡", "5'-캡 구조", "캡 구조"라는 용어는 일부 진핵세포의 1차 전사체, 예컨대 전구체 메신저 RNA의 5' 말단에서 발견되는 디뉴클레오타이드를 지칭하는 것으로 동의어로 사용된다. 5'-캡은 5' 트리포스페이트 결합(또는 특정 캡 유사체의 경우 변형된 트리포스페이트 결합)에서 5'을 통해 mRNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드에 (임의로 변형된) 구아노신이 결합된 구조이다. 용어는 종래의 캡 또는 캡 유사체를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 일부 특정 캡 디뉴클레오타이드 (캡 유사체 디뉴클레오타이드를 포함함)는 도 6에 도시되어 있다.
"5'-캡을 포함하는 RNA" 또는 "5'-캡이 제공된 RNA" 또는 "5'-캡으로 변형된 RNA" 또는 "캡핑된 RNA"는 5'-캡을 포함하는 RNA를 지칭한다. 예를 들어, RNA를 5'-캡과 함께 제공하는 것은 상기 5'-캡의 존재 하에 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥에 공동-전사적으로 혼입되거나, RNA는 예를 들어 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있으며, 5'-캡은 캡핑효소, 예를 들어 종두증 바이러스의 캡핑효소를 사용하여 전사 후 RNA에 부착될 수 있다. 캡핑된 RNA에서, (캡핑된) RNA 분자의 제 1 염기의 3' 위치는 인산디에스터 결합을 통해 RNA 분자의 후속 염기("제 2 염기")의 5' 위치에서 연결된다.
RNA 분자 상에 캡이 존재하는 것은 각 RNA를 숙주세포 또는 숙주 유기체에 도입한 후 초기 단계에서 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 번역이 요구되는 경우에 가장 바람직하다. 예를 들어, 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 캡의 존재는 RNA 레플리콘에 의해 코딩된 목적 유전자가 각각의 RNA를 숙주세포로 도입한 후 초기 단계에서 효율적으로 번역되도록 한다. "초기 단계"는 일반적으로 RNA 도입 후 처음 1시간 이내에, 또는 처음 2시간 이내에, 또는 처음 3시간 이내인 것을 의미한다.
또한, RNA 분자에 대한 캡의 존재는 기능적 복제효소의 부재 시 번역이 발생하거나 단지 적은 수준의 복제효소만이 숙주세포에 존재할 때 바람직하다. 예를 들어, 복제효소를 코딩하는 핵산 분자가 숙주세포에 도입되더라도, 도입 후 초기 단계에서 복제효소의 수준은 일반적으로 미미할 것이다.
본 발명에 따른 시스템에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체는 5'-캡을 포함하는 것이 바람직하다.
특히, 본 발명에 따른 RNA 레플리콘이 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 제 2 핵산 분자(예컨대 mRNA)와 함께 사용되지 않거나 제공되지 않는 경우, RNA 레플리콘은 5'-캡을 포함하는 것이 바람직하다. 독립적으로, RNA 레플리콘은 또한 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 제 2 핵산 분자와 함께 사용되거나 제공될 때에도 5'-캡을 포함할 수 있다.
"통상적인 5'-캡"이란 용어는 자연 발생적인 5'-캡을 지칭하고, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡을 지칭한다. 7-메틸구아노신 캡에서, 캡의 구아노신은 변형된 구아노신이며, 여기서 변형은 7-위치에서의 메틸화로 이루어진다(도 6 상단).
본 발명의 문맥 상에서, 용어 "5'-캡 유사체"는 통상적인 5'-캡과 유사한 분자 구조를 지칭하지만, 바람직하게는 생체내 및/또는 세포 내에서 부착된 경우 RNA를 안정화시키는 능력을 갖도록 변형된다. 캡 유사체는 통상적인 5'캡이 아니다.
진핵세포 mRNA의 경우, 5'-캡은 일반적으로 mRNA의 효율적인 번역에 관여하는 것으로 기술되어 왔다: 일반적으로 진핵세포에서 번역은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)가 존재하지 않는 한, 메신저 RNA(mRNA) 분자의 5' 말단에서만 개시된다. 진핵세포는 핵 내에서 전사 중에 5'-캡을 갖는 RNA를 제공할 수 있다: 예를 들어 전사체가 20 내지 30개의 뉴클레오타이드의 길이에 도달할 때, 새로 합성된 mRNA는 대체로 5'-캡 구조로 변형된다. 먼저, 5'-말단 뉴클레오타이드 pppN (ppp는 트리포스페이트를 나타내고; N은 임의의 뉴클레오사이드를 나타냄)은 RNA 5'-트리포스파타아제 및 구아닐릴 전이효소 활성을 갖는 캡핑효소에 의해 세포에서 5' GpppN으로 전환된다. 이어서, GpppN은 (구아닌-7)-메틸 전이효소 활성을 갖는 제 2 효소에 의해 세포에서 메틸화되어 모노-메틸화된 m7GpppN 캡을 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 5'-캡은 자연성 5'-캡이다.
본 발명에서, 자연성 5'-캡 디뉴클레오타이드는 전형적으로 비-메틸화 캡 디뉴클레오타이드 (G(5')ppp(5')N; GpppN이라고도 함) 및 메틸화된 캡 디뉴클레오타이드 ((m7G(5')ppp(5')N; m7GpppN이라고도 함)로 이루어진 군으로부터 선택된다. m7GpppN (여기서 N은 G이다)은 하기 식으로 나타내어진다:
Figure pct00001
본 발명의 캡핑된 RNA는 시험관내에서 제조될 수 있으므로, 숙주세포의 캡핑 장치에 의존하지 않는다. 시험관내에서 캡핑된 RNA를 형성하는데 가장 빈번하게 사용되는 방법은 모든 4개의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 캡 디뉴클레오타이드 예컨대 m7G(5')ppp(5')G (m7GpppG라고도 함)의 존재 하에 박테리아 또는 박테리오파지 RNA 중합효소로 DNA 주형을 전사하는 것이다. RNA 중합효소는 다음 주형 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (pppN)의 α-포스페이트에서 m7GpppG의 구아노신 부분의 3'-OH에 의한 친핵성 공격으로 전사를 개시하여 중간체 m7GpppGpN (여기서 N은 RNA 분자의 제 2염기이다)를 형성한다. 경쟁하는 GTP-개시된 생성물 pppGpN의 형성은 시험관내 전사 동안 캡 대 GTP의 몰비가 5 내지 10으로 설정함으로써 억제된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 5'-캡 (존재하는 경우)은 5'-캡 유사체이다. 이들 실시형태는 RNA가 시험관내 전사에 의해 수득되는 경우, 예를 들어 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)인 경우에 특히 적합하다. 캡 유사체는 초기에 시험관내 전사에 의해 RNA 전사체의 대규모 합성을 용이하게 하기 위해 기술하였다.
메신저 RNA의 경우, 일부 캡 유사체 (합성 캡)가 현재까지 일반적으로 기술되어 있으며, 이들은 모두 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 이상적으로, 보다 높은 번역 효율 및/또는 생체내 분해에 대한 증가된 내성 및/또는 시험관내 분해에 대한 증가된 내성과 관련된 캡 유사체가 선택된다.
바람직하게는, 오직 한 방향으로 RNA 사슬 내로 혼입될 수 있는 캡 유사체가 사용된다. 문헌[Pasquinelli et al. (1995, RNA J., vol., 1, pp. 957-967)]은 시험관내 전사 과정에서 박테리오파지 RNA 중합효소가 7-메틸구아노신 단위를 사용하여 전사를 개시함을 보여 주었고, 이로써 캡을 가진 전사체의 약 40-50%는 반대 방향으로 캡 디뉴클레오타이드를 갖는다 (즉, 초기 반응 생성물은 Gpppm7GpN이다). 정확한 캡을 갖는 RNA와 비교하여, 역방향의 캡을 갖는 RNA는 핵산 서열이 단백질로 번역되는 것과 관련하여 기능적이지 않다. 따라서, 캡을 정확한 방향, 즉 m7GpppGpN 등에 본질적으로 상응하는 구조를 갖는 RNA를 생성시키는 것이 바람직하다. 캡-디 뉴클레오타이드의 역 통합은 메틸화된 구아노신 단위의 2'- 또는 3'-OH기의 치환에 의해 개시되는 것을 보여준다 (Stepinski et al., 2001; RNA J., vol. 7, pp. 1486-1495; Peng et al., 2002; Org. Lett., vol. 24, pp. 161-164). 그러한 "항 역방향 캡 유사체"의 존재 하에서 합성된 RNA는 종래의 5'-캡 m7GpppG의 존재 하에 시험관내 전사된 RNA보다 효율적으로 번역된다. 이를 위해, 메틸화된 구아노신 단위의 3' OH기가 OCH3로 치환된 하나의 캡 유사체가 예를 들어 문헌[Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017]에 기재되어 있다 (7-메틸(3'-O-메틸)GpppG; 항-역방향 캡 유사체(ARCA)). ARCA는 본 발명에 따른 적합한 캡 디뉴클레오타이드이다.
Figure pct00002
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 RNA는 본질적으로 디캡핑(decapping)에 민감하지 않다. 이것은 일반적으로 배양된 포유류 세포에 도입된 합성 mRNA로부터 생산된 단백질의 양이 mRNA의 자연 분해에 의해 제한되기 때문에 중요한다. mRNA 분해를 위한 하나의 생체내 경로는 mRNA 캡의 제거로 시작된다. 이 제거는 조절 아단위(Dcp1) 및 촉매 아단위(Dcp2)를 함유하는 헤테로이량체 피로포스파타제에 의해 촉매된다. 촉매 아단위는 트리포스페이트 가교의 α와 β 포스페이트기 사이를 절단한다. 본 발명에서, 캡 유사체는 그 절단 유형에 민감하지 않거나 덜 민감한 것으로 선택되거나 존재할 수 있다. 이 목적을 위한 적합한 캡 유사체는 화학식 (I)에 따른 캡 디뉴클레오타이드로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00003
여기서 R1은 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 사이클로알킬, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴, 및 임의로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R2 및 R3은 독립적으로 H, 할로, OH 및 임의 치환된 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되거나, R2 및 R3은 함께 O-X-O를 형성하고, 여기서 X는 임의로 치환된 CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3), 및 C(CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R2는 R2가 부착된 고리의 4' 위치의 수소원자와 결합하여 -O-CH2- 또는 -CH2-O-를 형성하고,
R5는 S, Se, 및 BH3로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R4 및 R6은 독립적으로 O, S, Se, 및 BH3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
n은 1, 2, 또는 3이다.
R1, R2, R3, R4, R5, R6에 대한 바람직한 실시형태는 WO 2011/015347 A1에 개시되어 있으며 본 발명에 따라 적절하게 선택될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 RNA는 포스포로티오에이트-캡-유사체를 포함한다. 포스포로티오에이트-캡-유사체는 트리포스페이트 사슬에서 3개의 가교되지 않은 O 원자 중 하나가 S 원자로 치환된 특정 캡 유사체이고, 즉 화학식 (I)에서 R4, R5 또는 R6 중 하나는 S이다. 포스포로티오에이트-캡-유사체는 원치 않는 디캡핑 과정에 대한 해결과 같이, 문헌[J. Kowalska et al., 2008, RNA, vol. 14, pp. 1119-1131]에 기술되어 있으며, 따라서 생체내에서 RNA의 안정성을 증가시킨다. 특히, 5'-캡의 베타-포스페이트기에서의 황원자에 대한 산소원자의 치환은 Dcp2에 대한 안정화를 초래한다. 본 발명에서 바람직한 상기 실시형태에서, 화학식 (I)의 R5는 S이고; R4 및 R6은 O이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 RNA는 RNA 5'-캡의 포스포로티오에이트 변형이 "항-역방향 캡 유사체"(ARCA) 변형과 결합된 포스포로티오에이트-캡-유사체를 포함한다. 각각의 ARCA-포스포로티오에이트-캡-유사체는 WO 2008/157688 A2에 기술되어 있으며, 이들은 모두 본 발명의 RNA에서 사용될 수 있다. 상기 실시형태에서, 화학식 (I)의 R2 또는 R3 중 적어도 하나는 OH가 아니며, 바람직하게는 R2 및 R3 중 하나는 메톡시(OCH3)이고, R2 및 R3 중 다른 하나는 바람직하게는 OH이다. 바람직한 일 실시형태에서, 산소원자는 베타-포스페이트기의 황원자로 치환된다(화학식 (I)의 R5가 S이고, R4 및 R6이 O이다). ARCA의 포스포로티오에이트 변형은 α, β 및 γ 포스포로티오에이트기가 번역 및 디캡핑 기구에서 캡 결합 단백질의 활성 부위 내에 정확하게 위치하는 것을 보장한다고 여겨진다. 이들 유사체의 적어도 일부는 본질적으로 피로포스파타제 Dcp1/Dcp2에 내성을 갖는다. 포스포로티오에이트-변형된 ARCA는 포스포로티오에이트기가 없는 상응하는 ARCA보다 eIF4E가 훨씬 더 높은 친화도를 갖는 것으로 기술하였다.
본 발명에서 특히 바람직한 각각의 캡 유사체, 즉 m2' 7,2'-OGppspG는 베타-S-ARCA라고도 한다 (WO 2008/157688 A2; Kuhn et al., Gene Ther., 2010, vol. 17, pp. 961-971). 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 RNA는 베타-S-ARCA로 변형된다. 베타-S-ARCA는 하기 구조로 표시된다:
Figure pct00004
일반적으로, 가교성 포스페이트에서의 황원자에 대한 산소원자의 치환은 HPLC에서의 용출 패턴에 기초하여 D1 및 D2로 명명되는 포스포로티오에이트 부분입체이성질체를 초래한다. 간단히 말하면, 베타-S-ARCA의 D1 부분입체이성질체" 또는 "베타-S-ARCA(D1)"는 베타-S-ARCA의 D2 부분입체이성질체(베타-S-ARCA(D2))에 비해 HPLC 컬럼에서 먼저 용리되는 베타-S-ARCA의 부분입체이성질체이어서, 보다 짧은 체류 시간을 나타낸다. HPLC에 의한 입체화학적 배열의 결정은 WO 2011/015347 A1에 기술되어 있다.
