DE10061150A1

DE10061150A1 - Verfahren und Vektoren zur Erzeugung von transgenen Pflanzen

Info

Publication number: DE10061150A1
Application number: DE10061150A
Authority: DE
Inventors: Viktor Klimyuk; Gregor Benning; Serik Eliby; Yuri Gleba
Original assignee: Icon Genetics AG
Current assignee: Icon Genetics AG
Priority date: 2000-12-08
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2002-06-13
Also published as: ATE401409T1; EP1339859A2; ES2309112T3; WO2002046440A3; WO2002046438A2; EP1339859B1; AU2002229565A1; AU2002216082A1; US20040088764A1; DK1339859T3; US7652194B2; AR033851A1; WO2002046438A3; DE60134888D1; WO2002046440A2

Abstract

Diese Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Genexpression in Pflanzen, das Translationsvektoren benutzt. Mit Hilfe dieser Translationsvektoren wird ein Zielgen stabil in eine transkriptionell aktive, genomische Wirts-DNS integriert, so dass die Transkription des Zielgens von Promotoren des Wirtsorganismus kontrolliert wird. Diese Translationsvektoren basieren bevorzugt auf internen Ribosomeneingangsstellen (IRES-Elementen), die von Pflanzen, Pflanzenviren oder anderen Organismen stammen oder synthetischen Ursprungs sind.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorgelegte Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Vektoren zur Erzeugung transgener Pflanzen und Pflanzenzellen, die dadurch erhalten werden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erzeugung von bestimmten, stabil vererbten Expressionsmustern, die in transgenen Linien gewünscht werden, sind immer noch ein Hauptproblem der Pflanzenbiotechnologie. Der normale Ansatz geht dahin, ein Transgen als Teil einer völlig unabhängigen Transkriptionseinheit in einen Vektor einzuführen, wobei das Transgen unter der Kontrolle von pflanzenspezifischen Promotor- und Terminationssequenzen gestellt wird, die entweder heterolog oder homolog sein können (US 05,591,605; US05,977,441; WO 0053762 A2; US 05,352,605). Viele verschiedene Wirtsfaktoren beeinflussen jedoch nach der Integration der exogenen DNS in die genomische Pflanzen-DNS die Genexpression ausgehend von solchen transkriptionellen Vektoren, weil die Insertion zufällig ist. Diese Faktoren machen die Expression des Transgens instabil, unvorhersehbar und führt oft in der Nachkommenschaft zu der Stilllegung (Silencing) des Transgens (Matzke & Matzke, 2000, Plant Mol. Biol., 43, 401-415; Gelvin, 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232; Vaucheret et al., 1998, Plant J., 16, 651-659). Es sind gut dokumentierte Beispiele für die Stilllegung (Silencing) von Transgenen in Pflanzen bekannt, welche die Prozesse des transkriptionellen (TGS) und des posttranskriptionellen (PTGS) Gen-Silencing einschließen. Neue Ergebnisse zeigen eine enge Verbindung zwischen der Methylierung und der Chromatinstruktur im TGS und die Beteiligung von einer RNS-abhängigen RNS-Polymerase und einer Nuklease im PTGS (Meyer, 2000, PlantMol. Biol., 43, 221-234; Ding, 2000, Curr. Opin. Biotechnol 11, 152-156; lyer et al. Plant Mol. Biol. 2000, 43, 323-346). So konnte im Fall des TGS gezeigt werden, dass der Promotor des Transgens bei vielen Integrationsstellen mit Chromatinstrukturen oftmals einer Methylierung unterliegt, die eine stabile Expression eines Transgens nicht begünstigt. Aus diesen Resultaten ergibt sich die Notwendigkeit, dass mit den existierenden Methoden praktisch immer mehrere, unabhängige, transgene Pflanzen hergestellt und in mehreren Generationen analysiert werden müssen, um diejenigen zu finden, die das gewünschte Expressionsmuster zeigen. Überdies hinaus können sogar diejenigen Pflanzen, die ein stabiles Expressionsmuster des Transgens durch Generationen hindurch aufweisen, danach immer noch unter natürlich auftretenden Bedingungen wie Stress oder Pathogenbefall einer Stilllegung (Silencing) des Transgen unterliegen. Existierende Ansätze haben eine verbesserte Expressionskontrolle zum Ziel. Dazu kann der Gebrauch von Scaffold attachment-Regionen, die die Transkriptionseinheit flankieren, gezählt werden (Allen, 1996, Plant Cell, 8, 899-913; Capham, 1995, J. Exp. Bot., 46, 655-662; Allen, 1993, Plant Cell, 5, 603-613). Diese können möglicherweise die Unabhängigkeit und die Stabilität der Expression eines Transgens erhöhen, indem die Abhängigkeit von den verschiedenen Varianten der sogenannten "Positionseffekte" reduziert wird (Matzke & Matzke, 1998, Curr Opin. Plant Biol., 1, 142-148; Gelvin, 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232; WO 9844 139 A1; WO 0000676757 A1; EP 1 005 560 A1; AU 00,018,331 A1). Sie stellen jedoch nur teilweise eine Lösung für das bestehende Problem dar, Pflanzen mit einem gewünschten Expressionsmuster eines Transgens zu erzeugen.

Das Gen-Silencing kann als ein pflanzlicher Verteidigungsmechanismus bei Virusinfektionen ausgelöst werden (Ratcliff et al., 1997, Science, 276, 1558-1560; Al-Klaff et al, 1998, Science, 279, 2113-2115). Dieses Silencing ist in nicht transgenen Pflanzen gegen das Pathogen gerichtet, während es in transgenen Pflanzen auch das Transgen stilllegen kann. Dies tritt besonders verstärkt auf, wenn das Transgen Sequenzhomologien mit dem Pathogen aufweist. Hieraus ergibt sich ein besonderes Problem, wenn viele, verschiedene Elemente viralen Ursprungs für die Konstruktion von transkriptionellen Vektoren verwendet werden. Ein anschauliches Beispiel hierfür stellt die kürzlich erschienene Publikation von Al-Kaff und Mitarbeiter dar, in der gezeigt wird, dass CaMV (Cauliflower Mosaic Virus)-Infektionen einer transgenen Pflanze die Expression des BAR- Gens stilllegt, die mit Hilfe des vom CaMV abstammenden 35S-Promotors vermittelt wird (Al-Kaff et al., 2000, Nature Biotech., 18, 995-999).

In den letzten Jahren erhöhte sich signifikant die Reihe der cis-regulatorischen Elemente, die zur Zeit die Instrumente für eine differenziertere, räumliche und zeitliche Kontrolle der Expression eines Transgens darstellen. Dies umfasst mehrere trans kriptionelle Elemente wie verschiedene Promotoren und Transkriptionsterminatoren sowie translationelle, regulatorische Elemente der Genexpression. Im Allgemeinen können die Translation verstärkende Elemente (Enhancers) als cis-agierende Elemente definiert werden, die zusammen mit zellulären trans-agierenden Faktoren die Translation der mRNS vermitteln. Die Translation in eukaryotischen Zellen wird generell durch das Absuchen der mRNS mittels der Ribosomen vom geschützten (capped) 5'-Ende der mRNS initiiert. Die Initiierung der Translation kann jedoch auch durch Mechanismen eingeleitet werden, die unabhängig von der CAP-Struktur sind. In diesem Fall werden die Ribosomen mit Hilfe einer internen, ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) zu dem ersten Codon des Translationstartes geleitet. Diese Elemente, die man zunächst in Picornaviren entdeckte, wurden dann auch in anderen viralen und zellulären eukaryotischen mRNSs identifiziert (Jackson & Kaminski, 1995, RNA, 1, 985-1000). IRES-Elemente sind cis-agierende Elemente, die zusammen mit anderen zellulären trans-agierenden Faktoren, den Aufbau des ribosomalen Komplexes am internen Startcodon der mRNS vermitteln. Diese hervorstechende Eigenschaft wurde in der Konstruktion von Vektoren ausgenutzt, die eine Expression von zwei oder mehreren Proteinen mittels einer polycistronischen Transkriptionseinheit in tierischen Zellen oder Insektenzellen erlauben. Gegenwärtig sind IRES-Elemente in bicistronischen Ex pressionsvektoren für tierische Systeme weit verbreitet, wobei das erste Gen CAP-abhängig und das zweite Gen unter der Kontrolle des IRES-Elementes translatiert wird (Mountford & Smith, 1995, Trends Genet., 4, 179-184; Martines-Salas, 1999, Curr Opin. Biotech. 19, 458-464). Gewöhnlich variiert die Expression eines Gens, das unter der Kontrolle eines IRES-Elementes steht, signifikant und bewegt sich in einem Bereich von 6-100% im Vergleich zu der CAP-abhängigen Expression des ersten Gens (Mizuguchi et al., 2000, Mol Ther., 1, 376-382). Diese Ergebnisse haben wichtige Implikationen in bezug auf den Gebrauch von IRES-Elementen. So muss zum Beispiel entschieden werden, welches Gen als erstes in einem bicistronischen Vektor verwendet werden soll. Die Anwesenheit eines IRES-Elementes in einem Expressionsvektor verleiht eine selektive Translation nicht nur unter normalen Bedingungen, sondern auch unter Bedingungen, bei denen die CAP abhängige Translation inhibiert ist. Dieses geschieht normaler Weise unter Stressbedingungen wie Virusinfektionen, Hitzeschock, Wachstumsarretierung oder Ähnlichem, weil notwendige trans-agierende Faktoren nicht anwesend sind (Johannes & Sarnow, 1998, RNA, 4, 1500-1513; Sonenberg & Gingras, 1998, Curr Opin. Cell Biol., 10, 268-275).

