MX2013000164A - Liposomas con lipidos que tienen valor de pka ventajoso para suministro de arn. - Google Patents

Liposomas con lipidos que tienen valor de pka ventajoso para suministro de arn.

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Abstract

Se suministra ARN que codifica un inmunogen en un liposoma para los propósitos de inmunización. El liposoma incluye lípidos los cuales tienen un pKa en el intervalo de 5.0 a 7.6 y, preferentemente una amina terciaria. Estos liposomas pueden tener una carga superficial esencialmente neutral en pH fisiológico y son efectivos para inmunización.

Description

LIPOSOMAS CON LIPIDOS QUE TIENEN VALOR DE pKa VENTAJOSO PARA SUMINISTRO DE ARN CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención está en el campo de un suministro no viral de ARN para inmunización.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El suministro de ácidos nucleicos para inmunizar animales ha sido una meta por varios años. Se han probado varios procedimientos, incluyendo el uso de ADN o ARN, de vehículos de suministro virales o no virales (o incluso vehículo no de suministro, en una vacuna "desnuda"), de vectores de replicación o de no replicación, o de vectores virales o no virales.
Permanece una necesidad para vacunas de ácido nucleico adicionales y mejoradas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo a la invención, se suministra un ARN que codifica un inmunogen en un liposoma para los propósitos de inmunización. El liposoma incluye lípidos los cuales tienen un pKa en el intervalo de 5.0 a 7.6. Idealmente ellípido con un pKa en este intervalo tiene una amina terciaria; esos lípidos se comportan en forma diferente de los lípidos como DOTAP o DC-Chol, los cuales tienen un grupo amina cuaternaria. En aminas de pH fisiológico con un pKa en Re : 238222 el intervalo de 5.0 a 7.6 tienen carga superficial neutral o reducida, mientras que un lípido como DOTAP es fuertemente catiónico. Los inventores han encontrado que los liposomas formados de lípidos de aminas cuarternarias (por ejemplo DOTAP) son menos adecuados para suministro de ARN que codifica inmunogen que los liposomas formados de lípidos de amina terciarios (por ej . DLinDMA) .
De esta forma la invención proporciona un liposoma que tiene una bicapa lipídica que encapsula un núcleo acuoso, en donde: (i) la bicapa lipídica comprende un lípido que tiene un pKa en el intervalo de 5.0 a 7.6, y preferentemente tiene una amina terciaria; y (ii) el núcleo acuoso incluye un ARN el cual codifica un inmunogen. Estos liposomas son adecuados para suministro in vivo del ARN a una célula vertebrada y son por lo tanto útiles como componentes en composiciones farmacéuticas para inmunizar sujetos contra varias enfermedades.
La invención también proporciona un proceso para preparar un liposoma que contiene ARN, que comprende etapas de: (a) mezclar ARN con un lípido en un pH el cual está bajo del pKa de lípidos pero está arriba de 4.5, para formar un liposoma en el cual se encapsula el ARN; y (b) incrementar el pH de la mezcla que contiene liposoma resultante para estar arriba del pKa de lípidos.
El liposoma La invención utiliza liposomas en las cuales se encapsula el ARN que codifica inmunogen. De sta forma el ARN es (como en un virus natural) separado de cualquier medio externo por la bicapa lipídica de liposoma, y la encapsulación es de esta forma encontrada para proteger ARN de digestión de ARNasa. Los liposomas pueden incluir algún ARN externo (por ejemplo en su superficie) , pero al menos la mitad del ARN (e idealmente todo de el) es encapsulado en el núcleo del liposoma. La encapsulación dentro de los liposomas es distinta de, por ejemplo, los complejos de lípidos/ARN descritos en la referencia 1.
Varios lípidos anfifílicos pueden formar bicapas en un ambiente acuoso para encapsular un núcleo acuoso que contiene ARN como un liposoma. Estos lípidos pueden tener un grupo de cabeza aniónico, catiónico o zwiteriónico hidrofílico. Los liposomas de la invención comprenden un lípido que tiene un pKa en el intervalo de 5.0 a 7.6, y lípidos preferidos con un pKa en este intervalo tienen una amina terciaria. Por ejemplo, pueden comprender 1,2-dilinoleiloxi-N, -dimetil-3 -aminopropano (DLinDMA, pKa 5.8), y/o 1, 2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA) . Otro lípido adecuado que tiene una amina terciaria es 1,2-dioleiloxi-N, N-dimetil-3 -aminopropano (DODMA) . Ver la Figura 3 y la referencia 2. Algunos de los lípidos de aminoácidos de la referencia 3 pueden también ser usados, como ciertos de los lípidos amino de la referencia 4. Lípidos útiles útiles con aminas terciarias en sus grupos de cabeza son descritos en la referencia 5, los contenidos completos de los cuales son incorporados en la presente para referencia.
Los liposomas de la invención pueden ser formados de un lípido sencillo o de una mezcla de lípidos, con la condición de que por lo menos uno de los lípidos tiene un pKa en el intervalo de 5.0 a 7.6 (y, preferentemente, una amina terciaria) . Dentro de este intervalo de pKa, los lípidos preferidos tienen un pKa de 5.5 a 6.7 por ej . Entre 5.6 y 6.8, entre 5.6 y 6.3, entre 5.6 y 6.0, entre 5.5 y 6.2 ó entre 5.7 y 5.9. El pKa es el pH en el cual 50% de los lípidos son cargados, dejando la mitad entre el punto donde los lípidos son cargados completamente y el punto donde los lípidos con completamente no cargados . Puede ser medido en varias formas, pero es medido preferentemente usando el método descrito posteriormente en la sección titulada "medición de pka" . El pKa típicamente debe ser medido para el lípido solo más que para el lípido en el contenido de una mezcla la cual también incluye otros lípidos (por ej . No realizado en la referencia 6, la cual ve el pKa de un SNALP más que de los lípidos individuales) .
Donde un liposoma de la invención es formada de una mezcla de lípidos, se prefiere que la proporción de aquellos lípidos los cuales tienen un pKa dentro del intervalo deseado deben ser entre 20-80% de la cantidad total de lípidos, por ejemplo entre 30-70%, o entre 40-60%. Por ejemplo, los liposomas útiles son mostrados posteriormente en los cuales 40% ó 60% del lípido total es un lípido con un pKa en el intervalo deseado. El resto puede ser hecho de por ejemplo colesterol (por ejemplo 35-50% de colesterol) y/o DMG (opcionalmente PEGilado) y/o DSPC. Las mezclas son usadas posteriormente. Estos valores de % son por cientos molares.
Un liposoma puede incluir un lípido anfifílico cuya porción hidrofílica es PEGilada (es decir modificado por unión covalente de un polietilenglicol) . Esta modificación puede incrementar la estabilidad y evitar la adsorción no específica de los liposomas. Por ejemplo, los lípidos pueden ser conjugados a PEG usando técnicas como aquellas descritas en la referencia 6 y 7. PEG proporciona los liposomas con un recubrimiento el cual puede conferir características farmacocinéticas favorables. La combinción de encapsulación eficiente de un ARN (particularmente un ARN de auto replicación) , un lípido catiónico que tiene un pKa en el intervalo de 5.0-7.6 y una superficie PEGilada, permite el suministro eficiente a múltiples tipos celulares (incluyendo tanto células inmunológicas y no inmunológicas) , por lo mismo produciendo una respuesta inmunologica más fuerte y mejor que cuando se usan aminas cuaternarias sin PEGilación. Varias longitudes de PEG pueden ser usadas, por ejemplo entre 0.5-8 kDa .
Los lípidos usados con la invención pueden ser saturados o insaturados. Se prefiere el uso de por lo menos un lípido insaturado para preparar liposomas. La Figura 3 muestra tres lípidos insaturados útiles. Si un lípido insaturado tiene dos colas, ambas colas pueden ser insaturadas, o puede tener una cola saturada y una cola no saturada .
Se usa una mezcla de DSPC, DLinDMA, PEG-DMG y colesterol en los ejemplos. Un aspecto independiente de la invención es un liposoma que comprende DSPC, DLinDMA, PEG-DMG y colesterol. Este liposoma encapsula preferentemente AR , como ARN de auto replicación por ejemplo que codifica un inmunogen.
Las partículas liposomales son usualmente divididas en tres grupos: vesículas multilaminares (MLV, por sus siglas en inglés) ; vesículas unilaminares pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés) ; y vesículas unilaminares grandes (LUV, por sus siglas en inglés) . MLV tienen múltiples bicapas en cada vesícula, formando varios compartimientos acuosos separados. SUV y LUV tienen una bicapa simple que encapsula un núcleo acuoso; SUV tiene típicamente un diámetro < 50 nm, y LUV tienen un diámetro > 50 nm. Las partículas liposomales de la invención son idealmente LUV con un diámetro en el intervalo de 50-220 nm. Para una composición que comprende una población de LUV con diferentes diámetros: (i) por lo menos 80% por número deben tener diámetros en el intervalo de 20-220 nra, (ii) el diámetro promedio (Zav, por intensidad) de la población está idealmente en el intervalo de 40-200 nm, y/o (iii) los diámetros deben tener un índice de polidispersidad < 0.2 Los complejos de liposoma/AR de referencia 1 son esperados para tener un diámetro en el intervalo de 600-800 nm y para tener una alta polidispersidad. El liposoma puede ser substancialmente esférico .
Las técnicas para preparar liposomas adecuadas son bien conocidas en la técnica por ejemplo ver las referencias 8 a 10. Se describe un método útil en la referencia 11 e implica mezclar (i) una solución etanólica de los lípidos (ii) una solución acuosa del ácido nucleico y (iii) amortiguador, seguido por mezclar, equilibrio, dilución y purificación. Los liposomas preferidos de la invención son obtenibles por este proceso de mezclado.
Proceso de Mezclado Como se menciona anteriormente, la invención proporciona un proceso para preparar un liposoma que contienen ARN, que comprende las etapas de. (a) mezclar ARN con un lípido en un pH el cual está bajo del pKa del lípido pero está arriba de 4.5; entonces (b) incrementar el pH a arriba del pKa del lípido.
De esta forma un lípido catiónico es cargado positivamente durante la formación de liposoma en la etapa (a) , pero el cambio de pH después de esto significa que la mayoría (o todo) de los grupos cargados positivamente llegan a ser neutrales. Este proceso es ventajoso para preparar liposomas de la invención, y por evitar un pH debajo de 4.5 durante la etapa (a) la estabilidad del ARN encapsulado es mej orada .
El pH en la etapa (a) está arriba de 4.5, y está idealmente arriba de 4.8. Usando un pH en el intervalo de 5.0 a 6.0, o en el intervalo de 5.0 a 5.5, puede proporcionar liposomas adecuados.
El pH incrementado en la etapa (b) está arriba del pKa del lípido. El pH está idealmente incrementado a un pH menor a 9, y preferentemente menro a 8. Dependiendo del pKa del lípido, el pH en la etapa (b) puede de esta forma ser incrementado para estar dentro del intervalo de 6 a 8 por ejemplo a pH 6.5 + 0.3. El incremento de pH de la etapa (b) puede ser logrado por transferir los liposomas en un amortiguador adecuado por ejemplo en solución salina amortiguada con fosfato. El incremento de pH de la etapa (b) es realizada idealmente después de que ha tomado lugar la formación de liposoma.
El ARN usado en la etapa (a) puede estar en solución acuosa, para mezclar con una solución orgánica del lípido (por ejemplo una solución etanólica, como en la referencia 11) . La mezcla puede entonces ser diluida para formar liposomas, después de lo cual puede ser incrementado el pH en la etapa (b) .
El ARN La invención es útil para suministro in vivo de ARN el cual codifica un inmunogen. El ARN es traducido por células no inmunológicas en el sitio de suministro, llevando a la expresión del inmunogen, y también provoca que las células inmunológicas secreten interferones del tipo I y/o citocinas proinflamatorias las cuales proporcionan un efecto adyuvante local . Las células no inmunológicAs pueden también secretar interferones del tipo I y/o citocinas proinflamatorias en respuesta al ARN.
El ARN es de cadena + y por lo tanto puede ser traducida por las células no inmunológicas sin necesitar cualesquiera etapas de replicación de intervención como transcripción inversa. Puede también enlazar a receptores de TLR7 expresados por células inmunológicas, por lo mismo iniciando un efecto adyuvante.
Los ARN de cadena + preferidos son de auto replicación. Una molécula de ARN de auto replicación (replicón) puede, cuando se suministra a una célula vertebrada incluso sin cualesquiera proteínas, llevar a la producción de ARN hijas múltiples por transcripción de si mismo (por medio de una copia antisentido la cual se genera de si misma) . Una molécula de ARN de autorreplicación es de esta forma típicamente una molécula de cadena + la cual puede ser traducida directamente después de suministrar a una célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente a ARN la cual entonces produce tanto transcripciones antisentido y sentido a partir del ARN suministrado. De esta forma el ARN suministrado lleva a la producción de ARN hijas múltiples. Estos ARN hijas, así como también transcripciones subgenómicas colineares, pueden ser traducidas por sí mismas para proporcionar expresión in si tu de un inmunogen codificado, o pueden ser transcritos para proporcionar transcripciones adicionales con el mismos entido como el ARN suministrado los cuales son traducidos para proporcionar expresión in situ del inmunogen. Los resultados totales de esta secuencia de transcripciones es una amplificación grande en el número de los ARN de replicón introducidos y por lo tanto el inmunogen codificado lleva a ser un producto de polipéptido principal de las células.
