CN101802199B - 用于α病毒结构蛋白表达的无启动子盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种分离的RNA分子，其包括a)α病毒5’复制识别序列，其中从5’复制识别序列中去除了至少一个起始密码子；b)编码α病毒结构蛋白的核苷酸序列；和c)α病毒3’复制识别序列，条件是RNA分子不含有指导(b)的核苷酸序列转录的启动子，并且其中(a)和(c)的α病毒5’和3’复制识别序列指导整个RNA分子在α病毒非结构蛋白的存在下复制。

Description

用于α病毒结构蛋白表达的无启动子盒
优先权声明
本发明依据35U.S.C.§119(e)要求了2007年6月21日提交的U.S.临时申请No.60/936,637的权益，在此将其全部内容引入作为参考。
政府资助声明
本发明的一些方面得到国立健康研究院的补助No.5 UO1A1057286-03下的资金的资助。
发明领域
本发明涉及用于制备重组α病毒颗粒的改良构建体和制备重组α病毒颗粒的方法。
发明背景
α病毒目前用作研发传染病和癌症疫苗的载体平台(例如，参见U.S.专利No.5,792,462；6,156,558；5,811,407；6,531,135；6,541,010；6,783,939；6,844,188；6,982,087；7,045,335；5,789,245；6,015,694；5,739,026；Pushko等，Virology 239(2)：389-401(1997)，Frolov等，J.Virol.71(1)：248-258(1997)；Smerdou和Liljestrom，J.Virol.73(2)：1092-1098(1999))。α病毒包括披膜病毒科中的属，并且发现属中的成员遍布全世界，在脊椎动物和无脊椎动物宿主中都有。其中，得到最多研究的用于载体平台的α病毒是委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒、西门利克森林病毒(SFV)和辛德毕斯病毒(SV)，该属的原型成员。
一个这样的载体平台是α病毒复制子系统，描述于Garoff等的U.S.专利No.6,190,666，Johnston等的U.S.专利No.5,792,462和6,156,558中，Dubensky等的U.S.专利No.5,814,482、5,843,723、5,789,245、6,015,694、6,105,686和6,376,236；U.S.公开申请No.2002-0015945(Polo等)，U.S.公开申请No.2001-0016199(Johnson等)，Frolov等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11371-11377和Pushko等(1997)Virology 239：389-401中。将α病毒复制子载体工程化，以含有并表达一个或更多个目标核酸，其中目标核酸可以编码，例如，抗原、细胞因子、核酶或酶。α病毒复制子可以源自任何α病毒，其中如委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒，辛德毕斯病毒，例如TR339株，南非虫媒病毒No.86和西门利克森林病毒。然后将载体引入培养物中的细胞中，使α病毒复制，并且其中还表达了α病毒的结构蛋白，使得通过α病毒结构蛋白将载体包装成α病毒复制子颗粒(ARP)。然后从培养物中收集ARP，并传送至对象，用于各种治疗目的。
已经研发了各种构建体来提高ARP系统在疫苗应用中的免疫原性和有效性。还将这些构建体中的许多进行了设计，以降低通过基因组片段的重组形成可复制(replication-competent)α病毒的可能性。Johnson等(U.S.专利No.5,792,462和6,156,558)认识到从单个辅助系统(其中一套完整的α病毒的结构蛋白基因在一个RNA分子上，而非结构蛋白基因和异源目标核酸在分开的复制子RNA上)重组的可能，并因此设计了利用两个辅助RNA来编码结构蛋白的“双-辅助”系统。Dubensky等(U.S.专利No.5,789,245)和Polo等(U.S.专利No.6,242,259)描述了使用稳定转化至包装细胞系中的两个DNAα病毒结构蛋白表达盒，以通过将复制中的α病毒载体引入包装细胞的培养物中时产生表达那些结构蛋白的RNA来包装α病毒载体。Lijiestrom和同事已经提出了证实“单个辅助系统”将产生野生型α病毒颗粒的数据(Berglund等，Biotechnology 11(8)：916-920(1993))。Smith等已经描述了其他指导结构蛋白表达的新辅助RNA(WO2004/085660)。
通过将病毒编码序列分布在三个核酸中，其中两个包括辅助系统，如上所述，形成可复制病毒(“RCV”)的重组的理论频率相对于单个辅助系统明显下降。这些系统包括使用α病毒亚基因组启动子，通常称为26S启动子或病毒连接区启动子，以提供用作独立转录单位的构建体，和使用α病毒RNA聚合酶识别信号，使得辅助系统可以利用α病毒复制机制的存在，用于辅助功能的扩增和有效表达。
在现有的系统中，已知包装信号通常包括在复制子RNA中并排斥在辅助构建体之外。然而，尽管如此，辅助RNA以较低的频率得到包装或共同包装(Lu和Silver，J.Virol Methods，91(1)：59-65(2001))，并且具有末端识别信号的辅助构建体将在复制子存在下得到扩增和表达，潜在地与其他辅助分子或复制子RNA产生重组事件。
使用α病毒复制子颗粒的动物研究已经使用了105至108的剂量，并且107、5×107和108已经有效地用于非人灵长类动物中，这也是用于人类临床试验中的剂量。此外，较高剂量，如2×108、5×108和109，在用于人类的应用中也是有用。这样的剂量需要大规模的制造程序，并且在这样的规模下，在统计学上可能的是使用现有的RNA辅助系统可能产生可复制α病毒。
因此，本领域中仍然存在需要来提供用于制造α病毒复制子颗粒的改良系统，以进一步降低形成可复制α病毒的预测频率，以及优化制造策略和成本。
本发明提供了缺乏启动子序列的编码α病毒结构蛋白的α病毒RNA辅助分子，由此显著降低在辅助分子和复制子载体之间可能发生的功能性重组事件的理论数量，导致重组α病毒颗粒生产过程中可复制α病毒形成率的理论预测下降。
发明概述
本发明提供分离的RNA分子，其包含：a)α病毒5’复制识别序列，其中已经从所述5’复制识别序列中除去起始密码子；b)编码α病毒结构蛋白的核苷酸序列；和c)α病毒3’复制识别序列，条件是RNA分子不含有指导(b)的核苷酸序列转录的启动子，并且其中α病毒5’和3’复制识别序列在α病毒非结构蛋白的存在下指导整个RNA分子的复制。
在此另外提供的是制备α病毒复制子颗粒的方法，其包括在由此生产α病毒复制子颗粒的条件下，将一个或更多个本发明的RNA分子引入细胞中，由此RNA分子的组合连同α病毒复制子RNA一起编码生产α病毒复制子颗粒需要的所有α病毒结构蛋白。
此外，提供了制备α病毒复制子颗粒的方法，其包括在由此生产α病毒复制子颗粒的条件下，将下列引入细胞中：a)α病毒复制子RNA；b)一个或更多个本发明的RNA分子；和c)一个或更多个启动子辅助α病毒辅助构建体，由此(b)的RNA分子的组合和(c)的辅助构建体编码生产α病毒复制子颗粒需要的所有α病毒结构蛋白。
在其他实施方案中，本发明提供了α病毒复制子颗粒群，其中该群不含有可检测的可复制病毒颗粒，如通过在培养物中的允许(permissive)细胞上传代所测定的。
在此还提供了α病毒复制子颗粒群，其中该群不含有可检测的可复制病毒颗粒，如通过在培养物中的允许细胞上传代所测定的，其中α病毒复制子颗粒在α病毒结构蛋白或α病毒非结构蛋白或α病毒结构蛋白和α病毒非结构蛋白两者中含有一个或更多个减毒突变。
此外，本发明提供了诱导对象中免疫应答的方法，其包括将有效量的本发明的α病毒复制子颗粒群给予对象。
附图简述
图1显示了全长(FL)无启动子辅助分子的5’复制识别序列(RRS)的结构。用轮廓线和黑线表示5’复制识别序列内的衣壳或糖蛋白(GP)起始密码子的起始密码子上游的位置。轮廓线表示与衣壳或GP的编码序列符合阅读框的起始密码子。黑线表示与衣壳或GP的编码序列不符合阅读框的起始密码子。垂直线下的数字表示用于5’复制识别序列中推定起始密码子的第一个核苷酸位置，编号从分子的5’端开始。
图2显示了无启动子辅助分子中5’复制识别序列删除的结构。框出的框表示每个构建体内保留的5’复制识别序列，而框内的数字是序列以核苷酸的长度。细黑线表示已经从每个构建体删除的5’复制识别序列。带有斜线的框表示衣壳或GP的编码序列的位置。
图3是Northern印迹分析。从Vero细胞提取总细胞RNA，这些细胞已经用30μg pERK/342/MS/BoNT A复制子RNA和30μg dHE1-6M1(无启动子E1辅助子)或30μg含有26S的GP辅助RNA(13.4.6)电穿孔。将每个样品的RNA(5μg)在1％乙二醛凝胶上跑胶并转移至
Figure GPA00001027335700041
膜(Ambion；Austin，TX)。使用基因组正义α病毒RNA 3’端特异性的探针来检测辅助子的复制。泳道1：RNA分子量标记，泳道2：dHE1-6M1辅助子+BoNT A复制子，泳道3：启动子辅助GP辅助子+BoNT A复制子。
图4是显示了泛素单体的C-端氨基酸和核苷酸序列以及用于泛素化(dHcapU和dHgpU)或标准(dHcap和dHgp)构建体的α病毒衣壳和糖蛋白编码序列的N-端残基的图。这些序列右端的“Met Phe”、“ProMet Phe”、“Pro Thr Met Ser”和“Thr Met Ser”表示在衣壳和GP蛋白的N-端发现的氨基酸。泛素化构建体具有在13.2.2和13.4.6辅助子中未发现的其他N-端残基。最右侧的框表示3’RsrII位点和作为初级核苷酸序列编码结果的氨基酸。最左侧的框表示对于从VEE结构蛋白切割泛素关键的残基。
图5显示了在包装研究中从电穿孔产生VRP的细胞产生的细胞裂解物的Western印迹分析(一个使用衣壳特异性抗体，另一个使用糖蛋白(GP)特异性抗体)(表10)。除了复制子，将两个RNA辅助子电穿孔至细胞中，如下：泳道1，dHcap6-mut1和13.4.6(GP)；泳道2，Hcap4和dHgp6-mut1；泳道3，dHcapU和dHgpU；泳道4，dHcap(FL)和dHgp(FL)；泳道5，Hcap4和dHgpU；泳道6，Hcap4和dHgp(FL)；泳道7，dHcapU和13.4.6；泳道8，dHcap(FL)和13.4.6；泳道9，Hcap4和13.4.6；泳道10，分子量标记。
图6显示了在Vero细胞中产生的衣壳辅助RNA的Northern印迹分析，该Vero细胞中除了复制子外，已经将两个RNA辅助子电穿孔至该细胞中，如下：泳道1，dHcap6-mut1和13.4.6(GP)；泳道2，Hcap4和dHgp6-mut1；泳道3，dHcapU和dHgpU；泳道4，dHcap(FL)和dHgp(FL)；泳道5，Hcap4和dHgpU；泳道6，Hcap4和dHgp(FL)；泳道7，dHcapU和13.4.6；泳道8，dHcap(FL)和13.4.6。用星号标注每个泳道中可翻译的衣壳RNA分子。
图7显示了在Vero细胞中产生的糖蛋白(GP)辅助RNA的Northern印迹分析，该Vero细胞中除了复制子外，已经两个RNA辅助子电穿孔至该细胞中，如下：泳道1，dHcap6-mut1和13.4.6(GP)；泳道2，Hcap4和dHgp6-mut1；泳道3，dHcapU和dHgpU；泳道4，dHcap(FL)和dHgp(FL)；泳道5，Hcap4和dHgpU；泳道6，Hcap4和dHgp(FL)；泳道7，dHcapU和13.4.6；泳道8，dHcap(FL)和13.4.6。用星号标注每个泳道中可翻译的糖蛋白RNA分子。
发明详述
如在此所用的，“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”可以表示一种或更多种，这取决于其中使用它的内容。例如，“一(a)”种细胞可以表示一种细胞或更多种细胞。
此外，如在此所用的，“和/或”指的是并包括一种或更多种相关所示项目的任何和所有可能的组合，以及以可替换的方式(“或”)解释时，组合的缺乏。
此外，术语“约”，如在此所用的，涉及可测量值时，如本发明的化合物或试剂的含量、剂量、时间、温度等，表示包括特定含量±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变动。
术语“5’α病毒复制识别序列”、“3’α病毒复制识别序列”、“5’复制识别序列”和“3’复制识别序列”指的是在α病毒中发现的RNA序列、从其衍生的序列或基于各种α病毒中保守序列的合成序列，这些序列通过非结构α病毒复制酶蛋白识别并导致病毒RNA的复制。在一些实施方案中，这些序列是DNA的形式，以促进本发明的构建体、质粒和核酸的制备、突变和/或操纵，来产生VRP。这些序列也称为“5’和3’端”，非结构蛋白-介导的扩增需要的5’和3’病毒序列，非结构蛋白-介导的扩增需要的5’和3’序列，5’或3’保守序列元件(CSE)，5’或3’非编码区，5’或3’非编码区序列，复制需要的顺式5’或3’病毒序列，启动α病毒转录的5’或3’序列和/或α病毒5’和3’序列，5’和3’名称指的是它们在α病毒基因组中位置。在本发明的核酸分子中，这些5’和3’端的使用将导致这两端之间编码的RNA序列的复制和/或转录。可以通过标准分子生物技术来修饰这些序列(例如，在任一端截短和/或修饰来除去启动(即，起始)密码子或增强可翻译性)，用以进一步最小化重组的可能和/或用于引入克隆位点等，附加条件是它们必须仍然能通过α病毒复制机制来识别。
如在此所用的，术语“启动密码子”或“起始密码子”指的是RNA中的AUG和DNA中的ATG，其可以或不可以用于功能蛋白的翻译中。
术语“一个/几个α病毒结构蛋白”指的是由α病毒编码的一种结构蛋白或组合。这些通过野生型病毒作为多聚蛋白来产生并且通常在文献中描述为C-E3-E2-6k-E1。E3和6k作为两种糖蛋白E2和E1的跨膜/转运信号。因此，在此术语E1的使用可以指E1、E3-E1、6k-E1或E3-6k-E1，而在此术语E2的使用可以指E2、E3-E2、6k-E2、PE2、p62或E3-6k-E2。术语“糖蛋白辅助子”或“GP辅助子”在此通常指编码E2和E1糖蛋白的辅助分子；在本发明的特定实施方案中，在分开的辅助分子上编码E1和E2。
术语“辅助子”和“辅助分子”可以互换使用并且指的是表达编码一个或更多个α病毒结构蛋白的核酸的核酸分子。
术语“辅助细胞”和“包装细胞”在此可以互换使用并且指的是在其中产生α病毒复制子颗粒的细胞。辅助细胞包含一组如在此所述的编码一个或更多个α病毒结构蛋白的辅助分子和/或辅助构建体。辅助子可以是RNA或DNA或两者。辅助细胞或包装细胞可以是α病毒-允许的任何细胞，即，在引入复制子RNA时可以产生α病毒颗粒。α病毒-允许的细胞包括，但不限于，Vero、幼仓鼠肾(BHK)、293、293T/17(ATCC登录号CRL-11268)、鸡胚成纤维细胞(CEF)、UMNSAH/DF-1(ATCC登录号CRL-12203)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
如在此所用的“启动子”是指导RNA分子转录的核酸序列。
如在此所用的“分离的细胞”是已经从细胞自然产生的环境中取出的细胞或细胞群和/或从细胞在其自然环境中的状态改变或修饰的细胞或细胞群。本发明的分离细胞可以是例如在细胞培养物中的细胞。本发明的分离细胞还可以是在动物体内的细胞和/或引入动物中的细胞，并且其中细胞已经例如通过将本发明的α病毒颗粒引入细胞中而得到了改变或修饰。
如在此所用的，“α病毒亚基因组启动子”或“26S启动子”是最初在野生型α病毒基因组中限定的启动子，其指导亚基因组信使RNA的转录，作为α病毒复制过程的一部分。
在本发明的一些实施方案中所用的异源核酸(例如，目标基因或“GOI”或目标核酸或“NOI”)是不存在于野生型α病毒基因组中的核酸和/或是不以与其存在于本发明重组核酸中的相同次序存在于野生型α病毒基因组中的核酸。例如，在特定的实施方案中，将NOI用作感染性、缺陷型α病毒颗粒(例如，α病毒复制子颗粒)装配中的辅助核酸或作为用于对抗由特定α病毒引起的疾病的疫苗的免疫原时，NOI编码一个或更多个α病毒结构蛋白(例如，C、PE2/E2、E1、E3、6K)。
本发明是基于令人惊讶和出乎意料的发现：含有编码α病毒结构蛋白的核苷酸序列以及α病毒5’和3’序列但缺乏启动子序列(例如，亚基因组α病毒启动子序列，有时称为26S或病毒连接区启动子)的RNA分子可以复制，其中已经从5’复制识别序列中去除启动密码子，使得全长正链RNA可以得到有效地翻译并产生足量的反式α病毒结构蛋白，用于在培养的细胞系中生产α病毒复制子颗粒。这些“无启动子”RNA分子，在此有时称为“Δ26S辅助子”，通过降低辅助分子和复制子载体之间发生的功能性重组事件产生的预测理论频率提高了α病毒复制子颗粒群(例如，为用作疫苗或佐剂生产的)的理论安全限度。