Die auf der Translation basierenden Vektoren zogen kürzlich die Aufmerksamkeit der Wissenschaftler auf sich, die mit tierischen Zellsystemen arbeiten. Ein Artikel beschreibt den Gebrauch einer (RES-Cre Rekombinase-Kassette, mit der eine gewebespezifische Expression der Cre Rekombinase in Mäusen erreicht wurde (Michael et al., 1999, Mech. Dev., 85, 35-47). In dieser Arbeit wurde eine neue IRES-Cre Kassette in die Exon-Sequenz des EPHA2-Gens eingeführt. Das EPHA2-Gen kodiert dabei für den EPH-Rezeptor einer Protein-Tyrosinkinase, die in der frühen Entwicklungsphase exprimiert wird. Diese Arbeit ist von speziellem Interesse, weil es die erste Demonstration eines translationellen Vektors für die Gewebe spezifische Expression eines Transgens in tierischen Zellen ist, die sich auf die transkriptionelle Kontrolle der Wirts-DNS stützt. Eine andere wichtige Anwendung der IRES- Elemente ist ihr Gebrauch in Vektoren für die Insertionsmutagenese. In diesen Vektoren ist der Reporter oder der selektierbare Marker unter der Kontrolle eines IRES-Elementes und kann nur exprimiert werden, wenn er innerhalb einer transkribierten Region eines transkriptionell aktiven Gens inseriert ist (Zambrowich et ah, 1998, Nature, 392, 608-611; Araki et at, 1999, Cell Mol Biol 45, 737-750). Trotz des Fortschrittes, der in der Anwendung von IRES-Elementen im tierischen System gemacht wurde, sind jedoch IRES- Elemente aus diesem System in Pflanzenzellen nicht funktionell. Darüber hinaus wurden ähnliche Ansätze mit Pflanzenzellen nicht in Betracht gezogen, weil die Sequenz gerichtete oder homologe Rekombination in Pflanzenzellen extrem selten auftreten und von keinem praktischen Nutzen sind.

Es stehen wesentlich weniger Daten von pflanzenspezifischen IRES-Elementen zur Verfügung. Unlängst jedoch wurden mehrere IRES-Elemente in dem Tobamovirus crTMV entdeckt, die auch in Pflanzen aktiv sind (Ivanov et al., 1997, Virology, 232, 32-43; Skulachev et al., 1999, Virology, 263, 139-154; WO 98/54342). crTMV ist ein TMV Virus, der Kreuzblütler infiziert. Daneben gibt es Hinweise, dass IRES-Elemente auch in anderen Pflanzenviren eine Translationskontrolle ausüben (Hefferon et al, 1997, J. Gen. Virol., 78, 3051-3059; Niepel & Gallie, 1999, J. Virol., 73, 9080-9088). Die IRES-Technologie hat ein großes Potential im Bereich der Erzeugung von transgenen Pflanzen und pflanzlichen, viralen Vektoren, die eine geeignete Alternative zu bestehenden Vektoren darstellen. Bis heute liegt die einzige Anwendung von pflanzlichen IRES-Elementen darin, ein Gen von Bedeutung mit Hilfe von IRES-Sequenzen in einem bicitronischen Konstrukt zu exprimieren, das stabil, nukleär transformiert wurde (WO 98/54342). Dieses besagte Konstrukt umfasst dabei in 5'-3' Richtung, einen Transkriptionspromotor, das erste Gen, das mit dem besagten Trans-kriptionspromoter verbunden ist, ein IRES-Element, das am 3-Ende des ersten Gens lokalisiert ist und das zweite Gen, das am 3'-Ende des IRES-Elementes lokalisiert ist, d. h. es enthält noch den ganzen Satz der Transkriptionskontrollelemente.

Überraschenderweise haben wir gefunden, dass translationelle Vektoren, die ohne ihre eigenen Transkriptionskontrollelemente auskommen und ganz von der Insertion in eine transkriptionell aktive, genomische DNS abhängen, die Gewinnung von zahlreichen Transformanden erlauben, die das Zielgen exprimieren. Noch erstaunlicher war es, dass wir solche Transformanden sogar in Wirtspflanzen mit einem sehr geringen Anteil von transkriptionell aktiver DNS in ihrem Genom wie z. B. in Weizen sehr leicht detektieren konnten. Diese Entdeckung ist die Basis für das vorgeschlagene Verfahren, der die Expression eines Transgens erlaubt, die vollkommen von der Transkriptionsmaschinerie der Wirtszelle kontrolliert wird. Somit wird die Anzahl der genetisch heterologen DNS-Elemente minimiert, die dafür bekannt sind das Gen-Silencing auszulösen. Dadurch wird ebenfalls ein neuer Weg der Transgenkontrolle möglich, indem das Verhältnis von CAP-abhängiger gegen CAP-unabhängiger Translation moduliert wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Abb. 1 zeigt die Expression des Transgens von vier Translationsvektoren aus einer Vielzahl von möglichen Varianten.

A - der Vektor enthält ein Translation verstärkendes Element (Enhancer) und einen Translationsstop;

B - der Vektor enthält ein IRES-Element als Translationverstärker und eine Region, die die Transkription terminiert;

C - identisch zu B, zusätzlich ist dem IRES-Element ein Translations-Stop-Codon in allen drei Leserastern vorangestellt;

D - identisch zu C, außer, dass der Vektor von Intron/Exon Begrenzungsregionen (3'I-5'E und 3'-5'I) flankiert wird, um die Eigenschaften eines Exons einzuführen und um den Einbau in die prozessierte mRNS zu erleichtern.

Abb. 2 zeigt den Vektor plC1301 mit dem IRES_MP,75 ^CR-Element, dem BAR-Gen und dem 35S-Terminator.

Abb. 3 zeigt den Vektor plC1521 mit der "Haarnadelstruktur", dem IRES_MP,148 ^CR- Element, dem BAR-Gen und dem 35S-Terminator. Die "Haarnadelstruktur" dient dabei als Alternative zu einem Translations-Stop-Codon, um die Bildung eines translationellen Fusionsproduktes zu verhindern.

Abb. 4 zeigt den Vektor plC1451 mit dem BAR-Gen und dem 35S-Terminator ohne Promotor.

Abb. 5 zeigt den Vecktor plC052 mit loxP, HPT und NOS-Terminator.

Abb. 6 zeigt den Vektor plC06-IRES mit dem IRES_MP,75 ^CR-Element und dem AHAS- Gen, wobei das AHAS-Gen die mutierte Version des Arabidopsis Acetohydroxysäure- Synthase Gens ist, das eine Resistenz gegenüber Imidazol-Herbiziden verleiht.