Como se muestra posteriormente, no se requiere actividad de auto replicación para un ARN para proporcionar un efecto adyuvante, aunque puede incrementar la secreción de post transíección de citocinas . La actividad de auto replicación es particularmente útil para lograr expresión de alto nivel del inmunogen por células no inmunológicas . Puede también incrementar la apoptosis de las células no inmunológicas .
Un sistema adecuado para lograr autorreplicación es usar un replicón de ARN a base de alfavirus. Estos replicones de cadena + sont raducidos después del suministro a una célula para dar una replicasa (o replicasa-transcriptasa) . La replicasa es traducida como una poliproteína la cual se autoescinde para proporcionar un complejo de replicación el cual crea copias de cadenas genómicas del ARN suministrado por cadena +. Estas transcripciones de cadena - pueden por si mismas ser transcritas para dar copias adicionales del ARN progenitor de cadena + y también para dar una transcripción subgenómica la cual codifica el inmunogen. La traducción de la transcripción subgenómica de esta forma lleva a expresión in situ del inmunogen por la célula infectada. Los replicones de alfavirus adecuados pueden usar una replicasa de un virus Sindbis, un virus forest Semliki, un virus de encefalitis equino del este, un virus de encefalitis equino de Venezuela, etc. Secuencias de virus del tipo imitante o silvestre pueden ser usadas, por ejemplo el mutante TC83 atenuado de VEEV ha sido usado en replicones (12) .
Una molécula de ARN de autorreplicación preferida de esta forma codifica (i) una ARN polimerasa dependiente a ARN la cual puede transcribir ARN a partir de la molécula de ARN de autorreplicación y (ii) un inmunogen. La polimerasa puede ser una alfavirus replicasa por ejemplo que comprende una o más de las proteínas de alfavirus nsPl, nsP2, nsP3 y nsP4.
Mientras que los genomas de alfavirus naturales codifican proteínas de viriones estructurales además de la poliproteína replicasa no estructural, se prefiere que las moléculas de ARN de autorreplicación de la invención no codifiquen proteínas estructurales de alfavirus. De esta forma un ARN de autorreplicación preferido puede llevar a la producción de copias de ARN genómicas de si mismas en una célula, pero no a la producción de viriones que contienen ARN. La incapacidad para producir estos viriones significa que, a diferencia del alfavirus del tipo silvestre, la molécula de ARN de autorreplicación no puede perpetuarse por si misma en forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfa virus las cuales son necesarias para perpetuación en virus del tipo silvestre están ausentes de ARN de autorreplicación de la invención y su lugar es tomada por gen que codifica el inmunogen de interés, de tal forma que la transcripción subgenómica codifica el inmunogen más que las proteínas de virión alfa virus estructural .
De esta forma una molécula de ARN de autorreplicación útil con la invención puede tener dos cuadros de lectura abierta. El primer cuadro de lectura abierta (5') codifica una replicasa; el segundo cuadro de lectura abierta (3') codifica un inraunogen. En algunas modalidades el ARN puede tener cuadros de lectura abierta adicionales (por ejemplo cadena abajo) por ejemplo para codificar además inmunogenes (ver posteriormente) o para codificar polipéptidos accesorios.
Una molécula de ARN de autorreplicación puede tener una secuencia 5' la cual es compatible con la replicasa codificada .
Las moléculas de ARN de auto replicación pueden tener varias longitudes pero son típicamente 5000-25000 nucleótidos largos, por ejemplo 8000-15000 nucleótidos, ó 9000-12000 nucleótidos. De esta forma el ARN es mayor que el observado en suministro de sima.
Una molécula de ARN útil con la invención puede tener una corona en el extremo 5' (por ejemplo una 7-metilguanosina) . Esta corona en el extremo puede incrementar la traducción in vivo del ARN.
El nucleótido 5' de una molécula de ARN útil con la invención puede tener un grupo 5' trifosfato. En un ARN coronado en el extremo este puede ser enlazado a una 7-metilguanosina por medio de un puente 5' a 5'. Un trifosfato 5" puede incrementar enlace de RIG-I y de esta forma promueve efectos adyuvantes .
Una molécula de ARN puede tener una cola 3' poli-A. Puede también incluir una secuencia de reconocimiento de polimerasa poli A (por ejemplo AAUAAA) cerca de su extremo 3' .
Una molécula de ARN útil con la invención típicamente será de cadena sencilla. Los ARN de cadena sencilla pueden generalmente iniciar un efecto adyuvante por enlazar a TLR7, TLR8, ARN helicasas y/o PKR. El ARN suministrado en forma de doble cadena (ARNdc) puede enlazar a TLR3 , y este receptor puede también ser accionado por dsRNA el cual es formado ya sea durante la replicacion de un ARN de cadena sencilla o dentro de una estructura secundaria de un ARN de cadena sencilla.
Una molécula de ARN útil con la invención puede ser preparado convenientemente por transcripción in vi tro (IVT por sus siglas en inglés) . IVT puede usar un templado (ADNc) y propagado en forma de plásmido en bacterias, o creado sintéticamente (por ejemplo por métodos de modificación de reacción de cadena polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) y síntesis de genes) . Por ejemplo, un ARN polimerasa dependiente a ADN (como el bacteriófago T7, T3 ó SP6 ARN polimerasas) puede ser usado para transcribir el ARN de un templado de ADN. Un coronado en el extremo apropiado y reacciones de adición de poli A pueden ser usados como se requiere (aunque el poli A de replicón es codificado usualmente dentro del templado de ADN) . Estas ARN polimerasas pueden tener requerimientos astringentes para el nucleótido 5' transcrito y en algunas modalidades estos requerimientos deben ser acoplados con los requerimientos de la replicasa codificada, para asegurar que el ARN transcrito por IVT puede funcionar eficientemente como un substrato para su replicasa autocodificada.
Como se discute enla referencia 13, el ARN de autorreplicación puede incluir (además de cualquier estructura de corona en el extremo 5') uno o más nucleótidos que tienen una nucleobase modificada. De esta forma el ARN puede comprender m5C (5-metilcitidina) , m5U (5-metiluridina) , m6A (N6-metiladenosina) , s2U (2-tiouridina) , Um (2'-0-metiluridina) , mlA (1-metiladenosina) m2A (2-metiladenosina) ; Am (2 ' -O-metiladenosina) ; ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenosina) ; i6A (N-isopenteniladenosina) ; ms2i6A (2-metiltio-N6isopenteniladenosina) ; io6A (N6- (cis-hidroxiisopentenil) adenosina) ; ms2io6A (2-metiltio-N6- (cis-hidroxiisopentenil) adenosina) ; g6A (N6-glicinilcarbamoiladenosina) ; t6A (N6-treonilcarbamoiladenosina) ,- ms2t6A (2-metiltio-N6-treonilcarbamoiladenosina) m6t6A (N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina) ; hn6A (N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina) ; ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina) ; Ar(p) (2'-0-ribosiladenosina (fosfato)); I (inosina) ; mil (1-metilinosina) ; m'Im (1 , 2 ' -O-dimetilinosina) ; m3C (3-metilcitidina) ; Cm (2T-0-metilcitidina) ; s2C (2-tiocitidina) ; ac4C (N4-acetilcitidina) ; f5C (5-fonnilcitidina) ; m5Cm (5,2-O-dimetilcitidina) ; ac4Cm (N4acetil2Tometilcitidina) ; k2C (lisidina) ; mlG (1-metilguanosina) ; m2G (N2-metilguanosina) ; m7G (7-metilguanosina) ; Gm (2 ' -O-metilguanosina) ; m22G (N2 , 2-dimetilguanosina) ; m2Gm (N2 , 2 ' -O-dimetilguanosina) ; m22Gm (N2 , 2 , 2 ' -0-trimetilguanosina) ; Gr(p) (2"-0-ribosilguanosina (fosfato) ) ; yW (wibutosina) ; o2yW (peroxiwibutosina) ; OHy (hidroxi ibutosina) ; OHyW* (hidroxiwibutosina bajomodificada) , imG (wiosina) mimG (metilguanosina) , Q (queuosina) ; oQ (epoxiqueuosina) ; galQ (galtactosil-queuosina) ,- manQ (raanosil-queuosina) ; preQo (7-ciano-7-deazaguanosina) ; preQi (7-aminometil-7-deazaguanosina) ; G (arcaeosina) , D (dihidrouridina) ; m5Um (5 , 2 '-O-dimetiluridina) ; s4U (4 -tiouridina) ; m5s2U (5-metil-2 -tiouridina) ; s2Um (2-tio-2 ' -O-metiluridina) ; acp3U (3- (3-amino-3 -carboxipropil) uridina) ; ho5U (5-hidroxiuridina) ; mo5U (5-metoxiuridina) ; cmo5U (ácido uridin 5-oxiacético) ; mcmo5U (éster metilo del ácido uridin 5 -oxiacético) ; chm5U (5-(carboxihidroximetil) uridina) ) ; mchm5U (éster metilo de 5-(carboxihidroximetil) uridina) ; mcm5U (5-metoxicarbonil metiluridina) ; mcm5Um (S-metoxicarbonilmetil-2-?-metiluridina) ; mcm5s2U (5 -metoxicarbonilmetil-2 -tiouridina) ; nm5s2U (5 -aminometil-2-tiouridina) ; mnm5U (5-metilaminometiluridina) ; mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridina) ; mnm5se2U (5-metilarainometil-2-selenouridina) ; ncm5U (5-carbamoilmetil-uridina) ; ncm5Um (5-carbamoilmetil-2 ' -O-metiluridina) ; cmnm5U (5-carboximetilaminometiluridina) ; cnmm5Um (5-carboximetilarainometil-2-L-0-metiluridina) ; cmnm5s2U ( 5 -carboximetilaminometil-2 - tiouridina) ; m62A (N6 , 6-dimetiladenosina) ; Tm (2 " -O-metilinosina) ; m4C (N4-metilcitidina) ; m4Cm (N4 , 2 -O-dimetilcitidina) ; hm5C (5-hidroximetilcitidina) ; m3U (3 -metiluridina) ; cm5U (5-carboximetiluridina) ; m6Am (N6 , T-O-diraetiladenosina) ; rn62Am (N6,N6,0-2-trimetiladenosina) ; m2'TG (N2 , 7-dimetilguanosina) ; m2'2'7G (N2,N2, 7-trimetilguanosina) ; m3Um (3,2T-0-dimetiluridina) ; m5D (5-metildihidrouridina) ; f5Cm (5-formil-2 ' -O-metilicitidina) ; mlGm (l,2'-0-diraetilguanosina) ; m'Am ( 1 , 2 -O-dimetiladenosina) irinometiluridina) ; tm5s2U (S-taurinometil -2-tiouridina) ) ; imG-14 (4 -demetilguanosina) ; imG2 (isoguanosina) ; ó ac6A (N6-acetiladenosina) ; hipoxantina, inosina, 8-oxo-adenina, derivados 7 -substituidos de los mismos, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4 -tiouracilo, 5-aminouracilo, 5- (C1-C6) -alquiluracilo, 5-metiluracilo, 5- (C2-C6) -alqueniluracilo, 5-(C2-C6)-alquiniluracilo, 5 - (hidroximetil) uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-(Cl-C6)-alquilcitosina, 5-metilcitosina, 5- (C2-C6) -alquenilcitosina, 5- (C2-C6) -alquinilcitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 7- deazaguanina, 8-azaguanina, 7-deaza-7-substituido guanina, 7-deaza-7- (C2-C6) alquinilguanina, 7 -deaza- 8 -substituido guanina, 8- idroxiguanina, 6-tioguanina, 8-oxoguanina, 2-aminopurina , 2-amino-6-cloropurina, 2 , 4 -diaminopurina, 2,6-diaminopurina, 8-azapurina, 7-deazapurina substituida, purina 7-deaza-7-substituida, purina 7-deaza-8-substituida, o un nucleótido abásico. Por ejemplo, un ARN de autorreplicación puede incluir una o más nucleobases de pirimidina modificada, como residuos de pseudouridina y/o 5-metilcitosina . En algunas modalidades, sin embargo, el ARN incluye nucleobases no modificadas, y puede incluir nucleótidos no modificados es decir todos los nucleótidos en el ARN son estándar A, C, G y U ribonucleótidos (excepto para cualquier estructura de corona en el extremo 5", el cual puede incluir una 7'-metilguanosina) . En otras modalidades, el ARN puede incluir una corona en el extremo S" que comprende una 7'-metilguanosina, y el primer 1, 2 ó 3 5 'ribonucleótidos pueden ser metilados en la posición 2' de la ribosa.
Un ARN usado con la invención idealmente incluye solamente enlaces de fosfodiéster entre nucleósidos, pero en algunas modalidades puede contener enlaces de fosforamidato, fosforotioato, y/o metilfosfonato.