任何切割辅助系统需要最少两个独立的重组事件来产生可复制α病毒(RCV)。对于α病毒，认为重组主要是通过RNA复制复合物的随机链转换的结果(Weiss等，1991)，尽管已经报道了同源重组。对于第一个重组事件，例如，复制复合物将在文献中公开的切割辅助子/复制包装系统中的RNA辅助分子的3’端开始(例如，Johnson等，U.S.专利No.5,792,462)。如果复合物通过26S或病毒连接区持续该辅助RNA的复制，然后作为模板在复制子RNA中转换成外源核苷酸序列，并通过复制子5’端完成复制，所得到的“重组复制子中间产物”将含有编码所有非结构蛋白的序列，一些或所有含有外源目标核酸(NOI)编码区的转录单位和表达一种α病毒结构蛋白的新插入的转录单位。为了形成RCV，必须通过链转换事件转换成重组复制子中间产物(如上所述)的3’复制识别序列来产生随后的第二个重组事件，因为这是导致用于全部没有插入突变的非结构和结构蛋白编码序列的功能性转录单位停留的唯一位置。因为辅助RNA分子含有26S启动子，理论上，两个这样的重组事件可以形成RCV。精确的重组点不是关键的，因为每个重组插入片段将是独立的转录单位。
使用本发明的无启动子辅助分子产生RCV也还需要最少两个独立的重组事件，但用于获得功能性重组的约束条件要比文献中已知的RNA辅助分子的高得多，并因此产生RCV的理论频率低得多。这是因为，在26S启动子不存在的情况下，大部分重组事件没有导致能表达α病毒结构蛋白的功能性转录单位的形成。因此，使用无启动子辅助分子产生RCV需要产生结构多聚蛋白开放阅读框(即，实质上与产生这些辅助子的野生型病毒中发现的结构相似)，并且这依此需要两个所需的重组事件以特定的次序并在非常特定的核苷酸位置发生。最初的重组事件必须涉及衣壳辅助编码序列，因为其必须相对于糖蛋白位于正确的位置(即，5’)，以切割其自身并产生功能性衣壳蛋白。衣壳辅助子必须通过核苷酸-或近-核苷酸-正确重组事件与复制子载体重组，以实现其中衣壳蛋白从复制子26S启动子表达的重组。即，只有以下情况的重组是功能性的：1)直接在复制子26S启动子的下游，2)与异源GOI的任何剩余部分符合阅读框，和3)不会导致GOI/α病毒衣壳融合蛋白的产生(因此产生失活的α病毒衣壳)。第二种重组事件，涉及α病毒糖蛋白辅助子，除了限于在3’复制识别序列中发生，处于和第一种情况相同的约束条件下。因此，本发明使用无启动子辅助分子生产颗粒的方法在理论上将以比文献中已知辅助分子低得多的频率产生RCV，该频率足够低，以致用本发明的方法没有检测到这样的RCV。
本发明的这种令人惊讶的性质在于以下的事实：之前用于产生装配α病毒颗粒的辅助子/复制子系统的努力依赖于使用强启动子，最常见的是α病毒26S亚基因组启动子，以提供足够的RNA分子，从其翻译用于装配的结构蛋白。与现有文献截然相反，发明人发现了他们可以利用直接翻译成全长分子的RNA辅助分子，而没有文献中已知的在野生型α病毒繁殖和辅助RNA系统中从26S启动子转录较小的信使RNA和通常伴随该过程的信使扩增。然后通过由细胞核糖体机制识别全长RNA5’端的帽来完成本发明的辅助RNA的直接翻译。在真核细胞内，从mRNA启动翻译涉及一系列密切相关的事件，这些事件使核糖体亚基募集至mRNA。在帽依赖性翻译的情况中，存在于mRNA 5’端的甲基-7-G(5’)pppN结构，称为“帽”，由细胞启动因子eIF4F来识别，eIF4F由eIF4E、eIF4G和eIF4A组成。(综述参见Hershey&Merick.基因表 达的翻译控制(Translational Control of Gene Expression)，pp.33-88，Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2000)。
α病毒是正链RNA病毒；当病毒RNA进入细胞时，从该RNA产生非结构α病毒蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)的翻译，并且这些蛋白各自产生全长负链RNA模板。然后将负链RNA复制，以产生全长(“基因组”)正链RNA和在26S启动子启动的较小(“亚基因组”)正链。产生正链时，α病毒的非结构蛋白还给RNA加帽，使其在细胞质是可用的，用于通过核糖体来翻译。“帽”指的是添加至RNA 5’端的甲基化残基。在本发明的特定实施方案中，在体外产生的辅助RNA分子(其是正链RNA)没有加帽。将正链辅助RNA引入还含有复制子RNA的真核细胞中时，最初主要发生了负链合成。在α病毒复制子RNA的存在下，从其合成非结构蛋白，将负链模板(辅助子和复制子两者)复制成然后加帽的正链RNA。在本发明的其他实施方案中，使用本领域公知的和可购得的试剂，例如，来自Promege(Madison，WI)和Ambion(Austin，TX)，将辅助RNA在体外加帽。帽包括，例如，G帽、C帽、A帽、甲基化G(m7G(5’ppp(5’)pppG(5)A))；未甲基化的G(G(5’ppp(5’)A))；ARCA(反义帽类似物，3-O-Me-m7G(5’)pppG(5))；三甲基化(m2，2，7G(5’ppp(5’)pppG))，2-way帽(m7G(5’ppp(5’)m7G))。在一些实施方案中，为了ARP的最大产量，用于生产ARP的本发明的所有辅助子是加帽或未加帽的。使用加帽的辅助RNA记录了最高产量，但在特定的实施方案中，未加帽的辅助RNA可以产生足够高的产量，使得可以避免加帽的成本。还可以的是仅将一个辅助RNA加帽，尽管这有时候也限制了ARP产量。概括而言，发明人已经显示了可以通过着眼于几个变量的常规试验来优化ARP产量，如改变加帽的使用，转录混合物中帽类似物与NTP的比例和用于产生ARP的RNA比例。
因此，在特定的实施方案中，本发明提供了分离的RNA分子，其包括下列、基本上由下列组成和/或由下列组成：a)α病毒5’复制识别序列，其中已经除去至少一个启动密码子；b)编码α病毒结构蛋白的核苷酸序列；和c)α病毒3’复制识别序列，条件是RNA分子不含有指导(b)的核苷酸序列转录的启动子，并且其中α病毒5’和3’复制识别序列在α病毒非结构蛋白的存在下指导完整RNA分子的复制。
各种核酸序列可以满足本发明的核酸构建体中的5’和3’端功能。例如，序列可以包括α病毒5’复制识别序列和其他相邻序列，如以上例举的，用于VEEα病毒。此外，可以在天然5’α病毒中进行删除，以除去特定的二级结构元件，例如，茎-环结构。在特定的实施方案中，可以从本发明的辅助构建体中除去这些茎-环结构中的一个或更多个。或者，可以将非α病毒或其他序列用作该元件，同时保持相似的功能性能力，例如，在辛德毕斯病毒的情况中，用于tRNA天冬酰胺的核苷酸10-75(Schlesinger等，US专利No.5,091,309)。
在一些实施方案中，3’α病毒复制识别序列的长度大约为300个核苷酸，其基本上含有天然α病毒3’复制识别序列。在α病毒中保守的最小3’复制识别序列是19个核苷酸的序列(Hill等，Journal of Virology，2693-2704(1997))。此外，对于辛德毕斯病毒，已经显示出就在3’复制识别序列之后的poly(A)尾必须至少是11-12个残基长，并且3’复制识别序列的3’13nt对于有效的负链RNA合成是关键的(Hardy和Rice，Journal of Virology，79：4630-4639(2005))。因此，用于3’端的序列可以包括完整的α病毒3’复制识别序列，或3’复制识别序列截短的片段，其仍然保持作为识别序列的功能，或长度是25至325个核苷酸的3’端并就在3’复制识别序列之后含有poly(A)尾，最小长度为11-12nt。可以用于该内容中的其他序列实例包括，但不限于，维持相似的允许负链RNA合成启动的功能性能力的非α病毒或其他序列(例如，George等，J.Virol.74：9776-9785(2000)中所述的序列)。
本发明RNA分子中所用的5’和3’复制识别序列可以源自相同的或不同的任意组合的α病毒，并且它们可以与源自相同或不同α病毒的复制子载体以任意组合来使用。
在本发明的特定实施方案中，选择辅助RNA分子的5’和3’序列来最大化辅助子在生产VRP中的性能和最小化产生RCV的理论潜力。特定的实施方案可以包括5’和3’序列的修饰以及从α病毒删除原始5’或3’序列的一部分，在此描述了其实例。存在本发明中所述5’和3’序列的多种组合，并且不同的组合可以用于各个辅助分子。测试在此教导的各种修饰和删除的组合来测定它们在VRP生产中的性能是在本领域技术人员的能力范围内的。
本发明的RNA辅助分子依赖于核糖体从5’帽结构扫描通过5’复制识别序列，以在它们的天然蛋氨酸起始密码子处启动α病毒结构蛋白的翻译。这些区域中其他启动密码子的存在通过允许翻译以在用于结构蛋白的天然起始密码子之外的位点启动而降低了这些辅助子的有效性，因此随着核糖体沿着mRNA移动至α病毒结构蛋白编码区中产生了融合蛋白，或在核糖体随后到达5’复制识别序列中的终止密码子时产生了短的非功能性肽。因此，由于该区域中各种起始和终止密码子的存在，在这些辅助子中完整5’α病毒非编码区(即，从野生型α病毒的5’端直至26S亚基因组启动子的第一个密码子的完整序列)的使用不是关键的。因此，在特定的实施方案中，本发明的RNA分子可以从5’复制识别序列除去一个或更多个启动密码子。一个或更多个的意思是根据本领域的标准方法除去或灭活的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12或更多个启动密码子(即，起始密码子)。
因此，本发明提供了本发明的RNA分子，其中已经从5’复制识别序列除去了一个或更多个启动密码子，例如，通过从AUG突变成GUG。在特定的实施方案中，提供了RNA分子，其中已经从5’复制识别序列除去了所有的启动密码子，例如，通过从AUG突变成GUG。例如，在图1所示的以下位置可以除去任何任意组合的一个或更多个启动密码子，例如，突变的：12、45、148、154、160、258、294、299、331、390、411、441和499。
除去启动密码子的意思是将核苷酸序列进行修饰(例如，根据在此所述的和本领域已知的方法)以删除或改变启动密码子，由此除去或改变该位点的启动或活性(例如，翻译活性)。在一些实施方案中，可以除去大部分的启动密码子，但可能在特定辅助构建体的5’区中只有少数这样的密码子在该情况下通常是由核糖体识别的。因此，对于特定的5’序列，在可能的10-12个密码子中除去2-3个这样的密码子，可能导致表达水平与其中所有10-12个密码子都除去的构建体没有明显差异。在本发明的范围内，存在各种特定的5’序列，源自野生型α病毒序列，用于本发明的辅助分子中时，将导致包装或辅助细胞内的充分表达，以提供可接受的α病毒复制子颗粒产量。
本发明的RNA分子可以包含编码下列的核苷酸序列：1)α病毒衣壳蛋白，2)以任意次序的α病毒E1和E2蛋白，3)以任意次序的α病毒衣壳蛋白和α病毒E1蛋白，4)以任意次序的α病毒衣壳蛋白和α病毒E2蛋白，5)α病毒E2蛋白和/或6)α病毒E 1蛋白。在其他实施方案中，本发明的单个RNA分子可以编码三个α病毒结构蛋白，即，衣壳蛋白、α病毒E1蛋白和α病毒E2蛋白，以任意次序。在一些实施方案中，本发明的RNA分子可以特意排除编码α病毒结构蛋白的核苷酸序列(例如，可以特意排除编码衣壳、α病毒E1蛋白、α病毒E2蛋白或衣壳、E1蛋白和E2蛋白任意组合的核苷酸序列的分子)。
在本发明的各种实施方案中，RNA分子可以含有来自委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒5’端的序列，其包括5’复制识别序列。如Pushko等(1997)中所述的，VEE启动子辅助的辅助子的5’复制识别序列通常由VEE序列的575个核苷酸(nt)组成。头519个是连续的并表示未翻译区(UTR)的44个nt和nsP1的头475个nt(44+475＝519)。剩余的56个nt编码nsP4基因的最后21个nt(包括TAA终止密码子)，最小26S启动子的7个nt(该序列部分与nsP4基因重叠)和VEE结构蛋白基因启动密码子的28个nt前导序列上游(21+7+28＝56)。
因此，由Pushko等(1997)描述的用于启动子辅助的辅助子的完整5’复制识别序列由VEE序列的575个nt组成。本发明的无启动子辅助子编码上述启动子辅助的辅助子中发现的头514个核苷酸(nt)的全部或一部分。除了上述的514个nt，就在结构蛋白编码序列起始位点(DNA中的ATG；RNA中的AUG)的上游还存在编码RsrII限制酶位点的序列(7个nt)。包含这些nt将用于全长衣壳辅助子的5’复制识别序列(dHcap(FL))增加至521个nt(不包括启动密码子的A残基)。
在无启动子衣壳辅助子的一些实例和无启动子糖蛋白辅助子的所有实例中，增加了其他修饰，以就在结构蛋白编码序列启动密码子的上游但在RsrII序列的下游包括近-共有Kozak序列(3个nt(ACC))。由于Kozak修饰，全长糖蛋白辅助子(dHgp(FL))具有524个nt的5’复制识别序列。为了以下描述的目的，将用于无启动子衣壳和糖蛋白辅助子的这些核苷酸序列限定为“全长”(“FL”)5’VEE序列，该序列中的删除形成包括5’复制识别序列的其他实施方案。这些实施方案最小包括VEE核苷酸序列的核苷酸1至141(不包括启动密码子的A残基)。在5’序列的头200个核苷酸内，预测了RNA中有四个茎-环(SL)结构。
可用于本发明的辅助构建体中的5’序列的实施方案可以包括该区域中的1个、2个、3个或全部SL序列。除去SL2区但保留SL1、SL3和SL4结构的实施方案可用于本发明的辅助构建体中。SL结构1和2包含在头145个核苷酸中；SL3和4存在于核苷酸145至200之间。因此，在一些实施方案中，5’复制识别序列包括在长度是524个核苷酸的构建体5’非编码区中(例如，图2中的dHgp(FL))，而在其他实施方案中，5’复制识别序列可以包括在5’非编码区中，任何地方长度从70(例如，含有SL1、SL3和SL4)至524个核苷酸。例如，5’复制识别序列的长度可以是141、144(dH#8)200、203(dH#7)、248、249(dH#6)、309、312(dH#5)、351、354(dH#4)、412、415(dH#3)450、452(dH#2)、499或502(dH#1)个核苷酸，包括在此没有特意指出的70至524之间的任何数字(例如，237、379、444等)。应当注意到精确的核苷酸数和长度在不同的α病毒之间和给定的α病毒的不同株之间稍有不同。基于在此所述的任何α病毒中的相应结构和/或功能和/或二级结构，鉴定在此所述的核苷酸的相应位置，并形成本发明的RNA辅助分子以及从任何α病毒的初级核苷酸序列进行上述修饰，是在本领域技术人员的能力范围之内的。
本发明的RNA辅助分子还包括来自α病毒3’端的序列，在特定的实施方案中，其可以是，但不限于委内瑞拉马脑炎病毒，其包括α病毒3’复制识别序列。就α病毒中的长度和序列而言，所有α病毒的3’端19个核苷酸是高度保守的，而E1糖蛋白的最后一个密码子和高度保守的19个核苷酸之间的3’序列是不太保守的。3’非编码区的长度(包括保守的19个核苷酸，在此为SEQ ID NO：52)可以为25至325个核苷酸。在本发明的特定实施方案中，3’序列在VEE 3’端的73至117个核苷酸之间。在特定的实施方案中，本发明的α病毒3’复制识别序列可以包括以下核苷酸序列，或基本上由以下核苷酸序列组成和/或由以下核苷酸序列组成：SEQ ID NO：55(对于dHcap(FL)至dHcap7；dHcap(FL)mm至dHcap7mm，dHcap(FL)mut1至dHcap7-mut1)，SEQ ID NO：56(对于Hgp(FL)至dHgp7，dHgp(FL)mm至dHgp7-mm，dHgp(FL)mut1至dHgp7-mut1)，SEQ ID NO：57(对于dHcap6mut1(w/stop))，SEQ ID NO：58(对于dHcap7mut1(w/stop)+19nt和dHgp7mut1-S+19nt)和SEQ IDNO：59(dHcap6mut1(W-stop))。