Abb. 7 zeigt den Vektor plC-DOG und plC-CRE mit der Sequenz der 2- Deoxyglucose-6-phosphat (2-DOG-6-P) Phosphatase aus Hefe bzw. der Cre Rekombinase unter der Kontrolle des Reis Actin-Promotors.

Abb. 8 zeigt den translationellen Vektor plC-dSpm mit einem integrierten Transposon-element und den Vektor plC1491 mit der Transposase. pHBT ist ein chimärer Promotor, der eine Fusion des 35S-enhancer mit dem basalen Teil des C4PPDK-Gens aus Weizen darstellt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Ein primäres Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens oder Vektors, um transgene Pflanzen für die stabile Expression von transgenem Material, das in dem Pflanzengenom integriert wurde, zu erzeugen.

Dieses Ziel wird durch ein Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen oder Pflanzenzellen erreicht, die eine transgene codierende Zielsequenz unter transkriptioneller Kontrolle eines Kernpromotors eines Wirtes exprimieren können, durch Einführen eines Vektors in das Kerngenom, wobei der Vektor in seinem Transkript eine Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen in einer zur Initiation der Translation funktionellen Form aufweist sowie, stromabwärts davon, die transgene codierende Sequenz, und anschließende Selektion von Pflanzenzellen oder Pflanzen, die die transgene codierende Sequenz exprimieren. Das Zielgen steht unter der Kontrolle eines Translationssignals wie dem IRES-Element und ist nicht operativ mit einem Promotor verbunden. Diese Translationssignale sind dabei nicht auf die IRES-Sequenzen limitiert. Solche Vektoren hängen von der Insertion des Transgens in transkriptionell aktive DNS- Abschnitte des Wirtsgenoms ab.

Ferner wird ein neuer Vektor für die Transformation von Pflanzenzellen zur Verfügung gestellt, wobei der Vektor, wahlweise nach Prozessierung in der Wirtszelle, in seinem Transkript eine Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen in einer zur Initiation der Translation funktionellen Form umfasst sowie, stromabwärts davon, eine codierende Sequenz, wobei der Vektor frei von einem für die Transkription der codierenden Sequenz funktionsfähigen Promotor ist.

Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen definiert.

Die Konstruktion von Vektoren für die stabile Transformation von Pflanzen wurde von zahlreichen Autoren beschrieben (für Übersichtsartikel siehe Hansen & Wright, 1999, Trends in Plant Science, 4, 226-231; Gelvin, 1998, Curr. Opin. Biotech., 9, 227-232). Das Basisprinzip all dieser Konstrukte ist identisch - eine völlig funktionelle Transkriptionseinheit, die in 5'-3' Richtung einen pflanzenspezifischen Promotor, den strukturellen Teil des Gens von Bedeutung und einen transkriptionellen Terminator umfasst, muss in die Pflanzenzelle eingeführt und stabil in das Genom integriert werden, damit die Expression des Gens von Bedeutung erzielt wird.

Wir haben eine andere Technologie zur Erzeugung von stabilen, nukleären Pflanzentransformanden entwickelt. Unsere Erfindung stützt sich dabei auf den überraschenden Befund, dass die Transkriptionsmaschinerie der Wirtspflanze in der Lage ist, die Bildung der mRNS eines Transgens von Bedeutung in einer transformierten Pflanzenzelle zu bewirken. Das vorgeschlagene Verfahren nutzt Vektoren, die ein Gen von Bedeutung besitzen, das in diesen besagten Vektoren nicht operativ mit einem Promotor verbunden ist. Eigentlich bestehen sie nur aus der kodierenden Region eines Zielgens, das unter der Kontrolle eines Translationselementes steht. Dieses translationelle Element kann eine Sequenz zur Bindung eines cytoplasmatischen Ribosoms aus Pflanzen sein, wodurch die Translation einer kodierenden Sequenz erreicht wird. Die kodierende Sequenz liegt dabei unterhalb dieses Elementes und die Bindung an diese Sequenz sollte bevorzugt nach der Transkription stattfinden. Bevorzugterweise ist dieses translationelle Element eine Ribosomeneingangssstelle, die funktionell in Pflanzen ist. Noch bevorzugter sollte es ein pflanzenspezifisches IRES-Element, wenigstens aber ein IRES-Element aus einem Pflanzenvirus oder einer Pflanze sein, wobei es auch nicht pflanzlichen Ursprungs oder ein künstlich konstruiertes IRES-Element sein kann.

Diese Vektor-DNS erzeugt nach der Integration in eine transkribierte Region eines residenten Gens eine chimäre mRNS, die anschließend in das Protein von Bedeutung translatiert wird. Dabei wird die Translation von der besagten Sequenz für die Bindung eines pflanzlichen, cytoplasmatischen Ribosoms initiiert (Abb. 1). Nach unserem besten Wissen gibt es keine anderen Ansätze auf diese Weise stabile, nukleäre Pflanzentransformanden zu erzeugen.

Da der Anteil von transkriptionell aktiver DNS in Pflanzengenomen gering ist, war es sehr überraschend, dass die Transformationsexperimente mit den in dieser vorliegenden Erfindung beschriebenen, translationellen Vektoren zahlreiche Transformanden hervor brachten, die das Gen von Bedeutung exprimierten.

Unsere Erfindung bezieht sich auf die bevorstehenden Probleme der zuverlässigen Expression eines Transgens. Die Expression eines Transgens, das mit Hilfe unseres erfundenen Verfahrens in das Wirtsgenom integriert wird, hängt von der Transkriptionamaschinerie, die alle oder fast alle transkriptionellen, regulatorischen Elemente der residenten Wirtsgene einschließt, ab. Auf diese Weise wird die Stilllegung eines Transgens (Gen-Silencing), das gewöhnlich von xenogenetischen DNS-Elementen ausgelöst wird, minimiert.

Die Vektoren, die für die Integration eines Transgens verwendet werden, können auf verschiedenste Art und Weise konstruiert werden. Die einfachste Version besteht nur aus der Kodierungssequenz des Zielgens oder eines Teils desselben und einem Translationssignal (Grundversion des translationellen Vektors). In einem bevorzugten Vektor ist ein Translations-Stop-Signal stromaufwärts der Zielsequenz des pflanzlichen, cytoplasmatischen Ribosoms vorhanden. Das Stop-Signal kann zum Beispiel wenigstens ein Stop-Codon und/oder eine sekundäre Haarnadelstruktur in der RNS oder etwas Ähnliches sein. Dieses Stop-Signal verursacht den Abbruch der Translation der oberhalb gelegenen Sequenzen. Fortgeschrittene Versionen der Vektoren können ein pflanzen spezifisches IRES-Element enthalten, dem die kodierende Sequenz des Zielgens folgt. Oder sie können Sequenzen für die ortspezifische Rekombination enthalten, die entweder den Austausch eines existierenden Transgens oder die Integration irgendeines zusätzlichen Zielgens in die transkribierte Region der Wirts-DNS erlauben (für Übersichtsartikel siehe Corman & Bullock, 2000, Curr. Opin. Biotechnol., 11, 455-460). Ortspezifische Rekombinasen/Integrassen aus Bakteriophagen und Hefen werden häufig gebraucht, um DNS in vitro oder in Pflanzen zu manipulieren. Beispiele für Rekombinase spezifische Rekombinationsstellen, die für diese Erfindung eingesetzt werden können, sind im Folgenden aufgelistet: CRE Rekombinase-LoxP Rekombinationsstellen, FLP Rekombinase- FRT Rekombinationsstellen, R Rekombinase-RS Rekombinationsstellen, pHiC31 Integrase attp/attB Rekombinationsstellen etc.

Die Einbringen von Splicing-Stellen in den translationellen Vektor kann dazu verwendet werden, die Wahrscheinlichkeit der Inkorporation eines Transgens in das prozessierte Transkript zu erhöhen.