Idealmente, un liposoma contiene tan pocos como 10 diferentes especies de ARN por ejemplo 5, 4, 3, ó 2 diferentes especies; más preferentemente, un liposoma incluye una especie de ARN sencilla, es decir todas las moléculas de ARN en el liposoma tienen la misma secuencia y misma longitud.
La cantidad de ARN por partícula puede variar. El número de moléculas de ARN de autorreplicación individuales por liposoma es típicamente 50 por ejemplo, <20, <10, <5 ó 1-4 por liposoma.
El inmunogen Las moléculas de ARN usadas con la invención codifican un inmunogen de polipéptido. Después de la administración de los liposomas el ARN es traducido in vivo y el inmunogen puede producir una respuesta inmunológica en el receptor. El inmunogen puede producir una respuesta inmunológica contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito (o, en algunas modalidades, contra un alérgeno; y en otras modalidades, contra un antígeno de tumor) . La respuesta inmunológica puede comprender una respuesta de anticuerpo (usualmente que incluye IgG) y/o una respuesta inmunológica mediada por células. El inmunogen de polipéptido producirá típicamente una respuesta inmunológica la cual reconoce el polipéptido bacteriano, viral, fúngico o parásito correspondiente (o alérgeno o tumor) , pero en algunas modalidades el polipéptido puede actuar como un mimotopo para producir una respuesta inmunológica la cual reconoce un sacárido bacteriano, viral, fúngico o parásito. El inmunogen será típicamente un polipéptido superficial por ejemplo una adhesina, una hemaglutinina, una glicoproteína de cubierta, una glicoproteína de pitón, etc.
Las moléculas de ARN de autorreplicación pueden codificar un inmunogen de polipéptido simple o polipéptidos múltiples. Los inmunogenes múltiples pueden ser presentados como un inmunogen de polipéptido sencillo (polipéptido de fusión) o como polipéptidos separados. Si los inmunogenes son expresados como polipéptidos separados entonces uno o más de estos pueden ser proporcionados con un IRES cadena arriba o un elemento de promotor viral adicional. Alternativamente, pueden ser expresados inmunogenes múltiples a partir de una poliproteína que codifica inmunogenes individuales fusionados a una proteasa autocatalítica corta (por ejemplo proteína 2A de virus de enfermedad de pie a boca), o como inteinas .
A diferencia de las referencias 1 y 14, el ARN codifica un inmunogen. Para evitar la duda, la invención no comprende ARN el cual codifica una luciferaza de luciérnaga o la cual codifica una proteína de fusión de ß-galactosidasa de E. coli o la cual codifica una proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) . También, el ARN no es ARN de timo de ratón total.
En algunas modalidades el inmunogen produce una respuesta inmunológica contra una de estas bacterias.
Neisseria eningitidis: los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, proteínas de membrana como adhesinas, autotransportadores , toxinas, proteínas de adquisición de hierro, y proteína de enlace del factor H. Una combinación de tres polipéptidos útiles es descrita en la referencia 17.
Streptococcus pneumoniae: los inmunogenes de polipéptido útiles son descritos en la referencia 16. Estos incluyen, pero no se limitan a, la subunidad de RrgB pilus, el precursor de beta-N-acetil-hexosaminidasa (spr0057) , spr0096, proteína de estrés general GSP-781 (spr2021, SP2216) , serina/treonina cinasa StkP (SP1732) , y adhesina superficial de neumococo PsaA.
Streptococcus pyogenes : inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en las referencias 17 y 18.
Moraxella catarrhalis Bordetella pertussis: los inmunogenes de pertussis útiles incluyen, pero no se limitan a, toxina de pertussis o toxoide (PT, por sus siglas en inglés) , hemaglutinina filamentosa (FHA, por sus siglas en inglés) , pertactina, y aglutinogenos 2 y 3.
Staphylococcus aureus: los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en la referencia 19, como una hemolisina, esxA, esxB, proteína de enlace de ferricromo (sta006) y/o la lipoproteína staOll.
Clostridium tetani: el inmunogen típico es toxoide tetánico .
Cornynebacterium diphtheriae: el inmunogen típico es toxoide de difteria.
Hae ophilus influenzae los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en las referencias 20 y 21.
Pseudo onas aeruginosa Streptococcus agalactiae : los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en la referencia 17.
Chlamydia trachomatis: los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, similar a OmpH, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA, y urG (por ejemplo como se describe en la referencia 22. LcrE [23] y HtrA [24] son dos inmunogenes preferidos.
Chlamydia pneumoniae: los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en la referencia 25.
Helicojacter pylori inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, CagA, VacA, NAP, y/o ureasa [26].
Escherichia coli: inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, inmunogenes derivados de E, coli enterotoxigénico (ETEC, por sus siglas en inglés) , E. coli enteroagregativo (EAggEC) , E. coli de adhesión difusa (DAEC, por sus siglas en inglés) , E. coli enteropatogénico (EPEC, por sus siglas en inglés) , E. coli patogénico extraintestinal (ExPEC, por sus siglas en inglés) y/o E. coli enterohemorrágico (EHEC, por sus siglas en inglés) . Cepas de ExPEC incluyen E. coli uropatogénica (UPEC, por sus siglas en inglés) y E. coli asociado a meningitis/sepsis (MNEC, por sus siglas en inglés) . Los inmunogenes de polipéptido de UPEC útiles son descritos en las referencias 27 y 28. Los inmunogenes de MNEC útiles son descritos en la referencia 29. Un inmunogen útil para varios tipos de E. coli es AcfD [32].
Bacillus anthracis Yersinia pestis: los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en las referencias 31 y 32.
Staphylococcus epidermis Clostridium perfringens o Clostridiu botulin s Legionella pneumophila Coxiella burnetii Brúcela, tal como B. Abortus, B. Canis, B. melitensis, B. neoto ae, B. ovis, B.suis, B .pinnipediae.
Francisella, como F. novicida, F. philo iragia, F. tularensis.
Neisseria gonorrhoeae Treponema pallidium Haemophilus ducreyi Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium Staphylococcus saprophyticus Yersinia enterocolitica Mycobacterium tuberculosis Rickettsia histeria monocytogenes Vibrio cholerae Salmonella typhi Borrelia burgdorferi Porphyromonas gingivalis Klebsiella En algunas modalidades el inmunogen produce una respuesta inmunoloica contra uno de estos virus : Orthomyxovirus: los inmunogenes útiles pueden ser de un virus de influenza A, B ó C, como la hemaglutinina, neuraminidasa, o proteínas M2 de matriz. Donde el inmunogen es de un virus de influenza A la hemaglutinina puede ser de cualquier subtipo por ejemplo Hl, H2 , H3 , H4 , H5 , H6, H7 , H8 , H9, H10, Hll, H12, H13, H14 , H15 ó H16.
Virus Paramyxoviridae: los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de pneumovirus (por ejemplo virus sincicial respiratorio, RSV) , rubulavirus (por ejemplo, virus de paperas) , paramixovirus (por ejemplo virus de parainfluenza) , Metapneumovirus y Morbilivirus (por ejemplo sarampión) .
Poxviridae: inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Orthopoxvirus como Varióla vera, incluyendo pero no limitado a, Varióla major y Varióla minor.
Picornavirus : los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Picornavirus, como enterovirus, Rinovirus, Heparnavirus, Cardiovirus y Aftovirus. En una modalidad, el enterovirus es un poliovirus por ejemplo poliovirus del tipo 1, tipo 2 y/o tipo 3.. En otra modalidad, el enterovirus es un enterovirus EV71. En otra modalidad, el enterovirus es un virus coxsackie A o B.
Bunyavirus: Los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a: aquellos derivados de un Orthobunyavirus, como el virus de encefalitis de California, un Phlebovirus, como virus de fiebre de Rift Valley o un Nairovirus, como virus de fiebre hemorrágica Crimean-Congo.
Heparnavirus: los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Heparnavirus, como virus de hepatitis A (HAV, por sus siglas en inglés) .
Filovirus : los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un filovirus, como el virus del Ebola (que incluye virus de Zaire, Ivory Coast, Reston o Sudan) , o un virus Marburg.
Togavirus: los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Togavirus, como un Rubivirus, un Alfavirus, o un Arterivirus. Esto incluye virus de rubéola.
Flavivirus: los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Flavivirus, como virus de encefalitis transportada en garrapta (TBE, por sus siglas en inglés), virus del dengue (tipos 1, 2, 3 ó 4), virus de fiebre amarilla, virus de encefalitis Japonesa, virus de Kyasanur Forest, virus de encefalitis del Nilo Occidental, virus de encefalitis de St. Louis, virus de encefalitis de primavera verano de rusia, virus de encefalitis de Powassan.
Pestivirus: Inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Pestivirus, como diarrea viral bovina (BVDV, por sus siglas en inglés) , fiebre de cerdo clásica (CSFV, por sus siglas en inglés) o enfermedad de Border (BDV por sus siglas en inglés) .
Hepadnavirus: Inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Hepadnavirus, como virus de Hepatitis B. Una composición puede incluir antígeno superficial de virus de hepatitis B (HbsAg) .
Otros virus de hepatitis: Una composición puede incluir un inmunogen de virus de hepatitis C, virus de hepatitis delta, virus de hepatitis E, o virus de hepatitis G.
Rhabdovirus: Los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a: aquellos derivados de un Rhabdovirus, como Lyssavirus (por ejemplo virus de rabia) y vesiculovirus (VSV, por sus siglas en inglés) .
Caliciviridae: Los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Calciviridae, como virus de Norwalk (Norovirus) , y virus como Norwalk, como virus de Hawaii y virus de nieve de montaña.
Coronavirus: los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un coronavirus SARS, bronquitis infecciosa aviaria (IBV, por sus siglas en inglés) , virus de hepatitis de ratón (MHV, por sus siglas en inglés) , y virus gastroenteritis transmisibles porcino (TGEV por sus siglas en inglés) . El inmunogen de coronavirus puede ser un polipéptido de pitón.
.Retrovirus.- Inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Oncovirus, un Lentivirus (por ejemplo HIV-1 ó HIV-2) o un Spumavirus .
Reovirus : inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Ortoreovirus , un rotavirus, un Orbivirus o un Coltivirus.
Parvovirus: Inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Parvovirus B19.
Virus de Herpes: Inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un virus herpes humano, como, por la forma de ejemplo solamente, virus de herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés) (por ejemplo HSV del tipo 1 y 2) , virus de Varicela zoster (VZV, por sus siglas en inglés) , virus de Epstein-Barr (EBV, por sus siglas en inglés) , citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés) , virus de herpes humano 6 (HHV6, por sus siglas en inglés), virus del herpes humano 7 (HHV7, por sus siglas en inglés), y virus del herpes humano 8 (HHV8, por sus siglas en inglés).
Papovavirus: los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de papilomavirus y poliomavirus . Los papilomavirus (humanos) pueden ser del serotipo 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 ó 65 por ejemplo de uno o más serotipos 6, 11, 16 y/o 18.
Adenovirus: los inmunogenes virales incluyen aquellos derivados de adenovirus serotipo 36 (Ad-36) .
En algunas modalidades, el inmunogen produce una respuesta inmunológica contra un virus el cual infecta pescado, como: virus de anemia de salmón infeccioso (ISAV, por sus siglas en inglés) , virus de enfermedad pancreática de salmón (SPDV, por sus siglas en inglés) , virus de necrosis pancreática infecciosa (IP V por sus siglas en inglés) , virus de pescado gato de canal (CCV, por sus siglas en inglés) , virus de enfermedad de linfocistis de pescado (FLDV, por sus siglas en inglés) , virus de necrosis hematopoyética infecciosa (IH V, por sus siglas en inglés) , virus de herpes koi, virus similar a salmón picorna (también conocido como virus similar a picorna de salmón atlántico) , virus de salmón encerrado (LSV, por sus siglas en inglés) , rotavirus de salmón del atlántico (ASR, por sus siglas en inglés) , virus de enfermedad de trucha fresa (TSD por sus siglas en inglés) , virus de tumor de salmón coho (CSTV, por sus siglas en inglés) , o virus de septicemia hemorrágica viral (VHSV, por sus siglas en inglés) .
Los inmunogenes fúngicos pueden ser derivados de Dermatophytres, incluyendo: Epidermophyton floccusu , Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsu , Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubru , Trichophyton schoenleini , Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. álbum, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, y/o Trichophyton faviforme; o de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus níger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi , Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp. , Septata intestinalis y Enterocytozoon bieneusi ; los menos comunes son Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pytriumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosper , Sporothrix schenckii , Trichosporon beigelii , Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp. , Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp. , Rhizopus spp, Mucor spp. , Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp, Alternaría spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomhyces spp, Pithomyces spp, y Cladosporium spp.
En algunas modalidades el inmunogen produce una respuesta inmunológica contra un parásito a partir del género Plasmodium, como P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale. De esta forma la invención puede ser usada para inmunizar contra malaria. En algunas modalidades el inmunogen produce una respuesta inmunológica contra un parásito de la familia Caligidae, particularmente aquellas de los géneros Lepeophtheirus y Caligus, géneros por ejemplo piojos marinos como Lepeophtheirus salmonis o Caligus rogercresseyi.