본 발명의 첫 번째 특히 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 RNA는 베타-S-ARCA(D2) 부분입체이성질체로 변형된다. 베타-S-ARCA의 두 부분입체이성질체는 뉴클레아제에 대한 감수성이 다르다. 베타-S-ARCA의 D2 부분입체이성질체를 지닌 RNA는 Dcp2 절단에 거의 완전한 내성이 있는 것을 보여주는 반면에(변형되지 않은 ARCA 5'-캡의 존재 시 합성된 RNA와 비교하여 단지 6%의 절단), 베타-S-ARCA(D1) 5'-캡을 갖는 RNA는 Dcp2 절단에 대한 중간 감도를 나타낸다(71% 절단). 또한, Dcp2 절단에 대한 증가된 안정성은 포유류 세포에서의 단백질 발현 증가와 관련이있는 것으로 나타났다. 특히, 베타-S-ARCA(D2) 캡을 갖는 RNA는 베타-S-ARCA(D1) 캡을 갖는 RNA보다 포유류 세포에서 보다 효율적으로 번역되는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 RNA는 화학식 (I)에 따른 캡 유사체로 변형되고, 베타-S-ARCA의 D2 부분입체이성질체의 Pβ 원자에서와 상응하는 화학식 (I)에서 치환기 R5를 포함하는 P 원자에서 입체화학적 배열을 특징으로 한다. 상기 실시형태에서, 화학식 (I)의 R5는 S이고; R4 및 R6는 O이다. 또한, 화학식 (I)의 R2 또는 R3 중 적어도 하나는 바람직하게는 OH가 아니며, 바람직하게는 R2 및 R3 중 하나는 메톡시(OCH3)이고, R2 및 R3 중 다른 하나는 OH인 것이 바람직하다.
두 번째 특히 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 RNA는 베타-S-ARCA(D1) 부분입체이성질체로 변형된다. 이 실시형태는 백신접종 목적과 같이 미성숙 항원 제시 세포로의 캡핑된 RNA의 전달에 특히 적합하다. 미성숙 항원 제시 세포 내로 각각 캡핑된 RNA를 각각 전달할 때, 베타-S-ARCA(D1) 부분입체이성질체가 RNA의 안정성을 증가시키고 RNA의 번역 효율을 증가시키며 RNA의 번역을 연장시키고 RNA의 전체 단백질 발현을 증가시키고 및/또는 상기 RNA에 의해 코딩된 항원 또는 항원 펩티드에 대한 면역 반응을 증가시키는데 특히 적합함이 입증하였다(Kuhn et al., 2010, Gene Ther., vol. 17, pp. 961-971). 따라서, 본 발명의 다른 실시형태에서, 본 발명의 RNA는 화학식 (I)에 따른 캡 유사체로 변형되고, 베타-S-ARCA의 D1 부분입체이성질체의 Pβ 원자에 상응하는 화학식 (I)에서 치환기 R5를 포함하는 P 원자에서의 입체화학적 배열을 특징으로 한다. 각각의 캡 유사체 및 그의 실시형태는 WO 2011/015347 A1 및 문헌[Kuhn et al., 2010, Gene Ther., vol. 17, pp. 961-971]에 기재되어 있다. WO 2011/015347 A1에 기재된 임의의 캡 유사체가 본 발명에서 사용될 수 있고, 여기서 치환기 R5를 포함하는 P 원자에서의 입체화학적 배열이 베타 -S-ARCA의 D1 부분입체이성질체의 Pβ 원자에서의 것과 상응한다. 바람직하게는, 화학식 (I)에서 R5는 S이고; R4 및 R6는 O이다. 또한, 화학식 (I)의 R2 또는 R3 중 적어도 하나는 바람직하게는 OH가 아니며, 바람직하게는 R2 및 R3 중 하나는 메톡시(OCH3)이고, R2 및 R3 중 다른 하나는 OH인 것이 바람직하다.
일 실시형태에서, 본 발명의 RNA는 화학식 (I)에 따른 5'-캡 구조로 변형되고, 여기서 임의의 하나의 포스페이트기가 보라노포스페이트(boranophosphate)기 또는 포스포로셀레노에이트(phosphoroselenoate)기로 대체된다. 이러한 캡은 시험관내 및 생체내에서 안정성을 증가시켰다. 선택적으로, 각각의 화합물은 2'-O- 또는 3'-O-알킬기를 갖고(여기서, 알킬은 바람직하게는 메틸이다); 각각의 캡 유사체는 BH3-ARCA 또는 Se-ARCA로 불린다. mRNA의 캡핑에 특히 적합한 화합물은 WO 2009/149253 A2에 기술된 바와 같이 β-BH3-ARCA 및 β-Se-ARCA를 포함한다. 이들 화합물에 대하여, 베타-S-ARCA의 D1 부분입체이성질체의 Pβ 원자에서의 입체화학적 배열과 상응하는 화학식 (I)의 치환기 R5를 포함하는 P 원자에서의 입체화학적 배열이 바람직하다.
UTR
용어 "비번역 영역" 또는 "UTR"은 전사되지만 아미노산 서열로 번역되지 않는 DNA 분자 내의 영역에 관한 것이거나 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자 내의 상응하는 영역에 관한 것이다. 비번역 영역(UTR)은 오픈 리딩 프레임의 5'(상류)(5'-UTR) 및/또는 오픈 리딩 프레임의 3'(하류)(3'-UTR)에 존재할 수 있다.
3'-UTR은 존재하는 경우 단백질 코딩 영역의 종결 코돈의 하류에 유전자의 3'-말단에 위치하지만, 용어 "3'-UTR"은 바람직하게는 폴리(A) 꼬리를 포함하지 않는다. 따라서, 3'-UTR은 폴리(A) 꼬리의 상류, 예를 들어 폴리(A) 꼬리에 직접 인접하여 있다(존재한다면).
5'-UTR은 존재하는 경우 단백질 코딩 영역의 시작코돈의 상류에 유전자의 5' 말단에 위치한다. 5'-UTR은 5'-캡의 하류, 예를 들어 5'-캡 바로 옆에 있다(존재한다면).
본 발명에 따르면, 5'- 및/또는 3'-비번역 영역은 오픈 리딩 프레임과 기능적으로 연결될 수 있어서, 이들 영역이 오픈 리딩 프레임과 관련되어 안정성 및/또는 상기 오픈 리딩 프레임을 포함하는 RNA의 번역 효율이 증가된다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 복제효소 구성체는 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 복제효소 구성체는 이하를 포함한다:
(1) 5'-UTR,
(2) 오픈 리딩 프레임, 및
(3) 3'-UTR.
UTR은 RNA의 안정성 및 번역 효율에 관여한다. 특정 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)을 선택함으로써, 본원에 기재된 바와 같은 5'-캡 및/또는 3' 폴리(A)-꼬리에 관한 구조적 변형 이외에, 둘 모두 개선될 수 있다. UTR 내의 서열 요소는 일반적으로 번역 효율 (주로 5'-UTR) 및 RNA 안정성 (주로 3'-UTR)에 영향을 미치는 것으로 이해된다. 번역 효율 및/또는 복제효소 구성체의 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 5'-UTR이 존재하는 것이 바람직하다. 독립적으로 또는 부가적으로, 번역 효율 및/또는 복제효소 구성체의 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 3'-UTR이 존재하는 것이 바람직하다.
제 1 핵산 서열(예를 들어, UTR)과 관련하여 "번역 효율을 증가시키기 위한 활성" 및/또는 "안정성을 증가시키기 위한 활성"이란 용어는 상기 제 1 핵산 서열의 부재 하에 하기 번역 효율 및/또는 안정성이 하기 제 2 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성과 비교하여 증가되는 방식으로, 제 1 핵산 서열이 공통 전사체에서 제 2 핵산 서열, 상기 제 2 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 변형시킬 수 있음을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 복제효소 구성체는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질이 유래된 알파바이러스에 대해 이종 또는 고유하지 않은 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. 이것은 원하는 번역 효율 및 RNA 안정성에 따라 비번역 영역을 설계할 수 있게 한다. 따라서, 이종 또는 고유하지 않은 UTR은 고도의 유연성을 허용하며, 이러한 유연성은 자연성 알파바이러스 UTR에 비해 유리하다. 특히, 알파바이러스(자연성) RNA는 또한 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함하는 것으로 알려져 있지만, 알파바이러스 UTR은 이중 기능, 즉 (ⅰ) RNA 복제를 추진할 뿐만 아니라 (ⅱ) 번역을 추진한다. 알파바이러스 UTR은 번역에 비효율적이라고 보고되어 있지만 (Berben-Bloemheuvel et al., 1992, Eur. J. Biochem., vol. 208, pp. 581-587), 이들은 전형적으로 이들의 이중 기능 때문에 보다 효율적인 UTR로 대체할 수 없다. 그러나, 본 발명에서는 트랜스로 복제를 위한 복제효소 구성체에 포함된 5'-UTR 및/또는 3'-UTR은 RNA 복제에 대한 잠재적 영향과 무관하게 선택될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 복제효소 구성체는 바이러스 유래가 아니며; 특히 알파바이러스 유래가 아닌 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. 일 실시형태에서, 복제효소 구성체는 진핵세포 5'-UTR 유래의 5'-UTR 및/또는 진핵세포 3'UTR 유래의 3'UTR로부터 유래된 5'-UTR을 포함한다.
본 발명에 따른 5'-UTR은 선택적으로 링커에 의해 분리된 둘 이상의 핵산 서열의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 3'-UTR은 선택적으로 링커에 의해 분리된 하나 이상의 핵산 서열의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "링커"는 2개의 핵산 서열을 연결하기 위해 상기 2개의 핵산 서열 사이에 첨가된 핵산 서열에 관한 것이다. 링커 서열에 관한 특별한 제한은 없다.
3'-UTR은 전형적으로 길이가 200 내지 2000개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 500 내지 1500개의 뉴클레오타이드이다. 면역글로불린 mRNA의 3'-비번역 영역은 비교적 짧은 반면(약 300개 미만의 뉴클레오타이드), 다른 유전자의 3'-비번역 영역은 상대적으로 길다. 예를 들어, tPA의 3'-비번역 영역은 길이가 약 800개의 뉴클레오타이드이고, 인자 VIII의 길이는 약 1800개의 뉴클레오타이드이고, 에리스로포이에틴의 길이는 약 560개의 뉴클레오타이드이다. 포유류 mRNA의 3'-비번역 영역은 전형적으로 AAUAAA 헥사뉴클레오타이드 서열로서 공지된 상동성 영역을 갖는다. 이 서열은 아마도 폴리(A) 부착 신호이며, 종종 폴리(A) 부착 부위의 상류에 10 내지 30개의 염기에 위치한다. 3'-비번역 영역은 엑소리보뉴클레아제의 장벽으로 작용하거나 RNA 안정성을 증가시키는 것으로 알려진 단백질(예컨대 RNA-결합 단백질)과 상호작용하는 스템-루프 구조를 제공하기 위해 폴딩할 수 있는 하나 이상의 역반복을 포함할 수 있다.
인간 베타-글로빈 3'-UTR, 특히 인간 베타-글로빈 3'UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본은 높은 전사 안정성 및 번역 효율에 기여한다(Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017). 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 복제효소 구성체는 인간 베타-글로빈 3'-UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본을 포함한다. 따라서, 그것은 5'→3' 방향으로 (a) 선택적으로 5'-UTR; (b) 오픈 리딩 프레임; (c) 3'-UTR; 인간 베타-글로빈 3'-UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본, 이의 단편, 또는 인간 베타-글로빈 3'UTR의 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 상기 3'-UTR을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 복제효소 구성체는 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화하지만 인간 베타-글로빈 3'-UTR, 이의 단편, 또는 인간 베타-글로빈 3'-UTR의 변이체 또는 이의 단편이 아닌, 3'-UTR을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 복제효소 구성체는 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 5'-UTR을 포함한다.
본 발명에 따른 UTR-함유 복제효소 구성체는 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 이는 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 갖는 RNA의 전사를 허용하는 방식으로 주형 핵산 분자(예컨대 DNA)를 유전적으로 변형시킴으로써 달성될 수 있다.
도 1에 예시된 바와 같이, 또한 레플리콘은 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 특징으로 할 수 있다. 레플리콘의 UTR은 전형적으로 알파바이러스 UTR 또는 이의 변이체이다.
폴리(A) 서열
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 레플리콘은 3'-폴리(A) 서열을 포함한다. 레플리콘이 보존서열구성 4 (CSE 4)를 포함하는 경우, 레플리콘의 3'-폴리(A) 서열은 CSE 4의 하류에 존재하는 것이 가장 바람직하고, CSE 4에 직접 인접한 것이 가장 바람직하다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 복제효소 구성체는 3'-폴리(A) 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 일 실시형태에서, 폴리(A) 서열은 본질적으로 적어도 20, 바람직하게는 적어도 26, 바람직하게는 적어도 40, 바람직하게는 적어도 80, 바람직하게는 적어도 100개이고, 바람직하게는 500개 이하, 바람직하게는 400개 이하, 바람직하게는 300개 이하, 바람직하게는 200개 이하, 특히 150개 이하의 A 뉴클레오타이드이고, 특히 약 120개의 A 뉴클레오타이드로 구성되거나 포함한다. 본원에서 "본질적으로 구성된다"는 "폴리(A) 서열"에서 뉴클레오타이드 수에 따라 전형적으로 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%의 폴리(A) 서열에서의 대부분의 뉴클레오타이드가 A 뉴클레오타이드(아데닐레이트)이지만, 나머지 뉴클레오타이드는 A 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드, 예컨대 U 뉴클레오타이드 (유리딜레이트), G 뉴클레오타이드 (구아닐레이트), C 뉴클레오타이드 (시티딜레이트)인 것을 허용한다. 이 문맥에서 "로 구성된다"는 폴리(A) 서열에서의 모든 뉴클레오타이드, 즉 폴리(A) 서열에서의 뉴클레오타이드의 수에 따라 100%가 A 뉴클레오타이드인 것을 의미한다. 용어 "A 뉴클레오타이드" 또는 "A"는 아데닐레이트를 지칭한다.