在特定的实施方案中，本发明的α病毒5’复制识别序列可以包括以下核苷酸序列，或基本上由以下核苷酸序列组成和/或由以下核苷酸序列组成：SEQ ID NO：1(dHcap(FL))、SEQ ID NO：2(dHcap1)、SEQ ID NO：3(dHcap2)、SEQ ID NO：4(dHcap3)、SEQ ID NO：5(dHcap4)、SEQ ID NO：6(dHcap5)、SEQ ID NO：7(dHcap6)、SEQ ID NO：8(dHcap7)、EQ ID NO：9(dHcap8)、SEQ ID NO：10(dHgp(FL)、SEQ ID NO：11(dHgp1)、SEQ IDNO：12(dHgp2)、SEQ ID NO：13(dHgp3)、SEQ ID NO：14(dHgp4)、SEQ IDNO：15(dHgp5)、SEQ ID NO：16(dHgp6)、SEQ ID NO：17(dHgp7)、SEQ IDNO：18(dHgp8)、SEQ ID NO：19(dHcap(FL)-mm)、SEQ ID NO：20(dHcap1-mm)、SEQ ID NO：21(dHcap2-mm)、SEQ ID NO：22(dHcap3-mm)、SEQ ID NO：23(dHcap4-mm)、SEQ ID NO：24(dHcap5-mm)、SEQ ID NO：25(dHcap6-mm)、SEQ ID NO：26(dHcap7-mm)、SEQ ID NO：27(dHgp(FL)-mm)、SEQ ID NO：28(dHgp1-mm)、SEQ ID NO：29(dHgp2-mm)、SEQ ID NO：30(dHgp3-mm)、SEQ ID NO：31(dHgp4-mm)、SEQ ID NO：32(dHgp5-mm)、SEQ ID NO：33(dHgp6-mm)、SEQ ID NO：34(dHgp7-mm)、SEQ ID NO：35(dHcap(FL)mut1)、SEQ ID NO：36(dHcap1 mut1)、SEQ ID NO：37(dHcap2mut1)、SEQ ID NO：38(dHcap3 mut1)、SEQ ID NO：39(dHcap4 mut1)、SEQID NO：40(dHcap5 mut1)、SEQ ID NO：41(dHcap6 mut1)、SEQ ID NO：42(dHcap7 mut1)、SEQ ID NO：43(dHgp(FL)mut1)、SEQ ID NO：44(dHgp1mut1)、SEQ ID NO：45(dHgp2 mut1)、SEQ ID NO：46(dHgp3 mut1)、SEQID NO：47(dHgp4 mut1)、SEQ ID NO：48(dHgp5 mut1)、SEQ ID NO：49(dHgp6 mut1)、SEQ ID NO：50(dHgp7 mut1)、SEQ ID NO：51(dHcap6-mut1-dSL2)、SEQ ID NO：52(dHgp6-mut1-dSL2(-S))；SEQ IDNO：53(dHcapU)和SEQ ID NO：54(dHgpU)。括号中给出了为其已经合成这些5’序列实例的特定辅助子。由于使用其他的核苷酸来提供近-最佳Kozak共有序列以增强结构蛋白编码序列在一些辅助构建体中的翻译，序列长度可以略有不同。(用于结构蛋白编码序列的编码区的ATG(RNA中的AUG)不包括在这些5’序列中)。包含上述核苷酸序列的本发明的RNA分子可以用于本发明的方法中，以任意组合、任意次序和/或任意数量用于α病毒复制颗粒的生产。
本发明另外提供了含有本发明RNA分子的载体和/或核酸构建体。此外还提供了含有本发明的一个或更多个RNA分子和一个或更多个α病毒复制子载体的细胞。一个或更多个的意思是一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个等。本发明的细胞是其中可以表达编码α病毒蛋白的核酸构建体的任何细胞。本发明的细胞实例包括，但不限于，Vero、幼仓鼠肾(BHK)、293、293T/17(ATCC登录号CRL-11268)、鸡胚成纤维细胞(CEF)、UMNSAH/DF-1(ATCC登录号CRL-12203)、PERC6和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在此还提供了制备α病毒复制子颗粒的方法，其包括将本发明的一个或更多个RNA分子引入细胞中，由此RNA分子的组合连同α病毒复制子RNA在由此产生α病毒复制子颗粒的条件下编码生产α病毒复制子颗粒需要的所有α病毒结构蛋白。在本发明的一些实施方案中，α病毒颗粒模拟天然α病毒的结构构成，其中用衣壳蛋白覆盖复制子RNA，然后用含有α病毒糖蛋白的细胞膜包被。在这样的实施方案中，α病毒结构蛋白全部来自相同的α病毒。在可替换的实施方案中，α病毒蛋白可以来自不同的α病毒，只要这些不同的蛋白在颗粒装配过程中彼此“识别”或它们是修饰的(如文献中所述的)，使得它们能够彼此识别。
在本发明方法的一些实施方案中，将本发明的两个RNA分子引入本发明的细胞中，其中两个RNA分子以由此在包装细胞中产生生产α病毒复制子颗粒所需的全部结构蛋白的组合编码不同的α病毒结构蛋白。因此，本发明提供了一种方法，其中将两个RNA分子引入细胞中并且其中两个RNA中的第一个RNA分子编码一个或更多个α病毒结构蛋白但不是全部结构蛋白，而两个RNA分子中的第二个RNA分子编码不是由第一个RNA分子编码的一个或更多个α病毒结构蛋白。
还提供了一种方法，其中将本发明的三个RNA分子引入细胞中，其中三个RNA分子以由此在细胞中产生生产α病毒复制子颗粒所需的全部结构蛋白的组合各自编码不同的α病毒结构蛋白。因此，提供了一种方法，其中将本发明的三个RNA分子引入细胞中，其中三个RNA分子中的第一个RNA分子编码一个或更多个α病毒结构蛋白但不是全部结构蛋白，而三个RNA分子中的第二个RNA分子编码一个或更多个不同于由第一个RNA分子编码的α病毒结构蛋白的α病毒结构蛋白，并且三个RNA分子中的第三个RNA分子编码一个或更多个不同于由第一个RNA分子和第二个RNA分子编码的α病毒结构蛋白的α病毒结构蛋白。例如，在一个实施方案中，第一个RNA分子可以编码α病毒衣壳蛋白，第二个RNA分子可以编码α病毒糖蛋白E1和第三个RNA分子可以编码α病毒糖蛋白E2。
在一些实施方案中，通过由α病毒结构蛋白包装的复制子RNA编码α病毒结构蛋白中的一个或更多个，但不是全部。例如，在此要求的α病毒复制子颗粒制备方法中所用的重组RNA可以包括作为目标核酸和/或除了目标核酸以外的编码一个α病毒结构蛋白或超过一个α病毒结构蛋白的核苷酸序列。因此，在特定的实施方案中，复制子RNA编码一个α病毒结构蛋白或超过一个α病毒结构蛋白。可以将该复制子RNA和本发明的一个或更多个RNA辅助分子一起引入细胞群中，使得复制子RNA和RNA辅助分子产生全部的α病毒结构蛋白，并且在所述细胞中将RNA复制子包装至颗粒中。
在更多的实施方案中，提供了制备α病毒复制子颗粒的方法，其包括将下列引入细胞中：a)α病毒复制子RNA；b)本发明的一个或更多个RNA分子；和c)一个或更多个启动子辅助的α病毒辅助构建体，由此(b)的RNA分子和(c)的辅助构建体的组合在由此产生α病毒复制子颗粒的条件下编码生产α病毒复制子颗粒需要的全部α病毒结构蛋白。
因此，在本发明的其他实施方案中，“启动子辅助的辅助构建体”，即，在启动子例如26S启动子的指导下表达一个或更多个α病毒结构蛋白的重组DNA或RNA分子，结合本发明的辅助分子来使用。在一组RNA分子的实施方案中，“启动子辅助的辅助构建体”包括第一个核酸序列，其编码(i)5’α病毒复制识别序列，(ii)转录启动子，(iii)编码一个或更多个α病毒结构蛋白的核酸序列和(iv)3’α病毒复制识别序列。
在另一组RNA分子的实施方案中，“启动子辅助的辅助构建体”是重组辅助核酸，如WO2004/085660中所述的(2004年10月7日公开，在此引入作为参考)，其包括：编码5’α病毒复制识别序列的核酸序列，就在IRES元件上游的α病毒亚基因组启动子，至少一个编码α病毒结构蛋白的核酸和编码3’α病毒复制识别序列的核酸。在更多的实施方案中，这些启动子辅助的辅助构建体可以包含位于就在亚基因组启动子的下游和就在IRES元件上游的间隔核酸。间隔核酸可以包含任何随机或特定的非编码核酸序列或由任何随机或特定的非编码核酸序列组成，该序列足够长以防止至少一些从信使RNA的5’帽的翻译，并且在一些实施方案中，防止全部翻译，使得结构蛋白的翻译然后直接受IRES的指导，部分或全部。或者，间隔核酸可以是给予核酸足够的二级结构以防止至少一些和可能全部的从信使RNA的5’帽的翻译活性的长度和序列结构。本发明中所用的启动子辅助的辅助构建体还可以是DNA分子，其可以稳定地整合至辅助细胞的基因组中，或从没有明显整合的游离基因(例如，质粒)瞬时表达。本发明的DNA分子可以是任何DNA载体，包括但不限于，非整合DNA载体，如质粒，或病毒载体。
在本发明使用如在此所述的“辅助细胞”或“包装细胞”并包括本发明的无启动子RNA分子的实施方案中，辅助细胞可以进一步包括任意组合的启动子辅助的辅助构建体(RNA和/或DNA)，使得辅助细胞包括足以产生本发明α病毒复制子颗粒的编码α病毒结构蛋白的核苷酸序列的组合。在特定的实施方案中，E1和E2糖蛋白由第一个辅助构建体编码，而衣壳蛋白由第二个辅助构建体编码。在另一个实施方案中，E1糖蛋白、E2糖蛋白和衣壳蛋白各自由分开的辅助构建体编码(例如，第一个、第二个和第三个)。在其他实施方案中，衣壳蛋白和糖蛋白E1或E2由第一个辅助构建体编码，而剩余的未包括在第一个辅助构建体中的糖蛋白E1或E2由第二个具有或不具有衣壳编码序列的辅助构建体编码。在其他实施方案中，α病毒糖蛋白E1和E2以及衣壳蛋白可以全部在一个辅助构建体上编码，以任何次序和/或任何数量。在本发明包括的实施方案中，还可能的是通过超过一个的辅助构建体来表达给定的α病毒结构蛋白。可以将本发明的无启动子RNA辅助子，任选结合在此所述的其他已知辅助子，以任意组合、任何次序和/或任何数量引入α病毒允许细胞中。
在本发明的一些实施方案中(例如，用于编码无启动子RNA分子的DNA构建体或启动子辅助的RNA辅助构建体)，使用指导从DNA转录RNA的启动子，即，DNA依赖性RNA聚合酶，在体外转录反应中合成RNA，并且适于该用途的特定启动子包括，但不限于，SP6、T7和T3RNA聚合酶启动子。
在本发明的所有实施方案中，考虑了至少一个α病毒结构和/或非结构蛋白由无启动子辅助分子和/或启动子辅助的辅助构建体和/或复制子载体来编码，以及复制子核酸的非翻译区可以含有一个或更多个减毒突变，如在此所述的，以任意组合。
本发明进一步提供了α病毒复制子颗粒群，其中该群在每108个α病毒复制颗粒中含有少于一个可复制α病毒颗粒。在进一步的实施方案中，该群在每109、1010、1011、1012或1013个α病毒复制子颗粒中含有少于一个可复制α病毒颗粒。本发明另外提供了α病毒复制子颗粒群，其中该群不含有可检测的可复制病毒颗粒，如通过根据本领域公知的方法在培养物中的允许细胞上的传代所测定。
在此还提供了一组α病毒复制颗粒，其中该群在每108、109、1010、1011、1012或1013个α病毒复制子颗粒中不含有可检测的或含有少于一个的可复制α病毒颗粒，如通过在培养物中的允许细胞上的传代所测定，其中α病毒复制子颗粒在α病毒结构蛋白或α病毒非结构蛋白或α病毒结构蛋白和α病毒非结构蛋白两者中含有一个或更多个减毒突变。此外，提供了α病毒复制子颗粒群，其中该群不含有可检测的可复制病毒颗粒，如通过在培养物中的允许细胞上的传代所测定，其中α病毒复制子颗粒在α病毒结构蛋白或α病毒非结构蛋白或α病毒结构蛋白和α病毒非结构蛋白两者中含有一个或更多个减毒突变。
发明人已经证实了尽管缺少可识别的“包装信号”，本发明的辅助RNA以及文献中描述的辅助RNA在培养的细胞中通过α病毒结构蛋白得到包装，有时候以明显高于文献中报道的频率。因此，通过该群中颗粒子集的存在，将本发明的α病毒复制子颗粒群与文献中描述的那些颗粒区分开来，该群中包装了本发明的新辅助分子。
术语“α病毒复制子颗粒”、“ARP”、“病毒复制子颗粒”或“重组α病毒颗粒”在此可互换使用，意思是引入了表达一个或更多个异源RNA序列的α病毒复制子RNA的病毒粒子样结构复合物。通常，病毒粒子样结构复合物包括一个或更多个包埋在脂质包膜中的α病毒结构蛋白，脂质包膜包裹核壳，其依次包裹RNA。脂质包膜通常源自产生颗粒的细胞的质膜。在特定的实施方案中，α病毒复制子颗粒由核壳结构围绕，核壳结构由α病毒衣壳蛋白组成，并且α病毒糖蛋白包埋在细胞衍生的脂质包膜中。结构蛋白和复制子RNA可以源自相同或不同的α病毒。在特定的实施方案中，复制子RNA源自VEE，而结构蛋白源自辛德毕斯病毒(参见，例如，Dubensky等，U.S.专利No.6,376,236)。α病毒复制子颗粒是传染性的，但是传播缺陷的，即，在编码α病毒结构蛋白的辅助核酸不存在的情况下，复制子RNA不能在颗粒最初感染的细胞外传代。
术语“α病毒RNA复制子”、“α病毒复制子RNA”、“α病毒RNA载体复制子”和“载体复制子RNA”可互换使用，其指的是表达非结构蛋白基因的RNA分子，使得其可以指导其自身的复制(扩增)，并最少包括5’和3’α病毒复制识别序列(其可以是最小的序列，如上所述，但或者可以是来自α病毒的完整区域)，α病毒非结构蛋白的编码序列和多腺苷酸化通道。其可以另外含有启动子和/或IRES。还可以将其工程化来表达α病毒结构蛋白。Johnson等和Polo等描述了各种用于这样的α病毒RNA复制子的构建体，并且在此将这样的构建体引入作为参考。在α病毒复制子RNA的一个实施方案中，将α病毒非结构蛋白分成两个分开的翻译单位，如U.S.专利公开2003-0119182-A1中所述的，在此引入作为参考。
没有异源序列的α病毒复制子RNA，即，空复制子，可以用于α病毒复制子颗粒中来生产佐剂组合物。或者，α病毒复制子RNA可以表达编码α病毒结构蛋白的核酸和/或其他异源核酸序列，后一种情况可以选自各种源自病毒、原核生物和/或真核生物的序列。异源序列种类的实例包括，但不限于，免疫原(包括天然的、修饰的或合成的抗原蛋白、肽、免疫原性片段或抗原决定部位)、细胞因子、毒素、治疗蛋白、酶、反义序列和免疫应答调节剂。如果合适并且是特定应用所需，然后将转录的mRNA翻译，即，合成蛋白质或产生功能性RNA。这些mRNA在真核细胞内“加帽”，即，在mRNA的5’端存在甲基-7-鸟苷(5’)pppN结构(“帽”或“5’帽”)，并且该帽通过从mRNA合成蛋白的翻译启动因子来识别。因此，26S启动子指导转录，而“帽”提供了用于翻译的启动信号。
在一些实施方案中，复制子RNA可以缺乏编码任何α病毒结构蛋白的核酸。在其他实施方案中，α病毒复制RNA可以包含编码一个或两个α病毒结构蛋白的核酸，但是复制子RNA不含有编码全部α病毒结构蛋白的核酸。因此，本发明所得到的α病毒复制子颗粒是传播缺陷的，因为复制子RNA没有编码包被复制子RNA和装配传染性病毒粒子所需的全部结构蛋白。
所要求的本发明中所用的α病毒RNA复制子的特定实施方案可以含有一个或更多个减毒突变，如在此详细描述的。减弱核苷酸置换的实例包括在此所述的在VEE 5’端中的核苷酸3处的突变以及α病毒S.A.AR86中的nsP1氨基酸位置，nsP2氨基酸位置96或nsP2氨基酸位置372处的突变。
本发明的α病毒复制子颗粒可以含有来自任何α病毒的复制子RNA。此外，本发明的α病毒复制子颗粒可以含有来自本发明任一种α病毒的α病毒结构蛋白。因此，复制子颗粒可以由来自相同的α病毒或来自不同α病毒的复制子RNA和结构蛋白构成，后一种情况将是嵌合α病毒复制子颗粒(例如，包含基于VEE病毒的复制子RNA和辛德毕斯病毒结构蛋白的颗粒)。
在本发明的特定实施方案中，本发明的α病毒结构蛋白可以是辛德毕斯病毒结构蛋白、SFV结构蛋白、VEE结构蛋白、罗斯河病毒结构蛋白、EEE结构蛋白和/或WEE结构蛋白。这些可以彼此任意组合并可以结合非结构蛋白和其他α病毒序列而存在，其他序列如5’α病毒复制识别序列，α病毒亚基因组启动子和3’α病毒复制识别序列，来自这些或其他α病毒中的任何一种，以生产本发明的嵌合重组α病毒复制子颗粒和/或嵌合重组核酸。
在本发明的一些实施方案中，本发明可以包括含有一个或更多个减毒突变的α病毒核酸、α病毒蛋白、α病毒复制子RNA和/或α病毒复制子颗粒，减毒突变限定为一个或更多个核苷酸的核苷酸删除、添加和/或置换，或包含重排或嵌合构建的突变，其导致与合适的野生型α病毒相比，含有突变的活病毒失去了毒力。
合适的减毒突变将取决于所用的α病毒，并且是本领域技术人员已知的。示例性减毒突变包括，但不限于，公开于Johnson等的U.S.专利No.5,505,947，Johnson等的U.S.专利No.5,185,440，Davis等的U.S.专利No.5,643,576，Johnson等的U.S.专利No.5,792,462；6,156,558和5,639,650中所述的那些，在此将每一篇的公开内容全部引入作为参考。
用于VEE E1糖蛋白的特定减毒突变可以包括在E1氨基酸位置81、272或253任一处的减毒突变。从VEE-3042突变体制得的α病毒复制子颗粒在E1-81处含有异亮氨酸置换，而从VEE-3040突变体制得的病毒复制子颗粒在E1-253处含有减毒突变。用于VEE E2糖蛋白的特定减毒突变可以包括在E2氨基酸位置76、120或209任一处的减毒突变。从VEE-3014突变体制得的α病毒复制子颗粒在E1-272和E2-209处含有减毒突变(参见U.S.专利No.5,792,492)。用于VEE E3糖蛋白的特定减毒突变包括由E3氨基酸56-59的删除构成的减毒突变。从VEE-3526突变体制得的病毒复制子颗粒在E3中含有该删除(aa56-59)以及在E1-253处的第二个减毒突变。用于S.A.AR86E2糖蛋白的特定减毒突变包括在E2氨基酸位置304、314、372或376任一处的减毒突变。或者，减毒突变可以是E2糖蛋白中的氨基酸的置换、删除或插入，例如，在以下氨基酸位置的任一处或更多处，任意组合：158、159、160、161和162(参见Polo等，PCT公开No.WO00/61772)。或者，本发明的RNA分子可以源自TC83，VEE的疫苗株(参见WO2005/113782，在此将其引入作为参考)。
本发明的另一种减毒突变可以是在VEE基因组RNA的核苷酸3处的减毒突变，即，5’甲基化帽之后的第三个核苷酸(参见，例如，U.S.专利No.5,643,576，描述了在nt3的G→C突变)。该突变，位于病毒或复制子的非编码序列中，在一些实施方案中，可以是G→A或G→U突变。当α病毒结构和/或非结构蛋白来自S.A.AR86时，文献中已经描述了结构和非结构蛋白中的示例性减毒突变(参见，例如，U.S.专利No.5,639,650和U.S.专利No.6,982,987，在此将其公开内容全部引入作为参考)。