En algunas modalidades el inmunogen produce una respuesta inmunológica contra: alérgenos de polen (alérgenos de polen de árboles, hierba, mala hierba y pasto) ; alérgenos de insectos o arácnidos (alérgenos de inhalante, saliva y veneno por ejemplo alérgenos de termitas, cucarachas y alérgenos de mosquitos, alérgenos de veneno de himenoptera) ; alérgenos de cabello animal y caspa (por ejemplo de perro, gato, caballo, rata, ratón, etc.) y alergenes de alimentos (por ejemplo una gliadina) . Alérgenos de polen importantes de árboles, pastos y hierbas son de origen de órdenes taxonómicos de Fágales, Oléales, Piñales y platanaceae que incluyen, pero no se limitan a, pájaros (Betula) , aliso (Alnus) , avellano (Corylus) , carpe (Carpinus) y oliva (Olea) , cedro (Cryptomeria y Juniperus) , platanar (Platanus) , el orden de Poales que incluyen pastos del género Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Sécale y Sorghum, los órdenes de Asterales y Urticales que incluyen hierbas del género Ambrosia, Artemisia y Parietaria. Otros alérgenos de inhalación importantes son aquellos de termitas de polvo de casa del género Dermatophagoides y Euroglyphus, termitas de almacenamiento por ej . Lepidoglyphis , Glycyphafus y Tyrophagus, aquellos de cucarachas, mosquitos y moscas, por ejemplo Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides, y aquellos de mamíferos como gato, perro y caballo, alérgenos de veneno que incluyen los que se originan de insectos que pican o penetrantes como aquellos del orden taxonómico de hymenoptera que incluye abejas (Apidae) , avispas (Vespidea) y hormigas (Formicoidae) .
En algunas modalidades el inmunogen es un antígeno de tumor seleccionado de: (a) antígenos de cáncer de testículos como NY-ESO-1, SSX2 , SCP1 así como también polipéptidos de la familia RAGE, BAGE, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1 , GAGE- 2 , MAGE-1 , MAGE- 2 , MAGE-3 , MAGE-4 , MAGE-5 , MAGE-6 y MAGE- 12 (los cuales pueden ser usados, por ejemplo, para manejar el melanoma, pulmón, cabeza y cuello. Tumores de NSCLC, mama, gastrointestinal y vejiga; (b) antígenos mutados, por ejemplo, p53 (asociado con varios tumores sólidos, por ejemplo, cáncer colorrectal, pulmón, cabeza y cuello) , p21/Ras (asociado con, por ejemplo, melanoma, cáncer pancreático y cáncer colorrectal) , CDK4 (asociado con, por ejemplo melanoma) , MUM1 (asociado con, por ejemplo melanoma) , caspasa-8 (asociado con, cáncer de cabeza y cuello) , CIA 0205 (asociado con, por ejemplo, cáncer de vejiga), HLA-A2-R1701 , beta catenina (asociado con, por ejemplo, melanoma) , TCR (asociado con, por ejemplo, linfoma no de Hodgkins de células T) , BCR-abl (asociado con, por ejemplo leucemia mielogenosa crónica) , triosefosfato isomerasa, KIA 0205, CDC-27, y LDLR-FUT; (c) antígenos sobre expresados, por ejemplo, Galectina 4 (asociado con, por ejemplo, cáncer colorrectal) , Galectina 9 (asociado con, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin) , proteinasa 3 (asociado con, por ejemplo, leucemia mielogenosa crónica) , T 1 (asociado con, por ejemplo varias leucemias) , anhidrasa carbónica (asociada con, por ejemplo cáncer renal) , aldolasa A (asociado con, por ejemplo cáncer de pulmón) , PRAME (asociado con por ejemplo melanoma) , HER-2/neu (asociado con, por ej . Cáncer de mama, colon, pulmón u ovárico) , mamaglobina, alfa-fetoproteina (asociada con, por ejemplo, hepatoma) , KSA (asociado con, por ejemplo cáncer colorrectal) , gastrina (asociado con, por ejemplo cáncer pancreático y gástrico) , protelna catalítica de telomerasa, MUC-1 (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama y ovárico) , G-250 (asociado con, por ej . carcinoma celular renal) , p53 (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, colon) y antígeno carcinoembriónico (asociado con, por ejemplo cáncer de mama, cáncer de pulmón y cánceres del tracto gastrointestinal como cáncer colorrectal); (d) antígenos compartidos, por ejemplo, antígenos de diferenciación de melanoma-melanocito como MART-1/Melan A, gplOO, MC1R, receptor de hormona estimulante de melanocitos, tirosinasa, proteína-1/TRPl relacionada a tirosinasa y proteína-2/TRP2 relacionada a tirosinasa (asociada con, por ejemplo, melanoma) , (e) antígenos asociados a próstata como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociados con por ejemplo cáncer de próstata; (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociados con mieloma y linfornas de células B, por ejemplo) . En ciertas modalidades, los inmunogenes tumorales incluyen, pero no se limitan a, pl5, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos de virus Epstein Barr, EBNA, antígenos de papilomavirus humano (HPV, por sus siglas en inglés) , que incluyen E6 y E7, antígenos de virus de hepatitis B y C, antígenos de virus linfotrópico de células T humanas, TSP-180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23Hl, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.2, NuMa, K-ras, pl6, TAGE, PSCA, CT7 , 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA125, CA15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43 , CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM) , HTgp-175, M344, A-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16 , TA- 90 (proteína de enlace a Mac-2/proteína asociada a ciclofilinaC) , TAAL6, TAG72, TLP, TPS y similares.
Composiciones Farmacéuticas Los liposomas de la invención son útiles como componentes en composiciones farmacéuticas para inmunizar sujetos contra varias enfermedades. Estas composiciones incluirán típicamente un portador aceptable farmacéuticamente además de los liposomas. Está disponible una discusión completa de portadores aceptables farmacéuticamente en la referencia 33.
Una composición farmacéutica de la invención puede incluir uno o más inmunopotenciadores de molécula pequeña. Por ejemplo, la composición puede incluir un agonista de TLR2 (por ejemplo Pam3CSK4), un agonista de TLR4 (por ejemplo un fosfato de aminoalquilglucosaminida, como E6020) , un agonista de TLR7 (por ejemplo imiquimod) , un agonista de TLR8 (por ejemplo resiquimod) y/o un agonista de TLR9 (por ejemplo IC31) . Cualquier agonista tiene idealmente un peso molecular de <2000 Da. Donde se encapsula un ARN, en algunas modalidades los agonistas son también encapsulados con el ARN, pero en otras modalidades son no encapsulados. Donde se adsorbe un ARN a una partícula, en algunas modalidades los agonistas son también adsorbidos con el ARN, pero en otras modalidades son no adsorbidos .
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir los liposomas en agua simple (por ejemplo w.f.i.) o en un amortiguador por ejemplo un amortiguador de fosfato, un amortiguador Tris, un amortiguador borato, un amortiguador succinato, un amortiguador de histidina, o un amortiguador de citrato. Las sales de amortiguador serán típicamente incluidas en el intervalo de 5-20 mM.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener un pH entre 5.0 y 9.5 por ejemplo entre 6.0 y 8.0.
Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ej . cloruro de sodio) para dar tonicidad. Una concentración de 10 + 2 mg/ml de NaCl es típica por ej emplo aproximadamente 9 mg/ml .
Las composiciones de la invención pueden incluir quelantes de ion metálico. Estos pueden prolongar la estabilidad de ARN por remover iones los cuales pueden acelerar hidrólisis de fosfodiéster . De esta forma una composición puede incluir uno o más de EDTA, EGTA, BAPTA, ácido pentético, etc., Los quelantes están presentes típicamente entre 10-500 µ?, por ejemplo 0.1 mm. Una sal de citrato, como citrato de sodio, puede también actuar como un quelanté, mientras que también proporciona ventajosamente actividad de amortiguamiento.
Composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener una osomolaridad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo entre 240-360 mOsm/kg, o entre 290-310 mOsm/kg.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir uno o más conservadores, como tiomersal o 2-fenoxietanol . Se prefieren composiciones libres de mercurio, y pueden ser preparadas vacunas libres de conservadores.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferentemente estériles.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferentemente no pirogénicas por ejemplo que contienen <1 EU (unidad de endotoxina, una medición estándar) por dosis, y preferentemente < 0.1 EU por dosis.
Composiciones farmacéuticas de la invención son preferentemente libres de gluten.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser preparadas en una forma de dosis de unidad. En algunas modalidades una dosis de unidad puede tener un volumen de entre 0.1-1.0 mi por ejemplo aproximadamente 0.5 mi.
Las composiciones pueden ser preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones. La composición puede ser preparada para administración pulmonar por ejemplo por un inhalador, usando una aspersión fina. La composición puede ser preparada para administración nasal, aural u ocular por ejemplo como aspersiones o gotas. Los inyectables para administración intramuscular son típicas.
Las composiciones comprenden una cantidad efectiva inmunológicamente de liposomas, así como también cualesquiera otros componentes, como se necesite. Por "cantidad efectiva inmunológicamente" , se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis sencilla o como parte de una serie, es efectiva para tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la condición de salud y física del individuo a ser tratado, edad, el grupo taxonómico del individuo a ser tratado (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseada, la formulación de la vacuna, la evaluación del doctor que trata de la situación médica y de otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado a través de pruebas de rutina. El liposoma y contenido de ARN de composiciones de la invención serán generalmente expresadas en términos de la cantidad de ARN por dosis . Una dosis preferida tiene 100 µg de ARN (por ejemplo de 10-100 µg, como aproximadamente 10 µg, 25 µg, 50 µ , 75 µg ó 100 µg) , pero la expresión puede ser vista en niveles mucho menores por ejemplo < 1 µg/dosisí < 100 ng/dosis, 10 ng/dosis, < 1 ng/dosis, etc.
La invención también proporciona un dispositivo de suministro (por ejemplo jeringa, nebulizador, aspersor, inhalador, parche dérmico, etc.) que contiene una composición farmacéutica de la invención. Este dispositivo puede ser usado para administrar la composición a un sujeto vertebrado.
Los liposomas de la invención no incluyen ribosomas .
Métodos de Tratamiento y Usos Médicos En contraste a las partículas descritas en la referencia 14, los liposomas y composiciones farmacéuticas de la invención son para uso in vivo para producir una respuesta inmunológica contra un inmunogen de interés .
La invención proporciona un método para incrementar una respuesta inmunológica en un vertebrado que comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de un liposoma o composición farmacéutica de la invención. La respuesta inmunológica es preferentemente protectora y preferentemente implica anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. El método puede originar una respuesta de refuerzo.
La invención también proporciona un liposoma o composición farmacéutica de la invención para uso en un método para incrementar una respuesta inmunológica en un vertebrado .
La invención también proporciona el uso de un liposoma de la invención en la fabricación de un medicamento para aumentar una respuesta inmunológica en un vertebrado.
Por incrementar una respuesta inmunológica en el vertebrado por estos usos y métodos, el vertebrado puede ser protegido contra varias enfermedades y/o infecciones por ejemplo contra enfermedades bacteriales y/o virales como se discute anteriormente. Los liposomas y composiciones son inmunogénicas , y son más preferentemente composiciones de vacuna. Las vacunas de acuerdo a la invención pueden ser ya sea profilácticas (es decir evitar infección) o terapéuticas (es decir tratar infección) , pero típicamente serán profilácticas .
El vertebrado es preferentemente un mamífero, como un mamífero humano o veterinario grande (por ejemplo caballos, ganado, venados, cabras, cerdos) . Donde la vacuna es para uso profiláctico, el humano es preferentemente un niño (por ejemplo bebé o un infante) o un adolescente, donde la vacuna es para uso terapéutico, el humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna propuesta para niños puede también ser administrada a adultos por ejemplo para evaluar la seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc.
Las vacunas preparadas de acuerdo a la invención pueden ser usadas para tratar tanto niños y adultos. De esta forma un paciente humano puede ser menor a 1 año de edad, menor a 5 años de edad, 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad, ó por lo menos 55 años de edad. Pacientes preferidos para recibir las vacunas son los más viejos (por ejemplo 50 años de edad, > 60 años de edad, y preferentemente _> 65 años) , los óvenes (por ejemplo < 5 años de edad) , pacientes hospitalizados, trabajadores de la salud, servicio armado y personal militar, mujeres preñadas, la enfermedad crónica, o pacientes inmunodeficientes . Las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos, sin embargo, y pueden ser usados más generalmente en una población.
Composiciones de la invención generalmente serán administradas directamente a un paciente. El suministro directo puede ser realizado por inyección parental (por ejemplo subcutánea, intraperitoneal , intravenosa, intramuscular, intradérmicamente o al espacio intersticial de un tejido; a diferencia de la referencia 1, inyección intraglosal no es usada tipicamente con la presente invención) . Las rutas de suministro alternativas incluyen administración rectal, oral (por ejemplo tableta, aspersión) , bucal, sublingual, vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra mucosal. La administración intradérmica e intramuscular son dos rutas preferidas. La inyección puede ser por medio de una aguja (por ejemplo una aguja hipodérmica) , pero puede ser usada alternativamente inyección libre de aguja. Una dosis intramuscular típica es 0.5 mi.