Der Vektor kann ferner eine Sequenz, die für ein Targeting Signalpeptid kodiert und zwischen der besagten Sequenz zur Bindung eines pflanzlichen, cytoplasmatischen Ribosoms und besagter kodierenden Sequenz lokalisiert ist, enthalten. Ein bevorzugtes Beispiel für dieses Signalpeptid kann ein Plastiden Transitpeptid, ein Transitpeptid für Mitochondrien, ein nukleäres Targeting-Signalpeptid, ein vakuoläres Targeting-Peptid und Sekretions-Signalpeptid sein.

Verschiedene Methoden können verwendet werden, um den translationellen Vektor in die Pflanzenzelle zu bringen. Dies schließt die direkte Einführung des Vektors in eine Pflanzenzelle mittels Mikroprojektilbeschuss, Elektroporation oder PEG-vermittelter Behandlung von Protoplasten ein. Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation ist auch einen effizienter Weg, um den translationellen Vektor einzubringen. Die T-DNS Insertionsmutagenese in Arabidopsis und Nicotiana mit dem promotorlosen Reportergen APH(3')II, das in der Nähe der rechten T-DNS-border lokalisiert war, zeigte, dass wenigstens 30% aller Insertionen eine transkriptionelle und translationelle Genfusion induzierten (Koncz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. ScL, 86, 8467-8471).

Ein translationeller Vektor kann ebenfalls in ein transponierbares Element kloniert werden, um passende, transkribierte Regionen zu finden und um entweder konstitutive oder gewebe-/organspezifische Expressionmuster für das Transgen zu erzielen. Transponierbare Elemente werden intensiv in Pflanzen genutzt, um Gene auf Grund ihrer Inaktivierung zu isolieren (Pereira & Aarts, 1998, Methods Mol Biol., 82, 329-338; Long & Coupland, Methods MoL Biol 82, 315-328; Martin, 1998, Curr Opin. Biotechnol., 9, 220-226). Verschiedene Versionen der Transposon-Markierungssysteme wurden entwickelt. In der einfachsten Version, werden Transposons für die Insertionsmutagenese ohne irgendeine Modifikation, außer der Einführung von Deletionen oder Frame shift-Mutationen, um nicht autonome transponierbare Elemente zu generieren, genutzt. In weiter entwickelten Versionen sind zusätzliche Gene wie zum Beispiel re-Insertionsmarker, Reportergene oder Plasmid-rescue-Vektoren in das transponierbare Element integriert (Carroll et al, 1995, Genetics, 13, 407-420; Tissier et al., 1999, The Plant Cell, 11, 1841-1852). Daneben gibt es auch sogenannte Enhancer-trap und Gene-trap-Systeme (Sundaresan et at, 1995, Genes Dev., 9, 1797-1810; Fedorov & Smith, 1993, Plant J., 3, 273-289). Die transponierbaren Elemente dieser Systeme sind entweder mit einem Reportergen ohne Promotor oder einem Reportergen unter der Kontrolle eines Minimalpromotors ausgestattet. In dem ersten Fall kann das Reportergen nach der Insertion in eine transkribierte Region der Wirts-DNS exprimiert werden. Dabei muss die Insertion unmittelbar nach einem Wirtspromotor oder in eine kodierende Region des Wirtsgens stattfinden, so dass eine Fusionstranskript ent sprechend des Leserasters des Wirtsgens erzeugt wird.

Die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Fusion "im Leseraster" kann signifikant durch die Einführung von Splicing donor und acceptor sites für alle drei Leseraster vor dem Reportergen erhöht werden (Nussaume et at, 1995, Mol. Gen. Genet., 249, 91-101). In dem zweiten Fall wird die Transkription des Reportergens ausgehend von dem minimalen Promotor aktiviert, wobei das Konstrukt in der Nähe eines aktiven Wirtspromotors inseriert ist (Klimyuk et at, 1995, Mol. Gen. Genet., 249, 357-365). Der Erfolg von solchen Ansätzen für das Transposon-Tagging zeigt die Möglichkeiten der ähnlichen Ansätze für die translationalen Vektoren, die ein IRES-Element vor dem Zielgens inseriert haben.

Alle Ansätze, die zuvor beschrieben wurden, zielen auf das Design eines Systems ab, ein Transgen unter der Expressionskontrolle eines residenten Gens zu stellen, in welches die Insertion stattgefunden hat. Dieses kann für spezifische Aufgaben oder in bestimmten Fällen von Vorteil sein. In vielen, anderen Fällen wird vielleicht ein verändertes Expressionsmuster des Transgens bevorzugt. In solchen Anwendungen kann der translationelle Vektor mit transkriptionell aktiven Elementen ausgestattet werden. Dazu gehören zum Beispiel Enhancer-Elemente, die das Expressionsmuster des Transgens modulieren. Es ist bekannt, dass Enhancer-Sequenzen die Stärke von Promotoren, die mehrere tausend Basenpaare entfernt sind, beeinflussen können (Müller, 2000, Current Biology, 10, 241-244). Die Durchführbarkeit solcher Ansätze wurde in Activation tagging- Experimenten in Arabidopsis und in den oben beschriebenen Enhancer-trap Transposon Tagging-Experimenten demonstriert. In den Activation tagging-Experimenten veränderte ein 35S-enhancer-Element in der T-DNS das Expressionsmuster von residenten Genen (Weigel et al., 2000, Plant Physiol., 122, 1003-1013). In den Enhancer-trap Transposon Tagging- Experimenten bestimmten die Enhancer-Elemente der residenten Gene die Expressionsmuster der Reportergene. Dieser Ansatz kann zum Beispiel in den Anfangsstadien einer Pflanzentransformation oder wenn das Expressionsmuster des Transgens nach der Transformation verändert werden soll, sehr nützlich sein. Die Enhancer-Sequenzen können sehr leicht mit Hilfe von Sequenz spezifischen Rekombinationssystemen in Abhängigkeit der Bedürfnisse der Anwendung verändert (inseriert, deletiert oder entfernt) werden.

Unsere Vorgehensweise war es, einen Satz von Konstrukten mit IRES-Elementen zu erzeugen, die in Pflanzenzellen funktionell sind. Diese Konstrukte enthielten IRES- Elemente, denen ein Selektionsmarker für Pflanzen und ein Transkription/Translation- Terminationssignal folgte. Gleichzeitig konnten diese Konstrukte direkt für Pflanzenzelltransformationen, nachdem sie vom 5'-Ende vor der IRES-Sequenz linearisiert wurden, eingesetzt werden. Oder sie konnten in eine T-DNS für den Agrobacterium vermittelten DNS-Transfer kloniert werden. Ein anderer Satz von Konstrukten, die als Kontrollen dienten, enthielten entweder ein Selektionsmarkergen ohne Promotor (negative Kontrolle) oder ein selektierbares Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors, der funktionell in monokotylen und/oder dikotylen Zellen ist (positive Kontrolle). Die DNS wurde mit Hilfe verschiedener Technologien in Pflanzenzellen transformiert. Dazu gehörten Ti- Plasmidvektoren aus Agrobakterien (US 5,591,616; US 4,940,838; US 5,464,763), Projektil- oder Mikroprojektilbeschuss (US 05100792; EP 00444882 B1; EP 00434616 B1). Im Prinzip können auch andere Pflanzentransformationsmethoden wie Mikroinjektion (WO 09209696; WO 09400583 A1; EP 17596681), Elektroporation (EP 00564595 B 1; EP 00290395 B1; WO 08706614 A1) verwendet werden, wobei weitere Transformationsmethoden nicht auf diese beschränkt sind.

Die Transformationsmethode hängt von der Pflanzenspezies ab, die transformiert werden soll. Unsere Beispiele enthalten Daten bezüglich der Transformations-effizienzen für repräsentative Pflanzenarten der Monokotylidonen (z. B. Triticum monococcum) und Dikotylidonen (z. B. Brassica napus, Orichophragmus violaceous). Auf diese Weise wird die Durchführbarkeit unseres Ansatzes für Pflanzenspezies verschiedensten phylogenetischen Ursprungs und mit unterschiedlicher Dichte der transkribierten Regionen in dem Speziesgenom demonstriert.