本发明的α病毒可以是辛德毕斯病毒株(例如，TR339)、VEE(例如，在甲基化帽或TC83后的基因组RNA的核苷酸3处具有突变)、S.A.AR86病毒、Girdwood S.A.病毒、Ockelbo病毒和/或其嵌合病毒。对于各种α病毒的完整基因组序列以及各种结构和非结构蛋白的序列在文献中可获得，并包括：辛德毕斯病毒基因组序列(GenBank登录号No.J02363、NCBI登录号No.NC_001547)、S.A.AR86基因组序列(GenBank登录号No.U38305)、VEE基因组序列(GenBank登录号No.L04653、NCBI登录号No.NC_001449)、VEE的TC-83疫苗株(KinneyRM等(1989)，Virology 170：19-30；结合关注RM等(1993)，J.Virol.67(3)：1269-1277)；Girdwood S.A基因组序列(GenBank登录号No.U38304)，西门利克森林病毒基因组序列(GenBank登录号No.X04129，NCBI登录号No.NC_003215)和TR339基因组序列(Klimstra等，(1988)，J.Virol.72：7357；McKnight等，(1996)J.Virol.70：1981)。
根据在此公开的方法并结合本领域技术人员已知的技术来制备α病毒复制子颗粒。这些方法包括首先将选定的辅助子和α病毒复制子RNA引入α病毒允许细胞群中，然后在本领域公知的允许产生α病毒复制子颗粒的条件下培养细胞。将辅助子和α病毒复制子RNA引入辅助细胞群的步骤可以通过任何方式来进行，如在此公开的和本领域普通技术人员已知的。
根据例如U.S.专利No.7,078,218中所述的方法从辅助或包装细胞中收集α病毒复制子颗粒制剂，在此将该专利内容全部引入作为参考。或者，可以使用本领域技术人员已知的其他技术(例如，U.S.专利No.5,492,462和6,156,558)从包装细胞收集它们。根据在此所述的和文献中已知的方法来评价这些制剂中可复制病毒(RCV)的存在。本发明的制剂不含有可检测的RCV，如通过在培养物中的α病毒允许细胞上的传代所测定的。
在一些实施方案中，可以使用本发明在对象中包装编码免疫多肽的α病毒RNA复制子(例如，用于疫苗接种)，用于免疫治疗(例如，治疗患有癌症或肿瘤的对象)或免疫调节因子(例如，用于辅佐ARP或其他疫苗形态)。本发明提供了引发或增强对象中免疫应答的方法，包括将有效量的通过本发明的辅助构建体包装至颗粒中的核酸给予对象。
如在此所用的，“引发免疫应答”和“使对象免疫”包括在对象中产生对本发明的蛋白和/或多肽(例如，免疫原、抗原、免疫性肽和/或一个或更多个抗原决定部位)的体液免疫和/或细胞免疫应答。“体液”免疫应答，因为该术语是本领域公知的，指的是包括抗体的免疫应答，而“细胞”免疫应答，因为该术语是本领域公知的，指的是包括T-淋巴细胞和其他白血球的免疫应答，尤其是由HLA-限制的细胞毒性T细胞(即，“CTL”)引起的免疫原特异性应答。
还考虑了本发明的核酸、颗粒、制剂和药物组合物可以用于将目标NOI传送至细胞的方法中，该细胞可以是对象中的细胞。因此，本发明提供了将异源核酸传送至细胞的方法，其包括将有效量的用本发明的辅助构建体包装的颗粒、制剂和/或组合物引入细胞中。还提供了将异源核酸引入对象中细胞中的方法，其包括将有效量的用本发明的辅助构建体包装的颗粒、制剂和/或组合物引入细胞中。细胞可以是能够吸收并表达外源核酸的任何细胞。在由此表达异源核酸来产生由异源核酸编码的蛋白、肽或其他编码序列产物(例如，功能性RNA序列)的条件下培养细胞。可以根据公知的用于免疫和/或基因治疗的方案，将这样的方法用来将治疗作用给予本发明的细胞和/或对象。
本发明的“对象”包括，但不限于，温血动物，例如，人、非人灵长类动物、马、奶牛、猫、狗、猪、大鼠和小数。
本发明进一步提供了在药物学上可接受的载体中含有本发明的颗粒和/或制剂的组合物(例如，药物组合物)。“药物学上可接受的”意思是在生物学上或其他不是不利的材料，即，可以与选定的颗粒和/或其制剂一起为对象给药的材料，而没有引起实质性的有害生物作用或以有害方式影响组合物中含有的任何其他成分。药物学上可接受的载体适于给药或传送至人和本发明的其他对象。自然选择载体以最小化活性成分的任何降解和最小化对象中的任何副作用，这是本领域技术人员公知的(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Science；最近的一版)。本发明的药物制剂，如疫苗或其他免疫原性组合物，含有致免疫量的使用本发明的辅助构建体产生的感染性的、传播缺陷的α病毒复制子颗粒，结合药物学上可接受的载体。示例性药物学上可接受的载体包括，但不限于，无菌无热原水和无菌无热原生理盐水溶液。
“致免疫量”是本发明制剂中足以在给予或传送了颗粒制剂的对象中引起免疫应答的感染性α病毒颗粒的含量。认为约104至约109，尤其是106至108传染单位或“IU”/剂是合适的，如通过在此所述的测试所测定的，该含量取决于待治疗对象的年龄和物种。可以通过任何合适的方式来给药，如腹膜内、肌内、鼻内、阴道内、静脉内、皮内(例如，通过基因枪)、直肠内和/或皮下。可以通过皮肤多次划破法和/或通过贴剂或液体经皮来给药在此的组合物。可以以在一段时间内释放组合物的生物可降解材料的形式在皮下来传送组合物。
如在此所用的，“有效量”指的是本发明的群体或组合物或制剂足以产生所需效果的含量，该效果可以是治疗效果。有效量将随着对象的年龄、一般状况、待治疗病症的严重程度、给药的特定药剂、治疗的持续时间、任何同时进行的治疗的性质、所用的药物学上可接受的载体以及本领域技术人员知识和专长范围内的类似因素而改变。按照需要，可以通过本领域技术人员参考有关书本和文献和/或通过使用常规实验来确定任何个体病例中的“有效量”。(参见，例如，Remington，The ScienceAnd Practice of Pharmacy(第20版，2000))。
或者，本发明的药物制剂适于为对象给药的粘膜(例如，通过鼻内给药、口腔给药和/或吸入)。可以将制剂方便地制成单位剂型并可以通过本领域公知的任一种方法来制备。
此外，本发明的组合物可以用于感染或转染至树突细胞中，该细胞是根据本领域公知的方法从对象的细胞分离或生长得到的，或转染至来自对象的分散的外周血单核细胞(PBMC)或其各种细胞亚级分上。
如果使用ex vivo方法，可以根据本领域公知的标准实验方案，将细胞或组织取出并在体外维持，同时将本发明的组合物引入细胞或组织中。
可以通过本领域已知的任何方式来配制含有一组本发明颗粒(将组合物给药于人或动物时，其指导目标核酸序列的表达)的致免疫组合物。通常将这样的组合物，尤其是疫苗，制成可注射的，如液体溶液或悬浮液。也可以制备在注射之前适于溶解于或悬浮于液体中的固体形式。冻干制剂也是合适的。
通常将活性致免疫成分(例如，α病毒复制子颗粒)与药物学上可接受的和/或与活性成分相容的赋形剂和/或载体混合。合适的赋形剂包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合，以及稳定剂，例如，HAS或其他合适的蛋白质和还原糖。
此外，如果需要，疫苗可以含有少量辅助物质，如湿润剂和/或乳化剂，pH缓冲剂和/或提高疫苗功效的佐剂。有效佐剂的实例包括但不限于：QS-21、弗氏佐剂(完全的和不完全的)，铝盐(明矾)，磷酸铝，氢氧化铝；N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)；N-乙酰-nor-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称为nor-MDP)；N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-丙三氧基-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(CGP19835A，称为MTP-PE)；和RIBI，其在2％角鲨烯/吐温80乳液中含有从细菌提取的三种成分，单磷酰基脂A，海藻糖二梅菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
佐剂的其他实例包括，但不限于，水包油型乳液制剂，免疫调节剂，如细菌细胞壁成分或合成的分子，或寡核苷酸(例如，CpG)和核酸聚合物(双链和单链的RNA和DNA)，其可以结合可选择的主链部分，例如，聚乙烯聚合物。
可以通过测量针对α病毒复制子颗粒的致免疫产物的抗体或细胞毒性T-细胞的含量来测定佐剂的功效，该致免疫产物是由给予还含有佐剂或佐剂组合物的疫苗制剂中的含颗粒组合物引起的。还可以使用本领域已知的其他制剂和给药方式。
可以将佐剂结合本发明的组合物或结合可以结合本发明的组合物使用的其他疫苗制剂。
本发明的组合物还可以包括其他药剂、药物、载体和稀释剂。
可以将本发明的组合物优化并结合其他疫苗接种方案来提供最宽的(即，覆盖免疫应答的所有特征，包括以上所述的那些特征)可能的细胞和体液应答。在特定的实施方案中，这可以包括使用异源初免-加强免疫(prime-boost)策略，其中将本发明的组合物结合含有一种或更多种下列的组合物来使用：源自病原体或肿瘤的免疫原，重组免疫原，裸露核酸，用含脂质部分配制的核酸，非α病毒载体(包括但不限于痘病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，疱疹病毒载体，水泡性口膜炎病毒载体，副粘病毒载体，细小病毒载体，乳头状病毒载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体)和其他α病毒载体。示例性α病毒载体可以是含有复制子的颗粒，基于DNA的含复制子载体(有时候称为“ELVIS”系统，参见，例如，U.S.专利No.5,814,482)和/或裸露RNA载体。
以与剂型相容的方式并且以预防和/或治疗有效的含量来给药本发明的含致免疫(或另外生物学活性的)α病毒颗粒的制剂和组合物。待给药的含量，在一个剂量中通常为约104至约109感染单位/mL，这取决于待治疗的对象，给药或传送颗粒的途径，表达产物的免疫原性，所需的效应免疫应答的类型和所需的保护程度。在一些实施方案中，约106、107和108I.U.的剂量在人对象中特别有效。所需的待给药或传送的活性成分的有效量可以取决于医师、兽医或其他健康从业者的判断，并且对于给定的对象是特定的，但这样的决定在这样的从业者的技术范围内。
可以以单剂量或多剂量进度表来给予本发明的组合物和制剂。多剂量进度表是如下的一种情况：其中给药的主要过程可以包括1至10或更多的分开剂量，接着按照维持和或加强所需效果(例如，免疫应答)的需要在随后的时间间隔下给药其他剂量，例如，每周或1至4个月给药第二个剂量，并且如果需要，几个月(例如，4或6个月)/年后给予随后的剂量。
可以根据公知的实验方案来测定本发明治疗方法的功效，用于测定本发明病症治疗的成果。治疗功效的测定，包括但不限于，全部存活，无疾病存活，症状、进展时间和/或生活质量的改善等，如本领域公知的。
“在治疗”或“治疗中”或“治疗”指的是给予患有失调、疾病或病症的对象调节效果的任何类型的作用，其例如可以是有益的效果，包括对象病症的改善(例如，一个或更多个症状)，病症进展的延迟或减轻，失调、疾病或病症发作的防止或延迟，和/或失调、疾病或病症的任一个临床参数的变化等，如本领域公知的。
可以理解只是通过说明给出了之前的详述，并且可以在其中进行改变和变化而没有脱离本发明的精神和范围。
实施例
实施例1：dHcap和dHgp辅助子的构建
设计了引物(衣壳F(SEQ ID NO：98)，GP F(SEQ ID NO：60)和13-101.pr4(SEQ ID NO：6)(表1)，用以从VEE辅助质粒(对于衣壳辅助子，称为“13.2.2”，对于糖蛋白辅助子，称为“13.4.6”)扩增衣壳和糖蛋白(GP)基因，这描述于U.S.专利No.5,792,462，Pushko等，1997(Virology 239：389-401)和PCT公开WO02/03917(Olmsted等)中。这些引物各自提供了RsrII限制位点，并且还结合衣壳或糖蛋白编码序列的起点。以上引用的参考文献中所述的DNA质粒是获得结构蛋白编码片段的方便来源，例如，通过PCR扩增。或者，可以从VEE或其减毒变体的全长克隆获得这些编码片段(参见，U.S.专利No.5,185,440；U.S.专利5,505,947)。
使用这些引物的扩增形成具有以下元件的片段，从PCR产物的5’至3’端列出：5’-RsrII限制位点，VEE结构蛋白编码序列ORF，3’UTR，SphI限制位点-3’。然后用RsrII和SphI限制酶消化PCR产物并连接空VEE复制子载体，如U.S.专利No.5,792,462，Pushko等，1997(Virology239：389-401)和PCT公开WO02/03917(Olmsted等)中所述的。该复制子RNA含有VEE非结构基因和26S亚基因组RNA启动子的单个拷贝，接着是多克隆位点(MCS)。在疫苗构建体中，将一个或更多个编码免疫原的序列插入该克隆位点。用RsrII和SphI(除去大部分nsP1和全部nsPs2-4)消化该载体，并在连接时，产生了包括完整α病毒5’和3’端的辅助子，即，“全长”端。因此，将这两个辅助子称为dHcap(FL)和dHgp(FL)，并且它们具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：10各自的5’序列以及SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56各自的3’序列(图1)。
随后，在存在于dHcap(FL)和dHgp(FL)辅助子中的522nt 5’端中制得八个大约每个50nt的连续删除(图2)。以两个步骤来进行该程序。首先，设计八个与13.2.2和13.4.6辅助子(如上所述)的5’端直至位置502互补的反向引物(dHelp1-8R，SEQ ID NO：63-70)，并且将每个工程化来另外含有RsrII限制位点(表1)。设计了正向引物(3-16.1.1(SEQ ID NO：62)，表1)，然后将其与任一个反向引物混合，扩增具有以下元件的片段(5’至3’列出)：5’-XbaI限制位点，T7启动子，5’截短端，RsrII限制位点-3’。其次，将扩增的5’截短端片段克隆至用XbaI和RsrII线性化的dHcap(FL)和dHgp(FL)辅助子中。这产生了八组5’截短端辅助子构建体，称为dHcap1-8和dHgp1-8，其各自具有SEQ IDNO：2-9和SEQ ID NO：11-18的5’序列。在此作为SEQ ID NO：55提供了dHcap系列每个成员的3’序列和在此作为SEQ ID NO：56提供了dHgp系列每个成员的3’序列。
实施例2.无启动子辅助表达盒的表达分析方法
为了测定在此所述的Δ26S辅助构造表达结构蛋白有多好，将每个辅助子连同上述的VEE复制子载体一起电穿孔至Vero细胞中。为了证明本发明新的无启动子结构蛋白表达盒的能力，通过将GFP或肉毒杆菌神经毒素编码序列插入VEE复制子载体的克隆位点中。使用在此所述的无启动子结构蛋白表达盒的各种组合进行的从颗粒表达这些编码序列证明了这些盒的实用性和新颖性。
根据制造商的程序使用RiboMAX T7
Figure GPA00001027335700281
转录试剂盒(PromegaCorporation，Madison，WI)通过失控转录从每个辅助子和复制子载体转录RNA。在电穿孔之前，通过硅基色谱分离来纯化辅助子和复制子RNA。混合三十微克(30μg)的每种辅助子和复制子RNA，并电穿孔至3-5×107个Vero细胞中。将电穿孔的细胞在培养基中稀释并接种于25cm2烧瓶或96孔平板中。然后将电穿孔的细胞在37℃下培养16-24hr。
A.IFA分析
用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)将接种于96孔平板中的电穿孔细胞洗涤一次，然后用丙酮∶甲醇(1∶1)在室温下固定五分钟。然后使用结构蛋白特异性鼠抗体来分析细胞的VEE衣壳或GP蛋白的表达。将一抗稀释于PBS∶FBS(1∶1)中，并将100μl加入每个孔中。将平板在37℃下培养30min，用150μl PBS洗涤三次，然后用Alexa Fluor488山羊抗鼠二抗(Invitrogen，Carlsbad，CA)在37℃下培养30min。培养后，如上所述再次将细胞洗涤，并在通过紫外线荧光显微镜(Nikon Eclipse TE300)观察之前，将100μl终体积的PBS加入每个孔中。
B.Northern分析
用PBS洗涤接种于25cm2烧瓶中的电穿孔细胞，然后按照制造商建议的实验方案使用RNAwiz
Figure GPA00001027335700282
分离试剂(Ambion，Austin，TX)提取总细胞RNA。通过分光光度测定法来测定RNA浓度。将五微克(5μg)的每种样品通过1％乙二醛琼脂糖凝胶来电泳，RNA被动转移至BrightStar
Figure GPA00001027335700283
(Ambion)膜。按照制造商建议的实验方案使用BrightStar
Figure GPA00001027335700284