La invención puede ser usada para producir inmunidad sistémica y/o mucosal, preferentemente para producir una inmunidad sistémica y/o mucosal mejorada.
La dosis puede ser por un programa de dosis sencilla o un programa de dosis múltiple. Las dosis múltiples pueden ser usadas en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de dosis múltiple las varias dosis pueden ser dadas por las mismas o diferentes rutas por ejemplo un cebo parental y refuerzo mucosal, un cebo mucosal y reforzador parental, etc. Las dosis múltiples serán típicamente administradas por lo menos 1 semana aparte (por ejemplo aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). En una modalidad, las dosis múltiples pueden ser administradas aproximadamente 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas después del nacimiento, por ejemplo en una edad de 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas, como se usa con frecuencia en programa expandido en inmunización (EPI, por sus siglas en inglés) de la Organización Mundial de la Salud. En una modalidad alternativa, dos dosis primarias son administradas aproximadamente cada dos meses, por ejemplo aproximadamente 7, 8 ó 9 semanas aparte, seguido por una o más dosis de refuerzo aproximadamente 6 meses a 1 año después de la segunda dosis primaria, por ejemplo aproximadamente 6, 8, 10 ó 12 meses después de la segunda dosis primaria. En una modalidad adicional, se administran tres dosis primarias aproximadamente dos meses aparte, por ejemplo aproximadamente 7, 8 ó 9 meses de separación, seguido por una o más dosis de refuerzo aproximadamente 6 meses a 1 año después de la tercera dosis primaria, por ejemplo, aproximadamente 6, 8, ó 12 meses después de la tercera dosis primaria.
Modalidades Generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la experiencia de la técnica. Las técnicas son explicadas totalmente en la literatura. Ver, por ejemplo las referencias 34-40, etc.
El término "que comprende" comprende "que incluye" así como también "que consiste" por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y.
El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x + 10%.
La palabra "substancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo una composición la cual es "substancialmente libre" de Y puede ser completamente libre de Y. Donde sea necesario, la palabra "substancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención.
Referencias a carga, a cationes, a aniones, a zwiteriones, etc, se toman en pH 7.
TLR3 es el receptor 3 tipo peaje. Es un receptor de extensión de membrana sencillo el cual juega un papel clave en el sistema inmunológico innato. Los agonistas TLR3 conocidos incluyen poli(I:C) . "TLR3" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y es único HGNC ID es HGNC: 11849. La secuencia RefSeq para el gen TLR3 humano es GI: 2459625.
TLR7 es el receptor 7 similar a peaje. Es un receptor de extensión de membrana simple el cual juega un papel clave en el sistema inmunológico innato. Los agonistas TLR7 conocidos incluyen por ejemplo imiquimod. "TLR7" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y es único HGNC ID es HGNC: 15631. La secuencia RefSeq para el gen TLR7 humano es GI: 67944638.
TLR8 es el receptor 8 similar a peaje. Es un receptor de extensión de membrana simple el cual juega un papel clave en el sistema inmunológico innato. Los agonistas de TLR8 conocidos incluyen, por ejemplo resiquimod. "TLR8" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y es HGNC ID es HGNC: 15632. La secuencia RefSeq para el gen TLR8 humano es GI: 20302165.
La familia del receptor similar a RIG-I ( "RLR" ) incluye varias ARN helicasas las cuales juegan papel clave en el sistema inmunológico (41). RLR-l( también conocido como RIG-I o gen inducible I por ácido retinoico) tiene dos dominios de recrutación innnata de caspasa cerca de su N-terminal. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la RLR-l helicasa es "DDX58" (para DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) polipéptido 58 de cuadro) y el único HGNC ID es HGNC: 19102. La secuencia RefSeq para el gen RLR-l humano es Gl: 77732514. RLR-2 (también conocido como MDA5 o gen 5 asociado a diferenciación de melanoma) tiene también dos dominios de recrutación de caspasa cerca de su N-terminal. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la RLR-2 helicasa es "IFIH1" (para interferon inducido con helicasa C dominio 1) y la HGNC ID única es HGNC: 18873. La secuencia RefSEq para el gen RLR-2 humano es Gl: 27886567. RLR-3 (también conocido como LGP2 o laboratorio de genética y fisiología 2) no tiene dominios de recrutación de caspasa. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la RLR-3 helicasa es "DHX58" (para DEXH (Asp-Glu-X-His) polipéptido 58 de cuadro) y el único HGNC ID es HGNC: 29517. La secuencia RefSEq para el gen RLR-3 humano es Gl : 149408121.
PKR es una proteína cinasa dependiente a ARN de doble cadena. Juega un papel principal en el sistema inmunológico innato. "EIF2AK2" (para factor 2 -alfa cinasa 2 de inicio de traducción eucariótico) es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica esta enzima, y su único HGNC ID es HGNC: 9437. La secuencia RefSEq para el gen PKR humano es Gl : 208431825.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un gel con ARN teñido. Las bandas muestran (1) marcadores (2) replicón desnudo (3) replicón después del tratamiento con ARNasa (4) replicón encapsulado en liposoma (5) liposoma después del tratamiento con ARNasa (5) liposoma tratado con ARNasa entonces sometido a extracción con fenol/cloroformo.
La Figura 2 es una micrografía de electrones de liposomas .
La Figura 3 muestra las estructuras de DLinDMA, DLenDMA y DODMA.
La Figura 4 muestra un gel con ARN teñido. Las bandas muestras (1) marcadores (2) replicón desnudo (3) replicón encapsulado en liposoma (4) liposoma tratado con ARNasa entonces sometido a extracción con fenol/cloroformo .
La Figura 5 muestra expresión de proteína en los días 1, 3 y 6 después del suministro de ARN como replicón empacado en virión (cuadros) , como ARN desnudo (diamantes) o en liposomas (+=0.1 µg, x=l µg) .
La Figura 6 muestra expresión de proteína en los días 1, 3 y 6 después del suministro de cuatro dosis diferentes de ARN encapsulado en liposoma.
La Figura 7 muestra títulos de IgG anti-F en animales que reciben replicón empacado en virión (VRP o VSRP por sus siglas en inglés) , 1 µg ARN desnudo, y 1 µ9 de ARN encapsulado en liposoma.
La Figura 8 muestra títulos IgG anti-F en animales que reciben VRP, 1 µg de ARN desnudo, y 0.1 g ó 1 µg de ARN encapsulado en liposoma.
La Figura 9 muestra títulos de anticuerpo neutralizante en animales que reciben VRP o ya sea 0.1 g ó 1 µg de ARN encapsulado en liposoma.
La Figura 10 muestra niveles de expresión después del suministro de un replicón como ARN desnudo (círculos) , ARN encapsulado en liposoma (triángulo y cuadro) , o como un lipoplex (triángulo invertido) .
La Figura 11 muestra títulos de IgG específicos a F (2 semanas después de una segunda dosis) después del suministro de un replicón como ARN desnudo (0.01-1 µg) , ARN encapsulado en liposoma (0.01-10 µg) , o empacado como un virión (VRP, 106 unidades infecciosas o IU) .
La Figura 12 muestra títulos de IgG específicos a F (círculos) y títulos PRNT (cuadros) después del suministro de un replicón como ARN desnudo (1 µ ) , ARN encapsulado en liposoma (0.1 ó 1 g) , o empacado como un virión (VRP, 106 ITU) . Títulos en ratones ingenuos son también mostrados . Las líneas sólidas muestran media geométrica.
La Figura 13 muestra producción de citosina intracelular después de la restimulación con péptidos sintéticos que representan los epitopos principales en la proteína F, 4 semanas después de una segunda dosis. El eje y muestra el % de citosina + de CD8+CD4-.
Las Figuras 14A y 14B muestran títulos IgG específicos a F (títulos logio medios +_ desviación estándar) sobre 63 días (Figura 14A) y 210 días (Figura 14B) después de la inmunización de terneras. Las tres líneas son fácilmente distinguidas en el día 63 y son, de la parte inferior a la superior: control negativo PBS; ARN suministrado por liposoma; y el producto de "triángulo 4" .
La Figura 15 muestra expresión SEAP (intensidad relativa) en el día 6 contra pKa de lípidos usados en los liposomas. Los círculos muestran niveles para liposomas con DSPC, y cuadros para liposomas sin DSPC; algunas veces un traslape de cuadro y círculo, dejando solamente el cuadro visible para un pKa dado.
La Figura 16 muestra expresión de títulos anti F (con relación a RV01, 100%) dos semanas después de una primera dosis de proteína F que codifica replicón. Los títulos son graficados contra pKa en la misma forma como en la Figura 15. La estrella muestra RV02, la cual usa un lípido catiónico el cual tiene un pKa superior que los otros lípidos. Los triángulos muestran datos para liposomas que carecen de DSPC; los círculos son para liposomas que incluyen DSPC.
La Figura 17 muestra títulos IgG totales después del suministro de replicón en liposomas usando, de izquierda a derecha, RV01, RV16, RV17, RV18 ó RV19. Las barras muestran medias. La barra superior en cada caso es 2wp2 (es decir 2 semanas después de la segunda dosis) , mientras que la barra inferior es 2wpl .
La Figura 18 muestra títulos de IgG en 13 grupos de ratones. Cada círculo es un ratón individual, y las líneas lineas sólidas muestran media geométrica. La línea horizontal punteada es el límite de detección del ensayo. Los 13 grupos son, de izquierda a derecha, A a M como se describe posteriormente .
Las Figuras 19A y 19B muestran Figura 19A IL-6 y Figura 19B IFNoc (pg/ml) liberado por pDC. Hay cuatro pares de barras, a partir de izquierda a derecha; control: inmunizado con ARN+DOTAP; inmunizado con ARN+lipofectamina; e inmunizado con ARN en liposomas . En cada par la barra negra es ratones del tipo silvestre, gris es mutante rsql.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Replicones de ADN Varios replicones son usados posteriormente. En general estos se basan en un genoma alfavirus híbrido con proteínas no estructurales a partir de virus de encefalitis de equino de Venezuela (VEEV, por sus siglas en inglés) , una señal de empaque a partir del virus sindbis, y 3' UTR de virus sindbis o un mutante VEEV. El replicón es aproximadamente 10 kb de largo y tiene una cola poli-A.
El ADN de plásmido que codifica replicones de alfavirus (nombrado: pT7-mVEEV-FL-RSVF ó A317; pT7-mVEEV-SEAP ó A306; pSP6-VCR-GFP ó A50) sirve como un templado para síntesis de ARN in vitro. Los replicones contienen los elementos genéticos de alfa virus requeridos para replicación de ARN pero carecen de aquellos que codifican productos de genes necesarios para ensamble de partículas; las proteínas estructurales son en su lugar reemplazadas por una proteína de interés (ya sea un reportador como SEAP o GEP o un inmunogen como proteína RSV F de longitud completa) y por lo tanto los replicones son incapaces de inducir la generación de partículas infecciosas. Un promotor bacteriófago (T7 ó SP6) cadena arriba del ADNc de alfavirus facilita la síntesis del ARN de replicón in vitro y una ribozima de virus delta de hepatitis (HDV por sus siglas en inglés) inmediatamente cadena abajo de la cola poli (A) genera el extremo 3' correcto a través de su actividad de autoescisión.
Después de la linearización del ADN de plásmido cadena abajo de la ribozima HDV con una endonucleasa de restricción adecuada, las transcripcioines de corrida son sintetizadas in vitro usando ARN polimerasa dependiente a ADN derivado de bacteriófago T7 ó SP6. Las transcripciones son realizadas por 2 horas en 37°C en la presencia de 7.5 mM (ARN polimerasa de T7) ó 5 mM (ARN polimerasa de SP6) de cada uno de los trifosfatos de nucleósido (ATP, CTP, GTP y UTP) después de las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion) . Después de la transcripción el ADN templado es digerido con ADNasa TURBO (Ambion) . El ARN de replicón es precipitado con LiCl y reconstituido en agua libre de nucleasa. El ARN no coronado en el extremo es coronado en el extremo post-transcripcionalmente con Enzima de coronación en el extremo de Vaccinia (VCE, por sus siglas en inglés) usando el sistema de coronación en el extremo m7G ScriptCap (Epicentre Biotechnologies) como se subraya en el manual del usuario; replicones coronados en el extremo en esta forma son dados con el prefijo "v" por ejemplo vA317 es el replicón A317 coronado en el extremo por VCE. El ARN coronado en el extremo post-transcripcionalmente es precipitado con LiCl y reconstituido en agua libre de nucleasa. La concentración de las muestras de ARN es determinada por medir OD260nm- La integridad de las transcripciones in vitro es confirmada por desnaturalizar la electroforesis de gel de agarosa.
Encapsulación Liposomal Se encapsula el ARN en liposomas hechos por el método de referencias 11 y 42. Los liposomas son hechos de 10% de DSPC ( zwiteriónico) , 40% de DlinDMA (catiónico) , 48% de colesterol y 2% de DMG conjugado a PEG (2kDa de PEG) . Estas proporciones se refieren a % de moles en el liposoma total.