사실, 약 120개의 A 뉴클레오타이드의 3' 폴리(A) 서열은 형질주입된 진핵세포의 RNA 수준뿐만 아니라 3' 폴리(A) 서열의 상류(5')에 존재하는 오픈 리딩 프레임으로부터 번역된 단백질의 수준에 유익한 영향을 미친다는 것이 입증하였다 (Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017).
알파바이러스에서, 적어도 11개의 연속 아데닐레이트 잔기, 또는 적어도 25개의 연속 아데닐레이트 잔기의 3' 폴리(A) 서열은 마이너스 가닥의 효율적인 합성에 중요하다고 생각된다. 특히, 알파바이러스에서, 적어도 25개의 연속 아데닐레이트 잔기의 3' 폴리(A) 서열은 보존서열구성 4 (CSE 4)와 함께 작용하여 (-) 가닥의 합성을 촉진하는 것으로 이해된다 (Hardy & Rice, J. Virol., 2005, vol. 79, pp. 4630-4639).
본 발명은 코딩 가닥에 상보적인 가닥에서 반복된 dT 뉴클레오타이드 (데옥시티미딜레이트)를 포함하는 DNA 주형에 기반하여, RNA 전사 동안, 즉 시험관내 전사된 RNA의 제조 중에 부착되는 3' 폴리(A) 서열을 제공한다. 폴리(A) 서열을 코딩하는 DNA 서열(코딩 가닥)은 폴리(A) 카세트로 지칭된다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, DNA의 코딩 가닥에 존재하는 3' 폴리(A) 카세트는 본질적으로 dA 뉴클레오타이드로 이루어지지만, 4개의 뉴클레오타이드(dA, dC, dG, dT)의 균등한 분포를 갖는 무작위 서열에 의해 중단된다. 이러한 무작위 서열은 길이가 5 내지 50개, 바람직하게는 10 내지 30개, 보다 바람직하게는 10 내지 20개일 수 있다. 이러한 카세트는 WO 2016/005004 A1에 개시되어 있다. WO 2016/005004 A1에 개시된 임의의 폴리(A) 카세트가 본 발명에서 사용될 수 있다. 본질적으로 dA 뉴클레오타이드로 이루어지지만, 4개의 뉴클레오타이드(dA, dC, dG, dT)의 균등한 분포를 갖고 길이가 예를 들어 예를 들어 5 내지 50개의 뉴클레오타이드인 무작위 서열에 의해 중단되는 폴리(A) 카세트는 DNA 수준에서 E.coli에서의 플라스미드 DNA의 일정한 증식을 나타내며, RNA 수준에서 RNA 안정성 및 번역 효율을 지지하는 것과 관련하여 유익한 특성과 여전히 연관되어 있다.
결과적으로, 본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 본원에 기술된 RNA 분자에 함유된 3' 폴리(A) 서열은 본질적으로 A 뉴클레오타이드로 구성되지만, 4개의 뉴클레오타이드(A, C, G, U)가 균등한 분포를 갖는 무작위 서열에 의해 중단된다. 이러한 무작위 서열은 길이가 5 내지 50개, 바람직하게는 10 내지 30개, 보다 바람직하게는 10 내지 20개일 수 있다.
코돈 사용법
일반적으로 유전 암호의 축퇴는 동일한 암호화 능력을 유지하면서 다른 코돈 (염기 삼중항)에 의해 RNA 서열에 존재하는 특정 코돈(아미노산을 코딩하는 염기 삼중항)을 대체할 수 있게 한다(코돈을 대체하는 것은 대체된 코돈과 동일한 아미노산을 암호화한다). 본 발명의 일부 실시형태에서, RNA 분자에 포함된 오픈 리딩 프레임의 적어도 하나의 코돈은 오픈 리딩 프레임이 유래한 종에서 각각의 오픈 리딩 프레임의 각각의 코돈과 상이하다. 이 실시형태에서, 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열은 "개조된" 또는 "개질된"것으로 언급된다. 레플리콘에 포함된 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열이 변형될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 복제효소 구성체에 포함된 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 대한 코딩 서열이 변형될 수 있다.
예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열이 변형되는 경우, 빈번하게 사용되는 코돈이 선택될 수 있다: WO 2009/024567 A1은 더욱 빈번하게 사용되는 희귀 코돈의 치환을 포함하여, 핵산 분자의 코딩 서열의 변형을 기술한다. 코돈 사용의 빈도는 숙주세포 또는 숙주 유기체에 따라 다르기 때문에, 그러한 유형의 변형은 특정 숙주세포 또는 숙주 유기체에서의 발현에 핵산 서열을 맞추는 것이 적합하다. 일반적으로 말하면, 보다 빈번하게 사용되는 코돈은 전형적으로 숙주세포 또는 숙주 유기체에서 보다 효율적으로 번역되지만, 오픈 리딩 프레임의 모든 코돈의 변형이 항상 필요한 것은 아니다.
예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열이 변형되는 경우, G (구아닐레이트) 잔기 및 C (시티딜레이트) 잔기의 함량은 각 아미노산에 대해 가장 풍부한 GC-함량을 갖는 코돈을 선택함으로써 변경될 수 있다. GC가 풍부한 오픈 리딩 프레임을 가진 RNA 분자는 면역 활성을 감소시키고 RNA의 번역 및 반감기를 향상시킬 가능성이 있다고 보고되어 있다 (Thess et al., 2015, Mol. Ther. 23, 1457-1465).
본 발명에 따른 레플리콘이 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩할 때, 알파바이러스 비구조성 단백질의 코딩 서열은 원하는 대로 변형될 수 있다. 이러한 자유로움은 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 레플리콘의 5' 복제인식서열과 중첩되지 않기 때문에 가능한 것이다.
본 발명의 실시형태의 안전적 특징
하기 특징은 본 발명에서 단독으로 또는 임의의 적합한 조합으로 바람직하다:
바람직하게는, 본 발명의 레플리콘 또는 시스템은 입자-형성체가 아니다. 이것은, 본 발명의 레플리콘 또는 시스템에 의해 숙주세포의 접종 후에, 숙주세포는 차세대 바이러스 입자와 같은 바이러스 입자를 생성하지 않는다는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 모든 RNA 분자에는 코어 뉴클레오캡시드 단백질 C, 외피 단백질 P62, 및/또는 외피 단백질 E1과 같은 임의의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 유전 정보가 전혀 없다. 본 발명의 이러한 양상은 구조적 단백질이 트랜스-복제 헬퍼 RNA에 대해 코딩되는 종래 기술 시스템에 비해 안전면에서 부가적 가치를 제공한다 (예를 들어 Bredenbeek et al., J. Virol, 1993, vol. 67, pp. 6439-6446).
바람직하게는, 본 발명의 시스템은 코어 뉴클레오캡시드 단백질 C, 외피 단백질 P62, 및/또는 외피 단백질 E1과 같은 임의의 알파바이러스 구조 단백질을 포함하지 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 시스템의 레플리콘 및 복제효소 구성체는 서로 동일하지 않다. 일 실시형태에서, 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하지 않는다. 일 실시형태에서, 복제효소 구성체는 (+) 가닥 주형에 기반한 (-) 가닥 합성 및/또는 (-) 가닥 주형에 기반한 (+) 가닥 합성을 위해 요구되는 적어도 하나의 서열 요소 (바람직하게는 적어도 하나의 CSE)가 부족하다. 일 실시형태에서, 복제효소 구성체는 CSE 1 및/또는 CSE 4를 포함하지 않는다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 레플리콘 또는 본 발명에 따른 복제효소 구성체는 알파바이러스 패키징 신호를 포함하지 않는다. 예를 들어, SFV의 nsP2의 코딩 영역에 포함된 알파바이러스 패키징 신호 (White et al. 1998, J. Virol., vol. 72, pp. 4320-4326)는 예를 들어, 결실 또는 돌연변이에 의해 제거될 수 있다. 알파바이러스 패키징 신호를 제거하는 적절한 방법은 nsP2의 코딩 영역의 코돈 사용법의 변형을 포함한다. 유전 암호의 축퇴는 코딩된 nsP2의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않으면서 패키징 신호의 기능을 제거하도록 허용할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 시스템은 분리된 시스템이다. 이 실시형태에서, 시스템은 포유류 세포 내부와 같은 세포 내부에 존재하지 않거나, 알파바이러스 구조 단백질을 포함하는 외피 내부와 같은 바이러스 캡시드 내부에 존재하지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 시스템은 시험관내에 존재한다.
DNA
제 3 양상에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA를 제공한다.
바람직하게는, DNA는 이중가닥이다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 제 3 양상에 따른 DNA는 플라스미드이다. 본원에서 사용된 용어 "플라스미드"는 일반적으로 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는 염색체외 유전 물질, 대체로 원형 DNA 듀플렉스의 구성체에 관한 것이다.
본 발명의 DNA는 DNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 인식될 수 있는 프로모터를 포함할 수 있다. 이것은 생체내 또는 시험관내에서 코딩된 RNA, 예를 들어 본 발명의 RNA의 전사를 허용한다. IVT 벡터는 시험관내 전사를 위한 주형으로 표준화된 방식을 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 바람직한 프로모터의 예로서는 SP6, T3 또는 T7 중합효소에 대한 프로모터이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 DNA는 분리된 핵산 분자이다.
RNA 제조 방법
본 발명의 시스템의 부분일 수 있거나 또는 아닌, 본 발명에 따른 임의의 RNA 분자는 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있다. 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)는 본 발명에서 특히 중요하다. IVT-RNA는 핵산 분자 (특히 DNA 분자)로부터의 전사에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 제 3 양상의 DNA 분자(들)는 이러한 목적에 적합한데, 특히 DNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 인식될 수 있는 프로모터를 포함하는 경우에 적합하다.
본 발명에 따른 RNA는 시험관내에서 합성될 수 있다. 이것은 시험관내 전사 반응에 캡-유사체를 추가하도록 할 수 있다. 전형적으로, 폴리(A) 꼬리는 DNA 주형상의 폴리-(dT) 서열에 의해 코딩된다. 대안적으로, 캡핑 및 폴리(A) 꼬리 첨가는 전사 후에 효소로 달성될 수 있다.
시험관내 전사 방법론은 당업자에게 공지되어 있는 것이다. 예를 들어, WO 2011/015347 A1에서 언급된 바와 같이, 다양한 시험관내 전사 키트가 상업적으로 이용 가능하다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘 또는 본 발명의 제 2 양상에 따른 시스템을 포함하는 키트를 제공한다.
일 실시형태에서, 키트의 구성은 별개의 실체로 존재한다. 예를 들어, 키트의 하나의 핵산 분자는 하나의 실체에 존재할 수 있고, 키트의 다른 핵산은 별도의 실체에 존재할 수 있다. 예를 들어, 개방형 용기 또는 밀폐형 용기가 적합한 실체이다. 밀폐된 용기가 바람직하다. 사용된 용기는 바람직하게는 RNase가 없거나 본질적으로 RNase가 없어야 한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 키트는 세포 접종용 및/또는 인간이나 동물 대상체에 투여용 RNA를 포함한다.
본 발명에 따른 키트는 임의로 라벨 또는 다른 형태의 정보 요소, 예를 들면, 전자 데이터 이동매체를 포함한다. 라벨 또는 정보 요소는 바람직하게는 취급설명서, 예를 들어, 인쇄된 서면 취급설명서 또는 임의로 인쇄 가능한 전자 양식으로 된 취급설명서를 포함한다. 취급설명서는 적합하고 가능한 적어도 하나의 키트 사용법을 지칭할 수 있다.
약학 조성물
본원에 기재된 복제효소 구성체 및/또는 레플리콘은 약학 조성물의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 제약상 허용 가능한 희석제 및/또는 제약상 허용 가능한 부형제 및/또는 제약상 허용 가능한 담체 및/또는 제약상 허용 가능한 운반체를 포함한다. 제약상 허용 가능한 담체, 운반체, 부형제 또는 희석제의 선택은 특별히 제한되지 않는다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 제약상 허용 가능한 담체, 운반체, 부형제 또는 희석제가 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 약학 조성물은 용매, 예컨대 수성 용매 또는 RNA의 무결성을 보존할 수 있게 하는 임의의 용매를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 약학 조성물은 RNA를 포함하는 수용액이다. 수용액은 선택적으로 용질, 예를 들면, 생리식염수를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 약학 조성물은 동결 건조된 조성물의 형태이다. 동결 건조된 조성물은 각각의 수성 조성물을 동결 건조시킴으로써 얻을 수 있다.
일 실시형태에서, 약학 조성물은 적어도 하나의 양이온성 실체를 포함한다. 일반적으로, 양이온성 지질, 양이온성 중합체 및 양전하를 갖는 다른 물질은 음으로 하전된 핵산과 복합체를 형성할 수 있다. 양이온성 화합물, 바람직하게는 양이온성 또는 폴리양이온성 펩티드 또는 단백질과 같은 폴리양이온성 화합물과의 복합체화에 의해 본 발명에 따른 RNA를 안정화시키는 것이 가능하다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 프로타민, 폴리에틸렌 이민, 폴리-L-리신, 폴리-L-아르기닌, 히스톤 또는 양이온성 지질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온성 분자를 포함한다.