试剂盒(Ambion)，用VEE 3’复制识别序列正链的特异性生物素化DNA寡聚物来进行Northern分析。通过将处理过的膜暴露于胶片来检测化学发光。
C.dHcap(FL)和dHgp(FL)表达的分析
为了证明全长Δ26S辅助子(dHcap(FL)和dHgp(FL))能够复制并表达蛋白，将这些辅助RNA连同复制子载体一起电穿孔至细胞中，需要复制子载体来提供促进辅助RNA复制的α病毒非结构蛋白。用30或60μg的dHcap(FL)和dHgp(FL)辅助RNA结合30μg的复制子RNA将Vero细胞电穿孔。如上所述，将电穿孔的细胞进行处理，用于IFA、Western印迹和Northern分析。
实施例3：全长的和截短的Δ26S辅助子的表达分析
dHcap(FL)和dHgp(FL)辅助子表达了蛋白，如通过IFA和Western印迹所测定的，并且得到了有效地复制，如通过Northern印迹所证明的。
分析用于衣壳和GP的完整组的截短Δ26S复制子(删除1-8)，通过IFA分析蛋白表达，通过Northern印迹测定各自的表达和复制有多好。将每个dHcap辅助RNA结合VEE复制子RNA和13.4.6糖蛋白辅助RNA，并将三个RNA电穿孔至Vero细胞中。如上所述进行Northern分析和IFA。使用衣壳特异性抗体的IFA的结果显示于表2中。所有dHcap辅助子对于通过IFA测定的衣壳表达都是阳性的，尽管dHcap8辅助子只是弱阳性的。
从电穿孔细胞提取的RNA的Northern分析表明所有截短的衣壳Δ26S辅助子复制良好，除了dHcap8。
以相似的方式检测dHgp辅助子，除了该实验中不包括13.2.2衣壳辅助子。将每个dHgp辅助子结合VEE复制子RNA，电穿孔至细胞中，并如上所述产生用于IFA和Northern分析的样品。抗-GP IFA的结果显示于表3中。与dHcap辅助子相似，所有dHgp辅助子是阳性的，除了dHgp8。所有dHgp辅助子辅助良好，除了dHgp8。
实施例4：改良的无启动子辅助构建体
发明人注意到dHcap(FL)和dHgp(FL)表达了融合蛋白，如通过Western印迹显示的。这样的融合蛋白可能是在用于Δ26S辅助子转录产物上的衣壳或GP的起始密码子的框内起始密码子上游处翻译启动的结果。一种这样的上游密码子是用于VEE nsP1的天然起始密码子(位于VEE病毒基因组中的核苷酸45处)，其存在于dHcap和dHgp辅助子的5’端，在偏好的情况中，用于翻译的启动(例如，Kozak共有序列)。可能是可以通过核糖体从这些辅助子的加帽5’端的扫描来使用有利的Kozak环境中的起始密码子，由此产生非功能性的融合蛋白并降低从位于更下游的合适起始密码子产生功能性衣壳和糖蛋白多肽。
使用两种方法来降低所产生的这种融合蛋白的含量并提高全长衣壳和糖蛋白的蛋白表达。首先，将上述的偏好起始密码子突变成TAG终止密码子，而剩余的起始密码子未改变。采用这种方法使5’端序列尽可能地保持与天然VEE基因组中存在的序列相接近，以维持这些辅助子依赖的复制元件。其次，nt3的起始密码子下游(包括nsP 1(偏好)起始密码子)和衣壳或糖蛋白编码序列开放阅读框(ORF)全部从AUG变成GUG(存在总的12个变化)。采用这种方法来测定较低偏好的ATG密码子(RNA中的AUG)是否也对全长衣壳的产生或糖蛋白表达具有不利影响。
A.dHcap-mut1和dHgp-mut1辅助子的构建
为了形成偏好nsP1起始密码子已经变成TAG终止密码子的dHcap和dHgp辅助子，对每个dHcap和dHgp辅助子进行定点诱变，产生完整组(FL和截短1-7)的突变辅助子，称为dHcap-mut1和dHgp-mut1辅助子，其各自具有在此如SEQ ID NO：35-42和43-50提供的5’序列。根据制造商的实验方案使用Quikchange
Figure GPA00001027335700301
定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)进行定点诱变，使用表4中的正向(SEQ IDNO：71)和反向(SEQ ID NO：72)引物。
B.dHcap-mm和dHgp-mm辅助子的构建
为了产生带有不具有nt3的任何起始密码子下游和衣壳或GP ORF起始密码子的5’端的dHcap和dHgp辅助子，进行了定点诱变，将所有干涉ATG(RNA中的AUG)密码子变成GTG(RNA中的GUG)密码子。将dHgp(FL)构建体用作定点诱变的模板。使用
Figure GPA00001027335700302
多定点诱变试剂盒(Stratagene)来引入密码子改变，使用制造商的实验方案。用于引入密码子改变的引物显示于表5中(SEQ ID NO：73-82)。将含有所有密码子变化的dHgp(EL)构建体称为dHgp(FL)-mm(具有在此作为SEQ ID NO：19提供的5’序列)。证实序列存在所有密码子变化后，将该DNA用于产生dHcap(FL)-mm构建体，通过用来自dHgp(FL)-mm的5’复制识别序列替换dHcap(FL)5’复制识别序列。通过用RsrII和NotI酶消化DNA来完成这。然后将dHcap(FL)-mm RsrII/NotI 5’复制识别序列片段连接线性化的dHcap(FL)DNA，产生dHcap(FL)-mm(具有在此作为SEQ ID NO：27提供的5’序列)。此外，将dHgp(FL)-mm DNA用作模板来产生用于衣壳和GP辅助子的5’截短端组，使用以上对于dHcap1-7和dHgp1-7所述的方法和引物。将新的辅助子称为dHcap1mm-dHcap7mm(具有在此作为SEQ ID NO：20-26提供的5’序列)和dHgp1mm-dHgp7mm(具有在此作为SEQ ID NO：28-34提供的5’序列)。
C.mut1和mm无启动子辅助子的表达分析
分析了从上述Δ26S辅助子的各种mut1和mm形式的蛋白质产生。在该实验中，通过Western印迹分析了dHcap6-mut1(具有在此作为SEQID NO：41提供的5’序列)、dHcap6-mm(具有在此作为SEQ ID NO：25提供的5’序列)、dHcap7-mm(具有在此作为SEQ ID NO：26提供的5’序列)和dHgp-7mm(具有在此作为SEQ ID NO：27提供的5’序列)以及13.2.2和13.4.6辅助子。含有mm突变的Δ26S辅助子主要表达了全长衣壳或GP蛋白，几乎没有可检测的融合蛋白。Mut1辅助子表达了大量全长结构蛋白，但它们还持续表达一些融合蛋白。
对相同的样品进行了Northern分析来分析mut1和mmΔ26S辅助子的复制特征。结果表明dHcap6-mut1辅助子和13.2.2衣壳辅助子复制一样好。相反，dHcap6-mm、dHcap7-mm和dHgp7-mm辅助子似乎复制的程度低于13.2.2或mut1辅助子。
实施例5：使用Δ26S辅助子产生VEE复制子颗粒
表6中列出的是结合不同的无启动子衣壳和GP辅助子与VEE复制子RNA来产生VEE复制子颗粒(VRP)的各种实验。此外，在一些实验中，引入细胞中的各个辅助子RNA的含量也是不同的。通过用所示含量的辅助RNA以及30μg复制子RNA电穿孔5×107至1×108Vero细胞来产生VRP。通常，对于其中产生颗粒的所有实验，将电穿孔的细胞接种于含有无血清培养基的300cm2烧瓶中并在收集VRP之前培养16-24hr。
通过以下方法来测定VRP滴定度：用十倍连续稀释的样品感染生长于96孔平板中的Vero细胞，将细胞培养16-18hr，固定细胞并使用VEE nsP2蛋白特异性抗体或目标核酸产物进行IFA。将VRP产量报道为来自实验的总产量(即，表6)或基于每ml的来自20ml制剂的总产量(表7，9-13，15和16)。
还通过细胞病变效应(CPE)试验测试了这些制剂中可复制病毒(RCV)的存在。CPE试验由细胞培养物中的两次盲目传代组成，以筛选RCV的存在。对于传代1，用Vero细胞单层将来自VRP制剂的样品在37℃下培养1hr，然后除去样品流体并用新鲜培养基替换，将培养物培养24hr，以允许可能存在的任何RCV扩增。对于传代2，在传代1结束时将细胞培养物上清液加入新鲜Vero细胞单层中并在37℃下培养72hr。在传代2结束时，使用倒置光学显微镜检查培养物的CPE。已经将该试验标准化，并对于在大量VRP存在下检测活病毒的灵敏度进行了评价。在该试验中使用V3014或TC-83，掺加示踪剂研究表明了在1×108VRP的背景基础上3-8PFU较低的检测极限。已经对使用本发明的无启动子辅助子产生的超过1013的VRP进行了该试验，尚未检测到RCV。尽管该试验的检测极限，使用该检测极限，对于产生RCV的可能重组频率的理论计算低得多，即，1010VRP中1个，1011VRP中1个，1012VRP中1个或1013VRP中1个。
实施例6.“切割糖蛋白”无启动子辅助子
A.分开的E2和E1无启动子辅助子的构建
通过将E2和E1糖蛋白盒分开克隆至dHgp6-mut1辅助子的主链中来构建其中E2和E1编码序列置于分开的辅助子上的糖蛋白无启动子辅助子的构建。设计引物来通过PCR从pHCMV-Vsp扩增VEE结构蛋白编码区的衣壳-E3-E2区(参见，U.S.专利No.7,045,335，在此引入作为参考)。将扩增的片段克隆至pCR-Blunt II
Figure GPA00001027335700321
载体中(Invitrogen)，产生pCR-CE3E2。将CE3E2测序来确保在PCR扩增过程中没有引入错误。为了产生含有CE3E2结构区的启动子辅助的辅助子，用SpeI限制酶来消化pCR-CE3E2DNA来释放E3E2片段。然后将E3E2(SpeI)片段连接用SpeI酶线性化的衣壳辅助子(13.2.2)来产生pHCE3E2。通过消化来自pHCE3E2的E3-E2编码区来制备无启动子E2辅助子(称为dHE2-6M1)。首先用AscI限制酶将pHCE3E2DNA质粒线性化，然后用T4DNA聚合酶处理来形成平端。相似地，用SphI限制酶将dHgp6-mut1 DNA质粒线性化并用T4DNA聚合酶处理来形成平端。然后用SpeI限制酶消化两个线性化的、T4-聚合酶处理过的DNA，并将所得到的3.6kb dHgp6-mut1载体片段和1.4kb E3-E2片段各自凝胶纯化。然后使用T4DNA连接酶将两个纯化的片段连接在一起，以产生dHE2-6M1无启动子辅助子。
以几个步骤来完成无启动子E1辅助子的产生。设计引物来扩增两个结构蛋白编码片段：1)衣壳-E3(CE3)，和2)6K-E1(6KE1)。将PCR产物克隆至pCR-Blunt
Figure GPA00001027335700331
载体(Invitrogen)中，产生pCR-CE3和pCR-6KE1。将克隆测序以确保在扩增过程中没有引入错误。为了产生含有E1糖蛋白的E3和6K前导序列上游的盒，产生了另一个中间构建体。通过用BamHI酶消化pCR-6KE1DNA并纯化6KE1片段来完成这。然后将6KE1(BamHI)片段连接用BamHI酶线性化的pCR-CE3DNA，产生pCR-CE36KE1。为了产生含有CE36KE1盒的启动子辅助的辅助子，用SpeI和SphI酶消化pCR-CE36KE1DNA，释放结构蛋白编码序列盒。然后将CE36KE1(SpeI/SphI)片段连接用SpeI和SphI线性化的衣壳辅助子(13.2.2)来产生pHCE36KE1。通过从pHCE36KE1质粒消化E3-6K-E1编码区来完成无启动子E1辅助子(称为dHE1-6M1)的产生。用SpeI和SphI限制酶消化pHCE36KE1和dHgp6-mut1，并将得到的3.6kb dHgp6-mut1载体片段和1.7kb E3-6K-E1片段凝胶纯化。然后使用T4DNA连接酶将两个纯化的片段连接在一起，以产生dHE1-6M1无启动子辅助子。
B.切割糖蛋白无启动子辅助子的分析
将单个的糖蛋白辅助子在体外转录，并在连同VEE复制子RNA电穿孔至Vero细胞中之前，将RNA转录产物纯化。通过Northern印迹分析辅助子复制，并使用E1和E2糖蛋白特异性抗体通过IFA分析蛋白表达。Northern结果表明dHE1-6M1和dHE2-6M1辅助子都有效复制了。代表性的Northern印迹显示于图3中。
为了测定两个单独的糖蛋白-表达无启动子辅助子是否可以结合Δ26S衣壳辅助子来包装复制子RNA，以产生VRP。将三个辅助子结合表达肉毒杆菌神经毒素A片段的VEE复制子RNA并电穿孔至Vero细胞中。来自一个试验的VRP产量显示于表7中。
实施例7.修饰的5’和3’端无启动子辅助盒
A.修饰的5’端辅助盒的构建
在大部分α病毒的RNA的5’端(～头250nt)的预测二级结构含有四个茎环(SL)结构(SL1、SL2、SL3和SL4)。Frolov等(RNA，7：1638-1651(2001))证明了从辛德毕斯病毒辅助RNA除去编码SL2的核苷酸序列提高了该辅助子的复制。
如下通过PCR从dHcap6-mut1除去VEE 5’端的SL2区(基于M-折叠程序)，nt46至nt116，包括端点。从dHcap6-mut1 DNA扩增两个片段。使用引物13-82.1.9[SEQ ID NO.83]和dLS2(EcoRV)R[SEQ IDNO.84](表8)来扩增含有dHcap6-mut1 5’端的45个核苷酸和编码主链质粒序列的核苷酸的大约1千碱基对(kb)的5’片段。使用引物dSL2(EcoRV)F[SEQ ID NO.85]和3-8.pr4[SEQ ID NO.86]来扩增含有开始于核苷酸117的VEE 5’端部分和编码直至VEE3’端的完整衣壳序列的核苷酸的大约1.5kb的3’片段。用XhoI和EcoRV限制酶消化5’～1kb PCR片段。用EcoRV和NotI限制酶消化3’～1.5kb PCR片段。通过用XhoI和NotI消化将质粒dHgp6-mut1线性化，并纯化所得到的～2.5Kb载体主链。为了产生其中删除了SL2区的新辅助子，在此称为“dHcap6-mut1(dSL2)”，将5’(XhoI/EcoRV)片段，3’(EcoRV/NotI)片段和XhoI/NotI线性化载体连接在一起。将具有在此作为SEQ ID NO.51提供的5’端序列的dHcap6-mut1(dSL2)辅助子完整测序，以确保在PCR扩增过程中没有引入错误。为了产生相匹配的dHgp6-mut1(dSL2)辅助子，用XhoI和RsrII限制酶消化dHgp6-mut1 DNA，并纯化5.4kb片段。通过用XhoI和RsrII消化该DNA并纯化1.1kb片段来收集来自dHcap6-mut1(dSL2)的修饰5’端。将这两个片段连接在一起来产生dHgp6-mut1(dSL2)，其具有和dHcap6-mut1(dSL2)相同的5’端[SEQ IDNO.51]。
B.缩短的3’端无启动子辅助盒的构建
在这些实施例中，对于衣壳辅助构建体dHcap(FL)，dHcap1至dHcap7，dHcap(FL)mm，dHcap1mm至dHcap7mm，dHcap(FL)mut1和dHcap1mut1至dHcap7mut1，在此作为SEQ ID NO.55提供了3’端序列。尽管本发明的VEE衣壳蛋白缺乏完整的糖蛋白编码区，但在衣壳辅助子上保留了小部分的E3蛋白，以允许在包装细胞内发生胰凝乳蛋白酶样切割，来产生成熟的衣壳蛋白。对于糖蛋白辅助构建体dHgp(FL)，dHgp1至dHgp7，dHgp(FL)mm，dHgp1mm至dHgp7mm，dHgp(FL)mut1和dHgp1mut1至dHgp7mut1，3’端序列是较短的序列，因为在糖蛋白辅助构建体中不需要用于产生成熟衣壳蛋白所需的含有切割位点的序列。在此作为SEQ ID NO.56提供了这些实施例中用于这些糖蛋白构建体的3’序列。
此外，构建了具有较短3’端长度的无启动子RNA辅助子。通过降低α病毒3’端序列的含量，进一步降低了产生可复制VEE病毒所需的第二次重组事件的理论可能性。最初，在以下两个步骤中产生了具有功能性26S启动子的糖蛋白的辅助子，该启动子只含有包括α病毒高度保守的3’序列[SEQ ID NO.52]的19个核苷酸。首先，产生了含有糖蛋白(GP)编码序列盒的质粒，该盒具有独特的5’盒3’限制位点。设计引物来扩增具有独特的SphI位点(“GP(SphI)R”，SEQ ID NO.87，表8)和5’端的现有内部SpeI位点(“3-16.1.3”，SEQ ID NO.88，表8)的VEE GP，SphI位点就在3’端的E1终止密码子之后。扩增的片段是克隆至pCR2.1DNA中的TA(Invitrogen，Carlsbad，CA)，产生pCR2.1/GP19nt 5’。其次，设计正向引物来引入SphI位点，就在VEE 3’端的19个核苷酸保守序列的上游(3’trunk(SphI)F，SEQ ID NO.89，表8)。设计质粒主链序列特异性的反向引物来扩增将含有3’端独特AflII限制位点的片段(3’trunc(AflIII)R，SEQ ID NO.90，表8)。用SphI和AflII消化使用这些引物扩增得到的片段，并连接成13.4.6糖蛋白辅助子(实施例1中所述的)，已经用SphI和AflI限制酶将其线性化，因此导致pGP辅助子-int1的构建。pGP辅助子-int1构建体在GP终止密码子和辅助子的3’端(包括19nt保守序列)之间具有72个核苷酸区。为了产生只具有19个核苷酸3’端的GP辅助子，用SpeI和SphI消化pCR2.1/GP 19nt5’DNA，并将GP编码序列连接至用SpeI和SphI限制酶消化的pGP辅助子-int1中。将所得到的构建体命名为pGP辅助子19nt。