Se sintetiza DlinDMA (1,2 -dilinoleiloxi -N, N- dimetil-3 -arainopropano) usando el procedimiento de referencia 6. DSPC (1, 2-diasteroil-sn-glicero-3 - fosfocolina) es comprado de Genzyme . Se obtiene el 5 colesterol de Sigma-Aldrich. DMG conjugado a PEG (1,2- dimiristoil-sn-glicero-3 -fosfoetanolamina-N- [metoxi (polietilenglicol) , sal de amonio, DOTAP (1,2- dioleoil-3 - trimetilamonio-propano, sal de cloruro) y DC- col (clorhidrato de 3ß-[?- (?' , ' -dimetilaminoetano) - ^ carbamoil]colesterol ) son de Avanti Polar Lipids .
Brevemente, se disuelven los lípidos en etanol (2 mi) , se disuelve el replicón de ARN en amortiguador (2 mi, 100 mM de citrato de sodio, pH 6) y estos son mezclados con 2 mi de amortiguador seguido por 1 hora de equilibrio. Se ^ diluye la mezcla con 6 mi de amortiguador después se filtra.
El producto resultante contiene liposomas, con ~95% de eficiencia de encapsulación.
Por ejemplo, en un método particular, se preparan las soluciones de provisión de lípido fresco en etanol. 37 mg 0 de DlinDMA, 11.8 mg de DSPC, 27.8 mg de colesterol y 8.07 mg de PEG-DMG son pesados y disueltos en 7.55 mi de etanol. La solución de lípidos preparada recientemente es agitada suavemente en 37 °C por aproximadamente 15 minutos para formar una mezcla homogénea. Entonces, 755 µ?? de la provisión es 5 agregada a 1.245 mi de etanol para hacer una solución de provisión de lípidos de desarrollo de 2 mi. Esta cantidad de lípidos es usada para formar liposomas con 250 µg de ARN. Se prepara también 2 mi de solución de desarrollo de ARN a partir de una solución de provisión de ~ 1 µ9/µ en 100 mM de amortiguador de citrato (pH 6) . Tres viales de vidrio de 20 mi (con barras de agitación) son enjuagadas con solución de RNase Hawai (Molecular BioProducts) y se lava con abundante agua MilliQ antes de usar para descontaminar los viales de ARNasas . Uno de los viales es usado para la solución de desarrollo de ARN y los otros para recolectar las mezclas de lípidos y ARN (como se describe posteriormente) . Se calientan las soluciones de lípidos de desarrollo y ARN en 37 °C por 10 minutos antes de ser cargados en jeringas luer-lok de 3 mi. Se carga 2 mi de amortiguador de citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 mi. Las jeringas que contienen ARN y los lípidos se conectan a un mezclador T (unión ID de 500 µp? PEEK™, Idex Health Science) usando tubería FEP (etilen-propilen fluorinado; toda la tubería FEP usada tiene un diámetro interno de 2 mm y un diámetro externo de 3 mm) . La salida del mezclador T es también tubería FEP. La tercera jeringa que contiene el amortiguador de citrato es conectada a una pieza separada de tubería. Todas las jeringas son entonces accionadas en una velocidad de flujo de 7 ml/min usando una bomba de jeringa. Las salidas de tubo son colocadas para recolectar las mezclas en un vial de vidrio de 20 mi (mientras se agita) . Se toma la barra de agitación y se permite equilibrar el etanol/solución acuosa a temperatura ambiente por 1 hora. 4 mi de la mezcla se carga en una jeringa de 5 mi, la cual se conecta a una pieza de tubería FEP y en otra jeringa de 5 mi conectada a una longitud igual de tubería FEP, se carga una cantidad igual de 100 mM de amortiguador de citrato se carga (pH 6) . Se accionan dos jeringas en una velocidad de flujo de 7 ml/min usando la bomba de jeringa y la mezcla final se recolecta en un vial de vidrio de 20 mi (mientras se agita) . Después, la mezcla recolectada a partir de la segunda etapa de mezclado (liposomas) es pasada a través de una membrana Mustang Q (un soporte de intercambio de aniones que enlaza y remueve las moléculas aniónicas, obtenidas de Pall Corporation) . Antes de usar esta membrana para los liposomas, se pasan sucesivamente 4 mi de 1 NaOH, 4 mi de 1 M NaCl y 10 mi de 100 mM de amortiguador citrato (pH 6) a través de ella. Se calientan los liposomas por 10 minutos en 37 °C antes de pasar a través de la membrana. Después, los liposomas son concentrados a 2 mi y se dializan contra 10-15 volúmenes de IX PBS usando por filtración de flujo tangencial antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y membranas de filtración de fibra hueca son compradas de Spectrum Labs (Rancho Domínguez) y se usan de acuerdo a las pautas del fabricante . Se usan las membranas de filtración de fibra hueca de polisulfona con un corte de tamaño de poro de 100 kD y área superficial de 8 era2. Para los experimentos in vitro e in vivo se diluyen las formulaciones a la concentración requerida de ARN con IX PBS.
La Figura 2 muestra una micrografía de electrones de ejemplo de liposomas preparados por estos métodos. Estos liposomas contienen ARN encapsulado que codifican el antígeno RSV F de longitud completa. La difusión de luz dinámica de un lote muestra un diámetro promedio de 141 nm (por intensidad) ó 78 nm (por número) .
Se determina el porcentaje de concentración de ARN y ARN encapsulado por el kit de reactivo Quant-iT RiboGreen RNA (Invitrogen) , siguiendo las instrucciones del fabricante. El estándar de ARN ribosomal proporcionado en el kit es usado para generar una curva estándar. Se diluyen los liposomas lOx ó lOOx en amortiguador IX TE (del kit) antes a la adición del tinte. Separadamente, se diluyen los liposomas 10 veces ó 100 veces en amortiguador de IX TE que contiene 0.5% de Tritón X antes a la adición del tinte (para alterar los liposomas y de esta forma ensayar el ARN total) . Después de esto se agrega una cantidad igual de tinte a cada solución y entonces se carga -180 µ? de cada solución después de la adición del tinte por duplicado en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos. Se lee la fluorescencia (Ex 485 nm, Em 528 nm) en un lector de microplaca. Todas las formulaciones de liposoma son dosificadas in vivo en base a la cantidad encapsulada de ARN.
Se muestra la encapsulacion en liposomas para proteger ARN de digestión con ARNasa. Los experimentos usan 3.8 mAU de ARNasa por microgramo de ARN, incubado por 30 minutos en temperatura ambiente. Se inactiva la ARNasa con Proteinasa K en 55°C por 10 minutos. Se agrega entonces una mezcla 1:1 v/v de muestra a 25:24:1 v/v/v, fenol : cloroformo : alcohol isoamílico para extraer entonces el ARN de los lípidos en la fase acuosa. Se mezclan las muestras por vórtex por unos cuantos segundos y entonces se coloca en una centrífuga por 15 minutos en 12 k RPM. Se remueve la fase acuosa (que contiene el ARN) y se usa para analizar el ARN. Antes a la carga (400 ng de ARN por pozo) se incuban todas las muestras con tinte de carga de formaldehído, se desnaturaliza por 10 minutos en 65 °C y se enfría a temperatura ambiente. Se usan los marcadores Ambion Millennium para aproxmar el peso molecular de la construcción de ARN. Se corre el gel en 90 V. Se tiñe el gel usando 0.1% de oro SYBR de acuerdo a las pautas del fabricante en agua por mecer en temperatura ambiente por 1 hora. La Figura 1 muestra que la ARNasa digiere completamente el ARN en la ausencia de encapsulacion (banda 3) . El ARN es no detectable después de la encapsulacion (banda 4) , y no se observa cambio si estos liposomas son tratados con ARNasa (banda 4) . Después de que los liposomas tratados con ARNasa son sometidos a extracción con fenol, se observa ARN no digerido (banda 6) .
Incluso después de 1 semana en 4°C el ARN puede ser visto sin ninguna fragmentación (Figura 4, flecha). La expresión de proteínas in vivo no es cambiada después de 6 semanas en 4°C y un ciclo de congelación-descongelación. De esta forma es estable el ARN encapsulado en liposoma.
Para evaluar la expresión in vivo del ARN se codifica una enzima reportadora (SEAP; fosfatasa alcalina secretada) en el replicón, más que un inmunogen. Se miden los niveles de expresión en suero diluido 1:4 en amortiguador de IX Phospha-Light usando un substrato de fosfato alcalino quimioluminiscente . Se inyectan ratones BALB/c de 8-10 semanas de edad (5/grupo) intramuscularmente en el día 0, 50 µ? por pierna con 0.1 µg ó 1 µg de dosis de ARN. El mismo vector es también administrado sin los liposomas (en IX PBS libre de ARNasa) en 1 µg. Los replicones empacados en viriones son también probados. Los replicones empacados en viriones usados en la presente (referidos como VRP, por sus siglas en inglés) son obtenidos por los métodos de la referencia 43, donde el replicón de alfavirus es derivado de VEEV mutante o una quimera derivada del genoma de VEEV modificado para contener el 3' UTR de virus Sindbis y una señal de empaque de virus Sindbis (PS) , empacado por coelectroporarlos en células BHK con ARN auxiliadoras defectivas que codifican la capside de virus Sindbis y genes de glicoproteína .
Como se muestra en la Figura 5, la encapsulación incrementa los niveles de SEAP por aproximadamente ¾ log en una dosis de 1 µg, y en el día 6 expresión de niveles acoplados de dosis encapsulada de 0.1 µg observados con 1 g de dosis no encapsulada. Por el día 3 los niveles de expresión exceden aquellos logrados con VRP (cuadros) . De esta forma expresa incremento cuando el ARN es formulado en los liposomas con relación al control de ARN desnudo, incluso en una dosis 10 veces menor. La expresión es también superior con relación al control VRP, pero las cinéticas de expresión son muy diferentes (ver la Figura 5) . El suministro del ARN con electroporación resulta en expresión incrementada con relación al control de ARN desnudo, pero estos niveles son menores que con los liposomas.
Para evaluar si el efecto observado en los grupos de liposoma son debido simplemente a los componentes de liposoma, o se enlaza a la encapsulación, se administra el replicón en forma encapsulada (con dos diferentes protocolos de purificación, 0.01 µg de ARN) o mezclado con los liposomas después de su formación (un "lipoplex" no encapsulado, 0.1 µg de ARN) o como ARN desnudo (1 µg) . La Figura 10 muestra que el lipoplex da los niveles más bajos de expresión, mostrando que la encapsulación es esencial para expresión potente.
Estudios in vivo usando suministro liposomal confirman estos descubrimientos. Los ratones reciben varias combinaciones de (i) replicón de ADN de auto replicación que codifica proteína RSV F de longitud completa (ii) replicón de ARN de codificación de GFP de auto replicación (iii) replicón de ARN que codifica GFP con una anulación en nsP4 el cual elimina la autorreplicación (iv) proteína RSV F de longitud completa. 13 grupos en total reciben: Los resultados en la Figura 18 muestran que las respuestas de IgG específicas a F requieren encapsulación en el liposoma más que cosuministro simple (comparar los grupos C S d) . Una comparación de los grupos K, L y M muestra que el ARN proporciona un efecto adyuvante contra proteína cosuministrada, y este efecto es observado con tanto ARN de replicación y no replicación.
Los experimentos SEAP adicionales muestran una respuesta de dosis clara in vivo, con expresión vista después del suministro de tan poco como 1 ng de ARN (Figura 6) . Los experimentos adicionales que comparan expresión de repliciones encapsulados y desnudos indican que 0.01 µg de ARN encapsulado es equivalente a 1 de ARN desnudo . En una dosis de 0.5 µg de ARN el material encapsulado da una expresión 12 veces superior en el día 6; en niveles de dosis de 0.1 µg 24 veces superior en el día 6.
Más que observar en niveles promedio en el grupo, se estudian también los animales individuales . Mientras que varios animales no dan respuesta a replicaciones desnudas, la encapsulación elimina no respondedores.
Experimentos adicionales reemplazan DLinDMA con DOTAP. Aunque los liposomas DOTAP dan mejor expresión que el replicón desnudo, son inferiores a los liposomas DLinDMA (2 a 3 veces de diferencia en el día 1) . Mientras que DOTAP tiene una amina cuaternaria, y por lo tanto tiene una carga positiva en el punto de suministro, DLinDMA tiene una amina terciaria.
Para evaluar inmunogenicidad in vivo se construye un replicón para expresar proteína F de longitud completa a partir de virus sincicial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés) . Este es suministrado desnudo (1 µg) , encapsulado en liposomas (0.1 ó 1 µg) , o empacado en viriones (106 IU; "VRP") en los días 0 y 21. La Figura 7 muestra títulos IgG anti-F 2 semanas después de la segunda dosis; y los liposomas claramente incrementan la inmunogenicidad. La Figura 8 muestra títulos 2 semanas más tarde, punto en el cual no hay diferencia estadística entre el ARN encapsulado en 0.1 µg, el ARN encapsulado en 1 µg, o el grupo VRP. Los títulos de neutralización (medidos como 60% de reducción de placa, "PRNT60" ) no son diferentes significativamente en estos tres grupos 2 semanas después de la segunda dosis (Figura 9) . La Figura 12 muestra tanto títulos IgG y PRNT 4 semanas después de la segunda dosis.