Die transgene Kodierungssequenz in dem Vektor kann nur ein Teil eines Zielgens repräsentieren. In diesem Fall wird das Gen mit Hilfe der Sequenz gerichteten oder homologen Rekombination in der funktionellen Länge wieder hergestellt. Die Translation der Zielsequenz ist bevorzugt CAP-unabhängig. Der Wirt kann in der Art modifiziert werden, dass die CAP-abhängige Translation inhibiert (oder verstärkt) oder die CAP-unabhängige Translation verstärkt (oder inhibiert) wird. Dies kann zum einen durch Behandlung von exogenen Agenzien oder durch die Einführung einer Sequenz in den Vektor oder der Pflanze erreicht werden, dessen Expression den gewünschten Effekt hat.

BEISPIELE BEISPIEL 1 Konstruktion von Vektoren, die IRES-Elemente enthalten

IRES-vermittelte Expressionsvektoren wurden mit Hilfe von Standardmethoden der Molekularbiologie konstruiert (Maniatis et al 1982, Molecular cloning: a Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Der Vektor plC1301 (Abb. 2) wurde durch Verdau des Plasmids plC503 (p35S-GFP-IRES_MP,75 ^CR-BAR-35S Terminator in pUC120) mit Hind III und darauffolgender Religation des großen, gelelektrophoretisch gereinigten Fragments hergestellt. Die IRES_MP,75 ^CR-Sequenz stellt die 3'-terminalen 75 Basen der nicht translatierten 5'-Leader- Sequenz der subgenomischen RNS des Movement-Proteins (MP) aus dem Kruziferen infizierenden Tobamovirus (CRTMV) dar.

Der Vektor plC1521 (Abb. 3) wurde in den drei folgenden Klonierungsschritten hergestellt. Im ersten Schritt wurde das Plasmid plC1311 (nicht dargestellt) durch Ligation des großen HindIII-Pstl-Fragmentes aus dem Plasmid plC031 mit dem kleinen HindIII-Ncol Fragment aus dem Plasmid plC032 und dem kleinen BspHl-Pstl-Fragment aus dem Plasmid plC018 konstruiert. Das resultierende Plasmid, welche das unter dem 35S-Promotor stehende BAR-Gen enthält, wurde als vergleichende Kontrolle in den Transformationsexperimenten eingesetzt. Das Plasmid plC1311 wurde mit HindIII-Nrul verdaut und die Restriktionsenden mit dem Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I aufgefüllt. Anschließend wurde das große Restriktionsfragment gelelektrophoretisch aufgereinigt und religiert, wodurch das Plasmid plC1451 geschaffen wurde (BAR-35S Terminator ohne Promotor; Abb. 4). Durch Ligation des großen Sacl-Pstl Fragmentes aus dem Plasmid plC1451 mit dem kleinen Sacl-Ncol Fragment aus dem Plasmid plC033 und dem kleinen BspHl-Pstl Fragment aus dem Plasmid plC018 wurde das Plasmid plC1521 (Abb. 3) hergestellt. Dieses Konstrukt enthält eine "Haarnadel- Struktur" vor dem IRES_CP,148 ^CR-Element (CP steht hierbei für das Hüllprotein, Coat protein). Die "Haarnadelstruktur" kommt durch das Vorhandensein einer invertierten Tandem-Wiederholung, die mit Hilfe des Kpnl-EcoRl bzw. des Call-Kpnl Fragmentes der Polylinkersequenz aus dem Blueskript II SK+-Plasmid gebildet wird, zustande.

Sämtliche Vektoren wurden für die Transformationsexperimente linearisiert, indem sie entweder mit dem Restriktionsenzym Sacl (plC1521; plC1451) oder HindIII (plC1311; plC1301) geschnitten wurden. Nicht verdaute Vektor-Plasmid-DNS wurde mittels Gelelektrophorese entfernt.

BEISPIEL 2 PEG-vermittelte Protoplasten-Transformation von Brassica nanus Isolierung der Protoplasten

Die Isolierung von Brassica Protoplasten basierte auf bereits vorhandenen Protokollen (Glimelius, 1984, Physiot Plant., 61, 38-44; Sundberg & Glimelius, 1986, Plant Science, 43, 155-162 und Sundberg et al, 1987, Theor. Appl. Genet., 75, 96-104). Sterilisierte Samen (siehe Appendix) wurden in 90 mm Petrischalen ausplatiert, die ½ MS-Medium mit 0.3% Gelrite enthielten. Die Samen wurden in Reihen mit geringen Abständen voneinander auf dem Medium platziert. Die Petrischalen wurden verschlossen und in einem Winkel von 45° geneigt sechs Tage im Dunkeln bei 28°C aufbewahrt. Die Hypokotylen wurden mit einer scharfen Rasierklinge in 1-3 mm lange Stücke geschnitten. Dabei wurden die Klingen immer wieder erneuert, um eine Mazerisierung des Materials zu vermeiden. Die geschnittenen Stücke wurden in TVL-Lösung gegeben (siehe Appendix), um die Zellen zu plasmolysieren. Anschließend wurde das Material 1-3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Vorbehandlung verbesserte signifikant die Ausbeute an intakten Protoplasten. Die Plasmolyse-Lösung wurde durch 8-10 ml der Enzym- Lösung ersetzt (siehe Appendix). Die Enzym-Lösung sollte dabei das gesamte Material bedecken, aber nicht in einem Überschuss eingesetzt werden. Das Material wurde dann bei 20-25°C im Dunkeln für wenigstens 15 Stunden auf einem Rundschüttler mit leichter Schüttelbewegung inkubiert. Die Mischung aus Protoplasten und zellulärer Debris wurde anschließend durch einen Filter mit einer Maschenweite von 70 mm filtriert. Die Petrischalen wurden mit 5-10 ml W5-Lösung (siehe Appendix) gespült (Menczel et al., 1981, Theor. Appl. Genet., 59, 191-195). Anschließend wurde diese Waschlösung ebenfalls filtriert und mit der Protoplastensuspension vereinigt. Die Protoplastensuspension wurde in ein steriles 40 ml Falcon-Röhrchen überführt und bei 120 g für 7 min zentrifugiert, um die Protoplasten zu pelletieren. Der Überstand wurde verworfen und das Protoplastenpellet in 0.5 M Saccharose resuspendiert. Die Suspension wurde wiederum in ein steriles 10 ml Zentrifugenröhrchen überführt (8 ml pro Zentrifugenröhrchen), mit 2 ml W5-Lösung aufgefüllt und 10 min bei 190 g zentrifugiert. Anschließend konnten die intakten Protoplasten mit Hilfe einer Pasteurpipette aus der Interphase abgezogen werden. Nach dem Transfer in neue Zentrifugenröhrchen wurden sie in 0.5 Manitol mit 10 mM CaCl₂ resuspendiert und erneut mit 120 g (5 min) pelletiert.

PEG-Behandlung

Die Protoplasten wurden in dem Transformationspuffer resuspendiert (siehe Appendix). Die Protoplastenkonzentration wurde mit Hilfe einer Zählkammer bestimmt und auf einen Wert von 1-1.5 × 10⁶ Protoplasten/ml eingestellt. Ein 100 µl Tropfen dieser Suspension wurde am unteren Rand einer gekippten 6 cm Petrischale aufgetragen und für einige Minuten stehen gelassen, so dass die Protoplasten sich absetzen konnten. Die Protoplasten wurden dann mit 50-100 µl der DNS-Lösung (Qiagen gereinigt, gelöst in TE, Konzentration 1 µg/ml) vorsichtig gemischt. Anschließend wurden 200 µl der PEG-Lösung (siehe Appendix) tropfenweise zu dieser Protoplasten/DNS-Mischung gegeben. Nach 15-30 min wurde in kleinen Aliquots (tropfenweise) der Transformationspuffer (oder W5-Lösung) soweit zugegeben, dass die Petrischale fast gefüllt war (~ 6 ml). Die Suspension wurde für 1-5 Stunden stehen gelassen. Anschließend wurden die Protoplasten in ein Zentrifugenröhrchen überführt, resuspendiert und wiederum mit 120 g (5-7 min) pelletiert.