본 발명에 따르면, 양이온성 지질은 양이온성 양친매성 분자, 예를 들어 하나 이상의 친수성 및 친유성 잔기를 포함하는 분자이다. 양이온성 지질은 모노양이온성 또는 폴리양이온성일 수 있다. 양이온성 지질은 전형적으로 스테롤, 아실 또는 디아실 사슬과 같은 친유성 잔기를 가지며, 전반적인 순 양전하를 갖는다. 지질의 헤드기는 일반적으로 양전하를 띠고 있다. 양이온성 지질은 바람직하게는 1 내지 10가의 양전하, 보다 바람직하게는 1 내지 3 가의 양전하, 및 더욱 바람직하게는 1가의 양전하를 갖는다. 양이온성 지질의 예로는 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA); 디메틸디옥타데실암모늄 (DDAB); 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (DODAP); 1,2-디아실옥시-3-디메틸암모늄 프로판s; 1,2-디알킬옥시-3-디메틸암모늄 프로판; 디옥타데실디메틸 암모늄 클로라이드 (DODAC), 1,2-디미리스토일옥시프로필-1,3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 (DMRIE), 및 2,3-디올레오일옥시-N-[2(스페르민 카복사미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나뮴 트리플루오로아세테이트 (DOSPA)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 양이온성 지질은 또한 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 (DLinDMA)을 포함하는 삼차 아민기를 갖는 지질을 포함한다. 양이온성 지질은 본원에 기재된 바와 같이, 리포좀, 에멀젼 및 리포플렉스와 같은 지질 제형에서 RNA를 제형화하는데 적합하다. 전형적으로 양전하는 적어도 하나의 양이온성 지질에 의해 기여되고 음전하는 RNA에 의해 기여된다. 일 실시형태에서, 약학 조성물은 양이온성 지질 이외에 적어도 하나의 헬퍼 지질을 포함한다. 헬퍼 지질은 중성 또는 음이온성 지질일 수 있다. 헬퍼 지질은 천연 지질, 예컨대 인지질, 또는 천연 지질의 유사체, 또는 천연 지질과 유사하지 않은 완전 합성 지질, 또는 지질 유사 분자일 수 있다. 약학 조성물이 양이온성 지질 및 헬퍼 지질을 모두 포함하는 경우, 양이온성 지질 대 중성 지질의 몰비는 제형의 안정성 등의 관점에서 적절하게 결정될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 프로타민을 포함한다. 본 발명에 따르면, 프로타민은 양이온 담체 제제로서 유용하다. 용어 "프로타민"은 아르기닌이 풍부하고 어류와 같은 동물의 정자 세포에서 체세포 히스톤 대신 DNA와 특히 관련이 있다고 발혀진 비교적 저분자량의 다양한 강염기성 단백질을 지칭한다. 특히, "프로타민"이라는 용어는 어류 정자에서 발견되는 단백질로, 강염기성이며 물에 용해되고 열로 응고되지 않으며 다수의 아르기닌 단량체를 포함하는 단백질을 지칭한다. 본 발명에 따르면, 본원에서 사용되는 "프로타민"이라는 용어는 천연 또는 생물학적 원천으로부터 수득되거나 유도된 임의의 프로타민 아미노산 서열을 포함하는 것으로, 상기 아미노산 서열 또는 이의 단편의 다합체 형태 및 이의 단편을 포함하는 것을 의미한다. 또한, 이 용어는 인공적이고 특정 목적을 위해 특별히 설계된 것으로, 천연 또는 생물학적 원천으부터 분리될 수 없는 (합성된) 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 면역계의 반응을 자극하기 위해 백신에 보조제를 첨가할 수 있고; 보조제는 일반적으로 자체 면역력을 제공하지 않는다. 예시적인 보조제로는 무기 화합물 (예를 들어 백반, 알루미늄 수산화물, 알루미늄 포스페이트, 칼슘 포스페이트 수산화물); 미네랄오일 (예를 들어 파라핀 오일), 사이토카인 (예를 들어 IL-1, IL-2, IL-12); 면역자극성 폴리뉴클레오타이드 (예컨대 RNA 또는 DNA; 예를 들어, CpG-함유 올리고뉴클레오타이드); 사포닌 (예를 들어 퀼라야, 대두, Polygala senega로부터의 식물 사포닌); 오일에멀젼 또는 리포좀; 폴리옥시 에틸렌 에테르 및 폴리옥시 에틸렌 에스터 제형; 폴리포스파젠 (PCPP); 무라밀 펩티드; 이미다조퀴놀론 화합물; 티오세미카바존 화합물; Flt3 리간드 (WO 2010/066418 A1); 또는 당업자에 의해 공지된 임의의 다른 보조제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 RNA 투여에 바람직한 보조제는 Flt3 리간드 (WO 2010/066418 A1)이다. Flt3 리간드가 항원을 코딩하는 RNA와 함께 투여될 때 항원 특이적 CD8+ T 세포가 강하게 증가되는 것을 관찰할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 완충될 수 있다(예를 들어, 아세트산염 완충액, 구연산염 완충액, 숙신산염 완충액, 트리스 완충액, 인산염 완충액으로 완충한다).
RNA-함유 입자
일부 실시형태에서, 비보호된 RNA의 불안정성 때문에, 본 발명의 RNA 분자를 복합체 형태 또는 캡슐화된 형태로 제공하는 것이 유리하다. 각각의 약학 조성물이 본 발명에 제공된다. 특히, 일부 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은 핵산-함유 입자, 바람직하게는 RNA-함유 입자를 포함한다. 각각의 약학 조성물은 미립자 제형으로 지칭된다. 본 발명에 따른 미립자 제형에서, 입자는 본 발명에 따른 핵산 및 핵산 전달에 적합한 제약상 허용 가능한 담체 또는 제약상 허용 가능한 운반체를 포함한다. 핵산-함유 입자는 예를 들어 단백성 입자 형태 또는 지질-함유 입자 형태일 수 있다. 적합한 단백질 또는 지질은 입자 형성 제제로 지칭된다. 단백성 입자 및 지질-함유 입자는 종래에 미립자 형태로 알파바이러스 RNA를 전달하기에 적합한 것으로 기술되어 있다 (예를 들어 Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562). 특히, 알파바이러스 구조 단백질 (예를 들어, 헬퍼 바이러스에 의해 제공된다)은 단백성 입자의 형태로 RNA를 전달하기 위한 적합한 담체이다.
본 발명에 따른 시스템이 미립자 제형으로 제형화되는 경우, 각 RNA 종 (예를 들어, 레플리콘, 복제효소 구성체, 및 IFN을 저해하기에 적합한 단백질을 코딩하는 RNA와 같은 임의의 부가적인 RNA 종)을 개별 미립자 제형으로서 별도로 제형화할 수 있다. 이 경우, 각각의 개별 미립자 제형은 하나의 RNA 종을 포함할 것이다. 개별 미립자 제형은 별개의 실체로서, 예를 들어 별도의 용기에서 존재할 수 있다. 이러한 제형은 각각의 RNA 종을 개별적으로 (전형적으로 각각 RNA 함유 용액의 형태로) 입자 형성 제제와 함께 제공하여, 입자의 형성을 가능하게 함으로써 수득할 수 있다. 각각의 입자는 입자가 형성될 때 제공되는 특정 RNA 종을 독점적으로 함유할 것이다 (개별 미립자 제형).
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 둘 이상의 개별적인 입자 제형을 포함한다. 각각의 약학 조성물은 혼합된 미립자 제형으로 지칭된다. 본 발명에 따른 혼합된 미립자 제형은 개별적인 미립자 제형을 혼합한 후에 상기한 바와 같이 개별 미립자 제형을 따로 따로 형성하여 얻을 수 있다. 혼합 단계에 의해, RNA-함유 입자가 혼합된 집단을 포함하는 하나의 제형이 수득 가능하다 (예컨대 입자의 제 1 집단은 본 발명에 따른 레플리콘을 함유할 수 있고, 입자의 제 2 제형은 본 발명에 따른 복제효소 구성체를 함유할 수 있다). 개별 미립자 집단은 개별 미립자 제형의 혼합된 집단을 포함한 하나의 용기 내에 함께 있을 수 있다.
대안적으로, 약학 조성물의 모든 RNA 종 (예를 들어, 레플리콘, 복제효소 구성체, 및 IFN을 저해하기에 적합한 단백질을 코딩하는 RNA와 같은 임의의 부가적인 종)이 조합된 미립자 제형으로서 함께 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 모든 RNA 종의 조합된 제형 (전형적으로 조합된 용액)를 입자-형성 제제와 함께 제공하여, 입자의 형성을 가능하게 함으로써 수득할 수 있다. 혼합된 미립자 제형과는 대조적으로, 조합된 미립자 제형은 전형적으로 둘 이상의 RNA 종을 포함하는 입자를 포함할 것이다. 조합된 미립자 조성물에서, 상이한 RNA 종이 전형적으로 단일 입자 내에 함께 존재한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 미립자 제형은 나노미립자 제형이다. 이 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 나노입자의 형태로 본 발명에 따른 핵산을 포함한다. 나노미립자 제형은 다양한 프로토콜과 다양한 복합 화합물로 얻을 수 있다. 지질, 중합체, 올리고머 또는 양친매체는 나노미립자 제형의 전형적인 성분이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "나노입자"는 일반적으로 직경이 1000 나노미터(nm) 이하인 핵산의 전신 투여, 특히 비경구 투여에 적합한 입자를 형성하는 직경을 갖는 임의의 입자를 지칭한다. 일 실시형태에서, 나노입자는 평균 직경이 약 50 nm 내지 약 1000 nm, 바람직하게는 약 50 nm 내지 약 400 nm, 바람직하게는 약 100 nm 내지 약 300 nm, 예컨대 약 150 nm 내지 약 200 nm의 범위를 갖는다. 일 실시형태에서, 나노입자는 직경이 약 200 내지 약 700 nm, 약 200 내지 약 600 nm, 바람직하게는 약 250 내지 약 550 nm, 특히 약 300 내지 약 500 nm 또는 약 200 내지 약 400 nm의 범위를 갖는다.
일 실시형태에서, 동적 광산란에 의해 측정된 바와 같이, 본원에 기재된 나노입자의 다분산지수(PI)는 0.5 이하, 바람직하게는 0.4 이하 또는 더더욱 바람직하게는 0.3 이하이다. "다분산지수"(PI)는 입자 혼합물에서 개별 입자 (예컨대 리포좀)의 균질 또는 불균질적 크기 분포를 측정한 것으로, 혼합물 내의 입자 분포의 폭을 나타낸다. PI는 예를 들어 WO 2013/143555 A1에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "나노미립자 제형" 또는 유사한 용어는 적어도 하나의 나노입자를 함유하는 임의의 미립자 제형를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 나노미립자 조성물은 나노입자의 균일한 집합체이다. 일부 실시형태에서, 나노미립자 조성물은 리포좀 제형과 같은 지질-함유 약학 제형 또는 에멀젼이다.
지질-함유 약학 조성물
일 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은 적어도 하나의 지질을 포함한다. 바람직하게는, 적어도 하나의 지질은 양이온성 지질이다. 상기 지질-함유 약학 조성물은 본 발명에 따른 핵산을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 소포, 예를 들어 리포좀에 캡슐화된 RNA를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 에멀젼의 형태로 RNA를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 양이온성 화합물과의 복합체 중에 RNA를 포함함으로써, 예를 들어, 소위 리포플렉스 또는 폴리플렉스를 형성한다. 리포좀과 같은 소포 내 RNA의 캡슐화는 예를 들어 지질/RNA 복합체와는 다르다. 예를 들어, 지질/RNA 복합체는 RNA가 예를 들어 미리 형성된 리포좀과 혼합된 경우에 수득된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 소포에 캡슐화된 RNA를 포함한다. 이러한 제형은 본 발명에 따른 특정 미립자 제형이다. 소포는 구형의 껍데기로 감싸진 지질 이중층으로, 작은 공간을 둘러싸고 그 공간을 소포 외부의 공간과 분리한다. 전형적으로, 소포 내의 공간은 수성 공간, 즉 물을 포함한다. 전형적으로, 소포 외부의 공간은 수성 공간, 즉 물을 포함한다. 지질 이중층은 하나 이상의 지질(소포-형성 지질)에 의해 형성된다. 소포를 둘러싸고 있는 막은 원형질막과 유사한 라멜라 형상이다. 본 발명에 따른 소포는 다중 라멜라 소포, 단일 라멜라 소포 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 소포 내에 캡슐화될 때, RNA는 전형적으로 임의의 외부 매질로부터 분리된다. 따라서 그것은 자연성 알파바이러스의 보호된 형태와 기능적으로 동등한 보호된 형태로 존재한다. 적합한 소포는 본원에 기재된 바와 같은 입자, 특히 나노입자이다.
예를 들어, RNA는 리포좀에 캡슐화될 수 있다. 이 실시형태에서, 약학 조성물은 리포좀 제형이거나 이를 포함한다. 리포좀 내의 캡슐화는 전형적으로 RNase 분해로부터 RNA를 보호할 것이다. 리포좀은 일부 외부 RNA를 포함할 수 있지만, RNA의 적어도 절반(이상적으로는 모두)은 리포좀의 코어 내에 캡슐화된다.
리포좀은 종종 인지질과 같은 소포-형성 지질의 하나 이상의 이중층을 가진 미세한 지질 소포이고 약물, 예를 들어 RNA를 캡슐화 할 수 있다. 본 발명의 문맥 상에서, 다중 라멜라 소포 (MLV), 소형 단일 라멜라 소포 (SUV), 대형 단일 라멜라 소포 (LUV), 입체적으로 안정화된 리포좀 (SSL), 다포체 소포 (MV) 및 대형 다포체 소포 (LMV)뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 이중층 형태를 포함하는 리포좀의 다른 유형을 채용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 리포좀의 크기 및 층상도는 제조 방법에 따라 달라질 것이다. 지질이 라멜라 형상, 육방정 및 역상 육방정 형상, 입방 형상, 미셀, 단층으로 구성된 역 미셀을 포함하는, 수성 매질에서 존재할 수 있는 다른 여러 형태의 초분자성 구성이 있다. 또한, 이들 형상들은 DNA 또는 RNA와의 조합으로 수득될 수 있으며, RNA 및 DNA와의 상호작용은 실질적으로 형상 상태에 영향을 줄 수 있다. 이러한 형상은 본 발명의 나노미립자 RNA 제형에 존재할 수 있다.