然后将pGP辅助子19nt用于产生具有不同长度的3’复制识别序列的Δ26S辅助子。用NcoI和NotI限制酶消化pGP辅助子19nt构建体，并将含有糖蛋白编码序列的2515个碱基对片段进行凝胶纯化，该编码序列具有19nt 3’端片段。然后将该2515个碱基对(NcoI/NotI)片段连接至用NcoI和NotI限制酶消化的dHgp构建体中，产生各种dHgp 19nt构建体。
C.表达α病毒衣壳蛋白的修饰无启动子辅助盒的构建
在VEE病毒感染的细胞中，VEE衣壳蛋白从结构糖蛋白切割自身，结构糖蛋白是从26S亚基因组mRNA翻译的。尽管本发明的VEE衣壳辅助子缺乏完整的糖蛋白编码区，但在衣壳辅助子上保留了一小部分E3蛋白，以允许在包装细胞内发生胰凝乳蛋白酶样切割，来产生成熟的衣壳蛋白。在衣壳的3’端引入终止密码子，替代胰凝乳蛋白酶样切割位点，将提高使用糖蛋白辅助子产生功能性重组体的难度。即，对于使用本发明的dHgp辅助子来产生的功能性重组(即，产生可复制病毒)，重组事件必须是核苷酸完美的，以替代衣壳编码序列中的工程化终止密码子并维持活性衣壳切割位点。产生了两种形式的在3’端结合了终止密码子的dHcap辅助子。一种形式，dHcap6-mut1-dSL2(终止)，其具有在此作为SEQ ID NO：57提供的3’序列，替代了具有终止密码子的天然衣壳蛋白的C-端色氨酸残基；另一种形式保留了C-端色氨酸残基(dHcap6-mut1(W-终止)，其具有在此作为SEQ DI NO：59提供的3’序列)并就在色氨酸残基的下游插入了终止密码子。使用引物来扩增衣壳编码序列，设计该引物，以在5’端工程化独特的RsrII位点(衣壳(RsrII-Kozak)F，SEQ ID NO：91，表8)和3’端独特的SphI位点(衣壳(终止)SphI R，SEQ ID NO：92或衣壳(W-终止)SphI R，SEQ ID NO：93，表8)。还将正向引物工程化，以在近-最佳Kozak共有序列中放置衣壳起始密码子(Kozak，Cell，44(2)：283-292(1986))，以增强衣壳mRNA翻译的核糖体启动。用RsrII和SphI限制酶消化扩增的衣壳编码序列，并连接至用RsrII和SphI线性化的Δ26S辅助质粒中，以产生dHcap6-mut1-dSL2(终止)和dHcap6-mut1(W-终止)构建体。
D.表达α病毒糖蛋白的修饰启动子辅助盒的构建
VEE衣壳蛋白是在衣壳C-端色氨酸残基之后切割的胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。基于胰凝乳蛋白酶的切割特异性，预期可以容许就在色氨酸下游位置中的所有氨基酸残基，除了甲硫氨酸和脯氨酸。预期就在色氨酸下游的这些氨基酸在很大程度上降低胰凝乳蛋白酶切割活性。在天然VEE病毒中，存在包括VEE E3信号序列的18个氨基酸。设计构建体来减少E3信号序列中的氨基酸数量，同时维持E3序列的信号功能。因为预期可以在衣壳C-端色氨酸的下游位置中容许包含E3序列的18个氨基酸中的16个，如果在重建VEE结构糖蛋白编码序列的核苷酸完美重组事件发生时，将它们就放置在C-端色氨酸的下游，降低E3信号序列中的氨基酸数量将降低作为切割位点功能性的位点数量。作为这种方法的实例，通过PCR除去正常存在于E3信号序列中的N-端丝氨酸残基，留下亮氨酸残基作为N-端残基，并且构建dHgp无启动子辅助子来确定这样的修饰gp辅助子是否能起作用来包装VRP。
设计正向PCR引物(Gp(RsrII-Ser)F，SEQ ID NO：94)来除去E3的N-端丝氨酸残基并维持独特的RsrII限制位点(表8)。设计反向引物(3-16.2.14，SEQ ID NO：95)来扩增将含有独特的SnaBI限制位点的gp片段(表8)。用RsrII和SnaBI消化所得到的gp PCR片段并连接质RsrII和SnaBI消化的dHgp6-mut1 DNA中，产生dHgp6-mut1(-S)。
E.使用5’和3’修饰的Δ26S启动子进行VRP产生实验
还制备了含有上述修饰组合的辅助子。在VRP产生实验中分析dHcap和dHgp无启动子辅助子的不同组合和RNA浓度，以测定它们怎样有效地包装VEE复制子RNA(表达肉毒杆菌神经毒素片段A或流感HA的)。此外，对辅助子组合的子集分析了Δ26S辅助子加帽对VRP产量的作用。使用Δ26S辅助子不同组合的VRP产量的代表性实例显示于表9-13中。通过连续稀释VRP并用Vero细胞在37℃和5％CO2下培养过夜，在48-孔平板中在Vero细胞单层培养物中进行了定量VRP感染性和产量的效能测定。过夜培养后(18-20小时)，将细胞洗涤，固定，并用抗原特异性一抗接着FITC缀合的二抗将固定的单层染色。通过紫外线荧光显微镜(Nikon Eclipse TE300)检测含有FITC标记的抗原-抗体复合物的细胞。将单个的抗原阳性细胞计数并从已知的稀释和接种体积来计算表示为IU/mL的滴定度。
实施例8.结合泛素单体的无启动子辅助子
A.含有泛素单体的Δ26S辅助子的构建
在真核细胞中，通过细胞泛素羧基端水解酶(UCH)就在其C-端甘氨酸之后切割用泛素融合或标记的蛋白质(Pickart和Rose，J.Biol.Chem260：7903-7910(1985))。就在衣壳和糖蛋白编码序列上游符合阅读框地放置泛素编码序列的单体将消除使用本发明的特定无启动子辅助构建体产生的融合蛋白(这样的融合体是由用于每个结构蛋白编码序列的ATG上游多个转录起始位点引起的)。消除发生是因为所有框内融合蛋白将包括泛素单体，并因此它们可以通过UCH来切割，由此释放没有任何上游、外源蛋白序列的全长VEE结构蛋白。设计引物泛素F(SEQID NO：96)和泛素R(SEQ ID NO：97)(表14)，以在扩增的泛素单体编码序列的5’和3’端引入RsrII位点，同时保持泛素单体通过UCH切割需要的Arg-Gly-Gly序列(图4)。这些特定的构建体在切割后在每个所得到的结构蛋白上形成了天然结构蛋白上不存在的其他N-端氨基酸残基(即，对于衣壳辅助子，为额外的脯氨酸；对于糖蛋白辅助子，为额外的脯氨酸和苏氨酸)(图4)。
使用Pfu Taq聚合酶(Stratagene)将泛素编码序列进行PCR扩增并克隆至dHcap(FL)和dHgp(FL)独特的RsrII位点中。筛选转化体以测定泛素插入片段的方向。分离各自称为dHcapU和dHgpU的用于衣壳和糖蛋白的阳性泛素克隆(各自具有在此作为SEQ ID NO.53和54提供的5’端序列)，并测序来证实没有将错误引入扩增的泛素编码序列中。在分开的反应中使用RiboMax Express
Figure GPA00001027335700381
试剂盒从dHcapU、dHgpU、dHcap(FL)、dHgp(FL)、Hcap4和13.4.6质粒转录用于电穿孔的RNA并用氯化锂沉淀。
B.使用泛素修饰的Δ26S辅助子的VRP产生实验
用表达HIV分化体C糖蛋白的VEE复制子RAN(“DU151gp160”)将Vero细胞电穿孔并在所示RNA含量下选择无启动子衣壳和GP辅助子的组合。在一些实施方案中，使用了“Hcap4”衣壳辅助子。这是具有截短5’端(对应于上述的dHcap4截短)但保留26S亚基因组启动子序列的辅助子，并且在U.S.专利No.7,045,335中有充分描述，在此将其引入作为参考。在大约0.8ml的体积中，在0.4cm比色皿中，在500V、25μF、4个脉冲下进行电穿孔。将每个电穿孔接种于含有100ml
Figure GPA00001027335700391
(Gibco，Carlsbad，CA)的1-850cm2转瓶中。在18hr时在0.2μm滤器上收集VRP，使用25ml的0.5M NaCl洗涤。用1∶400的抗-gp120山羊抗体(其识别HIV gp160蛋白)滴定VRP盐洗物质。包装实验的结果显示于表15中。
随后进行电穿孔来比较用衣壳辅助子dHcapU或dHcap6-mut1(W-终止)结合dHgp6-mut1包装的各种核酸的滴定度。使用VEE nsP2特异性多克隆抗体来滴定VRP(表16)。
C.通过Western分析电穿孔细胞中的结构蛋白表达
从表16中概括的包装研究中用于产生VRP的细胞制得细胞裂解物。在半干转移至PVDF(PVDF在1X转移缓冲液中400mA下40min)之前，将来自每个样品的细胞裂解物在200V、400mA下在1X MPOS中在4-12％Bis-Tris Novex凝胶中电穿孔45min。将膜在1X BMB阻断/TBS中阻断过夜。一抗为1A4A抗-VEE GP的1∶500稀释和抗-VEE衣壳的1∶1500稀释，稀释于1X BMB阻断/TBS中。Western印迹结构显示于图5中。将从dHgpU表达的糖蛋白加工成TE2和E2GP形式，比从dHgp(FL)表达的糖蛋白更完整。这通过没有使用存在于dHgp(FL)中的泛素看到的融合蛋白模式的差别得到了证明(图5，使用GP抗体在Western印迹上比较了泳道3和4)。将泛素置于dHcapU辅助子中的衣壳蛋白的N-端导致衣壳融合蛋白消失(图5)和使用13.4.6糖蛋白辅助子包装时gp160滴定度高于2个对数的增加(表15)。
D.通过Northern分析电穿孔细胞的结构蛋白RNA表达
从表15中概括的包装研究中用于产生VRP的细胞提取总细胞RNA。用
Figure GPA00001027335700392
试剂(Ambion，Inc.，Austin，TX)裂解细胞，用氯仿提取，沉淀并接受使用衣壳和GP特异性探针的Northern分析(各自为图6和图7)。所有RNA物质与从各种构建体预期的大小一致。
实施例9.使用加帽和未加帽的Δ26S辅助构建体的VRP产生
A.表达各种α病毒的糖蛋白的VRP
使用表达作为目标核酸(NOI)的VEE(3022)、东方马脑炎病毒(EEE)(4200)或西方马脑炎病毒(WEE)(2100)的糖蛋白编码序列的VEE复制子来产生VRP，其中已经删除了每个furin切割位点。用NotI将编码用于产生VRP的辅助子的DNA质粒线性化，并按照制造商的说明使用T7
Figure GPA00001027335700401
试剂盒(Promega，Madison，WI)进行体外转录，并且按照其中所示的，补充7.5mM CAP类似物(Promega)。在表17中，将使用帽类似物产生的辅助子表示为“+帽”，没有使用帽类似物的那些表示为“-帽”。按照以上实施例5中所述的，用复制子、衣壳辅助子和GP辅助子RNA的组合将Vero细胞电穿孔并产生VRP。三个分开实验的结果显示于表17-19中。
B.表达流感株Wisconsin的HA编码序列的VRP
在该实验中，在用于产生编码VEE衣壳或VEE糖蛋白的Δ26S辅助子RNA的转录反应中，Cap类似物与GTP的摩尔比是不同的。如下装配转录反应：Promega 5X转录缓冲液；rNTP混合物(6mM UTP、CTP、ATP)；GTP(0-6mM，如表中所示)；(Promega Corporation Woods HollowRd.，Madision WI，目录#P1300)和Ribo m7G
Figure GPA00001027335700402
类似物(6mM)(Promega Corporation Woods HolloW Rd.，Madision WI，目录#P1712)。使用Promega的5X缓冲液和7.5mM rNTP进行其他反应，使用或未使用7.5m Ribo m7G Cap类似物来模拟制造商指定的T7RiboMAX
Figure GPA00001027335700403
RNA转录试剂盒条件(Promega Corporation Woods HolloW Rd.，Madision WI，目录#P1320)，其通常使用试剂盒中提供的2X缓冲液来运行。该实验中包装的VEE复制子编码流感HA(A/WI/05)蛋白。将30μg复制子RNA；10μgΔ26S衣壳辅助子RNA和60μgΔ26S糖蛋白辅助子RNA用于每次电穿孔。将Vero细胞扩大，然后洗涤并重悬浮于蔗糖缓冲液中至1.2×108细胞/mL。将这些细胞与RNA混合，然后用设定为500伏特、25μFd和四个脉冲的BioRad Gene Pulse
Figure GPA00001027335700404
装置电穿孔。将细胞转移至含有100mL
Figure GPA00001027335700405
的转瓶中，并在37℃下培养。电穿孔后二十四小时，收集VRP。在Vero的48-孔平板上滴定VRP，结果显示于表25中。
实施例10.使用由Δ26S辅助构建体制得的VRP对抗小鼠中肉毒杆菌神经毒素的保护
将表达肉毒杆菌神经毒素血清型A或B的重链的非毒性c-端片段的VEE复制子载体(各自为BoNT A或BoNT B)包装至VRP中，使用：(i)30μg未加帽的13.2.2和13.4.6辅助子或(ii)20μg加帽衣壳Δ26S辅助子和60μg加帽糖蛋白Δ26S辅助子，如实施例5中所述的。在第0天和第28天，使用1×107IU剂量的这些VRP来接种Swiss小鼠。在第二次免疫后一个月，用杀灭50％动物需要的BoNT A或BoNT B神经毒素剂量1000倍的剂量(1000LD50)来激发小鼠。激发实验的结果概括于表20中。
实施例11.使用表达来自天花病毒的抗原的VRP的免疫原性和保护研究
A.使用Δ26S辅助构建体产生的VRP在小鼠和灵长类动物中的免疫原性
使用Kamrud等所述的方法(Virology 360(2)：376-87(2007))，构建优化来表达四个牛痘病毒(VACV)基因(L1R、B5R、A27L和A33R)的VEE复制子载体。将这四个VACV基因总称为“4pox”。将4pox基因克隆至两个不同的VEE复制子载体系统中，一个基于VEE的3014株，而另一个基于TC-83疫苗株。使用每个优化的VACV编码序列-表达复制子载体来产生VRP，通过将30μg复制子、20μg Δ26S衣壳辅助RNA和60μg Δ26S GP辅助RNA混合，并将它们电穿孔至Vero细胞中。按照实施例5中所述的产生颗粒并收集。然后将单独的VACV VRP混合，产生用于免疫BALB/c小鼠或猕猴的4pox VRP混合物，并通过VACV抗原特异性ELISA分析来测量体液应答。接种小鼠中检测的VACV-特异性ELISA应答显示于表21中，而接种猕猴中检测的VACV-特异性ELISA应答显示于表22中。
B.小鼠中和非人灵长类动物中使用4pox VRP的保护
1.小鼠
通过鼻内途径使用2×106PFU牛痘病毒(IHD-J株)来激发小鼠，并且将结果呈现于表23中。
2.非人灵长类动物
通过静脉内途径使用5×106PFU的猴痘病毒来激发非人灵长类动物。使用世卫组织的损伤数量评分系统来确定疾病严重程度，并且将结果呈现于表24中。
如本领域技术人员所理解的，对于所要求发明的每个方面存在几个实施方案和要素，并且在此将不同要素的所有组合结合为本发明的实施方案，因此没有将在此例举的特定组合解释为所要求的本发明范围的限制。如果将特定的要素在组合中可用要素组中除去或添加进去，那么认为该要素组已经结合了这样的变化。
在此引用的参考文献，包括非专利出版物，专利申请和专利，在此将其全部引入作为参考，至如同在此单独和特意指出引入作为参考并全部重现的程度。
表1.产生Δ26S辅助子的引物
  引物名称   5’引物序列3’   SEQID NO：
  衣壳F   CCTCGGACCGATGTTCCCGTTCCAGCCAATG   98
  GP F   CCTCGGACCGACCATGTCACTAGTGACCACCATG   60
  13-101.pr4   TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAATATTAAAAACAAAATCCGATTCGG   61
  3-16.1.1   ACCGTCACCCTGGATGCTGT   62
  dHelp1R   CCTCGGACCGAAACAGCGACTTGCCCTTCGTAGCGACAC   63
  dHelp2R   CCTCGGACCGCATAGTCTCAGTTTCCAGGTCAGGGTCGC   64
  dHelp3R   CCTCGGACCGCGGCGAGCTCCTTCATTTTCTTGTCCAATTCCT   65
  dHelp4R   CCTCGGACCGCAGCTTAGTTGCATACTTATACAATCTGTCCGGA   66
  dHelp5R   CCTCGGACCGACATCTCATCGGACAGATACAATGATACTTGTGCT   67
  dHelp6R   CCTCGGACCGTCCAATGTCAAGGATCGTGTCGG   68
  ATGGGT
  dHelp7R   CCTCGGACCGAGTTTTGAAGCCAGATGCGAAAACGCTCTG   69
  dHelp8R   CCTCGGACCGCTTGGCTTCTACCTCAAACTGCGGGAAGC   70
表2.dHcap1-8辅助子的IFA分析
  辅助子   抗-衣壳IFA
  dHcap1   阳性
  dHcap2   阳性
  dHcap3   阳性
  dHcap4   阳性
  dHcap5   阳性
  dHcap6   阳性
  dHcap7   阳性