Protoplastenkultur und Selektion der Transformanden

Die Protoplasten wurden in das Kulturmedium 8pM überführt und bei 25°C, geringer Lichtintensität, in 2.5 cm oder 5 cm Petrischalen mit 0.5 ml bzw. 1.5 ml Medium inkubiert (Kao & Michayluk, 1975, Planta, 126, 105-110; siehe auch Appendix). Die Protoplastendichte betrug 2.5 × 10° Protoplasten/ml. Drei Volumen frisches 8pM-Medium ohne Hormonzusatz wurde nach der ersten Protoplastenteilung zugesetzt. Die Zellen wurden für 16 Stunden pro Tag bei hoher Lichtintensität inkubiert.

Nach 10 bis 14 Tagen wurden die Zellen auf das mit 0.13% Agarose verfestigte Differenzierungsmedium K3 mit 0.1 M Saccharose, 5-15 mg/l Phosphinotricin (PPT) transferiert (Nagy & Maliga, 1976, Z. Pflanzenphyslol., 78, 453-455). Die Hormonkonzentration in diesem Medium war vier Mal geringer als in dem 8pM-Medium. Um die Zellen auf frisches Medium zu transferieren, wurden die Zellen auf ein steriles Filterpapier gebracht und vorsichtig in einer dünnen Schicht auf diesem Papier verteilt. Die Zellen wurden 16 Stunden pro Tag bei hoher Lichtintensität gehalten. Zellkolonien mit einem Durchmesser von rund 0.5 cm wurden schließlich auf K3-Medium transferiert.

BEISPIEL 3 Transformation von Triticum monococcum mittels Mikroprojektilbeschuss Pflanzenzellkultur

Eine Suspensionszellkulturlinie von T. monococcum L. wurde in MS2-Medium (MS- Salze, 0.5 mg/l Thiamine HCl, 100 mg/l Inosit, 30 g/l Saccharose, 200 mg/l Bacto-Trypton, 2 mg/l 2,4-D) in einem 250 ml Erlenmeyerkolben auf einem Rundschüttler mit 160 rpm bei 25°C angezogen (Murashige & Skoog, 1962, Physiol. Plant., 15, 473-497). Die Subkultivierung erfolgte wöchentlich. Vier Tage nach der Subkultivierung wurden die Zellen auf einem sterilem 50 mm Filterpapier verteilt und mit dem Filterpapier auf das mit Gelrite (4 g/l) verfestigte MS2-Medium mit 0.5 M Saccharose gebracht.

Mikroprojektilbeschuss

Der Mikroprojektilbeschuss wurde mit Hilfe des Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System der Firma BioRad durchgeführt. Die Zellen wurden bei einem Druck von 900-1100 psi, mit einer Distanz von 15 mm vom Makrocarrier zum Stopping screen und einer Distanz von 60 mm vom Stopping screen zum Zielgewebe beschossen. Der Abstand zwischen Rupture disk und Makrocarrier betrug 12 mm. Die Zellen wurden nach vierstündiger, osmotischer Vorbehandlung beschossen.

Die Beschichtung der Goldpartikel mit DNS wurde nach dem Orginalprotokoll von BioRad in folgender Weise durchgeführt: 25 µl eines Goldpuders (0.6-1 µm) in 50% Glycerol (60 mg/ml) wurde mit 5 µl Plasmid-DNS (0.2 µg/µl), 25 µl 2.5 M CaCl₂ und 10 µl 0.1 M Spermidin gemischt. Die Mischung wurde 2 min gevortext ung. 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, zentrifugiert (2000 rpm, 1 min) und mit 70%igem bzw. 99.5%igem Ethanol gewaschen. Schließlich wurde das Pellet in 30 µl 99.5%igem Ethanol resuspendiert und die beschichteten Partikel für den Beschuss verwendet (6 µl/Schuss) (Sanford et aL, 1993, in: Methods in Enzymology, Hrsg. R. Wu. 217, 483-509).

Eine neue Methode der Goldbeschichtung (PEG/Mg) wurde wie folgt durchgeführt: 25 µl einer Goldsuspension (60 mg/ml in 50% Glycerol) wurde mit 5 µl Plasmid-DNS in einem Eppendorfgefäß gemischt und danach mit 30 µl einer 40%igen PEG-Lösung in 1.0 M MgCl₂ ergänzt. Die Mischung wurde für 2 min gevortext und weitere 30 min bei Raumtemperatur belassen. Nach der Zentrifugation dieser Mischung (2000 rpm, 1 min) wurde das Pellet zweimal mit 1 ml 70%igem Ethanol, einmal mit 99.5%igem Ethanol gewaschen und schließlich in 30 µl 99.5%igen Ethanol aufgenommen. Ein Aliquot dieser DNS- Goldsuspension von 6 µl wurde auf die Makrocarrier-Scheibe aufgetragen. Diese wurde anschließend 5 bis 10 min getrocknet, bevor sie für den Beschuss eingesetzt wurde.

Plasmid-DNS Präparation

Plasmid-DNS wurde in den E. coli Stamm DH10B transformiert, um Maxipreparationen der Plasmide durchzuführen. Die Zellen wurden hierfür in LB-Medium angezogen und die DNS mit dem entsprechenden Kit der Firma Qiagen aufgereinigt.

Selektion

Für stabile Transformationsexperimente wurden die Filter mit den beschossenen Zellen auf verfestigtes MS2-Medium mit dem entsprechenden, selektiven Agens (150 mg/l Hygromycin B (Duchefa); 10 mg/l Bialaphos (Duchefa)) transferiert. Die verwendeten Antibiotika wurden vor der Zugabe zum Medium steril filtriert. Die Inkubation der Platten erfolgte bei 26°C im Dunklen.

BEISPIEL 4 Transformation von Orychophragmus violaceus mittels Mikroprojektilbeschuss Präparation der Zellsuspensionskultur

O. violaceus Pflanzen wurden für 3 bis 4 Wochen in vitro auf mit 0.3% Gelrite verfestigtem MS-Medium (alternativ ½ MS mit 2% Saccharose und 0.8% Agar) bei 24°C und einer Photoperiode von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkel angezogen. In Abhängigkeit von der Größe wurden vier bis sechs Blätter in kleine Stücke geschnitten und in eine Magenta-Box mit 30 ml Kallus induzierendem Medium (Callus inducing medium (CIM), siehe Appendix) transferiert. Das Material wurde 4 bis 5 Wochen im Dunkeln oder bei reduziertem Licht stark geschüttelt. Während dieser Zeit wurde frisches CIM-Medium nachgefüllt, um das Pflanzengewebe in der Magenta Box immer mit Flüssigkeit zu bedecken.

Zellen, die sich an den Wänden der Magenta Box befanden, wurden durch heftiges Invertieren und Schütteln der Box wieder resuspendiert.

Präparation des Pflanzenmaterials für den Mikroprojektilbeschuss

Ein Aliquot einer Zellsuspension wurde vorsichtig auf ein steriles Filterpapier in einer mit verfestigtem CIM-Medium gefüllten Petrischale gegeben und für fünf bis sieben Tage im Dunkeln gehalten. Vier Stunden vor dem Beschuss wurde das Filterpapier mit den Zellen auf frisches CIM-Medium mit 10% Saccharose überführt. Der Mikroprojektil-beschuss wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. 14 Stunden nach dem Beschuss wurde das Material auf CIM-Medium mit 3% Saccharose transferiert und wiederum im Dunkeln gehalten.

Selektion der Transformanden

Zwei bis vier Tage nach dem Beschuss wurden die Zellen auf Platten mit CIM-Medium mit dem entsprechenden Selektionsagens (10-15 µg/ml PPT) transferiert. Alle sieben Tage wurde das Material auf frisches Selektionsmedium transferiert. Die Platten wurden im Dunkeln gehalten und nach ungefähr sechs Wochen wurde das Pflanzenmaterial auf Medium transferiert, das die Morphogenese induziert (Mophogenesis Inducing Medium MIM, siehe Appendix). Dem MIM-Medium war ebenfalls das entsprechende Selektionsagens (10-15 µg/ml PPT) zugesetzt. Die Platten wurden anschließend bei hoher Lichtintensität und einer Tageslänge von 16 Stunden inkubiert.