리포좀은 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 형성할 수 있다. 각각의 방법은 역 증발 방법, 에탄올 주입 방법, 탈수-재수화 방법, 초음파 처리 또는 다른 적절한 방법을 포함한다. 리포좀 형성 후, 실질적으로 균질한 크기 범위를 갖는 리포좀 집단을 얻도록 리포좀의 크기를 바꿀 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, RNA는 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함하는 리포좀에 존재한다. 각각의 리포좀은 적어도 하나의 양이온성 지질이 사용하는 경우, 단일 지질 또는 지질의 혼합물로부터 형성될 수 있다. 바람직한 양이온성 지질은 양성자화될 수 있는 질소 원자를 가지며; 바람직하게는, 이러한 양이온성 지질은 삼차 아민기를 갖는 지질이다. 삼차 아민기를 갖는 특히 적합한 지질은 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 (DLinDMA)이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 RNA는 WO 2012/006378 A1에 기술된 바와 같은 리포좀 제형으로 존재한다: RNA를 포함하는 수성 코어를 캡슐화하는 지질 이중층을 갖는 리포좀으로서, 지질 이중층은 pKa가 5.0 내지 7.6의 범위인 바람직하게는 삼차 아민기를 갖는 지질을 포함한다. 삼차 아민기를 갖는 바람직한 양이온성 지질은 DLinDMA (pKa 5.8)를 포함하고 일반적으로 WO 2012/031046 A2에 기술되어 있다. WO 2012/031046 A2에 따르면, 각각의 화합물을 포함하는 리포좀은 특히 RNA의 캡슐화에 적합하여 RNA의 리포좀 전달에 적합하다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 RNA는 리포좀 제형 내에 존재하며, 여기서 리포좀은 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함하며, 그 헤드기는 양성자화될 수 있는 적어도 하나의 질소원자(N)를 포함하며, 리포좀 및 RNA는 N:P 비율이 1:1 내지 20:1이다. 본 발명에 따르면, "N:P 비율"은 WO 2013/006825 A1에 기재된 바와 같이 지질-함유 입자 (예컨대 리포좀)에 포함된 RNA에서의 인원자(P)에 대한 양이온성 지질 중의 질소원자(N)의 몰비를 지칭한다. 1:1과 20:1 사이의 N:P 비율은 리포좀의 순 전하와 척추 세포로의 RNA 전달 효율에 연관됨을 시사하는 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 RNA는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 부분을 포함하는 적어도 하나의 지질을 포함하는 리포좀 제형에 존재하며, 여기서 WO 2012/031043 A1 및 WO 2013/033563 A1에 기술된 바와 같이, RNA가 PEG화된 리포좀 내에 캡슐화되어 PEG 부분이 리포좀의 외부에 존재한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 RNA는 리포좀 제형 내에 존재하고, WO 2012/030901 A1에 기재된 바와 같이 리포좀은 직경이 60-180 nm 범위를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 RNA는 리포좀 제형 내에 존재하고, WO 2013/143555 A1에 개시된 바와 같이, RNA-함유 리포좀이 0 또는 음성에 가까운 순 전하를 갖는다.
다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 RNA는 에멀젼의 형태로 존재한다. 에멀젼은 종래에 RNA 분자와 같은 핵산 분자를 세포에 전달하는 데 사용되는 것으로 기재되어 있다. 본 발명에서 바람직한 것은 수중유형 에멀젼이다. 각각의 에멀젼 입자는 오일 코어 및 양이온성 지질을 포함한다. 보다 바람직한 것은 본 발명에 따른 RNA가 에멀젼 입자와 복합체화된 양이온성 수중유형 에멀젼이다. 에멀젼 입자는 오일 코어 및 양이온성 지질을 포함한다. 양이온성 지질은 음으로 하전된 RNA와 상호작용하여 에멀젼 입자에 RNA를 고정시킨다. 수중유형 에멀젼에서, 에멀젼 입자는 수성 연속 상에 분산된다. 예를 들어, 에멀젼 입자의 평균 직경은 전형적으로 약 80 nm 내지 180 nm일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은 양이온성 수중유형 에멀젼이고, 여기서 에멀젼 입자는 WO 2012/006380 A2에 기술된 바와 같이 오일 코어 및 양이온성 지질을 포함한다. 본 발명에 따른 RNA는 양이온성 지질을 포함하는 에멀젼의 형태로 존재할 수 있고, 에멀젼의 N:P 비율이 WO 2013/006834 A1에 기술된 바와 같이 적어도 4:1이다. 본 발명에 따른 RNA는 WO 2013/006837 A1에 기재된 바와 같이 양이온성 지질 에멀젼의 형태로 존재할 수 있다. 특히, 조성물은 양이온성 수중유형 에멀젼의 입자와 복합체화된 RNA를 포함할 수 있으며, 여기서 오일/지질의 비율은 적어도 약 8:1 (몰:몰)이다.
다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 리포플렉스의 형태로 RNA를 포함한다. "리포플렉스" 또는 "RNA 리포플렉스"라는 용어는 지질 및 RNA와 같은 핵산의 복합체를 지칭한다. 리포플렉스는 양이온성 (양성 하전된) 리포좀과 음이온성 (음성 하전된) 핵산으로 형성될 수 있다. 양이온성 리포좀은 또한 중성 "헬퍼" 지질을 포함할 수 있다. 가장 간단한 경우에, 리포플렉스는 핵산을 특정 혼합 프로토콜로 리포좀과 혼합함으로써 자발적으로 형성되지만, 다양한 다른 프로토콜이 적용될 수 있다. 양성 하전된 리포좀과 음성 하전된 핵산 사이의 정전기적 상호작용이 리포플렉스 형성의 원동력임을 이해할 수 있다 (WO 2013/143555 A1). 본 발명의 일 실시형태에서, RNA 리포플렉스 입자의 순 전하는 0에 가깝거나 음성이다. RNA 및 리포좀의 전기적-중성 또는 음성 하전된 리포플렉스는 전신 투여 후 비장 수지상세포(DC)에서 실질적인 RNA 발현을 유도하고 양성 하전된 리포좀 및 리포플렉스에 대해 보고된 증가된 독성과 관련이없는 것으로 알려져있다(WO 2013/143555 A1 참고). 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 나노입자, 바람직하게는 리포플렉스 나노입자의 형태로 RNA를 포함하며, 여기서 (i) 나노입자 내의 양전하의 수가 나노입자 내의 음전하의 수를 초과하지 않고 및/또는 (ii) 나노입자가 중성 또는 순 음전하를 띠며, 및/또는 (iii) 나노입자에서 음전하에 대한 양전하의 전하 비율이 1.4:1 이하이며, 및/또는 (iv) 나노입자의 제타전위는 0 이하이다. WO 2013/143555 A1에 기재된 바와 같이, 제타전위는 콜로이드성 시스템에서 전기역학적 전위에 대한 과학 용어이다. 본 발명에서, (a) 제타전위 및 (b) 나노입자 내의 RNA에 대한 양이온성 지질의 전하 비율은 모두 WO 2013/143555 A1에 개시된 바와 같이 계산될 수 있다. 요약하면, WO 2013/143555 A1에 개시된 바와 같이, 입자의 순 전하가 0 또는 음에 가깝거나 음성인, 정의된 입자 크기를 갖는 나노미립자 리포플렉스 제형인 약학 조성물은 본 발명과 관련하여 바람직한 약학 조성물이다.
단백질 생산 방법
제 4 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있으며, 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 추가로 포함하는, 본 발명의 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘을 수득하는 단계, 및
(b) RNA 레플리콘을 세포 내에 접종하는 단계.
상기 방법의 다양한 실시형태에서, RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 및 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있는 한, RNA 레플리콘은 본 발명의 RNA 레플리콘에 대해 상기 정의된 바와 같다.
제 5 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체를 수득하는 단계,
(b) (a)에 따른 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 트랜스로 복제될 수 있고 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 본 발명의 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘을 수득하는 단계, 및
(c) 기능성 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체 및 RNA 레플리콘을 세포 내로 함께 접종하는 단계.
상기 방법의 다양한 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체 및/또는 RNA 레플리콘은 RNA 레플리콘이 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 트랜스로 복제될 수 있고 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 한, 본 발명의 시스템에 대해 상기 정의된 바와 같다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체 및 the RNA 레플리콘은 동일한 시점에 접종될 수 있거나 대안적으로 다른 시점에 접종될 수 있다. 두 번째 경우에, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체는 전형적으로 제 1 시점에 접종되고, 레플리콘은 전형적으로 차후 제 2 시점에 접종된다. 이 경우, 복제효소가 세포에서 이미 합성될 것이기 때문에 레플리콘은 즉시 복제될 것으로 예상된다. 제 2 시점은 전형적으로 제 1 시점 직후, 예를 들어 제 1시점 이후 1분 내지 24시간 후이다.
하나 이상의 핵 분자가 접종될 수 있는 세포는 "숙주세포"라고 지칭할 수 있다. 본 발명에 따라, 용어 "숙주세포"는 외인성 핵산 분자로 형질전환되거나 형질주입될 수 있는 임의의 세포를 말한다. "세포"라는 용어는 바람직하게는 무손상 세포, 즉 효소, 세포소기관 또는 유전 물질과 같은 정상적인 세포내 성분을 방출하지 않은 무손상 막을 갖는 세포이다. 무손상 세포는 바람직하게는 생존 가능한 세포, 즉 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포이다. 본 발명에 따르면, "숙주세포"란 용어는 원핵세포(예를 들면, E.coli) 또는 진핵세포(예를 들어 인간 및 동물 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 곤충 세포)를 포함한다. 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 말, 소, 양 및 염소를 비롯한 가축뿐만 아니라 영장류로부터의 세포와 같은 포유류 세포가 특히 바람직하다. 세포는 다수의 조직 유형으로부터 유도될 수 있고, 일차 세포 및 세포주를 포함할 수 있다. 특정 예로서는 각질, 말초 혈액성 백혈구, 골수 줄기세포 및 배아 줄기세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 숙주세포는 항원 제시 세포, 특히 수지상세포, 단핵구 또는 대식세포이다. 핵산은 단일 또는 수개의 사본으로 숙주세포에 존재할 수 있으며, 일 실시형태에서는 숙주세포에서 발현된다.
세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 원핵세포는 예를 들어 본 발명에 따른 DNA의 증식을 위해 본원에 적합하고, 진핵세포는 예를 들어 레플리콘의 오픈 리딩 프레임의 발현을 위해 본원에 적합하다.
본 발명의 방법에서, 본 발명에 따른 시스템, 또는 본 발명에 따른 키트, 또는 본 발명에 따른 약학 조성물 중 임의의 것이 사용될 수 있다. RNA는 약학 조성물의 형태로, 또는 예를 들어 전기천공법에 의해 네이키드된 RNA로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 숙주세포에서 목적 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있다(실시예 2 내지 5 참조).
일 실시형태에서, 부가적인 RNA 분자, 바람직하게는 mRNA 분자가 세포에 접종될 수 있다. 선택적으로, 부가적인 RNA 분자는 본원에 기재된 바와 같이 E3와 같은 IFN을 저해하기에 적합한 단백질을 코딩한다. 선택적으로, 부가적인 RNA 분자는 본 발명에 따른 레플리콘 또는 복제효소 구성체 또는 시스템의 접종 전에 접종될 수 있다.
본 발명에 따른 세포에서 단백질을 생산하는 방법에 있어서, 상기 세포는 항원 제시 세포일 수 있으며, 상기 방법은 항원을 코딩하는 RNA를 발현시키는데 사용될 수 있다. 이를 위해, 본 발명은 수지상세포와 같은 항원 제시 세포 내에 항원을 코딩하는 RNA를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 수지상세포와 같은 항원 제시 세포의 형질주입을 위해, 항원을 코딩하는 RNA를 포함하는 약학 조성물을 사용할 수 있다.
일 실시형태에서, 세포에서 단백질을 생산하는 방법은 시험관내 방법이다. 일 실시형태에서, 세포에서 단백질을 생산하는 방법은 수술 또는 치료에 의해 인간 또는 동물 대상체로부터 세포를 제거하는 것을 포함하지 않는다.
이 실시형태에서, 본 발명의 제 4 양상에 따라 접종된 세포는 대상체에서 단백질을 생성시키고 대상체에게 단백질을 제공하도록 대상체에게 투여될 수 있다. 세포는 대상체에 대해 자가, 동계, 동종이계 또는 이종일 수 있다.
다른 실시형태에서, 세포에서 단백질을 생산하는 방법에서의 그 세포는 환자와 같은 대상체에 존재할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 세포에서 단백질을 생산하는 방법은 대상체에 RNA 분자를 투여하는 것을 포함하는 생체내 방법이다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한 이하 단계를 포함하는, 대상체에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있으며 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 추가로 포함하는, 본 발명의 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘을 수득하는 단계, 및
(b) 대상체에 RNA 레플리콘을 투여하는 단계.
상기 방법의 다양한 실시형태에서, RNA 레플리콘은 RNA 레플리콘이 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 및 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있는 한, 본 발명의 RNA 레플리콘에 대해 상기 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 이하 단계를 포함하는, 대상체에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체를 수득하는 단계,
(b) (a)에 따른 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 트랜스로 복제될 수 있고 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는, 본 발명의 제 1 양상에 따른 RNA 레플리콘을 수득하는 단계, 및
(c) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체 및 RNA 레플리콘을 대상체에 투여하는 단계.
상기 방법의 다양한 실시형태에서, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체 및/또는 RNA 레플리콘은 RNA 레플리콘이 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 트랜스로 복제될 수 있으며 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 한, 본 발명의 시스템에 대해 상기 정의된 바와 같다. 구조 단백질을 포함하고, 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체 및 the RNA 레플리콘은 동일한 시점에서 투여될 수 있거나 대안적으로 다른 시점에서 투여될 수 있다. 두 번째 경우에, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체는 전형적으로 제 1 시점에서 투여되고, RNA 레플리콘은 전형적으로 차후 제 2 시점에 투여된다. 이 경우, 복제효소가 세포에서 이미 합성될 때문에 레플리콘은 즉시 복제될 것으로 예상된다. 제 2 시점은 전형적으로 제 1 시점 직후, 예를 들어 제 1시점 이후 1분 내지 24시간 후이다. 바람직하게는 RNA 레플리콘 및 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체를 동일한 표적 조직 또는 세포에 도달할 가망을 증가시키기 위해, RNA 레플리콘의 투여는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체의 투여와 동일한 부위에서 동일한 투여 경로를 통해 수행한다. "부위"는 대상체의 신체의 위치를 지칭한다. 적당한 부위는 예를 들면, 왼팔, 오른팔 등이다.
일 실시형태에서, 부가적인 RNA 분자, 바람직하게는 mRNA 분자가 대상체에게 투여될 수 있다. 선택적으로, 부가적인 RNA 분자는 본원에 기재된 바와 같이 E3와 같은 IFN을 저해하기에 적합한 단백질을 코딩한다. 선택적으로, 부가적인 RNA 분자는 본 발명에 따른 레플리콘 또는 복제효소 구성체 또는 시스템의 투여 전에 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 레플리콘, 본 발명에 따른 시스템, 또는 본 발명에 따른 키트, 또는 본 발명에 따른 약학 조성물 중 임의의 것이 본 발명에 따른 대상체에서 단백질을 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서, RNA는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물의 형태로, 또는 네이키드된 RNA로서 사용될 수 있다.