  dHcap8   阳性(弱)
表3
  辅助子   抗-GP IFA
  DHgp1   阳性
  dHgp2   阳性
  dHgp3   阳性
  dHgp4   阳性
  dHgp5   阳性
  dHgp6   阳性
  dHgp7   阳性
  dHgp8   阴性
表4.产生mut1辅助子的定点诱变引物
  引物名称   5’引物序列3’  SEQ ID NO
  Mut1F   GACCAATTACCTACCCAAATAGGAGAAAGTTCACGTTGAC  71
  Mut1R   GTCAACGTGAACTTTCTCCTATTTGGGTAGGTAATTGGTC  72
表5.用于将5’复制识别序列ATG密码子变成GTG的引物
  引物名称(ATG密码子中A残基的位置)   5’引物序列3’   SEQ IDNO
  nt-12   ATAGGCGGCGCGTGAGAGAAGCCCAG   73
  nt-45   CCTACCCAAAGTGGAGAAAGTTCACGTTGACATC   74
  nt-148/154/160   CAGGTCACTGATAGTGACCGTGCTAGTGCCAGAGCG   75
  nt-259   GCCCGCCCGCAGAGTGTATTCTAAGCAC   76
  nt-295/300   GTATCTGTCCGGTGAGGTGTGCGGAAGATCCG   77
  nt-331   GACAGATTGTATAAGTGTGCAACTAAGCTG   78
  nt-390   GAATGGACAAGAAAGTGAAGGAGCTC   79
  nt-411   CCGTCGTGAGCGACCCTGACCTGGAAAC   80
  nt-441   GAAACTGAGACTGTGTGCCTCCACG   81
  nt-499   GTTTACCAGGGTGTATACGCGGTTG   82
表6
BonT B复制子
  衣壳辅助子   GP辅助子   VRP产量
  dHcap6 mut1(30μg)   13.4.6(30μg)   9.0×109
BoNT A复制子
  衣壳辅助子   GP辅助子   VRP产量
  dHcap6(30μg)   dHgp7(30μg)   6.0×109
  dHcap6(30μg)   dHgp7(90μg)   2.6×1010
BoNT A复制子
  衣壳辅助子   GP辅助子   VRP产量
  dHcap5-mm(30μg)   dHgp6 mut1(90μg)   1.8×107
  dHcap6-mm(30μg)   dHgp6 mut1(90μg)   3.6×108
  dHcap7-mm(30μg)   dHgp6 mut1(90μg)   1.3×108
  dHcap4 mut1(30μg)   dHgp6 mut1(90μg)   1.3×109
  dHcap6 mut1(30μg)   dHgp6 mut1(90μg)   4.6×109
  dHcap7 mut1(30μg)   dHgp6 mut1(90μg)   6.2×109
  dHcap5-mm(10μg)   dHgp6 mut1(90μg)   4.2×106
  dHcap6-mm(10μg)   dHgp6 mut1(90μg)   2.6×108
  dHcap7-mm(10μg)   dHgp6 mut1(90μg)   4.4×107
  dHcap4 mut1(10μg)   dHgp6 mut1(90μg)   1.1×1010
  dHcap6 mut1(10μg)   dHgp6 mut1(90μg)   1.9×1010
  dHcap7 mut1(10μg)   dHgp6 mut1(90μg)   1.8×1010
SARS S复制子
  衣壳辅助子  GP辅助子   VRP产量
  dHcap4 mut1(10μg)  dHgp6 mut1(90μg)   4.4×109
  dHcap6 mut1(10μg)  dHgp6 mut1(90μg)   2.6×109
  dHcap7 mut1(10μg)  dHgp6 mut1(90μg)   1.4×109
BoNT A复制子
  衣壳辅助子   GP辅助子   VRP产量
  dHcap1(30μg)   13.4.6(30μg)   3.0×107
  dHcap2(30μg)   13.4.6(30μg)   9.2×107
  dHcap3(30μg)   13.4.6(30μg)   2.0×108
  dHcap4(30μg)   13.4.6(30μg)   1.3×109
  dHcap5(30μg)   13.4.6(30μg)   3.2×108
  dHcap6(30μg)   13.4.6(30μg)   3.0×108
  dHcap7(30μg)   13.4.6(30μg)   1.2×109
  dHcap8(30μg)   13.4.6(30μg)   1.8×107
  dHcap6mut1(30μg)   13.4.6(30μg)   8.4×109
  dHcap6mut1(30μg)   13.4.6(30μg)   1.2×1010
表7.使用Δ26S衣壳、E1和E2辅助子产生的VRP产量pERK/342/MS/BoNT A[30μg]
  衣壳辅助子   GP辅助子#1   GP辅助子#2   VRP滴定度/ml
  dHcap6-mut1[10μg]   dHE1-6M1[30μg]   dHE2-6M 1[30μg]   2.2×107
  dHcap6-mut1[10μg]   dHgp7-mut1[90μg]   1.3×109
表8.用于设计Δ26S辅助子的5’和3’区修饰的PCR引物
  引物名称   5’引物序列3’   SEQID NO：
  13-82.1.9   TCAGTGGAACGAAAACTCACG   83
  dSL2(EcoRV)R   TTTGATATCGGTAATTGGTCTGGGCTTCTC   84
  dSL2(EcoRV)F   TTTGATATCGAAGCCAAGCAGGTCACTG   85
  3-8.pr4   GCAACGCGGGGAGGCAGACA   86
  GP(SphI)R   GCATGCTCAATTATGTTTCTGGTTGG   87
  3-16.1.3   CGACATAGTCTAGTCCGCCA   88
  3′trunc(SphI)F   GCATGCATTTTGTTTTTAATATTTCAAA   89
  3′trunc(AflII)R   GCTCACATGTTCTTTCCTGCG   90
  Capsid(RsrII-Kozak)F   CCTCGGACCGACCATGTTCCCGTTCCAGCCAATG   91
  衣壳(终止)SphIR   ACATGCATGCTTATTGCTCGCAGTTCTCCGG   92
  衣壳(W-终止)SphI R   ACATGCATGCTTACCATTGCTCGCAGTTCTCCGG   93
  Gp(RsrII-Ser)F   CCTCGGTCCGACCATGCTAGTGACCACCATG   94
  3-16.2.14   ACATACACGGTAGTCACAAT   95
表9.
复制子包装的pERK/342/MS/BoNT A[30μg RNA]
  衣壳辅助子[RNA]   GP辅助子[RNA]  VRP滴定度IFU/ml
  dHcap7-mut1(W-stop)[10μg]   dHgp7-mut1[90μg]   1.0×108
  dHcap6-mut1(W-stop)[10μg]   dHgp7-mut1[90μg]   8.9×108
  dHcap7-mut1(W-stop)[20μg]   dHgp7-mut1[90μg]   3.0×108
  dHcap6-mut1(W-stop)[20μg]   dHgp7-mut1[90μg]   6.8×108
表10.
复制子包装的pERK/342/MS/BoNT A[30μg RNA]
  衣壳辅助子[RNA]   GP辅助子[RNA]   VRP滴定度IFU/ml
  dHcap6-mut1[10μg]   dHgp7-mut1[60μg]   2.1×108
  dHcap6-mut1(W-stop)[10μg]   dHgp7-mut1[60μg]   2.0×108
  dHcap6-mut1(W-stop)-dSL2[10μg]   dHgp7-mut1[60μg]   3.7×107
表11.
复制子包装的pERK/342/MS/BoNT A[30μg RNA]
  衣壳复制子[RNA]   GP复制子[RNA]   VRP滴定度IFU/ml
  dHcap7-mut1[20μg]   dHgp7-mut1[90μg]   4.9×107
  dHcap7-mut119nt[30μg]   dHgP7-mut1[90μg]   2.2×107
表12.
复制子包装的pERK/342/MS/BoNT A[30μgRNA]
  衣壳辅助子[RNA][10μg]   糖蛋白辅助子[RNA][60μg]   VRP滴定度IFU/ml
  dHcap7-mut1(W-终止)   dHgp6-mut1   6.1×106
  dHcap7-mut1(W-终止)   dHgp6-mut1-dSL2(-S)   6.6×105
  dHcap7-mut1(W-终止)   dHgp6-mut1-dSL2(-S)19nt   9.6×104
  dHcap7-mut1(W-终止)   dHgp6-mut1(-S)   1.0×107
  dHcap6-mut1(W-终止)   dHgp6-mut1   2.7×107
  dHcap6-mut1(W-终止)   dHgp6-mut1-dSL2(-S)   1.7×106
  dHcap6-mut1(W-终止)   dHgp6-mut1-dSL2(-S)19nt   1.2×105
  dHcap6-mut1(W-终止)   dHgp6-mut1(-S)   2.2×107
表13
pERK/383/MS/HA(A Wyoming)[30μg RNA]
  衣壳辅助子[RNA]   GP辅助子[RNA]   VRP滴定度IFU/ml
  dHcap6-mut1(W-终止)[20μg]   dHgp6-mut1[60μg]   2.0×108
  dHcap6-mut1(W-终止)加帽[20μg]   dHgp6-mut1加帽[60μg]   9.0×109
  dHcap6-mut1(W-终止)[10μg]   dHgp6-mut1[90μg]   2.5×107
  dHcap6-mut1(W-终止)加帽[10μg]   dHgp6-mut1加帽[90μg]   2.5×108
  dHcap6-mut1(W-终止)[10μg]   dHgp6-mm[90μg]   2.3×107
  dHcap6-mut1(W-终止)加帽[10μg]   dHgp6-mm加帽[90μg]   2.4×108
表14
  引物名称   5’引物序列3’   SEQ IDNO：
  泛素F   CATCGACGGACCGATGCAGATCTTCGTGAAGACCC   96
  泛素R   GATTTTCGGTCCGCCCCTCAGACGGAGGACCAGG   97
表15.使用泛素修饰的Δ26S辅助子组合产生VRP
  复制子RNA[30μg]   衣壳辅助子   糖蛋白辅助子[60μg]   VRP滴定度/ml
  DU151gp160   dHcap(FL)[10μg]   13.4.6   8.3×105
  DU151gp160   dHcapU[10μg]   13.4.6   1.3×108
  DU151gp160   Hcap4[30μg]   dHgp6-mut1   9.3×107
  DU151gp160   dHcap6-mut1(W-终止)[10μg]   13.4.6   5.6×108
表16.使用多个辅助子载体和修饰的Δ26S辅助子组合产生VRP
  辅助子RNA[30μg]   衣壳辅助子[10μg]   GP辅助子[60μg]   VRP滴定度/ml
  BoNT A   dHcapU   dHgp6-mut1   1.4×108
  BoNT A   dHcap6-mut1(W-终止)   dHgp6-mut1   3.6×108
  BoNT E   dHcapU   dHgp6-mut1   3.2×107
  BoNT E   dHcap6-mut1(W-终止)   dHgp6-mut1   1.4×108
  HA(A Wyoming)   dHcapU   dHgp6-mut1   3.8×108
  HA(A Wyoming)   dHcap6-mut1(W-终止)   dHgp6-mut1   6.4×108
  NA(A Wyoming)   dHcapU   dHgp6-mut1   4.0×108
  NA(A Wyoming)   dHcap6-mut1(W-终止)   dHgp6-mut1   5.3×108
  CEA   dHcapU   dHgp6-mut1   2.0×108
  CEA   dHcap6-mut1(W-终止)   dHgp6-mut1   3.1×108
表17.使用加帽vs.未加帽辅助子的比较
  VEE复制子中的NOI   辅助子   +/-帽   IU/细胞
  VEE糖蛋白3022   13.2.2；13.4.6   -帽   131.1
  VEE糖蛋白3022   13.2.2；13.4.6   +帽   1095.4
  VEE糖蛋白3022   Δ26S辅助子(C&GP)   -帽   49.0
  VEE糖蛋白3022   Δ26S辅助子(C&GP)   +帽   508.8
  EEE糖蛋白4200   13.2.2；13.4.6   -帽   30.7
  EEE糖蛋白4200   13.2.2；13.4.6   +帽   398.8
  EEE糖蛋白4200   Δ26S辅助子(C&GP)   -帽   9.3
  EEE糖蛋白4200   Δ26S辅助子(C&GP)   +帽   88.0
表18.
  VEE复制子中的NOI   辅助子   +/-帽   IU/细胞
  VEE糖蛋白3022   13.2.2；13.4.6   -帽   600.4
  VEE糖蛋白3022   13.2.2；13.4.6   +帽   2035.0
  VEE糖蛋白3022   Δ26S辅助子(C&GP)   -帽   101.3
  VEE糖蛋白3022   Δ26S辅助子(C&GP)   +帽   884.6
  EEE糖蛋白4200   13.2.2；13.4.6   -帽   75.2
  EEE糖蛋白4200   13.2.2；13.4.6   +帽   898.3
  EEE糖蛋白4200   Δ26S辅助子(C&GP)   -帽   29.8
  EEE糖蛋白4200   Δ26S辅助子(C&GP)   +帽   206.3
表19.
  VEE复制子中的NOI   Δ26S衣壳辅助子(+/-帽)   Δ26S GP辅助子(+/-帽)   IU/细胞
  WEE糖蛋白2100   -帽   -帽   37.1
  WEE糖蛋白2100   +帽   +帽   285.7
  WEE糖蛋白2100   +帽   -帽   38.6
  WEE糖蛋白2100   -帽   +帽   34.3
表20.接种使用Δ26S辅助子产生的VRP的小鼠的激发结果
复制子(辅助子组)   存活BoNT-A/总   存活BoNT-B/总
  MS/342/BoNT A(13.2.2+13.4.6)   8/10   NA
  MS/342/BoNT A(Δ26S衣壳+gp)   10/10   NA
  对照VRP1   0/10   NA
  MS/357/BoNT B(13.2.2+13.4.6)   NA   10/10
  MS/357/BoNT B((Δ26S衣壳+gp)   NA   8/10
  对照VRP1   NA   0/10
NA：不适用
1在复制子中含有表达无关蛋白的编码序列
表21.
Figure GPA00001027335700511
表22.
Figure GPA00001027335700521
表23.小鼠中的保护研究
  VRP疫苗  测试的小鼠#   存活％
  V30144pox   48   100％
  V3014对照   24   0％
  TC-834pox   40   100％
  TC-83对照   24   9％
表24.猕猴中的保护研究
Figure GPA00001027335700522
1TNTC＝太多以致难以计数
表25.Δ26S辅助子的加帽对编码来自流感Wisconsin株的HA编码序列的α病毒辅助子载体的包装的作用的研究
Figure GPA00001027335700531
Figure GPA00001027335700541
序列表
<110>AlphaVax，Inc.