BEISPIEL 5 Transformation von Triticum monococcum mit dem promotorlosen loxP-HPT-Gen

Plasmid-DNS des Konstruktes plC052 (Abb. 5) wurde mit Hilfe des Restriktionsenzym Hindlil linearisiert und anschließend Gel-gereinigt, um unverdaute DNS zu entfernen. Die so vorbereitete Plasmid-DNS wurde für den Mikroprojektil-beschuss wie in Beispiel 3 beschrieben eingesetzt. Der linearisierte Vektor enthält neben dem pUC19-Polylinker (57 bp) eine loxP Rekombinationssequenz, die an dem 5'-Ende des HPT-Gens lokalisiert ist, so dass nach dem Verdau ungefähr 100 bp vor dem 5'-Ende des Translationsstartkodons des HPT- Gens verbleiben. Insgesamt wurden 34 Platten beschossen und nach 1½ Monaten der Hygromycin-Selektion (siehe Beispiel 3) wurden drei Hygromycin resistente Kolonien selektiert. Die Sequenz der Integrationsstelle wurde mit Hilfe einer inverse PCR-Analyse (iPCR) identifiziert. Diese Analyse bestätigte die Unabhängigkeit der Integrationen in den drei Transformanden.

BEISPIEL 6 Transformation von Orychophraamus Blättern mit dem promotorlosen IRES_MP,75 ^CR-AHAS- Gen

Die pflanzliche Acetohydroxysäure Synthase (AHAS) ist ein nukleär kodiertes Gen, dessen Genprodukt in die Chloroplasten transportiert wird. Es katalysiert den ersten Schritt im Biosyntheseweg der Aminosäuren mit verzweigten Kettenresten. Das Enzym steht unter der allosterischen Kontrolle dieser Aminosäuren und kann durch mehrere Klassen von Herbiziden inhibiert werden.

Das Konstrukt plC06-IRES wurde erzeugt, indem der Promotor des Arabidopsis AHAS-Gens (1.3 kb Pstl-Ncol-Fragment) in plC06 durch die IRES_MP,75 ^CR-Sequenz ersetzt wurde. Das Endkonstrukt (Abb. 6) enthält die mutierte Version des Arabidopsis Acetohydroxysäure Synthase Gens (AHAS) mit einem Aminosäureaustausch an der Position 653 (Ser653-Asn), der zu einer Resistenz gegenüber der Imidazol-Herbizidfamilie führt (Sathasivan, Haughn & Murai, 1991, Plant Physiol., 97, 1044-1050). Das Plasmid wurde mittels Sall-Restriktion linearisiert und für den Mikroprojektil-beschuss von Zellen einer frisch induzierten O. violaceous Suspensionskultur eingesetzt. Blätter von steril aufgezogenen O. violaceous Pflanzen wurden dazu in kleine Stücke geschnitten und in flüssiges hoch Auxin Medium (High Auxin medium, HAM; siehe Appendix) gegeben und in Magenta Boxen einem Rundschüttler geschüttelt, um eine Suspensionskultur zu induzieren. Nach 7-14 Tagen wurde die Suspensionskultur mit Hilfe von sterilen Filterpapieren auf Petrischalen mit Ergrünungsmedium (Greening medium, GM; siehe Appendix) transferiert. Nach drei Tagen wurde das Filterpapier mit den Zellen auf GM-Medium mit 0.4 M Saccharose umgesetzt. Vier Stunden später wurden die Zellen für die Mikroprojektilbeschuss-Experimente mit linearisierter plC06-IRES-DNS wie in Beispiel 3 beschrieben eingesetzt. 14 Stunden nach dem Beschuss wurde das Filterpapier mit den Zellen auf GM-Medium mit 0.3% Saccharose transferiert. Zwei Tage nach diesem Transfer wurden die Zellen auf GM-Medium mit 0.7 µM Imazethapyr (AC263, 499 oder Pursuit, American Cyanamid) umgesetzt. Die Subkultivierung der Zellen erfolgte alle 7-10 Tage. Putative Integrationsereignisse wurden ungefähr nach vier bis sechs Wochen identifiziert. Transformanden wurden unter folgenden Bedingungen selektiert: hohe Lichtintensität 16 Stunden Lichtdauer, Regenerierungsmedium (RM) mit 1-2 µM Imazethapyr (siehe Appendix).

BEISPIEL 7 Expression des 2-DOG-6-P-Gens mit Hilfe eines translationellen Vektors

Das Ziel dieses Beispiels ist es, die Möglichkeit der Manipulation von transgenen Pflanzenzellen zu demonstrieren, die schon eine translationelle Vektorsequenz mit Sequenz spezifischen Rekombinationsstellen besitzen.

Die Hygromycin resistenten, mit dem Vektor plC052 transformierten T. monococcum Zellen (Beispiel 5) wurden für ein Mikroprojektilbeschuss-Experiment mit zwei Plasmiden, plC-DOG and plC-Cre (Abb. 7) eingesetzt. Das Plasmid plC-DOG enthält dabei die promotorlose 2-Deoxyglucose-6-phosphat (2-DOG-6-P) Phosphatase cDNS (WO 98/45456), die von zwei IoxP-Sequenzen flankiert wird. Die Cre Rekombinase vermittelte Integration des 2-DOG-6-P-Gens in die loxP-Stellen des plC052-Konstruktes in den Transformanden führt zu der Expression des 2-DOG-6-P-Proteins mit Hilfe eines residenten Promotors. Diese Expression verleiht der Zelle eine Resistenz gegenüber 2-Deoxyglucose (2-DOG). Die resistenten Kolonien wurden wie in Beispiel 3 beschrieben selektiert, wobei das selektives Agens 2-DOG in einer Konzentration von 0.075-0.1% eingesetzt wurde.

BEISPIEL 8 Translationeller Vektor, der ein Transposon inkorporiert hat

Das Ziel dieses Beispiels ist es, einen alternativen Weg der direkten Transformation eines translationellen Vektors, der gerichtet in eine gewünschte, transkriptionell aktive Stelle des Wirtsgenom integriert, zu zeigen.

Dazu wurde eine Co-Transformation mit dem in Abb. 8 gezeigten Konstrukten in O. violaceous Zellen durchgeführt. Die Selektion der Transformanden erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben. Das nicht autonome, transponierbare dSpm-Element enthält dabei das promotorlose BAR-Gen, dem auf der 5'-Seite das IRES_MP,75-^CR-Element vorangestellt ist. Die durch die Spm-Transposase induzierte Transposition bewirkt die Suche nach einer transkriptionell aktiven Region mit einem gewünschten Expressionsmuster (in diesem Fall ist diese konstitutiv) innerhalb des besagten Wirtsgenoms. Auf diese Weise wird die Anzahl der primären Transformanden erhöht. Die Anzahl der Transformanden war um drei bis vier Mal höher als mit dem IRES_MP,75 ^CR-BAR-Gen allein (plC1301, Abb. 2).

Appendix Samensterilisation

Samen werden für mindestens 2 Stunden (über Nacht ist bevorzugt) in 1% PPM- Lösung eingeweicht. Anschließend werden sie für eine Minute in 70% EtOH gewaschen und dann in 10% Hypochlorit-Lösung mit 0.01% SDS oder Tween 20 in einem 250 ml Erlenmeyerkolben auf einem Rundschüttler sterilisiert. Anschließend werden sie in 0.5 l sterilem Wasser gewaschen.