대상체에게 투여될 수 있는 용량의 관점에서, 본 발명에 따른 RNA 레플리콘, 본 발명에 따른 시스템, 또는 본 발명에 따른 키트, 또는 본 발명에 따른 약학 조성물 각각은 "의약품" 또는 이와 유사한 것으로 지칭될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 RNA 레플리콘, 시스템, 키트 및 약학 조성물이 의약품의 용도로 제공할 것이라 예견한다. 의약품은 대상체를 치료하는 데 사용할 수 있다. "치료"에 대해서는 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물 또는 다른 실체를 대상체에게 투여하는 것을 의미한다. 이 용어는 치료법에 의한 인간 또는 동물의 신체를 치료하는 방법을 포함한다.
상술한 의약품은 전형적으로 DNA를 포함하지 않으며, 따라서 종래 기술에 기재된 DNA 백신과 비교하여 부가적인 안전적 특징과 관련된다(예를 들어, WO 2008/119827 A1).
본 발명에 따른 또 다른 의학적 용도는 본 발명의 제 4 양상에 따른 세포에서 단백질을 생산하는 방법을 포함하며, 상기 세포는 수지상세포와 같은 항원 제시 세포일 수 있고, 이어서 상기 세포를 대상체에 도입한다. 예를 들어, 항원과 같은 약학적 활성 단백질을 코딩하는 RNA는 생체외에서 항원 제시 세포, 예를 들어 대상체로부터 수득된 항원 제시 세포 내에 도입(형질주입)시킬 수 있고, 선택적으로 생체외에서 클론 증식된 항원 제시 세포를 동일한 또는 다른 대상체에 재도입시킬 수 있다. 형질주입된 세포는 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 대상체에 재도입시킬 수 있다.
본 발명에 따른 의약품은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 의약품은 대상체의 예방뿐만 아니라 치료 방법에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 의약품은 유효량으로 투여된다. "유효량"은 반응을 일으키거나 원하는 효과를 일으키기 위해 단독으로 또는 다른 투여와 함께 충분한 양을 의미한다. 대상체의 특정 질병 또는 특정 상태를 치료하는 경우, 원하는 효과는 질병 진행의 억제이다. 여기에는 질병 진행의 감속, 특히 질병 진행의 중단이 포함된다. 또한, 질병 또는 상태의 치료에서 원하는 효과는 질병 발병의 지연 또는 질병 발병의 억제일 수 있다.
유효량은 치료되는 상태, 질병의 중증도, 나이, 생리 조건, 사이즈 및 체중을 포함하는 환자의 개별 매개변수, 치료 기간, 동반 요법의 유형(있는 경우), 특정 투여 방식 및 기타 요인에 따라 달라질 수 있을 것이다.
백신접종
용어 "면역조치" 또는 "백신접종"은 일반적으로 치료적 또는 예방적 이유로 대상체를 치료하는 방법을 지칭한다. 치료, 특히 예방적 처치는 바람직하게는 예를 들어 하나 이상의 항원에 대해 대상체의 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 것을 목표로 하는 처치이거나 이를 포함한다. 본 발명에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 RNA를 사용함으로써 면역 반응을 유도하거나 증진시키는 것이 바람직하다면, 면역 반응은 RNA에 의해 촉발되거나 강화될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 바람직하게는 대상체의 백신접종인 것이거나 이를 포함하는 예방적 처치를 제공한다.
레플리콘이 면역학적 활성 화합물 또는 항원인 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 목적 단백질로서 코딩하는 본 발명의 일 실시형태가 백신접종에 특히 유용하다.
RNA는 병원균이나 암을 포함한 외래 물질에 대한 백신접종에 대해 종래에 기술되어 왔다 (문헌[Ulmer et al., 2012, Vaccine, vol. 30, pp. 4414-4418]에서 최근 확인하였다). 종래 기술의 통상적인 접근법과는 대조적으로, 본 발명에 따른 레플리콘은 본원에 기술된 바와 같은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있는 능력 때문에 효율적인 백신접종에 특히 적합한 요소이다. 본 발명에 따른 백신접종은 예를 들면 약한 면역원성 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 RNA 백신의 경우, 단백질 항원은 결코 혈청 항체에 노출되지 않지만, RNA의 번역 후 형질주입된 세포 자체에 의해 생성된다. 그러므로 아나필락시스는 문제가 되어서는 안된다. 따라서, 본 발명은 알레르기 반응의 위험 없이 환자의 반복된 면역조치를 허용한다.
본 발명에 따른 백신접종을 포함하는 방법에서, 본 발명의 의약품은 특히 항원을 포함하는 질환을 갖거나 항원을 포함하는 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 것을 원하는 경우, 대상체에 투여된다.
본 발명에 따른 백신접종을 포함하는 방법에서, 본 발명에 따른 레플리콘에 의해 코딩된 목적 단백질은 예를 들어, 면역 반응이 유도되는 박테리아 항원 또는 면역 반응이 유도되는 바이러스 항원, 또는 면역 반응이 유도되는 암 항원 또는 면역 반응이 유도되는 단세포 생물의 항원에 대해 암호화한다. 백신접종의 효능은 유기체로부터의 항원-특이적 IgG 항체의 측정과 같은 공지된 표준 방법에 의해 평가될 수 있다. 본 발명에 따른 알러젠 특이적 면역요법을 포함하는 방법에서, 본 발명에 따른 레플리콘에 의해 코딩된 목적 단백질은 알레르기 관련 항원을 암호화한다. 알러젠-특이 면역요법 (탈감작요법으로도 알려짐)은 바람직하게는 원인 알러젠에 대한 후속 노출과 관련된 증상이 경감되는 상태를 달성하기 위해, 알러젠 백신의 증가된 투여량을 하나 이상의 알레르기를 가진 유기체에 투여하는 것으로 정의된다. 알러젠 특이적 면역요법의 효능은 유기체로부터 알러젠 특이적 IgG 및 IgE 항체의 측정과 같은 공지된 표준 방법으로 평가할 수 있다.
본 발명의 의약품은 예를 들어 대상체의 백신접종을 포함한 대상체의 치료를 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
용어 "대상체"는 척추 동물, 특히 포유류와 관련이 있다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서 포유류는 인간, 비인간 영장류, 가축 포유류, 예컨대 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등, 실험용 동물, 예컨대 마우스, 랫, 토끼, 기니아 피그 등뿐만 아니라, 감금된 동물, 예컨대 동물원의 동물이다. "대상체"라는 용어는 또한 조류 (특히 닭, 오리, 거위, 칠면조와 같은 가축화된 조류)와 같은 비포유류 척추동물 및 어류 (특히 연어나 메기와 같은 양식 어류)와 관련이 있다. 본원에서 사용된 용어 "동물"은 인간도 포함한다.
가축화된 동물, 예컨대 개, 고양이, 토끼, 기니피그, 햄스터, 양, 소, 염소, 돼지, 말, 닭, 오리, 거위, 칠면조 또는 야생 동물, 예를 들어 여우에 투여가 일부 실시형태에서는 바람직하다. 예를 들어, 본 발명에 따른 예방적 백신접종은 동물 집단, 예를 들어 농업에서, 또는 야생 동물 집단에 백신접종하기에 적합할 수 있다. 감금된 다른 동물 집단, 예컨대 애완동물, 또는 동물원 동물이 백신접종을 받을 수 있다.
대상체에게 투여될 때, 의약품으로서 사용되는 레플리콘 및/또는 복제효소 구성체는 바람직하게는 치료된 대상체가 속하는 종이나 속에 감염성 있는 알파바이러스 유형의 서열을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 이 경우에, 레플리콘 및/또는 복제효소 구성체는 각각의 종 또는 속을 감염시킬 수 있는 알파바이러스로부터의 어떠한 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다. 이 실시형태는 RNA가 투여되는 대상체가 감염성 알파바이러스에 의해 (예를 들어 우연히) 영향을 받더라도, 감염성 (예를 들어, 완전 기능성 또는 야생형) 알파바이러스와의 재조합이 가능하지 않다는 이점을 갖는다. 일례로서, 돼지의 치료를 위해, 사용된 레플리콘 및/또는 복제효소 구성체는 돼지를 감염시킬 수 있는 알파바이러스로부터의 어떠한 뉴클레오타이드 서열도 포함하지 않는다.
투여 모드
본 발명에 따른 의약품은 임의의 적합한 경로로 대상체에 적용될 수 있다.
예를 들면, 의약품은 전신적으로, 예를 들면 정맥내 (i.v.), 피하 (s.c.), 피내 (i.d.) 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 의약품은 근조직, 예컨대 골격근 또는 피부, 예를 들어 피하에 투여된다. 피하다. 일반적으로 피부 또는 근육 내로 RNA 전달은 체액성 및 세포성 면역 반응의 강한 유도와 병행하여 높고 지속적인 국소 발현을 유도한다는 것을 일반적으로 이해하고 있다 (Johansson et al. 2012, PLoS. One., 7, e29732; Geall et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, vol. 109, pp. 14604-14609).
근육 조직 또는 피부에 대한 투여의 대안은 피내, 비강내, 안구내, 복강내, 정맥내, 간질성, 구강, 경피, 또는 설하 투여를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 피내 및 근육내 투여가 선호되는 2가지 경로이다.
투여는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 의약품은 주사에 의해 투여된다. 바람직한 일 실시형태에서, 주사는 바늘을 통해 이루어진다. 무침 주사는 인젝션이 대안으로 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 도면과 실시예에 의해 예시되고 상세히 설명되며, 이는 단지 설명의 목적으로만 사용되며 한정하려는 것은 아니다. 상세한 설명 및 실시예들로 인해, 본 발명에 마찬가지로 포함되는 추가 실시형태들은 숙련된 기술자에게 이해하기 쉬운 것이다.
실시예
재료 및 방법:
하기 재료 및 방법을 하기 실시예에서 사용하였다.
플라스미드의 클로닝, 시험관내 전사, RNA 정제:
표준 기술을 사용하여 플라스미드를 클로닝하였다. 본 발명의 실시예에 사용된 개개의 플라스미드의 클로닝에 대한 세부 사항은 실시예 1에 기재되어 있다. 실시예 1에 기술된 플라스미드 및 T7 RNA-중합효소의 사용한 시험관내 전사 및 RNA의 정제는 종래에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017; Kuhn et al., 2010, 유전자 Ther., vol. 17, pp. 961-971).
정제된 RNA의 품질은 분광광도계 및 2100 BioAnalyzer (Agilent, Santa Clara, USA) 상의 분석에 의해 평가하였다. 실시예에서 세포로 형질주입된 모든 RNA는 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)이었다.
RNA 형질주입(RNA transfection):
전기천공을 위해, 하기 설정을 사용한 방형파 전기천공 장치 (BTX ECM 830, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)를 사용하여 실온에서 포유류 세포에 RNA를 전기천공도입하였다: BHK21 세포에 대해: 750 V/cm, 16 ms의 1펄스; 인간 포피 섬유아세포의 경우: 500 V/cm, 24 ms의 1펄스. 상이한 RNA 종의 혼합물을 RNAse-없는 튜브에서 제조하고 형질주입까지 얼음에 보관하였다. 전기천공을 위해, RNA 또는 RNA 혼합물을 최종 부피가 62.5 μl/mm의 큐벳 갭 크기가 되도록 재현탁시켰다.
리포펙션을 위해, 세포를 약 20,000 세포/cm2 성장 영역에 도말하고, 제조사의 설명서 (Life Technologies, Darmstadt, Germany)에 따라 총 260 ng/cm2 RNA 및 1 μl/cm2 MessengerMax 시약으로 형질주입하였다.
세포 배양:
모든 성장 배지, 태아 송아지 혈청 (FCS), 항생제 및 기타 보조제는 달리 언급되지 않는 한 Life Technologies/Gibco에서 제공받았다. 시스템 Bioscience (HFF, 신생아) 또는 ATCC (CCD-1079Sk)에서 얻은 인간 포피 섬유아세포를 15% FCS, 1% 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨을 함유하는 최소필수영양배지 (MEM)에서 37℃로 배양하였다. 세포를 5% CO2로 평형화된 가습 대기 상에서 37 ℃에서 성장시켰다. 미국 버지니아주 매너서스 소재의 American Type Culture Collection으로부터 입수 가능한 세포주 "BHK21 [C13] (ATCC® CCL10TM)"으로부터의 BHK21 세포를 10% FCS가 보충된 Eagle의 최소필수영양배지에서 성장시켰다.
유세포 분석:
FACS Canto II 유세포 분석기 (BD Bioscience, Heidelberg, Germany)를 사용하여 유세포 분석법으로 GFP를 코딩하는 RNA의 발현을 측정하고, 획득한 데이터를 상응하는 Diva 소프트웨어 또는 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다 (Tree Star Inc., Ashland, OR, USA).
루시퍼라아제 분석:
반딧불이 루시퍼라아제의 발현을 평가하기 위해, 형질주입된 세포를 96-웰 블랙 마이크로플레이트에 도말하고 Nanoluc 형질주입된 세포의 상등액을 96-웰 블랙 마이크로플레이트로 옮겼다(Nunc, Langenselbold, Germany). 반딧불이 루시퍼라아제 발현은 Bright-Glo 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 측정하였으며 Nanoluc 발현은 Nano-Glo 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다(둘다 Promega, Madison, WI, USA). 생체발광은 마이크로플레이트 발광 판독기인 Infinite M200 (Tecan Group, Maennedorf, Switzerland)을 사용하여 측정하였다. 데이터는 상대 조명 단위 [RLU]로 표시하며, 루시퍼라아제-음성 세포는 배경 신호를 빼는 데 사용하였다.