     Kamrud，Kurt I.
     Smith，Johnathan F.
     Maughan，Maureen
<120>用于α病毒结构蛋白表达的无启动子盒
<130>9368.9.WO
<150>US 60/936,637
<151>2007-06-21
<160>98
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>521
<212>DNA
<213>委内瑞拉马脑炎病毒
<400>1
atgggcggcg  catgagagaa  gcccagacca  attacctacc  caaaatggag  aaagttcacg     60
ttgacatcga  ggaagacagc  ccattcctca  gagctttgca  gcggagcttc  ccgcagtttg    120
aggtagaagc  caagcaggtc  actgataatg  accatgctaa  tgccagagcg  ttttcgcatc    180
tggcttcaaa  actgatcgaa  acggaggtgg  acccatccga  cacgatcctt  gacattggaa    240
gtgcgcccgc  ccgcagaatg  tattctaagc  acaagtatca  ttgtatctgt  ccgatgagat    300
gtgcggaaga  tccggacaga  ttgtataagt  atgcaactaa  gctgaagaaa  aactgtaagg    360
aaataactga  taaggaattg  gacaagaaaa  tgaaggagct  cgccgccgtc  atgagcgacc    420
ctgacctgga  aactgagact  atgtgcctcc  acgacgacga  gtcgtgtcgc  tacgaagggc    480
aagtcgctgt  ttaccaggat  gtatacgcgg  ttgacggacc  g                         521
<210>2
<211>499
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>2
ataggcggcg  catgagagaa  gcccagacca  attacctacc  caaaatggag  aaagttcacg     60
ttgacatcga  ggaagacagc  ccattcctca  gagctttgca  gcggagcttc  ccgcagtttg    120
aggtagaagc  caagcaggtc  actgataatg  accatgctaa  tgccagagcg  ttttcgcatc    180
tggcttcaaa  actgatcgaa  acggaggtgg  acccatccga  cacgatcctt  gacattggaa    240
gtgcgcccgc  ccgcagaatg  tattctaagc  acaagtatca  ttgtatctgt  ccgatgagat    300
gtgcggaaga  tccggacaga  ttgtataagt  atgcaactaa  gctgaagaaa  aactgtaagg    360
aaataactga  taaggaattg  gacaagaaaa  tgaaggagct  cgccgccgtc  atgagcgacc    420
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<210>3
<211>450
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>3
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gtgcgcccgc  ccgcagaatg  tattctaagc  acaagtatca  ttgtatctgt  ccgatgagat    300
gtgcggaaga  tccggacaga  ttgtataagt  atgcaactaa  gctgaagaaa  aactgtaagg    360
aaataactga  taaggaattg  gacaagaaaa  tgaaggagct  cgccgccgtc  atgagcgacc    420
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>4
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ttgacatcga  ggaagacagc  ccattcctca  gagctttgca  gcggagcttc  ccgcagtttg    120
aggtagaagc  caagcaggtc  actgataatg  accatgctaa  tgccagagcg  ttttcgcatc    180
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gtgcgcccgc  ccgcagaatg  tattctaagc  acaagtatca  ttgtatctgt  ccgatgagat    300
gtgcggaaga  tccggacaga  ttgtataagt  atgcaactaa  gctgaagaaa  aactgtaagg    360
aaataactga  taaggaattg  gacaagaaaa  tgaaggagct  cgccgcggtc  cg            412
<210>5
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>5
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<210>6
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<212>DNA
<213>人工
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<223>合成的非编码识别序列
<400>6
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<210>7
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<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>7
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<220>
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<400>9
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<210>10
<211>524
<212>DNA
<213>委内瑞拉马脑炎病毒
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<210>12
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<213>人工
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<223>合成的非编码识别序列
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<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>20
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aagtcgctgt  ttcggtccg                                                     499
<210>21
<211>450
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>21
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<211>412
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<223>合成的非编码识别序列
<400>22
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<213>人工
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<223>合成的非编码识别序列
<400>23
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<210>24
<211>309
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<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>24
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<210>25
<211>246
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>25
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<210>26
<211>200
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>26
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<210>27
<211>524
<212>DNA
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<220>
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<400>27
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gtgcgcccgc  ccgcagagtg  tattctaagc  acaagtatca  ttgtatctgt  ccggtgaggt    300
gtgcggaaga  tccggacaga  ttgtataagt  gtgcaactaa  gctgaagaaa  aactgtaagg    360
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<210>28
<211>507
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>28
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<210>29
<211>453
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<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>29
atgggcggcg  cgtgagagaa  gcccagacca  attacctacc  caaagtggag  aaagttcacg     60
ttgacatcga  ggaagacagc  ccattcctca  gagctttgca  gcggagcttc  ccgcagtttg    120
aggtagaagc  caagcaggtc  actgatagtg  accgtgctag  tgccagagcg  ttttcgcatc    180
tggcttcaaa  actgatcgaa  acggaggtgg  acccatccga  cacgatcctt  gacattggaa    240
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aaataactga  taaggaattg  gacaagaaag  tgaaggagct  cgccgccgtc  gtgagcgacc    420
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<212>DNA
<213>人工
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atgggcggcg  cgtgagagaa  gcccagacca  attacctacc  caaagtggag  aaagttcacg     60
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<223>合成的非编码识别序列
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<223>合成的非编码识别序列
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<223>合成的非编码识别序列
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<400>40
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gtcggaccg                                                                 309
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<212>DNA
<213>人工
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<400>45
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<210>49
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<212>DNA
<213>人工
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<223>合成的非编码识别序列
<400>49
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<210>50
<211>203
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>50
ataggcggcg  catgagagaa  gcccagacca  attacctacc  caaataggag  aaagttcacg     60
ttgacatcga  ggaagacagc  ccattcctca  gagctttgca  gcggagcttc  ccgcagtttg    120
aggtagaagc  caagcaggtc  actgataatg  accatgctaa  tgccagagcg  ttttcgcatc    180
tggcttcaaa  actcggtccg  acc                                               203
<210>51
<211>166
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>51
ataggcggcg  catgagagaa  gcccagacca  attaccgata  tcgaagccaa  gcaggtcact     60
gataatgacc  atgctaatgc  cagagcgttt  tcgcatctgg  cttcaaaact  gatcgaaacg    120
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<210>52
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>52
attttgtttt taatatttc                                                       19
<210>53
<211>752
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>53
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ttgacatcga  ggaagacagc  ccattcctca  gagctttgca  gcggagcttc  ccgcagtttg    120
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ctgacctgga  aactgagact  atgtgcctcc  acgacgacga  gtcgtgtcgc  tacgaagggc    480
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<210>54
<211>755
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>54
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ctgacctgga  aactgagact  atgtgcctcc  acgacgacga  gtcgtgtcgc  tacgaagggc    480
aagtcgctgt  ttaccaggat  gtatacgcgg  ttgacggacc  gatgcagatc  ttcgtgaaga    540
ccctgaccgg  caagaccatc  accttggagg  tggagcccag  tgacaccatc  gagaatgtga    600
aggccaagat  ccaggataaa  gagggcatcc  cccctgacca  gcagaggctg  atctttgccg    660
gcaagcagct  agaagatggc  cgcactctct  ctgattacaa  catccagaaa  gagtcgaccc    720
tgcacctggt  cctccgtctg  aggggcggac  cgacc                                 755
<210>55
<211>374
<212>DNA
<213>委内瑞拉马脑炎病毒
<400>55
tggtcactag  tgaccaccat  gtgtctgctc  gccaatgtga  cgttcccatg  tgctcaacca     60
ccaatttgct  acgacagaaa  accagcagag  actttggcca  tgctcagcgt  taacatccct    120
gctgggagga  tcagccgtaa  ttattataat  tggcttggtg  ctggctacta  ttgtggccat    180
gtacgtgctg  accaaccaga  aacataattg  aatacagcag  caattggcaa  gctgcttaca    240
tagaactcgc  ggcgattggc  atgccgcttt  aaaattttta  ttttattttt  cttttctttt    300
ccgaatcgga  ttttgttttt  aatatttcaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa    360
aaaaaaaaaa  aaaa                                                          374
<210>56
<211>166
<212>DNA
<213>委内瑞拉马脑炎病毒
<400>56
tgaatacagc  agcaattggc  aagctgctta  catagaactc  gcggcgattg  gcatgccgct     60
ttaaaatttt  tattttattt  ttcttttctt  ttccgaatcg  gattttgttt  ttaatatttc    120
aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaaa                    166
<210>57
<211>115
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>57
taagcatgcc  gctttaaaat  ttttatttta  tttttctttt  cttttccgaa  tcggattttg     60
tttttaatat  ttcaaaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaa         115
<210>58
<211>49
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>58
taagcatgca  ttttgttttt  aatatttcaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaa                  49
<210>59
<211>118
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成的非编码识别序列
<400>59
taagcatgcc  gctttaaaat  ttttatttta  tttttctttt  cttttccgaa  tcggattttg     60
tttttaatat  ttcaaaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaa      118
<210>60
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>60
cctcggaccg  accatgtcac  tagtgaccac  catg                                   34
<210>61
<211>73
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>61
tttttttttt  tttttttttt  tttttttttt  tttttttttt  tttttgaaat  attaaaaaca     60
aaatccgatt  cgg                                                            73
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>62
accgtcaccc  tggatgctgt                                        20
<210>63
<211>39
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>63
cctcggaccg  aaacagcgac ttgcccttcg  tagcgacac                  39
<210>64
<211>39
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>64
cctcggaccg  catagtctca  gtttccaggt  cagggtcgc                 39
<210>65
<211>43
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>65
cctcggaccg  cggcgagctc  cttcattttc  ttgtccaatt  cct           43
<210>66
<211>44
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>66
cctcggaccg  cagcttagtt  gcatacttat  acaatctgtc  cgga          44
<210>67
<211>45
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>67
cctcggaccg  acatctcatc  ggacagatac  aatgatactt  gtgct        45
<210>68
<211>39
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>68
cctcggaccg  tccaatgtca  aggatcgtgt  cggatgggt                39
<210>69
<211>40
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>69
cctcggaccg  agttttgaag  ccagatgcga  aaacgctctg               40
<210>70
<211>39
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>70
cctcggaccg  cttggcttct  acctcaaact  gcgggaagc                39
<210>71
<211>40
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>71
gaccaattac  ctacccaaat  aggagaaagt  tcacgttgac               40
<210>72
<211>40
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>72
gtcaacgtga  actttctcct  atttgggtag  gtaattggtc            40
<210>73
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>73
ataggcggcg  cgtgagagaa  gcccag                            26
<210>74
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>74
cctacccaaa  gtggagaaag  ttcacgttga  catc                  34
<210>75
<211>36
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>75
caggtcactg  atagtgaccg  tgctagtgcc  agagcg                36
<210>76
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>76
gcccgcccgc  agagtgtatt  ctaagcac                          28
<210>77
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>77
gtatctgtcc  ggtgaggtgt  gcggaagatc  cg                32
<210>78
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>78
gacagattgt  ataagtgtgc  aactaagctg                    30
<210>79
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>79
gaatggacaa  gaaagtgaag  gagctc                        26
<210>80
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>80
ccgtcgtgag  cgaccctgac  ctggaaac                      28
<210>81
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>81
gaaactgaga  ctgtgtgcct  ccacg                         25
<210>82
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>82
gtttaccagg  gtgtatacgc  ggttg                        25
<210>83
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>83
tcagtggaac  gaaaactcac  g                            21
<210>84
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>84
tttgatatcg  gtaattggtc  tgggcttctc                   30
<210>85
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>85
tttgatatcg  aagccaagca  ggtcactg                     28
<210>86
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>86
gcaacgcggg  gaggcagaca                               20
<210>87
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>87
gcatgctcaa  ttatgtttct  ggttgg                    26
<210>88
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>88
cgacatagtc tagtccgcca                             20
<210>89
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>89
gcatgcattt  tgtttttaat  atttcaaa                  28
<210>90
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>90
gctcacatgt  tctttcctgc  g                         21
<210>91
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>91
cctcggaccg  accatgttcc  cgttccagcc  aatg          34
<210>92
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>92
acatgcatgc  ttattgctcg  cagttctccg  g                31
<210>93
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>93
acatgcatgc  ttaccattgc  tcgcagttct  ccgg             34
<210>94
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>94
cctcggtccg  accatgctag  tgaccaccat  g                31
<210>95
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>95
acatacacgg  tagtcacaat                               20
<210>96
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>96
catcgacgga  ccgatgcaga  tcttcgtgaa  gaccc            35
<210>97
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>97
gattttcggt  ccgcccctca  gacggaggac  cagg            34
<210>98
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>98
cctcggaccg  atgttcccgt  tccagccaat  g               31

Claims (24)

1.分离的RNA分子，其包括：
a)α病毒5’复制识别序列，其中从所述5’复制识别序列中去除了至少一个起始密码子；
b)编码α病毒结构蛋白的核苷酸序列；和
c)α病毒3’复制识别序列，
条件是所述RNA分子不含有指导b)的核苷酸序列转录的启动子，并且其中a)和c)的α病毒5’和3’复制识别序列指导整个RNA分子在α病毒非结构蛋白的存在下复制。
2.权利要求1的RNA分子，其中编码α病毒结构蛋白的核苷酸序列选自编码下列的核苷酸序列：1)α病毒衣壳蛋白，2)以任意次序的α病毒E1和E2蛋白，3)以任意次序的α病毒衣壳蛋白和α病毒E1蛋白，4)以任意次序的α病毒衣壳蛋白和α病毒E2蛋白，5)α病毒E2蛋白和6)α病毒E1蛋白。
3.权利要求1的RNA分子，其中α病毒5’复制识别序列是委内瑞拉马脑炎病毒的5’复制识别序列。
4.权利要求3的RNA分子，其中5’复制识别序列的长度是70至524个核苷酸。
5.权利要求1或权利要求3的RNA分子，其中α病毒3’复制识别序列是委内瑞拉马脑炎病毒的3’复制识别序列。
6.权利要求1的RNA分子，其中3’复制识别序列的长度是19至325个核苷酸。
7.权利要求1的RNA分子，其中至少一个起始密码子是用于非结构蛋白1的起始密码子。
8.权利要求1的RNA分子，其中从5’复制识别序列中除去了所有起始密码子。
9.权利要求1的RNA分子，其中将RNA在5’端加帽。
10.制备α病毒复制子颗粒的方法，其包括将一个或更多个权利要求1的RNA分子引入细胞中，由此RNA分子的组合连同α病毒复制子RNA一起，在由此产生α病毒复制子颗粒的条件下，编码产生α病毒复制子颗粒需要的所有α病毒结构蛋白。
11.权利要求10的方法，其中将两个RNA分子引入细胞中，其 中两个RNA分子中的第一个RNA分子编码一个或更多个α病毒结构蛋白，两个RNA分子中的第二个RNA分子编码一个或更多个α病毒结构蛋白，其中至少一个不同于由第一个RNA分子编码的α病毒结构蛋白。
12.权利要求10的方法，其中将三个RNA分子引入细胞中，其中三个RNA分子中的第一个RNA分子编码一个或更多个α病毒结构蛋白，三个RNA分子中的第二个RNA分子编码一个或更多个α病毒结构蛋白，其中至少一个不同于由第一个RNA分子编码的α病毒结构蛋白，并且第三个RNA分子编码一个或更多个α病毒结构蛋白，其中至少一个不同于由第一个RNA分子和第二个RNA分子编码的α病毒结构蛋白。
13.权利要求10的方法，其中将一个或更多个RNA分子中的至少一个在5’端加帽。
14.制备α病毒复制子颗粒的方法，其包括将下列引入细胞中：
a)α病毒复制子RNA；
b)一个或更多个权利要求1的RNA分子；和
c)一个或更多个启动子辅助的α病毒辅助构建体，
由此b)的RNA分子和c)的辅助构建体的组合在由此产生α病毒复制子颗粒的条件下编码产生α病毒复制子颗粒需要的所有α病毒结构蛋白。
15.权利要求14的方法，其中将一个或更多个RNA分子中的至少一个在5’端加帽。
16.α病毒复制子颗粒群，其包括含有权利要求1的RNA分子的颗粒子集，其中该群在每108个α病毒复制子颗粒中不含有可检测的可复制α病毒颗粒，如通过在培养物中的允许细胞上的传代所测定的。
17.α病毒复制子颗粒群，其包括含有权利要求1的RNA分子的颗粒子集，其中该群在每108个α病毒复制子颗粒中不含有可检测的可复制α病毒颗粒，如通过在培养物中的允许细胞上的传代所测定的，其中α病毒复制子颗粒在α病毒结构蛋白或α病毒非结构蛋白或α病毒结构蛋白和α病毒非结构蛋白两者中包含一个或更多个减毒突变。 
18.组合物，其在药物学上可接受的载体中含有权利要求16或权利要求17的群。
19.权利要求16或权利要求17的群在制备诱导受试者中免疫应答的药物中的用途。
20.细胞，其含有权利要求1的RNA分子。
21.载体，其含有权利要求1的RNA分子。
22.核酸构建体，其含有权利要求1的RNA分子。
23.细胞，其含有权利要求21的载体。
24.细胞，其含有权利要求22的核酸构建体。 
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