La Figura 13 confirma que el ARN produce una respuesta de células T de CD8 robusta.
Experimentos adicionales comparan títulos de IgG específicos a F en ratones que reciben VRP, 0.1 µg de ARN encapsulado en liposoma ó 1 µg de ARN encapsulado en liposoma. Las proporciones de título (VRP : liposoma) en varios tiempos después de la segunda dosis son como a continuación: De esta forma el ARN encapsulado por liposoma induce esencialmente la misma magnitud de respuesta inmunológica como se observa con suministro de viriones.
Experimentos adicionales muestran respuestas de IgG específicos a F superiores con una dosis de 10 µg/ respuestas equivalentes para dosis de 1 µg y 0.1 µg, y una respuesta menor con una dosis de 0.01 µg. La Figura 11 muestra títulos de IgG en ratones que reciben el replicón en forma desnuda en 3 dosis diferentes, en liposomas en 4 diferentes dosis, o como VRP (106 IU) . La respuesta observada con 1 µg de ARN encapsulado en liposoma es estadísticamente insignificante (ANOVA por sus siglas en inglés) cuando se compara con VRP, pero la respuesta superior observada con 10 µg de ARN encapsulado en liposoma es estadísticamente significativa (p<0.05) cuando se compara con ambos de estos grupos.
Un estudio adicional confirma que 0.1 µg de ARN encapsulado en liposoma da respuestas de IgG anti-F más superiores (15 días post segunda dosis) que 0.1 µg de ADN suministrado, e incluso es más inmunogénico que 20 µg de ADN de plásmido que codifica el antígeno F, suministrado por electroporación (Sistema de suministro de ADN Elgen™, movió) .
Se realiza un estudio adicional en ratas de algodón (Sigmodon hispidis) en lugar de ratones. En una dosis de 1 µg de encapsulación de liposoma se incrementan los títulos IgG específicos a F por 8.3 veces comparado con ARN desnudo y se incrementan los títulos PRNT por 9.5 veces . La magnitud de la respuesta de anticuerpo es equivalente a aquella inducida por 5xl06 IU VRP. Tanto el ARN encapsulado en liposoma y desnudo son capaces de proteger las ratas de algodón a partir del reto con RSV (lxlO5 unidades formadoras de placa) , reduciendo la carga viral de pulmón por al menos 3.5 logs. La encapsulación incrementa la reducción por aproximadamente 2 veces .
Se realiza un estudio animal grande en ganado. Se inmunizan las vacas con 66 µg de proteína RSV F de longitud completa que codifica replicón en los días 0 y 21, formulados dentro de liposomas. Se usa PBS solo como un control negativo, y se usa vacuna autorizada como un control positivo ("Triángulo 4" a partir de Fort Doge, que contiene virus muerto) . La Figura 14 muestra títulos de IgG específicos a F sobre un periodo de 63 días iniciando a partir de la primera inmunización. El replicón de ARN es inmunogénico en las vacas, aunque da títulos menores que la vacuna autorizada. Todas las vacas vacunadas muestran anticuerpos específicos a F después de una segunda dosis, y los títulos son muy estables a partir del periodo de 2 a 6 semanas después de la segunda dosis (y son particularmente estables para la vacuna de AR ) .
Mecanismo de Acción Se obtienen células dendríticas derivadas de médula ósea (pDC) de ratones del tipo silvestre o la cepa mutante "Resq" (rsql) . La cepa mutante tiene una mutación de punto en la terminación amino de su receptor TLR7 el cual abóle señalización de TLR7 sin afectar el enlace de ligando (44) . Las células son estimuladas con ARN de replicón formulado con DOTAP, lipofectamina 2000 ó dentro de un liposoma. Como se muestra en la Figura 17, se inducen 11-6 y INFoc en células WT pero esta respuesta es casi completamente anulada en ratones mutantes. Estos resultados muestran que TLR7 es requerida para reconocimiento de ARN en células inmunológicas , y que los replicones encapsulados en liposomas pueden provocar que las células inmunológicas secreten altos niveles de ambos interferones y citocinas pro-inflamatorias .
Medición de pKa Se mide el pKa de un lípido en agua en temperatura estándar y presión usando la siguiente técnica • se prepara 2 mM de solución de lipido en etanol por pesar el lípido y disolver en etanol . 0.3 mM de solución de ácido nitrosulfónico de tolueno de sonda fluorescente (TNS, por sus siglas en inglés) en étanol :metanol 9:1 es preparada por hacer primero 3 mM de solución de TNS en metanol y entonces diluir a 0.3 mM con etanol , • se prepara un amortiguador acuoso que contiene fosfato de sodio, citrato de sodio acetato de sodio y cloruro 5 de sodio, en las concentraciones de 20 mM, 25 mM, 20 mM y 150 mM, respectivamente. El amortiguador es dividido en ocho partes y el pH es ajustado ya sea con 12 N de HC1 ó 6 N de NaOH para 4.44-4.52, 5.27, 6.15-6.21, 6.57, 7.10-7.20, 7.72- 7.80, 8.27-8.33 y 10.47-11.12. Se mezclan 400 µ? de 2 mM de ^ solución lipídica y 800 µ? de 0.3 mM de solución TNS. • 7.5 µ? de mezcla de sonda/lípido son agregados a 242.5 µ? de amortiguador en un mi de placa de 96 pozos. Esto es hecho con todos los ocho amortiguadores. Después de mezclar. 100 µ? de cada mezcla de sonda/lípido/amortiguador es transferido a un testido de 250 µ? con placa de 96 pozos de fondo claro (por ejemplo modelo COSTAR 3904, Corning) . Una forma conveniente de realizar esta mezcla es usar el software Gemini y manejador de líquidos de alto rendimiento Tecan Q Génesis RSP150.
• Se mide la fluorescencia de cada mezcla de sonda/lípido/amortiguador (por ejemplo con un espectrofotómetro SpectraMax M45 y software SoftMax pro 5.2) con 322 nm de excitación, 431 nm de emisión (auto corte en 420 nm) . 5 · Después de la medición, el valor de fluorescencia base de un pozo vacío en la placa de 96 pozos es substraída a partir de cada mezcla de sonda/lípido/amortiguador. Los valores de intensidad de fluorescencia son entonces normalizados al valor en el pH más bajo. La intensidad de la fluorescencia normalizada es entonces grafxcada contra pH y una línea de mejor fijación es proporcionada.
• Se encuentra el punto en la línea de la mejor fijación en la cual la intensidad de fluorescencia normalizada es igual a 0.5. El pH correspondiente a intensidad de fluorescencia normalizada igual a 0.5 es encontrada y es considerada el pKa del lípido.
Este método da un pKa de 5.8 para DLinDMA. Los valores de pKa medidos por este método para lípidos catiónicos de referencia 5 son incluidos posteriormente.
Encapsulacion en liposomas usando lípidos catiónicos alternativos Como una alternativa para usar DLinDMA, se usan los lípidos catiónicos de referencia 5. Estos lípidos pueden ser sintetizados como se describe en la referencia 5.
Los liposomas formados anteriormente usando DLinDMA son referidos posteriormente en la presente como la serie "RV01" . Se reemplaza el DlinDMa con varios lípidos catiónicos en la serie "RV02" a "RV12" como se describe posteriormente. Se forman dos tipos diferentes de cada liposoma, usando 2% de PEG2000 -DMG con ya sea (01) 40% del lípido catiónico, 10% de DSPC, y 48% de colesterol, ó (02) 60% del lípido catiónico y 38% de colesterol. De esta forma una comparación de (01) y (02) liposomas muestra el efecto del lípido zwiteriónico neutral .
Se hacen los liposomas RV02 usando el siguiente lípido catiónico (pka > 9, sin una amina terciaria) : Se hacen los liposomas RV03 usando el siguiente lípido catiónico (pKa 6.4): Los liposomas RV04 son hechos usando el siguiente lípido catiónico (pKa 6.62): ?? Se hacen los liposomas Rv06 usando el siguiente lípido catiónico (pKa 7.27).
Se hacen los liposomas Rv07 usando el siguiente lípido catiónico (pKa 6.8): Se hacen los liposomas RV08 usando el siguiente lípido catiónico (pKa 5.72): Se hacen los liposomas RV09 usando el siguiente lípido catiónico (pKa 6.07): Los liposomas RV10 son hechos para comparación usando el siguiente lípido catiónico (pKa 7.86) : Los liposomas RV11 son hechos usando el siguiente do catiónico (pKa 6.41) : Los liposomas RV16 son hechos usando el siguiente lípido catiónico (pKa 6.1) (45) Los liposomas RV17 son hechos usando el siguiente lípido catiónico (pKa 6.1) (45): Se hacen los liposomas RV18 usando DODMA. Se hacen los liposomas RV19 usando DOTMA, y se hacen los liposomas RV13 con DOTAP, ambos que tienen un grupo cabeza de amina cuaternaria .
Estos liposomas son caracterizados y son probados con el reportador SEAP descrito anteriormente. La siguiente tabla muestra el tamaño de los liposomas (Z promedio e índice de polidispersidad) , el % de encapsulación de ARN en cada liposoma, junto con la actividad SEAP detectada en los días 1 y 6 después de la inyección. La actividad SEAP es relativa a liposomas "RV01(02" hechos de DlinDMA, colesterol y PEG-DMG: La Figura 15 gráfica los niveles SEAP en el día contra el pKa de los lípidos catiónicos. Los mejores resultados son vistos donde el lípido tiene un pKa entre 5.6 y 6.8 , e idealmente entre 5.6 y 6.3.
Estos liposomas son también usados para suministrar una proteína RSV F de longitud completa que codifica replicón. Los títulos IgG totales contra la proteína F dos semanas después de la primera dosis (2wpl) son graficados contra pKa en la Figura 16. Los mejores resultados son observados donde el pKa es donde el lípido catiónico tiene un pKa entre 5.7-5.9, pero pKa solo no es suficiente garantía para un título alto, por ejemplo el lípido debe todavía soportar la formación de liposoma.
Inmunogenicidad de RSV Se realiza trabajo adicional con un replicón de auto-replicación (vA317) que codifica proteína RSV F. Se da a los ratones BALB/c, 4 u 8 animales por grupo, con vacunas intramusculares bilaterales (50 µ? por pierna) en días 0 y 21 con el replicón (1 µg) solo o formulado como liposomas con los lípidos RV01 o RV05 (ver anteriormente; pKa de 5.8 ó 5.85) o con RV13. Los liposomas RV01 tienen 40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de colesterol y 2% de PEG-DMG, pero con diferentes cantidades de ARN. Los liposomas RV05(01) tienen 40% de lípido catiónico, 48% de colesterol, 10% de DSPC, y 2% de PEG-DMG; los liposomas RV05(02) tienen 60% de lípido catiónico, 38% de colesterol y 2% de PEG-DMG. Los liposomas RV13 tienen 40% de DOTAP, 10% de DPE, 48% de colesterol y 2% de PEG-DMG. Para comparación, el ADN de plásmido desnudo (20 µg) que expresa el mismo antígeno RSV-F es suministrado ya sea usando electroporación o con liposomas RV01(10) (0.1 µ de ADN) . Se usan cuatro ratones como un grupo de control ingenuo .
Los liposomas son preparados por el método (A) o método (B) . En el método (A) se preparan soluciones de provisión de lípidos fresca en etanol . 37 mg de lípido catiónico, 11.8 mg de DSPC, 27.8 mg de colesterol y 8.07 mg de PEG-DMG se pesan y se disuelven en 7.55 mi de etanol. La solución de provisión lípida preparada recientemente es suavemente agitada en 37 °C por aproximadamente 15 minutos para formar una mezcla homogénea. Entonces, se agrega 226.7 µ? de la provisión a 1.773 mi de etanol para hacer una solución de provisión de lípidos de desarrollo de 2 mi . Esta cantidad de lípidos es usada para formar liposomas con 75 µg de ARN para dar una proporción 8:1 de nitrógeno a fosfato (excepto que en RV01 (08) y RV01 (09) esta proporción es modificada a 4:1 ó 16:1) . Se prepara también 2 mi de una solución de desarrollo de ARN (o, para RV01(10), ADN) a partir de una solución de provisión de ~1 µg/µl en amortiguador de citrato 100 mM (pH 6) . Tres viales de vidrio de 20 mi (con barras de agitación) se enjuagan con solución de ARNasa Hawai (Molecular BioProducts) y se lava con bastante agua MilliQ antes de uso para descontaminar los viales de ARNasas . Uno de los viales es usado para la solución de desarrollo de ARN y los otros para recolectar el lípido y mezclas de ARN (como se describe posteriormente) . Se calientan las soluciones de lípido de desarrollo y ARN en 37°C por 10 minutos antes de ser cargado en jeringas de 3 mi. Se cargan 2 mi de amortiguador de citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 mi. Las jeringas que contienen ARN y los lípidos son conectados a un mezclador T (PEEK™ 500 µp? de unión ID) usando tubería FEP. La salida del mezclador T es también tubería FEP. La tercera jeringa que contiene el amortiguador de citrato es conectada a una pieza separada de tubería FEP.