실시예 1: 플라스미드의 클로닝
A. Semliki forest 바이러스 (SFV) 기반의 레플리콘을 코딩하는 플라스미드는 PCR 기반의 심리스 클로닝 기법(seamless cloning technique)을 사용하여 수득하였다. 심리스 클로닝은 상동서열 스트레치를 사용하여 선형화된 벡터 내에 PCR 생성된 단편의 재조합에 기초한 클로닝 기술을 의미한다. 따라서, 바이러스 구조 유전자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 부재를 제외하고는, SFV 게놈에 상응하는 레플리콘을 코딩하는 DNA 서열을 pSFV-gen-GFP(Ehrengruber & Lundstrom, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, vol. 96, pp. 7041-7046; Lundstrom, 2001, Histochem. Cell Biol., vol. 115, pp. 83-91)로부터 T7 파지 RNA-중합효소 프로모터의 바로 하류의 pST1 플라스미드 백본(Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017) 내로 옮겼다. 플라스미드-120개의 아데닐레이트 잔기의 코딩된 폴리(A) 카세트 (Hxoltkamp et al., 상기)-또는 10개의 뉴클레오타이드 무작위 서열로 분리된 30개 및 70개 아데닐레이트 잔기로 이루어진 변형된 폴리(A) 카세트 (WO 2016/005004 A1)를 SFV 3'-UTR의 맨 마지막 뉴클레오타이드의 바로 하류에 첨가하였다. SapI 제한효소부위는 폴리(A) 카세트 또는 변형된 폴리(A) 카세트의 바로 하류에 위치하였다. 또한, myc-태그를 코딩하는 코딩 서열은 SFV nsP3의 가변 영역에 대한 코딩 영역에서 발견되는 XhoI 부위에 삽입하였다. nsP3 가변 영역으로의 삽입은 복제효소 폴리단백질의 활성에 영향을 미치지 않는다 (Spuul et al., 2010, J. Virol, vol. 85, pp. 7543-7557). 얻어진 플라스미드는 T7 중합효소에 대한 프로모터의 제어 하에서 SFV의 5' 복제인식서열을 코딩하는 DNA 서열을 포함하였다. SFV의 5' 복제인식서열을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호 4로 표시하였다:
ATGGCGGATGTGTGACATACACGACGCCAAAAGATTTTGTTCCAGCTCCTGCCACCTCCG
CTACGCGAGAGATTAACCACCCACG ATG GCCGCCAAAGTGC ATG TTGATATTGAGGCTGA
CAGCCCATTCATCAAGTCTTTGCAGAAGGCATTTCCGTCGTTCGAGGTGGAGTCATTGCA
GGTCACACCAA ATG ACC ATG CAA ATG CCAGAGCATTTTCGCACCTGGCTACCAAATTGA
(서열번호 4)
서열번호 4의 상기 표기에서, 첫 번째 밑줄 친 ATG는 nsP1의 N-말단 단편의 합성을 위한 개시코돈으로서 작용하고; 단백질로 번역된 염기는 굵은 글씨체로 표시하였다. nsP1 코딩 영역 내의 추가 ATG도 밑줄이 그었다. T7 중합효소에 의한 SFV (서열번호 4로 표시)의 5' 복제인식서열을 포함하는 플라스미드의 시험관내 전사 동안, 서열번호 3에 상응하는 RNA 서열을 포함하는 전사체를 수득하였다: 5' 말단 G는 T7 중합효소에 의해 전사되는 첫 번째 뉴클레오타이드에 상응하였다. 이 G는 알파바이러스 서열에 선행하며 T7 중합효소에 의한 효율적인 전사에 필요로 하였다.
GATGGCGGATGTGTGACATACACGACGCCAAAAGATTTTGTTCCAGCTCCTGCCACCTCCGCTACGCGAGAGATTAACCACCCACGATGGCCGCCAAAGTGCATGTTGATATTGAGGCTGACAGCCCATTCATCAAGTCTTTGCAGAAGGCATTTCCGTCGTTCGAGGTGGAGTCATTGCAGGTCACACCAAATGACCATGCAAATGCCAGAGCATTTTCGCACCTGGCTACCAAATTGATCGAGCAGGAGACTGACAAAGACACACTCATCTTGGATATC (서열번호 3)
서열번호 3의 상기 표기에서, 5개의 특정 ATG 염기 삼중항에는 밑줄이 표시하였다. SFV 복제효소 (GATATC)에 대한 코딩 영역의 고유한 EcoRV 제한효소부위는 굵은 글씨로 강조 표시하였다.
그 결과, 플라스미드 A를 수득하였다. 플라스미드 A는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질용 오픈 리딩 프레임을 포함하였다.
B. 비-변형된 5' 복제인식서열을 갖는 트랜스-레플리콘을 코딩하는 플라스미드는 플라스미드 A (상기 참조)에서 EcoRV로부터 SalI로 비구조성 단백질 코딩 서열을 제거함으로써 수득하였다. 이에 따라, nsP1234를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 주요 부분, 즉 유일한 EcoRV 제한효소부위로부터 고유한 SalI 제한효소부위까지 연장되는 서열이 제거하였다. 예시를 위해: GATATC (서열번호 3의 가장 3' 뉴클레오타이드 중 6개, 상기 표시에서 굵게 표시함)는 SFV 복제효소의 코딩 서열의 EcoRV 제한효소부위에 상응하였다. nsP1234를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 주요 부분을 제거한 후에, 5' 복제인식서열 및 서브게놈 프로모터가 여전히 존재하였다. nsP1234를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 주요 부분의 제거로 인해, 각 플라스미드에 의해 코딩된 RNA는 숙주세포에 존재할 때 시스로 복제를 유도할 수 없지만 복제에는 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 존재가 필요하였다.
반딧불이 루시퍼라아제 (전이유전자)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 서브게놈 프로모터 (SGP)의 하류에 삽입하였다. 따라서, 플라스미드 B를 얻었다. 각각의 플라스미드에 의해 코딩된 RNA 레플리콘은 도 1에서 "주형 RNA WT-RRS"로서 예시하였다.
RNA 2차 구조체 예측을 위해 웹 서버를 사용하여 (http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html) 문헌[Frolov, 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651]에 따라 비-변형된 5' 복제인식서열 (RNA)이 부모 RNA와 구분 안되는 4개의 스템루프로 접히는 것을 예측한 것을 확인하였다.
C-1. 플라스미드 B로부터 시작하여, 5' 복제인식서열의 변형을 갖는 트랜스-레플리콘을 코딩하는 플라스미드 (nsP1의 첫 번째 아미노산 잔기를 코딩하는 ATG 염기 삼중항의 제거뿐만 아니라 5' 복제인식서열 내에서 4개의 추가 ATG 염기 삼중항의 제거를 포함한다)는 단일-뉴클레오타이드 변화, 즉 다른 염기에 의해 각각의 ATG 염기 삼중항의 하나의 염기의 치환 (즉, A 또는 T 또는 G의 치환)에 의해 생성하였다. 바꾸어 말하면, 상기 밑줄 친 서열번호 3의 ATG 염기 삼중항을 각각 단일-뉴클레오타이드 (치환)의 변화에 의해 각각 제거하였다.
플라스미드에 의해 코딩된 트랜스-레플리콘 RNA의 접힘은 RNA 2차 구조체 예측(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html) 및 Mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)에 대해 웹서버를 이용하여 예측하였다.
ATG 제거를 특징으로 하는 변형된 5' 복제인식서열의 예측된 접힘을 각각의 변형되지 않은 5' 복제인식서열의 예상 접힘과 비교하였다. 변형된 5' 복제인식서열의 2차 구조체가 비변형된 5' 복제인식서열의 2차 구조체와 상이하다는 예측이 나온 경우, 하나 이상의 추가적인 뉴클레오타이드 변화 (치환)가 시행착오 접근법으로 ATG-없는 5' 복제인식서열 (△5ATG-RRS)의 RNA 접힘이 플라스미드 B에 의해 코딩된 비-변형된 5' 복제인식서열의 RNA 접힘과 동일한 것으로 예측될 때까지 수행하였다. 결과적으로, 서열번호 5에 따른 DNA 서열을 얻었다:
GATGGCGGATGTGTGACATACACGACGCCAAAAGATTTTGTTCCAGCTCCTGCCACCTCCGCTACGCGAGAGATTAACCACCCACGACGGCCGCCAAAGTGCTTGTTGATATTGAGGCTGACAGCCCATTCATCAAGTCTTAGCAGAAGGCATTTCCGTCGTTCGAGGTGGAGTCATTGGAGGTGACACCAAATCACCATCCAAATCCCAGAGCATTTTCGCACCTGGGTACCAAATTGATCGAGCAGGAGACTGACAAAGACACACTCATCTTGGATATC (서열번호 5)
예측된 동일한 접힘을 특징으로 하는 변형된 5' 복제인식서열을 코딩하는 플라스미드, 즉 서열번호 5를 포함하는 플라스미드를 본원에서 C-1이라 지칭하였다.
각각의 플라스미드에 의해 코딩된 RNA 레플리콘은 "△5ATG-RRS"로 명명된 도 1에 도시하였다.
서열번호 5에 예시된 바와 같이, 5개의 특정 ATG의 제거는 nsP1 또는 이의 단편의 합성을 방해할 것으로 이해하였다. nsP1에 대한 자연성 개시코돈의 제거로 인해, 단백질 합성은 서브게놈 프로모터 (SGP)의 하류의 첫 번째 개시코돈에서 개시되어, 반딧불이 루시퍼라아제 (전이유전자)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 전사를 초래한다는 것으로 이해하였다.
C-2. C-1로부터 시작하여, SGP를 EcoRV 및 SmaI로 절단하고 재결합시킴으로써 제거하였다. 각각의 RNA 레플리콘은 "△5ATG-RRS△SGP"로 명명된 도 1에 개략적으로 도시하였다. 각각의 RNA 레플리콘이 5' 캡을 포함하는 경우, 루시퍼라아제를 코딩하는 전이유전자는 5'-캡의 직접적인 번역 제어 하에 놓이게 하였다.
C-3. C-1에서 시작하여, SFV 복제효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 EcoRV 및 SalI 제한효소부위를 사용하여 삽입하였다. 이에 의해, 복제효소 ORF가 5' 복제인식서열과 중첩되지 않고 서브게놈 프로모터와 중첩되지 않는, 자기 복제 가능한 RNA를 코딩하는 플라스미드를 수득하였다. 각각의 RNA 레플리콘은 "시스플 레플리콘 △5ATG-RRS"로 명명된 도 1에 개략적으로 도시하였다.
D. 비-복제 mRNA로부터 복제효소를 코딩하는 핵산 서열의 번역을 가능하게 하기 위해, SFV 복제효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 인간 알파-글로빈 5'-UTR, 합성 3'-UTR 및 안정화하는 10개의 뉴클레오타이드 (10nt) 링커에 의해 분리된 30 플러스 70개의 아데닐레이트 잔기의 플라스미드-코딩된 폴리(A) 꼬리를 포함하는 플라스미트 내로 클로닝하였다(WO 2016/005324 A1). SFV 복제효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 인간 알파-글로빈 5'-UTR의 하류에 클로닝하였다. 플라스미드는 SFV 복제효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 전사를 위한 T7 프로모터를 함유하였다.
E. 비-복제 mRNA로부터의 종두증 바이러스 단백질 키나아제 R 저해제 E3을 코딩하는 핵산 서열의 번역을 가능하게 하기 위해, 종두증 바이러스 단백질 키나아제 R 저해제 E3("E3")을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 인간 알파-글로빈 5'-UTR, 합성 3'-UTR 및 안정화하는 10개의 뉴클레오타이드 (10nt) 링커에 의해 분리된 30 플러스 70개의 아데닐레이트 잔기의 플라스미드-코딩된 폴리(A) 꼬리를 포함하는 플라스미트 내로 클로닝하였다(WO 2016/005324 A1) E3를 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 인간 알파-글로빈 5'-UTR의 하류에 클로닝하였다. 플라스미드는 E3를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 전사를 위한 T7 프로모터를 함유하였다.
실시예 2: 5' 복제인식서열 내의 개시코돈의 제거는 트랜스-레플리콘 RNA의 복제에 영향을 미치지 않는다.
BHK21 세포를 (i) SFV 복제효소 (실시예 1의 플라스미드 D에 의해 코딩됨)를 코딩하는 5μg mRNA 및 (ii) 트랜스-레플리콘 RNA의 다양한 양 (실시예 1의 플라스미드 B 또는 C-1에 의해 코딩되고; 도 2에서: "주형")과 공동-전기천공주입하였다. 트랜스-레플리콘은 반딧불이 루시퍼라아제를 코딩하고; 트랜스-레플리콘은 야생형 5' 복제인식서열 (도 2: "WT-RRS"; 플라스미드 B에 의해 코딩됨); 또는 모든 개시코돈의 제거를 특징으로 하는 5' 복제인식서열 (도 2: "△5ATG-RRS"; 플라스미드 C-1에 의해 코딩됨)을 포함한다. 트랜스-레플리콘 RNA는 캡핑되지 않았다 (캡 없음). 5000개의 전기천공된 BHK21 세포는 전기천공 후 24시간에 루시퍼라아제 발현을 측정하기 위해 96-웰-플레이트의 각 웰에 도말하였다. 결과를 도 2B에 나타내었다.
실시예 3: 5' 복제인식서열 내의 개시코돈의 제거는 캡의 제어 하에 전이유전자의 번역을 가능하게 한다
모든 개시코돈의 제거를 특징으로 하고 서브게놈 프로모터를 포함하는 트랜스-레플리콘 (도 3: "△5ATG-RRS"; 실시예 1의 플라스미드 C-1에 의해 코딩됨), 모든 개시코돈의 제거를 특징으로 하지만 서브게놈 프로모터를 포함하지 않는 트랜스-레플리콘 (도 3: "△5ATG-RRS△SGP"; 실시예 1의 플라스미드 C-2에 의해 코딩됨), 및 모든 개시코돈을 가지고 서브게놈 프로모터를 포함하는 트랜스-레플리콘 (도 3 "주형 RNA WT-RRS")을 사용하였다. 인간 포피 섬유아세포를 (i) 도 3에 나타낸 바와 같이, 0.45 μg의 각각의 트랜스-레플리콘 RNA 및 (ii-a) 종두증 바이러스 E3 단백질을 코딩하는 2.5 μg mRNA (도 3에서 실시예 1의 플라스미드 E에 의해 코딩됨: "E3"), 또는 (ⅱ-b) 복제효소를 코딩하는 2.5 μg mRNA (도 3에서 실시예 1의 플라스미드 D에 의해 코딩됨: "복제효소") 플러스 종두증 바이러스 E3 단백질을 코딩하는 2.5 μg mRNA (실시예 1의 플라스미드 E에 의해 코딩됨)와 공동-전기천공주입하였다. 단백질 키나아제 R의 활성화를 억제하여 루시퍼라아제 및 복제효소의 발현을 촉진시키기 위해, 종두증 바이러스 E3 단백질을 코딩하는 mRNA를 첨가하였다. 트랜스-레플리콘 RNA는 캡핑되지 않거나(도 3: "캡 없음") 또는 베타-S-ARCA(D2) 캡 유사체로 공동-전사 캡핑하였다(도 3: "D2-캡"). 루시퍼라아제 발현은 24시간 후에 평가하였다. 결과를 도 3 (우측 패널)에 나타내었다.