TVL

0.3 M Sorbitol
0.05 M CaCl₂

× 2H₂

O
pH 5.6-5.8

Enzym-Lösung

1% Cellulase R10
0.2% Macerase R10
0.1% Dricelase gelöst in 8 pM Makrosalze mit 0.5 M
pH 5.6-5.8

W5

18.4 g/L CaCl₂

× 2H₂

O
9.0 g/L NaCl
1.0 g/L Glucose
0.8 g/L KCl
pH 5.6-5.8

PEG-Lösung

40% (w/v) of PEG-2000 in H₂O

CIM

Macro MS
Micro MS
Vitamin B5
MES 500 mg/L
PVP 500 mg/L
Sucrose 30 g/L
2.4-D 5 mg/L
Kin 0.25 mg/L
Gelrite 3 g/L
pH 5.6-5.8

MIM

Macro MS
Micro MS
Vitamin B5
MES 500 mg/L
PVP 500 mg/L
Sucrose 30 g/L
ABA 1 mg/L
BA 0.5 mg/L
IAA 0.1 mg/L
Gelrite 3 g/L
pH 5.6-5.8

Greening Medium (GM)

Macro MS
Micro MS
Vit B5
MES 500 mg/L
PVP 500 mg/L
Sucrose 30 g/L
BA 2 mg/L
Kin 0.5 mg/L
NAA 0.1 mg/L
pH 5.6-5.8

High Auxine Medium (HAM)

Macro MS
Micro MS
Vit B5
MES 500 mg/L
PVP 500 mg/L
Sucrose 30 g/L
NAA 5 mg/L
Kin 0.25 mg/L
BA 0.25 mg/L
pH 5.6-5.8

Regenerationsmedium

Macro MS
Micro MS
Vit B5
MES 500 mg/L
PVP 500 mg/L
Sucrose 30 g/L
ABA 1 mg/L
BA 0.5 mg/L
IAA 0.1 mg/L
pH 5.6-5.8

Hormonlösungen wurden filtersterilisiert und den autoklavierten Medien zugesetzt.

Claims

1. Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen oder Pflanzenzellen, die eine transgene codierende Zielsequenz unter transkriptioneller Kontrolle eines Kernpromotors eines Wirtes exprimieren können, durch Einführen eines Vektors in das Kerngenom, wobei der Vektor in seinem Transkript eine Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen in einer zur Initiation der Translation funktionellen Form aufweist sowie, stromabwärts davon, die transgene codierende Sequenz, und anschließende Selektion von Pflanzenzellen oder Pflanzen, die die transgene codierende Sequenz exprimieren.

2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Vektor zwischen der Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen und der transgenen codierenden Sequenz ferner eine Sequenz aufweist, die für ein Signalleitpeptid (targeting signal peptide) codiert.

3. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Vektor stromaufwärts der Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen weiterhin ein translatorisches Stopsignal enthält.

4. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Vektor stromaufwärts der Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen und/oder stromabwärts der transgenen codierenden Sequenz ferner Spleißdonor- und/oder Spleißakzeptorstellen aufweist.

5. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Vektor zusätzlich Translationsenhancer aufweist.

6. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Vektor zusätzlich Transkriptionsenhancer aufweist.

7. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Vektor zusätzlich ein oder mehrere Cistrons stromabwärts der transgenen codierenden Sequenz enthält, wobei diese zusätzlichen Cistrons operationell an zusätzliche Sequenzen zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen gekoppelt sind oder unter der Kontrolle eines oder mehrerer Promotoren stehen.

8. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Vektor ferner eine oder mehrere Rekombinationsstellen aufweist, die von Rekombinasen erkannt werden.

9. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen eine Ribosomeneingangsstelle (ribosome entry site) ist.

10. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen eine interne Ribosomeneingangsstelle (internal ribosome entry site) pflanzenviraler Herkunft ist.

11. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen eine interne Ribosomeneingangsstelle (internal ribosome entry site) pflanzlicher Herkunft ist.

12. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen eine interne Ribosomeneingangsstelle (internal ribosome entry site) nichtpflanzlicher Herkunft ist.

13. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen eine künstlich entworfene interne Ribosomeneingangsstelle (internal ribosome entry site) ist.

14. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 13, wobei das Signalleitpeptid aus der Gruppe bestehend aus einem Plastidenleitpeptid, einem mitochondrialen Leitpeptid, einem Kernsignalleitpeptid, einem Vakuolenleitpeptid und einem Sektretionssignalpeptid ausgewählt ist.

15. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die transgene codierende Sequenz ein nützliches Merkmal verleiht.

16. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Vektor weiterhin in ein Transposon eingefügt ist, um den Vektor auf eine gewünschte Transkriptionsstelle im Kerngenom des Wirtes zu richten.

17. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Verfahren in Kombination mit irgendeiner Methode zur ortspezifischen oder homologen Transformation benutzt wird, die es erlaubt, den Vektor auf eine gewünschte Insertionsstelle zu richten.

18. Das Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die in dem Vektor vorliegende transgene codierende Sequenz lediglich einen Teil eines Zielgens darstellt und eine funktionsfähige Länge des Gens als Folge von ortspezifischer oder homologer Rekombination wiederhergestellt wird.

19. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Translation einer oder mehrerer der codierenden Sequenzen des Vektors Cap-unabhängig ist.

20. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Translation eines oder mehrerer Gene, die durch dieses Verfahren in das Kerngenom eingeführt werden, derart durch Modifizierung des Wirtes kontrolliert wird, dass die Cap unabhängige Translation gesteigert oder inhibiert wird oder dass die Cap-abhängige Translation gesteigert oder inhibiert wird.

21. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei der Vektor ferner einen in der Pflanze und/oder der Zelle funktionsfähigen Translationsterminationsbereich und/oder einen Transkriptionsterminationsbereich aufweist.

22. Vektor zur Transformation von Pflanzenzellen umfassend, wahlweise nach Prozessierung in der Wirtszelle, in seinem Transkript eine Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen in einer zur Initiation der Translation funktionellen Form sowie, stromabwärts davon, eine codierende Sequenz, wobei der Vektor frei von einem für die Transkription der codierenden Sequenz funktionsfähigen Promotor ist.

23. Der Vektor gemäß Anspruch 22, der zwischen der Sequenz zum Binden pflanzlicher cytoplasmatischer Ribosomen und der codierenden Sequenz ferner eine Sequenz aufweist, die für ein Signalleitpeptid codiert.

24. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 oder 23, der stromaufwärts der Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen weiterhin ein translatorisches Stopsignal enthält.

25. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 24, der stromaufwärts der Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen und/oder stromabwärts der codierenden Sequenz ferner Spleißdonor- und/oder Spleißakzeptorstellen aufweist.

26. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 25, der zusätzlich Translationsenhancer aufweist.

27. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 26, der zusätzlich Transkriptionsenhancer aufweist.

28. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 27, der zusätzlich ein oder mehrere Cistrons stromabwärts der codierenden Sequenz enthält, wobei diese zusätzlichen Cistrons operationell an zusätzliche Sequenzen zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen gekoppelt sind oder unter der Kontrolle eines oder mehrerer Promotoren stehen.

29. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 28, der ferner eine oder mehrere Rekombinationsstellen aufweist, die von Rekombinasen erkannt werden.

30. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei die Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen eine Ribosomeneingangsstelle (ribosome entry site) ist.

31. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei die Sequenz zum Binden pflanzlicher cytoplasmatischer Ribosomen eine interne Ribosomeneingangsstelle (internal ribosome entry site) pflanzenviraler Herkunft ist.

32. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei die Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen eine interne Ribosomeneingangsstelle (internal ribosome entry site) pflanzlicher Herkunft ist.

33. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei die Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen eine interne Ribosomeneingangsstelle (internal ribosome entry site) nichtpflanzlicher Herkunft ist.

34. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei die Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen eine künstlich entworfene interne Ribosomeneingangsstelle (internal ribosome entry site) ist.

35. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 23 bis 34, wobei das Signalleitpeptid aus der Gruppe bestehend aus einem Plastidenleitpeptid, einem mitochondrialen Leitpeptid, einem Kernsignalleitpeptid, einem Vakuolenleitpeptid und einem Sektretionssignalpeptid ausgewählt ist.

36. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 35, wobei die codierende Sequenz ein nützliches Merkmal verleiht.

37. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 36, der in ein Transposon eingefügt ist, um den Vektor auf eine gewünschte Transkriptionsstelle im Kerngenom des Wirtes zu richten.

38. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 37, wobei die Translation eines oder mehrerer der codierenden Sequenzen des Vektors Cap-unabhängig ist.

39. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 38, wobei der Vektor ferner einen in der Pflanzenzelle funktionsfähigen Translationsterminationsbereich und/oder einen Transkriptionsterminationsbereich aufweisen.

40. Pflanzenzellen und Pflanzen, die in ihrer transkriptionsaktiven genomischen DNA ein oder mehrere durch den Vektor einer der Ansprüche 22 bis 39 eingeführte Konstrukte aufweist.