Todas las jeringas son entonces accionadas en una velocidad de flujo de 7 ml/min usando una bomba de jeringa. Las salidas de tubo se colocan para recolectar las mezclas en un vial de vidrio de 20 mi (mientras se agita) . Se toma la barra de agitación y se permite equilibrar el etanol/solución acuosa a temperatura ambiente por 1 hora. Entonces se carga la mezcla en una jeringa de 5 mi, la cual se fija a una pieza de tubería de FEP y en otra jeringa de 5 mi con igual longitud de tubería FEP, se carga un volumen igual de amortiguador de citrato 100 mM (pH 6) . Las dos jeringas son accionadas en velocidad de flujo de 7 ml/ml usando una bomba de jeringa y la mezcla final recolectada en un vial de vidrio de 20 mi (mientras se agita). Después, se concentran los liposomas a 2ml y se dializa contra 10-15 volúmenes de IX PBS usando TFF antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y las membranas de filtración de fibra hueca son compradas de Spectrum Labs y se usan de acuerdo a las pautas del fabricante. Se usan membranas de filtración de fibra hueca de polietersulfona (PES) (número de parte P-C1-100E-100-01N) con un corte de tamaño de poro de 100 kD y área superficial 20 'era2. Para los experimentos in vitro e in vivo, se diluyen las formulaciones a la concentración de ARN requerida con IX PBS.
El método de preparación (B) difiere en dos formas del método (A) . Primero, después de la recolección en el vial de vidrio de 20 mi pero antes de la concentración de TFF, se pasa la mezcla a través de membrana Mustang Q (un soporte de intercambio de aniones que enlaza y remueve moléculas aniónicas, obtenidas de Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA) . Esta membrana es primero lavada con 4 mi de IM NaOH, 4 mi de 1M NaCl y 10 mi de amortiguador de citrato 100 mM (pH 6) a su vez, y se calientan los liposomas por 10 minutos en 37°C antes de ser filtrados. Segundo, la membrana de filtración de fibra hueca es Polisulfona (número de parte P/N:X1AB-100-20P) .
El diámetro de partícula promedio Z, índice de polidispersidad y eficiencia de encapsulación de los liposomas son como a continuación: * Para esta formulación RV01(10) el ácido nucleico es ADN no ARN.
Se recolecta el suero para análisis de anticuerpo en los días 14, 36 y 49. Los vasos son cosechados a partir de ratones en el día 49 para los análisis de células T.
Los títulos IgG séricos específicos a F (GMT) son como a continuación: proporción de las células T las cuales son positivas a citosina y específicas para péptido RSV F51-66 son como a continuación, mostrando solamente figuras las cuales son estadística y positivamente arriba de cero: forma las formulaciones de liposoma incrementan significativamente la inmunogenicidad con relación a los controles de ARN desnudos, como se determina por títulos de IgG específicos a F incrementados y las frecuencias de células T. El ADN de plásmido formulado con liposomas, o suministrado desnudo usando electroporacion, es significativamente menos inmunogénico que el ARN de auto replicacion formulado por liposomas.
Las vacunas RVOl y RV06 son más inmunogénicas que la vacuna RV13 (DOTAP) . Estas formulaciones tienen características físicas comparables y son formuladas con el mismo ARN de auto replicacion, pero pueden contener diferentes lípidos catiónicos . RVOl y RV05 ambos tienen una amina terciaria en el grupo de cabeza con pKa de aproximadamente 5.8, y también incluyen colas de alquilo insaturadas . RV13 tiene colas de alquilo insaturadas pero su grupo cabeza tiene una amina cuaternaria y es muy fuertemente catiónica. Estos resultados sugieren que los lípidos con aminas terciarias con pKa en el intervalo de 5.0 a 7.6 son superiores a lípidos como DOTAP, los cuales son fuertemente catiónicos, cuando se usan en un sistema de suministro de liposoma para ARN.
Modalidades Alternativas para DLinDMA Se reemplaza el lípido catiónico en liposomas RV01 (DLinDMA) por RV16, RV17, RV18 ó RV19. Los títulos IgG totales son mostrados en la Figura 17. Los resultados más bajos son vistos con RV19 es decir la amina cuaternaria DOTMA.
Expresión BHK Los liposomas con diferentes lípidos son incubados con células BHK durante la noche y se evalúan para potencia de expresión de proteína. A partir de una línea base con lípidos RV05 la expresión puede ser incrementada 18 veces por agregar 10% de 1, 2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DpyPE) al liposoma, 10 veces por agregar 10% de 18:3 (cis) fosfatidilcolina y 900 veces en lugar de usar RV01.
Inmunogenicidad de RSV en diferentes cepas de ratón El replicón "vA317" codifica la glicoproteína de fusión (F) superficial del tipo silvestre de longitud completa de RSV pero con el péptido de fusión eliminado, y el extremo 3' es formado por escisión mediada por ribozima. Se prueba en tres diferentes cepas de ratón.
Se da a los ratones BALB/c vacunaciones intramusculares bilaterales (50 µ? por pierna) en los días 0 y 22. Se dividen los animales en 8 grupos de prueba (5 animales por grupo) y un control ingenuo (2 animales) : Grupo 1 se le da replicón desnudo (1 µg) .
Grupo 2 se le da 1 µg de replicón en liposomas "RV0K37)" con 40% de DlinDMA; 10% de DSPC, 48% de colesterol, 2% de DMG conjugado a PEG.
Grupo 3 se le da lo mismo como el grupo 2, pero en 0.1 µg de AR .
Grupo 4 se le da 1 µ de replicón en liposomas "RV17(10)" (40% de RV17 (ver anteriormente), 10% de DSPC, 49.5% de colesterol, 0.5% de PEG-DMG) .
Grupo 5 se le da 1 µg de replicón en liposomas "RV05(11)" (40% de lípido RV07, 30% de 18:2 PE (DLoPE, 28% de colesterol, 2% de PEG-DMG) .
Grupo 6 se le da 0.1 µg de replicón en liposomas "RV17 (10) " .
Grupo 7 se le da 5 µg de proteína de subunidad RSV-F en adyuvante con hidróxido de aluminio.
Grupo 8 se le da un control ingenuo (2 animales) Se recolectan los sueros para análisis de anticuerpo en los días 14, 35 y49. Los IgG GMT de suero específicos son: En el día 35 los títulos de IgGl específicos a F y títulos IgG2a (GMT) son como a continuación: Los títulos de anticuerpo de neutralización de suero RSV en los dís 35 y 49 son como a continuación (los datos son 60% de títulos de neutralización de reducción de placa de agrupaciones de 2-5 ratones, 1 agrupación por grupo) : Los vasos son cosechados en el día 49 para el análisis de células T. Las frecuencias de células T positivas a citosina específicas a F netas promedio (CD4+ ó CD8+) son como a continuación, mostrando solamente figuras las cuales son estadística y significativamente arriba de cero (específicas para péptidos RSV F51-66, F164-178, F309-323 para CD4+ , o para péptidos F85-93 y F249-258 para CD8+) Los ratones C57BL/6 son inmunizados en la misma forma, pero un noveno grupo recibe VRP (lxl0e IU) expresando la glicoproteína de fusión de superficie del tipo silvestre de longitud completa de RSV (eliminación de péptido de fusión) .
Los sueros son recolectados para análisis de anticuerpo en los días 14, 35 y 49. Los títulos IgG específicos a F (GMT) son: En el día 35 los títulos de IgGl y IgG2 específicos (GMT) son como a continuación: Los títulos de anticuerpo neutralizante sérico RSV en los días 35 y 49 son como a continuación (los datos son 60% de títulos de neutralización de reducción de placa de agrupaciones de 2-5 ratones, 1 agrupación por grupo) : Los vasos se cosechan en el día 49 para análisis de células T. Las frecuencias de células T positivas a citosina específicas a F netas promedio (CD8+) son como a continuación, mostrando solamente figuras las cuales son estadística y significativamente arriba de cero (específicas para péptidos RSV F85-93 y F249-258) : Se inmunizan nueve grupos de ratones C3H/HeN en la misma forma. Los títulos IgG específicos a F (GMT) son: En el día 35 los títulos IgGl y IgG2a específicos (GMT) son como a continuación: Los títulos de anticuerpo neutralizantes séricos RSV en los días 35 y 49 son como a continuación: De esta forma se prueban tres diferentes lípidos (RV01, RV05, RV17; pKa 5.8, 5.85, 6.1) en tres diferentes cepas de ratón reproducido. Para todas las 3 cepas RV01 es más efectivo que RV17; para cepas de BALB/c y C3H RV05 es menos efectivo que ya sea RV01 ó RV17, pero es más efectivo en la cepa B6. En todos los casos, sin embargo, los liposomas son más efectivos que dos nanoemulsiones catiónicas las cuales son probadas en paralelo.
Inmunogenicidad de CMV Los liposomas RV01 con DLinDMA como el lípido catiónico son usados para suministrar replicones de ARN que codifican glicoproteínas de citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés) . El replicón "vA160" codifica glicoproteínas de longitud completa H y L (gH/gL) , mientras que el replicón "vA322" codifica una forma soluble (gHsol/gL) . Las dos proteínas están bajo el control de promotores subgenómicos separados en un solo replicón; coadministración de dos vectores separados, uno que codifica gH y uno que codifica gL, no dan buenos resultados.
Se les da a los ratones BALB/c, 10 por grupo, vacunaciones intramusculares bilaterales (50 µ? por pierna) en los días 0, 21 y 42 con VRP que expresan gH/gL (lxlO6 IU) , VRP que expresan gHsol/gL (1X106 IU) y PBS como los controles. Dos grupos de prueba reciben 1 µg del replicón vA160 ó vA322 formulado en liposomas (40% DlinDMA, 10% de DSPC, 48% Chol, 2% de PEG-D G; hecho usando método (A) pero como se discute anteriormente, con 150 µg de tamaño de lote de ARN) .
Los liposomas vA160 tienen un diámetro Zav de 168 nm, un pdl de 0.144 y 87.4% de encapsulación. Los liposomas vA322 tienen un diámetro Zav de 162 nm, un pdl de 0.131 y 90% de encapsulación.
Los replicones son capaces de expresar dos proteínas de un solo vector.
Los sueros son recolectados para análisis inmunológico en el día 63 (3wp3) . Los títulos de neutralización CMV (el reciproco de la dilución sérica que produce una reducción de 50% en número de focos de virus positivos por pozo, con relación a los controles) son como a continuación: ARN que expresa ya sea una longitud completa o una forma soluble del complejo de gH/gL de CMV de esta forma produce altos títulos de anticuerpos de neutralización, como se ensaya en células epiteliales. Los títulos promedio producidos por los ARN encapsulados en liposoma son por lo menos tan altos como para los VRP correspondientes.
Será entendido que la invención ha sido descrita por la forma de ejemplo solamente y pueden hacerse modificaciones mientras que permanece dentro del espíritu y alcance de la invención.
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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un liposoma que tiene una bicapa lipídica que encapsula un núcleo acuoso, caracterizado porque: (i) la bicapa lipídica comprende un lípido que tiene un pKa en el intervalo de 5.0 a 7.6; y (ii) el núcleo acuoso incluye un ARN el cual codifica un inmunogen.
2. El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el lípido que tiene un pKa en el intervalo de 5.0 a 7.6 tiene una amina terciaria.
3. El liposoma de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque pKa en el intervalo de 5.0 a 7.6 está entre 5.7-5.9.
4. El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el lípido que tiene un pKa en el intervalo de 5.0 a 7.6 tiene la fórmula mostrada en la presente para RV01, RV02, RV03, RV04, RV05, RV06, RV07, RV08, RV09, RV11, RV12, RV16, ó RV17.
5. El liposoma de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque tiene un diámetro en el intervalo de 20-220 nm.
6. El liposoma de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la molécula de ARN codifica (i) una ARN polimerasa dependiente a ARN la cual puede transcribir ARN de la molécula de ARN y (ii) un inmunogne .
7. El liposoma de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula de ARN tiene dos cuadros de lectura abierta, el primero de los cuales codifica una replicasa de alfa virus y la segunda la cual codifica el inmunogen.
8. El liposoma de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la molécula de ARN es 9000-12000 nucleotidos de largo.
9. El liposoma de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el inmunogen puede producir una respuesta inmunológica in vivo contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito.
10. El liposoma de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el inmunogen puede producir una respuesta inmunológica in vivo contra virus sincicial respiratorio de glicoproteína F.
11. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el liposoma de conformidad con cualquier reivindicación precedente.
12. Un método para incrementar una respuesta inmunológica protectora en un vertebrado, caracterizado porque comprende la etapa de administrar al vertebrado una cantidad efectiva de liposoma de conformidad con las reivindicaciones 1-10, o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11.
13. Un proceso para preparar un liposoma que contiene ARN, caracterizado porque comprende etapas durante la formación de liposoma de: (a) mezclar ARN con un lípido en un pH el cual está abajo del pKa del lípido pero está arriba de 4.5; entonces (b) incrementar el pH a arriba del pKa del lípido.
14. El proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque: ARN usado en la etapa (a) está en solución acuosa, para mezclar con una solución orgánica del lípido para dar una mezcla la cual es entonces diluida para formar liposomas; y el pH es incrementado en la etapa (b) después de la formación de liposomas .
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