이 실시예는 5' 복제인식서열로부터 개시코돈의 제거가 전이유전자가 캡핑된 트랜스-레플리콘 RNA로부터 효율적으로 직접 번역할 수 있음을 입증하였다.
실시예 4: 형질주입 후 초기 단계에서, 5' 복제인식서열 내 시작코돈의 제거를 특징으로 하는 트랜스-레플리콘으로부터의 캡 의존성 번역은 서브게놈 RNA로부터의 것보다 강하다.
모든 개시코돈의 제거를 특징으로 하고, 서브게놈 프로모터를 포함하는 트랜스-레플리콘 (도 4: "△5ATG-RRS"; 실시예 1의 플라스미드 C-1에 의해 코딩됨), 및 모든 개시코돈의 제거를 특징으로 하지만, 서브게놈 프로모터를 포함하지 않는 트랜스-레플리콘 (도 4에서: "△5ATG-RRS△SGP"; 실시예 1의 플라스미드 C-2에 의해 코딩됨)을 사용하였다. BHK21 세포는 (i) 각각의 트랜스-레플리콘 RNA의 0.45 μg 및 (ii) 복제효소를 코딩하는 2.5 μg mRNA (실시예 1의 플라스미드 D에 의해 코딩됨)로 공동-전기천공주입하였다. 트랜스-레플리콘 RNA는 캡핑되지 않거나 (도 4: "캡 없음") 또는 베타-S-ARCA(D2) 캡 유사체로 동시-전사 캡핑하였다 (도 4: "D2-캡"). 루시퍼라아제 발현은 시간이 지남에 따라 평가하였다. 결과를 도 4 (우측 패널)에 나타내었다.
실시예 5: 5' 복제인식서열 내의 개시코돈의 제거를 특징으로 하는 트랜스-레플리콘으로부터의 캡 의존성 번역은 이전 복제효소의 발현에 의존하지 않고 초기 단계에서 전이유전자 발현을 가능하게 한다.
모든 개시코돈의 제거를 특징으로 하지만 서브게놈 프로모터를 포함하지 않는 트랜스-레플리콘 (도 5: "△5ATG-RRS△SGP"; 실시예 1의 플라스미드 C-2에 의해 코딩됨)을 사용하였다. 트랜스-레플리콘 RNA는 캡핑되지 않거나 (도 5: "캡 없음") 베타-S-ARCA(D2) 캡 유사체 (도 5: "D2-캡")로 공동-전사 캡핑하였다. BHK21 세포는 (i) 0.45 μg의 각각의 트랜스-레플리콘 RNA 및 지시된 경우(도 5의 "복제효소"), (ii) mRNA를 코딩하는 2.5 μg의 복제효소 (실시예 1의 플라스미드 D에 의해 코딩됨)를 추가로 전기천공주입하였다. 루시퍼라아제 발현은 시간이 지남에 따라 평가하였다. 결과를 도 5 (우측 패널)에 나타내었다.
실시예 6: ATG-결실된 복제인식서열을 갖는, 재구성된 시스-레플리콘은 기능적이다.
SFV 복제효소의 ORF는 "△5ATG-RRS" (도 7A: "△5ATG-RRS"; 실시예 1의 플라스미드 C-1에 의해 코딩됨) 내로 삽입되고 실시예 1 "시스레플리콘 △5ATG-RRS" 의 플라스미드 C-3에서 얻어지고 서브게놈 프로모터 (SGP)의 반딧불이 루시퍼라아제 하류를 암호화한다. 삽입된 복제효소 내에서, CSE 2 및 코어 SGP에 상응하는 영역은 이들 조절 영역의 중복을 피하기 위해 뉴클레오타이드 변화(빗금친 박스)에 의해 파괴시켰다. 이로 인해 시스-레플리콘을 재구성하였다. BHK21 세포는 2.5μg "시스-레플리콘 WT-RRS" 또는 "시스-레플리콘 △5ATG-RRS"로 공동-전기천공주입하였다. 전기천공 후 24시간에 루시퍼라아제 발현을 측정하고 재구성된 시스레플리콘이 기능적임을 입증하였다 (도 7B).
실시예 7: 바이시스트론 트랜스-레플리콘은 두 전이유전자를 발현한다.
트랜스-레플리콘 WT-RSS (실시예 1의 플라스미드 B)의 서브게놈 프로모터 (SGP)의 하류에 Secretable Nano-루시퍼라아제 (SNL)를 클로닝하였다. SGP의 상류 위치는 번역을 위해 접근 가능하지 않기 때문에 전이유전자를 코딩하지 않는다 (도 8A). 두 번째 구성체에서, SNL은 △ATG-RSS (실시예 1의 플라스미드 C-1)의 하류에 클로닝하고, 반딧불이 루시퍼라아제 (Luc)는 SGP의 하류에 삽입하였다. BHK21 세포는 0.9μg 트랜스-복제한 RNA 및 5μg SFV-복제효소 코딩하는 mRNA로 공동-전기천공주입하였다. 전기천공 후 48시간에 SNL 및 Luc 발현을 측정하였다 (도 8B). 이 실험은 전이유전자가 "△5ATG-RRS-바이시스트론" 트랜스-레플리콘 내의 두 위치에서 발현된다는 증거를 제공하였다.
실시예 8: 복제인식서열에서 시작코돈이 없는 Sindbis 바이러스 트랜스-레플리콘은 효율적으로 복제한다.
트랜스-레플리콘은 SFV에 대해 실시예 1에서 기술된 구성체와 유사하게 유전자 합성에 의해 Sindbis 바이러스 게놈으로부터 조작시켰다. 변형되지 않은 복제인식서열을 갖는 트랜스-레플리콘(WT-RSS) 외에 2가지 변이체를 생성하였다. 첫 번째 (△ATG-RRS)는 원래의 시작코돈의 결실과 4개의 추가 ATG 및 RNA 2차 구조체를 보존하기 위한 상응하는 보완적 뉴클레오타이드 변화를 포함한다. 다음 단계에서, 서브게놈 프로모터에 상응하는 영역을 추가로 제거하여 △ATG-RRS△SGP를 수득하였다. GFP는 △5ATG-RRS△SGP-벡터에서 ATG-결실된 5'RRS의 하류 또는 △5ATG-RRS 및 WT-RRS 벡터에서 서브게놈 프로모터 (SGP)의 하류에 직접적으로 트랜스-레플리콘 RNA 내에 삽입하였다 (도 9A). BHK21 세포는 0.1μg 트랜스-복제한 RNA 및 2.4μg SFV-복제효소 코딩한 mRNA 및 24시간 후의 GFP 발현물 (형질주입률 [%] 및 평균 형광 강도 (MFI)를 평가하였다(도 9B))과 공동-전기천공주입하였다. 이 실험은 SFV로 조작된 레플리콘에 적용된 동일한 서열 변형 원리가 Sindbis 바이러스 조작된 레플리콘에 적용될 수 있음을 보여주었다.
<110> BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH et al. <120> RNA replicon for versatile and efficient gene expression <130> 674-173 PCT2 <150> PCT/EP2016/056165 <151> 2016-03-21 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> conserved sequence element 3 <400> 1 accucuacgg cgguccuaaa uagg 24 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> conserved sequence element 4 <400> 2 auuuuguuuu uaauauuuc 19 <210> 3 <211> 281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' replication recognition sequence <400> 3 gatggcggat gtgtgacata cacgacgcca aaagattttg ttccagctcc tgccacctcc 60 gctacgcgag agattaacca cccacgatgg ccgccaaagt gcatgttgat attgaggctg 120 acagcccatt catcaagtct ttgcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgc 180 aggtcacacc aaatgaccat gcaaatgcca gagcattttc gcacctggct accaaattga 240 tcgagcagga gactgacaaa gacacactca tcttggatat c 281 <210> 4 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' replication recognition sequence <400> 4 atggcggatg tgtgacatac acgacgccaa aagattttgt tccagctcct gccacctccg 60 ctacgcgaga gattaaccac ccacgatggc cgccaaagtg catgttgata ttgaggctga 120 cagcccattc atcaagtctt tgcagaaggc atttccgtcg ttcgaggtgg agtcattgca 180 ggtcacacca aatgaccatg caaatgccag agcattttcg cacctggcta ccaaattga 239 <210> 5 <211> 281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' replication recognition sequence <400> 5 gatggcggat gtgtgacata cacgacgcca aaagattttg ttccagctcc tgccacctcc 60 gctacgcgag agattaacca cccacgacgg ccgccaaagt gcttgttgat attgaggctg 120 acagcccatt catcaagtct tagcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgg 180 aggtgacacc aaatcaccat ccaaatccca gagcattttc gcacctgggt accaaattga 240 tcgagcagga gactgacaaa gacacactca tcttggatat c 281 <210> 6 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> purine <400> 6 gccgccncca ugg 13

Claims (29)

  1. 5' 복제인식서열을 포함하는 RNA 레플리콘으로서,
    상기 5' 복제인식서열은 자연성 알파바이러스 5' 복제인식서열에 비하여 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 레플리콘.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 5' 복제인식서열은 알파바이러스의 5' 말단에서 약 250개의 뉴클레오타이드에 상동인 서열을 포함하고, 바람직하게는 알파바이러스의 5' 말단에서 약 300 내지 약 500개의 뉴클레오타이드에 상동인 서열을 포함하는 RNA 레플리콘.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 5' 복제인식서열은 알파바이러스의 보존서열구성 1 및 보존서열구성 2에 상동인 서열을 포함하는, RNA 레플리콘.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 보존서열구성 2는 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임의 단편을 포함하는, RNA 레플리콘.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 5' 복제인식서열은 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 단편은 자연성 알파바이러스 서열에 비하여 적어도 하나의 개시코돈의 제거를 포함하는, RNA 레플리콘.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편은 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임의 적어도 자연성 시작코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 레플리콘.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    상기 알파바이러스로부터의 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임에 상동인 서열 또는 이의 단편은 비구조성 단백질의 오픈 리딩 프레임의 자연성 시작코돈 이외에 하나 이상의 개시코돈의 제거를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 레플리콘.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 개시코돈의 제거에 의해 도입된 하나 이상의 스템루프 내에서의 뉴클레오타이드 결합형성 파괴를 보완하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화를 포함하는, RNA 레플리콘.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    절단된 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는, RNA 레플리콘.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 레플리콘은 3' 복제인식서열을 포함하는, RNA 레플리콘.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 레플리콘은 목적 단백질을 코딩하는 제 1 오픈 리딩 프레임을 포함하는, RNA 레플리콘.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은 주형으로서 RNA 레플리콘으로부터 발현될 수 있는, RNA 레플리콘.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    상기 목적 단백질을 코딩하는 제 1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 서브게놈 RNA의 생산을 제어하는 서브게놈 프로모터를 포함하는, RNA 레플리콘.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 제 1 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은 RNA 레플리콘 및 서브게놈 RNA로부터 발현될 수 있는, RNA 레플리콘.
  15. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    상기 RNA 레플리콘은 목적 단백질을 코딩하는 제 2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 서브게놈 RNA의 생산을 제어하는 서브게놈 프로모터를 포함하는, RNA 레플리콘.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 목적 단백질을 코딩하는 제 2 오픈 리딩 프레임 및 서브게놈 프로모터는 목적 단백질을 코딩하는 제 1 오픈 리딩 프레임의 하류에 위치하는, RNA 레플리콘.
  17. 제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 및/또는 제 2 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 목적 단백질은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질인, RNA 레플리콘.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는, RNA 레플리콘.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
    상기 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 5' 복제인식서열과 중첩되지 않는, RNA 레플리콘.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있는, RNA 레플리콘.
  21. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는, RNA 레플리콘.
  22. 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체, 및
    기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 제 1 항 내지 제 16 항 및 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 RNA 레플리콘을 포함하는, 시스템.
  23. 제 1 항 내지 제 21 항 또는 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알파바이러스는 Semliki Forest 바이러스인, RNA 레플리콘 또는 시스템.
  24. 제 1 항 내지 제 21 항 및 제 23 항 중 어느 한 항의 RNA 레플리콘을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA.
  25. 세포에서의 목적 단백질 생산 방법으로서,
    (a) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있으며, 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는, 제 1 항 내지 제 20 항 및 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 RNA 레플리콘을 수득하는 단계, 및
    (b) RNA 레플리콘을 세포 내에 접종하는 단계를 포함하는, 세포에서의 목적 단백질 생산 방법.
  26. 세포에서의 목적 단백질 생산 방법으로서,
    (a) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체를 수득하는 단계,
    (b) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 트랜스로 복제될 수 있고 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는, 제 1 항 내지 제 16 항, 제 21 항 및 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 RNA 레플리콘을 수득하는 단계, 및
    (c) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질 및 RNA 레플리콘을 세포 내에서 발현시키기 위한 RNA 구조체를 함께 접종하는 단계를 포함하는, 세포에서의 목적 단백질 생산 방법.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항의 방법에 따라 접종된 세포.
  28. 대상체에서의 목적 단백질 생산 방법으로서,
    (a) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 복제될 수 있으며, 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는, 제 1 항 내지 제 20 항 및 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 RNA 레플리콘을 수득하는 단계, 및
    (b) RNA 레플리콘을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 목적 단백질 생산 방법.
  29. 대상체에서의 목적 단백질 생산 방법으로서,
    (a) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체를 수득하는 단계,
    (b) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질에 의해 트랜스로 복제될 수 있고 목적 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는, 제 1 항 내지 제 16 항, 제 21 항 및 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 RNA 레플리콘을 수득하는 단계, 및
    (c) 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질을 발현하기 위한 RNA 구조체 및 RNA 레플리콘을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 목적 단백질 생산 방법.
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